ES2228331T3 - Procedimiento para la produccion de proteinas secretadas y plegadas naturalmente. - Google Patents

Procedimiento para la produccion de proteinas secretadas y plegadas naturalmente.

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Abstract

El procedimiento para la producción de polipéptidos eucarióticos solubles en agua plegados de forma natural, que contienen dos o varias cisteínas unidas mediante puentes disulfuro, por cultivo de células procariotas, a) en el cuál, dichas células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica por dicho polipéptido que contiene una secuencia señal procariótica en el N-terminal, b) bajo condiciones bajo las cuáles el polipéptido se secreta en el periplasma o en el medio, c) escindiendo la secuencia señal y aislando el polipéptido del periplasma o del medio, en dónde el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de fórmula general I R2-CO-NRR1 (I) en la que, R y R1 representan hidrógeno o una cadena C1-C4alquilo saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R2 representa hidrógeno, NHR1 o una cadena C1-C3alquilo saturada o insaturada, ramificada o no ramificada.

Description

Procedimiento para la producción de proteínas secretadas y plegadas naturalmente.
La invención concierne a un procedimiento para la producción de polipéptidos secretados y plegados de forma natural, solubles en agua tras la expresión en células procariotas.
La síntesis de proteínas en organismos procariotas, que es también llamada traducción, tiene lugar en los ribosomas en el citoplasma. Cuando el DNA recombinante se expresa en organismos huéspedes procariotas, es a menudo deseable para secretar el producto génico recombinante o la proteína que se obtiene en este procedimiento a partir del citoplasma a través de la membrana bacteriana interna en el espacio periplásmico entre la membrana externa e interna. Las proteínas secretadas pueden entonces ser liberadas del periplasma al medio de nutrientes por ejemplo mediante shock osmótico. Un inconveniente de este procedimiento es que los polipéptidos secretados a menudo no forman la conformación nativa, biológicamente activa (Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456-463; Baynex, Curr. Opin. Biotechnol, 10 (1999) 411-421).
Las recientes chaperonas moleculares y catalizadores de plegamiento tales como peptidil-prolil-cis/trans-isomerasas o proteína disulfuro isomerasas (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) se han usado para aumentar el rendimiento de la proteína recombinante nativa cuando se plega in vivo (Thomas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 66 (1997) 197-238). En algún caso esto ha conducido a mejoras considerables en la expresión p.ej. de ribulosa bisfosfato carboxilasa (RUBISCO; Goloubinoff et al., Nature 337 (1989) 44-47), procolagenasa humana (Lee & Olins, J. Biol. Chem. 267 (1992) 2849-2852) o sintasa de óxido de nitrógeno neuronal a partir de ratas (Roman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 8428-8432). En estos ejemplos GroEL/ES o el sistema DnaK a partir de E. coli se co-sobre-expresó en el citosol. El efecto positivo es normalmente un rendimiento aumentado de la proteína deseada en una forma soluble.
La co-expresión de chaperonas también se ha examinado cuando las proteínas recombinantes se secretan en el periplasma de E. coli. No obstante, en este caso tan sólo una sobreexpresión citosólica de las chaperonas se evaluó con el fin de optimizar la secreción en el periplasma (Perez-Perez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210 (1995) 524-529; Sato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202 (1994) 258-264; Berges et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996) 55-60). Los intentos previos en una co-secreción en E. coli tan sólo ha concernido a los catalizadores de plegamiento tales como por ejemplo proteína disulfuro isomerasa (PDI; Glockshuber et al., EP-A 0 510 658) o peptidilprolil-cis/trans-isomerasas o proteínas Dsb a partir de E. coli (Knappik et al., Bio/Technology 11 (1993) 77-83; Qiu et al., Appl. Environm. Microbiol. 64 (1998) 4891-4896 y Schmidt et al., Prot. Engin. 11 (1998) 601-607). Recientemente, la co-sobre-expresión de la proteína periplasmica Skp condujo a un plegamiento más eficiente de fase desarrolló un rendimiento superior de fragmentos de anticuerpo secretados al periplasma (Bothman y Pluckthun, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 376-380; Hayhurst y Harris, Prot. Expr. Purif. 15 (1999) 336-343).
Los compuestos tales como urea o derivados de urea, formamida, acetamida o L-arginina se usaron en los métodos para la re-naturalización in vitro de los agregados de proteína insolubles (cuerpos de inclusión) que se forman durante la expresión citoplasmática de DNA recombinante en células procariotas. La L-arginina como un aditivo puede mejorar considerablemente el rendimiento de las proteínas plegadas nativamente en la renaturalización in vitro (Rudolph et al., US-Patent No. 5,593,865; Buchner & Rudolph, Bio/ Technology 9 (1991)157-162; Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89 (1992) 3075-3079; Lin & Traugh, Prot. Express. Purif. 4 (1993) 256-264; EP 725140).
El objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para la producción de polipéptidos eucariotas solubles en agua, plegados de forma natural tras la expresión en procariotas que se puede llevar a cabo de una forma simple y que no requiere un trabajo in vitro tras el tratamiento tal como solubilización, reducción y renaturalización de cuerpos de inclusión, reducción y renaturalización.
El objeto es obtener mediante un procedimiento para la producción de un polipéptido eucariota plegado de forma natural y soluble en agua conteniendo dos o varias cisteínas unidas mediante puentes disulfuros, mediante cultivo de células procariotas,
a)
en que dichas células procariotas contienen un vector de expresión que codifica dicho polipéptido que contiene una secuencia señal procariota en el extremo N-terminal,
b)
bajo condiciones bajo las que el polipéptido se secreta en el periplasma o el medio,
c)
escindir la secuencia señal y aislar el polipéptido del periplasma o el medio en donde el cultivo se lleva a cabo en la presencia de arginina o un compuesto de la fórmula general I
(I)R_{2}CO-NRR_{1}
en que
R y R_{1} representan hidrógeno o una cadena C_{1}-C_{4} alquilo saturada o insaturada ramificada o sin ramificar y
R_{2} representa hidrógeno, NHR_{1} o una cadena C_{1}-C_{3} alquilo saturada o sin saturar, ramificada o sin ramificar.
La concentración de arginina o del compuesto de la fórmula general I es preferiblemente al menos 0,1 mol/l, pero también puede ser considerablemente mayor proporcionando que la solubilidad de la arginina o dicho compuesto esté asegurada. La arginina o los compuestos de la fórmula general I son preferiblemente usados a una concentración de 0,1 a 1,5 mol/l.
Formamida, acetamida, urea o derivados de urea tales como etilurea o metilurea se añaden preferiblemente como compuestos de la fórmula general I, al medio de nutrientes que se usa para cultivar las células procariotas. La arginina puede usarse por ejemplo como el hidrocloruro o tal como otra forma titulada de la base arginina. No obstante, L-arginina se usa preferiblemente y la forma hidrocloruro de L-arginina es particularmente preferida.
En una realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, reactivos reductores del tiol que contienen grupos SH se añaden adicionalmente al medio nutriente (medio de fermentación) usado para cultivar las células procariotas que además aumentan el rendimiento de la proteína producida recombinantemente. Se añaden 0,1-15 mmol/l de reactivo tiol preferiblemente. De acuerdo con la invención el término "reactivo tiol" tanto indica un agente reductor (reducción) con grupos SH o una mezcla de agentes reductores con grupos SH y reactivos oxidantes con grupos disulfuro. Las sustancias preferidas son glutatión oxidado y reducido (GSH), cisteína, cistina, N-acetilcisteína, cisteamina, \beta-mercaptoetanol y compuestos similares. Los reactivos tiol se pueden usar simplemente así como en mezclas. Los reactivos tiol tales como glutatión (GSH) que tienen un grupo SH simple por molécula son particularmente apropiados. Los reactivos tiol tales como glutatión son conocidos por mejorar el rendimiento de proteínas plegadas nativamente cuando el DNA recombinante se expresa en células procariotas (Glockshuber et al., EP-A 0 510 658).
En otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención las chaperonas moleculares se sobreexpresan adicionalmente y se co-secretan. Las chaperonas se entienden de acuerdo con la invención como proteínas que protegen otras proteínas no nativas de la agregación in vivo y promueve la formación de su conformación nativa. Las chaperonas moleculares se usaron en el arte anteriormente para estabilizar proteínas y así protegerlas de la agregación e inactivación (Buchner et al., EP-A 0 556 726 Al). Preferiblemente las chaperonas ATP-dependientes del tipo HSP40 (masa molar ca. 40 kDa) o una proteína de shock térmico pequeña (sHSP) se usan preferiblemente. DnaJ es una proteína de shock térmico de 40 kDa que aparece en el citoplasma de E. coli y es una parte del así llamado sistema de chaperonas Hsp70 (Bukau, B. & Horwich, A. Cell 92 (1998) 351-366). DnaK (Hsp70) y GrpE también pertenecen a este sistema. Las proteínas particulares se plegan en la conformación nativa mediante el sistema DnaK en un procedimiento ATP-dependiente (Schroder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144; Langer et al., Nature 356 (1992) 683-689). DnaJ protege las proteínas no nativas de la agregación en la ausencia de DnaK y ATP y media un estado competente de plegado (Schroder et al., EMBO J. 12 (1993) 4137-4144). Se ha demostrado que la co-expresión de DnaJ en el citosol puede llevar a un aumento en el rendimiento de la proteína soluble (Yokoyama et al., Microbiol. Ferment. Technol. 62 (1998) 1205-1210). La co-secreción de un fragmento N-terminal de DnaJ que comprende los aminoácidos 1-108 y a continuación se refiere como al dominio J (Kelley, TIBS 23 (1998) 222-227) se prefiere adicionalmente. Los dominios J y un dominio rico en G/F que son los responsables de las interacciones con DnaK se localizan en esta región (Wall et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 2139-2144). W09818946 describe un procedimiento para producir polipéptidos heterólogos en bacterias en donde los polipéptidos heterólogos y las chaperonas moleculares, DsbA ó DsbC, se secretan en el periplasma de la bacteria. En otro procedimiento la proteína heteróloga se aísla del periplasma o medio usando un agente caotrópico tal como urea. EP885967 describe un método para producir una proteína heteróloga en procariotas mediante cotransformación de DnaJ y recuperando dicha proteína heteróloga del medio de cultivo.
Hsp25 (p.ej. del ratón) es un representativo de las proteínas de shock térmico pequeñas (Gaestel et al., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 209-213) que son una clase omnipresente de las chaperonas. La masa molar de estas proteínas está entre 15 y 30 kDa. Durante el shock térmico existe una acumulación sustancial de sHsps en la célula (hasta 1% de las proteínas celulares totales-Arrigo & Landry (1994), En Morimoto (Hrsg.): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones, Cold Spring Harbour Press, 335-373). Como las proteínas DnaJ, sHsps tienen la propiedad de prevenir la agregación de proteínas no nativas y de mantener a éstas en un estado competente de plegado (Jakob et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 1517-1520; Ehrsperger et al., EMBO J. 16 (1997) 221-229).
El término "sobreexpresión" de acuerdo con la presente invención indica un incremento de la expresión de las proteínas secretadas tales como por ejemplo DnaJ y Hsp25 (preferiblemente en al menos 100%) comparado con la expresión en el tipo salvaje del organismo huésped procariota respectivo. Tal sobre-expresión se puede obtener por ejemplo con los genes (para la proteína, chaperona y/o péptido señal) están bajo el control de una señal de expresión, preferiblemente inducible, fuerte procariótica (por ejemplo de un lac o promotor T7 o un derivado de los mismos).
La construcción de secreción para la sobreexpresión de polipéptidos (proteínas) incluyendo regiones reguladoras (promotor y terminador) en el DNA recombinante se integra preferiblemente en un vector que adicionalmente codifica la arginina-tRNA_{AGA/AGG} que es rara en procariotas o se co-expresa con un vector que codifica este tRNA (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114). Esto permite la co-sobre-expresión de las proteínas respectivas en el periplasma bacteriano así como la trancripción del tRNA^{Arg}_{AGA/AGG} raro, que a menudo resulta en una síntesis aumentada de la proteína deseada en el organismo huésped bacteriano.
Una secuencia señal procariota en el sentido de la invención se entiende como un fragmento de ácido nucleico que deriva de procariotas, preferiblemente de bacterias gram negativas, y asegura que proteínas unidas al péptido señal pueden penetrar a través de las membranas internas bacterianas. Como resultado las proteínas se localizan en el periplasma o en el sorenadante celular. Tales secuencias señal normalmente tienen una longitud de 18-30 aminoácidos y se describen por ejemplo en Murphy & Beckwith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt et al. (editors): Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Vol. 1, ASM Press, Washington, 1996, p. 967-978. La escisión de las secuencias señal bacterianas puede por ejemplo ocurrir tras una secuencia Ala-X-Ala (von Heijne et al., J. Mol. Biol. 184 (1985) 99-105). La estructura de la peptidasa de señal bacteriana se describe en Paetzel et al., Nature 396 (1998)186-190. Las secuencias señal que se usan preferiblemente se escinden de nuevo de la proteína deseada mediante proteasas localizadas en el periplasma de células procariotas. Alternativamente tales proteasas se pueden añadir al sobrenadante celular o a la proteína aislada para escindir la secuencia señal.
El procedimiento de acuerdo con la invención puede mejorar la expresión heteróloga de numerosas proteínas eucariotas tales como por ejemplo proteasas, interferones, hormonas proteicas, anticuerpos o fragmentos de los mismos. El procedimiento es particularmente apropiado para la producción heteróloga de proteínas que contienen al menos dos cisteínas unidas mediante un puente disulfuro en su estado nativo, especialmente cuando no tienen secuencia señal procariota fusionada al extremo N-terminal y cuerpos de inclusión insolubles se forman durante su expresión procariota. El procedimiento es particularmente apropiado para las proteínas que contienen más de 5 puentes disulfuro en el estado nativo. Tal proteína es por ejemplo un activador del plasminógeno recombinante (referido como rPA en la siguiente, Martin et al., Cardiovasc. Drug Rev. 11 (1993) 299-311, US-Patent Nr. 5,223,256). rPA tiene 9 puentes disulfuro que no se forman en el citosol reducido de E. coli.
La localización periplásmica de la proteína y opcionalmente de la chaperona está asegurada por una unión operativa con un péptido señal para penetrar las membranas bacterianas internas.
Una concentración de 0,4 mol/l de L-arginina y 5 mmol/l de glutatión (en el caso de co-secreción de DnaJ, J dominio, Hsp25 y scFv) o 0,4 mol/l de L-arginina sin glutatión (sin co-secreción de DnaJ) ha demostrado ser óptimo para la expresión de tal activador de plasminógeno.
Con el fin de aislar la proteína secretora rPA en una forma funcional en E. coli, el gen para esta proteína a partir del plásmido pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) se fusionó mediante métodos de ingieneria genética a una secuencia señal procariota de bacterias gram negativas, por ejemplo a la secuencia señal de la pectato liasa B (PelB) de Erwinia carotovora. La fusión génica se construyó mediante clonación en el vector pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA). Como resultado la expresión génica está bajo el control del promotor T7. La secuencia señal presente en la proteína de fusión media la secreción en el periplasma. La secuencia señal se escinde durante o tras la secreción mediante una peptidasa localizada en la membrana interna. La proteína secretada se puede plegar en el periplasma. Las condiciones oxidantes en este compartimento permiten la formación de puentes disulfuro (Wuelting y Plückthun, Mol. Microbiol. 12 (1994) 685-692). La adición inventiva de aditivos de bajo peso molecular que mejora el pliegue y los reactivos de tiol en el medio de nutrientes y la co-sobreexpresión simultánea de DnaJ, dominio J o Hsp25 en el periplasma permite el rendimiento de la proteína funcional para ser aumentada en más de 100 veces.
Otros ejemplos de polipéptidos de acuerdo con la invención son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como un fragmento Fv de cadena simple (scFv, p.ej. frente a la hormona estimulante de tiroides, TSH). ScF_{v}s son anticuerpos acortados que tan sólo están compuestos de secciones variables (F_{v}) de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo que están artificialmente fusionados mediante un enlazante de péptidos corto (normalmente Gly4Ser3) (Hudson, Curr. Opin Biotechnol. 9 (1998) 395-402). ScF_{v}s normalmente tiene la misma afinidad por el antígeno que las cepas Fv padres, pero puede estar sobre-expresado en E. coli. Desde que éste tiene puentes disulfuro intradominio estabilizantes que son esenciales para la estabilidad, una expresión en el citosol normalmente lleva a la formación de cuerpos de inclusión (Shibui et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 352-357). ScF_{v}s se puede optimizar específicamente por unión de los antígenos deseados mediante mutaciones aleatorias y la consiguiente selección de despliegue de fagos (Allen et al., TIBS 20 (1995) 511-516; Hoogenboom et al., Immunotechnology 4 (1998) 1-20). La adición de 5 mM GSH y 0,4 M de L-arginina permite el rendimiento de ScF_{v}-TSH tfuncional para ser mejorado 7 veces en el periplasma y en 43 veces en el medio sobrenadante comparado con un cultivo sin aditivos.
Los siguientes ejemplos, publicaciones, el protocolo de secuencia y las figuras además elucidan la invención, el alcance protector de tales resultados de las reivindicaciones de las patentes. Los métodos descritos se deben entender como ejemplos que aún describen la materia sujeto de la invención aún tras modificaciones.
Descripción del listado de secuencia
ID DE SEC NO: 1 y 2 muestran la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-dnaJ que codifica la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA y DnaJ junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) que fueron amplificadas a partir de pIN III ompA3-dnaJ.
ID de SEC NO: 3 y 4 muestran la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-J-dominio que codifica la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA y el dominio J junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) que se ejemplifican a partir de pIN III ompA3-dnaJ.
ID DE SEC NO: 5 y 6 muestran la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25 que codifica la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal OmpA y Hsp25 junto con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) que son amplificadas de pIN III ompA3-hsp25.
ID DE SEC NO: 7 y 8 muestran la secuencia de la parte del plásmido de expresión pUBS520-scFvOx que codifica por la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal PetB y scFvOxazolon juntas con las secuencias reguladoras (promotor, terminador) que son amplificadas de pHEN-scFv o pIN III ompA3.
ID DE SEC NO: 9 y 10 muestran la secuencia de la parte del plásmido de expresión pET20b(+)-rPA que codifica por la proteína de fusión compuesta de la secuencia señal PeIB y rPA.
Descripción de las figuras
Fig. 1 muestra la dependencia de la expresión del nativo rPA en el periplasma de E. coli con 5 mM de GSH en la concentración de L-arginina y varias construcciones de co-secreción.
Fig. 2 muestra una comparación de la expresión del rPA en el periplasma de E. coli BL21 (DE3) cuando es co-secretado con DnaJ y cuando se añaden al medio 5 mM de GSH y varias sustancias de bajo peso molecular que mejoran el plegamiento.
Fig. 3 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-dnaJ.
Fig. 4 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-J-Dominio.
Fig. 5 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25.
Fig. 6 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pUBS520-scFvOx.
Fig. 7 muestra una representación esquemática del plásmido de expresión pET20b(+)-rPA.
Fig. 8 muestra la dependencia de la expresión del scFv-TSH funcional en la concentración de L-arginina en la presencia de 5 mM GSH en el periplasma y en el medio de cultivo.
General
Para la sobreexpresión periplásmica del DnaJ, el dominio J y Hsp25 en E. coli, se fundió el DNA que codifica para estas proteínas mediante un proceso de ingeniería genética, para la secuencia señal de la proteína externa de membrana A(OmpA) de E. Coli, y la fusión se expresó en E. Coli, en un plásmido recombinante bajo el control del promotor lac-lpp. Cómo resultado, la cadena de polipéptido de DnaJ y Hsp25 se transportaron adentro del periplasma del organismo hospedador procariótico y nativamente se plegaron allí. Se demostró su localización y plegamiento nativo mediante una proteólisis limitada con tripsina y mediante Western blot.
Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión pIN III omp A3-dnaJ
Las técnicas moleculares genéticas se basaron en Ausubel et al. (ed.), J. Wiley & Sons, 1997, Curr. Protocol of Molecular Biology. Oligonucleótidos se obtuvieron de las compañías MWG Biotech, Ebersberg o GIBCO Life Sciences, Eggenstein, DE.
El gen que codifica para DnaJ, Gene Bank Accession No. M 12565, se amplificó por PCR y se clonó por medio de los sitios de escisión de restricción creados EcoRl y BamHI dentro del plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442. La secuencia del fragmento clonado por PCR se confirmó por medio de la secuenciación de didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg). El plásmido resultante se llamó pIN III ompA3-dnaJ. La secuencia de DnaJ expresado en el periplasma difiere de aquella proteína de tipo salvaje en la que la secuencia de polipéptido empieza por Gly-Ile-Pro, en lugar de Met, por lo tanto había una extensión N-terminal de 2 aminoácidos. Por lo tanto, el DnaJ está bajo el control de un promotor lac-lpp que es inducido con IPTG (isopropil-(3-D-tiogalactosidasa).
Ejemplo 2 Construcción del plásmido de expresión pUBS520-plN-dnaJ
La región del plásmido pIN III ompA3-dnaJ que codifica por el operón lac-lpp, la secuencia señal, el gen de dnaJ y la región del terminador del operon se amplificó por medio de una PCR (ID DE SEC NO: 1). El producto del PCR se escindió con la endonucleasa de restricción Bglll y se clonó dentro del vector pUBS520 linearizado con la endonucleasa de restricción BamHl. El plásmido resultante se llamó pUBS520-pIN-dnaJ (Fig. 3).
Ejemplo 3 Construcción del plásmido de expresión pUBS 520-plN-J-Dominio
Se insertaron dos codones de parada en el plásmido pUBS 520-plN-dnaJ, después de los nucleótidos 324, por medio del sistema de mutagénesis QuikChange (Promega, Mannheim, DE) por ésto, se expresaron sólo los 108 primeros aminoácidos. La secuencia de la región mutagénica se determinó mediante la secuenciación didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg) y la expresión del fragmento de proteína acortada se detectó mediante Western blot y la detección con un anticuerpo anti-DnaJ. El plásmido que se formó se llamó pUBS 520-plN-J-dominio (Fig. 4).
Ejemplo 4 Construcción del plásmido de expresión pIN III ompA3-hsp25
El gen que codifica por Hsp25, Gene Bank Accession No.: L 07577, se amplificó por PCR y se clonó por medio de sitios de escisión generados EcoRl y BamHl dentro del plásmido de expresión pIN III ompA3 (Ghayreb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437-2442). La secuencia del fragmento clonado PCR se comprobó mediante la secuenciación didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg). El plásmido resultante se llamó pIN III ompA3-hsp25. La secuencia de Hsp25 expresada en el periplasma difiere de la proteína salvaje en aquella secuencia de polipéptido que empieza con Gly-Ile-Leu en lugar de Met, por esto había una extensión N-terminal de 2 aminoácidos. Por esto, Hsp25 está bajo el control de un promotor lac-lpp que es inducido por IPTG (isopropil-(3-D-tiogalactosidasa).
Ejemplo 5 Construcción del plásmido de expresión pUBS520-pIN-hsp25
La región del plásmido pIN III ompA3-hsp25 que codifica por el operón lac-lpp, la secuencia señal, el gen hsp25 y la región terminadora del operón se amplificó por medio de PCR (ID de SEC NO: 5). El producto de PCR se escindió con endonucleasas de restricción BgIII y se clonó dentro del vector pUBS520 linearizado con la endonucleasa de restricción BamHl. El plásmido resultante se le llamó pUBS520-pIN-hsp25 (Fig. 5).
Ejemplo 6 Construcción del plásmido de expresión pUBS520-scFvOx
La co-expresión de una cadena singular del fragmento Fv, que es dirigido contra el hapteno oxazolon (scFvOxazolon; Fiedler y Conrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090-1093) que no tiene propiedades de chaperona, se examinó cómo control negativo.
La región del plásmido pHEN-scFvOx que codifica por el promotor lac, la secuencia señal pelB y el gen scfvox se amplificó por medio de PCR. La región del plásmido pIN III ompA3 que codifica por el terminador Ipp se amplificó en un segundo PCR. Los dos fragmentos se fusionaron en un PCR subsiguiente. El producto de PCR (ID de SEC NO: 7) que se generó de esta manera, se cortó con la endonucleasa de restricción Bglll y se clonó dentro del vector pUBS520 que fue linearizado con la endonucleasa de restricción BamHl.
El plásmido resultante se llamó pUBS520-scFvOx (Fig. 6).
Ejemplo 7 Construcción del plásmido de expresión pET20b(+)-rPA
El gen del activador del plasminógeno (rPA) del vector plasmídico pA27fd7 (Kohnert et al., Protein Engineering 5 (1992) 93-100) se amplificó con la ayuda de un método de PCR. El producto de PCR se escindió con las endonucleasas de restricción Ncol y BamHl y se clonaron dentro del vector plasmídico pET20b(+) (Novagen Inc., Madison, USA). El plásmido codifica por una proteína de fusión que se compone de una secuencia señal de PeIB (pectato liasa de Erwinia carotovora) y rPA y la secreción de rPA dentro del periplasma se comprobó mediante la secuenciación didesoxi (LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE). La construcción se llamó pET20b(+)-rPA (Fig. 7). El rPA se expresó del plásmido bajo el control del promotor T7, la T7-RNA-polimerasa en la cepa E. coli BL21 (DE3) estando bajo el control de un promotor lacUV5. La inducción se llevó a cabo mediante la adición de IPTG.
El rPA expresado en el periplasma difiere del activador de plasminógeno descrito por Kohnert et al. en que el segundo aminoácido (Ser) está sustituido por Ala.
Ejemplo 8 La expresión funcional de rPA en el periplasma de E. coli utilizando cómo aditivos para el medio glutatión y L-arginina
Un cultivo estacionario durante toda la noche de E. coli BL21 (DE3) (Studier & Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130) que ha sido transformado con pET20b(+)-rPA y pUBS520-pIN-dnaJ (co-secreción de DnaJ), un cultivo de toda la noche de E. coli BL21 (DE3) que ha sido transformado con pET20b(+)-rPA y pUBS520-pIN-J-dominio (co-secreción del dominio J), un cultivo de toda la noche de E. coli BL21 (DE3) que había sido transformado con pET20b(+)-rPA y pUBS520-plN-hsp25 (co-secreción de Hsp25), un cultivo de toda la noche de E. coli BL21 (DE3) que había sido transformado con pET20b (+)-rPA y pUBS520-scFvOx (co-secreción de scFvOx), un cultivo de toda la noche de E. coli BL21 (DE3) que había sido transformado con pET20b(+)-rPA y pUBS520 o un cultivo de toda la noche de E. coli BL21 (DE3) que había sido transformado con pET20b(+)y pUBS520 (cultivo control), se diluyeron en un porcentaje de 1:50 en 100 ml de medio LB que contiene ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 gg/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) y agitado a 24ºC y 170 rpm. Después de 3 h de crecimiento, se añadieron 5 ml de alícuotas del cultivo a 10 ml de medio LB que contiene las cantidades anteriormente dichas de ampicilina y kanamicina y varias concentraciones de GSH (0-10 mM, Fluka, DE) y L-arginina HCl (0-0,4 M, ICN) y cada uno fue inducido con 1mM IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactosidasa, AppliChem, Darmstadt, DE). Las células se agitaron durante más de 21 h a 24ºC y 170 rpm y se tomó 1 ml de muestra después de la determinación de DO_{600}. Estas muestras de células de 1 ml se fraccionaron en tubos Eppendorf de 2 ml mediante el protocolo modificado de acuerdo con Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692-21699). En detalle, se añadieron 500 \mul de intermediario de fraccionamiento (150 mM NaCl (Roth GmbH), 50 mM Tris/HCI (Roth GmbH), 5 mM EDTA (Biomol) y 1 mg/ml sulfato de polimixina B (Sigma), pH 7.5) al pellet celular, agitando durante 1 h a 10ºC en un termoagitador de Eppendorf a 1400 rpm y después centrifugando durante 15 min a 14.000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf enfriada a 10ºC para formar una fracción que contiene las proteínas periplásmicas solubles (sobrenadante) y una fracción residual (pellet).
Se determinó la actividad de rPA de acuerdo con el método de Verheijen et al. Thromb. Hemostasis 48 (1982) 266-269).
Todas las concentraciones determinadas de rPA en los extractos celulares se estandarizaron con las suspenciones celulares de DO_{600}=1 con el propósito de corregir el error que ocurre cuando se miden diferentes intermediarios.
Ejemplo 9 Expresión funcional del rPA en el periplasma de E. coli usando mezclas de glutatión con formamida, metilformamida, acetamida, metilurea y etilurea cómo aditivos para el medio
Un cultivo estacionario durante toda la noche de E. coli BL21 (DE3), que había sido transformado con pET20b(+)-rPA y pUBS520-pIN-dnaJ (co-secreción de DnaJ) fue cultivado cómo lo declarado en el ejemplo 8. Los compuestos de la fórmula I, se añadieron adicionalmente en cada caso 5 mM de glutatión al medio de cultivo. Se cultivó un cultivo de control en LB sin aditivos. Los compuestos de la fórmula I y las concentraciones utilizadas se enumeran en la tabla 2. La preparación de la muestra, el fraccionamiento del periplasma y el test enzimático para la actividad tPA se llevaron a cabo cómo lo declarado en el ejemplo 8.
Las tablas 1 y 2 y las figuras 1 y 2 muestran los resultados de la expresión del rPA.
TABLA 1
1
El cultivo se llevó a cabo en la presencia de 5 mM de GSH.
TABLA 2
2
Ejemplo 10 Expresión de una cadena simple funcional del fragmento Fv con la adición del glutatión reducido y la L-arginina al medio de cultivo
Un cultivo estacionario durante toda la noche de E. coli BL21(DE3) que ha sido transformado con un plásmido que codifica por una cadena simple del fragmento Fv de un anticuerpo anti-TSH (US-Patent No. 5,614,367) y pUBS520, (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114) se diluye en una proporción de 1:50 en 100 ml del medio LB que contiene ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml, Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE) y se agita a 24ºC y 170 rpm. Después de 3 h de crecimiento, se añadieron 5 ml de alícuotas del cultivo a 10 ml de medio LB, que contenía las cantidades antes mencionadas de ampicilina y kanamicina y varias concentraciones de GSH (0-10 mM, Fluka) y L-arginina HCl (0-0,4 M, ICN) y cada uno se indujo con 1 mM de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactosidasa, AppliChem, Darmstadt). Las células se agitaron durante otras 21 h a 24ºC y 170 rpm y se sacó 1 ml de la muestra después de determinar la DO_{600}. Estas muestras celulares de 1 ml se fraccionaron en tubos Eppendorf de 2 ml mediante el protocolo modificado de acuerdo con Jacobi et al. (J. Biol. Chem. 272 (1997) 21692-21699) (ver ejemplo 8). Además se recogió una muestra del sobrenadante del medio (1 ml). Las muestras se sometieron a un test de ELISA para analizarlas por anticuerpos funcionales.
La unión del scFv-TSH nativo a TSH se estandarizó con un scFv-TSH estandard, purificado con el sistema RPAS (Pharmacia Biotech, Alemania) (una unidad corresponde a la unión de 1 \mul estandard con la placa de microtitulación revestida con TSH). La adición de L-arginina al medio de cultivo también tenía un efecto positivo en la producción de scFv-TSH nativo en el periplasma y en el medio sobrenadante de E. coli. La adición de 0,4 M de L-arginina y 5 mM de GSH hace posible la cantidad de fragmentos de anticuerpos que son detectados por medio de ELISA para ser incrementado 7 veces en el sobrenadante del medio y mediante 43 veces en la fracción periplásmica comparado con el cultivo con 5 mM de GSH (Fig. 8).
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Claims (10)

1. El procedimiento para la producción de polipéptidos eucarióticos solubles en agua plegados de forma natural, que contienen dos o varias cisteínas unidas mediante puentes disulfuro,
por cultivo de células procariotas,
a)
en el cuál, dichas células procarióticas contienen un vector de expresión que codifica por dicho polipéptido que contiene una secuencia señal procariótica en el N-terminal,
b)
bajo condiciones bajo las cuáles el polipéptido se secreta en el periplasma o en el medio,
c)
escindiendo la secuencia señal y aislando el polipéptido del periplasma o del medio,
en donde el cultivo se lleva a cabo en presencia de arginina o un compuesto de fórmula general I
(I)R_{2}-CO-NRR_{1}
en la que,
R y R_{1} representan hidrógeno o una cadena C_{1}-C_{4}alquilo saturada o insaturada, ramificada o no ramificada, y R_{2} representa hidrógeno, NHR_{1} o una cadena C_{1}-C_{3}alquilo saturada o insaturada, ramificada o no ramificada.
2. Un procedimiento cómo se reivindica en la reivindicación 1, en dónde la arginina se utiliza cómo el ácido clorhídrico o cómo otra forma titulada.
3. Un procedimiento cómo se reivindica en las reivindicaciones 1 a 2, dónde se añade al medio nutritivo un reactivo de tiol reductor.
4. Un procedimiento cómo se reivindica en la reivindicación 3, en dónde el glutatión (GSH) se utiliza cómo reactivo tiol reductor.
5. Un procedimiento cómo se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4, en dónde la secuencia señal se deriva de una bacteria gram negativa.
6. Un procedimiento cómo se reivindica en una de las reivindicaciones de 1 a 5, en dónde las células procarióticas contienen un vector de expresión adicional que codifica por una chaperona molecular.
7. Un procedimiento cómo se reivindica en la reivindicación 6, en dónde la chaperona molecular es DNAJ de E. coli o HSP25.
8. Un procedimiento cómo se reivindica en una de las reivindicaciones 6 ó 7, en dónde el DNA recombinante que codifica para una chaperona molecular está en unión operativa con un fragmento de DNA que codifica por un péptido señal para penetrar en la membrana interna bacteriana.
9. Un procedimiento cómo se reivindica en una de las reivindicaciones de 6 a 8, en dónde el DNA codificante para la chaperona molecular secretada y/o para la proteína secretada está bajo el control de una señal de expresión inducible.
10. Un procedimiento cómo se reivindica en una de las reivindicaciones de 1 a 9, en dónde el polipéptido es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, interferón, hormona proteica o una proteasa.
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