ES2247990T3 - Procedimiento para la produccion de proteinas plegadas naturalmente y secretadas mediante co-secrecion de chaperones moleculares. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de proteinas plegadas naturalmente y secretadas mediante co-secrecion de chaperones moleculares.Info
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Abstract
Procedimiento para la producción de un polipéptido eucariótico naturalmente plegado, que contiene dos o varias cisteínas unidas por puentes de disulfuro, mediante a) cultivo de células procarióticas en el cual dichas células procarióticas contienen un vector de expre- sión que codifica dicho polipéptido, el cual contiene una secuencia señal procariótica en el terminal N, b) secreción del polipéptido en el periplasma o el medio, c) escisión de la secuencia señal y aislamiento del po- lipéptido a partir del periplasma o del medio, en donde un ácido nucleico codifica una corta proteína de shock térmico (tipo sHsp) o una proteína de shock térmico con una masa molar de aproximadamente 40 kDa (tipo Hsp40) como chaperón molecular, se expresa adicionalmente en dicha célula procariótica y el chaperón se secreta en el periplasma con la condición de que el cultivo se efectúe sin la presencia de arginina o un compuesto de fórmula general I R2-CO-NRR1 (I) en la cual R y R1 representan hidrógeno ó unacadena alquílica de 1 a 4 átomos de carbono saturada o sin saturar, ramificada o sin ramificar, y R2 representa hidrógeno, NHR1 ó una cadena alquílica de 1 a 3 átomos de carbono saturada o sin saturar, ramificada o sin ramificar.
Description
Procedimiento para la producción de proteínas
plegadas naturalmente y secretadas mediante
co-secreción de chaperones moleculares.
La invención se refiere a un procedimiento para
la producción de polipéptidos solubles en agua, naturalmente
plegados y segregados, después de la expresión en células
procarióticas mediante la co-expresión de chaperones
moleculares.
La síntesis de proteínas en organismos
procarióticos a la que se llama también traducción, tiene lugar en
los ribosomas del citoplasma. Cuando el ADN recombinante se expresa
en organismos anfitriones procarióticos, es a menudo deseable que se
segregue el producto del gen recombinante o proteína que se obtiene
en este procedimiento a partir del citoplasma a través de la
membrana bacteriana interna dentro del espacio periplásmico entre
la membrana interna y externa. Las proteínas segregadas pueden a
continuación segregarse desde el periplasma al medio nutriente por
ejemplo mediante un shock osmótico. Una desventaja de este
procedimiento es que los polipéptidos segregados no forman a menudo
la conformación nativa biológicamente activa (Hockney TIBTECH 12
(1994) 456-463).
Recientemente, los "chaperones" moleculares
y catalizadores de plegado tales como las
peptidil-propil-cis/trans-isomerasas
o proteína disulfuro isomerasas (Golckshuber et al,
EP-A 0 510 658), se han empleado para aumentar el
rendimiento de la proteína nativa recombinante cuando se pliega
in vivo (Thomas et al., Appl. Biochem, Biotechnol. 66
(1997) 197-238). En algunos casos esto ha conducido
a considerables aumentos de la expresión p. ej., la ribulosa
bisfosfato carboxilasa (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature
337 (1989) 44-47), procolagenasa humana (Lee &
Olins, J. Biol. Chem. 267 (1992) 2849-2852) ó la
neuronal óxido de nitrógeno sintasa a partir de ratas (Roman et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)
8428-8432). En estos ejemplos, el sistema GroEL/ES ó
el sistema DnaK del E. coli fue
co-superexpresado en el citosol. Otros
procedimientos de expresión emplean chaperones de bacterias
termofílicas (Imanaka et al.,
EP-A-0 774 512) u operones
artificiales (Soyo et al.,
EP-A-0 885 967).
La co-expresión de chaperones ha
sido también examinada cuando se segregan proteínas recombinantes en
el periplasma de E. coli. Sin embargo, en este caso
solamente se evaluó una sobreexpresión citosólica de chaperones con
el fin de optimizar la secreción en el periplasma
(Perez-Perez et al., Biochem Biophys. Res.
Commun. 210 (1995) 524-529; Sato et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258-264;
Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996)
55-60). Tentativas anteriores de cosecreción en
E. coli han tenido que ver con las proteínas auxiliares del
plegado tales como p. ej., la proteína disulfuro isomerasa (PDI;
Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) ó las
peptidil-propil-cis/trans-isomerasas,
proteínas Dsb (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993)
77-83; Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol.
64 (1998) 4891-4896 y Schmidt et al., Prot.
Engin. 11 (1998) 601-607) ó proteína Skp (Hayhurst
and Harris, Protein Expr. Purif. 15 (1999) 336-343;
Joly et al., WO 96/14422A y WO 98/18946A) y proteínas de
fusión con estructuras de la superficie bacteriana (Korpela et
al. WO 00/66756).
El objeto de la invención es proporcionar un
procedimiento para la producción de polipéptidos eucarióticos
solubles en agua naturalmente plegados, después de la expresión en
procariotas, la cual pueda efectuarse de una manera sencilla y que
no requiera un laborioso post-tratamiento in
vitro tal como la disolución de cuerpos de inclusión, reducción
y renaturalización.
Este objetivo se consigue mediante un
procedimiento para la producción de un polipéptido eucariótico
plegado naturalmente, que contiene dos o varias cisteínas unidas
por puentes disulfuro mediante
a) cultivo de células procarióticas en el cual
dichas células procarióticas contienen un vector de expresión que
codifica dicho polipéptido, el cual vector contiene una secuencia
señal procariótica en los terminales N,
b) segregación del polipéptido dentro del
periplasma o el medio,
c) escisión de la secuencia señal y aislamiento
del polipéptido a partir del periplasma o del medio,
en donde un ácido nucleico que codifica una
pequeña proteína de choque térmico (del tipo sHsp), o una proteína
de choque térmico con una masa molar de aproximadamente 40 kDa
(tipo Hsp40) como chaperón molecular, se expresa adicionalmente en
dicha célula procariótica y el chaperón se segrega dentro del
periplasma con la condición de que el cultivo tenga lugar sin la
presencia de arginina o un compuesto de fórmula general I
R_{2}-CO-NRR_{1} (I) en la cual
R y R_{1} representan hidrógeno o una cadena alquílica de 1 a 4
átomos de carbono saturada o sin saturar, ramificada o sin
ramificar, y R_{2} representa hidrógeno, NHR1 ó una cadena
alquílica de 1 a 3 átomos de carbono saturada o sin saturar,
ramificada o sin ramificar. En este procedimiento es preferible que
el chaperón esté sobreexpresado.
En una versión preferida del procedimiento de
acuerdo con la invención, se añaden adicionalmente reactivos
reductores del tiol conteniendo grupos SH, al medio nutriente
(medio de fermentación) empleado para el cultivo de células
procarióticas que aumentan además el rendimiento de la proteína
producida recombinantemente. De preferencia, se añaden
0,1-15 mmoles/reactivo del tiol. De acuerdo con la
invención el término "reactivo del tiol" significa o bien un
reactivo para reducir el tiol (reducido) con grupos SH, o bien una
mezcla de reactivos reductores del tiol con grupos SH y reactivos
oxidantes del tiol con grupos disulfuro. Las substancias preferidas
son el glutatión reducido (GSH), cisteína,
N-acetilcisteína, cisteamina,
\beta-mercaptoetanol y compuestos similares.
Los reactivos de tiol pueden emplearse
individualmente así como también en mezclas. Son particularmente
apropiados los reactivos de tiol tales como el glutatión (GSH) el
cual tiene un solo grupo SH por molécula. Los reactivos de tiol
tales como el glutatión son conocidos por aumentar el rendimiento
de las proteínas plegadas nativamente cuando el ADN recombinante se
expresa en células procarióticas (Glockshuber et al.,
EP-A 0 510 658).
Los chaperones se definen de acuerdo con la
invención, como proteínas que protegen otras proteína no nativas de
la agregación in vivo y promueven la formación de su
conformación nativa (Reviews: Silver and Way, Cell 74 (1994)
5-6 y Cyr et al., TIBS 19 (1994)
176-181). Los chaperones moleculares se empleaban en
la técnica anterior para estabilizar proteínas y así protegerlas de
la agregación e inactivación (Buchner et al.,
EP-A 0 556 726 A1). De acuerdo con la invención se
emplean chaperones dependientes de ATP del tipo HSP40 (masa molar
aproximadamente 40 kDa) o una proteína de shock térmico pequeña
(sHSP). El DnaJ es una proteína de shock térmico de 40 kDa que se
encuentra en el citoplasma de E. coli y es una parte del así
llamado, sistema chaperón Hsp70 (Bukau, B. & Horwich, A., Cell
92 (1998) 351-366). La DnaK (Hsp70) y la GrpE
pertenecen también a este sistema. Proteínas particulares se
pliegan en la conformación nativa mediante el sistema DnaK en un
procedimiento dependiente de ATP (Schröder et al., EMBO J.
12(1993) 4137-4144: Langer et al.,
Nature 356 (1992) 683-689). Este sistema requiere
adicionalmente, ATP para replegar proteínas desnaturalizadas. La
DnaJ protege las proteínas no nativas de la agregación también en
ausencia de DnaK y ATP y promueve un estado competente con el
plegado (Schröder et al., EMBO J. 12 (1993)
4137-4144). Adicionalmente se prefiere la
co-secreción de un fragmento
N-terminal de DnaJ que contiene los aminoácidos
1-108 y que en adelante se llamará el dominio J
(Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227). Los dominios J y
un dominio rico en G/F que son responsables de las interacciones
con el DnaK están situados en esta región (Wall et al., J.
Biol. Chem. 270 (1995) 2139-2144). Se ha comprobado
que la co-expresión del DnaJ en el citosol puede
conducir a un aumento de rendimiento de la proteína soluble
(Yokoyama et al., Biosci. Biotech. Biochem. 62 (1998)
1205-1210).
El Hsp25 (p. ej., del ratón) es un representante
de las proteínas de shock térmico pequeñas (sHsps; Gaestel et
al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209-213), las
cuales son una clase ubicua de chaperones. La masa molar de estas
proteínas está entre 15 y 30 kDa. Durante el shock térmico hay una
substancial acumulación de sHsps en la célula (hasta el 1% de la
proteína celular total - Arrigo & Landry (1994). En Morimoto
(Ed.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones
("Biología de las proteínas de shock térmico y los chaperones
moleculares"), Cold Spring Harbour Press,
335-373). Como las proteínas DnaJ, las sHsps tienen
la propiedad de prevenir la agregación de proteínas no nativas y de
mantener éstas en un estado competente de plegado (Jakob et
al., J. Biol.. Chem. 268 (1993) 1517-1520;
Ehrnsperger et al., EMBO J. 16 (1997)
221-229). Todas las sHsps tienen regiones que son
homólogas a las proteínas cristalinas aA y aB de los lentes
oculares de los eucariotas, las cuales a su vez son miembros de la
familia sHsp (Jacob and Buchner, TIBS 19 (1994)
205-211).
El término "sobreexpresión" de acuerdo con
la presente invención, significa un aumento de la expresión de las
proteínas segregadas tales como p. ej., la DnaJ y el Hsp25 (de
preferencia por lo menos el 100%) comparado con la expresión en el
tipo salvaje del respectivo organismo anfitrión
pro-cariótico. Dicha sobreexpresión puede por
ejemplo lograrse cuando los genes (para la proteína, chaperones y/o
péptido señal) están bajo el control de una fuerte señal de
expresión procariótica, de preferencia inducible (p. ej., de un
promotor lac ó T7 ó un derivado de los mismos).
La construcción de secreción generada para la
sobreex-presión de polipéptidos (proteínas)
incluyendo regiones reguladoras (promotor y terminador) sobre el ADN
recombinante está de preferencia integrado dentro de un vector que
adicionalmente codifica la arginina-tARN_{AGA/AGG}
lo cual es raro en los procariotas o está
co-expresada con un vector que codifica este tARN
(Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114).
Esto permite la co-sobreexpresión de las
respectivas proteínas en el periplasma bacteriano así como también
la transcripción del raro tARN^{Arg}_{AGA/AGG} que da como
resultado una síntesis aumentada de la proteína deseada en el
organismo anfitrión bacteriano. El ácido nucleico que codifica el
polipéptido y el chaperón puede estar situado en un vector o en dos
vectores separados.
Una secuencia de señal procariótica en el sentido
de la invención se entiende que es un fragmento de ácido nucleico
el cual se deriva de procariotas, de preferencia de bacterias
gram-negativas y asegura que las proteínas unidas al
péptido señal puedan penetrar a través de la membrana bacteriana
interior. Como resultado, las proteínas se sitúan en el periplasma
o en el sobrenadante celular. Estas secuencias de señal tienen
habitualmente una longitud de 18-30 amino-ácidos y
están descritas por ejemplo en Murphy & Beckwith: Export of
Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli
("Exportación de proteínas por la cubierta celular de la
Escherichia coli") y en Neidhardt et al.
(editores): Escherichia coli y Salmonella. Segunda edición,
vol. 1, ASM Press, Washington, 1996, ps. 967-978.
La escisión de las secuencias señal bacterianas puede lograrse por
ejemplo después de una secuencia
Ala-X-Ala (de Heijne et al.,
J. Mol. Biol.. 184 (1985) 99-105). La estructura de
la peptidasa señal bacteriana está descrita en Paetzel et
al., Nature 396 (1998) 186-190. La secuencias
señal se emplean de preferencia de manera que son escindidas de
nuevo de la proteína deseada por proteasas situadas en el
periplasma de células procarióticas. Alternativamente, estas
proteasas pueden añadirse al sobre-nadante celular o
a la proteína aislada para escindir la secuencia señal.
El procedimiento según la invención puede
aumentar la expresión heteróloga de numerosas proteínas
eucarióticas tales como p. ej., proteasas, interferones, hormonas
de proteína, anticuerpos o fragmentos de los mismos: El
procedimiento es particularmente adecuado para la producción
heteróloga de proteínas que contienen por lo menos dos cisteínas
unidas por un puente de disulfuro en su estado nativo, especialmente
cuando no tienen ninguna secuencia señal procariótica fusionada en
el terminal N y durante su expresión procariótica se forman cuerpos
de inclusión insolubles. El procedimiento es particularmente
adecuado para proteínas que contienen más de 5 puentes disulfuro en
el estado nativo. Dicha proteína es por ejemplo un activador
plasminógeno recombinante (en adelante llamado rPA, Martín et
al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299-311.
Patente US nº 5.223.256). El rPA tiene 9 puentes de disulfuro que no
están formados en el citosol de reducción de E. coli.
La situación periplásmica de la proteína y del
chaperón se asegura mediante la "unión operativa" con un
péptido señal para penetrar las membranas internas bacterianas.
Con el fin de aislar la proteína secretora rPA en
una forma funcional en E. coli, el gen del plásmido pA27fd7
(Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992)
93-100) para esta proteína, se fusionó mediante
métodos de ingeniería genética con una secuencia de señal
procariótica de bacterias gram-negativas, por
ejemplo, con la secuencia señal de pectato liasa B (PeIB) de
Erwinia carotovora. La fusión del gen se efectuó por
clonación en el interior del vector pET20b(+) (Novagen Inc.,
Madison, USA). Como resultado, la expresión del gen está bajo el
control del promotor T7. La secuencia señal presente en la proteína
de fusión ocasiona la secreción en el periplasma. La secuencia señal
se escinde durante o después de la secreción mediante una peptidasa
situada en el interior de la membrana. La proteína secretada puede
plegarse a continuación en el periplasma. Las condiciones de
oxidación en este compartimiento permiten la formación de puentes de
disulfuro (Wülfing und Plückthun, Mol. Microbiol. 12 (1994)
685-692). La co-sobreexpresión
simultánea de la DnaJ, el dominio J ó la Hsp25 en el periplasma,
permite aumentar el rendimiento de la proteína funcional en
aproximadamente 5 a 10 veces (tabla 1).
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de parte del
plásmido de expresión
pUBS520-pIN-dnaJ el cual codifica la
proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA y la DnaJ
juntamente con las secuencias reguladoras (promotor, terminador)
que fue amplificada a partir de pIN III
ompA3-dnaJ.
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de fusión
OmpA-DnaJ.
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de parte del
plásmido de expresión
pUBS520-pIN-dominio J el cual
codifica la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA
y el dominio J juntamente con las secuencias reguladoras (promotor,
terminador) que fue amplificada a partir de pIN III
ompA3-dnaJ.
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de fusión OmpA-dominio
J.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de parte del
plásmido de expresión
pUBS520-pIN-hsp25 el cual codifica
la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA y el
Hsp25 juntamente con las secuencias reguladoras (promotor,
terminador) que fue amplificada a partir de pIN III
ompA3-hsp25.
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de fusión
OmpA-Hsp25.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de parte del
plásmido de expresión pUBS520-ScFvOx el cual
codifica la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal PeIB
y el ScFvOxazolona juntamente con las secuencias reguladoras
(promotor, terminador) que fue amplificada a partir de
pHEN-ScFv ó pIN III ompA3.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de fusión
PeIB-scF_{v}oxazolona.
La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de parte del
plásmido de expresión pET20b(+)-rPA el cual codifica
la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal PeIB y el
rPA.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de fusión PeIB-rPA.
La figura 1 muestra un Western blot de la
limitada proteolisis del DnaJ expresado periplásmicamente y
citosólicamente, con 50 \mug/ml de tripsina para detectar la
situación celular y el plegado nativo de la proteína. Los estándares
de los pesos moleculares figuran a la izquierda y a la derecha.
Como control, se sometió el DnaJ (izquierda) purificado al mismo
procedimiento pero empleando 6,25 \mug/ml de tripsina.
La figura 2 muestra una representación
esquemática del plásmido de expresión
pUBS520-pIN-dnaJ.
La figura 3 muestra una representación
esquemática del plásmido de expresión
pUBS520-pIN-dominio J.
La figura 4 muestra una representación
esquemática del plásmido de expresión
pUBS520-pIN-hsp25.
La figura 5 muestra una representación
esquemática del plásmido de expresión
pUBS520-ScFvOx.
La figura 6 muestra una representación
esquemática del plásmido de expresión
pET20b(+)-rPA.
Para la sobreexpresión periplásmica del DnaJ, el
dominio J y el Hsp25 en E. coli, el ADN a partir del cual
codifican estas proteínas, se fusionó mediante ingeniería genética
con la secuencia señal de la proteína A de la membrana externa
(OmpA) de E. coli, y la fusión se expresó en E. coli
sobre un plásmido recombinante bajo el control del promotor
lac-lpp. Como resultado, la cadena de polipéptidos
del DnaJ y Hsp25 son transportadas dentro del periplasma del
organismo anfitrión procariótico y se pliegan allí nativamente. Su
situación y el plegado nativo del DNAJ se demostró mediante
proteolisis limitada, con tripsina y mediante un Western blot.
Las técnicas de genética molecular se basaron
sobre Ausubel et al., (Ed), J.Wiley & Sons, 1997, Curr.
Protocols of Molecular Biology ("Protocolos de Biología
molecular"). Los oligonucleótidos se obtuvieron de las firmas MWG
Biotech, Ebersberg ó GIBCO Life Sciences, Eggenstein, Alemania.
El gen que codifica el DnaJ, con el nº de
registro del banco de datos M 12565, se clonó por medio de los
sitios de escisión de restricción EcoRI y BamHI dentro del plásmido
de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J.3 (1984)
2437-2442). La secuencia del fragmento PCR clonado
se comprobó mediante secuenciación didesoxi (secuenciador LiCor de
ADN modelo 4000, MWG Biotech, Ebersberg). El plásmido resultante
recibió el nombre de pIN III ompA3-dnaJ. La
secuencia del DnaJ expresado en el periplasma difiere de la de la
proteína de tipo salvaje en que la secuencia del polipéptido
empieza con Gly-Ile-Pro en lugar de
Met, por lo que existe una extensión N-terminal de
2 aminoácidos. Por lo tanto el DnaJ está bajo el control del
promotor lac-lpp el cual está inducido con IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido).
La región del plásmido pIN III
ompA3-dnaJ que codifica el operón
lac-lpp, la secuencia señal, el gen dnaJ y la
región terminadora del operón, se amplificaron por medio de PCR
(SEQ ID NO: 1). El producto de la PCR se escindió con la
endonucleasa de restricción BgIII y se clonó en el vector pUBS520
linealizado con la endonucleasa de restricción BamHI. El plásmido
resultante recibió el nombre de
pUBS520-pIN-dnaJ (figura 2).
Se insertaron dos codones de interrupción en el
plásmido pUBS 520-pIN-dnaJ después
del nucleótido 324 por medio del sistema de mutagénesis QuikChange
(Promega, Mannheim, Alemania) de manera que solamente se expresaron
los primeros 108 aminoácidos. La secuencia de la región mutagenizada
se determinó mediante secuenciación didesoxi (secuenciador de ADN
LiCor modelo 4000, MWG Biotech, Ebersberg) y la expresión del
fragmento de proteína acortada se detectó mediante Western blot y
detección con un anticuerpo anti-DnaJ. El plásmido
así formado recibió el nombre de pUBS
520-pIN-dominio J (figura 3).
El gen que codifica el Hsp25, con el nº de
registro del banco de genes L 07577, se clonó por medio de los
sitios de escisión de restricción EcoRI y BamHI en el plásmido de
expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984)
2437-2442). La secuencia del fragmento PCR clonado
se comprobó mediante secuenciación didesoxy (secuenciador de ADN
LiCor modelo 4000, MWG Biotech, Ebersberg). El plásmido resultante
recibió el nombre de pIN III ompA3-hsp25. La
secuencia del Hsp25 expresada en el periplasma difiere de la de la
proteíana tipo salvaje en que la secuencia del polipéptido empieza
con Gly-Ile-Leu en lugar de Met, por
lo cual existe una extensión N-terminal de 2
aminoácidos. Por lo tanto, el Hsp25 está bajo el control del
promotor lac-lpp el cual es inducido con IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido).
Se amplificó la región del plásmido pIN III
ompA3-hsp25 el cual codifica el operón
las-lpp, la secuencia señal, el gen hsp25 y la
región terminadora del operón, por medio de PCR (SEQ ID NO: 5). El
producto de la PCR se escindió con la endonucleasa de restricción
BgIII y se clonó en el vector pUBS520 linealizado con la
endonucleasa de restricción BamHI. El plásmido resultante recibió
el nombre de pUBS520-pIN-hsp25
(figura 4).
Se examinó la co-expresión de un
fragmento Fv de cadena simple, el cual está dirigido contra el
hapteno oxazolona (ScFvOxazolon; Fiedler and Conrad, Bio/Technology
13 (1995) 1090-1093), y que no tiene ninguna
propiedad de chaperón, como control negativo.
Se amplificó la región del plásmido
pHEN-ScFvOx la cual codifica el promotor lac, la
secuencia señal peIB y el gen scfvox, mediante una PCR. La región
del plásmido pIN III ompA3 que codifica el terminador Ipp, se
amplificó mediante una segunda PCR. Los dos fragmentos se
fusionaron en una PCR subsiguiente. El producto de la PCR(SEQ
ID NO: 7) que se formó de esta manera, se escindió con la
endonucleasa de restricción BgIII y se clonó en el vector pUBS520
que se linealizó con la endonucleasa de restricción BamHI. El
plásmido resultante recibió el nombre de
pUBS520-ScFvOx (figura 5).
Se amplificó el gen de un activador plasminógeno
(rPA) del vector de plásmido pA27fd7 (Kohnert et al.,
Protein Engineering ("Ingeniería de Proteínas") 5 (1992)
93-100), con ayuda de un método PCR. El producto de
la PCR se escindió con la endonucleasa de restricción NcoI y BamHI
y se clonó en el vector del plásmido pET20b(+)(Novagen Inc.,
Madison, USA). El plásmido codifica una proteína de fusión que está
compuesta de la secuencia señal de PeIB (pectato liasa de
Erwinia carotovora) y rPA y la secreción de rPA en el
periplasma se comprobó mediante secuenciado didesoxi (secuenciador
de ADN LiCor modelo 4000, MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). La
construcción recibió el nombre de pET20b(+)-rPA
(SEQ ID NO: 10) (figura 6). El rpA se expresa en el plásmido bajo
el control del promotor T7, estando la
T7-ARN-polimerasa en la cepa E.
coli BL21 (DE3) bajo el control del promotor lacUV5. La
inducción se efectuó por adición de IPTG. El rPA expresado en el
periplasma difiere del activador plasminógeno descrito por Kohnert
et al., en que el segundo aminoácido (Ser) está substituido
por Ala.
Un cultivo en reposo durante la noche, de células
E. coli BL21(DE3) (Studier & Moffat, J. Mol.
Biol.. 189 (1986) 113-130) que contenía
pET20b(+)-rPA y
pUBS520-pIN-dnaJ
(co-expresión de DnaJ), un cultivo durante la
noche de células E. coli BL21(DE3) que contenía
pET20b(+)-rPA y
pUBS520-pIN-dominio J
(co-expresión del dominio J), un cultivo durante la
noche de células E. coli BL21(DE3) que contenía
pET20b(+)-rPA y
PUBS520-pIN-hsp25
(co-expresión de Hsp25), un cultivo durante la noche
de células E. coli BL21(DE3) que contenía
pET20b(+)-rPA y pUBS520-ScFvOx
(co-expresión de ScFvOx), un cultivo durante la
noche de células E. coli BL21 (DE3) que contenía
pET20b(+)-rPA y pUBS520, o un cultivo durante la
noche de células E. coli BL21 (DE3) que contenía pET20b(+) y
pUBS520 (cultivo de control), se diluyó en una relación de 1:50, en
100 ml de medio LB conteniendo ampicilina (100 \mug/ml) y
canamicina (50 \mug/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm,
Alemania) y se agitó a 24ºC y 170 rpm. Después de 3 horas de
crecimiento, se añadieron alícuotas de 5 ml del cultivo a 10 ml del
medio LB conteniendo las cantidades antes citadas de ampicilina y
canamicina y 5 mM de GSH (Fluka, Alemania), y cada uno fue inducido
con 1 mM de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido,
AppliChem, Darmstadt, Alemania). Las células se agitaron durante 21
horas más a 24ºC y 170 rpm y se tomó una muestra de 1 ml después
de determinar el OD_{600}. Estas muestras de 1 ml de células se
fraccionaron en recipientes de reacción Eppendorf de 2 ml mediante
un protocolo modificado de acuerdo con Jacobi et al., (J.
Biol. Chem. 272 (1997) 21692-21699). En detalle, se
añadieron 500 \mul de tampón de fraccionamiento (150 mM de NaCl
(Roth GmbH), 50 mM de Tris/HCl (Roth GmbH, 5 mM de EDTA (Biomol) y 1
mg/ml de sulfato de polimixina B (Sigma), de pH 7,5), al sedimento
de células, se agitaron durante 1 hora a 10ºC en un termoagitador
Eppendorf a 1400 rpm y a continuación se centrifugó durante 15
minutos a 14000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf enfriada a 10ºC
para formar una fracción conteniendo las proteínas periplásmicas
solubles (sobrenadante) y una fracción residual (sedimento).
La actividad del rPA se determinó esencialmente
de acuerdo con el método de Verheijen et al., Thromb.
Haemostasis 48 (1982) 266-269).
Todas las concentraciones de rPA determinadas en
los extractos de células se estandarizaron a suspensiones celulares
de OD_{600} = 1 con el fin de corregir el error que tiene lugar
cuando se efectúa la medición en diferentes tampones. Los resultados
se muestran en la tabla 1.
| \begin{minipage}[t]{120mm} Efecto de la co-secreción de chaperones moleculares en la formación de rPA nativo en el periplasma de E. coli en presencia de 5 mM de GSH en el medio de fermentación\end{minipage} | ||
| Proteína co-secretada | rPA en ng/ml^{*}OD_{600} | Factor de estimulación |
| 0,030 \pm 0,001 | 29 | |
| DnaJ | 0,197 \pm 0,019 | 29 |
| Dominio J | 0,339 \pm 0,007 | 16 |
| Hsp25 | 0,053 \pm 0,002 | 27 |
| ScFvOxazolona | 0,041 \pm 0,003 | 13 |
| (control) |
El cultivo se efectuó en presencia de 5 mM de
GSH. Ejemplo 9.
Los esferoplastos se prepararon con el fin de
comprobar la posición periplásmica y el correcto plegado del DnaJ
que fue secretado en el periplasma por medio del pIN III
ompA3-dnaJ. Para ello se diluyeron 1:50, células
E. coli XLI azules conteniendo pIN III
ompA3-dnaJ, a partir de un precultivo estacionario
en medio LB (1 litro de medio LB contiene 10 g de
Bacto-triptona (Difco Factories, Detroit, Michigan,
USA), 5 g de levaduras(Difco Factories) y 5 g de NaCl (Roth
GmbH, Karlsruhe), conteniendo 100 \mug/25 ml de ampicilina
(Sigma, Deisenhofen), se cultivaron a 37ºC y 200 rpm y se indujeron
después de 2,75 horas (OD_{600} aproximadamente 0,5) con 1 mM de
IPTG. Después de 3 horas de crecimiento en presencia del inductor,
las células se recogieron mediante centrifugación (microcentrífuga
Eppendorf, 5000 rpm, 5 minutos). Se cultivó una cepa de E.
coli que contiene un plásmido para la sobreexpresión
intracelular del DnaJ como control y se indujo durante 3 horas. Los
esferoplastos se prepararon como sigue a partir de los sedimentos
celulares obtenidos después de la centrifugación:
Se fraccionó el equivalente de 2 ml de bacterias,
el cual corresponde a un OD_{600} de 1, de acuerdo con
Thorstenson et al., J. Bacteriol. 179 (1997)
5333-5339. Los esferoplastos acumulados como
sedimento se trataron en 30 \mul de Tris/HCl 50 mM, pH 8,0
conteniendo 100 mM de NaCl. Como control se trataron esferoplastos
en el mismo tampón pero con la adición de 0,1% de Triton®-100
(Amresco, Solon, Ohio, USA). Para una subsiguiente limitada
proteolisis con tripsina, se mezclaron 15 \mul de la respectiva
preparación de esferoplastos (con o sin
Triton®-X-100) con 2 \mul 1 mg/ml de tripsina
(Roche Diagnostics GmbH, GER) y 23 \mul de Tris/HCl 50 mM, pH 8,0
conteniendo 100 mM de NaCl y se incubó a 20ºC. Después de 0,5 y 30
minutes se sacaron muestras de 8 \mul, se mezclaron con 2 \mul
de 4 mg/ml de inhibidor soja-tripsina y 3 \mul de
tampón de aplicación de SDS-PAGE (4% de glicerina
(Sigma, Deisenhofen), 0,5% de SDS (ICN), 2% de mercaptoetanol
(Sigma), 0,0625 M de Tris/HCl, pH 6,8 y azul de bromofenol (Sigma))
y se hirvió durante 5 minutos. En un experimento de control se
mezclaron 2 \mug de DnaJ purificado (2 \mug/\mul) con 1 \mul
de tripsina 100 \mug/ml y 14 \mul de Tris/HCl 50 mM, pH 8,0
conteniendo 100 mM de NaCl, se incubaron a 20ºC y la proteolisis
finalizó en los tiempos citados. Los productos de la proteolisis
fueron separados por SDS-PAGE de acuerdo con Lämmli
et al., (Nature 227 (1970) 680-685). Las
proteínas separadas fueron transferidas sobre membranas de
nitro-celulosa (RioRad Laboratories, Munich)
(Khyse-Anderson, J. Biochem. Biophys. Methods 10
(1984) 203-207; Towbin et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79 (1979) 267-271). Las membranas
fueron bloqueadas durante la noche con TBS-5% de
leche en polvo (Glucksklee, Nestlé Frankfurt) y tratadas
subsiguientemente durante 2 horas con anticuerpos
anti-DnaJ en TBS-5% de leche en
polvo. Después de 3 pasos de lavado de 5 minutos cada vez en TBS, se
incubaron con un anticuerpo adicional (anti-IgG de
conejo peroxidasa, Amersham Life Sciences, Braunschweig) en
TBS-5% de leche en polvo durante 1,5 horas y lavadas
de nuevo 5 veces con tampón TBS. Para la detección se empleó el kit
de detección de ECL por Western blot de la Amersham Company. El
resultado se muestra en la figura 1. Dado que el chaperón secretado
es sensible a la proteasa después de la preparación de los
esferoplastos, esto demostró que está situado en el lado
periplásmico de la membrana interna. En cambio, el DnaJ
intracelular está todavía protegido de la proteasa después de la
preparación de los esferoplastos. La permeabilización de los
esferoplastos mediante Triton-X-100
conduce a la digestión del DnaJ intracelular mediante la tripsina.
El modelo de escisión del DnaJ expresado en el periplasma es
idéntico al del DnaJ nativo purificado. Esto demuestra por lo tanto
que el producto de expresión periplásmico está en la forma nativa
en este compartimento.
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AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Process para la producción de
proteínas plegadas naturalmente, secretadas mediante
co-secreción de chaperones moleculares
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Case 20381
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP99114811.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1881
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (392)..(1591)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1881
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (392)..(790)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (392)..(1090)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (199)..(969)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1137)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Procedimiento para la producción de un
polipéptido eucariótico naturalmente plegado, que contiene dos o
varias cisteínas unidas por puentes de disulfuro, mediante
- a)
- cultivo de células procarióticas en el cual dichas células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica dicho polipéptido, el cual contiene una secuencia señal procariótica en el terminal N,
- b)
- secreción del polipéptido en el periplasma o el medio,
- c)
- escisión de la secuencia señal y aislamiento del polipéptido a partir del periplasma o del medio,
en donde un ácido nucleico codifica una corta
proteína de shock térmico (tipo sHsp) o una proteína de shock
térmico con una masa molar de aproximadamente 40 kDa (tipo Hsp40)
como chaperón molecular, se expresa adicionalmente en dicha célula
procariótica y el chaperón se secreta en el periplasma con la
condición de que el cultivo se efectúe sin la presencia de arginina
o un compuesto de fórmula general I
(I)R_{2}-CO-NRR_{1}
en la
cual
R y R_{1} representan hidrógeno ó una cadena
alquílica de 1 a 4 átomos de carbono saturada o sin saturar,
ramificada o sin ramificar, y
R_{2} representa hidrógeno, NHR_{1} ó una
cadena alquílica de 1 a 3 átomos de carbono saturada o sin saturar,
ramificada o sin ramificar.
2. Procedimiento como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, en donde se añade un reactivo al medio nutriente,
que reduce el tiol.
3. Procedimiento como se ha reivindicado en la
reivindicación 2, en donde se emplea el glutatión (GSH) como
reactivo reductor del tiol.
4. Procedimiento como se ha reivindicado en las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia señal se deriva de
una bacteria gram-negativa.
5. Procedimiento como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico que
codifica el chaperón molecular y el ácido nucleico que codifica el
polipéptido están situados en dos vectores separados.
6. Procedimiento como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ácido nucleico que
codifica el chaperón molecular está situado en el vector de
expresión que contiene también el ácido nucleico que codifica el
polipéptido.
7. Procedimiento como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 5 ó 6, en donde el ADN recombinante que
codifica el chaperón molecular es una unión operativa con un
fragmento de ADN el cual codifica un péptido señal para la
penetración de la membrana bacteriana interna.
8. Procedimiento como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el ADN que codifica el
chaperón molecular secretado y/o la proteína secretada está bajo el
control de una señal de expresión inducible.
9. Procedimiento como se ha reivindicado en una
de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el polipéptido es un
anticuerpo, fragmento de anticuerpo, interferón, una hormona
proteica o una proteasa.
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