ES2247987T3 - Bacterias corineformes productoras de l-lisina, y procedimiento para la preparacion de lisina. - Google Patents
Bacterias corineformes productoras de l-lisina, y procedimiento para la preparacion de lisina.Info
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Abstract
Bacterias corineformes que producen L-lisina, con un gen de pyc reforzado, en las que adicionalmente se refuerza el gen de dapA.
Description
Bacterias corineformes productoras de
L-lisina, y procedimiento para la preparación de
lisina.
El invento se refiere a cepas de bacterias
corineformes productoras de L-lisina, con un gen de
pyc reforzado (gen de piruvato carboxilasa), en las que
adicionalmente el gen de dapA se sobreexpresa en particular de un
modo aumentado, y a un procedimiento para la preparación de
L-lisina.
La L-lisina es un
L-aminoácido comercialmente importante, que
encuentra aplicación en particular como aditivo para piensos en la
alimentación de animales. El consumo está subiendo constantemente en
los últimos años.
La L-lisina se prepara por
fermentación con cepas de bacterias corineformes productoras de
L-lisina, en particular con Corynebacterium
glutamicum. A causa de la gran importancia de este producto, se
está trabajando constantemente en la mejoría del procedimiento de
preparación. Las mejoras en el procedimiento pueden implicar medidas
técnicas de fermentación, tales como p.ej. la agitación y el
abastecimiento con oxígeno, o la composición de los medios
nutritivos tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la
fermentación, o el tratamiento para dar la forma del producto
mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones o las
propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo
propiamente dicho.
Con el fin de mejorar las propiedades de
rendimiento de estos microorganismos, se utilizan métodos de
mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera, se
obtienen unas cepas que son resistentes frente a antimetabolitos
tales como p.ej.
S-(2-amino-etil)-cisteína
o son auxótrofas para aminoácidos tales como p.ej.
L-leucina, y producen L-lisina.
Desde hace algunos años se están empleando
asimismo ciertos métodos de la tecnología de ADN recombinante con el
fin de mejorar las cepas de Corynebacterium glutamicum que
producen L-lisina, en los que genes individuales de
biosíntesis se amplifican y se investiga la repercusión sobre la
producción de L-lisina.
Así, en el documento de solicitud de patente
europea EP-A-0.088.166 se informa
acerca del aumento del rendimiento después de una amplificación de
un fragmento de ADN que confiere resistencia contra la
aminoetil-cisteína. En el documento de patente
europea EP-B-0.387.527 se informa
acerca del aumento del rendimiento después de una amplificación de
un alelo de lysC, que codifica una asparto-cinasa
resistente a la retroacción (en inglés "feed back"). En el
documento EP-B-0.197.335 se informa
acerca del aumento del rendimiento después de una amplificación del
gen de dapA que codifica la dihidrodipicolinto - sintasa. En el
documento EP-A-0.219.027 se informa
acerca del aumento del rendimiento después de una amplificación del
gen de asd que codifica la aspartatosemialdehído - deshidrogenasa.
Pisabarro y colaboradores (Journal of Bacteriology, 175(9),
2743-2749, (1993)) describen el gen de dapB que
codifica la dihidrodipicolinato - reductasa.
Además, se investigó también el efecto de la
amplificación de genes del metabolismo primario sobre la producción
de L-lisina. Así, en el documento
EP-A-0.219.027 se informa acerca del
aumento del rendimiento después de una amplificación del gen de aspC
que codifica la aspartato - aminotransferasa. En los documentos
EP-B-0.143.195 y
EP-B-0.358.940 se informa acerca del
aumento del rendimiento después de amplificación del gen de ppc que
codifica la fosfoenolpiruvato - carboxilasa. En el documento de
publicación de solicitud de patente alemana
DE-A-198.31.609 se informa acerca
del aumento del rendimiento después de una amplificación del gen de
pyc que codifica la piruvato - carboxilasa. A la reacción
anaplerótica, catalizada por la piruvato - carboxilasa, le
corresponde una importancia especial en comparación con la reacción
catalizada por la fosfoenolpiruvato - carboxilasa. Así, Wendisch y
colaboradores (en FEMS Microbiology Letters 112,
269-274 (1993)), mostraron que la supresión del gen
de ppc no perjudicaba a la producción de lisina por la cepa
MH20-22B.
Finalmente, en el documento
DE-A-195.48.222 se describe que una
actividad aumentada del vehículo de exportación de
L-lisina, codificado por el gen de lysE, favorece la
producción de lisina.
Junto a estos enfoques para la amplificación de
un gen individual, se siguieron también unos enfoques para
amplificar simultáneamente dos o más genes, y con ello mejorar la
producción de L-lisina en bacterias corineformes.
Así, en el documento de
DE-A-38.23.451 se informa acerca del
aumento del rendimiento después de una simultánea amplificación del
gen de asd y del gen de dapA de Escherichia coli. A partir
del documento DE-A-39.43.117 se
conoce el aumento del rendimiento después de una amplificación
simultánea de un alelo de lysC codificador, resistente a la
retroacción, y del gen de dapA. En el documento
EP-A-0.841.395 se informa en
particular acerca del aumento del rendimiento en el caso de una
amplificación simultánea de un alelo de lysC, codificador,
resistente a la retroacción y del gen de dapB; mediante una
amplificación adicional de los genes de dapB, lysA y ddh se pudieron
conseguir otras mejoras adicionales. En el documento
EP-A-0.854.189 se informa sobre el
aumento del rendimiento en el caso de una amplificación simultánea
de un alelo de lysC, codificador, resistente a la retroacción, del
gen de dapA, del gen de dapB, del gen de lysA y del gen de aspC. En
el documento EP-A-0.857.784 se
informa en particular acerca del aumento del rendimiento en el caso
de una amplificación simultánea de un alelo de lysC, codificador,
resistente a la retroacción, y del gen de lysA; mediante una
amplificación adicional del gen de ppc se pudo conseguir una mejoría
adicional.
A partir del gran número de los procedimientos
descritos en el estado de la técnica se pone de manifiesto que
existe una necesidad para el desarrollo de nuevos enfoques y la
mejoría de los procedimientos existentes para la producción de
lisina con bacterias corineformes.
Los autores del invento se han establecido como
misión la de poner a disposición nuevas cepas de bacterias
corineformes productoras de L-lisina, y
procedimientos para la preparación de L-lisina.
La L-lisina es un
L-aminoácido comercialmente importante, que
encuentra utilización en particular como aditivo para piensos en la
alimentación de animales.
Cuando en el texto que sigue se mencionan
L-lisina o lisina, con estos términos se entiende no
solamente la base sino también las correspondientes sales, tales
como p.ej. el hidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina.
Son objeto del invento unas cepas de bacterias
corineformes productoras de L-lisina con un gen de
pyc (gen de piruvato carboxilasa) reforzado, que se caracterizan
porque adicionalmente se refuerza, en particular se sobreexpresa, el
gen de dapA.
Un objeto adicional del invento son las
mutaciones MC20 y MA16 del promotor de dapA, representadas en
SEQ-ID-No. 5 y
SEQ-ID-No. 6, depositadas en las
cepas DSM 12868 y DSM 12867.
El concepto de "refuerzo" describe en este
contexto el aumento de la actividad intracelular en un
microorganismo de una o varias enzimas, que son codificadas por los
correspondientes ADN, mediante el recurso de que se aumenta el
número de copias del (de los) genes, se utiliza un promotor fuerte o
se utiliza un gen, que codifica una correspondiente enzima con una
alta actividad, y eventualmente se combinan estas medidas.
Un procedimiento para la preparación de
L-lisina, mediando utilización de las bacterias
antes descritas, es asimismo objeto del invento.
Los microorganismos, que son objeto del presente
invento, pueden preparar L-lisina a partir de
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidones,
celulosa, o a partir de glicerol y etanol, en particular a partir de
glucosa o sacarosa. Se trata de bacterias corineformes en particular
del género Corynebacterium. En el caso del género
Corynebacterium ha de mencionarse en particular la especie
Corynebacterium glutamicum, que es conocida en el sector
especializado por su capacidad de producir aminoácidos. A esta
especie pertenecen cepas de tipo salvaje, tales como p.ej.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium
flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola
ATCC17965 y cepas y respectivamente mutantes que se derivan de
ellas. Ejemplos de mutantes de bacterias corineformes que producen
L-lisina, son por ejemplo
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentun
FERM-P 1712
Brevibacterium flavum
FERM-P 6463
Brevibacterium flavum
FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum DSM 5714
Corynebacterium glutamicum DSM 12866
Los autores del invento descubrieron que una
expresión reforzada del gen de dapA además de la del gen de pyc,
mejora aún más la producción de L-lisina.
Con el fin de conseguir un refuerzo (una
sobreexpresión) se aumenta p.ej. el número de copias de los
correspondientes genes o se someten a mutación la región de promotor
y la de regulación o el sitio de unión a ribosomas, que se encuentra
situado secuencia arriba del gen estructural. De igual manera,
actúan ciertas casetes de expresión, que se incorporan secuencia
arriba del gen estructural. Mediante promotores inducibles es
posible adicionalmente aumentar la expresión en el transcurso de la
formación de L-lisina por fermentación. Mediante
medidas para prolongar la duración de la vida de los ARNm (ARN
mensajeros) se mejora asimismo la expresión. Además, mediante
evitación de la descomposición de la proteína enzimática, se
refuerza asimismo la actividad enzimática. Los genes o las
construcciones (estructuras artificiales) de genes se presentan en
tal caso o bien en plásmidos (vectores pendulantes) con diverso
número de copias, o se integran y amplifican en el cromosoma.
Alternativamente, se puede conseguir además una sobreexpresión de
los correspondientes genes mediante una modificación de la
composición del medio y la realización de la cultivación.
Instrucciones acerca de esto las encuentra un
experto en la especialidad, entre otras citas, en la de Martin y
colaboradores (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), de
Guerrero y colaboradores (Gene 138, 35-41 (1994)),
de Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430
(1988)), de Eikmanns y colaboradores (Gene 102,
93-98 (1991)), en el documento de patente europea
EPS 0.472.869, en la patente de los EE.UU. 4.601.893, en la cita de
Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991),
en la de Reinscheid y colaboradores (Applied and Environmental
Microbiology 60, 126-132 (1994)), en la de LaBarre y
colaboradores (Journal of Bacteriology 175,
1001-1007 (1993)), en el documento de solicitud de
patente internacional WO 96/15246, en la cita de Malumbres y
colaboradores (Gene 134, 15-24 (1993)), en el
documento de publicación de solicitud de patente japonesa
JP-A-10-229891, en
la cita de Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), o en el manual "Manual of Methods
for General Bacteriology" [Manual de métodos de bacteriología
general] de la American Society for Bacteriology [Sociedad Americana
de bacteriología] (Washington D.C., USA, 1981) y en conocidos libros
de texto de genética y biología molecular.
Los genes de Corynebacterium glutamicum,
utilizados conforme al invento, han sido descritos y se pueden
aislar, o bien preparar o sintetizar, con métodos conocidos.
Métodos acerca de la mutagénesis específica para
un sitio se describen entre otras citas, en la de Higuchi y
colaboradores (Nucleic Acids Research 16: 7351-7367
(1988)) o en la de Silver y colaboradores en el manual de Innis,
Glefand y Sninsky (coordinadores de edición): PCR Strategies
[Estrategias de reacción en cadena de la polimerasas] (Academic
Press, Londres, Reino Unido, 1995).
Para el aislamiento de un gen interesante de
C. glutamicum, se establece en primer lugar un banco de genes
de este microorganismo en el seno de p.ej. E. coli o
eventualmente también en el de C. glutamicum. El
establecimiento de bancos de genes se describe en libros de texto y
manuales conocidos en términos generales. Como ejemplo de esto se
han de mencionar el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone,
Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes y clones, una
introducción en la tecnología genética] (editorial Chemie, Weinheim,
Alemania, 1990) o el manual de Sambrook y colaboradores: Molecular
Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de
laboratorio] (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bathe y
colaboradores (en Molecular and General Genetics [Genética molecular
y general], 252: 255-265, 1996) describen un banco
de genes de C. glutamicum ATCC13032, que se había establecido
con ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl y colaboradores, 1987,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA [Actas de la
Academia Nacional de Ciencias de los EE.UU.], 84:
2160-2164) en la cepa K-12 NM554 de
E. coli (Raleigh y colaboradores, 1988, Nucleic Acids
Research [Investigación de ácidos nucleicos] 16:
1563-1575). Börmann y colaboradores (Molecular
Microbiology [Microbiología Molecular] 6(3),
317-326)), a su vez, describen un banco de genes de
C. glutamicum ATCC13032 mediando utilización del cósmido
pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298 (1980)).
Acerca de la preparación de un banco de genes de C.
glutamicum en E. coli, se pueden utilizar también
plásmidos tales como el pBR322 (Bolivar, Life Sciences [Ciencias de
la vida], 25, 807-818 (1979)) o pUC19 (Norrander y
colaboradores, 1983, Gene [Genes], 26: 101-106). De
igual manera, se pueden utilizar también vectores pendulantes tales
como p.ej. el pJC1 (Cremer y colaboradores, Molecular and General
Genetics 220, 478-480 (1990)) o el pEC5 (Eikmanns y
colaboradores, 1991, Gene 102, 93-98), que se
replican en E. coli y C. glutamicum. Como anfitrionas
son apropiadas en especial las cepas que están con defecto de
restricción y/o recombinación. Un ejemplo de ellas es la cepa
DH5\alphamcr de E. coli, que fue descrita por Grant y
colaboradores (Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
87 (1990) 4645-4649). Otro ejemplo de ellas son las
cepas RM3 y RM4 de C. glutamicum con defecto de restricción,
que se describen en la cita de Schäfer y colaboradores (Applied and
Environmental Microbiology [Microbiología aplicada y ambiental]
60(2), 756-759, (1994)).
El banco de genes es transformado a continuación
en una cepa indicadora por medio de una transformación (Hanahan,
Journal of Molecular Biology [Revista de biología molecular] 166,
557-580, 1983) o de una electroporación (Tauch y
colaboradores, 1994, FEMS Microbiological Letters [Cartas
microbiológicas de FEMS], 123: 343-347). La cepa
indicadora se distingue por el hecho de que posee una mutación en el
gen que interesa, la cual provoca un fenotipo detectable, p.ej. una
auxotrofía. Las cepas indicadoras, o bien las mutantes, son
obtenibles a partir de fuentes publicadas o de colecciones de cepas
tales como p.ej. la del Genetic Stock Center [Centro de
Almacenamiento Genético] de la Universidad de Yale (New Haven,
Connecticut, EE.UU.) o eventualmente incluso se preparan. Como
ejemplo de una cepa indicadora de este tipo se ha de mencionar la
cepa RDA8 de E. coli (Richaud y colaboradores C. R. Acad.
Sci. París Ser. III, 293: 507-512 (1981)), que lleva
una mutación (dapA::Mu) en el gen de dapA.
Después de una transformación de la cepa
indicadora con un plásmido recombinante, que es portador del gen
interesante, y de una expresión del gen correspondiente, la cepa
indicadora es prototrofa en lo que se refiere a la correspondiente
propiedad. Si el fragmento de ADN clonado confiere resistencia p.ej.
contra un antimetabolito tal como
S-(2-amino-etil)-cisteína,
la identificación de la cepa indicadora que es portadora del
plásmido recombinante puede efectuarse por selección en medios
nutritivos suplementados correspondientemente.
En el caso de una secuencia de nucleótidos,
conocida o accesible en un banco de datos, de la región del gen que
interesa, el ADN cromosomal se puede aislar con métodos conocidos,
tal como se describen p.ej. en la cita de Eikmanns y colaboradores
(Microbiology 140, 1817-1828, (1994)), y el gen
correspondiente se sintetiza mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) mediando utilización de apropiados cebadores, y se
clona en un apropiado vector plásmido tal como p.ej. el pCRIITOPO de
la entidad Invitrogen (Groningen, Holanda). Una recopilación acerca
de la metodología de PCR puede tomarse del libro de Newton y Graham:
PCR (Spektrum Akademischer Verlag [Editorial Académica Spectrum],
Heidelberg, Alemania, 1994).
Bancos de datos, públicamente accesibles, para
secuencias de nucleótidos son, por ejemplo, los de los European
Molecular Biologies Laboratories [Laboratorios Europeos de Biología
Molecular] (EMBL, Heidelberg, Alemania) o los del National Center
for Biotechnology Information [Centro Nacional de Información sobre
Biotecnología] (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.).
El aislamiento y la clonación del gen de pyc de
C. glutamicum ATCC13032 se describen en el documento
DE-A-198.31.609 y en la cita de
Koffas y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 50,
346-352 (1998)). La secuencia de nucleótidos del gen
de pyc es accesible bajo el número de acceso AF038548 ó Y09548.
El aislamiento, la clonación y la secuenciación
del gen de dapA de diferentes cepas de C. glutamicum se
describen en la cita de Cremer y colaboradores (Molecular and
General Genetics 220: 478-480 (1990)), en la de
Pisabarro y colaboradores (Journal of Bacteriology 175:
2743-2749, (1993)) y en la de Bonnassie y
colaboradores (Nucleic Acids Research 18:6421 (1990). En el
documento DE-A-39.43.117 se informa
acerca del refuerzo del gen de dapA mediante el plásmido pJC23. La
secuencia de nucleótidos del gen de dapA es accesible bajo el número
de acceso X53993.
El gen obtenido de esta manera se podría entonces
incorporar, individualmente o en combinaciones apropiadas entre
otros, en vectores plásmidos tales como p.ej. el pJC1 (Cremer y
colaboradores (Molecular and General Genetics 220:
478-480 (1990)) o el pEC5 (Eikmanns y colaboradores,
1991, Gene 102, 93-98), e incorporar y llevar a
expresión en deseadas cepas de bacterias corineformes, p.ej. la cepa
MH20-22B (Schrumpf y colaboradores, Applied
Microbiology and Biotechnology 37: 566-571 (1992))
por medio de una transformación tal como p.ej. se señala en la cita
de Thierbach y colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology
29, 356-362 (1988)) o por electroporación tal como
p.ej. en la cita de Dunican y Shivnan (Bio/Technology 7,
1067-1070 (1989)). Es igualmente posible transformar
la cepa que se ha de seleccionar con dos vectores plásmidos, que en
cada caso contienen el correspondiente gen o los correspondientes
genes, y con ello conseguir la ventajosa expresión reforzada
simultáneamente de dos o más genes, de manera adicional al conocido
refuerzo del gen de pyc.
Un ejemplo de una cepa de este tipo es
- \bullet
- la cepa MH20-22B/pJC23/pEC7pyc en la que se expresan de manera reforzada simultáneamente el gen de pyc y el gen de dapA.
Los microorganismos producidos conforme al
invento se pueden cultivar de un modo continuo o discontinuo en el
procedimiento batch (cultivación en tandas) o en el procedimiento
fed batch (procedimiento de afluencia) o en el procedimiento
repeated fed batch (procedimiento repetitivo de afluencia) con el
fin de efectuar la producción de L-lisina. Una
recopilación acerca de conocidos métodos de cultivación se describe
en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik [técnica de procesos biológicos 1.
Introducción en la técnica de procedimientos biológicos] (editorial
Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Biorreactores y
disposiciones periféricas] (editorial Vieweg,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo, que se ha de utilizar, debe
satisfacer de manera apropiada las exigencias de los respectivos
microorganismos. Unas descripciones de medios de cultivo de
diferentes microorganismos están contenidas en el manual "Manual
of Methods for General Bacteriology" [Manual de métodos para
bacteriología general] de la American Society for Bacteriology
[Sociedad Americana para Bacteriología] (Washington D.C. EE.UU.,
1981). Como fuente de carbono se pueden utilizar azúcares e hidratos
de carbono tales como p.ej. glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa,
maltosa, melazas, almidones y celulosas, aceites y grasas tales como
p.ej. aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y
aceite de coco. Ácidos grasos tales como p.ej. ácido palmítico,
ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como p.ej.
glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como p.ej. ácido
acético. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o en
forma de una mezcla. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tales como peptonas, un
extracto de levadura, un extracto de carne, un extracto de malta,
agua de maceración de maíz, harina de haba de soja, y urea, o
compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de
amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio.
Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o en
forma de una mezcla. Como fuente de fósforo se pueden utilizar
dihidrógeno-fosfato de potasio o
hidrógeno-fosfato de dipotasio o las
correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe
contener además sales de metales tales como p.ej. sulfato de
magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, se pueden emplear hormonas somatotropas
esenciales tales como aminoácidos y vitaminas, de modo adicional a
las sustancias antes mencionadas. Las mencionadas sustancias
empleadas de partida se pueden añadir al cultivo en forma de una
tanda añadida de una sola vez, o se pueden alimentar de una manera
apropiada durante la cultivación.
Para el control del pH del cultivo, se emplean de
manera apropiada compuestos de carácter básico, tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco, o compuestos de carácter
ácido, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Para la
represión del desarrollo de espuma se pueden emplear agentes
antiespumantes tales como p.ej. ésteres poliglicólicos de ácidos
grasos. Con el fin de conservar la estabilidad de los plásmidos, se
pueden añadir al medio apropiadas sustancias con acción selectiva,
p.ej. antibióticos. Con el fin de mantener condiciones aerobias, se
incorporan en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen
oxígeno, tales como p.ej. aire. La temperatura del cultivo está
situada normalmente entre 20ºC y 45ºC y preferiblemente entre 25ºC y
40ºC. La cultivación se prosigue durante tanto tiempo hasta que se
haya formado una cantidad máxima de L-lisina. Esta
meta se alcanza normalmente en el transcurso de 10 horas hasta 160
horas.
La concentración de L-lisina
formada se puede determinar con ayuda de aparatos analizadores de
aminoácidos, mediante una cromatografía con intercambio de iones y
reacción en columnas posteriores con detección por ninhidrina, tal
como se describe en la cita de Spackmann y colaboradores (Analytical
Chemistry [Química analítica] 30, 1190 (1958)).
Los siguientes microorganismos fueron depositados
en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
[Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares] (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Convenio de Budapest:
- \bullet
- Cepa DSM5715aecD::dapA(MA16) de Corynebacterium glutamicum como DSM12867, y
- \bullet
- Cepa DSM5715aecD::dapA(MC20) de Corynebacterium glutamicum como DSM12868.
El presente invento se explica en lo sucesivo con
mayor detalle con ayuda de Ejemplos de realización.
(Que no entra dentro de este
invento)
A partir de la cepa ATCC 13032 se aisló un ADN
cromosomal con los métodos usuales (Eikmanns y colaboradores,
Microbiology 140: 1817-1828 (1994)). Con ayuda de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se aplicó un fragmento de
ADN que es portador del gen de lysE. Basándose en la secuencia del
gen de lysE, conocida para C. glutamicum (Vrljic y
colaboradores, Molecular Microbiology 22(5),
815-826 (1996)) (número de acceso X96471) se
seleccionaron los siguientes oligonucleótidos cebadores para la
PCR:
LysBam1:
5' CTC GAG AGC (GGA TCC) GCG CTG ACT CAC C 3'
LysBam2:
5' GGA GAG TAC GGC (GGA TCC) ACC GTG ACC 3'
Los cebadores expuestos fueron sintetizados por
la entidad MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción de PCR se
llevó a cabo de acuerdo con el método clásico de PCR de Innis y
colaboradores (PCR protocols. A guide to methods and applications
[Protocolos de PCR. Una guía para métodos y aplicaciones] 1990,
Academic Press). Los cebadores hacen posible la amplificación de un
fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 1,1 kb
(kilobases), que es portador del gen de lysE. Además, los cebadores
contienen la secuencia para el sitio de corte con la endonucleasa de
restricción BamHI, que está marcado por unos paréntesis en la
sucesión de nucleótidos arriba representada.
El fragmento amplificado de ADN de
aproximadamente 1,1 kb, que es portador del gen de lysE, se
identificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%,
se aisló a partir del gel y se purificó con el estuche para
extracción en gel QIAquick (número de catálogo 28704) de la entidad
Quiagen (Hilden, Alemania).
A continuación se efectuó la ligación del
fragmento mediante una ligasa de ADN de T4 de la entidad Boehringer
Mannheim (Mannheim, Alemania) en el vector pUC18 (Norrander y
colaboradores, Gene (26) 101 - 106 (1983)). Para esto, el vector
pUC18 se cortó totalmente con la endonucleasa de restricción SmaI, y
se trató con una fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase,
Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). La tanda de ligación se
transformó en el seno de la cepa DH5\alpha de E. coli
(Hanahan, En: DNA cloning. A practical approach [Clonación de ADN.
Un enfoque práctico] volumen I, IRL-Press, Oxford,
Washington D.C., EE.UU.). La selección de células portadoras del
plásmido se efectuó por siembra en placas de la tanda de
transformación sobre un agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular
cloning: a laboratory manual [Clonación molecular: un manual de
laboratorio], 2ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor N.Y.), que había sido suplementado con 50 mg/l de
ampicilina. El ADN de plásmido se aisló a partir de un
transformante, y se comprobó por tratamiento con la enzima de
restricción BamHI con una subsiguiente electroforesis en un gel de
agarosa. El plásmido fue denominado pUC18lysE.
(Que no entra dentro de este
invento)
Un ADN cromosomal se aisló, tal como se indica en
el Ejemplo 1, a partir de la cepa ATCC 13032 de Corynebacterium
glutamicum. La secuencia del gen de dapB, como tal, procedente
de Corynebacterium glutamicum, es conocida (número de acceso
X67737). Sin embargo, la secuencia publicada de ADN comprende
solamente 56 pb (pares de bases) antes del comienzo de la
traducción. Por lo tanto, se secuenció adicionalmente la región 5'
antes del comienzo de la traducción.
Para esto se llevó a cabo la secuenciación con el
plásmido pJC25 (documento EP-B 0.435.132) y mediando
utilización de un oligonucleótido cebador, que se fija en la región
de la conocida secuencia de dapB (número de acceso X67737). La
secuencia del cebador de secuenciación utilizado era:
5' GAA CGC CAA CCT TGA TTC C 3'
La secuenciación se efectuó de acuerdo con el
método de rotura de la cadena, descrito en la cita de Sanger y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (74) 5463 - 5467 (1977).
La reacción de secuenciación se llevó a cabo con ayuda del estuche
de secuenciación AutoRead (Pharmacia, Freiburg). El análisis y la
detección por electroforesis de los productos de secuenciación se
llevaron a cabo con el aparato secuenciador de ADN A.L.F. de la
entidad Pharmacia (Freiburg, Alemania).
La secuencia obtenida de ADN se utilizó para la
selección de un segundo cebador, con el fin de obtener más datos de
la secuencia antes del comienzo de la transcripción. Para esto se
seleccionó el siguiente cebador:
5' CTT TGC CGC CGT TGG GTT C 5'
La reacción de secuenciación se efectuó tal como
antes se ha descrito. La nueva secuencia situada secuencia arriba
del gen de dapB se representa como SEQ ID NO 1. La secuencia,
inclusive la sucesión de nucleótidos del gen de dapB, se representa
como SEQ ID NO 2.
El gen de dapB se amplificó con ayuda de la
reacción en cadena de la polimerasa. Para esto se sintetizaron por
la entidad MWG Biotech dos oligonucleótidos cebadores, que se
seleccionaron basándose en la conocida secuencia de ADN del gen de
dapB:
P-dap:
5' (AAG CTT) AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3'
dapall:
5' TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3'
El cebador en 5' (cebador P-dap)
contiene un sitio de corte con HindIII, que está marcado mediante
paréntesis en la secuencia antes representada. La realización de la
PCR se efectuó de acuerdo con el Ejemplo 1. De esta manera se
amplificó un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 1,1
kb, que es portador del gen de dapB y que junto a ambos extremos
contiene en cada caso un sitio de corte para la endonucleasa de
restricción HindIII. El fragmento de PCR obtenido se purificó a
partir del gel de agarosa al 0,8% (estuche para extracción en gel
QIAquick de la entidad Qiagen, Hilden, Alemania)) y se clonó con el
estuche de clonación TOPO TA (Invitrogen, Leek, Holanda, número de
catálogo K4550-01) en el vector de clonación
pCR2.1TOPO (Invitrogen, Leek, Holanda). La tanda de ligación se
transformó en el seno de la cepa TOP10F' de E. coli de la
entidad Invitrogen, la tanda de transformación se sembró en placas
sobre un agar LB que contenía kanamicina (50 mg/l) con IPTG (0,16
mM) y X-Gal (64 mg/l), y se aislaron unas colonias
resistentes a kanamicina y coloreadas de blanco. Un ADN de plásmido
se aisló a partir de una transformante con ayuda del estuche QIAprep
Spin Miniprep de la entidad QiAgen y se comprobó mediante corte por
restricción con la enzima HindIII y subsiguiente electroforesis en
un gel de agarosa. La secuencia de ADN del fragmento amplificado de
ADN se comprobó mediante secuenciación. La secuencia del producto de
la PCR coincide con la secuencia representada en SEQ ID NO 1. El
plásmido obtenido fue denominado pCER2.1TOPO
dapB.
dapB.
La cepa ATCC 13032 de Corynebacterium
glutamicum se utilizó como donante para el ADN cromosomal. A
partir de la cepa ATCC 13032 se aislaron ADN cromosomales, tal como
se describen en el Ejemplo 1. Con ayuda de la reacción en cadena de
la polimerasa se amplificó un fragmento de ADN, que es portador del
gen de pyc. Basándose en la secuencia del gen de pyc, conocida para
C. glutamicum (Peters-Wendisch y
colaboradores, 1998. Microbiology, 144, 915-927)
(número de acceso Y09548) se seleccionaron los siguientes
oligonucleótidos cebadores para la PCR:
5-PYC-IN:
5' GC(T CTA GA)A GTG TCG CAA CCG
TGC TTG A 3'
3-PYC-IN:
5' GC(T CTA GA)T TGA GCC TTG GTC
TCC ATC T 3'
Los cebadores señalados fueron sintetizados por
la entidad MWG Biotech y la reacción de PCR se llevó a cabo de
acuerdo con el método clásico de PCR de Innis y colaboradores (PCR
protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic
Press). Los cebadores hacen posible la amplificación de un fragmento
de ADN con un tamaño de 3,8 kb (kilobases), que es portador del gen
de pyc. Además, los cebadores contienen la secuencia para un sitio
de corte con la nucleasa de restricción XbaI, que está marcado por
paréntesis en la sucesión de nucleótidos arriba
represen-
tada.
tada.
El fragmento amplificado de ADN, de
aproximadamente 3,8 kb, que es portador del gen de pyc, fue
identificado mediante una electroforesis en gel en un gel de agarosa
al 0,8% y fue aislado a partir del gel y purificado con los métodos
usuales (estuche para extracción en gel QIAquick, Qiagen,
Hilden).
A continuación se efectuó la ligación del
fragmento mediante el estuche de clonación Dual Promotor Topo TA
(Invitrogen, Leek, Holanda, número de catálogo
K4600-01) en el vector pCRII-TOPO.
La tanda de ligación se transformó en el seno de la cepa TOP10 de
E. coli (Invitrogen, Leek, Holanda). La selección de células
portadoras del plásmido se efectuó mediante una siembra en placas de
la tanda de transformación sobre un agar de LB que contiene
kanamicina (50 mg/l) con X-Gal (64 mg/l).
El plásmido obtenido, después de un aislamiento
del ADN, se comprobó mediante corte por restricción y se identificó
en el gel de agarosa. El plásmido fue denominado
pCRII-TOPOpyc y la secuencia de ADN del inserto
clonado se secuenció como control testigo. Puesto que la secuencia
determinada del inserto pyc en pCRII-TOPOpyc
coincide con las secuencias del registro en el banco de genes, este
plásmido se utilizó ulteriormente.
(Que no entra dentro de este
invento)
A partir del plásmido pCR2.1TOPOdapB (del Ejemplo
2) se aisló un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 1,1
kb, que es portador del gen de dapB. El plásmido pCR2.1TOPOdapB se
digirió totalmente para esto con la enzima de restricción HindIII y
el fragmento de ADN, con un tamaño de aproximadamente 1,1 kb, se
aisló con el gen de dapB.
El fragmento dapB se insertó en el vector pEC7.
El vector pEC7 está basado en el vector de lanzadera (Shuttle) de
E. coli - C. glutamicum pEC5 (Eikmanns y
colaboradores, 1991, 102: 93 - 98). A partir del plásmido pEC5 se
eliminó el sitio de corte con BamHI, que no está situado en el
polienlazador, de la siguiente manera: El plásmido pEC5 se cortó
parcialmente con la enzima de restricción BamHI. El fragmento de
ADN, con un tamaño de aproximadamente 7,2 kb, se aisló a partir del
gel de agarosa y los extremos sobresalientes se rellenaron con la
polimerasa de Klenow (Boehringer Mannheim). El fragmento de ADN así
obtenido fue ligado (con la ligasa de T4, de Boehringer Mannheim).
La tanda de ligación se transformó en el seno de la cepa DH5\alpha
de E. coli y se aislaron colonias resistentes a kanamicina
sobre un agar LB con kanamicina (50 mg/l). El ADN de plásmido se
aisló a partir de un transformante (estuche QIAprep Spin Miniprep de
la entidad Qiagen) y se comprobó mediante corte por restricción con
las enzimas de restricción BamHI y PstI. El plásmido obtenido de
esta manera fue denominado pEC6.
El plásmido pEC6 se cortó totalmente con la
enzima de restricción XhoI. Un fragmento de ADN, que es portador del
terminador trp, se ligó con el fragmento de ADN de vector (ligasa de
T4, Boehringer Mannheim). La tanda de ligación se transformó en el
seno de la cepa DH5\alpha de E. coli,y las colonias
resistentes a kanamicina se aislaron sobre un agar de LB con
kanamicina (50 mg/l). El ADN de plásmido se aisló a partir de un
transformante (estuche QIAprep Spin Miniprep de la entidad Qiagen) y
se comprobó mediante corte por restricción con las enzimas de
restricción BamHI y XhoI. El plásmido obtenido de esta manera fue
denominado pEC7.
El fragmento de ADN, portador de dapB, que se
había obtenido se ligó con el vector pEC7 (ligasa de ADN de T4,
Boehringer Mannheim) que asimismo había sido digerido totalmente con
la enzima de restricción HindIII y había sido tratado con una
fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim). La
tanda de ligación se transformó en el seno de la cepa DH5\alpha de
E. coli, y las colonias resistentes a kanamicina se aislaron
sobre un agar LB con kanamicina (50 mg/l). El ADN de plásmido se
aisló a partir de un transformante (estuche QIAprep Spin Miniprep de
la entidad Qiagen) y se comprobó mediante corte por restricción con
la enzima de restricción HindIII. El plásmido obtenido de esta
manera fue denominado pEC7dapB (Figura 1). La obtenida cepa de
Escherichia coli fue denominada DH5\alpha/pEC7dapB.
(Que no entra dentro de este
invento)
El plásmido pUC18lysEneu descrito en el Ejemplo 1
se digirió totalmente con la enzima de restricción BamHI y el
fragmento de BamHI, con un tamaño de 1,1 kb, se aisló con el gen de
LysE igual que en el Ejemplo 1. Asimismo, el vector pEC7 fue cortado
totalmente con la enzima de restricción BamHI y tratado con una
fosfatasa alcalina. El fragmento de vector de BamHI y el fragmento
de lysE de BamHI fueron ligados (estuche de ligación rápida de ADN
(Rapid DNA ligation Kit), de Boehringer Mannheim), y se
transformaron en el seno de la cepa DH5\alpha de E. coli.
Los transformantes portadores del plásmido se seleccionaron sobre un
agar LB que contenía cloramfenicol (10 mg/l). El ADN de plásmido se
aisló (con el estuche QIAprep Spin Miniprep, Qiagen) y se comprobó
por medio de corte por restricción con la enzima BamHI. El plásmido
así obtenido fue denominado pEC7lysE (Figura 2). La cepa, obtenida
por transformación del plásmido pEC7lysE en la cepa DH5\alpha de
E. coli, fue denominada DH5\alpha/pEC7lysE.
A partir del plásmido
pCRII-TOPOpyc (del Ejemplo 3) se obtuvo el fragmento
de ADN con un tamaño de 3,8 kb, que es portador del gen de pyc
procedente de C. glutamicum ATCC 13032, mediante corte con la
enzima de restricción XbaI. El fragmento de ADN con un tamaño de 3,8
kb se identificó por medio de una electroforesis en gel, se aisló a
partir del gel y se purificó con los métodos usuales, y los extremos
sobresalientes se rellenaron con la polimerasa de Klenow. Asimismo
el vector pEC7 se cortó totalmente con la enzima de restricción SmaI
y se trató con una fosfatasa alcalina. El fragmento de vector de
SmaI y el fragmento de pyc tratado con XbaI y con Klenow se ligaron
(ligasa de T4, Boehringer Mannheim) y se transformaron en el seno de
la cepa DH5\alpha de E. coli. Los transformantes portadores
del plásmido se seleccionaron sobre un agar LB que contenía
cloramfenicol (10 mg/l). El ADN de plásmido se aisló (con el estuche
QIAprep Spin Miniprep, Qiagen, Hilden, Alemania) y se comprobó
mediante corte por restricción con la enzima de restricción SalI. El
plásmido obtenido de esta manera fue denominado pEC7pyc (Figura 3).
La cepa de E. coli, obtenida por transformación del plásmido
pEC7pyc en la cepa DH5\alpha de E. coli, fue
denominada
DH5\alpha/pEC7pyc.
DH5\alpha/pEC7pyc.
(Que no entra dentro de este
invento)
A partir del plásmido pCR2.1TOPOdapB, que
contiene el gen de dapB procedente de C. glutamicum ATCC
13032, se aisló el gen de dapB como fragmento para HindIII. Para
esto, el plásmido se digirió totalmente con la enzima de restricción
HindIII y el fragmento de ADN portador de dapB se aisló a partir de
un gel de agarosa al 0,8% (estuche de extracción en gel QIAquick,
Qiagen).
Además, el vector pEC7lysE se digirió totalmente
con la enzima de restricción HindIII y se trató con una fosfatasa
alcalina. Con el fragmento de vector lineal obtenido de esta manera,
se ligó el fragmento que contenía dapB con un tamaño de 1,1 kb
(ligasa de T4, Boehringer Mannheim) y la tanda de ligación se
transformó en el seno de la cepa DH5\alpha de E. coli. Los
transformantes portadores del plásmido fueron seleccionados sobre un
agar LB que contenía cloramfenicol (10 mg/l). El ADN de plásmido fue
aislado (estuche QIAprep Spin Miniprep, Qiagen, Hilden, Alemania) y
se comprobó mediante corte por restricción con la enzima de
restricción HindIII.
El plásmido así obtenido fue denominado
pEC7lysEdapB. Este plásmido es replicable autónomamente en
Escherichia coli y en Corynebacterium y confiere a su anfitriona resistencias frente al antibiótico cloramfenicol.
Escherichia coli y en Corynebacterium y confiere a su anfitriona resistencias frente al antibiótico cloramfenicol.
El plásmido pEC7lysEdapB contiene simultáneamente
el gen de dapB, que codifica la dihidrodipicolinato reductasa y el
gen de lysE, que codifica el exportador de lisina.
La cepa, obtenida por transformación de
DH5\alpha de E. coli con pEC7lysEdapB, fue depositada como
DH5\alpha/ pEC7lysEdapB.
\newpage
(Que no entra dentro de este
invento)
El plásmido, que es portador del gen de pyc, que
codifica la piruvato-carboxilasa procedente de
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se cortó totalmente
con la enzima de restricción XbaI, y con la polimerasa de Klenow se
rellenaron los extremos sobresalientes tal como se describe en el
Ejemplo 6. De esta manera se pudo aislar el fragmento de ADN con un
tamaño de 3,8 kb, que contiene el gen para la
piruvato-carboxilasa.
El plásmido pEC7dapB (del Ejemplo 4) se cortó
asimismo de modo total con la enzima de restricción SmaI y los
extremos se trataron con una fosfatasa alcalina. El fragmento de
vector lineal, obtenido de esta manera, se ligó con el fragmento de
ADN con un tamaño de 3,8 kb, que contiene el gen de pyc, mediando
utilización de la ligasa de ADN de T4 (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania). De esta manera resultó un plásmido, que
contiene tanto el gen de dapB como también en gen de pyc procedente
de corinebacterias. Los transformantes portadores del plásmido se
seleccionaron sobre un agar LB que contenía cloramfenicol (10 mg/l).
El ADN de plásmido se aisló (con el estuche QIAprep Spin Miniprep,
Qiagen, Hilden, Alemania) y mediante corte por restricción con la
enzima de restricción SalI. El plásmido está representado en la
Figura 4 y fue denominado pEC7dapBpyc. La cepa de E. coli,
obtenida por transformación del plásmido pEC7dapBpyc en la cepa
DH5\alpha de E. coli, fue denominada
DH5\alpha/pEC7dapBpyc.
(Que no entra dentro de este
invento)
El plásmido pCRII-TOPOpyc (del
Ejemplo 3), que es portador del gen de pyc que codifica la piruvato
carboxilasa procedente de Corynebacterium glutamicum ATCC
13032, se cortó totalmente con la enzima de restricción XbaI y se
trató con la polimerasa de Klenow, tal como se describe en el
Ejemplo 6. De esta manera se pudo aislar el fragmento de ADN con un
tamaño de 3,8 kb, que contiene el gen para la piruvato
carboxilasa.
El plásmido pEC7dapBlysE se cortó asimismo
totalmente con la enzima de restricción SmaI y los extremos se
trataron con una fosfatasa alcalina. El fragmento de vector lineal,
obtenido de esta manera, se ligó con el fragmento de ADN con un
tamaño de 3,8 kb, que contiene el gen de pyc, mediando utilización
de la ligasa de ADN de T4 (Boehringer Mannheim). De esta manera
resultó un plásmido que contiene tanto el gen de lysE y el gen de
dapB como también el gen de pyc procedente de Corynebacterium
glutamicum. Los transformantes portadores del plásmido se
seleccionaron sobre un agar LB que contenía cloramfenicol (10 mg/l).
El ADN de plásmido se aisló (en el estuche QIAprep Spin Miniprep,
Qiagen, Hilden, Alemania) y se trató mediante corte por restricción
con la enzima de restricción SmaI. El plásmido está representado en
la Figura 5 y fue denominado pEC7dapBlysEpyc. La cepa de E.
coli, obtenida por transformación del plásmido pEC7dapBlysEpyc
en la cepa DH5\alpha de E. coli, fue denominada
DH5\alpha/pEC7dapBlysEpyc.
(Que no entra dentro de este
invento)
El plásmido pJC1 es un plásmido replicable en
Escherichia coli y en Corynebacterium glutamicum
(Cremer y colaboradores, 1990, Molecular and General Genetics 220:
478-480). De éste se deriva el plásmido pJC33
(Cremer y colaboradores, 1991, Applied and Environmental
Microbiology 57 (6) 1746-1752), que es portador del
gen de lysC(Fbr) procedente de la cepa de C.
glutamicum MH20-22B.
El plásmido pJC23 se basa asimismo en el vector
pJC1 y es portador del gen de dapA procedente de C.
glutamicum ATCC 13032 (Cremer y colaboradores, 1990, Molecular
and General Genetics 220: 478-480) (documento
EP-B 0.435.132). En la cepa MH20-22B
se introdujeron los plásmidos pJC1, pJC33 y pJC23 con el método de
electroporación (de Haynes y Britz, FEMS, Microbiology Letters (61)
329 - 334 (1989)). La cepa de C. glutamicum
MH20-22B es una productora de lisina resistente a
AEC, que se ha depositado con el número de depósito DSM5715.
Los transformantes obtenidos con ayuda de la
electroporación, se aislaron sobre un agar de selección (LBHIS Agar
(18,5 g/l de caldo de infusión de cerebro y corazón
(Brain-Heart Infusion Boullion), 0,5 M de sorbitol,
5 g/l de Bacto-triptona, 2,5 g/l de extracto de
levadura Bacto, 5 g/l de NaCl, 18 g/l de agar Bacto)) con 15 mg/l de
kanamicina. El ADN de plásmidos se aisló de acuerdo con los métodos
usuales (Peters-Wendisch y colaboradores, 1998,
Microbiology, 144, 915-927), se cortó con apropiadas
endonucleasas de restricción y se comprobó. Las cepas obtenidas
fueron denominadas MH20-22B/pJC1,
MH20-22B/pJC33 y MH20-22B/pJC23.
(Que no entra dentro de este
invento)
En lo sucesivo se utilizaron las cepas preparadas
en el Ejemplo 9, con el fin de proveerlas de un segundo
plásmido.
En las descritas cepas
MH20-22B/pJC1, MH20-22B/pJC33 y
MH20-22B/pJC23 se introdujeron con el método de
electroporación los plásmidos
\bullet pEC7pyc \hskip2cm (véase el Ejemplo
6)
\bullet pEC7dapBpyc \hskip1,3cm (véase el
Ejemplo 7)
\bullet pEC7dapBlysEpyc \hskip0,7cm (véase el
Ejemplo 8).
Las bacterias transformadas se seleccionaron
basándose en la resistencia a antibióticos de los plásmidos
contenidos. Los transformantes obtenidos con ayuda de la
electroporación se aislaron sobre un agar de selección (agar LBHIS
con 15 mg/l de kanamicina y 7,5 mg/l de cloramfenicol). El ADN del
plásmido se aisló, se cortó con apropiadas endonucleasas de
restricción y se comprobó.
Las cepas obtenidas se exponen seguidamente:
DSM5715/pJC1/pEC7pyc
DSM5715/pJC33/pEC7pyc
DSM5715/pJC23/pEC7pyc
DSM5715/pJC23/pEC7dapBpyc
DSM5715/pJC23/pEC7lysEdapBpyc
(Que no entra dentro de este
invento)
Las diferentes cepas de C. glutamicum,
obtenidas en los Ejemplos 9 y 10, se cultivaron en un medio
nutritivo que es apropiado para la producción de lisina, y se
determinó el contenido de lisina en el material sobrenadante de
cultivo.
Para esto, las diferentes cepas se incubaron
primeramente sobre placas de agar con los correspondientes
antibióticos (agar de corazón-cerebro con kanamicina
(25 mg/l), cloramfenicol (10 mg/l)) durante 24 h a 33ºC. Partiendo
de estos cultivos de agar se inoculó un cultivo previo (10 ml del
medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml de capacidad). Como medio
para el cultivo previo se utilizó el medio completo CgIII. Se
añadieron kanamicina (25 mg/l) y cloramfenicol (10 mg/l). El cultivo
previo se incubó durante 24 horas a 33ºC con 240 rpm (revoluciones
por minuto) en el dispositivo sacudidor. De este cultivo previo se
inoculó un cultivo principal, de manera tal que la OD (densidad
óptica) inicial (a 660 nm) del cultivo principal es de 0,2 OD. Para
el cultivo principal se utilizó el medio MM.
| Medio MM: | ||
| CSL | 5 g/l | |
| MOPS | 20 g/l | |
| Glucosa | 50 g/l (tratada en autoclave por separado) | |
| Sales: | ||
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 0,1 g/l | |
| MgSO_{4}*7H_{2}O | 1,0 g/l | |
| CaCl_{2}*2H_{2}O | 10 mg/l | |
| FeSO_{4}*7H_{2}O | 10 mg/l | |
| MnSO_{4}*H_{2}O | 5,0 mg/l | |
| Biotina | 0,3 mg/l (filtrada en condiciones estériles) | |
| Tiamina*HCl | 0,2 mg/l (filtrada en condiciones estériles) | |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
| Abreviaturas: |
| CSL: Corn Steep Liquor = líquido de maceración de maíz |
| MOPS: Ácido morfolinopropanolsulfónico |
El CSL, el MOPS y la solución de sales se ajustan
con agua amoniacal a un pH de 7 y se tratan en autoclave. A
continuación se añaden el substrato estéril y las soluciones de
vitaminas, así como se añade el CaCO_{3} tratado en seco dentro de
un autoclave.
La cultivación se efectúa en un volumen de 10 ml
dentro de un matraz Erlenmeyer con una capacidad de 100 ml, provisto
de obstáculos. Se añadieron kanamicina (25 mg/l) y cloramfenicol (10
mg/l). La cultivación se efectuó a 33ºC y una humedad del aire de
80%.
Después de 72 horas se determinó la densidad
óptica (DO) a una longitud de onda de medición de 660 nm. La
cantidad formada de lisina se determinó con un aparato analizador de
aminoácidos de la entidad Eppendorf-BioTronik
(Hamburgo, Alemania) mediante una cromatografía con intercambio de
iones y una derivatización en columna posterior con detección por
ninhidrina. El contenido de glucosa se determinó con el aparato
analizador de azúcares de la entidad Skalar Analytic GmbH (Erkelenz,
Alemania).
En la Tabla 1 se representa el resultado del
ensayo
\vskip1.000000\baselineskip
| cepa | Gen | DO(660) | Lisina-HCl |
| g/l | |||
| DSM715/pJC1/pEC7pyc | pyc | 9,3 | 11,3 |
| DSM5715/pJC33/pEC7pyc | pyc, lysC (Fbr) | 9,2 | 11,9 |
| DSM5715/pJC23/pEC7pyc | pyc, dapA | 9,3 | 14,4 |
| DSM5715/pJC33/pEC7dapBpyc | pyc, dapA, dapB | 9,3 | 16,9 |
| DSM5715/pJC23/pEC7lysEdapBpyc | pyc, dapA, dapB, lysE | 9,1 | 17,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSIR21 (Rossol, tesis, Universidad de
Bielefeld 1992) se cortó totalmente con las enzimas BglII y EcoRV y
se aisló el fragmento de ADN con un tamaño de 1,4 kb que contiene el
gen de aecD (número de acceso M89931) (Rossol y Pühler, Journal of
Bacteriology 174 (9), 2968-2977 (1992)) procedente
de C. glutamicum ATCC 13032. El fragmento de ADN aislado se ligó con
el plásmido pUC18, que había sido digerido totalmente con las
enzimas BamHI y SmaI, se ligó con ayuda de la ligasa de ADN de T4,
tal como se describe en la cita de Sambroock y colaboradores
(Molecular Cloning: a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press). La tanda de ligación se transformó en el seno de
la cepa DH5\alpha de E. coli. La selección de los
transformantes se efectuó sobre placas de corazón y cerebro con 100
mg/l de ampicilina. De una colonia se aisló el ADN de plásmido. El
plásmido obtenido fue denominado pUC18::aecD.
Un fragmento de gen de dapA se aisló como
fragmento SphI-BamHI a partir del plásmido pJC20
(Cremer, J., tesis 1989, Universidad de Düsseldorf). El vector pSP72
(Promega Corporation, EE.UU.) se cortó totalmente con las enzimas
SphI y BamHI y se trató con una fosfatasa alcalina. En este vector,
el fragmento portador de dapA se ligó con ayuda de la ligasa de ADN
de T4. El ADN se transformó a continuación en la cepa de E.
coli XL1 Blue (Bullock, Fernández y Short, BioTechniques (5)
376-379 (1987)). La selección de los transformantes
se efectuó en un medio LB con 100 mg/l de ampicilina. A partir de un
transformante se aisló el ADN de plásmido y fue designado como
pSP72::dapA.
Para la mutagénesis de la región del promotor se
utilizó el estuche de mutagénesis dirigida a un sitio Quickchange de
la entidad Stratagene. Se establecieron los siguientes cebadores con
ayuda de la secuencia de dapA presente y se emplearon para la
mutagénesis.
Para la preparación de
pSP72::dapA(MC20)
Cebador dap1 para MC20
CCA AAT GAG AGA TGG TAA CCT TGA ACT CTA TGA
GCA
Cebador dap2 para MC20
GTG CTC ATA GAG TTC AAG GTT ACC ATC TTC CCT CAT
TTG G
\vskip1.000000\baselineskip
Para la preparación de
pSP72::dapA(MA16)
Cebador dap3 para MA16
CCA AAT GAG GGA AGA AGG TAT AAT TGA ACT CTA TGA
GCA
Cebador dap4 para MA16
GTG CTC ATA GAG TTC AAT TAT ACC TTC TTC CCT CAT
TTG G
La reacción de PCR se efectuó tal como se indica
por el fabricante (Stratagene) del estuche de mutagénesis dirigida a
un sitio Quickchange y mediando utilización del plásmido pSP72::dapA
(del Ejemplo 13) como molde.
Se efectuó la transformación de las tandas de
mutagénesis en la cepa XL1 Blue de E. coli. La selección de
los transformantes se efectuó sobre un medio LB con 100 mg/l de
carbenicilina. A partir de un transformante se aisló el ADN de
plásmido, mediante digestión con BstEII se controló la supresión del
sitio de corte con BstEII. Los plásmidos, que ya no eran portadores
de ningún sitio de corte con BstEII, tenían la deseada mutación.
Los plásmidos obtenidos se transformaron en el
seno de la mutante RDA8 de E. coli con defecto en dapA. Las tandas
de transformación se sembraron en placas sobre LB con 100 mg/l de
carbenicilina, con el fin de ensayar la complementación de la
mutación de dapA. A partir de cada vez uno de los transformantes se
aisló el ADN y los plásmidos obtenidos fueron denominados
pSP72::dapA(MC20) y pSP72::dapA(MA16). Se efectuó la
secuenciación de los plásmidos mediando utilización de los cebadores
de secuenciación inversa y universales de acuerdo con el método de
rotura de cadena descrito en la cita de Sanger y colaboradores,
Proceedings of National Academy of Sciences of the USA [Actas de la
Academia Nacional de Ciencias de los EE.UU.] (74), 5463 - 5467
(1977). La reacción de secuenciación se llevó a cabo con ayuda del
estuche de secuenciación AutoRead (Pharmacia, Freiburg). El análisis
y la detección por electroforesis de los productos de la
secuenciación se llevaron a cabo con el secuenciador de ADN A.L.F.
(Pharmacia, Freiburg, Alemania).
Los plásmidos pSP72::dapA(MC20) y
pSP72::dapA(MA16) (procedentes del Ejemplo 14) se cortaron
totalmente con las enzimas de restricción PvuII y SmaI. Los
fragmentos de PvuII-SmaI con un tamaño de 1.450 pb,
que son portadores del gen de dapA con el promotor mutado MC20 o
bien MA16, fueron ligados con la ligasa de ADN de T4 en el vector
pUC18::aecD cortado con StuI (del Ejemplo 12). La tanda de ligación
se transformó en el seno de la cepa DH5\alpha de E. coli.
La selección de los transformantes se efectuó sobre un medio LB con
ampicilina 100 mg/l. A partir de cada uno de los transformantes se
aisló el ADN de plásmido. De esta manera se obtuvieron los plásmidos
pUC18aecD::dapA(MC20) y pUC18aecD::dapA(MA16).
Los plásmidos pUC18aecD::dapA(MC20) y
pUC18aecD::dapA(MA16) se cortaron parcialmente con la enzima
de restricción EcoRI y totalmente con la enzima SalI, para obtener
el plásmido con un tamaño de 3,0 kb, portador de
aecD::dapA(MC20) y aecD::dapA(MA16). El fragmento se
ligó con ayuda de la ligasa de ADN de T4 en el vector pK19mobsacB
cortado y tratado con una fosfatasa alcalina (Schäfer y
colaboradores, Gene (145) 69-73 (1994)). La tanda de
ligación se transformó en el seno de la cepa de E. coli DH5
(Hanahan (1985), En: DNA cloning. A practical approach. [Clonación
de ADN. Un enfoque práctico] volumen. I. IRL-Press,
Oxford, Washington DC, EE.UU.). La selección de los transformantes
se efectuó sobre un medio LB con 50 mg/l de kanamicina. A partir de
cada uno de los transformantes se aisló el ADN de plásmido. De esta
manera se obtuvieron los plásmidos
pK19mobsacBaecD::dapA(MC20) y
pK19mobsacBaecD::dapA(MA16).
El ADN de plásmido se transformó en el seno de la
cepa S17-1 de E. coli (Simon, Priefer y
Pühler, Bio/Technology, (1) 784-791 (1983)). La
selección de los transformantes se efectuó sobre un medio LB con 50
mg/l de kanamicina. A partir de cada uno de los transformantes se
aisló y comprobó el ADN de plásmido. Las cepas obtenidas fueron
denominadas S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)
y S17-1/ pK19mobsacBaecD::dapA(MA16).
Los plásmidos pK19mobsacBaecD::dapA(MC20)
y pK19mobsacBaecD::dapA(MA16) fueron transferidos a la cepa
de C. glutamicum DSM5715 con el método de la conjugación
(Schäfer y colaboradores, Journal of Bacteriology, (172)
1663-1666 (1990)) de
S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MC20) y
S17-1/pK19mobsacBaecD::dapA(MA16) (del
Ejemplo 15) en la cepa DSM5715 de C. glutamicum. Para la
selección de los transconjugantes, las tandas de conjugación se
sembraron en placas sobre un medio de cerebro y corazón con ácido
nalidíxico y kanamicina. Los transconjugantes obtenidos se incubaron
durante una noche en 10 ml de un medio de cerebro y corazón. A
continuación, unas partes alícuotas se sembraron en placas que
contenían sacarosa (agar de corazón y cerebro con 10% de sacarosa)
con el fin de seleccionar en cuanto a la pérdida de sensibilidad a
la sacarosa. Los clones resistentes a la sacarosa se aislaron y se
comprobaron de nuevo en placas de agar que contenían cloramfenicol y
kanamicina (medio de corazón y cerebro con 15 mg/l de kanamicina y
medio de corazón y cerebro con 10 mg/l de cloramfenicol).
Se aislaron colonias que tenían el siguiente
fenotipo:
Resistentes a sacarosa,
sensibles a kanamicina,
sensibles a cloramfenicol.
La inserción del fragmento de gen de dapA en el
gen de aecD se comprobó con el método de la transferencia de borrón
Southern (Sambroock y colaboradores, Molecular Cloning: a Laboratory
Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7,
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7 y
DSM5715/pEC7
El gen de pyc se presenta en el vector pEC7 tal
como se describe en el Ejemplo 6. Este plásmido pEC7pyc así como el
plásmido pEC7 se introdujeron mediante electroporación (Haynes 1989,
FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) en las cepas
DSM5715aecD::dapA(MC20), DSM5715aecD::dapA(MA16) y
DSM5715 (del Ejemplo 16) para obtener de esta manera las
DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pECpyc,
DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7,
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7 y DSM5715/pEC7 de C.
glutamicum. La selección de los transformantes se efectuó sobre
un agar de cerebro y corazón con 25 mg/l kanamicina. A partir de
cada uno de los transformantes se aisló y comprobó el ADN de
plásmido. De esta manera se obtuvieron las cepas
DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7,
DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7 y
DSM5715/pEC7.
Las cepas
DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7pyc,
DSM5715aecD::dapA (MC20)/pEC7,
DSM5715aecD::dapA (MA16)/pEC7 y DSM5715/pEC7, tal
como se describe en el Ejemplo 11, después de una cultivación previa
en el medio de CgIII (Kase & Nakayama, Agricultural and
Biological Chemistry 36 (9) 1611-1621 (1972)) se
cultivaron en el medio de producción MM. Después de una incubación
durante 48 horas se determinaron la densidad óptica a 660 nm y la
concentración de L-lisina formada.
En la Tabla 2 se representa el resultado del
ensayo.
| Cepa | DO | Lisina-HCl g/l |
| DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7pyc | 14,15 | 13,3 |
| DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7pyc | 13,6 | 13,4 |
| DSM5715/pEC7 | 13,3 | 11,5 |
| DSM5715aecD::dapA(MA16)/pEC7 | 13,3 | 12,9 |
| DSM5715aecD::dapA(MC20)/pEC7 | 14,0 | 12,8 |
Se añade la siguiente Figura:
Figura 1: pEC7pyc (véase el Ejemplo 2)
Las abreviaturas utilizadas en la Figura tienen
los siguientes significados:
- Cm:
- Gen de resistencia para cloramfenicol
- pyc:
- Gen de pyc de C. glutamicum
- OriE:
- Origen de replicación en E. coli codificado por un plásmido
- pBL:
- Fragmento de ADN del plásmido pBL1
- HindIII:
- Sitio de corte con la enzima de restricción HindIII
- SalI:
- Sitio de corte con la enzima de restricción SalI
- SmaI:
- Sitio de corte con la enzima de restricción SmaI
- BamHI:
- Sitio de corte con la enzima de restricción BamHI
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120>Bacterias corineformes productoras de
L-lisina y procedimiento para la preparación de
lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 980183 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 795
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> -35 señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (774)..(779)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN secuencia arriba de dapB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1815
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> -35 señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (774)..(779)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> -10 señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (798)..(803)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (851)..(1594)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de tipo salvaje de dapA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Promotor de dapA de C. glutamicum con la mutación
MC20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (45)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Promotor de dapA de C. glutamicum con la mutación
MA16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(53)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Bacterias corineformes que producen
L-lisina, con un gen de pyc reforzado, en las que
adicionalmente se refuerza el gen de dapA.
2. Bacterias corineformes de acuerdo con la
reivindicación 1, en las que se refuerzan el gen de dapA y el gen de
dapB.
3. Bacterias corineformes de acuerdo con la
reivindicación 1, en las que se refuerzan el gen de dapA, el gen de
dapB y el gen de lysE.
4. Bacterias corineformes de acuerdo con la
reivindicación 1, en las que el promotor del gen de dapA tiene la
mutación MC20 ó MA16, representada en
SEQ-ID-NO. 5 y
SEQ-ID-NO. 6.
5. Cepa DSM5715aecD::dapA(MA16) de
Corynebacterium glutamicum, depositada como DSM12867.
6. Cepa DSM5715aecD::dapA(MC20) de
Corynebacterium glutamicum, depositada como DSM12868.
7. ADN replicable con la secuencia de nucleótidos
MC20, mostrada en la SEQ-ID-NO.
5.
8. Bacterias corineformes que contienen el ADN
replicable de la secuencia de nucleótidos MC20, mostrada en la
SEQ-ID-NO. 5.
9. ADN replicable con la secuencia de nucleótidos
MA16, mostrada en la SEQ-ID-NO.
6.
10. Bacterias corineformes, que contienen el ADN
replicable de la secuencia de nucleótidos MA16, mostrada en la
SEQ-ID-NO. 6.
11. Procedimiento para la preparación de
L-lisina por fermentación de bacterias corineformes
con un gen de pyc reforzado, caracterizado porque se emplean
unas bacterias, en las que se refuerza el gen de dapA.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque se emplean unas
bacterias, en las que se refuerzan el gen de dapA y simultáneamente
el gen de lysC.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque se emplean unas
bacterias, en las que se refuerzan simultáneamente el gen de dapA,
el gen de dapB y el gen de lysE.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque el promotor de gen de
dapA reforzado tiene las mutaciones MC20 ó MA16, representadas en
SEQ-ID-NO. 5 y
SEQ-ID-NO. 6.
15. Procedimiento de acuerdo con una o varias de
las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
emplean bacterias del género Corynebacterium glutamicum.
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|---|---|---|---|
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