ES2248921T3 - Celulas de insecto o fracciones como adyuvante para antigenos. - Google Patents

Abstract

Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha composición de vacuna es una vacuna veterinaria.

Description

Células de insecto o fracciones como adyuvante para antígenos.

Campo de la invención

La presente invención concierne a adyuvantes, tales como adyuvantes para al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alergeno), composiciones inmunológicas, inmunogénicas, antigénicas o de vacuna que comprenden los adyuvantes, y métodos para fabricar y usar los mismos. Más en particular, la presente invención se refiere a células de insecto como adyuvantes, tales como adyuvantes para al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alergeno), composiciones inmunológicas, inmunogénicas, antigénicas o de vacuna que comprenden los adyuvantes, y métodos para fabricar y usar los mismos.

La presente invención también se refiere a células de insecto, por ejemplo, células de insecto de especies de insectos Lepidópteros tales como células de insecto de S. frugiperda, preferiblemente obtenibles de infección con un virus de insecto tal como un baculovirus, por ejemplo, un virus de insecto recombinante tal como un baculovirus recombinante, que comprende adyuvantes, tales como adyuvantes para al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alergeno), composiciones inmunológicas, inmunogénicas, antigénicas o de vacuna que comprenden los adyuvantes, y métodos para fabricar y usar los mismos.

El al menos un epítopo de interés o antígeno puede ser una proteína recombinante de la expresión del baculovirus recombinante. Por tanto, la invención concierne de manera ventajosa a un adyuvante que comprende células de insecto, por ejemplo, células de insecto de especies de insectos Lepidópteros o fracciones de las mismas tales como células de insecto de S. frugiperda, a partir de la infección con un virus de insecto recombinante tal como un baculovirus recombinante, para potenciar la inmunogenicidad de al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alergeno), a una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna que comprende el adyuvante y al menos un epítopo de interés o antígeno; donde, de manera ventajosa el epítopo de interés o antígeno se obtiene de la expresión por el virus recombinante de al menos un ácido nucleico codificante exógeno del mismo a partir de la infección de las células por el virus recombinante; y, a métodos para fabricar y usar los mismos.

Los adyuvantes de la invención alteran sorprendentemente de manera favorable la respuesta inmune por un vertebrado, por ejemplo, ave, mamífero, frente al epítopo de interés o antígeno combinado con el mismo. Y, la invención concierne a composiciones y usos surgidos de esta observación.

Antecendentes de la invención

La inmunogenicidad puede mejorarse significativamente si un antígeno se coadministra con un adyuvante, habitualmente usado como solución del 0,001% al 50% en solución salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune frente a antígenos, pero no son necesariamente inmunogénicos por sí mismos. Los adyuvantes pueden funcionar reteniendo el antígeno de manera local cerca del sitio de administración para producir un efecto de depósito que facilita una liberación lenta y sostenida del antígeno a células del sistema inmune. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmune a un depósito de antígeno y estimular dichas células para provocar respuestas inmunes.

Los agentes inmunoestimuladores o adyuvantes se han usado durante muchos años para mejorar la respuesta inmune del hospedador frente a, por ejemplo, vacunas. Los adyuvantes intrínsicos, tales como lipopolisacáridos, habitualmente son los componentes de las bacterias muertas o atenuadas usadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están típicamente unidos de manera no covalente a los antígenos y se formulan para potenciar la respuesta inmune del hospedador.

Se usan de manera rutinaria hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio (mencionados habitualmente de manera colectiva como alumbre) como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpo frente a toxoides de la difteria y el tétanos está bien establecida y, más recientemente, se ha potenciado una vacuna de HbsAg con alumbre.

Un amplio intervalo de adyuvantes extrínsecos puede provocar respuestas inmunes potentes frente a antígenos. Estos incluyen saponinas, complejadas con antígeno proteicos de membrana (complejos estimulantes inmunes), polímeros plurónicos con aceite mineral, micobacterias muertas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como muramil dipéptido (MDP) y lipopolisacárido (LPS), así como lípido A; y liposomas. Para inducir de manera eficaz la respuesta inmune humoral (HIR) y la inmunidad mediada por células (CMI), los inmunógenos se emulsionan preferiblemente en adyuvantes.

Se han investigado los adyuvantes definidos químicamente, tales como monofosforil lípido A, conjugados fosfolípidos (véase Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147:410-415 (1991)) que tienen una encapsulación de la proteína en un proteoliposoma (véase Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992)).

Los polímeros sintéticos también se han evaluado como adyuvantes. Estos incluyen los homo- y copolímeros de ácido láctico y glicólico, que se han usado para producir microesferas que encapsulan antígenos (véase Eldridge et al., Mol. Immunol. 28:287-294 (1993)).

Los copolímeros de bloque no iónicos son otro adyuvante sintético que se está evaluando. Los efectos adyuvantes también se han investigado para copolímeros de bajo peso molecular en emulsiones basadas en aceite (véase, Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, páginas 51-94 (1995)) y para copolímeros de alto peso molecular en formulaciones acuosas (Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)).

Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen todas y cada una (preferiblemente la mayoría y más preferiblemente todas) de:

(1) ausencia de toxicidad;

(2) capacidad de estimular una respuesta inmune de larga duración;

(3) simplicidad de fabricación y estabilidad en almacenamiento de larga duración

(4) capacidad de provocar tanto CMI como HIR frente a antígenos administrados por diversas vías;

(5) sinergia con otros adyuvantes;

(6) capacidad de interaccionar de manera selectiva con poblaciones de células presentadoras de antígeno (APC);

(7) capacidad de provocar de manera específica respuestas inmunes específicas de células T_{H}1 o T_{H}2 apropiadas; y

(8) capacidad de aumentar de manera selectiva los niveles de isotipo de anticuerpo apropiado (por ejemplo IgA) frente a antígenos.

En este momento, sin embargo, el único adyuvante usado ampliamente en seres humanos ha sido el alumbre. Otros adyuvantes, tales como Saponina, Quil A, y el adyuvante agua en aceite, de Freund con bacilos de tuberculosis muertos (completo de Freund) o sin bacilos (incompleto de Freund), han tenido limitado su uso en seres humanos debido a sus efectos tóxicos; y, han surgido preocupaciones a causa de los efectos no deseables en animales. Simplemente, se han descrito muchas formulaciones adyuvantes pero la mayoría nunca se ha aceptado para vacunas de rutina, y pocas se han evaluado en seres humanos, principalmente debido a su toxicidad.

Por ejemplo, los aceites minerales usados como adyuvantes en ciertas vacunas animales no se degradan fácilmente y se persisten en el sitio de inyección provocando de este modo granulomas inaceptables; y, en formulaciones adyuvantes generales tales como emulsiones oleosas de compuestos minerales, liposomas y microesferas poliméricas biodegradables provocan reacciones locales debido a la formación de depósitos en el sitio de inyección.

De hecho, el efecto adyuvante de la mayoría de los adyuvantes experimentales se ha asociado a los efectos adversos que provocan.

Por ejemplo, los adyuvantes que funcionan como inmunoestimuladores tales como muramil dipéptido, lipopolisacárido, lípido A, monofosforil lípido A, y citoquinas tales como IL-2 e IL-12 también pueden provocar efectos secundarios sistémicos (toxicidad general, pirogenicidad), limitando su uso.

Por consiguiente, un problema en la técnica es una necesidad de adyuvantes. Permanece una necesidad de adyuvantes mejorados que sean seguros y económicos de fabricar para vacunas humanas y veterinarias (revisado por Gupta y Siber, Vaccine 13:1263-1276 (1995)).

Las células de insecto de S. frugiperda y otras especies de insectos Lepidópteros se han descrito en la bibliografía y su uso general para mantener la infección y replicación de baculovirus y la producción de proteínas recombinantes en bien conocido (véase, por ejemplo, Smith et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.745.051 (baculovirus recombinante); Richardson, C.D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39. "Baculovirus Expression Protocols" Humana Press Inc., (1995)); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Mol. Cell. Biol., 3(12):2156-2165 (1983); Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector", Mol. Cell. Biol., 4(3):399-406 (1984), documento EPA 0 370 573, Solicitud de Patente de EP Nº 265785).

La expresión de antígenos en células de insecto con vectores de expresión de baculovirus y su potencial como vacunas es también bien conocida. Por ejemplo, Kamiya et al., Virus Res. 32:375-379 (1994) se refiere al efecto protector de glicoproteínas del virus de la enfermedad de Newcastle expresado en células de insecto después de inmunización con glicoproteínas recombinantes. Hulst et al., J. Virol. 67:5435-5442 (1993) concierne al uso de glicoproteína de vacuna recombinante purificada fabricada en células de insecto que protegen a los cerdos de infección con el virus del cólera del cerdo.

Hay vacunas donde se usan células de insecto completas o fracciones de membrana celular de insecto que contienen un antígeno seleccionado. Por ejemplo, McCown et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 42:491-499 (1990), usa células completas de insecto Spodoptera que expresan la glicoproteína E del Virus de la Encefalitis Japonesa (JEV) para inmunizar y proteger a ratones frente a JEV. Putnak et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 45:159-167 (1991), usa una fracción de membrana microsomal de células de insecto infectadas con un baculovirus que expresa una glicoproteína de la envuelta del Dengue-1 para inmunizar y proteger a ratones frente a la estimulación con virus del Dengue-1.

Sin embargo, las vacunas de célula de insecto completa o fracción de membrana celular de insecto han sido un medio desfavorecido para suministrar un epítopo de interés o antígeno; creyéndose que el aislamiento del epítopo de interés o antígeno de las mismas es necesario para que el epítopo de interés o antígeno sean de utilizad práctica y no sólo como una curiosidad de laboratorio. Por ejemplo, las vacunas de células de insecto o fracción de membrana celular de insecto se han usado en ensayos de laboratorio básicos de productos de expresión recombinante con animales de laboratorios básicos, pero para los productos de expresión a considerar de utilidad práctica (por ejemplo, útiles para aplicaciones médicas humanas o veterinarias animales), se creyó que los productos de expresión necesitaban aislarse adicionalmente de las células de insecto o fracciones de membrana celular de insecto.

Por tanto, hasta ahora no ha habido un reconocimiento de que células de insecto completas o alteradas, por ejemplo, células de insecto de especies de insectos Lepidópteros tales como células de insecto de S. frugiperda, preferiblemente obtenibles de infección con un virus de insecto tal como un baculovirus, por ejemplo, un virus de insecto recombinante tal como un baculovirus recombinante, puedan ser adyuvantes, tales como adyuvantes para al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alergeno), por ejemplo, un epítopo de interés o antígeno de la expresión por el baculovirus recombinante.

Objetos y sumario de la invención

Ahora se ha descubierto sorprendentemente que preparaciones de células de insecto tales como de especies de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, preferiblemente cuando se infectan con un virus de insecto tal como un baculovirus, por ejemplo, un baculovirus diseñado genéticamente para producir un epítopo de interés o antígeno, por ejemplo, siguiendo los métodos de Smith et al. (Mol. Cell Biol., 12:2156-2165 (1993)), tienen la propiedad inesperada de funcionar como adyuvante.

La presente invención puede tener cada uno y todos como objeto: proporcionar un adyuvante, composiciones que comprenden un adyuvante, métodos para fabricar o usar un adyuvante o una composición que comprende un adyuvante.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de células de insecto completas o alteradas en la fabricación de una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna, para potenciar la inmunogenicidad de un epítopo de interés o antígeno. Ventajosamente las células son de una especie de insecto que es no picadora y/o de una especie de insecto donde la hipersensibilidad a los antígenos de la célula de insecto es baja o está ausente en la especie humana y especies animales y/o de una especie de insecto que es no tóxica, no pirogénica, no tumorigénica, no contiene retrovirus conocidos u otros virus humanos o animales, micoplasma u otros patógenos, por ejemplo, especies de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda tal como la línea celular Sf9. Más ventajosamente, las células de insecto se pueden obtener de la infección de las células por un virus de insecto, tal como un baculovirus, y preferiblemente, las células de insecto son de la infección de las células por un virus de insecto. En una realización, el virus de insecto puede ser un virus recombinante; por ejemplo, un baculovirus recombinante. Los virus de insecto recombinantes pueden comprender al menos un ácido nucleico codificante exógeno, por ejemplo, ADN, para un epítopo de interés o antígeno.

En este documento se describe una composición inmunogénica, inmunológica, antigénica o de vacuna que comprende el adyuvante de la invención. La composición también puede comprender al menos un epítopo de interés o antígeno. Por consiguiente, este documento contiene una composición inmunogénica, inmunológica, antigénica o de vacuna que comprende al menos un epítopo de interés o antígeno y células de insecto completas o alteradas como adyuvante.

Las células de insecto son preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda; y, se pueden obtener de manera ventajosa, y preferiblemente se obtienen, de la infección de dichas células por un virus de insecto tal como un baculovirus, por ejemplo, un virus de insecto recombinante, por ejemplo, un baculovirus recombinante.

El epítopo de interés o antígeno puede ser de cualquier fuente, por ejemplo, expresión nativa por un patógeno, expresión recombinante, etc. y combinaciones de los mismos. El epítopo de interés o antígeno puede haberse aislado de su fuente, y haberse añadido a células de insecto o una fracción de las mismas. Alternativa o adicionalmente, el epítopo de interés o antígeno puede ser de la expresión por un virus de insecto recombinante, tal como un baculovirus, usado para preparar el adyuvante.

Por tanto, la invención proporciona el uso de una composición inmunogénica, inmunológica, antigénica o de vacuna que comprende al menos un epítopo recombinante de interés o antígeno de la expresión de un virus de insecto que ha infectado una célula de insecto y la célula de insecto completa o alterada como adyuvante. El virus preferiblemente es un baculovirus y la célula de insecto es preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda. La composición puede contener adicionalmente al menos un epítopo de interés o antígeno aislado de su fuente y añadido al adyuvante.

Por consiguiente, la invención comprende composiciones multivalentes o de combinación o "cóctel", por ejemplo, obtenibles de la adición de epítopos aislados o antígenos al adyuvante; o de la adición de al menos un primer epítopo de interés aislado o antígeno a una composición que comprende al menos un segundo epítopo de interés o antígeno y células de insecto completas o alteradas como adyuvante, donde el al menos un segundo epítopo de interés o antígeno es igual o diferente del primero y se puede obtener y preferiblemente se obtiene de la expresión por un virus de insecto recombinante, por ejemplo, la expresión de al menos un ácido nucleico codificante exógeno por el virus de insecto recombinante, a partir de la infección de las células de insecto.

La invención también proporciona adicionalmente un kit para una composición inmunogénica, inmunológica, antigénica o de vacuna que comprende células de insecto completas o alteradas como adyuvante y al menos un epítopo de interés o antígeno, y opcionalmente instrucciones para mezclar o combinar el adyuvante y el epítopo de interés o antígeno y/o administrar la composición. El adyuvante y al menos un epítopo de interés pueden estar en recipientes separados, pudiendo envasarse juntos dichos recipientes.

Como en una realización ventajosa puede usarse una célula de insecto completa o alterada como adyuvante en una composición multivalente o de combinación o "cóctel", el kit puede comprender al menos un primer epítopo de interés aislado o antígeno, y al menos un segundo epítopo de interés o antígeno y células se insecto completas o alteradas como adyuvante, donde el al menos un segundo epítopo de interés o antígeno es igual o diferente del primero y se puede obtener y preferiblemente se obtiene de la expresión por un virus de insecto recombinante, por ejemplo, la expresión de al menos un ácido nucleico codificante exógeno por el virus de insecto recombinante, a partir de la infección de células de insecto, y opcionalmente instrucciones para mezclar o combinar el adyuvante y epítopo de interés o antígeno y/o administrar la composición; y, el al menos un segundo epítopo de interés o antígeno y adyuvante pueden estar en un primer recipiente y el al menos un epítopo de interés puede estar en un segundo recipiente, pudiendo envasarse juntos dichos recipientes.

En este documento también se describe a modo de referencia un método para preparar un adyuvante que comprende aislar células de insecto. Las células se insecto son preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda; y, se pueden obtener de manera ventajosa, y preferiblemente se obtienen, de la infección de dichas células por un virus de insecto tal como un baculovirus, por ejemplo, un virus de insecto recombinante, por ejemplo un baculovirus recombinante. Cuando se obtienen de la infección de dichas células por un virus de insecto, es ventajoso retirar o inactivar el virus. Pueden usarse medios mecánicos y/o químicos para retirar o inactivar de otro modo el virus.

También se describe en este documento un método para preparar una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna que comprende: aislar al menos un epítopo de interés o antígeno de la expresión del mismo por un virus se insecto recombinante tal como un baculovirus recombinante en células de insecto, preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, junto con las células de insecto. Adicional o alternativamente, un método para preparar una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna comprende mezclar al menos un epítopo de interés o antígeno con células de insecto aisladas, preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, que se pueden obtener de manera ventajosa de la infección de las mismas por un virus de insecto tal como baculovirus, y más ventajosamente se pueden obtener de la infección de las mismas por un virus de insecto recombinante.

La invención incluso también comprende adicionalmente usos de los adyuvantes y de las composiciones inmunológicas, inmunogénicas, antigénicas o de vacuna. Por ejemplo, este documento contiene el uso de células de insecto para potenciar la inmunogenicidad de al menos un epítopo de interés o antígeno, por ejemplo, para potenciar la inmunogenicidad de al menos un epítopo de interés o antígeno por el uso de una adyuvante que comprende células de insecto, preferiblemente de una especie de Lepidópteros, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, que se puede obtener de manera ventajosa de la infección de las mismas por un virus de insecto tal como un baculovirus, y se puede obtener de manera más ventajosa de la infección de las mismas por un virus de insecto recombinante.

La administración puede ser contemporánea, por ejemplo, el al menos un epítopo de interés o antígeno está en la misma composición que el adyuvante y lo que se administra es la composición. En este aspecto, el adyuvante es para administrarlo "con" el epítopo de interés o antígeno.

O, la administración puede ser secuencial, por ejemplo, el al menos un epítopo de interés o antígeno es para administrarlo de un modo antes o después de la administración del adyuvante para que tenga inmunogenicidad potenciada por el mismo (por ejemplo, el epítopo de interés o antígeno se administra del mismo modo tal como por vía subcutánea y en la misma localización del hospedador tal como brazo o nalgas que el adyuvante y el epítopo de interés o antígeno se administra antes o después del adyuvante pero en un periodo de tiempo tal que el adyuvante potencie la inmunogenicidad del epítopo de interés o antígeno). En este aspecto el adyuvante es para administrarlo "junto con" el epítopo de interés o antígeno.

La invención por tanto proporciona adicionalmente el uso de células de insecto completas o alteradas para obtener una respuesta inmunológica, inmunogénica, antigénica o protectora en un animal tal como un hospedador vertebrado, por ejemplo, ave, mamífero, hospedador humano, ventajosamente una respuesta potenciada. Para propósitos de esta memoria descriptiva, "animal" incluye todas las especies de vertebrados, excepto seres humanos; y "vertebrado" incluye todos los vertebrados, incluyendo animales (como se usa "animal" en este documento) y seres humanos. Y, por supuesto, un subconjunto de "animal" es "mamífero", que para propósitos de esta memoria descriptiva incluye todos los mamíferos, excepto seres humanos.

Estas y otras realizaciones se describen o son obvias a partir de y se incluye por, la siguiente Descripción Detallada.

Breve descripción de las figuras

La siguiente Descripción Detallada, que se da a modo de ejemplo, pero no pretende limitar la invención a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con las Figuras adjuntas, incorporadas en este documento como referencia, en las que:

La Figura 1 muestra un gráfico de la inactivación de baculovirus (título de virus (1,0 E+2 a 1,0 E+9) frente al tiempo (minutos)) por inactivación química (tratamiento con SDS/ colato); y,

La Figura 2 muestra un gráfico de la inactivación de baculovirus (título de virus (1,0 E+0 a 1,0 E+6) frente al tiempo (horas)) por inactivación química (tratamiento con formaldehído) que muestra que la inactivación sigue una cinética de primer orden.

Descripción detallada

Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona el uso de células de insecto completas o alteradas en la fabricación de una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna para potenciar la inmunogenicidad de un epítopo de interés o antígeno y un kit que comprende el adyuvante.

Por tanto, en una realización la invención proporciona una preparación farmacéutica para su administración in vivo para provocar inmunización, compuesta de células de insecto completas o células de insecto alteradas y opcionalmente al menos un epítopo de interés o antígeno. Las células de las especies de Lepidópteros (por ejemplo, mariposas y polillas), como las del gusano cogollero del maíz S. frugiperda, especialmente dichas células en combinación con un virus de insecto tal como el vector de baculovirus usado para expresar un epítopo de interés o antígeno, tienen propiedades que las hacen apropiadas para su uso en composiciones farmacéuticas para uso humano y animal.

Las células de insecto de S. frugiperda son no tóxicas, no pirogénicas, no tumorigénicas, no contienen retrovirus conocidos u otros virus humanos o animales, micoplasma u otros patógenos. Las especies de insecto de las que se obtienen las células son no picadoras y la hipersensibilidad a los antígenos de las células de insecto es baja o está ausente en la especie humana y especies animales.

Además, la presente invención proporciona un uso donde el adyuvante de las células de insecto es una parte de una composición farmacéutica con un antígeno seleccionado sin la adición de compuestos químicos y sin la necesidad de etapas de formulación costosas. Dicha composición adyuvante permite una reducción en la dosis de epítopo o antígeno necesaria para una respuesta deseada tal como una inmunización protectora. Esto significa que las vacunas podrían ser menos caras de producir; y por tanto la invención proporciona un beneficio económico en la producción de vacunas que es especialmente relevante para vacunas humanas de países desarrollados y para vacunas veterinarias.

La presente invención también proporciona un método para preparar una preparación farmacéutica que comprende al menos un epítopo de interés o antígeno y células de insecto completas o células de insecto alteradas para su uso como vacuna. El al menos un epítopo de interés o antígeno está preferiblemente en contacto con las células de insecto o células de insecto alteradas. En una realización preferida de la invención se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el epítopo de interés o antígeno, por ejemplo, un gen, en un vector de expresión de baculovirus, tal como el Virus de la Polihedrosis Nuclear Múltiple de Autografa californica (AcMNPV) preferiblemente bajo el control de un promotor tal como un promotor potente, por ejemplo, el promotor de la polihedrina (Smith et al., supra). El vector de expresión de baculovirus seleccionado después se usa para infectar células de insecto que son susceptibles de infección por AcMNPV, tal como una línea celular obtenida de S. frugiperda. Después de la infección de la células de insecto y la expresión del producto génico seleccionado, las células que contienen el epítopo recombinante de interés o antígeno se recogen y se usan en una preparación farmacéutica para la administración del epítopo de interés o antígeno.

En una realización de la invención, las células de insecto que contienen el epítopo de interés o antígeno se separan del medio de crecimiento y se usan en una formulación farmacéutica apropiada en forma de composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna.

En una segunda realización de la invención las células de insecto que contienen el epítopo de interés o antígeno se tratan por métodos mecánicos o químicos o por una combinación de métodos mecánicos y químicos que vuelven al baculovirus no infeccioso, no destruyen la propiedad adyuvante de las células de insecto, y no desnaturalizan el antígeno seleccionado.

A modo de ejemplo, la presente invención proporciona un método para prepara una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna de células de insecto de S. frugiperda infectadas con un baculovirus que expresa el antígeno, hemaglutinina de la gripe.

También se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna frente a la gripe de aves que induce altos niveles de anticuerpos que neutralizan un virus de la gripe de aves. Se describen ejemplos de métodos químicos que inactivan el baculovirus recombinante con el que las células de S. frugiperda se infectan para la expresión del epítopo de interés o antígeno. Por ejemplo, puede usarse formaldehído a una concentración del 0,001% al 1,0% para inactivar el baculovirus. Alternativa o adicionalmente puede usarse un detergente o mezcla de detergentes para inactivar el baculovirus, por ejemplo, ácido cólico (colato) y/o SDS (docecil sulfato sódico) y/o bromuro de cetildimetilamonio (CDAB) tal como ácido cólico del 1-3% preferiblemente al 2% y/o SDS del 0,1-1,0% preferiblemente al 0,5% y/o CDAB del 0,5-1,5% preferiblemente al 0,1%.

Una molécula de ácido nucleico insertada, por ejemplo, el gen extraño, la molécula de ácido nucleico heterólogo o exógena, por ejemplo, ADN, en un vector de virus de insecto, por ejemplo, en un vector de baculovirus, usado en la práctica de la presente invención, preferiblemente codifica una producto de expresión que comprende al menos un epítopo de interés o antígeno (incluyendo alérgeno). De manera similar, las composiciones de la invención pueden incluir al menos un epítopo de interés o un antígeno. Con respecto a estos términos, se hace referencia al siguiente análisis, y en líneas generales a Kendrew, The Encyclopedia Of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1995 y Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982 ("Maniatis et al., 1982").

Un epítopo de interés es una región inmunológicamente relevante de un antígeno o inmunógeno o fragmento inmunológicamente activo del mismo, por ejemplo, de un patógeno o toxina de interés veterinario o humano.

Puede prepararse un epítopo de interés a partir de un antígeno de un patógeno o toxina, o de otro antígeno o toxina que provoca una respuesta con respecto al patógeno o toxina, tal como, por ejemplo: un antígeno de Morbillivirus, por ejemplo, un virus del moquillo canino o antígeno del sarampión o de la peste bovina tal como HA o F; una glicoproteína de la rabia, por ejemplo, la glicoproteína G de la rabia; un antígeno de la gripe de aves, por ejemplo, HA de la gripe del pavo, el antígeno de la gripe Chicken/Pennsylvania/1/83 tal como una nucleoproteína (NP) o una hemaglutinina de la gripe de aves tal como hemaglutinina A/Jalisco/95 H5 de la gripe; antígeno del virus de la leucemia bovina, por ejemplo, gp51,30 de envuelta; un antígeno del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), por ejemplo, HN o F; un antígeno del virus de la leucemia felina (FeLV), por ejemplo, la proteína de envuelta FeLV; un antígeno del virus asociado a sarcoma de rous tal como RAV-1 env; matriz y/o preplómero del virus de la bronquitis infecciosa; una glicoproteína de Herpesvirus, por ejemplo, una glicoproteína, por ejemplo del herpesvirus felino, herpesvirus equino, herpesvirus bovino, virus de la pseudorrabia, herpesvirus canino, HSV, Virus de la Enfermedad de Marek, herpesvirus de pavos (HVT) o citomegalovirus; un antígeno de flavivirus, por ejemplo, un antígeno del virus de la encefalitis japonesa (JEV), un antígeno de la Fiebre Amarilla, o un antígeno del virus del Dengue; un antígeno de la malaria (Plasmodium), un antígeno del virus de la inmunodeficiencia, por ejemplo, un antígeno del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) o un antígeno del virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) o un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); un antígeno de parvovirus, por ejemplo, parvovirus canino; un antígeno de la gripe equina; un antígeno de poxvirus, por ejemplo, un antígeno de la ectromelia, un antígeno del poxvirus del canario o un antígeno de poxvirus de aves de corral; o un antígeno del virus de la enfermedad bursal infecciosa, por ejemplo VP2, VP3, VP4.

Un epítopo de interés puede ser de un antígeno de un patógeno o toxina humano, o de otro antígeno o toxina que provoque una respuesta con respecto al patógeno o toxina, tal como, por ejemplo: un antígeno de Morbillivirus, por ejemplo, un antígeno del virus del sarampión tal como HA o F; una glicoproteína de la rabia, por ejemplo, la glicoproteína G del virus de la rabia; un antígeno de la gripe, por ejemplo, HA o N del virus de la gripe; un antígeno de Herpesvirus ,por ejemplo, una glicoproteína de un virus del herpes simple (HSV), un citomegalovirus humano (HCMV), Epstein-Barr; un antígeno de flavivirus, un antígeno de JEV, del virus de la Fiebre Amarilla o del virus del Dengue; un antígeno del virus de la Hepatitis, por ejemplo, HBsAg; un antígeno del virus de la inmunodeficiencia, por ejemplo, un antígeno de VIH tal como gp120, gp160; un antígeno del virus Hantaan; un antígeno de C. tetani; un antígeno de las paperas; un antígeno de neumococos, por ejemplo, PspA; un antígeno de Borrelia, por ejemplo OspA, OspB, OspC de Borrelia asociado con enfermedad de Lyme tal como Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelli y Borrelia garinii; un antígeno de la viruela del pollo (varicella zoster); o un antígeno de Plasmodium.

Por supuesto, las listas anteriores pretenden ser ejemplares, ya que el epítopo de interés puede obtenerse de cualquier antígeno de cualquier patógeno o toxina veterinaria o humana; y, para obtener un epítopo de interés, se puede expresar un antígeno de cualquier patógeno o toxina veterinaria o humana.

Con respecto a las listas anteriores, con respecto al ADN de Borrelia, se hace referencia a la Patente de Estados Unidos Nº 5.523.089; documento WO93/08306; Bergstrom et al., Mol. Microbiol., 3(4):479-486 (abril 1989); Johnson et al. Infect. and Immun. 60:1845-1853 (1992); Johnson et al., Vaccine 13(12): 1086-1094 (1995); "The Sixth International Conference on Lyme Borreliosis: Progress on the Development of Lyme Disease Vaccine", Vaccine, 13(1):133-135, 1995 y las publicaciones PCT WO 90/04411, WO 91/09870, WO 93/04175, y WO 96/06165.

Con respecto a los epítopos de neumococos de interés, se hace referencia a Briles et al. documento WO 92/14488.

Con respecto a los epítopos de interés y antígenos de la gripe, por ejemplo HA, y expresión en baculovirus recombinante de los mismos, útiles en la práctica de la presente invención, se hace referencia a Smith et al., documentos WO 9507983 y US 5858368.

Con respecto a virus tumorales se hace referencia a Molecular Biology of Tumor Viruses, RNA TUMOR VIRUSES (Segunda edición, Editada por Weiss et al., Cold Spring Harbor Laboratory 1982) (por ejemplo página 44, y siguientes - Taxonomy of Retroviruses).

Con respecto al ADN que codifica epítopos de interés, se dirige la atención a documentos citados en este documento, véase, por ejemplo, documentos citados supra y documentos citados infla, por ejemplo: las Patentes de Estados Unidos Nº 5.174.993 y 5.505.941 (por ejemplo, gen de la glicoproteína (G) de la rabia, gen de la hemaglutinina de la gripe del pavo, gen de gp51,30 de envuelta del virus de la leucemia bovina, antígeno del Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), gen de FeLV de envuelta, gen de RAV-1 env, NP (gen de la nucleoproteína del virus de la gripe Chicken/Pennsylvania/1/83), gen de matriz y preplómero del virus de la bronquitis infecciosa; gD de HSV); Patente de Estados Unidos Nº 5.338.683 (por ejemplo., ADN que codifica glicoproteínas de Herpesvirus, entre otros); Patente de Estados Unidos Nº 5.494.807 (por ejemplo, ADN que codifica antígenos de la rabia, Hepatitis B, JEV, YF, Dengue, sarampión, pseudorrabia, Epstein-Barr, HSV, VIH, VIS, EHV, BHV, HCMV, parvovirus canino, gripe equina, FeLV, FHV, Hantaan, C. tetani, gripe de aves, paperas, NDV, entre otros); Patente de Estados Unidos Nº 5.503.834 (por ejemplo, Morbillivirus, por ejemplo, F del sarampión, hemaglutinina, entre otros); Patente de Estados Unidos Nº 4.722.848 (por ejemplo, tk de HSV, glicoproteínas de HSV, por ejemplo, gB, gD, HA de la gripe, Hepatitis B, por ejemplo HBsAg entre otros); Patente de Reino Unido GB 2 269 820 B y Patente de Estados Unidos Nº 5.514.375 (por ejemplo, proteínas estructurales de flavivirus); documento 92/22641 (por ejemplo, antígenos de Lentivirus tales como antígeno del virus de la inmunodeficiencia, entre otros); publicaciones PCT WO 93/03145 (por ejemplo, antígenos de IBDV, entre otros) y el documento WO 94/16716 (por ejemplo, antígenos asociados a citoquinas y/o tumores, entre otros); Patente de Estados Unidos Nº 5.529.780 (por ejemplo, antígenos del herpesvirus canino), publicación PCT WO 96/3941 (por ejemplo, antígenos de citomegalovirus), y documento WO 94 28930 (antígenos de Plasmodium).

En cuanto a antígenos para su uso en composiciones de vacuna o inmunológicas, inmunogénicas o antigénicas, se hace referencia a los documentos citados en este documento y el análisis expuesto en este documento (véase, por ejemplo, los documentos citados supra) y también el Diccionario Médico de Stedman (24ª edición, 1982), por ejemplo, definición de vacuna (para una lista de antígenos usados en formulaciones de vacuna; dichos antígenos o epítopos de interés de esos antígenos pueden usarse en la invención, en forma de producto aislado empleado con un adyuvante de la invención o un producto de expresión de un virus o vector de insecto recombinante).

En cuanto a los epítopos de interés, un especialista en la técnica puede determinar un epítopo o región inmunodominante de un péptido o polipéptido y por tanto el ADN codificante de la misma a partir del conocimiento de las secuencias de aminoácidos y ADN correspondientes del péptido o polipéptido, así como a partir de la naturaleza de los aminoácidos particulares (por ejemplo, tamaño, cargo, etc.) y el diccionario de codones, sin experimentación excesiva.

Un método general para determinar qué porciones de una proteína usar en una composición inmunológica se centra en el tamaño y secuencia del antígeno de interés. "In general, large proteins, because they have more potential determinants are better antigens than small ones. The more foreign an antigen, that is the less similar to self configurations which induce tolerance, the more effective it is in provoking an immune response." Ivan Roitt, Essential Immunology (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988).

En cuanto al tamaño: el especialista en la técnica puede maximizar el tamaño de la proteína codificada por la secuencia de ADN a insertar en el vector viral (teniendo en cuenta las limitaciones de empaquetamiento del vector). Para minimizar el ADN insertado maximizando el tamaño de la proteína expresada, la secuencia de ADN puede excluir intrones (regiones de un gen que se transcriben pero que se escinden posteriormente del transcrito de ARN primario).

Como mínimo, la secuencia de ADN puede codificar un péptido de al menos 8 ó 9 aminoácidos de longitud. Esta es la longitud mínima que un péptido necesita tener para estimular una respuesta de células T CD8+ (que reconocen células infectadas por virus o células cancerosas). Un péptido mínimo de 13 a 25 aminoácidos de longitud es útil para estimular una respuesta de células T CD4+ (que reconocen células presentadoras de antígeno especiales que tienen internado el patógeno). Véase Kendrew, supra. Sin embargo, como estas son longitudes mínimas, estos péptidos tienen la probabilidad de generar una respuesta inmunológica, es decir, una respuesta de anticuerpo o células T; pero, para una respuesta protectora (como de una composición de vacuna), se prefiere un péptido más largo.

Con respecto a la secuencia, la secuencia de ADN preferiblemente codifica al menos regiones del péptido que generan una respuesta de anticuerpo o una respuesta de células T. Un método para determinar los epítopos de células T y B implica un mapeo de epítopos. La proteína de interés "se fragmenta en péptidos solapantes con enzimas proteolíticas. Los péptidos individuales después se ensayan para su capacidad de unirse a un anticuerpo provocado por la proteína nativa o de inducir la actividad de células T o células B. Este enfoque ha sido particularmente útil en el mapeo de epítopos de células T ya que la célula T reconoce péptidos lineales cortos complejados con moléculas MHC. El método es menos eficaz para determinar los epítopos de células B" ya que los epítopos de células B a menudo son una secuencia de aminoácidos no lineal pero que son el resultado de una estructura terciaria de la proteína tridimensional plegada. Janis Kuby, Immunology, páginas 79-80 (W.H. Freeman, julio 1992).

Otro método para determinar un epítopo de interés es elegir las regiones de la proteína que son hidrófilas. Los restos hidrófilos a menudo están en la superficie de la proteína y por lo tanto son a menudo las regiones de la proteína que son accesibles para el anticuerpo. Janis Kuby, Immunology, pág. 81 (W.H. Freeman, julio 1992).

Otro método más para determinar un epítopo de interés es realizar un análisis cristalográfico de rayos X del complejo antígeno (longitud completa)-anticuerpo. Janis Kuby, Immunology, pág. 80 (W.H. Freeman, julio 1992).

Otro método más para elegir un epítopo de interés que puede generar una respuesta de células T es identificar de la secuencia proteica motivos de unión de anclaje a HLA potenciales que son secuencias peptídicas que se sabe que probablemente se unen a la molécula MHC.

El péptido que es un supuesto epítopo de interés, para generar una respuesta de células T, debe presentarse en un complejo MHC. El péptido preferiblemente contiene motivos de anclaje apropiados para la unión a las moléculas MHC, y debe unirse con afinidad suficientemente alta para generar una respuesta inmune. Los factores que pueden considerarse son: el tipo de HLA del paciente (vertebrado, animal o humano) que se espera inmunizar, la secuencia de la proteína, la presencia de motivos de anclaje apropiados y la existencia de la secuencia peptídica en otras células vitales.

Una respuesta inmune se genera, en general, del siguiente modo: las células T reconocen proteínas sólo cuando la proteína se ha escindido en péptidos más pequeños y se presenta en un complejo llamado ``complejo principal de histocompatibilidad MHC'' localizado en otra superficie celular. Hay dos clases de complejos MHC - clase I y clase II, y cada clase está compuesta de muchos alelos diferentes. Los diferentes pacientes tienen diferentes tipos de alelos de complejo MHC; se dice que tienen un "tipo HLA diferente".

Los complejos MHC de clase I se encuentran prácticamente en todas las células y presentan péptidos de proteínas producidas en el interior de la célula. Por tanto, los complejos MHC de clase I son útiles para eliminar células cuando están infectadas por virus o cuando se han vuelto cancerosas y como resultado de la expresión de un oncogén. Las células T que tienen una proteína llamada CD8 en su superficie, se unen específicamente a los complejos MHC de clase I/péptido mediante el receptor de células T. Esto conduce a las actividades efectoras citolíticas.

Los complejos MHC de clase II se encuentran sólo en células presentadoras de antígenos y se usan para presentar péptidos de patógenos circulantes que se han endocitado por las células presentadoras de antígeno. Las células T que tienen una proteína llamada CD4 se unen a los complejos MHC de clase II/péptido mediante el receptor de células T. Esto conduce a la síntesis de citoquinas específicas que estimulan una respuesta inmune.

Algunas directrices para determinar si una proteína es un epítopo de interés que estimularía una respuesta de células T, incluyen: longitud del péptido - el péptido debe tener al menos 8 ó 9 aminoácidos de longitud para encajar en el complejo MHC de clase I y al menos 13-25 aminoácidos de longitud para encajar en un complejo MHC de clase II. Esta longitud es un mínimo para que el péptido se una al complejo MHC. Se prefiere para los péptidos que sean más largos que estas longitudes porque las células pueden cortar los péptidos expresados. El péptido debe contener un motivo de anclaje apropiado que posibilitará que se una a las diversas moléculas de clase I o clase II con especificidad suficientemente alta para generar una respuesta inmune (Véase, Bocchia, M. et al., Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85(10):2680-2684, 15 de mayo de 1995; Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994)). Esto puede hacerse, sin experimentación excesiva, comparando la secuencia de la proteína de interés con estructuras publicadas de péptidos asociados a las moléculas MHC. Los epítopos proteicos reconocidos por los receptores de células T son péptidos generados por degradación enzimática de la molécula proteica y se presentan en la superficie celular junto con las moléculas MHC de clase I o clase II.

Además, el especialista en la técnica puede determinar un epítopo de interés comparando la secuencia proteica con secuencias enumeradas en la base de datos de proteínas.

Además, otro método es simplemente generar o expresar porciones de una proteína de interés, generar anticuerpos monoclonales frente a esas porciones de la proteína de interés, y después determinar si los anticuerpos inhiben el crecimiento in vitro del patógeno del que se ha obtenido la proteína. El especialista en la técnica puede usar las otras directrices expuestas en esta descripción y en la técnica para generar o expresar porciones de una proteína de interés para el análisis con respecto a si los anticuerpos frente a la misma inhiben el crecimiento in vitro. Por ejemplo, el especialista en la técnica puede generar porciones de una proteína de interés: seleccionando porciones de 8 a 9 ó 13 a 25 aminoácidos de longitud de la proteína, seleccionando regiones hidrófilas, seleccionando porciones que han demostrado unirse a partir de los datos de rayos X del complejo antígeno (longitud completa)-anticuerpo, seleccionando regiones que difieren en secuencia de otras proteínas, seleccionando motivos de unión de anclaje a HLA potenciales, o cualquier combinación de estos métodos u otros métodos conocidos en la técnica.

Los epítopos reconocidos por anticuerpos se expresan en la superficie de una proteína. Para determinar las regiones de una proteína que son más probables de estimular una respuesta de anticuerpo un especialista en la técnica puede realizar preferiblemente un mapa de epítopos, usando los métodos generales descritos anteriormente, u otros métodos de mapeo conocidos en la técnica.

Como se puede observar a partir de lo anterior, sin experimentación excesiva, a partir de esta descripción y del conocimiento en la técnica, el especialista en la técnica puede determinar la secuencia de aminoácidos y de ADN correspondiente de un epítopo de interés para obtener una respuesta de células T, células B y/o anticuerpos. Además, se hace referencia a Gefter et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.019.384, presentada el 28 de mayo de 1991, y los documentos que cita, (Obsérvese especialmente la sección "Bibliografía Relevante" de esta patente, y la columna 13 de esta patente, que describe que: "Una gran cantidad de epítopos se ha definido a partir de una amplia diversidad de organismos de interés. Son de particular interés aquellos epítopos a los que se dirigen los anticuerpos neutralizantes. Las descripciones de dichos epítopos están en muchas de la referencias citadas en la sección de Bibliografía Relevante").

Por consiguiente, sin ninguna experimentación excesiva, la presente invención puede practicarse para cualquier epítopo de interés deseado o antígeno de cualquier patógeno o toxina humana o veterinaria.

Una composición inmunológica provoca una respuesta inmunológica - local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesita, ser protectora. Una composición inmunogénica probablemente provoca una respuesta inmunológica local o sistémica que puede, pero no necesita, ser protectora. Una composición antigénica provoca de manera similar una respuesta inmunológica local o sistémica que puede, pero no necesita, se protectora. Una composición de vacuna provoca una respuesta protectora local o sistémica. Por consiguiente, los términos "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" y "composición antigénica" incluyen una "composición de vacuna" (ya que los tres términos anteriores pueden ser composiciones protectoras.

Una composición de la invención puede envasarse en una forma de dosificación única para inmunización por administración parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración a un orifico, por ejemplo, perlingual (es decir, oral), intragástrica, administración a la mucosa incluyendo intraoral, intraanal, intravaginal La dosificación eficaz y vía de administración se determinan por la naturaleza de la composición, por ejemplo, inmunogénica, antigénica, inmunológica o de vacuna así como por la naturaleza del epítopo de interés o antígeno presente, por el nivel de expresión si se usa directamente el virus recombinante, y por factores conocidos, tales como raza o especie, edad, sexo, peso, condición y naturaleza del hospedador, así como LD_{50} y otros procedimientos de exploración que son conocidos y no necesitan experimentación excesiva. Las dosificaciones del epítopo de interés o antígeno puede variar de unos pocos a unos pocos miles, por ejemplo, 10 a 1000 unidades, o unos pocos a unos pocos cientos de microgramos, por ejemplo, 5 a 500 \mug. El virus o vector recombinante puede infectar células de insecto en cualquier cantidad apropiada para conseguir la expresión a estos niveles de dosificación. Las cantidades apropiadas pueden ser una cantidad de aproximadamente al menos 10^{3,5} pfu; por ejemplo, de aproximadamente 10^{4} pfu a aproximadamente 10^{6}pfu, de aproximadamente 10^{4} pfu a aproximadamente 10^{10} pfu, por ejemplo, de aproximadamente 10^{5} pfu a aproximadamente 10^{9} pfu, o de aproximadamente 10^{6} pfu a aproximadamente 10^{8} pfu.

El procedimiento de administración para las composiciones de la invención tales como composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna pueden ser mediante una vía parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Dicha administración posibilita una respuesta inmune sistémica. La administración puede ser mediante una vía mucosa, por ejemplo, oral, nasal, genital, etc. Dicha administración posibilita una respuesta inmune local.

Más generalmente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna de la invención pueden prepararse de acuerdo con técnicas descritas en este documento junto a técnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica farmacéutica, médica o veterinaria. Dichas composiciones pueden administrarse en dosificaciones y por técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica médica o veterinaria teniendo en consideración factores tales como raza o especie, edad, sexo, peso, y condición del paciente particular, y la vía de administración. Las composiciones pueden administrarse solas, o pueden co-administrarse o administrarse secuencialmente con otras composiciones de la invención o con otras composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o terapéuticas. Dichas composiciones distintas pueden incluir antígenos o epítopos nativos purificados o antígenos o epítopos de expresión por un sistema vector; y se administran teniendo en cuenta los factores mencionados anterior-
mente.

Los ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas para administración a un orificio, por ejemplo, oral, nasal, anal, genital, por ejemplo, vaginal, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y, preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable) tales como suspensiones o emulsiones estériles. En dichas composiciones el adyuvante de la invención y el epítopo opcional de interés o antígeno pueden estar en mezcla con un vehículo, diluyente o excipiente apropiado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa.

Las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna típicamente pueden contener un adyuvante; y, el adyuvante de la invención que comprende células de insecto o fracciones de las mismas está bien adaptado para cualquier tipo de composición antigénica, inmunológica o de vacuna.

Adicionalmente, las composiciones inmunogénicas, antigénicas, inmunológicas o de vacuna de la invención pueden estimular una respuesta inmune o de anticuerpo en animales. A partir de esos anticuerpos, por técnicas bien conocidas en la técnica, pueden prepararse anticuerpos monoclonales y, esos anticuerpos monoclonales, pueden emplearse en ensayos de unión a anticuerpo bien conocidos, kits de diagnóstico o ensayos para determinar la presencia o ausencia de antígeno o antígenos y de ella la presencia o ausencia del agente causal natural del epítopo de interés o antígeno o, para determinar si una respuesta inmune frente a ese agente o al epítopo o epítopos o antígeno o antígenos simplemente se ha estimulado.

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas por células de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un determinante antigénico único y proporciona especificidad mayor que un anticuerpo convencional obtenido de suero. Además, explora una gran cantidad de anticuerpos monoclonales hace posible seleccionar un anticuerpo individual con especificidad, avidez e isotipo deseados. Las líneas celulares de hibridoma proporcionan una fuente constante y no cara de anticuerpos químicamente idénticos y las preparaciones de dichos anticuerpos pueden normalizarse fácilmente. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales son bien conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, Koprowski, H. et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.196.265, presentada el 1 de abril de 1989. Son bien conocidos los usos de los anticuerpos monoclonales. Uno de dichos usos es en métodos de diagnóstico, por ejemplo, David, G. y Greene, H., Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110, presentada el 8 de marzo de 1983. Los anticuerpos monoclonales también se han usado para recuperar materiales por cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo, Milstein C., Scientific American 243:66, 70 (1980).

Por consiguiente, la presente invención tiene numerosas utilidades.

Un mejor entendimiento de la presente invención y de sus muchas ventajas se obtendrá a partir de los siguientes Ejemplos no limitantes, dados a modo de ilustración.

Ejemplos Ejemplo 1 Las células de insecto como adyuvante para antígeno alteran de manera favorable la respuesta inmune frente al antígeno

Este Ejemplo ilustra una realización de la invención que demuestra la propiedad de células de insecto de S. frugiperda de tener propiedades adyuvantes que potencian de manera favorable las respuestas inmunes frente a un antígeno particular (hemaglutinina A/Jalisco/95 H5 de la gripe).

Se infecto un cultivo de células de insecto de S. frugiperda con un baculovirus recombinante diseñado para expresar la hemaglutinina A/Jalisco/95 H5 de la gripe de aves (rHA).

El ARN viral, A/Jalisco/95 (H5N2) está disponible y se suministró por el Dr. Michael Perdue, Influenza Research, ARS, SEPRL, USDA, Athens, GA. El ARN viral completo se usó como molde para hacer ADNc utilizando la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (M-MuLV). El cebador usado para la síntesis de ADNc fue un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEC ID Nº: 1) homólogo al extremo de todos segmentos de virión del gen de la gripe.

La amplificación del gen HA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usó kits Gene Amp obtenidos de Cetus/Perkin Elmer. Estos cebadores 5' y 3' se diseñaron en con sitios de enzimas de restricción que no se encuentran en los genes de HA (Sma1 y Kpn1). La mezcla de reacción de PCR, 100 \mul, contenía 20 pmol de cebadores específicos para los extremos 5' y 3' del gen de HA H5. La amplificación por PCR se realizó durante 25-30 ciclos constando cada uno de 1 minutos de desnaturalización a 94ºC, 2 minutos a 35ºC para la rehibridación y 2 minutos a 72ºC para la extensión. El ADN amplificado del gen de HA se ligó en un plásmido de transferencia. Los productos de ADN de doble cadena resultantes contenían la secuencia codificante de HA madura completa y se verificaron por secuenciación de ADN. El plásmido de transferencia de gen de HA después se subclonó por procedimientos convencionales (Maniatis et al., 1982) en un vector de expresión de baculovirus.

Las células de insecto que contenían el antígeno rHA seleccionado se recogieron por centrifugación, 6.000 rpm durante 30 minutos, y se prepararon preparaciones de vacuna de acuerdo con los ejemplos mostrados en la Tabla 1.

La preparación 1 era células de insecto completas que se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La preparación 2 era células suspendidas en PBS alteradas por medios mecánicos con un homogeneizador Polytron^{TM} (Brinkmann Instruments Inc., Westbury).

Las preparaciones 3 y 4 eran células de insecto alteradas con una mezcla de detergentes (véase abreviaturas de la Tabla 1) seleccionados para inactivar el baculovirus sin desnaturalizar el antígeno seleccionado. Las células se suspendieron en las soluciones detergentes y se alteraron con un Polytron^{TM}.

Cada preparación de la Tabla 1 se analizó para la presencia de baculovirus infecciosos usando un ensayo de placa de baculovirus convencional. El contenido en hemaglutinina se midió usando un ensayo convencional de hemaglutinación de células sanguíneas rojas de pollo.

TABLA 1 Células de Insecto de S. frugiperda Infectadas con un Vector de Baculovirus que Expresa la hemaglutinina A/Jalisco/95 H5 de la Gripe de Aves Alterado con Detergentes

Nº Prep	Células de Insecto	Tratamiento
1	Completas	PBS
2	Alteradas	PBS
3	Alteradas	colato al 2%, SDS al 0,5%
4	Alteradas	colato al 2%, CDAB al1%
\begin{minipage}[t]{140mm} Abreviaturas: N^{o} Prep. - N^{o} de Preparación; CDAB - bromuro de cetildimetilamonio; SDS - dodecil sulfato sódico\end{minipage}

Como control para el estudio, se expresó rHA A/Jalisco/95 H5 de la gripe en células de insecto de S. frugiperda usando el vector de baculovirus y se purificó hasta >95%.

Para evaluar la inmunogenicidad de las preparaciones de vacuna descritas en la Tabla 1, se inyectaron alícuotas que contenían cantidades iguales de rHA medidas usando el ensayo de aglutinación de células sanguíneas rojas de pollo, en grupos de seis ratones. Cada preparación de vacuna se administró en una dosis de 0,5 ml, a grupos de seis ratones para cada preparación. No se observaron efectos tóxicos inmediatos o retardados, respuestas inflamatorias, o granulomas en el sitio de inoculación. La ausencia de toxicidad de las preparaciones se confirmó por la ganancia de peso normal de los animales (Tabla 2).

TABLA 2 La Ganancia de Peso Media durante 28 Días en Ratones Inmunizados con Preparaciones de Vacuna

Preparación de Vacuna Nº	Ganancia de peso	Desviación
	(porcentaje de aumento)	Típica
1 Células completas	19	14
2 Alterado con PBS	22	6
3 Colato al 2%, SDS al 0,5%	24	9
4 Colato al 2%, CDAB al 1%	26	7
5 rHA purificado	16	14
6 rHA purificado + adyuvante de Freund	24	12
7 PBS control	26	11

Las muestras de sangre se obtuvieron 21 días después de la inyección y los sueros se analizaron por un ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA) para la presencia de los anticuerpos anti-rHA. Las muestras también se analizaron por el ensayo de inhibición de hemaglutinina (HAI) para la presencia de anticuerpos anti-rHA que podrían neutralizar el virus A/Jalisco/95 H5 de la gripe (Tabla 3).

TABLA 3 Inmunogenicidad del rHA A/Jalisco/95 H5 de la gripe en Ratones Inmunizados con Antígeno rHA en Células de Insecto

Preparación de Vacuna Nº	Título de Anticuerpo	Título HAI
	3 semanas	3 semanas
1 Células completas	57.470	128
2 Alterado con PBS	77.605	128
3 Colato al 2%, SDS al 0,5%	61.440	205
4 Colato al 2%, CDAB al 1%	102.400	287
5 rHA purificado	10.159	29
6 rHA purificado + adyuvante de Freund	102.400	645
7 PBS control	10	4

Los datos presentados en la Tabla 3 demuestran que el antígeno seleccionado, rHA, sin un adyuvante (Tabla 3, preparación Nº 5) produjo sólo una respuesta inmune muy ligera. Como se esperaba, el rHA purificado mezclado con un adyuvante completo de Freund produjo una respuesta de anticuerpo muy fuerte que incluyó un alto nivel de anticuerpos neutralizantes (Tabla 3, preparación Nº 6).

Cuando se presentó el antígeno rHA seleccionado al sistema inmune como parte de la célula de insecto completa o alterada sus propiedades inmunogénicas se potenciaron de manera significativa. Las células se insecto completas, las células de insecto alteradas con un proceso mecánico, y las células se insecto alteradas mecánicamente en presencia de detergentes fueron todas significativamente más inmunogénicas que la proteína rHA purificada (Tabla 3, preparaciones Nº 1, Nº 2, Nº 3 y Nº 4). Las preparaciones de vacuna del antígeno seleccionado (rHA) en células de insecto produjeron de 5 a 10 veces el título de anticuerpos anti-HA que rHA purificado (Tabla 3). Las células de insecto que contenían el antígeno rHA seleccionado y tratadas por alteración mecánica en presencia de mezcla de detergente que contenía colato al 2% y CDAB al 1% indujeron un título de anticuerpo medio en los ratones que es equivalente al antígeno purificado más adyuvante completo de Freund (Tabla 3, preparación Nº 4).

Ejemplo 2 Medios mecánicos y/o químicos para retirar o inactivar de otro modo baculovirus recombinante en células de insecto para adyuvante

Es convencional inactivar los virus en ciertas formulaciones de vacuna que contienen vacunas inactivadas o de subunidades. Los baculovirus se inactivan rápidamente por los tratamientos con detergente descritos en el Ejemplo 1 sin desnaturalizar el antígeno rHA recombinante seleccionado medido por el ensayo de HA para la actividad biológica y para la capacidad de la vacuna de rHA para inducir los anticuerpos neutralizantes (Tabla 3). Las células de insecto de S. frugiperda infectadas con un baculovirus recombinante se suspendieron en tampón que contenía colato al 2%, SDS al 0,5% y se alteraron con Polytron^{TM}. Se tomaron alícuotas en los tiempos indicados en la Tabla 4 y el título de baculovirus se determinó por el método de ensayo de placa. Los datos presentados en la Tabla 4 y la Figura 2 muestran que en los 10 primeros minutos de tratamiento, se redujo la infectividad de baculovirus recombinante hasta niveles indetectables.

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TABLA 4 y Figura 1

Inactivación de Baculovirus Recombinante Usando Tratamiento con SDS/colato de Células de Insecto
Nº	Tiempo (min)	Título del virus (pfu/ml)
1	0	8, 4 x 10^{8}
2	11	<10^{2}
3	13	<10^{2}
4	20	<10^{2}
5	40	<10^{2}
6	70	<10^{2}
7	110	<10^{2}
8	310	<10^{2}

Ejemplo 3 Células de insecto de spodoptera frugiperda subfraccionadas en una fracción de membrana que contiene proteínas recombinantes unidas a la membrana y la fracción que contiene proteínas solubles y la mayoría del ADN y el ARN

Las células de insecto que expresan rHA A/Jalisco/95 de la gripe de aves se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 1. Las células se alteraron en tampón de etanolamina de alta fuerza iónica a pH 9,5 con un homogeneizador Polytron^{TM} (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY) y la fracción de membrana se aisló por centrifugación. La fracción de membrana se separó de las proteínas adsorbidas lavando con el tampón de etanolamina de baja fuerza iónica a pH 9,5. Este procedimiento también reduce el título de baculovirus aproximadamente en 1000 veces. El baculovirus restante puede inactivarse completamente tratando el sedimento con formaldehído al 0,5%. Los datos presentados en la Tabla 5 y la Figura 3 muestran que la inactivación del baculovirus es un proceso de primer orden y que el baculovirus puede eliminarse completamente por un tratamiento durante una noche de la fracción de membrana que contiene rHA lavada con formaldehído al 0,5%. En el transcurso de la inactivación de baculovirus se registró la integridad estructural del rHA por ensayo de hemaglutinación normalizado. Sólo la hemaglutinina que está plegada apropiadamente y ensamblada en trímeros pueden aglutinar células sanguíneas rojas y la desnaturalización de la proteína recombinante viene acompañada por la pérdida de actividad de hemaglutinación. La actividad de hemaglutinación del rHA no disminuyó lo que indica que rHA no se desnaturalizó durante la inactivación de baculovirus
(Tabla 5).

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TABLA 5 y Figura 2

Inactivación de baculovirus recombinante con formaldehído

	Tiempo (horas)	Virus	Unidades rHA
	0,01	5,60E+05	3000
	1	8,00E+04	3000
	3	7,00E+03	3000
	4	7,30E+03	3000
	5	2,00E+03	5000
	6	1,5E+0,3	5000

Habiendo descrito de este modo en detalle las realizaciones preferidas de la presente invención, se entiende que la invención definida por las reivindicaciones adjuntas no está limitada a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior aunque son posibles muchas variaciones evidentes de la misma sin alejarse del alcance de la presente invención.

Claims (12)

1. Uso de células de insecto completas o alteradas en la fabricación de una composición inmunológica, inmunogénica, antigénica o de vacuna, para potenciar la inmunogenicidad de un epítopo de interés o antígeno.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde las células de insecto se pueden obtener de una especie de Lepidópteros.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, donde las células se pueden obtener de Spodoptera frugiperda.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde las células son de la línea celular Sf9.

5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las células se pueden obtener de la infección de las células por un virus de insecto.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde el virus de insecto es un virus de insecto recombinante.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, donde el virus de insecto es un baculovirus.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, donde el virus de insecto recombinante es un baculovirus recombinante que comprende al menos un ácido nucleico codificante exógeno de un epítopo de interés o antígeno.

9. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las células se insecto se alteran por medios mecánicos o químicos o tanto mecánicos como químicos.

10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho epítopo de interés o antígeno se aísla de su fuente y dicho epítopo de interés o antígeno se añade a dichas células de insecto.

11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha composición de vacuna es una vacuna veterinaria.

12. Un kit para la preparación de una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende un epítopo de interés o antígeno y un adyuvante, donde el adyuvante comprende células de insecto completas o alteradas, comprendiendo dicho kit el epítopo de interés o antígeno en un primer recipiente, y el adyuvante en un segundo recipiente, y opcionalmente instrucciones para mezclar el epítopo de interés o antígeno y el adyuvante y/o para la administración de la composición; y donde opcionalmente los recipientes están en un envase.