ES2247790T3 - Procedimiento para el cribado de una sustancia promotora de la oligomerizacion de moleculas de proteinas receptoras. - Google Patents
Procedimiento para el cribado de una sustancia promotora de la oligomerizacion de moleculas de proteinas receptoras.Info
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Abstract
Procedimiento para cribar sustancias que promueven la oligomerización de moléculas de proteína de receptor, o de fragmentos peptídicos de las mismas, el cual comprende determinar si las moléculas de proteína de receptor, o los fragmentos peptídicos de las mismas, están oligomerizadas cuando se ponen en contacto con una sustancia de ensayo.
Description
Procedimiento para el cribado de una sustancia
promotora de la oligomerización de moléculas de proteínas
receptoras.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para examinar sustancias que promueven la
oligomerización de moléculas de proteína del receptor. Más
específicamente, se refiere a un procedimiento para examinar
sustancias fisiológicamente activas, el cual usa la oligomerización
de las moléculas de proteína del receptor como un indicador.
Las sustancias fisiológicamente activas, tales
como la eritropoyetina y la hormona del crecimiento, contribuyen a
la transducción de las señales de diferenciación y de proliferación
a través de su unión a receptores específicos expresados sobre la
membrana de la célula diana. En 1990, Yoshimura et al.,
informaron que un receptor de la EPO, portador de una mutación de
Arg a Cys en la posición 129 en su dominio extracelular, induce la
transducción de una señal de proliferación, incluso en ausencia de
la EPO, sugiriendo que la multimerización de los dominios
extracelulares de los receptores de la EPO, a través de enlaces
disulfuro, es importante para la transducción de la señal
(Nature, 348:647-649 (1990)). Además, el
análisis de la estructura de rayos X de la unión hormona del
crecimiento-receptor de la hormona del crecimiento
indicó que dos receptores de la hormona se unen a una molécula de
hormona del crecimiento (Journal of Molecular Biology,
222(4):865-868 (1991)). Por tanto, la
multimerización del receptor es más probable que contribuya al
primer paso de la vía de transducción de la señal inducida por
sustancias fisiológicamente activas.
En 1996, se describió un péptido unidor del
receptor de la EPO que tenía una estructura central de 14
aminoácidos YXCXXGPXTWXCXP (X podía ser cualquier aminoácido) para
imitar posiblemente la actividad de la EPO (Science,
273:458-463 (1996)). El análisis de la estructura
del cristal de este péptido y del complejo con el receptor de la EPO
indicó que el dímero del péptido promueve la dimerización del
receptor de la EPO (Science, 273:464-471
(1996)).
Además, se ha hallado un anticuerpo contra un
dominio extracelular del receptor de la EPO que posiblemente imita
la actividad de la EPO. Los fragmentos monovalentes (Fab) de este
anticuerpo pueden unirse al receptor de la EPO, pero no inducen
transducción de señal, sugiriendo que se requiere la dimerización
del receptor de la EPO por parte del anticuerpo divalente unidor
para su función (J. Biol. Chem.,
271(40):24691-24697 (1996)).
Esa vía de transducción de señal activada por la
multimerización del receptor se observa, no sólo en la EPO y en la
hormona del crecimiento, sino también en otras sustancias
fisiológicamente activas, incluyendo los interferones y el factor de
estimulación de las colonias de granulocitos
(G-CSF). Con respecto a la trombopoyetina, se ha
identificado también un péptido que podría imitar la actividad de la
trombopoyetina a través de la multimerización del receptor
(Science, 276:1696-1699 (1997)).
Cunningham et al. mostraron un
procedimiento para seleccionar agonistas y antagonistas detectando
la formación del complejo ternario de receptores de la hormona del
crecimiento y sus ligandos (Solicitud de Patente Japonesa nº
5-500070). Sin embargo, este procedimiento detecta
la homoatenuación de sondas fluorescentes usando un
espectrofluorímetro, y por tanto no es apropiado para el examen a
gran escala de sustancias de ensayo.
El objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de examen de sustitutos de sustancias
fisiológicamente activas, el cual usa la multimerización del
receptor como un indicador.
Hemos establecido un sistema de examen que
permite una determinación conveniente de si las moléculas de
proteína del receptor, o los fragmentos peptídicos de las mismas, se
oligomerizan mediante el contacto con una sustancia de ensayo, o no,
y, de ese modo hemos completado la invención.
La presente invención proporciona un
procedimiento para examinar sustancias que promueven la
oligomerización de las moléculas de proteína del receptor, o de
fragmentos peptídicos de las mismas, el cual comprende determinar si
las moléculas de proteína, o los fragmentos peptídicos de las
mismas, se oligomerizan cuando se ponen en contacto con las
sustancias de ensayo. La sustancia de ensayo podría ponerse en
contacto con las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, en un entorno libre de células.
En el procedimiento anterior, es posible medir
señales generadas por la oligomerización de las moléculas de
proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas, para
determinar su las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, están oligomerizados. Las señales podrían
seleccionarse de entre el grupo consistente en señales de centelleo,
señales de quimioluminiscencia, señales de fluorescencia, señales de
absorción, señales de radiación ionizante, señales de resonancia
magnética nuclear, y señales de resonancia plasmón de superficie.
Tales señales podrían medirse mediante el procedimiento SPA, el
procedimiento RIA, la resonancia plasmón de superficie, la
resonancia magnética nuclear, el ensayo inmunosorbente asociado a
enzima, la cromatografía de filtración en gel, y similares. Al menos
una de las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, podría estar marcada. La marca podría
seleccionarse de entre el grupo consistente en radioisótopo,
fluoróforo, enzima, biotina, avidina, de centelleo, y combinaciones
de las mismas. Para determinar la presencia de moléculas o
fragmentos oligomerizados usando el procedimiento SPA, por ejemplo,
al menos una de las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, podrían marcarse con un radioisótopo,
mientras que al menos una de las otras podría anclarse sobre una
superficie de cuentas que contienen un agente de centelleo. En este
caso, puede añadirse una sustancia de ensayo a una solución acuosa
que comprende los receptores, o fragmentos peptídicos de los mismos,
marcados radiactivamente, así como los receptores, o fragmentos
peptídicos de los mismos, anclarse sobre la superficie de cuentas
que contiene el agente de centelleo, y entonces pueden medirse las
señales de centelleo generadas para determinar si los receptores, o
fragmentos peptídicos de los mismos, están oligomerizados. Aquéllos
formados en la técnica podría determinar correctamente la proporción
de mezcla de las cuentas que contienen el agente de centelleo
(cuentas SPA) respecto los receptores que deben anclarse a las
cuentas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los oligómeros de moléculas de proteína del
receptor, o fragmentos peptídicos del mismo, podrían formarse en una
solución o sobre una superficie sólida. Para determinar la presencia
de los oligómeros usando, en general, la resonancia magnética
nuclear o la cromatografía de filtración en gel, los oligómeros se
forman preferiblemente en solución. Para determinar la presencia de
los oligómeros usando, en general, el procedimiento del SPA, el
procedimiento del RIA, la resonancia plasmón de superficie, o el
ensayo inmunosorbente ligado a enzima, los oligómeros se forman
preferiblemente sobre una superficie sólida.
El receptor podría ser un receptor de citocina
seleccionado del grupo consistente en el receptor del factor
hematopoyético, receptor de linfocina, receptor del factor del
crecimiento, y receptor del factor inhibidor de la diferenciación.
Más específicamente, podría seleccionarse del grupo consistente en
el receptor de la eritropoyetina (EPO), el receptor de la
trombopoyetina (TPO), el receptor del factor estimulador de las
colonias de granulocitos (G-CSF), el receptor del
factor estimulador de las colonias de macrófagos
(M-CSF), el receptor del factor estimulador de las
colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF), el receptor del factor de la necrosis del
tumor (TNF), el receptor de la interleucina-1
(IL-1), el receptor de la
interleucina-2 (IL-2), el receptor
de la interleucina-3 (IL-3), el
receptor de la interleucina-4
(IL-4), el receptor de la
interleucina-5 (IL-5), el receptor
de la interleucina-6(IL-6),
el receptor de la interleucina-7
(IL-7), el receptor de la
interleucina-9 (IL-9), el receptor
de la interleucina-10 (IL-10), el
receptor de la interleucina-11
(IL-11), el receptor de la
interleucina-12 (IL-12), el receptor
de la interleucina-13 (IL-13), el
receptor de la interleucina-15
(IL-15), el receptor del
interferón-\alpha (INF-\alpha),
el receptor del interferón-\beta
(INF-\beta), el receptor del
interferón-\gamma (INF-\gamma),
el receptor de la hormona del crecimiento (GH), el receptor de la
insulina, el receptor del factor de células madre (SCF), el receptor
del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor
del factor de crecimiento epidérmico (EGF), el receptor del factor
de crecimiento del nervio (NGF), el receptor del factor de
crecimiento de fibroblastos), el receptor del factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), el receptor del
factor-\beta transformante
(TGF-\beta), el receptor del factor inhibidor de
la leucemia (LIF), el receptor del factor neurotrófico ciliar
(CNTF), el receptor de la oncostatina M (OSM), y el receptor del
tipo Notch.
La molécula de proteína del receptor podría ser
una subunidad del receptor de citocina. Por ejemplo, cada uno de, el
receptor de la IL-3, el receptor de la
IL-5, y el receptor del GM-CSF
consiste en subunidades \alpha y \beta. Estos receptores son
conocidos por compartir una subunidad \beta común. Cada uno de, el
receptor de la IL-6, el receptor del LIF, y el
receptor de la IL-11 consiste en una subunidad
\alpha y una subunidad gp130. Estos receptores son conocidos por
compartir una subunidad gp130 común. Cada uno del receptor del CNTF
y del receptor de la OSM es un trímero de
subunidad-\alpha, la subunidad \alpha del
receptor del LIF, y la subunidad gp130. También, cada uno del
receptor de la IL-2, el receptor de la
IL-4, el receptor de la IL-7, el
receptor de la IL-9 y el receptor de la
IL-15, consiste en subunidades \alpha, \beta y
\gamma. Estos receptores son conocidos por compartir una
subunidad \gamma común.
El fragmento peptídico de la molécula de proteína
del receptor preferiblemente comprende al menos un sitio de unión de
ligando del receptor. La molécula de proteína del receptor tiene un
sitio de unión de ligando en su región extracelular o región
soluble.
El oligómero que puede formarse a partir de las
moléculas de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las
mismas, podría ser cualquier homooligómero o heterooligómero,
incluyendo un dímero, trímero y tetrámero. Por ejemplo, el receptor
de la eritropoyetina, el receptor de la trombopoyetina, el receptor
del G-CSF, el receptor del SCF, y el receptor del
EGF son conocidos por formar homodímeros; el receptor de la
IL-6, el receptor del LIF, y el receptor de la
IL-11 son conocidos por formar heterodímeros; y el
receptor de la IL-2, el receptor del CNTF y el
receptor de la OSM son conocidos por formar heterotrímeros.
Una sustancia a examinarse podría ser un
sustituto novedoso de una sustancia fisiológicamente activa. Las
sustancias fisiológicamente activas conocidas incluyen la
eritropoyetina, el interferón, el G-CSF, la hormona
del crecimiento, la trombopoyetina, el GM-CSF y el
M-CSF.
En una realización del procedimiento anterior,
pueden examinarse sustancias que promueven la dimerización de
moléculas de proteína del receptor de la eritropoyetina, o
fragmentos peptídicos de las mismas, mediante la adición de una
sustancia de ensayo a una solución acuosa que comprende receptores
de la eritropoyetina marcados con ^{125}I, o fragmentos peptídicos
de los mismos, así como receptores de la eritropoyetina, o
fragmentos de los mismos, unidos a la superficie de cuentas de
silicato de itrio o poliviniltolueno que contienen agente de
centelleo; y a continuación medir las señales de centelleo generadas
para determinar si los receptores de la eritropoyetina, o fragmentos
de los mismos, están dimerizados.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para examinar sustancias que inhiben la
oligomerización de las moléculas de proteína del receptor, o
fragmentos peptídicos de las mismas, el cual comprende determinar si
la oligomerización de las moléculas de proteína del receptor, o
fragmentos peptídicos de las mismas, está inhibida cuando se ponen
en contacto con una sustancia de ensayo. La sustancia promotora de
la oligomerización podría tener una actividad fisiológica. La
sustancia que inhibe la oligomerización de las moléculas de proteína
del receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas, podría tener la
capacidad de inhibir la actividad fisiológica de la sustancia
promotora de la oligomerización. Por ejemplo, la sustancia promotora
de la oligomerización podría ser la eritropoyetina, y el receptor
podría ser un receptor de la eritropoyetina.
La presente invención proporciona además un
equipo de ensayo para examinar sustancias que inhiben la
oligomerización de las moléculas de proteína del receptor, o
fragmentos peptídicos de las mismas, el cual comprende una sustancia
promotora de la oligomerización, las moléculas de proteína del
receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas, y un tampón. Por
ejemplo, la sustancia promotora de la oligomerización podría ser la
eritropoyetina; la molécula de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, podría ser una molécula de proteína del
receptor de la eritropoyetina, o fragmento peptídicos del mismo; y
el tampón podría ser una solución salina tamponada con
fosfato.
fosfato.
La presente invención proporciona además el uso
de moléculas de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de
las mismas, para determinar si una sustancia de ensayo promueve la
oligomerización de las moléculas de proteína del receptor, o
fragmentos peptídicos de las mismas.
La presente invención se describirá
adicionalmente más abajo.
Preparamos primero moléculas de proteína del
receptor y fragmentos peptídicos de las mismas. La molécula de
proteína del receptor, o el fragmento peptídico de la misma, podrían
estar en forma de una fracción de membrana que contiene las
moléculas de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las
mismas, preferiblemente podría aislarse y purificarse a partir de
células, más preferiblemente podría producirse recombinantemente.
Por ejemplo, la molécula de proteína del receptor, o fragmento
peptídico de la misma, podría prepararse como sigue.
Cuando se usa una fracción de membrana, las
células que expresan las moléculas de proteína del receptor de
interés podrían solubilizarse en una solución tamponante que
contiene un tensioactivo tal como el Triton X-100, y
a continuación cromatografiarse, usando una columna de afinidad
sobre la que se han inmovilizado ligandos o anticuerpos
anti-receptor, con objeto de purificar las
moléculas de proteína del receptor.
Cuando la molécula de proteína del receptor tiene
un sitio de unión de ligando identificado, podría sintetizarse un
fragmento peptídico correspondiente a este sitio y usarse en la
presente invención.
Para producir recombinantemente la molécula de
proteína del receptor, o fragmento peptídico de la misma, el ADNc
que codifica la molécula de proteína del receptor en su longitud
completa, o su región extracelular que contiene un sitio de unión de
ligando, podría clonarse usando el procedimiento de la PCR y una
biblioteca de ADNc, y a continuación integrarse en un vector de
expresión apropiado para expresar el gen de interés en una célula
huésped tal como E. coli o las células CHO. Para el propósito
de purificación sencilla, un gen que codifica una marca, tal como el
MBP, GST o FLAG, podría ligarse cadena arriba o cadena abajo
respecto el gen que codifica la proteína de interés.
Para detectar el oligómero de las moléculas de
proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas,
mediante el procedimiento del RIA o el ensayo inmunosorbente ligado
a enzima, las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos
peptídicos de las mismas, se han marcado previamente.
A continuación, para determinar si las moléculas
de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas,
están oligomerizadas, las moléculas o fragmentos podrían ponerse en
contacto con una sustancia de ensayo apropiada como sigue.
En una realización de la presente invención,
podemos medir la unión entre receptores mediante la técnica del
centelleo. La técnica del centelleo puede detectar la emisión de
fotones que resulta de las colisiones entre rayos radiactivos
procedentes de algunos receptores marcados con radioisótopos y
sustancias de emisión (es decir, centelleantes) unidas al otro
receptor en el complejo de oligómero. La emisión de fotón resultante
podría medirse como un pulso de voltaje por medio de un
fotomultiplicador o un fotodiodo. La sustancia de emisión preferida
incluye los cristales y polvos de NaI, CsI y ZnS, o los cristales de
antraceno y naftaleno. Alternativamente, puede usarse con este
propósito la técnica del ensayo de centelleo por proximidad (SPA)
desarrollada por Amersham International (Bothworth, N. y Towers, P.,
Nature, 341:167-1168 (1989)). La técnica del
SPA convierte la energía de radiación procedente de un radioisótopo
en luz a través de la absorción por cuentas de silicato de itrio o
poliviniltolueno que contienen agente de centelleo (cuentas del SPA)
cuando el radioisótopo se une o está en estrecha proximidad de
cuentas del SPA. Por ejemplo, algunos receptores se unen a cuentas
del SPA, mientras que otros receptores están marcados
radiactivamente. A continuación, se podría añadir una sustancia de
ensayo a una solución que comprende los receptores marcados
radiactivamente, así como los receptores unidos a cuentas del SPA,
con objeto de detectar la luz resultante de la oligomerización del
receptor mediada por la sustancia de ensayo. Para unir los
receptores a las cuentas del SPA, pueden usarse la avidina y
biotina. El radioisótopo a usar incluye el ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{45}Ca y ^{125}I. Alternativamente, podemos usar una
placa de microvaloración que contiene agente de centelleo en la
superficie del fondo en lugar de cuentas del SPA. Por ejemplo, se
inmovilizan receptores sin marcar sobre la superficie del fondo de
la placa, y se añaden a la misma receptores marcados radiactivamente
y la sustancia de ensayo.
A partir de la formación del oligómero del
receptor mediada por la sustancia de ensayo, los receptores marcados
radiactivamente se acumulan sobre la superficie del fondo de la
placa, y el agente de centelleo contenido en la superficie del fondo
absorbe energía de radiación procedente del radioisótopo, causando
de ese modo la emisión de fotones. La emisión de fotones
incrementada resulta en la detección de la oligomerización del
receptor. El procedimiento que usa cuentas del SPA es conveniente y
apropiado para el examen a gran escala de sustancias de ensayo en
función de su actividad, porque no hay necesidad de separar los
receptores no unidos de los receptores unidos antes de la
detección.
detección.
En otra realización de la presente invención, un
sensor de resonancia plasmón de superficie, denominado BIACORE
(desarrollado por, y disponible comercialmente de Pharmacia Biotech)
puede usarse para detectar la oligomerización del receptor. El
BIACORE tiene una estructura básica que incluye una fuente de luz,
un prisma, un detector y un microcanal. Algunos receptores se han
inmovilizado sobre un chip sensor del tipo casete, y los otros
receptores se inyectan a continuación sobre el chip sensor. Los
receptores inyectados se suministran al chip sensor a una velocidad
de flujo constante, y a continuación se distribuyen sobre los
receptores inmovilizados. A partir de la formación del oligómero a
través de la unión de los receptores inmovilizados con los
receptores inyectados, los receptores inyectados se acumulan sobre
el chip sensor, lo que resulta en un volumen incrementado de
proteínas sobre el chip. Este volumen incrementado puede detectarse
ópticamente como una señal de resonancia de plasmón. Por ejemplo,
podría inyectarse una sustancia de ensayo simultáneamente con los
receptores para detectar una intensidad incrementada de señal de
resonancia de plasmón, permitiendo la detección de la actividad de
la sustancia de ensayo a partir de una señal de resonancia de
plasmón incrementada, inducida por la presencia de la sustancia de
ensayo.
En una realización adicional de la presente
invención, puede usarse la técnica de la resonancia magnética
nuclear (RMN) para detectar la oligomerización del receptor. La
técnica de la RMN usa una onda electromagnética de baja energía, y
se prefiere debido a su elevada sensibilidad para detectar incluso
pequeños cambios de energía. Por ejemplo, se disuelven dos tipos de
receptores en un solvente a aproximadamente 1 mM, seguido por la
medición de las señales de resonancia magnética nuclear. A
continuación, se añade una sustancia de ensayo a la solución. Las
señales de resonancia magnética nuclear pueden medirse de nuevo para
detectar la oligomerización del receptor como un desplazamiento de
la señal.
En una realización adicional de la presente
invención, puede usarse el ensayo inmunosorbente ligado a enzima
(ELISA). Por ejemplo, se inmovilizan algunos receptores sobre cada
pocillo de una placa de 96 pocillos, y a continuación se hacen
reaccionar, en una medio apropiado, con una sustancia de ensayo y
los otros receptores marcados con un enzima, tal como la peroxidasa
de rábano silvestre o fosfatasa alcalina. Después de lavarla, se
añade un reactivo de coloración a la placa, y se mide la absorbancia
para cada placa. La oligomerización del receptor puede detectarse
mediante absorbancia incrementada. La oligomerización del receptor
puede detectarse también usando la quimioluminiscencia marcando los
receptores con luciferasa, como un enzima, y revelando la placa
mediante un agente de coloración. Alternativamente, pueden usarse
receptores marcados radiactivamente o fluorescentemente, en vez de
los receptores marcados enzimáticamente, para detectar la
oligomerización del receptor. En este caso, la detección podría
conseguirse mediante la medición de la dosis de radiación ionizada
restante o la intensidad de la fluorescencia.
En otra realización de la presente invención,
puede usarse una técnica de cromatografía por filtración en gel. Se
hacen reaccionar dos tipos de receptores y una sustancia de ensayo
en condiciones apropiadas, y a continuación se someten a
cromatografía de filtración en gel. La oligomerización del receptor
puede detectarse mediante un desplazamiento de un tiempo de
retención para la absorbancia del pico.
Una sustancia que inhibe la oligomerización de
las moléculas de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de
las mismas, podría examinarse como sigue.
Una sustancia inhibidora de la oligomerización
puede examinarse mediante la detección de un cambio en la intensidad
de la señal en presencia de una sustancia de ensayo, junto con una
sustancia que promueve la oligomerización de las moléculas de
proteína del receptor o fragmentos peptídicos de las mismas.
Por ejemplo, la sustancia que inhibe la
oligomerización puede detectarse añadiendo una sustancia promotora
de la oligomerización y una sustancia de ensayo a una solución
acuosa que comprende receptores de la eritropoyetina marcados con
^{125}I, o fragmentos peptídicos de los mismos, así como
receptores de la eritropoyetina, o fragmentos peptídicos de los
mismos, unidos sobre la superficie de cuentas de silicato de itrio o
poliviniltolueno que contienen agente de centelleo; y midiendo a
continuación las señales de centelleo generadas.
En una realización del equipo de ensayo acorde
con la presente invención, los elementos que comprenden el equipo
podrían empaquetarse en un(os) contenedor(es),
tal(es) como vial(es) o tubo(s), de forma
separada, o en combinación, o como una única unidad. El/los
contenedor(es) podría(n) empaquetarse además como una
única unidad en un contenedor con varios compartimentos. En este
equipo de ensayo, ambas moléculas de proteína del receptor, o
fragmentos peptídicos de las mismas, y la sustancia promotora de la
oligomerización, podrían estar en forma liofilizada. Estos elementos
podrían reconstituirse con un tampón cuando se usa el equipo de
ensayo en el ensayo de examen.
Esta especificación incluye parte o la totalidad
de los contenidos tal como se descubren en la especificación y/o
figuras de la Solicitud de Patente Japonesa nº
10-102325, la cual es un documento prioritario de la
presente solicitud.
La Figura 1 muestra los resultados de la
detección del dímero del receptor de la EPO usando cuentas del SPA.
El eje horizontal indica una concentración molar del dímero EMP1 y
el eje vertical indica el recuento de emisión.
La presente invención se describirá
adicionalmente en los ejemplos siguientes, los cuales se
proporcionan con propósitos ilustrativos y no se pretende que
limiten el ámbito de la invención.
1) Se diseñaron dos pares de cebadores de la PCR
(es decir, 4 cebadores en total) en base a la secuencia del ADNc
del receptor de la EPO. A saber, para la primera amplificación se
prepararon el siguiente cebador-5'
ERO-1 y el cebador-3'
ERO-2:
- ERO-1
- (5'-GCAGCTGCTG ACCCAGCTGT-3') {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 1)
- ERO-2
- (5'-AAGTCTTGAG TCTGCACTGG-3') {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 2)
Para mejorar la precisión de la clonación, se
prepararon los siguientes cebadores, cebador-5'
ERI-1 y cebador-3'
ERI-2, los cuales son internamente adyacente
respectivamente a ERO-1 y ERO-2,
para la segunda amplificación mediante la PCR.
- ERI-1
- (5'-TTTGAATTCT GTATCATGGA CCACCTCGG-3') {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 3)
- ERI-2
- (5'-TTTAAGCTTG ATCCCTGATC ATCTGCAGC-3') {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 4)
Los cebadores ERI-1 y
ERI-2 incluyen respectivamente un sitio para EcoR I
y un sitio para Hind III con objeto de simplificar la subsiguiente
subclonación.
2) Se usó la línea celular AS-E2
que expresa de forma elevada los receptores de la EPO
(aproximadamente 1 \times 10^{8} células) para extraer el ARN
total (1,23 mg) de acuerdo con un procedimiento AGPC modificado, con
tratamiento con fenol y tratamiento con cloroformo. Se usaron
cuentas de oligo dT-latex para purificar el
poli(A) + ARN (7,8 \mug) a partir del ARN total completo.
Después de confirmar la pureza del ARNm mediante electroforesis, se
sometió 1 \mug de poli(A) + ARN a una reacción de
transcripción inversa usando un equipo de síntesis de ADNc de
Amersham. Se sometieron dos microlitros de la mezcla de reacción
resultante (20 \mul en total) a la PCR usando LA Taq (equipo de
PCR LA de Takara, ver2). Se usaron ERO-1 &
ERO-2 y ERI-1 &
ERI-2 como pares de cebadores para la PCR. La
reacción de la PCR se realizó en las condiciones siguientes: 2
minutos a 94ºC, (20 segundos a 98ºC/90 segundos a 60ºC/3 minutos a
72ºC) \times 30 ciclos, y 10 minutos a 72ºC. Se electroforesó una
porción de esta mezcla de reacción de RT-PCR con
objeto de determinar el tamaño del fragmento amplificado.
3) El ADNc de la primera hebra sintetizado a
partir del ARNm de células AS-E2 se usó como una
plantilla, y se sometió a seis reacciones de la PCR separadas usando
LA Taq (Takara), tal como se ha descrito más arriba. En estas
reacciones de la PCR se usaron como cebadores el
ERI-1 y ERI-2. Cada uno de los
fragmentos de la PCR amplificados se subclonaron en un pBluescript
SK(+). Se seleccionó un clon para cada fragmento de la PCR para
preparar un plásmido. Se analizaron los seis plásmidos de clones
resultantes y los fragmentos de la PCR (secuenciación
directa).
directa).
4) El inserto de ADNc se extrajo con BamH I e
Hind III a partir de un plásmido del ADNc de EPO-R
portador de dos sustituciones de bases, y a continuación se insertó
en un sitio BamH I/Hind III del vector pUC 119. Este plásmido se
digirió con BssH II y Bal I para obtener un fragmento que incluía el
vector (fragmento 1). Mientras tanto, se extrajo una región entre un
sitio BassH II y un sitio Bal I a partir de un clon normal sin
ninguna mutación en esta región (fragmento 2), clon que se había
seleccionado de entre los seis clones de ADNc de
EPO-R preparados más arriba en 3). Los fragmentos 1
y 2 se ligaron entre ellos. Los clones resultantes se analizaron
mediante secuenciación, con objeto de aislar un clon en el cual se
hubiera insertado correctamente el fragmento 2 (pUC
119-EPOR-L2). El inserto de ADNc se
cortó del pUC 119-EPOR-L2 usando
BamH I e Hind III, y se insertó en un sitio BamH I/Hind III del
vector pBLSII SK(+), obteniéndose de ese modo un clon
(pEPOR-L2/SK).
1) Para construir un gen del receptor humano
soluble de la EPO, se realizó la PCR usando pEPOR-SK
como una plantilla y los siguientes cebadores 1 y 2:
- Cebador 1:
- 5-TTTTAAGAAT TCCACCATGG ACCACCTCGG GGCGT-3' {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 5)
- Cebador 2:
- 5-GGGATCCTTA TTTATCGTCA TCGTCTTTGT AGTCGCTAGG CGTCAGCAGC GACA-3' {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 6)
- Cebador 3:
- 5-TGAATTCAGT GTGTGCTGAG CAACCT-3' {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 7)
- Cebador 4:
- 5-GGGATCCGCT TTGCTCTCGA ACTT-3' {}\hskip0.5cm (SEC. Nº ID.: 8)
Una mezcla de reacción (50 \mul) que contenía
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, 2,5 U Ex. Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), dNTP 0,25 mM, cebadores
1 y 2 0,2 \muM, y 180 ng de pEPOR-SK, se recubrió
con 15 \mul de Chill Out 14 (MJ Research Inc.). La amplificación
con la PCR se realizó en un ciclador térmico modelo 480
(Perkin-Elmer) durante 30 ciclos, en las siguientes
condiciones: 1 minuto a 96ºC, 1 minuto a 60ºC, y 2 minutos a 72ºC,
acabando la amplificación con un mantenimiento a 72ºC durante 10
minutos adicionales. Los productos resultantes de la PCR se
purificaron usando un equipo de purificación para PCR (Qiagen), se
precipitaron en etanol, y se disolvieron en 8 \mul de TE. Después
de la adición de 1 \mul 10\times de tampón H (Takara Shuzo Co.,
Ltd.), los productos de la PCR purificados se digirieron con EcoR I
y BamH I (0,5 \mul, 10U de cada) a 37ºC durante 2 horas. Los
productos digeridos se electroforaron en geles de agarosa al 1%,
para cortar una banda de aproximadamente 700 p.b. Esta banda se
extrajo y purificó usando un equipo de extracción de gel (Qiagen),
se precipitó en etanol, y se disolvió en 5 \mul de TE. De forma
similar, se digirió 1 \mug de pUC 19 (Takara Shuzo Co., Ltd.) con
EcoR I y BamH I, se precipitó en etanol, y se disolvió en 5 \mul
de TE. La banda (2 \mul) y el pUC 19 (1 \mul) obtenidos de este
modo se mezclaron e hicieron reaccionar con 1 \mul de ligasa de
ADN de T4 (Life Technologies Oriental, Inc.) en 4 \mul de agua
destilada y 2 \mul 5 \times T4 de tampón de ligada de ADN, a
16ºC, durante 2 horas. La mezcla de reacción se transformó entonces
en células competentes de la cepa JM109 de E. coli (Takara
Shuzo Co., Ltd.), las cuales se habían fundido sobre hielo, y se
incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Después de una incubación
adicional durante 1 minuto a 42ºC y a continuación durante 25
minutos sobre hielo, las células se mantuvieron adicionalmente a
37ºC en 500 \mul de medio SOC (Life Technologies Oriental Inc.)
añadidos a la misma. Las células transformadas (200 \mul) se
inocularon sobre placas de LBA-Amp y se cultivaron
durante la noche a 37ºC. Se recogieron seis colonias de las colonias
resultantes, cada una de las cuales se inoculó en 3 ml de medio
LB-Amp, y se rayaron sobre una placa de
LBA-Amp, seguida por cultivo a 37ºC. De forma
subsiguiente, las células cultivadas en cada cultivo celular se
suspendieron en agua destilada y se sometieron a PCR de colonias en
las condiciones descritas más arriba. Los productos de la PCR
resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa,
confirmándose que cada colonia es portadora de gen insertado del
receptor de la EPO. Las células de E. coli se recogieron
mediante centrifugación a 2000 r.p.m. durante 15 minutos (Hitachi
05PR22) a partir de cada cultivo celular en LB-Amp.
Se usó un equipo de plásmido QIAprep-spin (Qiagen)
para recolectar los plásmidos en 100 \mul de TE. Cada solución de
plásmido se analizó mediante secuenciación cíclica en un
secuenciador de ADN modelo ABI373A (Perkin-Elmer)
usando una equipo de secuenciación cíclica
(Perkin-Elmer), los cebadores 1, 2, 3 y 4, y el
cebador M13(-21) (Perkin-Elmer) o M13RV (Takara
Shuzo Co., Ltd.). La solución de plásmido preparada a partir de un
clon que tiene la secuencia diana que codifica el receptor soluble
de la EPO se digirió con EcoR I y BamH I ne las condiciones
descritas más arriba, seguidas por la extracción y purificación. El
plásmido digerido se ligó a pCHO1, el cual se había digerido y
purificado de forma similar, y a continuación se transformó en
células competentes de la cepa JM109 de E. coli en las
condiciones descritas más arriba. De forma similar, se preparó una
solución de plásmido y se digirió con EcoR I y BamH I, y a
continuación se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa,
obteniéndose de ese modo un plásmido de expresión pCHO/EpoR2 para el
receptor soluble humano de la EPO, el cual lleva insertado el gen
del receptor soluble de la EPO.
2) A continuación, se preparó la línea celular
CHO que expresa los receptores solubles de la EPO.
Se mezcló una solución del plásmido pCHO/EpoR2
(30 \mul) con 4 \mul de 10 \times Tampón K (Takara Shuzo Co.,
Ltd.), 4 \mul de solución de BSA al 1%, y 2 \mul de Pvu I, y se
incubó durante la noche a 37ºC. Después de la adición de 50 \mul
de TE y 100 \mul de fenol saturado de TE, se centrifugó la
solución a 14.000 r.p.m. durante 1 minuto (MRX-150,
Tomy Seiko Co., Ltd.) para recuperar una fase acuosa. Esta fase
acuosa se mezcló con 100 \mul de cloroformo añadidos a la misma, y
se centrifugó a 14.000 r.p.m. durante 1 minuto
(MRX-150, Tomy Seiko Co., Ltd.) para recuperar una
fase acuosa, seguida por precipitación en etanol. Los productos
precipitados se disolvieron en 20 \mul de TE estéril con objeto de
medir su absorbancia a 260 nm para medir su concentración. Se
suspendieron diez microlitros de Lipofect AMINE (Life Technologies
Oriental Inc.) y 3 \mug de solución de plásmido digerido con Puv
I, en 0,3 ml de medio \alpha-MEM, seguida por
incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de
lavar con \alpha-MEM, las células CHO cultivadas
hasta el 70% de confluencia en frascos 25T (Becton Dickinson &
Co.) se cultivaron en 2,4 ml de \alpha-MEM en
presencia de la mezcla Lipofect AMINE-plásmido, a
37ºC, bajo 5% de CO_{2}, durante 8 horas. Se descartó el
sobrenadante, y se mantuvieron las células durante la noche en 5 ml
de \alpha-MEM suplementado con un 10% de suero
fetal bovino (FCS). Se descartó de nuevo el sobrenadante, y se
inició un cultivo celular en 5 ml de \alpha-MEM
suplementado con un 10% de FCS (libre de ácido nucleico, medio
selectivo). El medio selectivo se cambió cada 2-4
días. Después de subcultivar una vez en frascos 75T, se sometieron
las células a dilución limitada en cinco placas
96-1/2 (Corning), de tal forma que las células se
diluyeron hasta 0,1 células por pocillo. Dos semanas más tarde, se
observó cada pocillo mediante un microscopio invertido para
confirmar la proliferación de 89 clones. Después de lavar con PBS de
Dulbecco, se recolectaron las células mediante tratamiento con una
solución de tripsina-EDTA. Las células recolectadas
se cultivaron adicionalmente en placas de 24 pocillos hasta su
confluencia. El cultivo de células se continuó durante 4 días
después de cambiar el medio para obtener el sobrenadante del
cultivo. Los receptores solubles de EPO se detectaron mediante el
procedimiento de transferencia Western, usando anticuerpos
anti-FLAB M2 como anticuerpos primarios,
obteniéndose de ese modo un clon c165 que expresaba los receptores
solubles de la EPO. El clon c165 se cultivó en medio selectivo que
contenía MTX 20 nM, seguido por dilución limitada, obteniéndose de
ese modo 26 clones.
Los receptores solubles de EPO en el sobrenadante
de los cultivos se detectaron mediante el procedimiento de
transferencia Western, usando anticuerpos anti-FLAG
M2 o anticuerpos anti-receptor de la EPO (R&D
Systems) como anticuerpos primarios, obteniéndose de ese modo una
línea celular de CHO, EpoR/CHO c165-19, que expresa
los receptores solubles de la EPO.
El sobrenadante del cultivo de células CHO que
expresan el sEpo-R se filtró (tamaño de poro: 5
\mum, Fuji Photo Film Co., Ltd.), y a continuación se pasó a
través de un filtro SARTOPURE PP (Sartorius) y de un filtro
SARTOBRAN P (tamaño de poro: 0,45 \pm 0,2 \mum, Sartorius) para
retirar los restos celulares.
Se añadió tampón
Bis-Tris-HCl al filtrado resultante
hasta 20 mM, tampón que se había preparado disolviendo
Bis-Tris en agua y ajustando el pH a 6,0 con HCl.
Este filtrado se aplicó entonces, a una velocidad de flujo de
4-5 ml/min, a una columna Q Sepharose Fast Flow
(volumen de lecho: 500 ml) equilibrada con tampón
Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6,0). Esta
columna se lavó con tampón
Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6,0) que
contenía NaCl 0,5 M, a una velocidad de 5-6 ml/min.
Se añadió tampón Tris-HCl a la fracción resultante
hasta 50 mM, tampón que se había preparado disolviendo Tris en agua
y ajustando el pH a 7,3 con HCl. Esta fracción se aplicó entonces, a
una velocidad de flujo de 1 ml/min, a una columna de afinidad
anti-FLAG M2 (volumen de lecho: 10 ml, Eastman
Kodak, Co.) equilibrada con solución de TBS (Takara Shuzo Co.,
Ltd.).
Las proteínas adsorbidas sobre la columna de
afinidad anti-FLAG M2 se eluyeron con tampón
glicina-HCl 0,1 M (pH 3,5) y se ajustaron a pH
neutro añadiendo aproximadamente 1/10 volúmenes de tampón
Tris-HCl 1 M (pH 8,0), seguidos por HPLC en fase
inversa usando una columna Vydac Protein C4 (Vydac). Es decir, las
proteínas se adsorbieron a un columna Vydac Protein C4 equilibrada
con una solución de ácido trifluoroacético al 0,1% que contenía un
20% de acetonitrilo, y a continuación se eluyó con un gradiente
lineal de acetonitrilo hasta el 80% a lo largo de 60 minutos. La
elución usando esta técnica de HPLC resultó en un único pico de
elución, obteniéndose de ese modo sEpoR purificado.
El sEpoR purificado del Ejemplo 3 se sometió a
sustitución del solvente con tampón bicarbonato sódico 0,1 M (pH
8,6). A saber, el sEpoR se disolvió en tampón bicarbonato sódico 0,1
M (pH 8,6) después de secarlo en un concentrador centrífugo bajo
presión reducida, o se aplicó a una columna Fast Desalting
(Pharmacia) equilibrada con tampón bicarbonato sódico 0,1 M (pH
8,6).
Se añadió un reactivo biotinilado (Amersham) a
las proteínas que se iban a marcar, en una cantidad de 40 \mul por
mg de proteína, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante
una hora mientras se agitaba. La mezcla de reacción se aplicó a una
columna Bio-Gel P-6
(Bio-Rad Laboratories) equilibrada con solución de
PBS que contenía Tween 20 al 0,02% para retirar los reactivos sin
reaccionar, obteniéndose de ese modo una fracción de proteína que
contenía el sEpoR biotinilado.
El sEpoR purificado del Ejemplo 3 se sometió a
sustitución del solvente con tampón bicarbonato sódico 0,1 M (pH
8,6). A saber, el sEpoR se disolvió en tampón bicarbonato sódico 0,1
M (pH 8,6) después de secarlo en un concentrador centrífugo bajo
presión reducida, o se aplicó a una columna Fast Desalting
(Pharmacia) equilibrada con tampón bicarbonato sódico 0,1 M (pH
8,6).
Un vial que contenía
^{125}I-reactivo de Bolton y Hunter (Amersham) se
expuso a una corriente de nitrógeno gas para evaporar el solvente
contenido en él. Se añadieron quince microlitros de solución de
sEpoR (aproximadamente 1 mg/ml) a este vial y se dejaron reaccionar
con el reactivo, sobre hielo, durante 30 minutos, mientras se
agitaba cada 5 minutos. La reacción continuó durante 5 minutos
adicionales sobre hielo después de la adición de 500 \mul de
tampón bicarbonato sódico 0,1 M (pH 8,6) que contenía glicina 0,2
M.
La mezcla de reacción se aplicó a una columna
Sephadex G-25 (Pharmacia) equilibrada con tampón
fosfato 0,1 M (pH 7,2) que contenía un 0,25% de gelatina para
retirar reactivos sin reaccionar, obteniéndose de ese modo una
fracción de proteína que contenía sEpoR marcado con ^{125}I.
Se disolvieron 50 \mug de cuentas de SPA unidas
a estreptoavidina (Amersham), de sEpoR biotinilado, y
aproximadamente 150.000 c.p.m. de sEpoR marcado con ^{125}I, en
100 \mul de tampón de ensayo (PBS(-) de Dulbecco, conteniendo 0,1%
de BSA, y EDTA 5 mM) para preparar una solución de ensayo. Mientras
tanto, se prepararon dímeros de receptor de la
EPO-péptido unidor solicitando al Peptide Institute,
Inc. que los sintetizara tal como se describe en Science,
273:458-463 (1996); Blood, 88(10):542a
(1996); Science, 276:1696-1699 (1997). Los
dímeros de receptor de la EPO-péptido unidor se
mezclaron e hicieron reaccionar con la solución de ensayo a
temperatura ambiente durante 12 horas, seguidas por la detección
usando Microbeta (Pharmacia).
Las señales cuya intensidad depende de la
concentración del dímero EMP 1 se generaron a partir de las cuentas
del SPA, resultando en la detección de la dimerización del receptor
de la EPO (Figura 1).
La presente invención proporciona un
procedimiento para examinar sustitutos de sustancias
fisiológicamente activas, el cual usa la multimerización del
receptor como un indicador.
<110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para examinar
sustancias capaces de promover la oligomerización de moléculas de
proteína de receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DCH/FP5888359
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 99913652.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-04-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/JP99/01965
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-04-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-102325
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-04-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagctgctg acccagctgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcttgag tctgcactgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgaattct gtatcatgga ccacctcgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttaagcttg atccctgatc atctgcagc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttaagaat tccaccatgg accacctcgg ggcgt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatcctta tttatcgtca tcgtctttgt agtcgctagg cgtcagcagc gaca
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskiptgaattcagt gtgtgctgag caacct
\hfill26
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<210> 8
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: ADN sintético
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatccgct ttgctctcga actt
\hfill24
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<210> 9
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<211> 42
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Disulfuro
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<222> (6)..(15)
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<220>
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<221> Disulfuro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)..(37)
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (22)
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<223> bAla
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<400> 9
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Claims (29)
1. Procedimiento para cribar sustancias que
promueven la oligomerización de moléculas de proteína de receptor, o
de fragmentos peptídicos de las mismas, el cual comprende determinar
si las moléculas de proteína de receptor, o los fragmentos
peptídicos de las mismas, están oligomerizadas cuando se ponen en
contacto con una sustancia de ensayo.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde
las moléculas de proteína de receptor, o los fragmentos peptídicos
de las mismas, se ponen en contacto con la sustancia de ensayo en un
entorno libre de células.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, el
cual comprende medir señales generadas por la oligomerización de las
moléculas de proteína de receptor, o de los fragmentos peptídicos de
las mismas, con objeto de determinar si las moléculas de proteína de
receptor, o los fragmentos peptídicos de las mismas, están
oligomerizadas.
4. Procedimiento de la reivindicación 3, en donde
la señal se selecciona de entre el grupo que consiste en señal de
centelleo, señal de quimioluminiscencia, señal de fluorescencia,
señal de absorción, señal de radiación ionizante, señal de
resonancia magnética nuclear, y señal de resonancia de plasmón
superficial.
5. Procedimiento de la reivindicación 3, en donde
al menos una de las moléculas de proteína del receptor, o de los
fragmentos peptídicos de las mismas, está marcada.
6. Procedimiento de la reivindicación 5, en donde
la marca se selecciona de entre el grupo que consiste en
radioisótopo, fluoróforo, enzima, biotina, avidina, agente de
centelleo, y combinaciones de los mismos.
7. Procedimiento de la reivindicación 6, en donde
al menos una de las moléculas de proteína del receptor, o de los
fragmentos peptídicos de la misma, está marcado radiactivamente,
mientras que al menos una de las otras está unida sobre la
superficie de cuentas que contienen agente de centelleo.
8. Procedimiento de la reivindicación 7, el cual
comprende:
- añadir la sustancia de ensayo a una solución acuosa que comprende los receptores, o fragmentos peptídicos de los mismos, marcados radiactivamente, así como los receptores, o fragmentos peptídicos de los mismos, unidos a cuentas que contienen agente de centelleo; y
- medir las señales de centelleo generadas para determinar si los receptores, o fragmentos peptídicos de los mismos, están oligomerizados.
9. Procedimiento de la reivindicación 1, en donde
el oligómero de las moléculas de proteína del receptor, o de los
fragmentos peptídicos de las mismas, se forma en una solución.
10. Procedimiento de la reivindicación 1, en
donde el oligómero de las moléculas de proteína del receptor, o de
los fragmentos peptídicos de las mismas, se forma sobre una
superficie sólida.
11. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde el receptor es un receptor de
citocina.
12. Procedimiento de la reivindicación 11, en
donde el receptor de citocina se selecciona de entre el grupo que
consiste en el receptor de un factor hematopoyético, el receptor de
una linfocina, el receptor de un factor de crecimiento y el receptor
de un factor inhibidor de la diferenciación.
13. Procedimiento de la reivindicación 11, en
donde el receptor de citocina se selecciona de entre el grupo que
consiste en el receptor de la eritropoyetina (EPO), el receptor de
la trombopoyetina (TPO), el receptor del factor estimulador de las
colonias de granulocitos (G-CSF), el receptor del
factor estimulador de las colonias de macrófagos
(M-CSF), el receptor del factor estimulador de las
colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF), el receptor del factor de la necrosis del
tumor (TNF), el receptor de la interleucina-1
(IL-1), el receptor de la
interleucina-2 (IL-2), el receptor
de la interleucina-3 (IL-3), el
receptor de la interleucina-4
(IL-4), el receptor de la
interleucina-5 (IL-5), el receptor
de la interleucina-6(IL-6),
el receptor de la interleucina-7
(IL-7), el receptor de la
interleucina-9 (IL-9), el receptor
de la interleucina-10 (IL-10), el
receptor de la interleucina-11
(IL-11), el receptor de la
interleucina-12 (IL-12), el receptor
de la interleucina-13 (IL-13), el
receptor de la interleucina-15
(IL-15), el receptor del
interferón-\alpha (INF-\alpha),
el receptor del interferón-\beta
(INF-\beta), el receptor del
interferón-\gamma (INF-\gamma),
el receptor de la hormona del crecimiento (GH), el receptor de la
insulina, el receptor del factor de células madre (SCF), el receptor
del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor
del factor de crecimiento epidérmico (EGF), el receptor del factor
de crecimiento del nervio (NGF), el receptor del factor de
crecimiento de fibroblastos (FGC), el receptor del factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el receptor del
factor-\beta de crecimiento transformante
(TGF-\beta), el receptor del factor inhibidor de
la leucemia (LIF), el receptor del factor neurotrófico ciliar
(CNTF), el receptor de la oncostatina M (OSM), y el receptor del
tipo Notch.
14. Procedimiento de la reivindicación 11, en
donde la molécula de proteína del receptor es una subunidad de
receptor de citocina.
15. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde el fragmento peptídico de la
molécula de proteína del receptor comprende una región soluble del
receptor.
16. Procedimiento de la reivindicación 15, en
donde el fragmento peptídico de la molécula de proteína del receptor
comprende una región extracelular del receptor.
17. Procedimiento de la reivindicación 15, en
donde el fragmento peptídico de la molécula de proteína del receptor
comprende al menos un sitio de unión de ligando del receptor.
18. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde el oligómero es un
homooligómero.
19. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde el oligómero es un
heterooligómero.
20. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en donde el oligómero es un dímero.
21. Procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en donde la sustancia a ser cribada es un
nuevo sustituto de una sustancia fisiológicamente activa.
22. Procedimiento para cribar sustancias que
promueven la dimerización de moléculas de proteína del receptor de
la eritropoyetina, o de fragmentos peptídicos de las mismas, el cual
comprende:
- añadir una sustancia de ensayo a una solución acuosa que comprende receptores de la eritropoyetina marcados con ^{125}I, o fragmentos peptídico de los mismos, así como receptores de la eritropoyetina, o fragmentos peptídicos de los mismos, unidos a la superficie de cuentas de silicato de itrio o poliviniltolueno que contienen agente de centelleo; y
- medir las señales de centelleo generadas para determinar si los receptores de la eritropoyetina, o fragmentos peptídicos de los mismos, se han dimerizado.
23. Procedimiento para cribar sustancias que
inhiben la oligomerización de las moléculas de proteína del
receptor, o de fragmentos peptídicos de las mismas, el cual
comprende determinar si la oligomerización de las moléculas de
proteína del receptor o fragmentos peptídicos del mismo, en
presencia de una sustancia promotora de la oligomerización, es
inhibida por contacto con una sustancia de ensayo.
24. Procedimiento de la reivindicación 23, en
donde la sustancia promotora de la oligomerización tiene actividad
fisiológica.
25. Procedimiento de la reivindicación 24, en
donde la sustancia que inhibe la oligomerización de las moléculas de
proteína del receptor, o de fragmentos peptídicos de las mismas,
tiene la capacidad de inhibir la actividad fisiológica de la
sustancia promotora de la oligomerización.
26. Procedimiento de la reivindicación 23, en
donde la sustancia promotora de la oligomerización es la
eritropoyetina, y el receptor es un receptor de eritropoyetina.
27. Equipo de ensayo para cribar sustancias que
inhiben la oligomerización de las moléculas de proteína del
receptor, o de fragmentos peptídicos de las mismas, el cual
comprende una sustancia promotora de la oligomerización, las
moléculas de proteína del receptor, o fragmentos peptídicos de las
mismas, y un tampón.
28. Equipo de ensayo de la reivindicación 27, en
donde la sustancia promotora de la oligomerización es la
eritropoyetina, la molécula de proteína del receptor, o fragmento
peptídico de la misma, es una molécula de proteína del receptor de
la eritropoyetina, o un fragmento peptídico de la misma, y el tampón
es una solución salina tamponada con fosfato.
29. Utilización de moléculas de proteína de
receptor, o fragmentos peptídicos de las mismas, para determinar si
un sustancia de ensayo promueve la oligomerización de las moléculas
de proteína del receptor, o de fragmentos peptídicos de las
mismas.
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