ES2249042T3 - Pge sintasa y procedimientos y medios para la modulacion de su actividad. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado y puro que es una PGE sintasa, y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. La presente invención proporciona en varios aspectos la posibilidad de uso de la PGE sintasa purificada en varios contextos, en particular, en procedimientos de ensayo y de examen de sustancias capaces de modular, especialmente inhibir, la actividad PGE sintasa. La PGE sintasa purificada podría prepararse mediante expresión recombinante a partir de ácido nucleico. Podría expresarse en sistemas de expresión eucariotas o procariotas, y podría carecer de la glicosilación nativa. Las sustancias identificada como moduladoras de la PGE sintasa podrían emplearse en el control o tratamiento de la inflamación, artritis, cáncer u otras anomalías del crecimiento celular, en la enfermedad de Alzheimer, para modular la apoptosis, y para tratar el dolor.

Description

PGE sintasa y procedimientos y medios para la modulación de su actividad.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a modular la actividad de la PGE sintasa. En particular, la presente invención se basa en la identificación de la PGE sintasa y del ADN que la codifica, proporcionando ensayos para sustancias capaces de modular, especialmente inhibir, la actividad de la PGE sintasa. La PGE es un potente compuesto conocido por producir inflamación (incluyendo los síntomas: la fiebre y el dolor), y la inhibición de su producción podría usarse en el tratamiento de la inflamación, artritis, cáncer, enfermedad de Alzheimer, para modular la apoptosis, y para tratar el dolor.

El endoperóxidos H_{2} de la prostaglandina (PGH_{2}) se forma a partir del ácido araquidónico mediante la acción de la ciclooxigenasa (cox) 1 o 2. La cox-1 se expresa constitutivamente en muchas células y tejidos tales como las plaquetas, el endotelio, el estómago y el riñón, mientras que la proteína cox-2 puede ser inducida por citocinas proinflamatorias como la interleucina-1\beta en el sitio de inflamación. Para una revisión reciente de la cox, consultar Smith, W., Advances in Experimental Medicine & Biology, 400B:989-1011 (1997); Herschman, H.R., Biochimica et Biophysica Acta, 1299:125-140 (1996); Dubois, R., et al., Faseb J. 12:1063-1073 (1998). Cadena abajo de las ciclooxigenasas, su producto, el PGH_{2}, puede ser metabolizado adicionalmente en los diversos eicosanoides fisiológicamente importantes, por ejemplo, la PGF_{2}\alpha, PGE_{2}, PGD_{2}, PGI_{2} (prostaciclina) y tromboxano (TX) A_{2} (Smith, W. L., 4Am. J. Physiol., 263:F181-F191 (1992)).

El mecanismo para la biosíntesis de la PGE_{1} y de la PGF_{1\alpha} (formada usando ácido dihomo-\gamma-linolénico en vez de ácido araquidónico) (Hamberg, M. & Samuelsson, B., J. Biol. Chem., 242:5336-5343 (1967)), por parte de las glándulas vesiculares del carnero, se postuló que progresaba a través de un endoperóxido cíclico (Samuelsson, B., J. Am. Chem. Soc., 87:3011-3013 (1965)) más tarde denominado PGH2 (Hamberg, M. & Samuelsson, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:899-903 (1973); Hamberg, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:345-349 (1974);
Nugteren, D. H. & Hazelhof, E., Biochim. Biophys. Acta, 326:448-461 (1973)). De forma resumida, las reacciones catalizadas por las ciclooxigenasas implican una abstracción estereoespecífica del átomo de hidrógeno 13-pro-S del ácido araquidónico. Esto conduce a la formación de un radical carbono que es atrapado por el oxígeno molecular en la posición C-11, la formación del endoperóxido 9,11 y del enlace entre las posiciones C-8 y C-12 con las cadenas laterales alifáticas en trans, la reorganización del radical al C-15, y la reacción con una segunda molécula de oxígeno. En el paso siguiente, el grupo peroxi resultante en C-15 se reduce a un grupo hidroperoxi, y se forma la PGG_{2}. Este grupo hidroperoxi puede ser subsiguientemente reducido por la actividad peroxidasa de la ciclooxigenasa (en presencia de un agente reductor, por ejemplo, el glutatión), formándose así el PGH_{2}. Los enzimas responsables de la isomerización del PGH_{2} en la PGE_{2} no son bien conocidos. Se han hecho intentos para purificar la PGE sintasa microsomal a partir de vesículas seminales ovinas y bovinas, un órgano que se sabe contiene una elevada actividad PGE sintasa (Ogino, N., et al., Journal of Biological Chemistry, 252:890-5 (1977);
Moonen, P., et al., Methods in Enzymology, 86:84-91 (1982)). Estos estudios han mostrado que la PGE sintasa puede solubilizarse y purificarse parcialmente. La actividad enzimática también era dependiente del glutatión, pero se inactivaba rápidamente durante el curso de la purificación. Dos anticuerpos monoclonales, denominados IGG1(hei-7) e IGG1(hei-26), generados contra PGE sintasa parcialmente purificada procedente de vesículas seminales de carnero, pudieron inmunoprecipitar dos proteínas de las vesículas seminales de carnero con masas moleculares de 17,5 y 180 kDa, respectivamente (Tanaka, Y., et al., J. Biol. Chem., 262:1374-1381 (1987)). Se halló que ambas proteínas precipitadas poseían una actividad PGE sintasa dependiente del glutatión, pero no actividad glutatión-S-transferasa. De forma interesante, el anticuerpo IGG1(hei-7) también causó la co-precipitación de la ciclooxigenasa, demostrando que la proteína de 17,5 kDa y las proteínas cox estaban en el mismo lado de las membranas microsomales. La proteína de 17,5 kDa mostró una Km para el PGH_{2} de 40 \muM, similar al que se ha descrito por otros que investigan la PGE sintasa microsomal (Moonen, P., et al., Methods in Enzymology, 86:84-91 (1982)). Por contra, la proteína mayor presentó una Km para el PGH_{2} de 150 \muM. También se han descrito proteínas adicionales, que pertenecen a la superfamilia de la glutatión-S-transferasa citosólica, que poseen actividades PGE, PGD y PGF sintasa (Urade, Y., et al., J. Lipid Med., 12:257-273 (1995)). Recientemente, se purificó una proteína de 16,5 kDa a partir de vesículas seminales de carnero que posee actividad PGF_{2}\alpha sintasa dependiente de glutatión
(Burgess, J.R. & Reddy, C.C., Biochem. & Mol. Biol. Int., 41:217-226 (1997)). El enzima (reductasa de endoperóxido de prostaglandina) también pudo catalizar la reducción del hidroperóxido de cumeno, mientras que el 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (un sustrato típico para varias glutatión-S-transferasas) no fue un sustrato. La actividad PGE sintasa microsomal se midió también en varios órganos de rata (Watanabe, K., et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 235:148-52(1997)) y se halló una elevada actividad dependiente de glutatión en el conducto deferente, los órganos genitales accesorios, y el riñón. Se observó actividad PGE sintasa microsomal independiente del glutatión en el corazón, bazo y útero.

El enzima responsable de la biosíntesis de la PGE proporciona por tanto una diana novedosa para el desarrollo de fármacos con objeto de tratar varios trastornos inflamatorios. Sin embargo, tal como es evidente a partir de la discusión precedente, nadie ha tenido previamente éxito en proporcionar una PGE sintasa pura, ni los medios para proporcionarla.

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Oxford Biomedical vende una preparación parcialmente purificada de PGE sintasa ovina (Número de Catálogo PE 02). El análisis de la preparación indica que es bastante cruda, y que incluye una mezcla compleja de numerosos componentes.

Las dificultades concretas para purificar la PGE sintasa incluyen el hecho de que la proteína es una proteína de membrana, en general, muy difíciles de purificar hasta su homogeneidad, y el hecho de que su actividad enzimática es muy inestable después de la solubilización. También, el trabajo descrito en ésta demuestra que la proteína posee una actividad enzimática muy elevada, proporcionando una indicación de que los niveles de proteína dentro de las células son muy bajos, lo que se añade a la dificultad de la purificación.

Urade et al., J. Lipid Med., 12:257-273 (1995), destacan "se conoce poco sobre las propiedades de la PGE sintasa". Incluso más recientemente, William Smith en "Molecular Biology of Prostanoid Biosynthetic Enzymes and Receptors", Advances in Experimental Medicine & Biology, 400B:989-1011, publicado el 1997, destacaba "La historia de la PGE sintasa ha sido una historia confusa", apuntando que la formación de la PGE no se ha atribuido a una única proteína.

El trabajo de los presentes inventores descrito más abajo demuestra que la PGE sintasa humana es un miembro de una superfamilia de proteínas consistente en proteínas de 14-18 kDa asociadas a membrana, implicadas en el metabolismo de los eicosanoides y del glutatión. La PGE sintasa presenta un 38% de identidad, a nivel de secuencia de aminoácidos, con la glutatión-S-transferasa 1 microsomal. La secuencia del ADNc humano, así como la secuencia de aminoácidos predicha, se depositaron en bases de datos públicas con el nombre MGST1-L1 (número de acceso en GenBank: AF027740), así como de una PIG12 inducida por p53 (número de acceso en GenBank: AF010316). Previamente no se ha adscrito ninguna función a estas secuencias de ADNc.

Polyak et al., Nature, 389:300-305 (1997) identificaron lo que ellos denominaron "PIG12" mediante la clonación de secuencias cuya expresión estaba regulada hacia arriba por la P53. Ellos afirman que la "PIG12 es un nuevo miembro de la familia de de genes de la glutatión-S-transferasa microsomal", pero no identifican función real alguna. Ciertamente, no hay sugerencia de que su PIG12 sea realmente la PGE sintasa humana.

En resumen, nadie ha proporcionado previamente la PGE sintasa en ninguna forma o cantidad que pudiera permitir la secuenciación de aminoácidos, para proporcionar un potencial punto de partida para intentar la clonación de una secuencia codificante. Más aún, no hay sugerencia alguna de que la secuencia en las bases de datos, que los presentes inventores han demostrado ahora que codifica la PGE sintasa, codificara de hecho la PGE sintasa.

A la luz del trabajo de los inventores, la presente invención proporciona en varios aspectos la posibilidad de uso de la PGE sintasa purificada en varios contextos, en particular, en procedimientos de ensayo y de examen de sustancias capaces de modular, especialmente inhibir, la actividad PGE sintasa. La PGE sintasa purificada podría prepararse mediante expresión recombinante a partir de ácido nucleico. Podría expresarse en sistemas de expresión eucariotas o procariotas, y podría carecer de la glicosilación nativa. Las sustancias identificada como moduladoras de la PGE sintasa podrían emplearse en el control o tratamiento de la inflamación, artritis, cáncer u otras anomalías del crecimiento celular, en la enfermedad de Alzheimer, para modular la apoptosis, y para tratar el dolor.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el resultado de un cromatograma de HPLC en fase inversa de los productos formados durante la incubación con PGH_{2} (se representan las cuentas por minuto (CPM) respecto el tiempo en minutos). La Figura 1A muestra los resultados obtenidos con la fracción de membrana de la PGE sintasa mezclada con solución de paro. La Figura 1B muestra los resultados obtenidos con el tampón. La Figura 1C muestra los resultados obtenidos con la fracción de membrana de PGE sintasa. B y C se incubaron durante 2 minutos antes de añadir la solución de paro. Los productos se detectaron usando detección mediante radiactividad. Los primeros 20 minutos representan la elución isocrática usando agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético (70:30:0,007, en volumen) como fase móvil, con una velocidad de flujo de 1 ml/min. A continuación, se aplicó un gradiente lineal desde el 100% de la fase móvil hasta el 100% de metanol a lo largo de un período de 10 minutos, el cual se mantuvo durante el resto del análisis.

La Figura 2 ilustra la dependencia de la formación de la PGE_{2} de la concentración de proteína de membrana, la cantidad de PGE_{2} en pmoles se representa respecto los mg/ml de proteína.

La Figura 3 muestra el curso temporal de la formación de la PGE_{2}, representándose la cantidad de PGE_{2} en pmoles respecto el tiempo en minutos. Los círculos rellenos corresponden a la PGE sintasa incubada con glutatión; los círculos vacíos corresponden a la PGE sintasa incubada sin glutatión; los triángulos rellenos corresponden al tampón con glutatión. En ésta se usan las siguientes abreviaturas:

PGG_{1}, Prostaglandina G_{1}: ácido 15(S)-hidroperoxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-13-enoico;

PGG_{2}, Prostaglandina G_{2}: ácido 15(S)-hidroperoxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-5-cis-13-trans-dienoico;

PGG_{3}, Prostaglandina G_{3}: ácido 15(S)-hidroperoxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-5,13,17-trienoico;

PGH_{1}, Prostaglandina H_{1}: ácido 15(S)-hidroxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-13-enoico;

PGH_{2}, Prostaglandina H_{2}: ácido 15(S)-hidroxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-5-cis-13-trans-dienoico;

PGH_{3}, Prostaglandina H_{3}: ácido 15(S)-hidroxi-9\alpha,11\alpha-peroxidoprosta-5,13,17-trienoico;

PGE_{2}, Prostaglandina E_{2}: ácido 11\alpha, 15(S)-dihidroxi-9-ceto-prosta-5-cis-13-trans-dienoico;

PGF_{2\alpha}, Prostaglandina F_{2\alpha}: ácido 9\alpha,11\alpha,15(S)-trihidroxiprosta-5-cis-13-trans-dienoico;

PGD_{2}, Prostaglandina D_{2}: ácido 9\alpha, 15(S)-dihidroxi-11-ceto-prosta-5-cis-13-trans-dienoico;

PGI_{2}, Prostaciclina: ácido 6,9\alpha-epoxi-11\alpha,15(S)-dihidroxi-prosta-5-cis-13-trans-dienoico;

TXA_{2}, Tromboxano A: ácido 9\alpha, 11\alpha, epoxi-15(S)-hidroxitromba-5-cis-13-trans-dienoico;

12-HHT: ácido 12(S)-Hidroxi-8,10-trans-5-cis-heptadecatrienoico;

PGH sintasa: Prostaglandina H sintasa;

RP-HPLC: cromatografía líquida de elevadas prestaciones en fase inversa;

LT: Leucotrieno;

LTA_{4}, Leucotrieno A_{4}: ácido 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9-trans-11,14-cis-eicosatetraenoico;

LTC_{4}, Leucotrieno C_{4}: ácido 5(S)-hidroxi-6(R)-S-glutationil-7,9-trans-11,14-cis-eicosa-tetraenoico;

FLAP: proteína activadora de la 5-lipoxigenasa;

MGST: glutatión-S-transferasa microsomal;

NSAID: fármacos antiinflamatorios no esteroideos.

La presente invención proporciona PGE sintasa pura. Un polipéptido preferido de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

Los polipéptidos aislados de la invención serán aquéllos que son como los definidos en ésta, en forma aislada, libre o sustancialmente libre de material con el cual están asociados de forma natural, tal como otros polipéptidos con los que se hallan en la célula. Los polipéptidos podrían, por supuesto, formularse con diluyentes o adyuvantes y aún, para propósitos prácticos, estar aislados; por ejemplo, los polipéptidos estarán normalmente mezclados con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microvaloración para su uso en inmunoensayo. Los polipéptidos podrían estar glicosilados, bien de forma natural o mediante sistemas de células eucariotas heterólogos, o podrían estar (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula procariota) no glicosilados. El término "careciendo de glicosilación nativa" podría usarse con referencia a un polipéptido que, o no tiene glicosilación (por ejemplo, a continuación de su producción en célula procariota) o tiene un patrón de glicosilación que no es el patrón nativo, por ejemplo, tal como el conferido por la expresión en un tipo particular de célula huésped (la cual podría ser las células CHO).

Los polipéptidos de la invención podrían modificarse, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia señal para promover su secreción desde una célula, o de residuos histidina para ayudar a su purificación. Podrían generarse proteínas de fusión que incorporan (por ejemplo) seis residuos histidina en uno cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal de la proteína recombinante. Tal marca de histidina podría usarse para la purificación de la proteína mediante el uso de columnas comercialmente disponibles, las cuales contienen un ion metálico, bien de níquel o cobalto (Clontech, Palo Alto, California, EE.UU.). Estas marcas sirven también para detectar la proteína usando anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente y dirigidos contra los seis residuos histidina (Clontech, Palo Alto, California, EE.UU.).

También se proporcionan en la presente invención polipéptido que son variantes, alelos, derivados o mutantes de la secuencia de aminoácidos, tales formas tienen al menos el 70% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos el 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con la SEC. Nº ID.: 2. Un polipéptido que es una variante, alelo, derivado o mutante también podría tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la dada en la SEC. Nº ID.: 2 por una o más de la adición, sustitución, supresión e inserción de uno o más (tales como de 1 a 20, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 a 10) aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2 está codificada por la secuencia de nucleótidos humana de la SEC. Nº ID.: 1. Los polipéptidos de la invención incluyen aquéllos codificados por alelos de la secuencia humana, y las homólogas de otros animales, particularmente de primates, así como los fragmentos de tales polipéptidos, tal como se discute adicionalmente más abajo. La secuencia primaria de la proteína PGE sintasa será sustancialmente similar a la de la SEC. Nº ID.: 2, y podría determinarse mediante técnicas rutinarias disponibles para los especialistas en el campo. En esencia, tales técnicas incluyen usar polinucleótidos derivados de la SEC. Nº ID.: 1 como sondas para recuperar y determinar la secuencia del gen de la PGE sintasa en otras especies. Hay disponibles una amplia variedad de técnicas para esto, por ejemplo, la amplificación y clonación del gen con la PCR usando una fuente de ARNm apropiada, o mediante procedimientos que incluyen la obtención de una biblioteca de ADNc a partir de un mamífero, por ejemplo, una biblioteca de ADNc procedente de una de las fuentes arriba mencionadas, sondear dicha biblioteca con un polinucleótido de la invención en condiciones rigurosas, y recuperar el ADNc que codifica la totalidad o parte de la proteína PGE sintasa de ese mamífero. Cuando se obtiene un ADNc concreto, podría determinarse la secuencia codificante en su longitud completa mediante técnicas de extensión con cebadores.

Una "porción activa" de los polipéptidos significa un péptido que es menos que dicho polipéptido de longitud completa, pero que retiene su actividad biológica esencial. En particular, la porción activa retiene la capacidad de catalizar la síntesis de la PGE a partir de la PGH en presencia de glutatión.

Por tanto, la porciones activas apropiadas incluyen el segmento central de la SEC. Nº ID.: 2, por ejemplo, aproximadamente entre los residuos 30-130. Se espera que la región catalítica relevante de la proteína PGE sintasa esté en el segmento central de la SEC. Nº ID.: 2 en base a su analogía con la MGST1 y LTC_{4} sintasa: los aminoácidos
1-41 pueden suprimirse de la MGST1 sin pérdida de la función (Andersson et al., Biochim. Biophys. Acta, 1204:298-304 (1994)); los segmentos C-terminales pueden intercambiarse entre la LTC_{4} sintasa y la FLAP sin alteración de la función de la proteína (Lam et al., J. Biol. Chem., 272:13923-13928 (1997)).

Una porción activa de la invención incluye o consisten en los aminoácidos 30-152 de la SEC. Nº ID.: 2. Otra porción activa incluye o consiste en los aminoácidos 1-130 de la SEC. Nº ID.: 2. Aún una porción activa adicional incluye o consiste en los aminoácidos 30-130 de la SEC. Nº ID.: 2.

La presente invención incluye un polipéptido que incluye una porción activa de una PGE sintasa proporcionada en ésta, el cual polipéptido podría incluir aminoácidos heterólogos, tales como una secuencia identificable o el dominio de otra proteína, o una marca histidina u otra secuencia marca, y la invención incluye un polipéptido consistente esencialmente en una porción activa de la PGE sintasa.

Un polipéptido acorde con la presente invención podría aislarse y/o purificarse (por ejemplo, usando un anticuerpo, por ejemplo, después de la producción mediante expresión a partir de un ácido nucleico que lo codifica. Los polipéptidos acordes con la presente invención podrían generarse también total o parcialmente mediante síntesis química, por ejemplo, de manera paso a paso. El polipéptido aislado y/o purificado podría usarse en la formulación de una composición, la cual podría incluir al menos un componente adicional, tal como el agua.

Un polipéptido acorde con la presente invención podría usarse en la búsqueda de moléculas que afectan o modulan su actividad o función. Tales moléculas podrían ser útiles en un contexto terapéutico (el cul podría ser profiláctico). Esto se discute en detalle más abajo.

Un polipéptido de la invención podría marcarse con una marca reveladora. La marca reveladora podría ser cualquier marca apropiada que permite la detección del polipéptido. Las marcas apropiadas incluyen los radioisótopos, por ejemplo, el ^{125}I, los enzimas, los anticuerpos, los polinucleótidos y unidores tales como la biotina.

Tal como se ha destacado, una forma preferida de producir un polipéptido de la invención es emplear ácido nucleico codificante en un sistema de expresión apropiado para producir el polipéptido de forma recombinante. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la PGE sintasa en la producción de PGE sintasa.

Los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen los ácidos nucleicos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido, el cual incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2, y un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad con la SEC. Nº ID.: 2. Preferiblemente, el grado de identidad de secuencia es, en cualquier caso, al menos del 80%, tal como al menos el 90%, 95%, 98% ó 99%.

Los ácidos nucleicos útiles en la invención incluyen además los ácidos nucleicos que incluyen una secuencia que tiene al menos el 70% de homología, más preferiblemente al menos el 80%, tal como al menos el 90%, 95%, 98% ó 99% de homología de secuencia con las secuencias de ácidos nucleicos de la SEC. Nº ID.: 1 o su complementaria.

El ácido nucleico de la invención podría codificar la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2, en cuyo caso podría incluir la SEC. Nº ID.: 1 o una secuencia de nucleótidos diferente, tal como permite la degeneración del código genético, o un polipéptido con actividad PGE sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEC. Nº ID.: 2.

Cuando un aspecto de la presente invención se expresa en términos de ácido nucleico con al menos un % especificado de homología con la SEC. Nº ID.: 1 o su complementaria, podría excluirse la secuencia real de la SEC.
Nº ID.: 1 o de su complementaria. En varias realizaciones, la presente invención proporciona un ácido nucleico que no ocurre de forma natural y que codifica un polipéptido con actividad PGE sintasa, tal como un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2 o una variante alélica de la misma, o un mutante del polipéptido que no ocurre de forma natural, o una variante o derivado del mismo.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican toda o parte de un gen de la PGE sintasa pueden ser preparadas fácilmente por la persona capacitada, usando la información y referencias contenidas en ésta, y las técnicas conocidas en el campo (por ejemplo, ver Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de tal ácido nucleico, por ejemplo, procedente de fuentes genómicas, (ii) la síntesis química o (iii) la preparación de secuencias de ADNc. Pueden hacerse modificaciones a las secuencias del tipo salvaje descritas en ésta, por ejemplo, usando la mutagénesis dirigida a un sitio, para conducir a la expresión de polipéptidos modificados o para tomar en consideración las preferencias de codones en las células huéspedes usadas para expresar el ácido
nucleico.

En general, las secuencias cortas a usar como cebadores se producirán mediante medios sintéticos, implicando la construcción paso a paso de la secuencia de ácido nucleico deseada, un nucleótido cada vez. Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automatizadas son fácilmente asequibles en el campo.

Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará construir un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15-50 nucleótidos) en base a la información de secuencia proporcionada en ésta para una región del ARNm o para una secuencia genómica que codifica el ARNm que se desea clonar, poniendo en contacto los cebadores con el ARNm o ADNc obtenido de células de mamífero (las cuales podrían ser, por ejemplo, cualquiera de entre la línea celular A549 humana, las células epiteliales, las líneas celulares derivadas de osteosarcoma, los osteoblastos, los leucocitos humanos, los fibroblastos, las células endoteliales, las células del sistema reproductor, las células mesangiales, y otras células renales), realizando la reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que proporcionan la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa), y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores podrían diseñarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados, de tal forma que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación apropiado.

Tales técnicas podrían usarse para obtener todas o parte de las secuencias descritas en ésta. Los clones genómicos que contienen el gen de la PGE sintasa y sus intrones y regiones promotoras podrían obtenerse también de manera análoga, empezando con ADN genómico procedente de un mamífero, por ejemplo, una célula humana, por ejemplo, una célula primaria tal como una célula de hígado, una célula de cultivo celular, o una biblioteca tal como una biblioteca de fago, cósmido, YAC (cromosoma artificial de levadura), BAC (cromosoma artificial de bacteria), o PAC (cromosoma artificial de fago P1/P2).

Los polinucleótidos que no son 100% homólogos con las secuencias de la presente invención, pero que se hallan dentro del ámbito de esta invención, pueden obtenerse de un cierto número de formas.

Otras variantes humanas (por ejemplo, las formas alélicas) del gen de la PGE sintasa descrito en ésta podrían obtenerse, por ejemplo, sondeando bibliotecas de ADNc o ADN genómico preparadas a partir de tejido humano.

Además, podrían obtenerse homólogos del gen de otros animales, y particularmente los mamíferos (por ejemplo, ratón, rata o conejo, oveja, cabra, vaca, caballo, cerdo, perro, gato o primates). Tales secuencias podrían obtenerse construyendo u obteniendo bibliotecas de ADNc preparadas a partir de células o tejidos, o bibliotecas de ADN genómico procedentes de otras especies animales, y sondeando dichas bibliotecas con sondas que incluyen la totalidad o parte de un ácido nucleico de la invención, en condiciones de rigurosidad media a alta (por ejemplo, para la hibridación sobre un soporte sólido (filtro), la incubación durante la noche a 42ºC en una solución que contiene el 50% formamida, 5 \times SSC (NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, seguida por lavado en cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M (es decir, 0,2\times SSC), a desde aproximadamente 50ºC hasta aproximadamente
60ºC).

Por tanto, la presente invención podría emplear un ácido nucleico aislado que se hibrida con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. Nº ID.: 1, en las condiciones de hibridación y lavado antes mencionadas. Un ácido nucleico tal es apropiado para su uso como una sonda para detectar el gen de la PGE sintasa, por ejemplo, en transferencias Southern o en extensiones en metafase.

Alternativamente, tales polinucleótidos podrían obtenerse mediante mutagénesis dirigida a un sitio de las secuencias SEC. Nº ID.: 1 o variantes alélicas de la misma. Esto podría ser útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios silenciosos de codones en secuencias para optimizar las preferencias de codones para una determinada célula huésped en la cual se expresan las secuencias de polinucleótidos. Otros cambios de la secuencia podrían desearse con objeto de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Podrían ser deseables cambios adicionales para representar cambios codificantes concretos, los cuales son requeridos para proporcionar, por ejemplo, sustituciones conservadoras.

En el contexto de la clonación, podría ser necesario para uno o más fragmentos de genes que estuvieran ligados para generar una secuencia codificante de longitud completa. También, cuando no se ha obtenido una molécula de ácido nucleico codificante de longitud completa, podría usarse una molécula más pequeña, que representa parte de la molécula completa, para obtener clones de longitud completa. Los insertos podrían prepararse a partir de clones de ADNc parciales, y usarse para examinar bibliotecas de ADNc. Los clones de longitud completa aislados podrían subclonarse en vectores de expresión y ensayarse según su actividad mediante transfección en células huéspedes apropiadas, por ejemplo, con un plásmido informador.

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector está operativamente unido a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por parte de la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos está en una relación que les permite funcionar de la manera que se pretende. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante está ligada de tal forma que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Pueden escogerse o construirse vectores apropiados que contienen las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo las secuencias promotoras, los fragmentos terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias potenciadoras, los genes marcadores, y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores podrían ser plásmidos, virus, por ejemplo, fagos, fagómidos o baculovirus, cósmidos, YAC, BAC o PAC según sea conveniente.

Los vectores podrían proporcionarse con un origen de replicación, opcionalmente con un promotor para la expresión de dicho polinucleótido, y opcionalmente con un regulador del promotor. Los vectores podrían contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de mamífero. Los vectores podrían usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o usarse para transfectar o trasformar una célula huésped. El vector podría adaptarse también para ser usado in vivo, por ejemplo, en procedimientos de terapia génica. Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huéspedes son bien conocidos. Las células huésped apropiadas incluyen las bacterias, las células eucariotas tales como las de mamífero y las levaduras, y los sistemas de baculovirus. Ls líneas de células de mamíferos en el campo para la expresión de polipéptidos heterólogos incluyen las células ováricas de hámster chino, las células HeLa, las células renales de cría de hámster, las células COS, y muchas otras.

Para más detalles consultar, por ejemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, en la mutagénesis, en la secuenciación, en la introducción de ADN dentro de células, y en la expresión de genes, y en el análisis de proteínas, se describen en detalle en "Current Protocols in Molecular Biology", editores Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.

Los vectores podrían transformarse en una célula huésped apropiada, tal como se ha descrito más arriba, para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un proceso para preparar polipéptidos acordes con la invención, el cual incluye cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión tal como se ha descrito más arriba, en condiciones apropiadas para proporcionar la expresión por parte del vector de una secuencia codificante que codifica los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados. Los polipéptidos podrían expresarse también en sistemas in vitro, tal como el lisado de reticulocito.

A continuación de la producción de un polipéptido de la invención, podría ensayarse la actividad PGE sintasa de éste, por ejemplo, mediante la determinación de la producción de PGE a partir de la incubación del polipéptido con PGH_{2} y glutatión reducido. La PGE puede detectarse usando cromatografía líquida de alta presión con fase invertida (RP-HPLC), la cual permite la cuantificación de la cantidad presente.

La PGE sintasa aislada/pura podría usarse en una variedad de contextos.

Debido a la importancia de la PGE en la inflamación y en otros contextos de importancia médica, aspectos importantes de la invención están relacionados con la identificación de sustancias que son capaces de afectar la producción de PGE, en particular, modulando la actividad de la PGE sintasa. La inhibición de la actividad de la PGE sintasa es del máximo interés para reducir los niveles de producción de PGE.

Es bien conocido que la PGE causa dolor tanto in vivo como in vitro (Bley et al., Trends in Pharmacological Sciences, 19:141-147 (1998)). También se ha demostrado que el receptor de la prostaglandina E (EP_{3}) es crucial para la respuesta funcional de la fiebre (Ushikubi et al., Nature, 395:281-284 (1998)). También el papel de las prostaglandinas en la inflamación y en las enfermedades inflamatorias, tales como la artritis, ha sido bien documentado a través del uso de varios inhibidores de la ciclooxigenasa (fármacos antiinflamatorios no esteroideos, NSAID, incluyendo la aspirina (Vane & Botting, American J. of Med., 104(3A):2S-8S (1998)). En relación a esto, se ha reconocido que la PGE es la prostaglandina proinflamatoria más potente (Moncada et al., Nature, 246:217-219 (1973)), lo que es la razón por la cual la supresión específica de este compuesto, mediante inhibición de la PGE sintasa, podría usarse para proporcionar control de la reacción inflamatoria con menos efectos secundarios en comparación con los NSAI usados actualmente.

Varios informes han demostrado los significativos efectos antitumorales de los NSAID en el cáncer colorectal (Giovannucci et al., Annals of Internal Medicine, 121:241-246 (1994); Giardiello et al., European Journal of Cancer, 31A:1071 (1995); Williams et al., Journal of Clinical Investigation, 100:1325-1329 (1997)). La PGE promueve la proliferación de las células cancerosas (Qiao et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1258:215-23 (1995)) así como inhibe la muerte celular programada (Ottonello et al., Experimental Hematology, 26:895-902 (1998); Goetzl et al., Journal of Immunology, 154:1041-1047 (1995)), resultando en conjunto en el apoyo del crecimiento de células cancerosas (Sheng et al., Cancer Research, 58:362-366 (1998)). Por tanto, la inhibición de la formación de la PGE conduce a una proliferación más lenta en combinación con una apoptosis incrementada de la población de células cancerosas. Este efecto inhibidor de los NSAI se ha observado también en otras condiciones cancerosas tales como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (Hida et al., Anticancer Research, 18:775-782 (1998)).

Las prostaglandinas se han relacionado también en la enfermedad de Alzheimer. Diversos ensayos clínicos han demostrado que los usuarios de NSAID experimentan tan poco como la mitad del riesgo de adquirir la enfermedad de Alzheimer (Dubois et al., Faseb J., 12:1063-1073 (1998)). De forma consiste con esto, otras observaciones sugieren que los procesos inflamatorios podrían contribuir a esta enfermedad (Aisen, Gerontology, 43:143-149
(1997)).

En varios aspectos adicionales, la presente invención se refiere a procedimientos y medios de examen y ensayo, y a sustancias identificadas por los mismos, especialmente a inhibidores de la PGE sintasa.

Por tanto, los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan el uso de un polipéptido o péptido (particularmente un fragmento de un polipéptido de la invención tal como se descubre, y/o al acido nucleico que los codifica), en el examen o búsqueda para y/o en la obtención/identificación de una sustancia, por ejemplo, un péptido o compuesto químico, la cual interacciona y/o se une con el polipéptido de la invención y/o interfiere con su función o actividad o con la de otra sustancia, por ejemplo, un polipéptido o péptido, la cual interacciona y/o se une con el polipéptido o péptido de la invención. Por ejemplo, un procedimiento acorde con un aspecto de la invención incluye proporcionar un polipéptido o péptido de la invención y ponerlo en contacto con una sustancia, contacto que podría resultar en la unión entre el polipéptido o péptido y la sustancia. La unión podría determinarse mediante cualquiera de un cierto número de técnicas disponibles en el campo, tanto cualitativas como
cuantitativas.

En varios aspectos, la presente invención concierne a la provisión de ensayos para sustancias que interaccionan con o unen un polipéptido de la invención, y/o modulan una o más de sus actividades.

Un aspecto de la presente invención proporciona un ensayo que incluye:

(a)

poner en contacto un polipéptido o péptido acorde con la invención y una molécula unidora putativa u otra sustancia de ensayo; y

(b)

determinar la interacción o unión entre el polipéptido o péptido y la sustancia de ensayo.

Una sustancia que interacciona con el polipéptido o péptido de la invención podría aislarse y/o purificarse, fabricarse y/o usarse para modular su actividad tal como se ha discutido.

No es necesario usar las proteínas completas para ensayos de la invención que ensayan la unión entre dos moléculas como más arriba, o que ensayan la actividad PGE sintasa (ver más abajo). Podrían generarse fragmentos y usarse de cualquier forma apropiada conocida por los especialistas en la técnica. Las formas apropiadas para generar fragmentos incluyen, pero no se limitan a, la expresión recombinante de un fragmento a partir de ADN que lo codifica. Tales fragmentos podrían generarse tomando ADN codificante, identificando sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados en cualquier lado de la porción a expresar, y cortando dicha porción del ADN. La porción podría entonces unirse operativamente a un promotor apropiado en un sistema de expresión estándar disponible comercialmente. Otra estrategia recombinante es amplificar la porción relevante del ADN con cebadores de la PCR apropiados. Los fragmentos pequeños (por ejemplo, hasta aproximadamente 20 ó 30 aminoácidos) podrían generarse también usando procedimientos de síntesis de péptidos que son bien conocidos en la técnica.

El formato preciso del ensayo de la invención podría ser variado por aquéllos con formación en la técnica usando formación y conocimientos ordinarios. Por ejemplo, la interacción entre los polipéptidos podría estudiarse in vitro marcando uno con una marca detectable, y poniéndolo en contacto con el otro que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido. Las marcas apropiadas incluyen la ^{35}S-metionina, la cual podría incorporarse en péptidos y polipéptidos producidos recombinantemente. Los péptidos y polipéptidos producidos recombinantemente podrían expresarse también como una proteína de fusión que contiene un epitomo, el cual puede marcarse con un anticuerpo.

La proteína que se inmoviliza sobre un soporte sólido podría inmovilizarse usando un anticuerpo contra esa proteína unido a un soporte sólido, o a través de otras tecnologías que son conocidas per se. Una interacción in vitro preferida podría utilizar una proteína de fusión que incluye la glutatión-S-transferasa (GST). Esta podría inmovilizarse sobre cuentas de glutatión-agarosa. En un formato de ensayo in vitro del tipo descrito más arriba, puede ensayarse un compuesto de ensayo determinando su capacidad para disminuir la cantidad de péptido o polipéptido marcado que se une a la GST-polipéptido de fusión inmovilizada. Esta podría determinarse fraccionando las cuentas de glutatión-agarosa mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Alternativamente, las cuentas podrían lavarse para retirar la proteína no unida, y la cantidad de proteína que se ha unido puede determinarse contando la cantidad de marca presente en, por ejemplo, un contador de centelleo apropiado.

La determinación de la capacidad de un compuesto de ensayo para interaccionar y/o unirse con un polipéptido o fragmento de la PGE sintasa podría usarse para identificar ese compuesto de ensayo como un candidato a modulador de la actividad de la PGE sintasa. Generalmente, la identificación de la capacidad de un compuesto de ensayo para unir un polipéptido o fragmento de la invención va seguida por uno o más pasos de ensayo adicionales que implican la determinación de si el compuesto es capaz o no de modular la actividad de la PGE sintasa. Naturalmente, los ensayos que implican la determinación de la capacidad de una sustancia de ensayo para modular la actividad de la PGE sintasa podrían realizarse cuando no hay conocimiento de si la sustancia de ensayo puede unir o interaccionar con la PGE sintasa, pero podría usarse un ensayo de unión/interacción previo como examen "en grueso" para ensayar un número elevado de sustancias, reduciendo el número de candidatos a un nivel más manejable para un ensayo funcional, implicando la determinación de la capacidad para modular la actividad de la PGE sintasa. Una posibilidad adicional para un examen en grueso es ensayar la capacidad de una sustancia para afectar la producción de PGE mediante una línea celular apropiada que exprese la PGE sintasa (bien natural o recombinantemente). Un ensayo acorde con la presente invención podría también adoptar la forma de un ensayo in vivo. El ensayo in vivo podría realizarse en una línea celular tal como una cepa de levadura en la que se expresan los polipéptidos o péptidos relevantes a partir de uno o más vectores introducidos dentro de la célula. Aún una posibilidad adicional para un examen en grueso es ensayar la capacidad de una sustancia para afectar la producción de PGE por parte de una preparación de proteína impura que incluye la PGE sintasa (sea humana o de otro mamífero). Sin embargo, en último lugar, un ensayo preferido de la invención incluye determinar la capacidad de un compuesto de ensayo para modular la actividad PGE sintasa de un polipéptido aislado/purificado de la invención (incluyendo una PGE sintasa de longitud completa o una porción activa de la misma).

Un procedimiento de examen de una sustancia que modula la actividad de un polipéptido podría incluir poner en contacto una o más sustancias de ensayo con el polipéptido en un medio de reacción apropiado, ensayar la actividad del polipéptido tratado, y comparar la actividad con la actividad del polipéptido en un medio de reacción comparable sin tratar con la sustancia o sustancias de ensayo. Una diferencia en la actividad entre los polipéptidos tratados y sin tratar es indicativa de un efecto modulador de la sustancia o sustancias de ensayo rele-
vantes.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento de ensayo que incluye:

(a)

incubar un polipéptido aislado que tiene actividad PGE sintasa y un compuesto de ensayo en presencia de glutatión reducido y PGH_{2}, en condiciones en las que normalmente es produce la PGE; y

(b)

determinar la producción de PGE.

El sustrato PGH_{2} para la PGE sintasa podría proporcionarse mediante la incubación de la ciclooxigenasa y el ácido araquidónico, por tanto, estos podrían proporcionarse en el medio de ensayo con objeto de proporcionar el PGH_{2}.

Más aún, la PGE sintasa cataliza la formación esteroespecífica de 9-ceto, 11\alpha hidroxi prostaglandina a partir del endoperóxido cíclico, y por tanto, podrían usarse otros sustratos de la PGE sintasa en la determinación de la actividad de la PGE sintasa, y el efecto sobre esa actividad de un compuesto de ensayo, mediante la determinación de la producción del producto apropiado.

Substrato	Producto
PGH_{2}	PGE_{2}
PGH_{1}	PGE_{1}
PGH_{3}	PGE_{3}
PGG_{2}	15(S)hidroperoxi PGE_{2}
PGG_{1}	15(S)hidroperoxi PGE_{1}
PGG_{3}	15(S)hidroperoxi PGE_{3}

Por tanto, un aspecto más general de la invención proporciona un procedimiento de ensayo que incluye:

(a)

incubar un polipéptido aislado, el cual tiene actividad PGE sintasa, y un compuesto de ensayo en presencia de un sustrato endoperóxido cíclico de la PGE sintasa, en condiciones en las que la PGE sintasa cataliza normalmente la conversión del sustrato endoperóxido cíclico en un producto que es la forma 9-ceto, 11\alpha hidroxi del sustrato; y

(b)

determinar la producción de dicho producto.

Tal como se ha destacado, el sustrato podría ser cualquiera de los discutidos más arriba, o cualquier otro sustrato apropiado a disposición de la persona capacitada. Podría ser el PGH_{2}, siendo entonces la PGE el producto.

Un inhibidor de la PGE sintasa podría identificarse (o podría confirmarse como tal una sustancia candidata sospechosa de ser un inhibidor de la PGE sintasa) mediante la determinación de la producción reducida de PGE u otro producto (dependiendo del sustrato usado) en comparación con un experimento control en el que no se aplica el compuesto de ensayo.

La determinación del producto podría emplear HPLC, espectrometría de UV, detección de la radiactividad, o RIA (tal como un equipo de RIA disponible comercialmente para la detección de la PGE). La formación del producto podría analizarse mediante cromatografía en gas (GC) o espectrometría de masas (MS), o TLC con barrido de la radiactividad.

La tecnología de bibliotecas combinatorias (Schultz, J.S., Biotechnol. Prog., 12:729-74 (1996)3) proporciona una forma eficiente de ensayar un número potencialmente vasto de diferentes sustratos en función de su capacidad para modular la actividad de un polipéptido.

La cantidad de sustancias o compuestos de ensayo que podrían añadirse a un ensayo de la invención se determinará normalmente mediante prueba y error dependiendo del tipo de compuesto usado. Típicamente, podrían usarse concentraciones de un compuesto de ensayo (por ejemplo, un inhibidor putativo) desde aproximadamente 0,1 nM hasta
10 \muM. Podrían usarse concentraciones mayores cuando la sustancia de ensayo es un péptido.

Los compuestos que podrían usarse podrían ser compuestos naturales o químicos sintéticos, usado en los programas de examen de fármacos. Los extractos de plantas que contienen varios componentes caracterizados y sin caracterizar también podrían usarse.

Otros compuestos inhibidores candidatos podrían basarse en modelar la estructura tridimensional de un polipéptido o fragmento de péptido usando el diseño racional de fármacos para proporcionar compuestos inhibidores potenciales con unas determinadas características de forma, tamaño y carga.

A continuación de la identificación de una sustancia que modula o afecta la actividad del polipéptido, la sustancia podría investigarse adicionalmente. Más aún, podría fabricarse y/o usarse en la preparación, es decir, fabricación o formulación, de una composición tal como un medicamento, composición farmacéutica, o fármaco. Estos podrían administrarse a individuos.

Por tanto, la presente invención se extiende en varios aspectos, no sólo a una sustancia identificada como un modulador de la actividad del polipéptido, de acuerdo con lo que se descubre en esta, y a una sustancia obtenida mediante un procedimiento de la invención, sino también a una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición que comprenda tal sustancia, un procedimiento que comprende la administración de dicha composición a un paciente, por ejemplo, para el tratamiento (el cual podría incluir el tratamiento preventivo) de la inflamación o de una anormalidad en el crecimiento celular, u otra enfermedad o condición según se ha discutido, el uso de un sustrato tal en la fabricación de una composición para su administración, por ejemplo, para el tratamiento de la inflamación o un anormalidad celular u otra enfermedad o condición según se ha discutido, y un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar una sustancia tal con un excipiente aceptable, vehículo o portador, y opcionalmente otros ingredientes.

Una sustancia que se ha identificado usándola como un modulador de la actividad de la PGE sintasa, podría tener naturaleza peptídica o no peptídica. A menudo se prefieren las "moléculas pequeñas" no peptídicas para muchos usos farmacéuticos in vivo. En consecuencia. un mimético o un imitador de la sustancia (particularmente si es un péptido) podría diseñarse para un uso farmacéutico. El diseño de miméticos de un compuesto farmacéutico activo conocido es una estrategia conocida al desarrollo de fármacos basados en un compuesto "líder". Esto podría ser deseable cuando el compuesto activo es difícil o caro de sintetizar, o cuando no es apropiado como agente activo para composiciones orales, ya que tienden a degradarse rápidamente por las proteasas en el canal alimentario. El diseño, la síntesis y el ensayo de miméticos podría usares para evitar el examen aleatorio de un gran número de moléculas sobre en busca de una propiedad diana.

Hay varios pasos que se toman comúnmente en el diseño de un mimético a partir de un compuesto que tiene una determinada propiedad diana. En primer lugar, se determinan las partes concretas del compuesto que son críticas y/o importante para determinar la propiedad diana. En el caso de un péptido, esto puede hacerse variando sistemáticamente los residuos aminoácidos en el péptido, por ejemplo, sustituyendo cada residuo por turnos. Estas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto son conocidos como su "farmacóforo".

Una vez se ha hallado el farmacóforo, se modela su estructura de acuerdo con sus propiedades físicas, por ejemplo, estereoquímica, enlaces, tamaño y/o carga, usando datos procedentes de una rango de fuentes, por ejemplo, las técnicas espectroscópicas, los datos de difracción de rayos-X, y la RMN. En este proceso de modelado pueden usarse el análisis computacional, el mapeado de similitudes (que modela la carga y/o volumen de un farmacóforo en vez de los enlaces entre átomos), y otras técnicas.

En una variante de esta estrategia, se modelan la estructura tridimensional del ligando y de su pareja de unión. Esto puede se específicamente útil cuando el ligando y/o pareja de unión cambian de conformación a partir de su unión, permitiendo que el modelo tome esto en consideración en el diseño del mimético.

A continuación se selecciona una molécula plantilla sobre la que pueden injertarse los grupos químicos que imitan el farmacóforo. La molécula plantilla y los grupos químicos injertados sobre ella pueden seleccionarse convenientemente de forma que el mimético sea fácil de sintetizar, es probable que sea farmacológicamente aceptable, y no se degrade in vivo, mientras que retiene la actividad biológica del compuesto líder. El mimético o miméticos hallados mediante esta estrategia pueden examinarse para ver si tienen la propiedad diana, o hasta que alcance la exhiben. A continuación pueden llevarse a cabo la optimización o modificación adicional para llegar a uno o más miméticos finales para el ensayo clínico o in vivo.

Los miméticos de sustancia identificadas como poseedoras de la capacidad de modular la actividad del polipéptido usando un procedimiento de ensayo tal como el descubierto en ésta, se hallan dentro del ámbito de la presente invención. Un polipéptido, péptido, o sustancia capaz de modular la actividad de un polipéptido acorde con la presente invención podrían proporcionarse en un equipo, por ejemplo, sellado en un contenedor apropiado que protege su contenido del entorno externo. Un equipo tal podría incluir instrucciones para su uso.

Los aspectos y las realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes a los especialistas en la técnica. Los experimentos siguientes proporcionan apoyo y ejemplos por medio de la ilustración de aspectos y realizaciones de la invención.

Todos los documentos mencionados en esta especificación se incorporan por referencia.

Experimental

Tal como se ha destacado más arriba, antes del trabajo de los inventores descubierto en ésta, no había sugerencia alguna de que la secuencia de ADNc en la base de datos GenBank etiquetada como MGST1-L1 (GenBank, número de acceso AF027740) así como una PIG12 inducida por la p53 (GenBank, número de acceso AF010316) codifica la PGE sintasa humana. Polyak et al. (ver más arriba) destacaron simplemente que el cADN de la PIG12 parecía codificar otra, aunque se podría decir aún otra, glutatión-S-transferasa microsomal.

Los inventores expresaron la proteína identificada por ellos como PGE sintasa (SEC. Nº ID.: 2) en un sistema de expresión bacteriano, empleando la secuencia codificante de la SEC. Nº ID.: 1. A continuación de la expresión heteróloga en E. coli, se prepararon ambas fracciones, la citosólica y la de membrana. Se generó un antisuero de conejo contra un péptido interno de la PGE sintasa, y el análisis de transferencia Western detectó específicamente una proteína de 15 kDa en la fracción de membrana de las bacterias que expresaban la PGE sintasa.

Las fracciones de membrana y citosólica bacterianas se incubaron con PGH_{2} en presencia o ausencia de glutatión reducido. Los productos (PGF_{2\alpha}, PGE_{2}, PGD_{2} y 12-HHT) se analizaron mediante RP-HPLC usando la absorción UV a 195 nm, así como la detección en línea de radiactividad. Se halló que la fracción de membrana, pero no la citosólica, poseía una elevada actividad PGE sintasa dependiente de glutatión (0,25 \mumol/min/mg).

Se usaron células A594 como un modelo para estudiar la inducción de la ciclooxigenasa-2 por la interleucina-1\beta. Cuando las células A594 se cultivaron en presencia de interleucina-1\beta (1 ng/ml) durante 24 horas, se observó una inducción significativa de la proteína PGE sintasa usando el análisis por transferencia Western. También, el antisuero reconoció específicamente una proteína de 16 kDa en actividad PGE sintasa parcialmente purificada y disponible comercialmente, aislada a partir de vesículas seminales de carnero.

Material y procedimientos

Se generó antisuero de conejo anti-PGE sintasa humana contra el siguiente péptido sintético: CRSDPDVERSLRAHRN (SEC Nº ID.: 3) conjugado con hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura (Innovagen, Lund, Suecia). Este antígeno peptídico corresponde a los aminoácidos 59-74 de la PGE sintasa (nota: se remplazó Cys 68 con Ser, en caso de que la inclusión de la Cys interfiriese con la síntesis del péptido).

Se compró anticuerpo de burro anti-conejo unido a peroxidasa de rábano silvestre a Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra. También se obtuvo película (Hyperfilm ECL) de la misma fuente. Los oligonucleótidos procedían del Kebo Laboratory, Suecia. La polimerasa de ADN Pfu procedía de Stratagene, California, EE.UU. El PGH_{2} y 3H-PGH_{2} se compraron a Cayman Chemical, EE.UU. La PGF_{2\alpha}, PGE_{2}, PGD_{2} y 12-HHT se obtuvieron de Biomol, Pa., EE.UU. El glutatión y la interleucina-1\beta procedían de Sigma-Aldrich, Inc. Los solventes de HPLC eran de Rathburn Chemicals, Escocia. La PGE sintasa parcialmente purificada, aislada a partir de vesículas seminales de carnero, se obtuvo de Oxford Biomedical Research, Inc., MI, EE.UU. La línea celular A549 procedía de Boehringer Ingelheim Biowhittaker, Bélgica. El medio de cultivo celular y los antibióticos eran de Gibco BRL, Life Technology, Suecia. La mezcla de inhibidores de proteasa, Complete™, se obtuvo de Boehringer Mannheim Scandinavia, Suecia.

Aislamiento y clonación de la PGE sintasa

El clon de EST 143735, con número de acceso en GenBank R76492, se había identificado previamente como "glutatión-S-transferasa 1, como 1" (MGST1-L1) codificada por el número de acceso en GenBank AF027740. El mismo producto del gen se había caracterizado cmo "PIG121 inducida por p53" codificada por el número de acceso en GenBank AF010316.

La secuencia codificante de la PGE sintasa correspondiente a la secuencia de nucleótidos 19 a 477 del clon de EST 143735 (número de acceso AF027740) se amplificó mediante la PCR. Se construyeron cebadores de oligonucleótidos para incorporar los sitios de restricción apropiados (Nde I-Hind III) en los extremos 5' y 3' del producto.

Cebador 1 (con sentido):

5'-GAGAGACATATGCCTGCCCACAGCCTG-3'

(el subrayado es el sitio Nde I);

Cebador 2 (antisentido):

5'-GAGAGAAAGCTTCACAGGTGGCGGGCCGC-3'

(el subrayado es el sitio Hind III).

En ambos cebadores GAGAGA son tan sólo nucleótidos flanqueadores adicionales.

La PCR se realizó con 0,2 mM de dNTP, 0,5 \muM de los respectivos cebadores, 70 ng de plantilla, 2,5 U de polimerasa Pfu en 1\times tampón de Pfu (proporcionado por el fabricante). Los ciclos de temperatura fueron: 45 s a 94ºC, 45 s a 60ºC y 45 s a 72ºC, repetidos 25 veces. Sin embargo, el primer período de desnaturalización fue de 4 minutos, y el último período de extensión fue de 10 minutos. El producto de la PCR se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificó del gel, y se cortó con Nde I e Hind III.

El producto resultante se purificó en gel y se ligó en el vector de expresión bacteriano pSP19T7LT (Weinander, R., et al., Biochemical Journal, 311:861-866 (1995)). Los plásmidos ligados se transformaron en células competentes DH5a™. Los plásmidos se aislaron a partir de un cierto número de clones y se cortaron con NdeI e Hind III, seguido por electroforesis en gel de agarosa para confirmar el tamaño de los insertos. Los insertos seleccionados se secuenciaron en un secuenciador de ADN automatizado 373A de Applied Biosystems, usando un equipo de secuenciación cíclico con terminador de colorante.

La construcción de expresión, que contenía la secuencia codificante correcta para la PGE sintasa, se transformó en E. coli BL21 (DE3) (que albergaba el plásmido pLys SL (Studier, F.W., Journal of Molecular Biology, 219:37-44 (1991)). Las reservas en glicerol se prepararon y almacenaron a -70ºC para su subsiguiente uso como material de partida para los experimentos de expresión.

Expresión en E. coli

Se cultivaron alícuotas pequeñas (1-2 \mul) de reserva de bacterias en glicerol en 2\times YT durante la noche, a 37ºC. Los cultivos se diluyeron 1:100 en 2 litros de medio Terrific Broth que contenía ampicilina (75 \mug/ml) y cloranfenicol (10 \mug/ml) en un frasco de 5 litros colocado en un baño de agua termostatizado. El cultivo se oxigenó burbujeando aire y se dejó crecer hasta que la OD_{600} era 0,4-1,2. En este punto, se indujo la expresión mediante la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido 1 mM, se cambió la temperatura a 30ºC y se dejó crecer el cultivo durante otras 4 horas.

A continuación, se apelotonaron las células y se resuspendieron en 100 ml de tampón TSEG (Tris-HCl 15 mM, pH 8,0, sacarosa 0,25 M, EDTA 0,1 mM, glutatión 1 mM). Se añadió lisozima hasta una concentración final de
0,2 mg/ml, y se agitó la mezcla suavemente durante 30 minutos a 4ºC. A continuación se lisaron las células mediante seis pulsos de sonicación de 30 segundos de un sonicador MSE Soniprep 150 al 40-60% de la potencia máxima. Los restos celulares de retiraron mediante centrifugación a 5000 \timesg durante 10 minutos. Entonces se centrifugó el sobrenadante a 250.000 \timesg durante 1 hora y los precipitados de membrana se resuspendieron finalmente en fosfato potásico 10 mM, pH 7,0, 20% de glicerol, EDTA 0,1 mM, glutatión 1 mM. La concentración total de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína con Coomassie de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad).

SDS-PAGE y transferencia Western

Las muestras se diluyeron e hirvieron durante dos minutos en tampón de muestras que contenía SDS (Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970)). Las proteínas se separaron a través de geles de poliacrilamida al 14% (Novex) y se electrotransfirieron (Towbin, H., et al., PNAS USA, 76:4350-4354 (1979)) sobre membranas de PVDF (Pall). La eficiencia de la transferencia se visualizó usando estándares teñidos previamente (Novex). A continuación se empaparon las membranas durante 1 hora a 25ºC en solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 100 mM, pH = 7,5, NaCl 150 mM) que contenía un 0,1% (v/v) de Tween y un 5% (w/v) de leche en polvo descremada. A continuación de lavó la membrana dos veces en 0,1% T-TBS, seguido por una incubación de 1 hora a 25ºC con el antisuero indicado (dilución 1:2000) en 0,05% (v/v) T-TBS y 2% (w/v) de leche en polvo descremada. A continuación de varios pasos de lavado (2 \times 1 minuto, 1 \times 15 minuto, y 3 \times 5 minutos), se incubó la transferencia durante 1 hora a 25ºC con un anticuerpo de burro anti-conejo unido a peroxidasa de rábano silvestre (dilución 1:2000) en 0,05% (v/v) T-TBS y 2% (p/v) de leche en polvo descremada. Los pasos de lavado se repitieron, y de forma subsiguiente se realizó la detección de quimioluminiscencia potenciada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ECL plus, Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra).

Cultivo celular

Las células A549 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino desactivado por el calor (10%), fungizona (2,5 \mug/ml), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Se sembraron las células a una concentración de 0,15 \times 10^{6}/ml en frascos de 75 cm^{2}. Transcurridos tres días, se alcanzó la confluencia y se lavaron las células con PBS dos veces, a continuación se desprendieron usando 1,5 ml de solución 1\times Trypsin/EDTA (GibcoBRL) durante 15 minutos a 37ºC, en una atmósfera del 5% de CO_{2}. A continuación se añadieron 3 ml de medio para detener la tripsina y se diluyeron las células aún más y se sembraron de nuevo en el número/cm^{2} apropiado tal como se acaba de describir. Con objeto de investigar el efecto de la IL-1\beta sobre la expresión de la PGE sintasa en las células A549, se sembraron 1 \times 10^{6} células en 5 ml de medio en frascos de 25 cm^{2}, y se incubaron durante 24 horas. A continuación, se lavaron las células en PBS tres veces, seguido por la adición de 5 ml de medio RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino (2%), \beta (1 ng/ml), y se incubaron durante otras 24 h. Para la recolección se lavaron las células en PBS dos veces, se tripsinizaron en 0,5 ml de solución 1\times Trypsin/EDTA durante 15 minutos a 37ºC, se añadió 1 ml de medio de cultivo, y se centrifugaron las células a 500 \timesg durante 10 minutos, seguida por dos lavados en 1 ml de PBS. Las células se resuspendieron en 50 \mul de tampón de homogeneización, consistente en tampón fosfato potásico (0,1 M, pH = 7,4) y 1\times cóctel inhibidor de proteasas Complete™. Las muestras se sonicaron 2 \times 10 segundos, a continuación se añadieron 50 \mul de 2\times tampón Laemmli hirviendo, y se hirvió la muestra durante 2 minutos adicionales.

Ensayo del enzima PGE sintasa

La muestra de proteína de diluyó en tampón fosfato potásico inorgánico (0,1 M, pH = 7,4) que contenía glutatión reducido 2,5 mM. La reacción (volumen total = 100 \mul) se inició mediante la adición de PGH_{2} 10 \muM con o sin
0,1 \muCi 3H PGH_{2}, y se terminó con 60 \mul de acetonitrilo/HCl, disminuyendo el pH a 3,2. Con objeto de determinar la formación de cualquiera de PGF_{2\alpha}, PGE_{2} o PGD_{2}, se analizó una alícuota (60 \mul) mediante HPLC en fase inversa combinada con detección en el UV (195 nm) y/o detección de la radiactividad usando un detector \beta-RAM en línea (Inus System, Inc.). La columna de RP-HPLC era una Nova-Pak C18 (3,9 \times 150 mm, 4 \mum de tamaño de partícula) obtenida de Waters. La fase móvil era agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético (70:30:0,007, por volumen) con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.

Para el análisis del 12-HHT se usó una fase móvil de metanol, agua y ácido acético (70:30:0,01, en volumen) y la detección en el UV a 236 nm. Las cantidades de PGE_{2} y 12-HHT producidas se cuantificaron respectivamente mediante integración a 195 y 236 nm de las áreas bajo los picos eluidos.

Resultados Identificación de la PGE sintasa

La secuencia de aminoácidos de la PGE sintasa (SEC. Nº ID.: 2) tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 38% con la MGST1. Además, la MGST1 y la PGE sintasa presentan perfiles de hidropatía similares y pI ele-
vados (>10).

Expresión de la PGE sintasa

La PGE sintasa se expresó usando un sistema de expresión bacteriano. Con objeto de demostrar la expresión de la proteína, se generó un antisuero peptídico contra la PGE sintasa (segmento de aminoácidos 59-74).

Ambas, las fracciones de membrana y citosólicas de bacterias que expresaban la PGE sintasa se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western. Como control se incluyó la fracción de membrana de bacterias que expresaban la ratMGST1. En todos los carriles se analizaron 5 \mug de proteínas totales. Los resultados se obtuvieron usando antisuero anti-péptido contra la PGE sintasa, el suero preinmune correspondiente, y el antisuero anti-péptido diluido en presencia de antígeno peptídico 10^{-6} M. El tiempo de exposición fue de 2 minutos.

El antisuero reconoció una banda de 15 kDa en la fracción de membrana procedente de bacterias que expresaban la PGE sintasa. Esta banda no se halló en la fracción citosólica correspondiente. Más aún, el antisuero no reconoció la ratMGST1 expresada usando el mismo sistema de expresión.

La detección de la PGE sintasa era específica, puesto que el antisuero diluido, en presencia de antígeno (péptido) 1 \times 10^{-6} M perdió la capacidad de detectar la PGE sintasa.

Actividad de la prostaglandina E sintasa

La fracción de membrana (0,02 mg proteína total/ml) aislada de bacterias que expresaban la PGE sintasa se incubó durante 2 minutos en presencia de PGH_{2} (10 \muM, incluyendo 1 \muCi ^{3}H-PGH_{2}) y glutatión reducido (2,5 mM).

Los cromatogramas de HPLC en fase inversa se representaron para los productos formados después de las incubaciones con PGH_{2} (representando cuentas por minutos (CPM) frente al tiempo en minutos).

La Figura 1A muestra los resultados obtenidos con fracción de membrana-PGE sintasa mezclada con la solución de detención.

La Figura 1B muestra los resultados obtenidos con tampón.

La Figura 1C muestra los resultados obtenidos con fracción de membrana-PGE sintasa. El material en los experimentos para los que se muestran los resultados en las Figura 1B y Figura 1C se incubaron durante 2 minutos antes de la adición de la solución de detención. Los productos se detectaron usando detección de la radiactividad. Los primeros 20 minutos representan la elución isocrática usando agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético (70:30:0,007, en volumen) como fase móvil, con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. A continuación se aplicó un gradiente lineal desde el 100% de fase móvil hasta el 100% de metanol a lo largo de un período de 10 minutos, el cual se mantuvo durante el resto del análisis.

La Figura 1C muestra el perfil de RP-HPLC de los productos marcados radiactivos formados en estas condiciones. Se produce un pico principal que eluye a los 12,3 minutos, correspondiente al tiempo de elución de la PGE_{2} sintética. Se recolectó el material de este pico, se derivatizó, y se analizó mediante GC/MS, confirmándose su identidad como PGE_{2}. También se produjo un pico menor que eluyó a los 31,5 minutos, correspondientes al tiempo de retención del 12-HHT.

La formación no enzimática de estos productos se muestra en la Figura 1B. En este cromatograma, el pico correspondiente a la PGE_{2} es responsable de menos del 25% del formado en presencia de membranas procedentes de bacterias que expresan la PGE sintasa. En cambio, el producto principal formado corresponde al 12-HHT que eluye el minuto 31,5, así como a otro pico menor con un tiempo de retención de 14,9 minutos, que corresponde al tiempo de retención de la PGD_{2}. El cromatograma en la Figura 1A muestra la incubación a tiempo cero cuando se añade sustrato al tampón que contiene la fracción de membrana con solución de detención previamente mezclada. Se detectó poca PGE_{2} y el principal pico de producto correspondía al tiempo de retención del 12-HHT.

La formación de PGE_{2} (Figura 1C) se suprimía si se hervía la membrana durante 2 minutos antes de la incubación, demostrándose la naturaleza enzimática de la catálisis. También, no se observó actividad de la PGE sintasa usando la fracción de membrana obtenido a partir de bacterias que expresaban la ratMGST1. Si la fracción de membrana se trataba con N-etilmaleimida (1 mM) durante 5 minutos antes de la incubación, se suprimía la actividad del enzima. No se detectó actividad en la fracción citosólica procedente de bacterias que expresaban la PGE sintasa. Más aún, no se observó actividad de la PGE sintasa en los microsomas obtenidos a partir de células Sf9 que expresaban
la MGST2.

La Figura 2 demuestra la producción de PGE_{2} como una función de la concentración de proteína. En este experimento, las diversas diluciones de la fracción de membrana obtenida de bacterias que expresaban la PGE sintasa se incubaron en presencia de PGH_{2} (10 \muM) y GSH (2,5 mM) durante 2 minutos. La formación de PGE_{2} se analizó y cuantificó mediante RP-HPLC y detección en el UV a 195 nm, tal como se describió más arriba en los Materiales y Procedimientos.

Se halló una relación lineal usando concentraciones de proteína de hasta 0,015 mg/ml. A partir de ahí la pendiente declina rápidamente debido a la casi completa conversión del PGH_{2} añadido en PGE_{2}.

La Figura 3 demuestra la producción de PGE_{2} en función del tiempo después de incubar la fracción de membrana (0,02 mg/ml) con PGH_{2} (10 \muM) en presencia o ausencia de GSH (2,5 mM). La fracción de membrana obtenida a partir de bacterias que expresan la PGE sintasa (0,02 mg/ml) se incubó con PGH_{2} durante los tiempos indicados en presencia (círculos rellenos) o ausencia (círculos vacíos) de glutatión. Los triángulos rellenos representan la formación de PGE_{2} no enzimática (sólo tampón) después de la incubación con PGH_{2}. La formación de producto se analizó mediante RP-HPLC, y la PGE_{2} se detecto y cuantificó usando la absorbancia en el UV a 195 nm.

Se obtuvo una relación lineal durante los primeros 60 segundos de incubación. A partir de ahí, la pendiente de la curva declina debido al rápido consumo del sustrato.

La Figura 3 muestra también que la actividad depende de la presencia de glutatión. La actividad específica en condiciones lineales (restando la formación de fondo) fue de 600 pmol/1,2 minutos/0,002 mg de fracción de membrana (es decir, 250 nmol/minuto/mg).

Inducción de la PGE sintasa por la IL-1\beta

Las células A549 se han usado para estudiar la inducción de la cox-2, y también se ha descrito que incrementan significativamente su liberación de PGE_{2} a continuación del tratamiento con interleucina-1\beta. Con objeto de investigar si la PGE sintasa podía estar regulada también por esta citocina, se cultivaron células A549 durante 24 horas en presencia de 1 ng/ml de IL-1\beta. Las células normales, así como las tratadas con IL-1\beta, se analizaron subsiguientemente en busca de expresión de la PGE sintasa mediante una SDS-PAGE seguida por transferencia
Western.

La proteína total correspondiente a 0,2 \times 10^{6} células cultivada durante 24 horas en presencia (1 ng/ml) o ausencia de IL-1\beta se fraccionó mediante SDS-PAGE y se transfirió a membrana PVDF. Las membranas se incubaron usando antisuero para PGE sintasa, o antisuero para PGE sintasa que contenía el péptido antigénico (10^{-6} M). También se analizó la PGE sintasa, parcialmente purificada, comercialmente disponible, procedente de vesículas seminales de carneros (6 \mug), así como la fracción de membrana procedente de bacterias que expresaban la PGE sintasa humana
(5 \mug).

La PGE sintasa fue inducida por la IL-1\beta. En el carril cargado con células tratadas con IL-1\beta, apareció una banda de 15 kDa que migraba conjuntamente con la PGE sintasa expresada en bacterias. El reconocimiento se perdía se si mezclaba el antisuero con el péptido antigénico (1 \muM), demostrándose la detección específica de la PGE sintasa en células A549 tratadas con IL-1\beta. Se detectaron niveles significativamente inferiores de PGE sintasa en células A549 no tratadas.

Identificación de una proteína de 16 kDa inmunoreactiva, PGE sintasa parcialmente purificada, derivada de vesículas seminales ovinas

Se ensayó la reactividad cruzada de la preparación de PGE sintasa impura disponible comercialmente, purificada parcialmente a partir de vesículas seminales de carnero, con el antisuero de la PGE sintasa humana.

A partir de los resultados de la transferencia Western, es evidente que aparece una banda de proteína de 16 kDa en el carril cargado con 6 \mug de esta muestra. La banda se perdió usando el antisuero adsorbido de péptido, sugiriéndose un reconocimiento específico. La proteína difiere algo en tamaño y aparece más difusa, lo que podría sugerir cierto tipo de modificación post-traducción.

Ensayo de actividad de la PGE sintasa

Los estudios previos han demostrado que las prostaglandinas pueden separarse mediante RP-HPLC y detectarse mediante espectrofotometría de UV (Terragno et al., Prostaglandins, 21(1):101-112 (1981); Powell, Anal. Biochem., 148(1):59-69 (1985)). El coeficiente de extinción molar de la PGE2 es de 16.500 a 192,5 nm (Terragno et al., Prostaglandins, 21(1):101-112 (1981)). Las diferencias entre la absorbancia a 192,5 nm y 195 nm fue marginal (Terragno et al., Prostaglandins, 21(1):101-112 (1981)). Sin embargo, nuestros resultados usando las condiciones de RP-HPLC (descritas más abajo) demostraron un línea base significativamente más estable, con menos ruido a una longitud de onda mayor. Los productos principales del PGH2 son la PGF2\alpha, la PGE2 y la PGD2. Usando las condiciones de RP-HPLC descritas, los tiempos de retención eran respectivamente de 19,0, 23,8 y 28,6 minutos para la PGF2\alpha, PGE2 y PGD2. Con objeto de obtener un estándar interno, hemos ensayado la 11\beta-PGE2 y 16,16-dimetil-PGE2. El último compuesto era demasiado hidrofóbico y no pudo usarse en el sistema isocrático descrito. Por contra, la 11\beta-PGE2 eluyó con un tiempo de retención de 25,3 minutos, casi con separación de la PGE2 en la línea base. Con objeto de investigar la relación de absorbancia en el UV entre la 11-\beta PGE_{2} y la PGE_{2}, se analizaron cantidades iguales (cuantificadas mediante GC-MS) mediante RP-HPLC y se analizó la absorbancia en el UV a 195 nm. Los dos compuestos mostraron propiedades de absorbancia en el UV idénticas. Con objeto de ensayar la recuperación y reproducibilidad de la extracción en fase sólida, se diluyeron cantidades conocidas de 11-\beta PGE_{2} y PGE_{2} en tampón de muestras, y se acidificaron mediante la adición de solución de detención (que no contenía ion cloruro) seguida por la adición de acetonitrilo (concentración final del 33%), y se sometió a análisis (10% (v/v) de la muestra total). Alternativamente, después de la adición de la solución de detención, se extrajo la muestra mediante extracción en fase sólida, y se analizó a continuación la fracción correspondiente (10% (v/v) de la muestra total). Las cantidades de 11-\beta PGE_{2} y PGE_{2} antes y después de la extracción se compararon y se estimó que la recuperación era
del 85-90%.

Con objeto de cuantificar la PGE_{2}, se preparó una curva estándar de PGE_{2}. La curva fue lineal a lo largo del rango desde 0,9 pmoles hasta 706 pmoles (R^{2} = 0,9997, k = 0,0012). Para la cuantificación usamos rutinariamente tanto el estándar externo como la técnica del estándar interno, el último procedimiento tomaba también en consideración las pérdidas durante la preparación.

Podrían haberse encontrado algunas dificultades cuando se ensayaba la PGE sintasa con el PGH2. El sustrato es muy lábil y se descompone de forma no enzimática, con una vida media de aproximadamente 5 minutos a 37ºC, en una mezcla de PGE2 y PGD2 con una proporción E/D de aproximadamente 3 (Hamberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 71:345-349 (1974); Nugteren y Christ-Hazelhof, en Adv. in Prostaglandin and Thromboxane Res. 6, editado por B. Samuelsson, P. W. Ramwell, y R. Paoletti. Raven Press: N.Y., 129-137 (1980)). También, la catálisis por la PGE sintasa es muy rápida, es por eso que fácilmente puede ocurrir que se agote el sustrato en pocos segundos, impidiendo un análisis cuantitativo. Una vez se ha terminado la reacción, cualquier PGH2 restante se debe separar también rápidamente de los productos con objeto de no interferir con los resultados. Para hacer frente a estas propiedades del sustrato, el ensayo debe realizarse tal como sigue.

Con objeto de minimizar la producción no enzimática de PGE_{2}, el sustrato (PGH_{2}) se mantuvo siempre sobre nieve carbónica (-78ºC) hasta su uso, y la reacción enzimática se realizó a 0ºC en presencia de PGH2 y glutatión reducido (GSH). Se usó una solución de detención, conteniendo FeCl_{2}, la cual convertía cualquier PGH_{2} restante en HHT (Hamberg y Samuelsson, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 71(9):3400-3404 (1974)). También, los productos son mucho más estables en solventes orgánicos (Nugteren y Christ-Hazelhof, en Adv. in Prostaglandin and Thromboxane Res. 6, editado por B. Samuelsson, P.W. Ramwell, y R. Paoletti. Raven Press: N.Y., 129-137 (1980)), de forma que extrajimos la muestra inmediatamente después de la terminación mediante extracción en fase sólida y mantuvimos el eluato en acetonitrilo.

Procedimiento de ensayo

Las muestras de ensayo se diluyeron en tampón fosfato potásico inorgánico (0,1 M, pH 7,4) que contenía glutatión reducido 2,5 mM (GSH). 4 \mul de PGH_{2}, disuelto en acetona (0,284 mM), se añadieron a tubos Eppendorf y se mantuvo sobre nieve carbónica (-78ºC). Antes de la incubación, ambos, el sustrato y las muestras, se transfirieron sobre hielo húmedo (o 37ºC) durante 2 minutos para equilibrar la temperatura, y se inició la reacción mediante la adición de
100 \mul de muestra a los tubos que contenían el PGH_{2}. La reacción se terminó mediante la adición de 400 \mul de solución de detención (FeCl_{2} 25 mM, ácido cítrico 50 mM y 11-\beta PGE_{2} 2,7 \muM), disminuyéndose el pH hasta 3, proporcionando una concentración total de FeCl_{2} 20 mM, ácido cítrico 40 mM y 11-\beta PGE_{2} 2,1 \muM. La extracción en fase sólida se realizó inmediatamente usando columnas C18-Chromabond. Las muestras se eluyeron con 500 \mul de acetonitrilo y a continuación se añadió 1 ml de H_{2}O. Con objeto de determinar la formación de PGE_{2} y 11-\beta PGE_{2}, se analizó una alícuota (150 \mul) mediante RP-HPLC, combinada con la detección mediante UV a 195 nm. La columna de HPLC en fase reversa fue una Nova-Pak C18 (3,9 \times 150 mm, 4 \mum de tamaño de partícula) obtenida de Waters, y la fase móvil fue agua, acetonitrilo y ácido trifluoroacético (72:28:0,007, en volumen). La velocidad de flujo fue de 0,7 ml/minutos, y los productos se cuantificaron mediante la integración de las áreas de
los picos.

Discusión

La MGST1-L1 se identificó como una homóloga de la MGST1 que presentaba similitudes tanto a nivel
de secuencia (38% de identidad de aminoácidos) como de propiedades estructurales (perfil de hidrofobici-
dad).

La MGST1-L1 se expresó usando un sistema de expresión bacteriano. Cuando se ensayó la actividad de la PGE sintasa, las membranas procedentes de bacterias que expresaban la MGST1-L1 exhibieron un actividad PGE sintasa significativa (0,25 \mumol/minutos/mg) correspondiente a los niveles más elevados de actividad PGE sintasa que ocurren normalmente, es decir, en microsomas aislados de vesículas seminales de carnero (Moonen, P., et al., Methods in Enzymology, 86:84-91 (1982)) y conductos deferentes de ratas (Watanabe, K., et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 235:148-52 (1997)). De hecho, estimando que el 1% de la proteína de membrana bacteriana es MGST1-L1, la actividad específica deducida pasa a ser de 25 \mumol/minutos/mg, correspondiente a una Kcat/Km en el rango 10^{6} M^{-1}s^{-1} range. Tales valores elevados de Kcat/Km son marcas características de enzimas extremadamente eficientes (Fersht, A., Enzyme Structure and Mechanism, (W.H. Freeman & Co., New York, (1985)). Considerando la corta vida media del PGH_{2} y la existencia de vías competidoras, tiene sentido que un actividad fisiológicamente relevante sea altamente eficiente.

Estos resultados proporcionan indicación de que la MGST1-L1 es una PGE sintasa humana, el análisis de transferencia Western confirmó la expresión exitosa de la proteína y también que la expresión de la proteína PGE sintasa estaba regulada hacia arriba en células A549 (una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humana) a continuación del tratamiento con IL-1\beta. Las células A549 han sido usadas por muchos investigadores para estudiar la regulación de la cox-2 y enzimas relacionados, tales como la fosfolipasa A2 citosólica. Los resultados coinciden con los datos publicados, demostrando la regulación hacia arriba de la cox-2 y el incremento en varias veces de la biosíntesis de la PGE-2 en respuesta al tratamiento con interleucina-11 de las células A549 (Huang, M., et al., Cancer Res., 58:1208-1216 (1998); Mitchell, J., et al., British J. of Pharmacol., 113:1008-1014 (1994)). En combinación con estos hallazgos sobre la cox-2, los datos sugieren que la PGE sintasa y la cox-2 están co-reguladas, y que la biosíntesis de la PGE_{2} podría ser dependiente de la presencia de ambos de estos enzimas. De acuerdo con esto, se ha descrito también una actividad PGE sintasa inducible en macrófagos peritoneales de rata estimulados con lipopolisacáridos, lo que coincide con la expresión de la cox-2 y los cambios en la formación de producto a favor de la PGE_{2} (Naraba, H., et al., Journal of Immunology, 160:2974-2982 (1998); Matsumoto, H., et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 230:110-114 (1997)). La inducción de la PGE sintasa (PIG12) a continuación de la expresión de la p53 en una línea celular de cáncer colorectal (DLD-1) (Polyak, K., et al., Nature, 389:300-305 (1997)) podría ser de importancia también para comprender el papel de la cox y de la PGE sintasa en el cáncer y la apoptosis. También la ciclooxigenasa-2 ha sido implicada en el cáncer de colon a través de los efectos beneficiosos observados por varios NSAID sobre el crecimiento del cáncer (Dubois, R., et al., Faseb J., 12:1063-1073
(1998)).

En resumen, se ha identificado y caracterizado la primera PGE sintasa microsomal dependiente de glutatión, y se ha demostrado que es regulada hacia arriba por la interleucina-1\beta pro-inflamatoria en una línea celular de cáncer de pulmón. Esta citocina también regula hacia arriba la cox-2 y la capacidad celular para producir PGE_{2}. Esto proporciona la PGE sintasa como una nueva diana para el desarrollo de fármacos en varias áreas, incluyendo la inflamación, el cáncer y la apoptosis, tal como ya se ha discutido más arriba.

<110> Jakobsson, Per-Johan

\hskip1,05cm

Morgenstern, Ralf

\hskip1,05cm

Samuelsson, Bengt

\hskip1,05cm

Karolinska Institutet, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry II, S-171 77, Estocolmo, Suecia

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<120> Procedimientos y medios para modular la actividad de la PGE sintasa

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<210> 1

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 1

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10

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<210> 2

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<212> PRT

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<213> Humano

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<400> 2

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11

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<210> 3

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<212> PRT

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<213> Humano

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<400> 3

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CRSDPDVERSLRAHRN

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<210> 4

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<212> ADN

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<400> 4

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GAGAGACATATGCCTGCCCACAGCCTG

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<210> 5

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<212> ADN

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<400> 5

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GAGAGAAAGCTTCACAGGTGGCGGGCCGC

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Claims (37)

1. Polipéptido aislado y puro que es una PGE sintasa, y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC.
Nº ID.: 2.

2. Polipéptido aislado y puro que es una PGE sintasa, y que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, en donde dicha porción incluye los aminoácidos 30-152 de la SEC.
Nº ID.: 2.

4. Polipéptido según la reivindicación 2, en donde dicha porción incluye los aminoácidos 1-130 de la SEC.

\hbox{Nº ID.: 2.}

5. Polipéptido según la reivindicación 2, en donde dicha porción incluye los aminoácidos 30-130 de la SEC.
Nº ID.: 2.

6. Polipéptido aislado y puro que es una PGE sintasa, y que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2, pero tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, el cual tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, fusionado con una secuencia heteróloga de aminoácidos.

9. Procedimiento de ensayo para identificar un candidato modulador de la actividad de la PGE sintasa, procedimiento que comprende:

(a)

poner en contacto un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y una molécula de unión putativa u otra sustancia de ensayo; y

(b)

determinar la interacción o unión entre el polipéptido y la sustancia de ensayo, mediante la cual se identifica un candidato a modulador de la actividad de la PGE sintasa.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 que comprende además ensayar un modulador candidato identificado de la actividad de la PGE sintasa por su capacidad para modular la actividad de la PGE sintasa.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde dicho candidato a modulador se identifica como un inhibidor de la actividad de la PGE sintasa.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, que además comprende formular dicho inhibidor en una composición que comprende al menos un componente adicional.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en donde dicha composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

14. Procedimiento de ensayo para identificar un modulador de la actividad de la PGE sintasa, procedimiento que comprende:

(a)

incubar un polipéptido aislado, tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el cual tiene actividad PGE sintasa, y un compuesto de ensayo, en presencia de un sustrato de endoperóxido cíclico de la PGE sintasa, en condiciones en las que la PGE sintasa cataliza habitualmente la conversión del sustrato endoperóxido cíclico en un producto que es la forma 9-ceto, 11\alpha hidroxi del sustrato; y

(b)

determinar la producción de dicho producto.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en donde dicho polipéptido y un compuesto de ensayo se incuban en presencia de una glutationa reducida y PGH_{2}, en condiciones en las que la PGE se produce normalmente, y el procedimiento comprende determinar la producción de PGE.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó reivindicación 15, en donde un compuesto de ensayo se identifica como un modulador de la actividad de la PGE sintasa.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en donde un compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la actividad de la PGE sintasa.

18. Procedimiento según la reivindicación 16 o reivindicación 17, que además comprende formular dicho modulador en una composición que comprende al menos un componente adicional.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

20. Utilización de un polipéptido aislado, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en un procedimiento para obtener o identificar un modulador de la actividad de la PGE sintasa.

21. Utilización según la reivindicación 20, en donde se obtiene o identifica un inhibidor de la PGE sintasa.

22. Procedimiento para producir un polipéptido, el cual tiene actividad PGE sintasa, comprendiendo el procedimiento:

(a)

causar la expresión a partir de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es una PGE sintasa, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un sistema de expresión apropiado, para producir de manera recombinante el polipéptido;

(b)

ensayar el polipéptido producido de manera recombinante según su actividad PGE sintasa.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en donde dicho ácido nucleico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 1.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde se aísla el polipéptido producido de manera recombinante.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en donde se ensaya la actividad PGE sintasa del polipéptido aislado, mediante la determinación de la producción de PGE en la incubación del polipéptido con PGH_{2} y glutationa reducida.

27. Procedimiento según la reivindicación 25 o reivindicación 26, en donde el polipéptido producido de manera recombinante se formula en una composición que comprende al menos un componente adicional.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde se ensaya la actividad de PGE sintasa del polipéptido producido de manera recombinante, en presencia y ausencia de un compuesto de ensayo.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en donde el compuesto de ensayo es un inhibidor de la actividad de la PGE sintasa.

30. Construcción de ácido nucleico apropiada para su uso en la producción de un polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo la construcción una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, y que está unida operativamente a secuencias reguladoras para la expresión del polipéptido codificado.

31. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 30, en donde el polipéptido codificado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

32. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 31, en donde dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. Nº ID.: 1.

33. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 30, en donde el polipéptido codificado, el cual es una PGE sintasa, consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos SEC. Nº ID.: 2.

34. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 30, en donde el polipéptido codificado, el cual es una PGE sintasa, tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2, pero tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

35. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 34, en donde el polipéptido codificado tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC. Nº ID.: 2.

36. Célula hospedadora transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35.

37. Utilización de una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35 en un procedimiento para producir un polipéptido que es una PGE sintasa.