ES2310924T3 - Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. - Google Patents
Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2310924T3 ES2310924T3 ES94922889T ES94922889T ES2310924T3 ES 2310924 T3 ES2310924 T3 ES 2310924T3 ES 94922889 T ES94922889 T ES 94922889T ES 94922889 T ES94922889 T ES 94922889T ES 2310924 T3 ES2310924 T3 ES 2310924T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- adenovirus
- plasmid
- virus
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/075—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Adenovirus recombinante defectivo caracterizado porque comprende: - las secuencias ITR, - una secuencia que permite la encapsidación, - una secuencia de ADN heterólogo - una región que contiene el gen E2, y - en el que el gen E1 y al menos el gen E4 no son funcionales.
Description
Vectores adenovirales defectivos y utilización
en terapia génica.
La presente invención se refiere a nuevos
vectores virales, a su preparación y a su utilización en terapia
génica. Se refiere igualmente a las composiciones farmacéuticas que
contienen dichos vectores virales. Más particularmente, la presente
invención se refiere a adenovirus recombinantes como vectores para
la terapia génica.
La terapia génica consiste en corregir una
deficiencia o una anormalidad (mutación, expresión aberrante, etc)
mediante la introducción de una información genética en la célula o
el órgano afectado. Esta información genética puede introducirse
bien in vitro en una célula extraída del órgano, volviéndose
a introducir la célula modificada en el organismo, bien
directamente in vivo en el tejido apropiado. En este segundo
caso, existen diferentes técnicas, entre las que las diversas
técnicas de transfección implican complejos de ADN y de
DEAE-dextrano (Pagano et al., J. Virol. 1
(1967) 891), de ADN y de proteínas nucleares (Kaneda et al.,
Science 243 (1989) 375), de ADN y de lípidos (Felgner et
al., PNAS 84 (1987) 7413), el empleo de liposomas (Fraley et
al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Más recientemente,
el empleo de virus como vectores para la transferencia de genes ha
surgido como una alternativa prometedora a estas técnicas físicas de
transfección. A este respecto, se han ensayado diferentes virus
para evaluar su capacidad para infectar determinadas poblaciones
celulares. En particular, los retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), el
virus HSV, los virus adeno-asociados y los
adenovirus.
Entre estos virus, los adenovirus presentan
determinadas propiedades interesantes para una utilización en
terapia génica. Principalmente, tienen un espectro de anfitriones
bastante amplio, son capaces de infectar células quiescentes, no se
integran en el genoma de la célula infectada y no se han asociado
hasta la fecha a patologías importantes en el ser humano.
Los adenovirus son virus con ADN de doble hebra
lineal con un tamaño de 36 kb aproximadamente. Su genoma comprende
principalmente una secuencia inversa repetida (ITR) en su extremo,
una secuencia de encapsidación, genes precoces y genes tardíos
(Véase la figura 1). Los principales genes precoces son los genes E1
(E1a y E1b), E2, E3 y E4. Los principales genes tardíos son los
genes L1 a L5.
Habida cuenta de las propiedades de los
adenovirus mencionadas anteriormente, éstos ya han sido utilizados
para la transferencia de genes in vivo. A este efecto, se han
preparado diferentes vectores derivados de los adenovirus que
incorporan diferentes genes (\beta-gal, OTC,
\alpha-1 AT, citoquinas, etc). En cada una de
estas construcciones, el adenovirus se ha modificado de manera que
se vuelve incapaz de replicación en la célula infectada. Así, las
construcciones descritas en la técnica anterior son adenovirus a los
que se han delecionado las regiones E1 (E1a y/o E1b) y
opcionalmente E3 en cuyo lugar se insertan las secuencias de ADN
heterólogo (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195;
Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161).
WO 93/06223 divulga adenovirus derivados de dl324 que contienen el
gen de la beta-galactosidasa y tienen deleciones de
las regiones E1 y E3. Sin embargo, los vectores descritos en la
técnica anterior presentan numerosos inconvenientes que limitan su
explotación en terapia génica. En particular, todos estos vectores
incluyen numerosos genes virales cuya expresión in vivo no
es deseable en el marco de una terapia génica. Además, estos
vectores no permiten la incorporación de fragmentos de ADN con un
tamaño muy grande, que pueden ser necesarios para determinadas
aplicaciones.
La presente invención permite remediar estos
inconvenientes. La presente invención describe en efecto adenovirus
recombinantes para la terapia génica, capaces de transferir de
manera eficaz ADN (hasta 30 kb) in vivo, de expresar a
niveles elevados y de manera estable este ADN in vivo,
limitando cualquier riesgo de producción de proteínas virales, de
transmisión del virus, de patogenicidad, etc. En particular, se ha
encontrado que es posible reducir considerablemente el tamaño del
genoma del adenovirus, sin impedir la formación de una partícula
viral encapsidada. Esto es sorprendente en la medida en la que se
había observado en el caso de otros virus, por ejemplo retrovirus,
que determinadas secuencias distribuidas a lo largo del genoma eran
necesarias para una encapsidación eficaz de las partículas virales.
Por esto, la realización de vectores que poseen importantes
deleciones internas estaba muy limitada. La presente invención
muestra igualmente que la supresión de la mayor parte de los genes
virales no impide tampoco la formación de una partícula viral.
Además, los adenovirus recombinantes así obtenidos conservan, a
pesar de las modificaciones importantes de su
\hbox{estructura
genómica, sus propiedades ventajosas de alto poder infeccioso, de
estabilidad in vivo , etc.}
Los vectores de la invención son particularmente
ventajosos ya que permiten la incorporación de secuencias de ADN
deseadas con un tamaño muy grande. Así, es posible insertar un gen
con una longitud superior a 30 kb. Esto es particularmente
interesante para determinadas patologías cuyo tratamiento necesita
la co-expresión de varios genes o la expresión de
genes muy grandes. Así, por ejemplo, en el caso de la distrofia
muscular, no era posible hasta el presente transferir el ADNc
correspondiente al gen nativo responsable de esta patología (gen de
la distrofina) debido a su gran tamaño (14 kb).
Los vectores de la invención son igualmente muy
ventajosos ya que poseen muy pocas regiones virales funcionales,
por esto, los riesgos inherentes a la utilización de virus como
vectores en terapia génica tales como inmunogenicidad,
patogenicidad, transmisión, replicación, recombinación, etc se
reducen en gran medida e incluso se suprimen.
La presente invención proporciona así vectores
virales particularmente adaptados a la transferencia y a la
expresión in vivo de secuencias de ADN deseadas.
El objeto de la presente invención se refiere,
por lo tanto, a un adenovirus recombinante defectivo que
comprende:
- -
- las secuencias ITR,
- -
- una secuencia que permite la encapsidación,
- -
- una secuencia de ADN heterólogo,
- -
- una región que contiene el gen E2,
y en el
que:
- -
- el gen E1 no es funcional y
- -
- al menos el gen E4, no es funcional.
En el sentido de la presente invención, el
término "adenovirus defectivo" designa un adenovirus incapaz de
replicarse de forma autónoma en la célula diana. Generalmente, el
genoma de los adenovirus defectivos según la presente invención
está por lo tanto desprovisto al menos de las secuencias necesarias
para la replicación de dicho virus en la célula infectada. Estas
regiones pueden eliminarse (en todo o en parte), bien volviéndolas
no funcionales o bien sustituyéndolas por otras secuencias y
principalmente por la secuencia de ADN heterólogo.
Las secuencias inversas repetidas (ITR)
constituyen el origen de replicación de los adenovirus. Están
localizadas en los extremos 3' y 5' del genoma viral (Véase la
figura 1), a partir de los que pueden aislarse fácilmente según las
técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en
la técnica. La secuencia nucleotídica de las secuencias ITR de los
adenovirus humanos (en particular de los serotipos Ad2 y Ad5) está
descrita en la bibliografía, así como de los adenovirus caninos
(principalmente CAV1 y CAV2). En lo que se refiere al adenovirus
Ad5 por ejemplo, la secuencia ITR izquierda corresponde a la región
que comprende los nucleótidos 1 a 103 del genoma.
La secuencia de encapsidación (designada
igualmente secuencia Psi) es necesaria para la encapsidación del
ADN viral. Por lo tanto, esta región debe estar presente para
permitir la preparación de adenovirus recombinantes defectivos
según la invención. La secuencia de encapsidación está localizada en
el genoma de los adenovirus entre 1TTR izquierda (5') y el gen E1
(Véase la figura 1). Puede aislarse o sintetizarse artificialmente
mediante las técnicas clásicas de biología molecular. La secuencia
nucleotídica de la secuencia de encapsidación de los adenovirus
humanos (en particular de los serotipos Ad2 y Ad5) está descrita en
la bibliografía, así como de los adenovirus caninos (principalmente
CAV1 y CAV2). En lo que se refiere al adenovirus Ad5 por ejemplo,
la secuencia de encapsidación corresponde a la región que comprende
los nucleótidos 194 a 358 del genoma.
Existen diferentes serotipos de adenovirus, cuya
estructura y propiedades varían un poco. Sin embargo, estos virus
presentan una organización genética comparable y las enseñanzas
descritas en la presente solicitud pueden reproducirse fácilmente
por el experto en la técnica para cualquier tipo de adenovirus.
Los adenovirus de la invención pueden ser de
origen humano, animal o mixto (humano y animal).
En lo que se refiere a los adenovirus de origen
humano, se prefiere utilizar las clases del grupo C. Más
preferentemente, entre los diferentes serotipos de adenovirus
humanos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención
los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad 2 o Ad 5).
Como se ha indicado más arriba, los adenovirus
de la invención pueden ser igualmente de origen animal o incluir
secuencias procedentes de adenovirus de origen animal. La
solicitante ha mostrado en efecto que los adenovirus de origen
animal son capaces de infectar con una gran eficacia células humanas
y que son incapaces de propagarse en las células humanas en las que
se han ensayado (Véase la solicitud FR 93 05954). La solicitante ha
mostrado igualmente que los adenovirus de origen animal no se
transcomplementan de ninguna manera con los adenovirus de origen
humano, lo que elimina cualquier riesgo de recombinación y de
propagación in vivo, en presencia de un adenovirus humano,
que puede dar lugar a la formación de una partícula infecciosa. La
utilización de adenovirus o de regiones de adenovirus de origen
animal es, por lo tanto, particularmente ventajosa ya que los
riesgos inherentes a la utilización de virus como vectores en
terapia génica son muy bajos.
Los adenovirus de origen animal utilizables en
el marco de la presente invención pueden ser de origen canino,
bovino, murino, (ejemplo: Mav1, Beard et al., Virology 75
(1990) 81), ovino, porcino, aviar o incluso de simio (ejemplo:
SAV). Más particularmente, entre los adenovirus aviares, se pueden
citar los serotipos 1 a 10 accesibles en la ATCC, como por ejemplo
las cepas Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC
VR-280), P7-A (ATCC
VR-827), IBH-2A (ATCC
VR-828), J2-A (ATCC
VR-829), T8-A (ATCC
VR-830), K-11 (ATCC
VR-921) o también las cepas con referencia de ATCC
VR-831 a 835. Entre los adenovirus bovinos, se
pueden utilizar los diferentes serotipos conocidos y principalmente
los disponibles en la ATCC (tipos 1 a 8) con las referencias ATCC
VR-313, 314, 639-642, 768 y 769. Se
pueden citar igualmente los adenovirus murinos FL (ATCC
VR-550) y E20308 (ATCC VR-528), el
adenovirus ovino tipo 5 (ATCC VR-1343) o tipo 6
(ATCC VR-1340); el adenovirus porcino 5359) o los
adenovirus de simios tales como principalmente los adenovirus con
referencia en la ATCC con los números
VR-591-594, 941-943,
195-203, etc.
Preferentemente, entre los diferentes adenovirus
de origen animal, se utilizan en el marco de la invención
adenovirus o regiones de adenovirus de origen canino y
principalmente todas las cepas de adenovirus CAV2 [cepa manhattan o
A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Los adenovirus
caninos han sido el objeto de numerosos estudios estructurales.
Así, se han descrito mapas de restricción completos de los
adenovirus CAV1 y CAV2 en la técnica anterior (Spibey et
al., J. Gen. Virot. 70 (1989) 165) y los genes E1a, E3 así como
se han clonado y secuenciado las secuencias ITR (véase
principalmente Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241;
Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Como se ha indicado anteriormente, los
adenovirus de la presente invención incluyen una secuencia de ADN
heterólogo. La secuencia de ADN heterólogo designa cualquier
secuencia de ADN introducida en el virus recombinante, de la que se
investiga su transferencia y/o expresión en la célula diana.
En particular, la secuencia de ADN heterólogo
puede incluir uno o varios genes terapéuticos y/o uno o varios
genes que codifican péptidos antigénicos.
Los genes terapéuticos que pueden transferirse
así son cualquier gen cuya transcripción y opcionalmente traducción
en la célula diana generan productos que tienen un efecto
terapéutico.
Puede tratarse, en particular, de genes que
codifican productos proteicos que tienen un efecto terapéutico. El
producto proteico así codificado puede ser una proteína, un péptido,
un aminoácido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo
respecto a la célula diana (es decir, un producto que se expresa
normalmente en la célula diana cuando ésta no presenta ninguna
patología). En este caso, la expresión de una proteína permite, por
ejemplo, paliar una expresión insuficiente en la célula o la
expresión de una proteína inactiva o débilmente activa debido a una
modificación o también sobreexpresar dicha proteína. El gen
terapéutico también puede codificar un mutante de una proteína
celular, que tiene una estabilidad incrementada, una actividad
modificada, etc. El producto proteico puede ser igualmente
heterólogo respecto a la célula diana. En este caso, una proteína
expresada puede, por ejemplo, completar o aportar una actividad
deficiente en la célula lo que la permite luchar contra una
patología.
Entre los productos terapéuticos en el sentido
de la presente invención, se pueden citar más particularmente
enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfoquinas:
interleuquinas, interferones, TNF, etc (FR 9203120), factores de
crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,
NT3, NT5, etc; apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93
05125), distrofina o una minidistrofina (FR 9111947), genes
supresores de tumores: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev,
etc (FR 93 04745), genes que codifican factores implicados en la
coagulación: Factores VII, VIII, IX, etc.
El gen terapéutico puede ser igualmente un gen o
una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula diana
permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm
celulares. Dichas secuencias pueden, por ejemplo, transcribirse en
la célula diana en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear
así su traducción en proteínas, según la técnica descrita en la
patente EP 140308.
Como se ha indicado más arriba, la secuencia de
ADN heterólogo puede incluir igualmente uno o varios genes que
codifican un péptido antigénico, capaz de generar en el ser humano
una respuesta inmunitaria. En este modo particular de aplicación,
la invención permite, por lo tanto, la realización de vacunas que
permiten inmunizar al ser humano, principalmente contra
microorganismos o virus. Puede tratarse principalmente de péptidos
antigénicos específicos del virus de epstein barr, virus HIV, virus
de la hepatitis B (EP 185 573), virus de la
pseudo-rabia o también específicos de tumores (EP
259 212).
Generalmente, la secuencia de ADN heterólogo
comprende igualmente secuencias que permiten la expresión del gen
terapéutico y/o del gen que codifica el péptido antigénico en la
célula infectada. Puede tratarse de secuencias que son responsables
naturalmente de la expresión del gen considerado cuando estas
secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada.
Puede tratarse igualmente de secuencias de origen diferente
(responsables de la expresión de otras proteínas o incluso
sintéticas). Principalmente, puede tratarse de secuencias promotoras
de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede tratarse de
secuencias promotoras procedentes del genoma de la célula que se
desea infectar. Asimismo, puede tratarse de secuencias promotoras
procedentes del genoma de un virus, incluido el adenovirus
utilizado. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los
promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas
secuencias de expresión pueden modificarse por adición de
secuencias de activación, de regulación, etc. Por otra parte, cuando
el gen insertado no contiene secuencias de expresión, puede
insertarse en el genoma del virus defectivo en posición 3' respecto
a dicha secuencia.
Por otra parte, la secuencia de ADN heterólogo
puede incluir igualmente, en particular en posición 5' respecto al
gen terapéutico, una secuencia señal que dirige el producto
terapéutico sintetizado a las vías de secreción de la célula diana.
Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del
producto terapéutico, aunque puede tratarse igualmente de cualquier
otra secuencia señal funcional o de una secuencia señal
artificial.
Como se ha indicado anteriormente, los vectores
de la invención poseen una región que contiene el gen E2 y al menos
el gen E1 y el gen E4 no son funcionales. El gen viral considerado
puede hacerse no funcional por cualquier técnica conocida por el
experto en la técnica y principalmente por supresión, sustitución,
deleción o adición de una o varias bases en el o los genes
considerados. Dichas modificaciones pueden obtenerse in
vitro (en el ADN aislado) o in situ, por ejemplo,
mediante las técnicas de ingeniería genética o incluso por
tratamiento mediante agentes mutágenos.
Entre los agentes mutágenos se pueden citar, por
ejemplo, los agentes físicos tales como las radiaciones energéticas
(rayos X, g, ultravioleta, etc.) o los agentes químicos capaces de
reaccionar con diferentes grupos funcionales de las bases del ADN
y, por ejemplo, los agentes alquilantes [sulfonato de etilmetano
(EMS),
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina,
N-nitroquinoleina-1-óxido (NQO)],
los agentes bialquilantes, los agentes intercalantes, etc.
Por deleción se entiende en el sentido de la
invención cualquier supresión del gen considerado. Puede tratarse
principalmente de toda o parte de la región que codifica dicho gen
y/o de toda o parte de la región promotora de la transcripción de
dicho gen. La supresión puede efectuarse por digestión mediante
enzimas de restricción apropiadas y ligación según las técnicas
clásicas de biología molecular, así como se ilustra en los
ejemplos.
Las modificaciones genéticas pueden obtenerse
igualmente por disrupción génica, por ejemplo según el protocolo
inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1.983)
202]. En este caso, toda o parte de la secuencia codificadora se
perturba preferentemente para permitir el reemplazamiento, por
recombinación homóloga, de la secuencia genómica por una secuencia
no funcional o mutante.
Dicha o dichas modificaciones genéticas pueden
estar localizadas en la parte codificadora del gen en cuestión o
fuera de la región codificadora y por ejemplo en las regiones
responsables de la expresión y/o de la regulación transcripcional
de dichos genes. El carácter no funcional de dichos genes puede
manifestarse, por lo tanto, por la producción de una proteína
inactiva debido a modificaciones estructurales o conformacionales,
por la ausencia de producción, por la producción de una proteína
que tiene alterada una actividad o por la producción de la proteína
natural a un nivel atenuado o según un modo de regulación
deseado.
Por otra parte, determinadas alteraciones tales
como las mutaciones puntuales son por naturaleza capaces de ser
corregidas o atenuadas por los mecanismos celulares. Dichas
alteraciones genéticas tienen un interés limitado a nivel
industrial. Por lo tanto, se prefiere particularmente que el
carácter no funcional sea perfectamente estable segregacionalmente
y/o no reversible.
Preferentemente, el gen no es funcional debido a
una deleción parcial o total.
Preferentemente, los adenovirus recombinantes
defectivos de la invención están desprovistos de genes tardíos de
adenovirus.
En la presente memoria, también se divulga un
adenovirus recombinante defectivo que comprende:
- -
- las secuencias ITR,
- -
- una secuencia que permite la encapsidación,
- -
- una secuencia de ADN heterólogo, y
- -
- una región que contiene el gen o una parte del gen E2;
así como un adenovirus recombinante
defectivo que
comprende:
- -
- las secuencias ITR,
- -
- una secuencia que permite la encapsidación,
- -
- una secuencia de ADN heterólogo, y
- -
- una región que contiene el gen o una parte del gen E4.
En un modo particularmente ventajoso, los
vectores de la invención poseen además un gen E3 funcional bajo el
control de un promotor heterólogo. Más preferentemente, los vectores
poseen una parte del gen E3 que permite la expresión de la proteína
gp19K.
Los adenovirus recombinantes defectivos según la
invención pueden prepararse de diferentes formas.
Un primer método consiste en transfectar el ADN
del virus recombinante defectivo preparado in vitro (bien
por ligación o bien en forma de plásmido) en una línea celular
competente, es decir que contiene en trans todas las funciones
necesarias para la complementación del virus defectivo. Estas
funciones están preferentemente integradas en el genoma de la
célula, lo que permite evitar los riesgos de recombinación y
confiere una estabilidad incrementada a la línea celular. La
preparación de dichas líneas celulares se describe en los
ejemplos.
Un segundo método consiste en
co-transfectar en una línea celular apropiada el ADN
del virus recombinante defectivo preparado in vitro (bien
por ligación o bien en forma de plásmido) y el ADN de un virus
auxiliar. Según este método, no es necesario disponer de una línea
celular competente capaz de complementar todas las funciones
defectivas del adenovirus recombinante. Una parte de estas funciones
se complementa en efecto por el virus auxiliar. Este virus auxiliar
debe ser él mismo defectivo y la línea celular contiene en trans las
funciones necesarias para su complementación. La preparación de
adenovirus recombinantes defectivos de la invención según este
método se ilustra igualmente en los ejemplos.
Entre las líneas celulares utilizables en el
marco de este segundo método, se pueden citar principalmente la
línea de riñón embrionario humano 293, las células KB, las células
Hela, MDCK, GHK, etc (Véanse los ejemplos).
A continuación, los vectores que se multiplican
se recuperan, purifican y amplifican según las técnicas clásicas de
biología molecular.
La presente invención se refiere también, por lo
tanto, a las líneas celulares infectables por los adenovirus que
comprenden, integradas en su genoma, las funciones necesarias para
la complementación de un adenovirus recombinante defectivo tal como
se ha descrito anteriormente. En particular, se refiere a las líneas
celulares que incluyen, integradas en su genoma, las regiones E1 y
E2 (principalmente la región que codifica la proteína 72K) y/o E4
y/o el gen del receptor de los glucocorticoides. Preferentemente,
estas líneas se obtienen a partir de la línea 293 o gm DBP6.
La presente invención se refiere igualmente a
cualquier composición farmacéutica que comprende uno o varios
adenovirus recombinantes defectivos tales como se han descrito
anteriormente. Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden formularse con vista a una administración por vía tópica,
oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular,
subcutánea, intraocular, transdérmica, etc.
Preferentemente, la composición farmacéutica
contiene vehículos aceptables farmacéuticamente para una formulación
inyectable. Puede tratarse en particular de disoluciones salinas
(fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o
magnesio, etc, o mezclas de dichas sales), estériles, isotónicas o
de composiciones secas, principalmente liofilizadas, que, por
adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico,
permiten la constitución de solutos inyectables.
Las dosis de virus utilizadas para inyección
pueden adaptarse en función de diferentes parámetros y,
principalmente, en función del modo de administración utilizado, de
la patología en cuestión, del gen a expresar o también de la
duración del tratamiento buscado. De una manera general, los
adenovirus recombinantes según la invención se formulan y
administran en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y
10^{14} pfu/ml y preferentemente 10^{6} a 10^{10} pfu/ml. El
término pfu ("unidad formadora de placas") corresponde al poder
infeccioso de una disolución de virus y se determina por infección
de un cultivo celular apropiado y mide generalmente después de 5
días, el número de halos de lisis de células infectadas. Las
técnicas de determinación de la titulación pfu de una disolución
viral están bien documentadas en la bibliografía.
Según la secuencia de ADN heterólogo insertada,
los adenovirus de la invención pueden utilizarse para el tratamiento
o la prevención de numerosas patologías, incluyendo las
enfermedades genéticas (distrofia, fibrosis quística, etc), las
enfermedades neurodegenerativas (alzheimer, parkinson, ALS, etc),
los cánceres, las patologías asociadas a trastornos de la
coagulación o a dislipoproteinemias, las patologías asociadas a
infecciones virales (hepatitis, SIDA, etc), etc.
La presente invención se describirá más
completamente mediante los ejemplos siguientes, que se deben
considerar como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Organización genética del adenovirus
Ad5. La secuencia completa de Ad5 está disponible en bases de datos
y permite al experto en la técnica seleccionar o crear cualquier
sitio de restricción y así aislar cualquier región del genoma.
Figura 2: Mapa de restricción del adenovirus
CAV2 cepa Manhattan (según Spibey et al citado
anteriormente).
Figura 3: Construcción de virus defectivos de la
invención por ligación.
Figura 4: Construcción de un virus recombinante
que contiene el gen E4.
Figura 5: Construcción de un virus recombinante
que contiene el gen E2.
Figura 6: Construcción y representación del
plásmido pPY32.
Figura 7: Representación del plásmido pPY55.
Figura 8: Representación del plásmido p2.
Figura 9: Representación del plásmido intermedio
utilizado para la construcción del plásmido
pITRL5-E4.
Figura 10: Representación del plásmido
pITRL5-E4.
Los métodos utilizados clásicamente en biología
molecular tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico,
centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio,
electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, purificación de
fragmentos de ADN por electroelución, extracción de proteínas con
fenol o con fenol-cloroformo, precipitación de ADN
en medio salino con etanol o isopropanol, transformación en
Escherichia coli, etc..., son muy conocidos por el experto
en la técnica y se describen extensamente en la bibliografía
[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York,
1987].
Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de
la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research
Laboratories).
Para las ligaciones, los fragmentos de ADN
pueden separarse según su tamaño por electroforesis en geles de
agarosa o acrilamida, extraerse con fenol o con una mezcla
fenol/cloroformo, precipitarse con etanol y después incubarse en
presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las
recomendaciones del proveedor.
El relleno de los extremos 5' prominentes puede
efectuarse mediante el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I
de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del
proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se efectúa
en presencia de la ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada
según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los
extremos 5' prominentes se efectúa por un tratamiento moderado con
la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodesoxinucleótidos sintéticos puede efectuarse según el método
desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985)
8749-8764] utilizando el kit distribuido por
Amersham.
La amplificación enzimática de los fragmentos de
ADN mediante la técnica mencionada de PCR
[Polymerase-catalyzed Chain
Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230
(1985) 1350-1354; Mullis K. B. y Faloona F. A.,
Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] puede efectuarse
utilizando un "ciclador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus)
según las especificaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas
puede efectuarse por el método desarrollado por Sanger et
al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-5467] utilizando el kit distribuido por
Amersham.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos siguientes, se han utilizado o
pueden utilizarse las líneas celulares siguientes:
- -
- Línea de riñón embrionario humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Esta línea contiene principalmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma del adenovirus humano Ad5 (12%).
- -
- Línea de células humanas KB: Procedente de un carcinoma epidérmico humano, esta línea se puede obtener en la ATCC (ref. CCL17) así como las condiciones que permiten su cultivo.
- -
- Línea de células humanas Hela: Procedente de un carcinoma de epitelio humano, esta línea se puede obtener en la ATCC (ref. CCL2) así como las condiciones que permiten su cultivo.
- -
- Línea de células caninas MDCK: Las condiciones de cultivo de las células MDCK las han descrito principalmente Macatney et al., Science 44 (1988) 9.
- -
- Línea de células gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624).
Esta línea está constituida por células Hela que
contienen el gen E2 de adenovirus bajo el control del LTR de
MMTV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
Este ejemplo demuestra la factibilidad de un
adenovirus recombinante desprovisto de la mayoría de los genes
virales. Para esto, se construyó una serie de mutantes de deleción
en el adenovirus por ligación in vitro y cada uno de estos
mutantes se co-transfectó con un virus auxiliar en
las células KB. Estas células no permiten la propagación de los
virus defectivos para E1, la transcomplementación contenida en la
región E1.
Los diferentes mutantes de deleción se
prepararon a partir del adenovirus Ad5 por digestión y ligación
in vitro. Para esto, el ADN viral de Ad5 se aísla según la
técnica descrita por Lipp et al. (J. Virol. 63 (1989) 5133),
se somete a digestión en presencia de diferentes enzimas de
restricción (Véase la figura 3) y el producto de la digestión se
liga en presencia de T4 ADN ligasa. El tamaño de los diferentes
mutantes de deleción se controla en gel SDS agarosa 0,8%. Estos
mutantes se mapean (Véase la figura 3). Estos diferentes mutantes
incluyen las regiones siguientes:
mt1: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-20642(SauI) y
(SauI)33797-35935
mt2: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-19549(NdeI) y
(NdeI)31089-35935
mt3: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-10754(AatII) y
(AatII)25915-35935
mt4: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-11311(MluI) y
(MluI)24392-35935
mt5: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-9462(SalI) y
(XhoI)29791-35935
mt6: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-5788(XhoI) y
(XhoI)29791-35935
mt7: Ligación entre los fragmentos de Ad5
0-3665(SphI) y
(SphI)31224-35935
Cada uno de los mutantes preparados
anteriormente se co-transfectó con el ADN viral de
Ad.RSV\betaGal (Stratford-Perricaudet et
al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) en las células KB, en
presencia de fosfato de calcio. Las células se recogieron 8 días
después de la transfección y los sobrenadantes del cultivo se
recogieron y amplificaron en células KB hasta la obtención de
preparaciones madre de 50 botes para cada transfección. A partir de
cada muestra, se aisló el ADN episómico y se separó en gradiente de
cloruro de cesio. Se observaron dos bandas distintas de virus en
cada caso, se tomaron y se analizaron. La más pesada corresponde al
ADN viral de Ad.RSV\betaGal y la más ligera al ADN del virus
recombinante generado por ligación (figura 3). La titulación
obtenida para esta última es de aproximadamente 10^{8}
pfu/ml.
Se construyó una segunda serie de mutantes de
deleción en el adenovirus por ligación in vitro según la
misma metodología. Estos diferentes mutantes incluyen las regiones
siguientes:
mt8: Ligación entre los fragmentos
0-4623(ApaI) de Ad RSV\betaGal y
(ApaI)31909-35935 de Ad5.
mt9: Ligación entre los fragmentos
0-10178(BglII) de Ad RSV\betaGal y
(BamHI)21562-35935 de Ad5.
Estos mutantes que contienen el gen LacZ bajo el
control del promotor LTR del virus RSV, se
co-transfectan en las células 293 en presencia del
ADN viral de H2dl808 (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986)
833), que tiene delecionada la región E4. Según esta segunda
técnica, la transcomplementación está contenida en E4 y no en E1.
Esta técnica permite así generar, como se ha descrito anteriormente,
virus recombinantes que no poseen como gen viral más que la región
E4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
Este ejemplo describe la preparación de
adenovirus recombinantes defectivos por
co-transfección, con un virus auxiliar, del ADN del
virus recombinante incorporado en un plásmido.
Para esto, se construyó un plásmido que contiene
las ITR de unión de Ad5, la secuencia de encapsidación, el gen E4
bajo el control de su propio promotor y, como gen heterólogo, el gen
LacZ bajo el control del promotor LTR del virus RSV (figura 4).
Este plásmido, designado pE4Gal, se obtuvo por clonación y ligación
de los fragmentos siguientes (véase la figura 4):
- -
- fragmento HindIII-SacII procedente del plásmido pFG144 (Graham et al, EMBO J. 8 (1989) 2077). Este fragmento contiene las secuencias ITR de Ad5 en disposición cabeza a cola y la secuencia de encapsidación: fragmento HindIII (34920)-SacII (352).
- -
- fragmento de Ad5 comprendido entre los sitios SacII (localizado a nivel del par de bases 3827) y PstI (localizado a nivel del par de bases 4245);
- -
- fragmento de pSP 72 (Promega) comprendido entre los sitios PstI (pb 32) y SalI (pb 34);
- -
- fragmento XhoI-XbaI del plásmido pAdLTR GalIX descrito en Stratford-Perricaudet et al (JCI 90 (1992) 626). Este fragmento contiene el gen LacZ bajo el control del LTR del virus RSV.
- -
- fragmento XbaI (pb 40) - NdeI (pb 2379) del plásmido pSP 72;
- -
- fragmento NdeI (pb 31089) - HindIII (pb 34930) de Ad5. Este fragmento localizado en el extremo derecho del genoma de Ad5 contiene la región E4 bajo el control de su propio promotor. Se clonó a nivel de los sitios NdeI (2379) del plásmido pSP 72 y HindIII del primer fragmento.
Este plásmido se obtuvo por clonación de los
diferentes fragmentos en las regiones indicadas del plásmido pSP
72. Se entiende que el experto en la técnica puede obtener
fragmentos equivalentes a partir de otras fuentes.
El plásmido pE4Gal se
co-transfecta con el ADN del virus H2d1808 en las
células 293 en presencia de fosfato de calcio. El virus
recombinante se prepara como se ha descrito en el ejemplo 1. Este
virus contiene, como único gen viral, el gen E4 del adenovirus Ad5
(figura 4). Su genoma tiene un tamaño de 12 kb aproximadamente, lo
que permite la inserción de ADN heterólogo con un tamaño muy grande
(hasta 20 kb). Así, el experto en la técnica puede reemplazar
fácilmente el gen LacZ por cualquier otro gen terapéutico tales como
los mencionados más arriba. Por otra parte, este virus incluye
determinadas secuencias procedentes del plásmido pSP 72, que pueden
eliminarse por las técnicas clásicas de biología molecular si es
necesario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo describe la preparación de otro
adenovirus recombinante defectivo según la invención por
co-transfección, con un virus auxiliar, del ADN del
virus recombinante incorporado en un plásmido.
Para esto, se construyó un plásmido que contiene
las ITR de unión de Ad5, la secuencia de encapsidación, el gen E2
de Ad2 bajo el control de su propio promotor y, como gen heterólogo,
el gen LacZ bajo el control del promotor LTR del virus RSV (figura
5). Este plásmido, designado pE2Gal, se obtuvo por clonación y
ligación de los fragmentos siguientes (véase la figura 5):
- -
- fragmento HindIII-SacII procedente del plásmido pFG144 (Graham et al, EMBO J. 8 (1989) 2077). Este fragmento contiene las secuencias ITR de Ad5 en disposición cabeza a cola y la secuencia de encapsidación: fragmento HindIII (34920)-SacII (352). Se clonó, con el fragmento siguiente, a nivel de los sitios HindIII (16) - PstI (32) del plásmido pSP 72.
- -
- fragmento de Ad5 comprendido entre los sitios SacII (localizado a nivel del par de bases 3827) y PstI (localizado a nivel del par de bases 4245). Este fragmento se clonó a nivel del sitio SacII del fragmento anterior y del sitio PstI (32) del plásmido pSP 72.
- -
- fragmento de pSP 72 (Promega) comprendido entre los sitios PstI (pb 32) y SalI (pb 34);
- -
- fragmento XhoI-XbaI del plásmido pAdLTR GalIX descrito en Stratford-Perricaudet et al (JCI 90 (1992) 626). Este fragmento contiene el gen LacZ bajo el control del LTR del virus RSV. Se clonó a nivel de los sitios SalI (34) y XbaI del plásmido pSP 72.
- -
- fragmento de pSP 72 (Promega) comprendido entre los sitios XbaI (pb 34) y BamHI (pb 46);
- -
- fragmento BamHI (pb 21606) - SmaI (pb 27339) de Ad2. Este fragmento del genoma de Ad2 contiene la región E2 bajo el control de su propio promotor. Se clonó a nivel de los sitios BamHI (46) y EcoRV del plásmido pSP 72.
- -
- fragmento EcoRV (pb 81) - HindIII (pb 16) del plásmido pSP 72.
Este plásmido se obtuvo por clonación de
diferentes fragmentos en las regiones indicadas del plásmido pSP
72. Se entiende que el experto en la técnica puede obtener
fragmentos equivalentes a partir de otras fuentes.
El plásmido pE2Gal se
co-transfectó con el ADN del virus H2dl802
desprovisto de la región E2 (Rice et al. J. Virol. 56 (1985)
767) en las células 293, en presencia de fosfato de calcio. El virus
recombinante se prepara como se ha descrito en el ejemplo 1. Este
virus contiene, como único gen viral, el gen E2 del adenovirus Ad2
(figura 5). Su genoma tiene un tamaño de 12 kb aproximadamente, lo
que permite la inserción de ADN heterólogo con un tamaño muy grande
(hasta 20 kb). Así, el experto en la técnica puede reemplazar
fácilmente el gen LacZ por cualquier otro gen terapéutico tales
como los mencionados más arriba. Por otra parte, este virus incluye
determinadas secuencias procedentes del plásmido intermedio, que
pueden eliminarse por las técnicas clásicas de biología molecular
si es necesario.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este ejemplo describe la construcción de líneas
celulares complementarias para las regiones E1, E2 y/o E4 de los
adenovirus. Estas líneas permiten la construcción de adenovirus
recombinantes según la invención delecionados para estas regiones,
sin recurrir a un virus auxiliar. Estos virus se obtienen por
recombinación in vivo y pueden incluir secuencias
heterólogas importantes.
En las líneas celulares descritas, las regiones
E2 y E4, potencialmente citotóxicas, se ponen bajo el control de un
promotor inducible: LTR de MMTV (Pharmacia), que se induce con la
dexametasona, bien nativo, o la forma mínima descrita en PNAS 90
(1993) 5603; o el sistema represible por la tetraciclina descrito
por Gossen y Büjard (PNAS 89 (1992) 5547). Se entiende que pueden
utilizarse otros promotores y principalmente variantes del LTR de
MMTV que contienen, por ejemplo, regiones heterólogas de regulación
(región "amplificadora" principalmente). Las líneas de la
invención se construyeron por transfección de las células
correspondientes, en presencia de fosfato de calcio, con un
fragmento de ADN que contiene los genes indicados (regiones de
adenovirus y/o gen del receptor de los glucocorticoides) bajo el
control de un promotor de la transcripción y de un terminador
(sitio de poliadenilación). El terminador puede ser bien el
terminador natural del gen transfectado o bien un terminador
diferente como por ejemplo el terminador del mensajero precoz del
virus SV40. Ventajosamente, el fragmento de ADN contiene igualmente
un gen que permite la selección de las células transformadas y, por
ejemplo, el gen de resistencia a la geneticina. El gen de
resistencia puede estar contenido igualmente en un fragmento de ADN
diferente, co-transfectado con el primero.
Después de la transfección, las células
transformadas se seleccionan y su ADN se analiza para verificar la
integración del fragmento de ADN en el genoma.
Esta técnica permite obtener las líneas
celulares siguientes:
- 1.
- Células 293 que poseen el gen de la 72K de la región E2 de Ad5 bajo el control del LTR de MMTV;
- 2.
- Células 293 que poseen el gen de la 72K de la región E2 de Ad5 bajo el control del LTR de MMTV y el gen del receptor de los glucocorticoides;
- 3.
- Células 293 que poseen el gen de la 72K de la región E2 de Ad5 bajo el control del LTR de MMTV y la región E4 bajo el control del LTR de MMTV;
- 4.
- Células 293 que poseen el gen de la 72K de la región E2 de Ad5 bajo el control del LTR de MMTV, la región E4 bajo el control del LTR de MMTV y el gen del receptor de los glucocorticoides;
- 5.
- Células 293 que poseen la región E4 bajo el control del LTR de MMTV;
- 6.
- Células que poseen la región E4 bajo el control del LTR de MMTV y el gen del receptor de los glucocorticoides;
- 7.
- Células gm DBP6 que poseen las regiones E1A y E1B bajo el control de su propio promotor;
- 8.
- Células gm DBP6 que poseen las regiones E1A y E1B bajo el control de su propio promotor y la región E4 bajo el control del LTR de MMTV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este ejemplo describe la preparación de
adenovirus recombinantes defectivos según la invención de cuyo
genoma se han delecionado los genes E1, E3 y E4. Según un modo
ventajoso de realización, ilustrado en este ejemplo y en el ejemplo
3 principalmente, el genoma de los adenovirus recombinantes de la
invención está modificado de manera que al menos los genes E1 y E4
no sean funcionales. Dichos adenovirus poseen en primer lugar una
capacidad de incorporación de genes heterólogos importante. Por otra
parte, estos vectores presentan una seguridad elevada debido a la
deleción de la región E4, que está implicada en la regulación de la
expresión de los genes tardíos, en la estabilidad de los ARN
nucleares tardíos, en la terminación de la expresión de las
proteínas de la célula anfitriona y en la eficacia de la
replicación del ADN viral. Estos vectores poseen, por lo tanto, una
transcripción basal y una expresión de genes virales muy reducidas.
Finalmente, de manera particularmente ventajosa, estos vectores
pueden producirse con titulaciones comparables a los adenovirus
salvajes.
Estos adenovirus se prepararon a partir del
plásmido pPY55, que contiene la parte derecha modificada del genoma
del adenovirus Ad5, bien por co-transfección con un
plásmido auxiliar (véanse igualmente los ejemplos 1, 2 y 3) o bien
mediante una línea complementaria (ejemplo 4).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento AvrII-BcII del
plásmido pFG144 [F.L. Graham et al. EMBO J. 8 (1989)
2077-2085], correspondiente al extremo derecho del
genoma del adenovirus Ad5, se clonó en primer lugar entre los sitios
XbaI y BamHI del vector pIC19H, preparado a partir de un contexto
dam-. Esto genera el plásmido pPY23. Una característica interesante
del plásmido pPY23 es que el sitio SalI que procede del multisitio
de clonación del vector pIC19H es único y está localizado al lado
del extremo derecho del genoma del adenovirus Ad5. El fragmento
HaeIII-SalI del plásmido pPY23 que contiene el
extremo derecho del genoma del adenovirus Ad5, a partir del sitio
HaeIII localizado en posición 35614, se clonó entre los sitios
EcoRV y XhoI del vector pIC20H, lo que genera el plásmido pPY29.
Una característica interesante de este plásmido es que los sitios
XbaI y ClaI que proceden del multisitio de clonación del vector
pIC20H están localizados al lado de la unión EcoRV/HaeIII resultante
de la clonación. Además, esta unión modifica el contexto
nucleotídico inmediatamente adyacente al sitio ClaI que se convierte
ahora en metilable en un contexto dam+. El fragmento
XbaI(30470)-MaeII(32811) del genoma
del adenovirus Ad5 se clonó entre los sitios XbaI y ClaI del
plásmido pPY29 preparado a partir de un contexto dam-, lo que genera
el plásmido pPY30. El fragmento SstI del plásmido pPY30, que
corresponde a la secuencia del genoma del adenovirus Ad5 del sitio
SstI en posición 30556 hasta el extremo derecho se clonó finalmente
entre los sitios SstI del vector pIC20H, lo que genera el plásmido
pPY31, del que se proporciona en la Figura 6 un mapa de restricción
del inserto localizado entre los sitios HindIII.
El plásmido pPY32 se obtuvo después de digestión
parcial del plásmido pPY31 con BglII, seguida de una digestión
total con BamHI y religación. El plásmido pPY32 corresponde, por lo
tanto, a la deleción del genoma del adenovirus Ad5 situada entre el
sitio BamHI del plásmido pPY31 y el sitio BglII localizado en
posición 30818. En la Figura 6 se proporciona un mapa de
restricción del fragmento HindIII del plásmido pPY32. Una
característica del plásmido pPY32 es que posee sitios SalI y XbaI
únicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento
BamHI(21562)-XbaI(28592) del genoma
del adenovirus Ad5 se clonó en primer lugar entre los sitios BamHI
y XbaI del vector plC19H preparado a partir de un contexto dam-, lo
que genera el plásmido pPY17. Este plásmido contiene, por lo tanto,
un fragmento HindIII (26328)-BgIII(28133) del
genoma del adenovirus Ad5, que puede clonarse entre los sitios
HindIII y BgIII del vector pIC20R, para generar el plásmido pPY34.
Una característica de este plásmido es que el sitio BamHI que
procede del multisitio de clonación está localizado en la
proximidad inmediata del sitio HindIII(26328) del genoma del
adenovirus Ad5.
El fragmento BamHI
(21562)-HindIII(26328) del genoma del
adenovirus Ad5 que procede del plásmido pPY17 se clonó entre los
sitios BamHI y HindIII del plásmido pPY34, lo que genera el plásmido
pPY39. El fragmento BamHI-XbaI del plásmido pPY39
preparado a partir de un contexto dam-, que contiene la parte del
genoma del adenovirus Ad5 comprendida entre los sitios
BamHI(21562) y BgIII(28133), se clonó entre los sitios
BamHI y XbaI del vector pIC19H preparado a partir de un contexto
dam-. Esto genera el plásmido pPY47 del que una característica
interesante es que el sitio SalI que procede del multisitio de
clonación está localizado cerca del sitio HindIII (figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento SalI-XbaI del
plásmido pPY47 preparado a partir de un contexto dam-, y que
contiene la parte del genoma del adenovirus Ad5 que va del sitio
BamHI(21562) hasta el sitio BglII(28133), se clonó
entre los sitios SalI y XbaI del plásmido pPY32, lo que genera el
plásmido pPY55. Este plásmido se puede utilizar directamente para
la obtención de adenovirus recombinantes al menos delecionados para
la región E3 (deleción entre los sitios BgIII localizados en las
posiciones 28133 y 30818 del genoma del adenovirus Ad5) y para la
región E4 en su totalidad (deleción entre los sitios
MaeII(32811) y HaeIII(35614) del genoma del adenovirus
Ad5 (figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
El principio se basa en la transcomplementación
entre un "mini-virus" (virus auxiliar) que
expresa la región E4 y un virus recombinante delecionado al menos
para E3 y E4. Estos virus se obtienen bien por ligación in
vitro o bien después de recombinación in vivo, según las
estrategias siguientes:
- (i)
- El ADN del virus Ad-dl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) y el plásmido pPY55, los dos digeridos con BamHI, se ligan en primer lugar in vitro y se cotransfectan con el plásmido pEAGaI (descrito en el ejemplo 2) en las células 293.
- (ii)
- El ADN del virus Ad-dl324 digerido con EcoRI y el plásmido pPY55 digerido con BamHI se cotransfectan, con el plásmido pE4Gal, en las células 293.
- (iii)
- El ADN del adenovirus Ad5 y el plásmido pPY55, los dos digeridos con BamHI, se ligan y se cotransfectan con el plásmido pE4Gal en las células 293.
- (iv)
- El ADN del adenovirus Ad5 digerido con EcoRI y el plásmido pPY55 digerido con BamHI se cotransfectan con pEAGaI en las células 293.
Las estrategias (i) y (ii) permiten generar un
adenovirus recombinante delecionado para las regiones E1, E3 y E4;
las estrategias (iii) y (iv) permiten generar un adenovirus
recombinante delecionado para las regiones E3 y E4. Por supuesto,
el ADN de un virus recombinante delecionado para la región E1 pero
que expresa un transgén cualquiera puede utilizarse en lugar del
ADN del virus Ad-dl324 según las estrategias (i) o
(ii), con el objetivo de generar un virus recombinante delecionado
para las regiones E1, E3 y E4 y que expresa dicho transgén.
\vskip1.000000\baselineskip
El principio se basa aquí en el hecho de que una
línea celular derivada de una línea que expresa la región E1, por
ejemplo la línea 293, y que expresa igualmente al menos las fases
abiertas ORF6 y ORF6/7 de la región E4 del adenovirus Ad5 bajo el
control de un promotor, por ejemplo inducible, es capaz de
transcomplementar a la vez las regiones E1 y E4 del adenovirus Ad5.
Dichas líneas se han descrito en el ejemplo 4.
Por lo tanto, puede obtenerse un virus
recombinante delecionado para las regiones E1, E3 y E4 por ligación
in vitro o por recombinación in vivo según los
protocolos descritos anteriormente. Sea cual sea el protocolo
utilizado para generar los virus delecionados al menos para la
región E4, se observó un efecto citopático (que indica la
producción de virus recombinantes) después de la transfección en las
células utilizadas. Las células se recogieron, se rompieron con
tres ciclos de congelación-descongelación en su
sobrenadante y se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante así obtenido se amplificó en un cultivo celular fresco
(células 293 para los protocolos a) y células 293 que expresan la
región E4 para el protocolo b)). Los virus se purificaron a partir
de halos de lisis y su ADN se analiza según el método de Hirt
(citado anteriormente). Se preparan preparaciones madre de virus en
gradiente de cloruro de cesio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ejemplo describe la preparación de
adenovirus recombinantes defectivos según la invención de cuyo
genoma se han delecionado los genes E1, E3, L5 y E4. Estos vectores
son particularmente ventajosos ya que la región L5 codifica la
fibra, que es una proteína extremadamente tóxica para la célula.
Estos adenovirus se prepararon a partir del
plásmido p2, que contiene la parte derecha modificada del genoma
del adenovirus Ad5, por co-transfección con
diferentes plásmidos auxiliares. Pueden prepararse igualmente
mediante una línea complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Este plásmido contiene toda la región derecha
del genoma del adenovirus Ad5, a partir del sitio BamHI (21562), de
la que se ha delecionado el fragmento comprendido entre los sitios
XbaI (28592) y AvrII (35463), que contiene los genes E3, L5 y E4.
El plásmido p2 se obtuvo por clonación y ligación de los fragmentos
siguientes en el plásmido pIC19R linearizado con BamHI y
desfosforilado (véase la figura 8):
- -
- fragmento del genoma del adenovirus Ad5 comprendido entre los sitios BamHI (21562) y XbaI (28592), y
- -
- extremo derecho del genoma del adenovirus Ad5 (que contiene la ITR derecha), a partir del sitio AvrII (35463), hasta el sitio BclI (compatible BamHI).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido auxiliar pITRL5-E4
aporta en trans los genes E4 y L5. Corresponde al plásmido pE4Gal
descrito en el ejemplo 2, que contiene además la región L5 que
codifica la fibra bajo el control del promotor MLP del adenovirus
Ad2. El plásmido pITRL5-E4 se construyó de la manera
siguiente (figuras 9 y 10):
Se sintetizó un oligonucleótido de 58 pb que
contiene, en el sentido 5'-3', un sitio HindIII, ATG
de la fibra y la secuencia codificadora de la fibra hasta el sitio
NdeI en posición 31089 del genoma del adenovirus Ad5. La secuencia
de este oligonucleótido se proporciona a continuación, en la
orientación 5'-3':
AAGCTTATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTAACCCCGTGTATCCATATG
Los sitios HindIII, en 5', y NdeI, en 3', están
subrayados con una línea simple, ATG de la fibra está subrayado con
una línea doble.
Un fragmento SspI-HindIII que
contiene la secuencia del promotor MLP seguida del líder tripartito
del adenovirus Ad2 se aisló a partir del plásmido pMLP10 (Ballay
et al., (1987) UCLA Symposia on molecular and cellular
biology, New series, Vol 70, Robinson et al (Eds)
Nueva-York, 481). Este fragmento se insertó con el
oligonucleótido de 58 pb descrito anteriormente entre los sitios
NdeI y EcoRV del plásmido pIC19P, para proporcionar un plásmido
intermedio (véase la figura 9). El fragmento SacII (convertido en
romo)-NdeI del plásmido pE4Gal (ejemplo 2) se
introdujo en el plásmido intermedio entre los sitios SspI y NddeI
para generar el plásmido pITRL5-E4 (figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
El principio se basa en la transcomplementación
entre un "mini-virus" (virus auxiliar) que
expresa la región L5 o las regiones E4 y L5 y un virus recombinante
delecionado al menos para E3, E4 y L5.
Estos virus se obtuvieron bien por ligación
in vitro o bien después de recombinación in vivo,
según las estrategias siguientes:
- (i)
- El ADN del virus Ad-dl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) y el plásmido p2, los dos digeridos con BamHI, se ligaron en primer lugar in vitro y se cotransfectan con el plásmido auxiliar pITRL5-E4 (ejemplo 6.2.) en las células 293.
- (ii)
- El ADN del virus Ad-d1324 digerido con EcoRI y el plásmido p2 digerido con BamHI se cotransfectan, con el plásmido pITRL5-E4, en las células 293.
- (iii)
- El ADN del adenovirus Ad5 y el plásmido p2, los dos digeridos con BamHI, se ligan y se cotransfectan con el plásmido pITRL5-E4 en las células 293.
- (iv)
- El ADN del adenovirus Ad5 digerido con EcoRI y el plásmido p2 digerido con BamHI se cotransfectan con pITRL5-E4 en las células 293.
Las estrategias (i) y (ii) permiten generar un
adenovirus recombinante delecionado para las regiones E1, E3, L5 y
E4; las estrategias (iii) y (iv) permiten generar un adenovirus
recombinante delecionado para las regiones E3, L5 y E4. Por
supuesto, el ADN de un virus recombinante delecionado para la región
E1 pero que expresa un transgén cualquiera puede utilizarse en
lugar del ADN del virus Ad-dl324 según las
estrategias (i) o (ii), con el objetivo de generar un virus
recombinante delecionado para las regiones E1, E3, L5 y E4 y que
expresa dicho transgén.
Los protocolos descritos anteriormente pueden
aplicarse igualmente con un virus auxiliar que no contenga más que
la región L5, utilizando una línea celular capaz de expresar las
regiones E1 y E4 del adenovirus, tal como la descrita en el ejemplo
4.
Por otra parte, es posible igualmente utilizar
una línea complementaria capaz de expresar las regiones E1, E4 y
L5, de forma que se evita totalmente el empleo de un virus
auxiliar.
Después de la transfección, los virus producidos
se recuperan, amplifican y purifican en las condiciones descritas
en el ejemplo 5.
Claims (16)
1. Adenovirus recombinante defectivo
caracterizado porque comprende:
- -
- las secuencias ITR,
- -
- una secuencia que permite la encapsidación,
- -
- una secuencia de ADN heterólogo
- -
- una región que contiene el gen E2, y
- -
- en el que el gen E1 y al menos el gen E4 no son funcionales.
2. Adenovirus según la reivindicación 1
caracterizado porque comprende un gen E3 funcional bajo el
control de un promotor heterólogo.
3. Adenovirus según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la secuencia
de ADN heterólogo contiene uno o varios genes terapéuticos y/o uno
o varios genes que codifican péptidos antigénicos.
4. Adenovirus según la reivindicación 3
caracterizado porque el gen terapéutico se elige entre los
genes que codifican enzimas, derivados sanguíneos, hormonas,
linfoquinas (interleuquinas, interferones, TNF, etc), factores de
crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, factores tróficos (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,
NT3, NT5, etc), apolipoproteínas (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc),
distrofina o una minidistrofina, genes supresores de tumores o
genes que codifican factores implicados en la coagulación (Factores
VH, VM, IX, etc).
5. Adenovirus según la reivindicación 3
caracterizado porque el gen terapéutico es un gen o una
secuencia antisentido, cuya expresión en la célula diana permite
controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm
celulares.
6. Adenovirus según la reivindicación 3
caracterizado porque el gen codifica un péptido antigénico
capaz de generar en el ser humano una respuesta inmunitaria contra
microorganismos o virus.
7. Adenovirus según la reivindicación 6
caracterizado porque el gen codifica un péptido antigénico
específico del virus de Epstein Barr, del virus MV, del virus de la
hepatitis B o del virus de la pseudo-rabia.
8. Adenovirus según la reivindicación 3,
caracterizado porque el gen codifica un péptido antigénico
específico de tumores.
9. Adenovirus según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la secuencia
de ADN heterólogo comprende igualmente secuencias que permiten la
expresión del gen terapéutico y/o del gen que codifica el péptido
antigénico en la célula infectada.
10. Adenovirus según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque la secuencia
de ADN heterólogo comprende, en posición 5' respecto al gen
terapéutico, una secuencia señal que dirige el producto terapéutico
sintetizado a las vías de secreción de la célula diana.
11. Línea celular que puede ser infectada por un
adenovirus y que comprende, integradas en su genoma, las funciones
necesarias para la complementación de un adenovirus recombinante
defectivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizada porque incluye en su genoma al menos los genes
E1 y E4 de un adenovirus y porque el gen E4 está situado bajo el
control de un promotor inducible.
12. Línea celular según la reivindicación 11
caracterizada porque incluye además el gen del receptor de
los glucocorticoides.
13. Línea celular según la reivindicación 11
caracterizada porque el promotor inducible es el promotor LTR
de MMTV.
14. Línea celular según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13 caracterizada porque se obtiene a
partir de la línea 293.
15. Composición farmacéutica que comprende al
menos un adenovirus recombinante defectivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
16. Composición farmacéutica según la
reivindicación 15 que comprende un vehículo aceptable
farmacéuticamente para una formulación inyectable.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9308596A FR2707664B1 (fr) | 1993-07-13 | 1993-07-13 | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| FR9308596 | 1993-07-13 | ||
| FR9404590 | 1994-04-18 | ||
| FR9404590A FR2718749B1 (fr) | 1994-04-18 | 1994-04-18 | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2310924T3 true ES2310924T3 (es) | 2009-01-16 |
Family
ID=26230472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94922889T Expired - Lifetime ES2310924T3 (es) | 1993-07-13 | 1994-07-08 | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030096787A1 (es) |
| EP (1) | EP0667912B1 (es) |
| JP (1) | JP4190028B2 (es) |
| KR (1) | KR100356615B1 (es) |
| CN (1) | CN1115414C (es) |
| AT (1) | ATE399873T1 (es) |
| AU (1) | AU7264694A (es) |
| BR (1) | BR9405507A (es) |
| CA (1) | CA2144040A1 (es) |
| CZ (1) | CZ287157B6 (es) |
| DE (1) | DE69435108D1 (es) |
| DK (1) | DK0667912T3 (es) |
| ES (1) | ES2310924T3 (es) |
| FI (1) | FI951138A7 (es) |
| HU (1) | HU216871B (es) |
| IL (1) | IL110284A0 (es) |
| NO (1) | NO321309B1 (es) |
| NZ (1) | NZ269156A (es) |
| PL (1) | PL179877B1 (es) |
| PT (1) | PT667912E (es) |
| RU (1) | RU2219241C2 (es) |
| SK (1) | SK282843B6 (es) |
| WO (1) | WO1995002697A1 (es) |
Families Citing this family (236)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6410010B1 (en) | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| US5747469A (en) * | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| WO1992015680A1 (en) | 1991-03-06 | 1992-09-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| CA2162497A1 (en) | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Sheila Connelly | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
| US7252989B1 (en) * | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
| US5851806A (en) * | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| JP3816518B2 (ja) | 1994-06-10 | 2006-08-30 | ジェンベク、インコーポレイティッド | 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 |
| EP1369487A3 (en) * | 1994-08-16 | 2004-04-07 | Crucell Holland B.V. | Recombinant vectors derived from adenovirus for use in gene therapy |
| FR2723697B1 (fr) * | 1994-08-17 | 1996-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement de la restenose par la therapie genique |
| WO1996013597A2 (en) * | 1994-10-28 | 1996-05-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved adenovirus and methods of use thereof |
| US5856152A (en) * | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| FR2727867B1 (fr) | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| FR2738575B1 (fr) * | 1995-09-08 | 1997-10-10 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR2741891B1 (fr) * | 1995-06-01 | 1998-01-09 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| IL116816A (en) * | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| FR2729674B1 (fr) * | 1995-01-20 | 1997-04-11 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR2730504B1 (fr) | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| US5637456A (en) * | 1995-02-17 | 1997-06-10 | The University Of Texas, Board Of Regents | Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation |
| US5652224A (en) | 1995-02-24 | 1997-07-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism |
| US6752987B1 (en) | 1995-02-28 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI |
| WO1996026742A1 (en) | 1995-02-28 | 1996-09-06 | The Regents Of The University Of California | Gene transfer-mediated angiogenesis therapy |
| FR2731710B1 (fr) * | 1995-03-14 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique |
| JP3770333B2 (ja) * | 1995-03-15 | 2006-04-26 | 大日本住友製薬株式会社 | 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法 |
| US5707618A (en) * | 1995-03-24 | 1998-01-13 | Genzyme Corporation | Adenovirus vectors for gene therapy |
| FR2732357B1 (fr) * | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| DE69628744D1 (de) * | 1995-04-17 | 2003-07-24 | Univ Texas System Austin Board | Adenovirus helfervirus system |
| FR2734826B1 (fr) * | 1995-06-01 | 1997-07-04 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations |
| US5756283A (en) * | 1995-06-05 | 1998-05-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy |
| US5698202A (en) * | 1995-06-05 | 1997-12-16 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| AU6261696A (en) | 1995-06-05 | 1996-12-24 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier |
| US6265212B1 (en) | 1995-06-15 | 2001-07-24 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US6783980B2 (en) * | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
| FR2735789B1 (fr) * | 1995-06-23 | 1997-07-25 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant |
| AU6390596A (en) * | 1995-06-23 | 1997-01-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | C-cam expression constructs and their application in cancer therapy |
| FR2737222B1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-10-17 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique |
| FR2737221B1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-10-17 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs viraux pour la therapie genique |
| FR2737501B1 (fr) | 1995-07-31 | 1997-10-24 | Transgene Sa | Nouveaux virus auxiliaires pour la preparation de vecteurs viraux recombinants |
| AUPN477695A0 (en) * | 1995-08-14 | 1995-09-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Gene therapy |
| US6482803B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-11-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modification of mutated P53 gene in tumors by retroviral delivery of ribozyme A |
| AU7674896A (en) * | 1995-10-31 | 1997-05-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus-antisense k-ras expression vectors and their application in cancer therapy |
| JP2006075171A (ja) * | 1995-11-09 | 2006-03-23 | Avigen Inc | 組換えａａｖビリオン産生における使用のための補助機能 |
| US6004797A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-21 | Avigen, Inc. | Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production |
| AU1867297A (en) * | 1995-11-17 | 1997-06-05 | Wolfgang M. Franz | Gene-therapeutic nucleic acid construct, production of same and use of same in the treatment of heart disorders |
| FR2746110B1 (fr) * | 1996-03-14 | 1998-04-17 | Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants | |
| US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
| US20040156861A1 (en) | 1996-07-11 | 2004-08-12 | Figdor Carl Gustav | Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma |
| US5958892A (en) | 1996-07-30 | 1999-09-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells |
| WO1998010087A1 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| NZ334827A (en) * | 1996-09-25 | 2001-02-23 | Scripps Research Inst | High-capacity adenoviral vectors suitable for adenoviral-based gene therapy |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| ATE291080T1 (de) | 1996-12-06 | 2005-04-15 | Aventis Pharma Inc | Von humanem lipase-ähnlichem gen kodierte polypeptide, sowie zusammensetzungen und methoden |
| US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| WO1998032860A1 (en) * | 1997-01-28 | 1998-07-30 | Baxter International Inc. | Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors |
| US6403370B1 (en) | 1997-02-10 | 2002-06-11 | Genstar Therapeutics Corporation | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system |
| IL132323A0 (en) | 1997-04-28 | 2001-03-19 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors |
| AUPO856097A0 (en) * | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| US6875606B1 (en) | 1997-10-23 | 2005-04-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Human α-7 nicotinic receptor promoter |
| US6653088B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-11-25 | Aventis Pharma S.A. | Interaction test for the investigation of inhibitory molecules of the interaction between a presenilin and the β-amyloid peptide |
| CN1263854C (zh) | 1997-11-06 | 2006-07-12 | 启龙股份公司 | 奈瑟球菌抗原 |
| JP2002500039A (ja) | 1998-01-08 | 2002-01-08 | アベンティス ファーマスーティカルズ プロダクツ インコーポレイテッド | 機能あるヒトリポタンパク質（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ |
| AU1979599A (en) | 1998-01-14 | 1999-08-02 | Chiron S.P.A. | (neisseria meningitidis) antigens |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| EP2261352A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-04 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| US6225456B1 (en) | 1998-05-07 | 2001-05-01 | University Technololy Corporation | Ras suppressor SUR-5 |
| US6506889B1 (en) | 1998-05-19 | 2003-01-14 | University Technology Corporation | Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods |
| US6413776B1 (en) | 1998-06-12 | 2002-07-02 | Galapagos Geonomics N.V. | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications |
| CA2340276A1 (en) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Duke University | Adenoviruses deleted in the iva2, 100k and/or preterminal protein sequences |
| US6441156B1 (en) | 1998-12-30 | 2002-08-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Calcium channel compositions and methods of use thereof |
| US6387368B1 (en) | 1999-02-08 | 2002-05-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| US6291226B1 (en) * | 1999-02-25 | 2001-09-18 | National Research Council Of Canada | Adenovirus mutants with deleted protease gene |
| CN100457914C (zh) * | 1999-04-15 | 2009-02-04 | 荷兰克鲁塞尔公司 | 用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白 |
| JP2003518363A (ja) | 1999-04-30 | 2003-06-10 | カイロン エセ．ピー．アー． | 保存されたナイセリア抗原 |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US6793926B1 (en) | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| RU2281956C2 (ru) | 1999-10-29 | 2006-08-20 | Чирон С.Р.Л. | Антигенные пептиды neisseria |
| CA2395839A1 (en) | 1999-12-27 | 2001-07-05 | The Regents Of The University Of California | Gene therapy for congestive heart failure |
| PT2289545T (pt) | 2000-01-17 | 2016-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacina de omv suplementada contra meningococos |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| NZ521786A (en) | 2000-03-31 | 2004-07-30 | Aventis Pharma Inc | NFIF-14b and NFIF-7a (nuclear factor kappa B inducing factor) polypeptides and nulciec acids and their use in compositions for inhibiting inflammation |
| AU2001265219A1 (en) * | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Human Gene Therapy Research Institute | Methods and compositions for efficient gene transfer using transcomplementary vectors |
| DK1328543T3 (da) | 2000-10-27 | 2009-11-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Nukleinsyrer og proteiner fra streptococcus-gruppe A & B |
| US7060442B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-06-13 | Regents Of The University Of Michigan | Modulators on Nod2 signaling |
| ES2359625T3 (es) | 2000-12-28 | 2011-05-25 | Wyeth Llc | Proteina protectora recombinante de. |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| AUPR518501A0 (en) | 2001-05-22 | 2001-06-14 | Unisearch Limited | Yin yang-1 |
| US6682929B2 (en) | 2001-07-23 | 2004-01-27 | Genvec, Inc. | Adenovector complementing cells |
| US7569217B2 (en) | 2001-09-24 | 2009-08-04 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus E1 and E4 regions |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| CN100515494C (zh) | 2001-12-12 | 2009-07-22 | 启龙有限公司 | 抗沙眼衣原体的免疫 |
| AR038153A1 (es) * | 2002-01-18 | 2004-12-29 | Schering Ag | Formulaciones estabilizadas de adenovirus |
| US7319001B2 (en) | 2002-03-09 | 2008-01-15 | Neurogenex Co., Ltd. | High throughput system for producing recombinant viruses using site-specific recombination |
| US7217796B2 (en) | 2002-05-24 | 2007-05-15 | Schering Corporation | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
| CA2421269A1 (en) | 2002-08-09 | 2004-02-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms |
| US7977049B2 (en) | 2002-08-09 | 2011-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms |
| US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| RU2244928C2 (ru) * | 2003-02-19 | 2005-01-20 | Пинигина Нина Максимовна | Эндогенная фармацевтическая композиция, полученная на основе целенаправленной активации гуморальных медиаторов нервных окончаний коры головного мозга |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| ES2391975T3 (es) * | 2003-07-25 | 2012-12-03 | Genvec, Inc. | Vacunas a base de vector adenovírico |
| DE602004025726D1 (de) | 2003-11-14 | 2010-04-08 | Genvec Inc | Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc). |
| US7432057B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-07 | Michigan State University | Genetic test for PSE-susceptible turkeys |
| US8268324B2 (en) | 2004-03-29 | 2012-09-18 | Galpharma Co., Ltd. | Modified galectin 9 proteins and use thereof |
| AU2005243730B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-05-27 | Genvec, Inc. | Method of using adenoviral vectors to induce an immune response |
| US7510868B2 (en) | 2004-05-26 | 2009-03-31 | Paul Harden | Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment |
| DK2031063T3 (da) | 2004-06-18 | 2014-01-27 | Univ Duke | Modulatorer af duftreceptorer |
| US7604798B2 (en) | 2004-07-15 | 2009-10-20 | Northwestern University | Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei |
| JP4772045B2 (ja) | 2004-07-16 | 2011-09-14 | アメリカ合衆国 | Ｃｍｖ／ｒ核酸コンストラクトを含むａｉｄｓに対するワクチン |
| WO2006039045A2 (en) * | 2004-09-01 | 2006-04-13 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation |
| PL2002003T3 (pl) | 2005-05-27 | 2016-06-30 | Ospedale San Raffaele Srl | Wektor genetyczny zawierający mi-RNA |
| AU2006284756B2 (en) | 2005-08-31 | 2012-06-07 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| BRPI0618441B8 (pt) | 2005-11-10 | 2021-07-27 | Genvec Inc | vetor adenoviral |
| DK2054431T3 (da) | 2006-06-09 | 2012-01-02 | Novartis Ag | Konformere af bakterielle adhæsiner |
| US8329669B2 (en) | 2006-07-28 | 2012-12-11 | Sanofi | Composition and method for treatment of tumors |
| WO2008060814A2 (en) | 2006-10-19 | 2008-05-22 | Merck & Co., Inc. | ANTI-IL-13Rα1 ANTIBODIES AND THEIR USES THEREOF |
| CN101588816B (zh) | 2006-10-19 | 2013-06-19 | Csl有限公司 | 白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物 |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| CN101679979A (zh) | 2007-03-24 | 2010-03-24 | 基酶有限公司 | 施用与人载脂蛋白b互补的反义寡核苷酸 |
| CN101067139B (zh) * | 2007-05-14 | 2010-05-26 | 清华大学深圳研究生院 | 一种RNAi载体及其应用 |
| CN101619324B (zh) * | 2008-07-01 | 2013-06-26 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用 |
| WO2010045659A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | American Gene Technologies International Inc. | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules |
| BRPI0921286B8 (pt) | 2008-11-05 | 2022-10-25 | Wyeth Llc | Composição imunogênica com múltiplos componentes para a prevenção de doença por estreptococos beta-hemolíticos (bhs). |
| EP3115063A3 (en) | 2008-12-03 | 2017-04-19 | The John Hopkins University | Galectin-3 and annexin-a2 as immunological target |
| CN102361985B (zh) * | 2008-12-04 | 2017-06-20 | 库尔纳公司 | 通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病 |
| WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
| WO2011047316A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins |
| WO2011057254A2 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Simian adenoviral vector-based vaccines |
| EA201270607A1 (ru) | 2009-11-09 | 2012-09-28 | Генвек, Инк. | Аденовирус обезьян и способы его использования |
| ES2887335T3 (es) | 2010-03-17 | 2021-12-22 | Univ Cornell | Vacuna contra las drogas de abuso basada en adenovirus alterado |
| WO2012021730A2 (en) | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| KR101594228B1 (ko) | 2010-08-23 | 2016-02-15 | 와이어쓰 엘엘씨 | 네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제 |
| NZ607224A (en) | 2010-09-10 | 2014-11-28 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
| WO2012083297A2 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors with modified hexon regions |
| WO2012088041A1 (en) | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based dengue fever vaccine |
| EP2690950B1 (en) | 2011-03-29 | 2017-01-04 | Dynavax Technologies Corporation | Tlr8 transgenic animals |
| CN102240405A (zh) * | 2011-05-09 | 2011-11-16 | 上海市第十人民医院 | ApoA-Ⅰmilano基因药物 |
| WO2012162428A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Prime-boost vaccination for viral infection |
| US9629906B2 (en) | 2011-10-05 | 2017-04-25 | Genvec, Inc. | Affenadenovirus (gorilla) or adenoviral vectors and methods of use |
| WO2013052859A2 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| WO2013052832A2 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors and methods of use |
| EP2764012B1 (en) | 2011-10-05 | 2022-02-23 | GenVec, Inc. | Adenoviral vectors and methods of use |
| CN117721110A (zh) * | 2011-12-28 | 2024-03-19 | 日本新药株式会社 | 反义核酸 |
| US20150157700A1 (en) | 2012-02-02 | 2015-06-11 | GanVec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccine |
| RU2491097C1 (ru) * | 2012-02-16 | 2013-08-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза |
| MX359256B (es) | 2012-03-09 | 2018-09-19 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas. |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| WO2013181128A1 (en) | 2012-05-29 | 2013-12-05 | Genvec, Inc. | Modified serotype 28 adenoviral vectors |
| EP2855511B1 (en) | 2012-05-29 | 2019-07-24 | GenVec, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
| WO2014107739A1 (en) | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Antibodies against pcsk9 |
| US9802987B2 (en) | 2013-03-08 | 2017-10-31 | Pfizer Inc. | Immunogenic fusion polypeptides |
| US10981961B2 (en) | 2013-03-11 | 2021-04-20 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Delivery of card protein as therapy for occular inflammation |
| FI2970398T3 (fi) | 2013-03-13 | 2024-08-06 | Us Health | Rsv f -prefuusioproteiineja ja niiden käyttö |
| RU2662968C2 (ru) | 2013-09-08 | 2018-07-31 | Пфайзер Инк. | Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты) |
| RS61039B1 (sr) | 2013-09-12 | 2020-12-31 | Biomarin Pharm Inc | Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii |
| AU2014338864C1 (en) | 2013-10-25 | 2020-07-16 | Akamis Bio Limited | Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes |
| WO2015127094A1 (en) | 2014-02-19 | 2015-08-27 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species |
| WO2016037154A1 (en) | 2014-09-04 | 2016-03-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| CA3193811A1 (en) | 2014-11-14 | 2016-05-19 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| EP3236998A1 (en) | 2014-12-24 | 2017-11-01 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant metapneumovirus f proteins and their use |
| CN107406835A (zh) | 2015-01-20 | 2017-11-28 | 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表 | 表达嵌合rsv/bpiv3f蛋白的重组人/牛副流感病毒3(b/hpiv3)及其用途 |
| CA2975447C (en) | 2015-01-30 | 2021-02-23 | The Regents Of The University Of California | Spinal subpial gene delivery system |
| AU2016221318B2 (en) | 2015-02-19 | 2020-06-25 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| WO2016138160A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use |
| PE20180241A1 (es) | 2015-04-30 | 2018-01-31 | Psioxus Therapeutics Ltd | Adenovirus oncolitico que codifica una proteina b7 |
| EP3307894B1 (en) * | 2015-06-10 | 2026-01-28 | American Gene Technologies International Inc. | Non-integrating viral delivery system and methods of use thereof |
| JP6890831B2 (ja) | 2015-07-08 | 2021-06-18 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法 |
| CN108289909A (zh) | 2015-10-19 | 2018-07-17 | 巴尔的摩马里兰大学 | 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法 |
| EA201891022A1 (ru) | 2015-12-17 | 2019-01-31 | Псайоксус Терапьютикс Лимитед | Вирус, кодирующий антитело к комплексу tcr или фрагмент указанного антитела |
| US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
| DK3402483T3 (da) | 2016-01-15 | 2024-01-02 | American Gene Tech Int Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til aktivering af gamma-delta-T-celler |
| WO2017139392A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| US10888613B2 (en) | 2016-02-08 | 2021-01-12 | American Gene Technologies International Inc. | Method of producing cells resistant to HIV infection |
| DK3426777T3 (da) | 2016-03-09 | 2022-04-25 | American Gene Tech Int Inc | Kombinationsvektorer og fremgangsmåder til behandling af cancer |
| EP3426291A1 (en) | 2016-03-09 | 2019-01-16 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| AU2017241534A1 (en) | 2016-03-28 | 2018-10-04 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for treating neuronal hyper-excitability |
| US11560412B2 (en) | 2016-04-01 | 2023-01-24 | University Of Maryland, Baltimore | Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use |
| US11976292B2 (en) | 2016-06-08 | 2024-05-07 | American Gene Technologies International Inc. | Non-integrating viral delivery system and methods related thereto |
| CA2971303C (en) * | 2016-06-21 | 2026-03-03 | Bamboo Therapeutics, Inc. | Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use |
| IL284348B2 (en) | 2016-07-08 | 2025-06-01 | American Gene Tech Int Inc | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
| JP7176756B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-11-22 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | パーキンソン病を処置するためのウイルスベクター |
| GB201713765D0 (en) | 2017-08-28 | 2017-10-11 | Psioxus Therapeutics Ltd | Modified adenovirus |
| CN119614520A (zh) | 2016-08-29 | 2025-03-14 | 阿卡米斯生物公司 | 携带双特异性t细胞衔接器的腺病毒 |
| WO2018054822A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New swine influenza vaccine |
| KR102618843B1 (ko) | 2016-09-20 | 2024-01-02 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 신규한 ehv 삽입 부위 orf70 |
| WO2018057441A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Canine adenovirus vectors |
| MY199909A (en) | 2016-09-20 | 2023-11-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Promoters |
| WO2018064523A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Genvec, Inc. | Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells |
| US11602559B2 (en) | 2016-10-03 | 2023-03-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HIV-1 Env fusion peptide immunogens and their use |
| EP4599847A3 (en) | 2016-10-25 | 2025-11-12 | Trustees of Dartmouth College | Prefusion coronavirus spike proteins and their use |
| US11147249B2 (en) | 2016-12-08 | 2021-10-19 | Alector Llc | Siglec transgenic mice and methods of use thereof |
| US11084850B2 (en) | 2016-12-16 | 2021-08-10 | The Pirbright Institute | Recombinant prefusion RSV F proteins and uses thereof |
| AU2018215585B2 (en) | 2017-01-31 | 2022-03-17 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| EP3600405B1 (en) | 2017-03-24 | 2025-08-20 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Glycan-masked engineered outer domains of hiv-1 gp120 and their use |
| CA3057142A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
| CA3064442A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of tumor cytotoxicity via human gamma-delta t-cells |
| TW202413649A (zh) | 2017-10-16 | 2024-04-01 | 美商航海家醫療公司 | 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療 |
| WO2019079242A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) |
| EP3697440A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| EP3973973A1 (en) | 2017-10-31 | 2022-03-30 | KaliVir Immunotherapeutics, Inc. | Platform oncolytic vector for systemic delivery |
| US11470827B2 (en) | 2017-12-12 | 2022-10-18 | Alector Llc | Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof |
| IL277128B2 (en) | 2018-03-06 | 2025-11-01 | Precigen Inc | Hepatitis b vaccines and uses of the same |
| WO2019173465A1 (en) | 2018-03-06 | 2019-09-12 | Intrexon Corporation | Human papillomavirus vaccines and uses of the same |
| WO2020010035A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cannula system |
| US20210254103A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-08-19 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord |
| EP3870703A1 (en) | 2018-10-22 | 2021-09-01 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion |
| EP4034157A1 (en) | 2019-09-27 | 2022-08-03 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| AU2020361533A1 (en) | 2019-10-08 | 2022-04-28 | Trustees Of Boston College | Proteins containing multiple, different unnatural amino acids and methods of making and using such proteins |
| CN110714027A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-01-21 | 嘉铭(固安)生物科技有限公司 | 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用 |
| MX2022009836A (es) | 2020-02-11 | 2022-11-30 | Us Health | Vacuna para sars-cov-2. |
| US11213482B1 (en) | 2020-03-05 | 2022-01-04 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat | SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system |
| IL296103A (en) | 2020-03-05 | 2022-11-01 | Neotx Therapeutics Ltd | Methods and compositions for treating cancer with immune cells |
| US11773391B2 (en) | 2020-04-01 | 2023-10-03 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19 |
| US20230174587A1 (en) | 2020-04-29 | 2023-06-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use |
| WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
| WO2022035860A2 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use |
| CA3197371A1 (en) | 2020-11-19 | 2022-05-27 | Kalivir Immunotherapeutics, Inc. | Oncolytic immunotherapy by tumor micro-environment remodeling |
| US20240228549A1 (en) | 2021-04-29 | 2024-07-11 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use |
| EP4329786A4 (en) | 2021-04-30 | 2024-12-11 | KaliVir Immunotherapeutics, Inc. | Oncolytic viruses for modified mhc expression |
| US20240374761A1 (en) | 2021-05-05 | 2024-11-14 | Radius Pharmaceuticals, Inc. | Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor |
| AU2022323509A1 (en) | 2021-08-03 | 2024-02-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection |
| CN118660710A (zh) | 2021-10-20 | 2024-09-17 | 罗切斯特大学 | 用于年龄相关白质损失的竞争性治疗的分离神经胶质祖细胞 |
| EP4426331A1 (en) | 2021-11-02 | 2024-09-11 | University of Rochester | Tcf7l2 mediated remyelination in the brain |
| US20250018060A1 (en) | 2021-11-19 | 2025-01-16 | Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. | Adenovirus delivery system for cancer treatment |
| US20250197455A1 (en) | 2022-03-27 | 2025-06-19 | TThe United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Servi | Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use |
| WO2023196898A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Beta globin mimetic peptides and their use |
| WO2024091824A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Ada Forsyth Institute, Inc. | Differentiation and reprogramming of chondrocyte |
| WO2024163747A2 (en) | 2023-02-02 | 2024-08-08 | University Of Rochester | Competitive replacement of glial cells |
| WO2024249626A1 (en) | 2023-05-30 | 2024-12-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hiv-1 envelope triple tandem trimers and their use |
| WO2025090427A1 (en) | 2023-10-23 | 2025-05-01 | University Of Rochester | Glial-targeted relief of hyperexcitability in neurodegenerative diseases |
| WO2026030724A1 (en) | 2024-08-01 | 2026-02-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Sars-cov-2 vaccine |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4920211A (en) * | 1988-01-04 | 1990-04-24 | Vanderbilt University | Mutated adenovirus E1A gene for E1A promoter stimulation |
| US5585362A (en) * | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| US5670488A (en) * | 1992-12-03 | 1997-09-23 | Genzyme Corporation | Adenovirus vector for gene therapy |
| FR2681786A1 (fr) * | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
| AU680459B2 (en) * | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
-
1994
- 1994-07-08 BR BR9405507A patent/BR9405507A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-07-08 PL PL94308122A patent/PL179877B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 RU RU95108217/13A patent/RU2219241C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 DK DK94922889T patent/DK0667912T3/da active
- 1994-07-08 AT AT94922889T patent/ATE399873T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 CZ CZ1995639A patent/CZ287157B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 CA CA002144040A patent/CA2144040A1/fr not_active Abandoned
- 1994-07-08 ES ES94922889T patent/ES2310924T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 AU AU72646/94A patent/AU7264694A/en not_active Abandoned
- 1994-07-08 WO PCT/FR1994/000851 patent/WO1995002697A1/fr not_active Ceased
- 1994-07-08 KR KR1019950700975A patent/KR100356615B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 PT PT94922889T patent/PT667912E/pt unknown
- 1994-07-08 FI FI951138A patent/FI951138A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1994-07-08 DE DE69435108T patent/DE69435108D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 HU HU9500732A patent/HU216871B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 EP EP94922889A patent/EP0667912B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 NZ NZ269156A patent/NZ269156A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 JP JP50436895A patent/JP4190028B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 CN CN94190594A patent/CN1115414C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 SK SK312-95A patent/SK282843B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-07-11 IL IL11028494A patent/IL110284A0/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-10 NO NO19950939A patent/NO321309B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-11-21 US US10/301,085 patent/US20030096787A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2310924T3 (es) | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. | |
| KR100514070B1 (ko) | 재조합아데노바이러스,에이에이브이제조를위한이의용도,상보성세포주및이러한아데노바이러스를함유하는약학조성물 | |
| KR100379569B1 (ko) | 개기원의아데노바이러스벡터및유전자치료에서이의사용방법 | |
| AU706647B2 (en) | Process for preparing recombinant adeno-associated viruses (AAVs), and uses | |
| JP3816952B2 (ja) | 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス | |
| US20040161848A1 (en) | Adenoviral vector and related system and methods of making and use | |
| US6200798B1 (en) | Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene | |
| MXPA97001766A (es) | Adenovirus recombinantes defectuosos con un gen iva2 inactivado | |
| AU725843B2 (en) | Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy | |
| AU2002327630A1 (en) | Adenoviral vector and related system and methods of making and use |