ES2279647T3 - Reguladores mitogenicos. - Google Patents

Abstract

Una proteína asilada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) SEQ ID Nº 2 b) SEQ ID Nº 21 c) SEQ ID Nº 42 d) una de las secuencias de aminoácidos de a) hasta c) con una deleción en las mismas o una adición en las mismas de menos del 5% de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos, en la que dicha proteína es capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno, o e) una proteína aislada capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de a) hasta c) con una sustitución conservativa seleccionada de los grupos 1) a 6), que son: 1) alanina, serina o treonina, una por otra; 2) ácido aspártico o ácido glutámico, uno por el otro; 3) asparagina o glutamina, una por la otra; 4) arginina o lisina, una por la otra; 5) isoleucina, leucina, metionina o valina, una por la otra; y 6) fenilalanina, tirosina o triptofano, uno por el otro, o f) un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionado de uno de a) hasta c), en el que dicho fragmento es capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno.

Description

Reguladores mitogénicos.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo del crecimiento celular normal y anormal, en particular a la regulación mitogénica. La presente invención provee lo siguiente: secuencias de nucleótidos que codifican la producción de enzimas que son reguladores mitogénicos; secuencias de aminoácidos de estas enzimas; vectores conteniendo estas secuencias de nucleótidos; procedimientos para transfectar células con vectores que producen estas enzimas; células transfectadas; procedimientos para administrar estas células transfectadas a animales no humanos para inducir la formación de tumores; y anticuerpos para estas enzimas que son útiles para detectar y medir los niveles de estas enzimas, y para unirse a células que poseen epítopes extracelulares de estas enzimas.

Antecedentes de la invención

Los intermediarios reactivos de oxígeno (ROI) son productos de reducción parcial de oxígeno: 1 electrón reduce O_{2} para formar superóxido (O_{2}^{-}), y 2 electrones reducen O_{2} para formar peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}). Los ROI se generan como un subproducto del metabolismo aeróbico y por mecanismos toxicológicos. Existen evidencias crecientes de la generación enzimática regulada de O_{2}^{-} y su conversión a H_{2}O_{2} en una diversidad de células. La conversión de O_{2}^{-} a H_{2}O_{2} se produce espontáneamente, pero es acelerada de forma notable por superóxido dismutasa (SOD). Los niveles elevados de IOR están asociados con daños en biomoléculas tales como ADN, biomembranas y proteínas. Evidencias recientes indican la generación de ROI bajo condiciones celulares normales y apuntan a señalar el papel que cumplen O_{2}^{-} y H_{2}O_{2}.

Varios sistemas biológicos generan oxígeno reactivo. Las células fagocíticas tales como neutrófilos generan grandes cantidades de ROI como parte de su batería de mecanismos bactericidas. La exposición de neutrófilos a bacterias o a diversos mediadores solubles tales como formil-Met-Leu-Phe o ésteres de forbol activa un consumo masivo de oxígeno, llamado explosión respiratoria, para generar inicialmente superóxido, con la generación secundaria de H_{2}O_{2}, HOCI y radical hidroxilo. La enzima responsable de este consumo de oxígeno es la oxidasa de explosión respiratoria (nicotinamida adenina dinucleótido fosfatasa en forma reducida (NADPH) oxidasa).

Existen crecientes evidencias de la generación de ROI por parte de células no fagocíticas, particularmente en situaciones relacionadas con proliferación celular. Se ha notado una generación significativa de H_{2}O_{2}, O_{2}^{-}, o ambos en algunos tipos de células. Los fibroblastos y células endoteliales muestran liberación aumentada de superóxido en respuesta a citoquinas tales como interleuquina-1 o factor de necrosis tumoral (TNF) (Meier y col. (1989) Biochem J. 263, 539-545.; Matsubara y col. (1986) J. lmmun.137, 3295-3298). Los fibroblastos transformados con Ras muestran liberación aumentada de superóxido comparados con fibroblastos control (Irani, y col. (1997) Science 275, 1649-1652). Las células de músculo liso vascular de rata muestran liberación aumentada de H_{2}O_{2} en respuesta a PDGF (Sundaresan y col. (1995) Science 270, 296-299) y angiotensina II (Griendling y col. (1994) Circ. Res. 74, 1141-1148; Fukui y col. (1997) Circ. Res. 80, 45-51; Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 211, 23317-23321), y el H_{2}O_{2} está asociado en estas células con tasas aumentadas de proliferación. En la Tabla 1 se resume la generación de ROI en una diversidad de tipos celulares (adaptado de Burdon, R. (1995) Free Radical Biol. Med.18, 775-794).

TABLA 1

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Los ROI generados por neutrófilos tienen función citotóxica. Aunque los ROI son dirigidos normalmente al microbio invasor, los ROI pueden también inducir daño tisular (por ejemplo, en condiciones inflamatorias tales como artritis, choque, enfermedad pulmonar y enfermedad intestinal inflamatoria) o pueden estar involucrados en el inicio o promoción de tumores, debido a efectos dañinos sobre el ADN.. Nathan (Szatrowski y col. (1991) Canc. Res. 51, 794-798)
propusieron que la generación de ROI en células tumorales puede contribuir a la hipermutabilidad observada en los tumores, y puede por lo tanto contribuir a la heterogeneidad, a la invasión y metástasis tumoral.

Además de los papeles citotóxico y mutagénico, los ROI tienen propiedades ideales como moléculas señal: 1) se generan de manera controlada en respuesta a señales previas; 2) la señal puede terminar por rápido metabolismo de O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} por parte de SOD y peroxidasas de catalasa; 3) ejercen efectos posteriores en moléculas diana, por ejemplo, proteínas reguladoras sensibles a redox tales como NF kappa B y AP-1 (Schreck y col. (1991) EMB4 J.10, 2247-2258; Schmidt y col. (1995) Chemistry & Biology 2, 13-22). Los oxidantes tales como O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} tienen un papel como señal relativamente bien definido en las bacterias, operando por medio del regulón SoxIIII para regular la transcripción.

Los ROI parecen tener un papel directo en la regulación de la división celular y pueden funcionar como señales mitogénicas en afecciones patológicas relacionadas con el crecimiento. Estas afecciones incluyen cáncer y enfermedad cardiovascular. El O_{2}^{-} se genera en células endoteliales en respuesta a citoquinas y puede jugar un papel en la angiogénesis (Matsubara y col. (1986) J. lmmun.137, 3295-3298). Se propone también que O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} funcionan como "señales de vida", previniendo a las células de sufrir apoptosis (Matsubara y col. (1986) J. Immun.137, 3295-3298). Como se discutió anteriormente, muchas células responden a factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento derivado de epidermis (EGF), angiotensina II, y diversas citoquinas) con producción aumentada de O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} y proliferación aumentada. La inhibición de generación de ROI previene la respuesta mitogénica. La exposición a O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} generados de manera exógena da como resultado un aumento en la proliferación celular. En la Tabla 2 a continuación se muestra una lista parcial de tipos celulares que responden a O_{2}^{-} y H_{2}O_{2} (adaptado de Burdon, R. (1995) Free Radical Biol. Med.18, 775-794).

TABLA 2

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Mientras que las células no transformadas pueden responder a factores de crecimiento y citoquinas con producción de ROI, las células tumorales parecen producir ROI de manera descontrolada. Una serie de células tumorales humanas produjeron grandes cantidades de peróxido de hidrógeno en comparación con células no tumorales (Szatrowski y col. (1991) Canc. Res. 51, 794-798). Las células NIH 3T3 transformadas con Ras generaron cantidades elevadas de superóxido, y la inhibición de generación de superóxido por medio de varios mecanismos dio como resultado una reversión a un fenotipo de crecimiento "normal".

El O_{2}^{-} ha sido implicado en el mantenimiento del fenotipo transformado en células cancerosas incluyendo melanoma, cáncer de mama, fibrosarcoma y células tumorales transfectadas con virus. Se han medido niveles disminuidos de la forma manganeso de SOD (MnSOD) en células cancerosas y en líneas celulares transformadas in vitro, pronosticando niveles aumentados de O_{2}^{-} (Burdon, R. (1995) Free Radical Biol. Med.18, 775-794). La MnSOD está codificada en el cromosoma 6q25 que frecuentemente se pierde en el melanoma. La sobreexpresión de MnSOD en melanoma y otras células cancerosas (Church y col. (1993) Proc. of Natl. Acad. Sci. 90, 3113-3117; Fernandez-Pol y col. (1982) Canc. Res. 42, 609-617; Yan y col. (1996) Canc. Res. 56, 2864-2871) dio como resultado la supresión del fenotipo transformado.

Los ROI están implicados en el crecimiento del músculo liso vascular asociado con la hipertensión, aterosclerosis y reestenosis tras angioplastia. Se observa generación de O_{2}^{-} en la lámina adventicia de aorta de conejo (Pagano y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 14483-14488). Las células endoteliales vasculares liberan O_{2}^{-} en respuesta a citoquinas (Matsubara y col. (1986) J. Immun. 137, 3295-3298). Las células de músculo liso de aorta en cultivo generan O_{2}^{-}, y la generación aumentada de O_{2}^{-} es estimulada por angiotensina II que también induce hipertrofia celular. En un sistema en modelo de rata, la infusión de angiotensina II lleva a hipertensión así como a generación aumentada de O_{2}^{-} en el tejido aórtico aislado posteriormente (Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 23317-23321.; Yu y col. (1997) J. Biol. Chem. 272, 27288-27294). La infusión intravenosa de una forma de SOD que se localiza en la vasculatura o una infusión de un barredor de O_{2}^{-} previno la hipertensión inducida por angiotensina II e inhibió la generación de ROI (Fukui y col. (1997) Circ. Res. 80, 45-51).

La NADPH oxidasa de neutrófilos, conocida también como oxidasa de explosión respiratoria de fagocitos, provee un paradigma para el estudio de sistemas enzimáticos generadores de ROI especializados. Esta enzima ampliamente estudiada oxida NADPH y reduce oxígeno para formar O_{2}^{-}. La NADPH oxidasa está constituida por múltiples proteínas y está regulada por el ensamble de componentes citosólicos y de membrana. El fragmento catalítico está constituido por flavocitocrono b_{558}, una enzima integral de membrana plasmática que comprende dos componentes: gp91phox (gp se refiere a glicoproteína; phox es una abreviatura de las palabras fagocito y oxidasa) y p22phox (p se refiere a proteína), gp91 phox contiene 1 flavinadenindinucleótido (FAD) y 2 hemos así como también un sitio de unión para NADPH. El componente p22phox tiene una secuencia en el extremo C terminal rica en prolina que sirve como sitio de unión para proteínas reguladoras citosólicas. Las dos subunidades del citocromo, gp91 phox y p22phox parecen estabilizarse una a la otra, ya que la ausencia genética de cualquier subunidad, como en la afección hereditaria llamada enfermedad granulomatosa crónica (CGD), da como resultado la ausencia de la otra subunidad (Yu y col. (1997) J. Biol. Chem. 272, 27288-27294). Las proteínas citosólicas esenciales incluyen p47phox, p67phox y la pequeña GTPasa Rac, de la que hay dos isoformas. Tanto p47phox como p67phox contienen regiones SH_{3} y regiones ricas en prolina que participan en interacciones proteicas que dirigen el ensamble de los componentes de la oxidasa durante la activación. La enzima de los neutrófilos es regulada en respuesta a la fagocitosis bacteriana o a señales quimiotácticas por la fosforilación de p47phox, y tal vez otros componentes, así como por intercambio de nucleótidos guanina para activar la proteína de unión a GTP, Rac.

El origen de los ROI en tejidos no fagocíticos no está probado, pero se ha evaluado la presencia de componentes de oxidasas de fagocitos en varios sistemas por medio de procedimientos inmunoquímicos, reacciones de transferencia Northern y reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). El mensaje para p22phox se expresa ampliamente, como también el mensaje para Rac1. Se ha demostrado que varios tipos de células que son capaces de generar O_{2}^{-} contienen todos los componentes de phox incluyendo gp91phox, como se resume en la Tabla 3 a continuación. Estos tipos celulares incluyen células endoteliales, la adventicia de al aorta y linfocitos.

TABLA 3

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Sin embargo, se observa un patrón claramente diferente en varios otros tipos de células mostrados en la Tabla 3 incluyendo células mesangiales glomerulares, músculo liso aórtico y fibroblastos. En estas células, está ausente la expresión de gp91 mientras que se ha demostrado que están presentes p22phox y en algunos casos componentes citosólicos de phox. Dado que gp91 phox y p22phox se estabilizan una a la otra en los neutrófilos, se ha especulado mucho en que alguna molécula, posiblemente relacionada con gp91phox, explique la generación de ROI en células mesangiales glomerulares, músculo liso aórtico de rata y fibroblastos (Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 23317-23321). La investigación de fibroblastos de un paciente con ausencia genética de gp91phox provee pruebas de que la subunidad gp91phox no está involucrada en la generación de ROI en estas células (Emmendorffer y col. (1993) Eur. J. Haemafol. 51, 223-227). La depleción de p22phox del músculo liso vascular usando un enfoque antisentido indicó que esta subunidad participa en la generación de ROI en estas células, a pesar de la ausencia de gp91phox detectable (Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 23317-23321). Actualmente se desconocen los candidatos moleculares posiblemente relacionados con gp91phox e involucrados en la generación de ROI en estas células.

En consecuencia, lo que se necesita es la identidad de las proteínas involucradas en la generación de ROI, especialmente en tejidos y células no fagocíticos. También se necesitan las secuencias que codifican estas proteínas, y las secuencias primarias de las mismas proteínas. Se necesitan también vectores diseñados para incluir nucleótidos que codifiquen esas proteínas. Se necesitan sondas y cebadores de PCR derivados de las secuencias de nucleótidos que se quiere detectar, localizar y medir las secuencias de nucleótidos, incluyendo ARNm, involucradas en la síntesis de estas proteínas. Además, lo que se necesita es un medio para transfectar células con estos vectores. También se necesitan sistemas de expresión para la producción de estas moléculas. Se necesitan también anticuerpos dirigidos a estas moléculas para una diversidad de usos incluyendo localización, detección, medición e inmunización pasiva.

Resumen de la invención

La presente invención resuelve los problemas descritos anteriormente proveyendo una nueva familia de secuencias de nucleótidos y proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos llamadas proteínas mox. En particular, la presente invención provee composiciones que comprenden las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, y fragmentos de las mismas, que codifican la expresión de proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, respectivamente, y fragmentos de las mismas. Se cree que estas proteínas están involucradas en la producción de ROI. Sin querer estar ligados a la afirmación anterior, la presente invención también provee vectores que contienen estas secuencias de nucleótidos, células transfectadas con estos vectores que producen las proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas, y anticuerpos para estas proteínas y fragmentos de las mismas. La presente invención también provee procedimientos para estimular la proliferación celular administrando vectores codificados para la producción de las proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Los nucleótidos y anticuerpos de la presente invención son útiles para la detección, localización y medición de los ácidos nucleicos que codifican la producción de las proteínas de la presente invención, y también para la detección, localización y medición de las proteínas de la presente invención. Estos nucleótidos y anticuerpos pueden combinarse con otros reactivos en equipos para fines de detección, localización y medición.

Más particularmente, la presente invención incluye un procedimiento para regular la división celular o proliferación celular modificando la actividad o expresión de las proteínas descritas como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas. Se espera que estas proteínas, y sus formas expresadas o que se presentan naturalmente, sean útiles en el desarrollo de fármacos, por ejemplo para seleccionar bibliotecas químicas y de fármacos mediante la observación de la inhibición de la actividad de estas enzimas. Tales compuestos químicos y fármacos probablemente serían útiles como tratamientos para el cáncer, hipertrofia prostática, hipertrofia prostática benigna, hipertensión, aterosclerosis y muchas otras afecciones que incluyen crecimiento o proliferación celular anormal descritas anteriormente. La proteína completa expresada puede ser útil en estos ensayos. Las porciones de la molécula que pueden ser dianas para inhibición o modificación incluyen, pero no se limitan a, sitio de unión para nucleótidos piridina (NADPH o NADH), el dominio de flavoproteína (aproximadamente los 265 aminoácidos del extremo C terminal), y/o el sitio de unión o el sitio catalítico para flavinadenindinucleótido (FAD).

El procedimiento de la presente invención puede usarse para desarrollar fármacos y otros tratamientos de afecciones asociadas con crecimiento anormal incluyendo, pero no limitado a las siguientes: cáncer, soriasis, hipertrofia prostática, hipertrofia prostática benigna, enfermedad cardiovascular, proliferación de vasos, incluyendo pero no limitado a vasos sanguíneos y vasos linfáticos, malformaciones arteriovenosas, problemas vasculares asociados con el ojo, aterosclerosis, hipertensión y reestenosis tras angioplastia. Las enzimas de la presente invención son dianas excelentes para el desarrollo de fármacos y otros agentes que pueden modular la actividad de estas enzimas. Debe entenderse que la modulación de la actividad puede dar como resultado el aumento, disminución o ausencia de actividad enzimática. La modulación de la actividad de estas enzimas puede ser útil en el tratamiento de afecciones asociadas con el crecimiento anormal.

Los fármacos que afectan la actividad de las enzimas representadas en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas, pueden también combinarse con otros tratamientos en el tratamiento de afecciones específicas. Por ejemplo, estos fármacos pueden combinarse con inhibidores de angiogénesis en el tratamiento del cáncer, con antihipertensivos para el tratamiento de hipertensión, y con fármacos que disminuyen los niveles de colesterol para el tratamiento de la aterosclerosis.

En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proveer secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas para la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucrados en la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es proveer vectores conteniendo estas secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer células transfectadas con estos vectores.

Otro objetivo de la presente invención es proveer proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, o fragmentos de los mismos, dirigidos a proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es administrar genes que contienen secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, a células obtenidas de animales o seres humanos.

Otro objetivo de la presente invención es administrar secuencias complementarias antisentido de genes que contienen secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, a células obtenidas de animales o seres humanos.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer modelos en animales en desarrollo de formación de tumores usando un procedimiento para estimular o inhibir la proliferación celular administrando vectores conteniendo secuencias de oligonucleótidos, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, a animales. Es un objetivo de la presente invención modelos en animales en desarrollo de formación de tumores usando un procedimiento para estimular o inhibir la proliferación celular administrando vectores conteniendo secuencias complementarias antisentido de secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, a animales.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer anticuerpos útiles en inmunoterapia contra cánceres expresando las proteínas representadas en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer sondas de nucleótidos útiles para la detección, localización y medición de secuencias de nucleótidos, o fragmentos de los mismos, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es proveer anticuerpos útiles para la detección, localización y medición de secuencias de nucleótidos, o fragmentos de las mismas, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección de ácidos nucleicos que incluyen los ácidos nucleicos representados en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de los mismos, que codifican proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección y medición de ácidos nucleicos incluyendo los ácidos nucleicos representados en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de los mismos, que codifican proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer equipos útiles para la localización de ácidos nucleicos incluyendo los ácidos nucleicos representados en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de los mismos, que codifican proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección de proteínas incluyendo las proteínas representadas en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismos, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección y medición de proteínas incluyendo las proteínas representadas en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismos, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo más de la presente invención es proveer equipos útiles para la localización de proteínas incluyendo las proteínas representadas en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismos, que están involucradas en la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección, medición y localización de ácidos nucleicos, o fragmentos de los mismos, que codifican la producción de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, para uso en el diagnóstico o pronóstico de la proliferación celular anormal relacionada con la producción de ROI.

Otro objetivo de la presente invención es proveer equipos útiles para la detección, medición y localización de proteínas, o fragmentos de las mismas, que están involucradas en la producción de ROI, para uso en el diagnóstico o pronóstico de la proliferación celular anormal relacionada con la producción de ROI.

Estos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes tras una revisión de la siguiente descripción detallada de las formas de realización descritas y de los dibujos incluidos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1(a-d). Comparación de secuencias de aminoácidos de proteína mox1 humana (marcada mox1.human, SEQ ID Nº 2), proteína mox1 de rata (marcada mox1.rat, SEQ ID Nº 21), proteína mox2 humana (marcada mox2.human, SEQ ID Nº 4) de la presente invención con las proteínas: humana (gp91 phox/human.pep, SEQ ID Nº 12) bovina (gp91 phox/bovine.pep, SEQ 30 ID Nº 37), y murina (gp91 phox/mouse.pep, SEQ ID Nº 38). Están incluidas también las proteínas enzimáticas relacionadas de plantas cytb 558.arabidopsis.pep (SEQ ID Nº 39) y cytb558.rice.pep, (SEQ ID Nº 40). Los restos similares de aminoácidos están encerrados en cajas.

Fig. 2. Similitudes de secuencia entre proteínas relacionadas con gp91 phox incluyendo mox1 humana (SEQ ID Nº 2), mox2 humana (SEQ ID Nº 4), y mox1 de rata (SEQ ID Nº 21). El dendrograma indica el grado de similitud entre esta familia de proteínas, y también incluye las enzimas relacionadas de plantas.

Fig. 3. Ensayo libre de células para actividad de mox1. La generación de superóxido se midió usando la reacción quimioluminiscente entre lucigenina y superóxido en lisados celulares de vector control NEF2 y células NIH3T3 transfectadas con mox1.

Fig. 4. Generación de superóxido por mox1 humana. La reducción de NBT en fibroblastos transfectados con mox1 y fibroblastos control se midió en ausencia (barras rellenas) o en presencia (barras abiertas) de superóxido dismutasa.

Fig. 5. Aconitasa (barras rellenas), lactato deshidrogenasa (trama estrecha) y fumarasa (trama ancha) se determinaron en lisados de células transfectadas con vector solo (NEF2) o con mox1 (YA26, YA28 y YA212).

Descripción detallada de la invención

La presente invención resuelve los problemas descritos anteriormente proveyendo una nueva familia de secuencias de nucleótidos y proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos llamadas proteínas mox. El término "mox" se refiere a "oxidasa mitogénica". En particular, la presente invención provee composiciones que comprenden las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, y fragmentos de las mismas, que codifican, respectivamente, la expresión de proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas.

Las proteínas mox descritas en este documento tienen homología con la proteína gp91 phox involucrada en la generación de ROI, sin embargo, las proteínas mox comprenden una familia nueva y diferente de proteínas. Las proteínas mox incluidas en la presente invención tienen un peso molecular de aproximadamente 65 kDa como se determinó por medio de electroforesis en gel reductor y son capaces de inducir la generación de ROI en células. Como se describe en más detalle a continuación, las proteínas mox de la presente invención funcionan también en la regulación del crecimiento celular, y están por consiguiente implicadas en enfermedades que incluyen crecimiento celular anormal tal como el cáncer. La presente invención describe proteínas mox halladas en seres humanos y en ratas, sin embargo, es probable que la familia de genes/proteínas mox esté ampliamente distribuida entre los organismos multicelulares.

Además de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente, la presente invención también provee vectores que contienen estas secuencias de nucleótidos y fragmentos de las mismas, células transfectadas con estos vectores que producen las proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas, y anticuerpos para estas proteínas y fragmentos de las mismas. La presente invención también provee procedimientos para estimular la proliferación celular administrando vectores, o células conteniendo vectores, que codifican la producción de las proteínas que comprenden SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Los nucleótidos y anticuerpos de la presente invención son útiles para la detección, localización y medición de ácidos nucleicos que codifican la producción de las proteínas de la presente invención, y también para la detección, localización y medición de las proteínas de la presente invención. Estos nucleótidos y anticuerpos pueden estar combinados con otros reactivos en equipos para los fines de detección, localización y medición. Estos equipos son útiles para diagnóstico y pronóstico de afecciones que incluyen proliferación celular asociada con producción de intermediarios reactivos de oxígeno.

La presente invención soluciona los problemas descritos anteriormente proveyendo una composición que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 y fragmentos de la misma. La presente invención también provee una composición que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 y fragmentos de la misma. La presente invención también provee una composición que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 y fragmentos de la misma.

La presente invención provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 2 codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1. La presente invención provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 21 codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22. La presente invención provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 42 codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41.

La presente invención provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 2 o fragmentos de la misma, codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 21 o fragmentos de la misma, codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee una composición que comprende la proteína SEQ ID Nº 42 o fragmentos de la misma, codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 o fragmentos de la misma.

La presente invención también provee vectores que contienen la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de las mismas. La presente invención también provee células transfectadas con estos vectores. Además, la presente invención provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 3 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 o fragmentos de la misma.

La presente invención provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ I D Nº 1 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 2 o fragmentos de la misma. Además, la presente invención provee células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 o fragmentos de la misma que producen la proteína SEQ ID Nº 21 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 o fragmentos de la misma que producen la proteína SEQ ID Nº 42 o fragmentos de la misma.

La presente invención provee un procedimiento para estimular el crecimiento administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 que producen la proteína SEQ ID Nº 2 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee un procedimiento para estimular el crecimiento administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 21 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee un procedimiento para estimular el crecimiento administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 42 o fragmentos de la misma.

Específicamente, la presente invención provee un procedimiento para estimular la formación de tumores administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 2 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee un procedimiento para estimular la formación de tumores administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 22 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 21 o fragmentos de la misma. La presente invención también provee un procedimiento para estimular la formación de tumores administrando células transfectadas de manera estable con la secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 41 o fragmentos de la misma, que producen la proteína SEQ ID Nº 42 o fragmentos de la misma, o

La presente invención puede también usarse para desarrollar secuencias de nucleótidos antisentido para SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de las mismas. Estas moléculas antisentido pueden usarse para interferir con la traducción de secuencia de nucleótidos, tales como SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de las mismas, que codifican las proteínas tales como SEQ IDNº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas. La administración de estas moléculas antisentido, o vectores que codifican moléculas antisentido, a seres humanos y animales, podría interferir con la producción de proteínas tales como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas, disminuyendo así la producción de ROI e inhibiendo la proliferación celular. Estos procedimientos son útiles en la producción de modelos animales para uso en el estudio de desarrollo de tumores y desarrollo y crecimiento vascular, y para el estudio de la eficacia de tratamientos que afectan el crecimiento tumoral y vascular in vivo.

La presente invención también provee un procedimiento altamente productivo para seleccionar fármacos y compuestos químicos que modulan la actividad proliferativa de las enzimas de la presente invención, afectando de esta manera la división celular. Pueden seleccionarse bibliotecas de química combinatoria en busca de compuestos químicos que modulan la actividad proliferativa de estas enzimas. Pueden evaluarse fármacos y compuestos químicos en base a su capacidad para modular la actividad enzimática de las proteínas expresadas de manera endógena, incluyendo aquellas representadas por SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas. Las proteínas endógenas pueden obtenerse de muchos tejidos y células diferentes, tales como células del colon. También pueden evaluarse fármacos en base a su capacidad para unirse a las proteínas expresadas o endógenas representadas por SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas. La actividad enzimática puede ser generación de superóxido dependiente de NADPH o NADH catalizada por la holoproteína. La actividad enzimática puede también ser actividad de diaforasa dependiente de NADPH- o NADH- catalizada por la holoproteína o el dominio de flavoproteína.

Por dominio de flavoproteína, se entiende aproximadamente la mitad del extremo C terminal de las enzimas que se muestran en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas. Este fragmento de gp91phox tiene actividad reductasa dependiente de NADPH hacia citocromo c, nitroazul tetrazolio y otros colorantes. Pueden usarse proteínas expresadas o fragmentos de las mismas para seleccionar por medio de robótica bibliotecas de química combinatoria existentes. Sin la intención de estar ligados a la siguiente afirmación, se cree que el sitio de unión para NADPH o NADH y el sitio de unión para FAD son útiles para evaluar la capacidad de fármacos y otras composiciones para unirse a las enzimas mox y duox o para modular su actividad enzimática. Resulta de preferencia el uso de holoproteína o la mitad C terminal o regiones del extremo para desarrollar una selección de fármacos altamente productiva. Además, el tercio N terminal del domino duox (el dominio peroxidasa) puede también usarse para evaluar la capacidad de fármacos y otras composiciones para inhibir la actividad peroxidasa, y para desarrollar además una selección de fármacos altamente productiva.

La presente invención también provee anticuerpos dirigidos a las proteínas SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Los anticuerpos de la presente invención son útiles para una diversidad de objetivos incluyendo localización, detección y medición de las proteínas SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Los anticuerpos pueden usarse en equipos para lograr estos objetivos. Estos anticuerpos pueden también estar unidos a agentes citotóxicos para eliminar células selectivamente. El término anticuerpo supone la inclusión de cualquier clase de anticuerpo tales como IgG, IgM y otras clases. El término anticuerpo también incluye un anticuerpo completamente intacto y también fragmentos de los mismos, incluyendo pero no limitado a fragmentos Fab y fragmentos Fab + Fc.

La presente invención también provee las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, y fragmentos de las mismas. Estos nucleótidos son útiles para una diversidad de objetivos incluyendo localización, detección y medición de ARN mensajero involucrado en la síntesis de las proteínas representadas como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Estos nucleótidos pueden también usarse en la construcción de sondas marcadas para localización, detección y medición de ácidos nucleicos tal como ARN mensajero o alternativamente para el aislamiento de secuencias de nucleótidos más grandes conteniendo las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de las mismas. Estas secuencias de nucleótidos pueden usarse para aislar hebras homólogas de otras especies usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estas secuencias de nucleótidos pueden también usarse para generar sondas y hebras complementarias. Los nucleótidos pueden usarse en equipos para lograr estos objetivos.

Más particularmente, la presente invención incluye un procedimiento para modular el crecimiento modificando las proteínas representadas como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas.

El término "reguladores mitogénicos" como se usa en este documento significa cualquier molécula que actúa afectando la división celular.

El término "animal" como se usa en este documento significa animales no humanos de ambos sexos.

Los términos "un", "una" y "el" "la" como se usa en este documento significan uno o más e incluye el plural a menos que el contexto sea inapropiado.

"Proteínas", "péptidos,""polipéptidos" y "oligopéptidos" son cadenas de aminoácidos (típicamente L-aminoácidos) cuyos carbonos alfa están unidos a través de enlaces peptídicos formados por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alga de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. El aminoácido terminal en un extremo de la cadena (es decir, el amino terminal) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (es decir, el carboxi terminal) tiene un grupo carboxilo libre. Como tal, la expresión "amino terminal" (abreviado N terminal) se refiere al grupo alfa amino libre en el aminoácido en el extremo amino terminal de la proteína, o al grupo alfa amino (grupo imino cuando participa en un enlace peptídico) de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro de la proteína. De manera similar, la expresión "carboxi terminal" (abreviado C terminal) se refiere al grupo carboxilo libre en el aminoácido en el extremo carboxi terminal de una proteína, o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otra ubicación dentro de la proteína.

Típicamente, los aminoácidos que forman una proteína se numeran en orden, comenzando en el amino terminal y aumentando en dirección hacia el carboxi terminal de la proteína. Por ello, cuando se dice que un aminoácido "sigue" a otro, ese aminoácido está ubicado más cerca al extremo carboxi terminal de la proteína que el aminoácido precedente.

El término "resto" se usa en este documento para referirse a un aminoácido (D o L) o a un mimético de aminoácido que se incorpora en una proteína por medio de un enlace amida. Como tal, el aminoácido puede presentarse naturalmente o, a menos que esté limitado de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de manera similar a los aminoácidos que se presentan naturalmente (es decir, miméticos de aminoácidos). Más aún, un mimético de enlace amida incluye modificaciones del esqueleto peptídico bien conocidas por los expertos en la técnica.

Además, un experto reconocerá que, como se mencionó anteriormente, sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, agregan o quitan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos del 5%, más típicamente menos del 1%) en una secuencia codificada son variaciones modificadas de manera conservativa cuando las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativa que proveen aminoácidos con funcionalidad similar son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas para el otro:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparagina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Cuando los péptidos son relativamente cortos (es decir, menos de aproximadamente 50 aminoácidos), frecuentemente se sintetizan usando técnicas químicas convencionales de síntesis de péptidos. La síntesis en fase sólida en la que el aminoácido C terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido por el agregado secuencial de los restantes aminoácidos en la secuencia es un procedimiento de preferencia para la síntesis química de los epítopes antigénicos descritos en este documento. Las técnicas para síntesis en fase sólida son conocidas por los expertos en la técnica.

Como alternativa, los epítopes antigénicos descritos en este documento se sintetizan usando procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes. Generalmente, esto incluye la creación de una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido o proteína, colocando el ácido nucleico en un módulo de expresión bajo el control de un promotor particular, expresando el péptido o proteína en un huésped, aislando el péptido o proteína expresada y, si es necesario, renaturalizando el péptido o proteína. En la bibliografía pueden encontrarse suficientes técnicas para guiar a un experto a través de tales procedimientos.

Cuando varios fragmentos deseados de proteínas o péptidos están codificados en la secuencia de nucleótidos incorporada en un vector, un experto en la técnica apreciará que los fragmentos de proteínas o péptidos pueden estar separados por moléculas espaciadoras tales como, por ejemplo, un péptido constituido por uno o más aminoácidos. Generalmente, el espaciador no tendrá otra actividad biológica más que unir los fragmentos deseados de proteína o péptidos, o conservar una distancia mínima u otra relación espacial entre ellos. Sin embargo, los aminoácidos que constituyen el espaciador pueden seleccionarse para tener influencia sobre alguna propiedad de la molécula tal como plegamiento, carga neta o hidrofobicidad. Pueden construirse dentro del vector secuencias de nucleótidos que codifican la producción de restos que pueden ser útiles en la purificación de proteínas. Tales secuencias son conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede agregarse una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia polihistidina a un vector para facilitar la purificación de la proteína recombinante expresada en una columna de níquel.

Una vez expresados, los péptidos, polipéptidos y proteínas recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Resultan de preferencia las composiciones sustancialmente puras con aproximadamente 50 a 99% de homogeneidad, y para uso como agentes terapéuticos resulta de preferencia una homogeneidad de entre 80 y 95% o más.

Un experto en la técnica reconocerá que tras la síntesis química, expresión biológica o purificación, las proteínas deseadas o fragmentos de las mismas pueden tener una conformación sustancialmente diferente de las conformaciones de las proteínas nativas, fragmentos y péptidos de las mismas. En este caso, con frecuencia es necesario desnaturalizar y reducir la proteína y a continuación provocar nuevamente el plegamiento de la proteína para lograr la conformación de preferencia. Los expertos en la técnica conocen procedimientos para reducir y desnaturalizar proteínas e inducir el plegamiento.

Las construcciones genéticas de la presente invención incluyen secuencias codificadoras para diferentes proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos. Las construcciones genéticas también incluyen epítopes o dominios elegidos para permitir la purificación o detección de la proteína expresada. Tales epítopes o dominios incluyen secuencias de ADN que codifican el dominio de unión de glutatión de la glutatión S-transferasa, hexahistidina, tioredoxina, antígeno hemaglutinina, proteína de unión a maltosa y otras comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. La construcción genética de preferencia incluye las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, o fragmentos de las mismas. Debe entenderse que pueden incluirse secuencias de nucleótidos adicionales o alternativas en las construcciones genéticas con el fin de codificar los siguientes: a) múltiples copias de las proteínas deseadas; b) diversas combinaciones de las proteínas, fragmentos de las mismas o péptidos deseados; y c) modificaciones conservativas de las proteínas, fragmentos de las mismas o péptidos deseados. Las proteínas de preferencia incluyen la proteína mox1 humana y la proteína mox2 humana como se muestra en SEQ ID Nº 2 y fragmentos de las mismas. Algunos fragmentos de preferencia de la proteína mox1 humana (SEQ ID Nº 2) incluyen pero no están limitados a las proteínas mostradas como SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 24, y SEQ ID Nº 25. En esta solicitud, la proteína mox1 es también llamada p65mox. Otra proteína de preferencia de la presente invención es la proteína mox1 de rata, mostrada como SEQ ID Nº 21 y fragmentos de la misma. Otra proteína de preferencia de la presente invención es la proteína mox1 B de rata, mostrada como SEQ ID Nº 42 y fragmentos de la misma.

La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede usarse también para hibridar a ácidos nucleicos tales como secuencia de nucleótidos de ADN o ARN bajo condiciones de alta rigurosidad que permiten la detección, por ejemplo, de mensajes empalmados alternativamente.

La construcción genética se expresa en un sistema de expresión tal como en células NIH 3T3 usando secuencias recombinantes en un vector pcDNA-3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para producir una proteína recombinante. Los sistemas de expresión de preferencia incluyen, pero no se limitan a células Cos-7, células de insecto usando baculovirus recombinantes, y levaduras. Debe entenderse que para la expresión de construcciones genéticas de la presente invención pueden usarse otros sistemas de expresión conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas de preferencia de la presente invención son las proteínas llamadas en este documento mox1 humana y mox2 humana o fragmentos de las mismas que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4, respectivamente, o una secuencia de aminoácidos con sustituciones de aminoácidos como se definieron anteriormente y que no alteran significativamente la función de la proteína recombinante en una manera adversa. Otra proteína de preferencia de la presente invención es llamada en este documento mox1 de rata y tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº 21. Otra proteína más de preferencia de la presente invención es llamada en este documento mox1B de rata y tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº 42.

Terminología

Debería entenderse que parte de la terminología usada para describir las proteínas mox nuevas contenida en este documento es diferente de la terminología usada en la Solicitud Provisional de EEUU Nº de Serie 60/149.332 sobre la que esta solicitud reivindica prioridad en parte. Como se describe en este documento, la expresión "mox2 humana" se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en SEQ ID Nº 4, o un fragmento de la misma, y codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Nº 3, o un fragmento de la misma. o fragmentos de la misma.

Construcción del Gen Recombinante

Se une el gen deseado a un vector de transferencia, tal como pcDNA3, y se usan los recombinantes para transformar células huésped tales como células Cos-7. Deberá entenderse que pueden usarse diferentes vectores de transferencia, células huésped y procedimientos de transfección conocidos comúnmente por los expertos en la técnica. En SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22 y SEQ ID Nº 41 se muestran seis genes deseados para uso en la transfección. Por ejemplo, se usó transfección mediada por lipofectamina y recombinación homóloga para introducir el gen de mox1 en células
NIH 3T3.

Se clona el gen sintético y se produce la construcción recombinante conteniendo el gen de mox en cultivos de monocapas confluentes de una línea celular Cos-7. Posteriormente se purifica la proteína recombinante expresada, de preferencia usando técnicas de cromatografía por afinidad, y se determina su pureza y especificidad por medio de procedimientos conocidos.

Puede usarse una diversidad de sistemas de expresión para la proteína recombinante. Tales procedimientos de expresión incluyen, pero no se limitan a los siguientes: sistemas de expresión bacterianos, incluyendo aquellos que usan E. coli y Bacillus subtilis; sistemas virales; sistemas de expresión en levaduras; células cultivadas de insectos y de mamíferos; y otros sistemas de expresión conocidos por los expertos en la técnica.

Transfección de Células

Debe entenderse que los vectores de la presente invención pueden transfectarse en cualquier célula o línea celular deseada. Tanto la transfección de células in vivo como in vitro están contempladas como parte de la presente invención. Las células de preferencia para transfección incluyen pero no se limitan a las siguientes: fibroblastos (posiblemente para mejorar la cicatrización de heridas y la formación de piel), granulocitos (posible beneficio para aumentar la función en un sistema inmune comprometido como puede verse en SIDA y en anemia aplásica), células musculares, neuroblastos, células madre, células de médula ósea, osteoblastos, linfocitos B y linfocitos T.

Las células pueden transfectarse con una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica e incluyen pero no se limitan a los siguientes: electroporación, pistola de genes, fosfato de calcio, lipofectamina y fugene, así como sistemas de transfección adenoviral.

Se usan células transfectadas con los ácidos nucleicos representados en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41 o fragmentos de los mismos, para expresar las proteínas SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, respectivamente, o fragmentos de las mismas.

Estas proteínas expresadas se usan para obtener anticuerpos. Estos anticuerpos pueden usarse para una diversidad de aplicaciones que incluyen pero no se limitan a inmunoterapia contra cánceres que expresan una de las proteínas mox, y para detección, localización y medición de las proteínas que se muestran en SEQ ID Nº 2, SEQ 1 D NO-21, SEQ 1 D Nº 42, o fragmentos de las mismas.

Purificación y Caracterización de la Proteína Expresada

Las proteínas de la presente invención pueden expresarse como una proteína de fusión con un componente polihistidina, tal como una hexahistidina, y purificarse por unión a una columna de afinidad de metales usando matrices de afinidad de níquel o cobalto. La proteína puede también expresarse como una proteína de fusión con glutatión S-transferasa y purificarse por medio de cromatografía de afinidad usando una matriz de glutatión agarosa. La proteína puede purificarse también por cromatografía de inmunoafinidad expresándola como una proteína de fusión, por ejemplo con antígeno hemaglutinina. La proteína expresada o que se presenta naturalmente puede también purificarse por medio de procedimientos cromatográficos y de purificación convencionales que incluyen la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico, cromatografía de exclusión en gel, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía de unión a colorantes, precipitación con sulfato de amonio, precipitación en disolventes orgánicos u otras técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica.

Procedimientos para Evaluar la Actividad de las Proteínas Expresadas

Se dispone de diferentes procedimientos para evaluar la actividad de las proteínas expresadas de la presente invención, que incluyen pero no se limitan a las proteínas representadas como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, análogos sustituidos de las mismas y fragmentos de las mismas.

1. Ensayos de la holoproteína y fragmentos de la misma para la generación de superóxido A. Consideraciones generales

Estos ensayos son útiles para evaluar la eficacia de fármacos diseñados para modular la actividad de las enzimas de la presente invención. La holoproteína puede expresarse en células COS-7, células NIH 3T3, células de insectos (usando tecnología baculoviral) u otras células usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Se usan fracciones de membrana o proteínas purificadas para el ensayo. El ensayo puede necesitar o puede aumentarse por otras proteínas celulares tales como p47phox, p67phox, y Rac1, así como potencialmente otros factores no identificados (por ejemplo, quinasas u otras proteínas reguladoras).

B. Reducción de citocromo c

Se usa NADPH o NADH como sustrato reductor, en una concentración de aproximadamente 100 \muM. La reducción de citocromo c se controla por medio de espectrofotometría mediante el incremento de la absorbancia a 550 nm, asumiendo un coeficiente de extinción de 21 mM^{-1} \cdot cm^{-1}. El ensayo se realiza en ausencia y en presencia de aproximadamente 10 \mug de superóxido dismutasa. La reducción dependiente de superóxido se define como la reducción de citocromo c en ausencia de superóxido dismutasa menos la reducción en presencia de superóxido dismutasa (Uhlinger y col. (1991) J. Biol. Chem. 266, 20990-20997). Puede usarse también citocromo c acetilado, ya que se piensa que la reducción de citocromo c acetilado es exclusivamente a través de superóxido.

C. Reducción de nitroazul de tetrazolio

Para la reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT), se usa el mismo protocolo general, excepto que se usa NBT en vez de citocromo c. En general, se agrega aproximadamente 1 ml de nitroazul de tetrazolio al 0,25% filtrado (Sigma, St. Louis, MO) en tampón de Hanks sin o con aproximadamente 600 Unidades de superóxido dismutasa (Sigma) y se incuban las muestras a aproximadamente 37ºC. El NBT oxidado es claro, mientras que el NBT reducido es azul e insoluble. Se recoge el producto insoluble por centrifugación, se suspende la pella en aproximadamente 1 ml de piridina (Sigma) y se calienta durante aproximadamente 10 minutos a 100ºC para disolver el NBT reducido. Se determina la concentración de NBT midiendo la absorbancia a 510 nm, usando un coeficiente de extinción de
11.000 M^{-1} \cdot cm^{-1}. Los pocillos no tratados se usaron para determinar el número de células.

D. Luminiscencia

La generación de superóxido puede controlarse también con un sistema de detección de quimioluminiscencia que usa lucigenina (nitrato de bis-N-metilacridinio, Sigma, St. Louis, MO). Se mezcla la muestra con aproximadamente 100 \muM de NADPH (Sigma, St. Louis, MO) y 10 \muM de lucigenina (Sigma, St. Louis, MO) en un volumen de aproximadamente 150 \mul de solución de Hanks. Se controla la luminiscencia en una placa de 96 pocillos usando un LumiCounter (Packard, Downers Grove, IL) durante 0,5 segundos por lectura en intervalos de aproximadamente 1 minuto para un total de aproximadamente 5 minutos; el valor estable más elevado en cada serie de datos se usa para comparación. Como anteriormente, se agrega superóxido dismutasa a algunas muestras para probar que la luminiscencia se produce a partir del superóxido. Se resta un blanco de tampón de cada lectura (Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 23317-23321).

E. Ensayos en células intactas

Los ensayos para generación de superóxido generación pueden llevarse a cabo usando células intactas, por ejemplo, las células NIH 3T3 transfectadas con mox. En principio, cualquiera de los ensayos anteriores puede usarse para evaluar la generación de superóxido usando células intactas, por ejemplo las células NIH 3T3 transfectadas con mox. Un procedimiento de preferencia es la reducción de NBT.

2. Ensayos de proteínas truncadas que comprenden aproximadamente los 256 restos aminoácido del extremo C terminal

Sin pretender estar ligados a la siguiente afirmación, no se espera que la proteína truncada que comprende aproximadamente los 265 restos aminoácido del extremo C terminal genere superóxido, y por lo tanto, no se agrega superóxido dismutasa en los ensayos de proteína truncada. Básicamente, se establece un ensayo similar y se examina la reducción independiente de superóxido de NBT, citocromo c, diclorofenolindofenol, ferricianuro u otro colorante activo por redox.

Sondas de Nucleótidos y Ácidos Nucleicos

Las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, así como los fragmentos de las mismas y cebadores de PCR de las mismas, pueden usarse, respectivamente, para localización, detección y medición de ácidos nucleicos relacionados con SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41 así como fragmentos de los mismos. La secuencia de nucleótidos SEQ ID Nº 1 es llamada también gen mox1 humano en esta solicitud. La SEQ ID Nº 22 es conocida también como el gen de mox1 de rata en esta solicitud. La SEQ ID Nº 41 es conocida también como el gen mox1B de rata en esta solicitud.

Las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41 así como fragmentos de las mismas, pueden usarse para crear sondas para aislar secuencias de nucleótidos más largas conteniendo las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22 y SEQ ID Nº 41 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, así como fragmentos de las mismas, pueden usarse también para crear sondas para identificar y aislar proteínas mox de otras especies.

Los ácidos nucleicos descritos en este documento incluyen ARN mensajero que codifica la producción de SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Tales ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a sondas de ADNc. Estas sondas pueden estar marcadas en una diversidad de formas conocidas por los expertos en la técnica. Tales procedimientos incluyen pero no se limitan a marcado isotópico y no isotópico. Pueden usarse estas sondas para hibridación in situ para localización de ácidos nucleicos tal como ARNm que codifica SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de los mismos. La localización puede realizarse usando hibridación in situ a nivel de resolución ultraestructural y a nivel de microscopía óptica usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Estas sondas pueden también usarse para detectar y cuantificar ácidos nucleicos y niveles de ARNm usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen pero no se limitan a hibridación de solución.

Producción de Anticuerpos

Las proteínas que se muestran en SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas, se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica y administrarla a animales para la producción de anticuerpos policlonales usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los animales de preferencia para la producción de anticuerpos son conejos y ratones. Pueden usarse otros animales para inmunización con estas proteínas o fragmentos de las mismas; ovejas, caballos, cerdos, burros, vacas, monos y roedores tales como cobayas y ratas.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se usa en este documento para significar cualquier líquido incluyendo pero no limitado a agua o solución salina, aceite, gel, bálsamo, disolvente, diluyente, base de ungüento fluido, liposoma, micela, micela gigante y similares, que es adecuado para uso en contacto con animales o tejidos humanos vivos sin causar respuestas fisiológicas adversas, y que no interactúa con los otros componentes de la composición de manera perjudicial.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias y pueden prepararse por medio de técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo y el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con los vehículos líquidos.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que otorgan a la formulación isotonicidad con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse liofilizadas requiriendo sólo el agregado del vehículo estéril líquido, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente previo al uso. Las suspensiones y soluciones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos comúnmente usados por un experto en la técnica.

Las formulaciones de dosificación unitaria de preferencia son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción adecuada de las misma, del ingrediente administrado. Debería entenderse que en el agregado de otros ingredientes, particularmente mencionados anteriormente, la presente invención puede incluir otros agentes comúnmente usados por los expertos en la técnica. La composición farmacéutica puede administrarse a través de diferentes vías, tales como oral, incluyendo bucal y sublingual, rectal, parenteral, aerosol, nasal, intramuscular, subcutánea, intradérmica y tópica. La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse en diferentes formas, incluyendo pero no limitado a soluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas, partículas, nanopartículas y liposomas. Se espera que se necesiten desde aproximadamente 1 hasta 7 dosificaciones por régimen de inmunización. Las inyecciones iniciales pueden variar desde aproximadamente 0,1 hasta 1 mg, con un intervalo de preferencia desde aproximadamente 1 \mug hasta 800 \mug, y un intervalo de más preferencia desde aproximadamente 25 \mug hasta 500 \mug. Las inyecciones de estímulo pueden variar desde 0,1 \mug hasta 1 mg, con un intervalo de preferencia de aproximadamente 1 \mug a 800 \mug, y de más preferencia desde aproximadamente 10 \mug hasta 500 \mug.

El volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración y el tamaño del receptor. Por ejemplo, las inyecciones intramusculares pueden variar desde aproximadamente 0,1 ml hasta 1,0 ml.

La composición farmacéutica puede almacenarse a temperaturas desde aproximadamente 4ºC hasta -100ºC. La composición farmacéutica puede también almacenarse en estado liofilizado a diferentes temperaturas incluyendo temperatura ambiente. La composición farmacéutica puede esterilizarse a través de medios convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a filtración, radiación y calor. La composición farmacéutica de la presente invención puede también combinarse con agentes bacteriostáticos, tal como timerosal, para inhibir el crecimiento bacteriano.

Adyuvantes

Puede administrarse una diversidad de adyuvantes conocidos por los expertos en la técnica en conjunción con la proteína en la composición farmacéutica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a los siguientes: polímeros, copolímeros tales como copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, incluyendo copolímeros de bloque; polímero P1005; adyuvante completo de Freund (para animales); adyuvante incompleto de Freund; sorbitán monooleato; escualeno; adyuvante CRL-8300; alum; QS 21, dipéptido de muramilo; trehalosa; extractos bacterianos, incluyendo extractor de micobacterias; endotoxinas detoxificadas; lípidos de membrana; o combinaciones de los mismos.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridomas de acuerdo con los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los anticuerpos son útiles como reactivos de diagnóstico o investigación o pueden usarse para inmunización pasiva. La composición puede opcionalmente contener un adyuvante.

Los anticuerpos policlonales y monoclonales útiles como reactivos de diagnóstico o investigación pueden usarse para la detección y medición de SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, y fragmentos de las mismas. Tales anticuerpos pueden usarse para detectar estas proteínas en una muestra biológica, incluyendo pero no limitado a muestras tales como células, extractos celulares, tejidos, extractos tisulares, biopsias, tumores y fluidos biológicos. Tal capacidad de detección es útil para detectar enfermedades relacionadas con estas proteínas para facilitar el diagnóstico y pronóstico y para sugerir posibles alternativas de tratamiento.

La detección puede lograrse a través del uso de inmunocitoquímica, ELISA, radioinmunoensayo u otros ensayos comúnmente conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas mox1, mox2, duox1 y duox2, o fragmentos de las mismas, pueden marcarse a través de técnicas comúnmente conocidas que incluyen pero no se limitan a las siguientes: radiomarcado, colorantes, partículas magnéticas, biotina-avidina, moléculas fluorescentes, moléculas y sistemas quimioluminiscentes, ferritina, oro coloidal y otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica de marcado de proteínas.

Administración de Anticuerpos

Los anticuerpos dirigidos a las proteínas mostradas como SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o dirigidos a fragmentos de las mismas, pueden también administrarse directamente a seres humanos y animales en un paradigma de inmunización pasiva. Los anticuerpos dirigidos a porciones extracelulares de SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, se unen a estos epítopes extracelulares. La unión de marcadores a estos anticuerpos facilita la localización y visualización de los sitios de unión. La unión a estos anticuerpos de moléculas tales como ricina u otras citotoxinas ayuda a dañar o matar selectivamente células que expresan SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 42, o fragmentos de las mismas.

La presente invención incluye equipos útiles con los anticuerpos, ácidos nucleicos, sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos marcados, proteínas marcadas o fragmentos de las mismas para la detección, localización y medición de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 42, o combinaciones y fragmentos de las mismas.

Los equipos pueden usarse para inmunocitoquímica, hibridación in situ, hibridación en solución, radioinmunoensayo, ELISA, reacciones de transferencia Western, PCR cuantitativa y otros ensayos para la detección, localización y medición de estos ácidos nucleicos, proteínas o fragmentos de las mismas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22; SEQ ID Nº 41 o fragmentos de las mismas, pueden también usarse bajo condiciones de rigurosidad alta para detectar mensajes empalmados alternativamente relacionados con SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41 o fragmentos de las mismas, respectivamente.

Como se discutió en uno de los Ejemplos, la proteína mox1 (SEQ ID Nº 21) es similar a la proteína gp91 de ratón (SEQ ID Nº 38), mientras que la proteína mox1B de rata (SEQ ID Nº 42) es similar a la proteína gp91 humana (SEQ ID Nº 12). Esta observación sugiere que pueden existir otras isoformas de gp91 de ratón y humana. Además, también existe otro subtipo de mox1 humana similar a mox1B de rata (SEQ ID Nº 42). La presencia de dos isoformas de proteína mox1 de rata en músculo liso vascular puede tener consecuencias fisiológicas y aplicaciones biomédicas importantes. Por ejemplo, las dos isoformas pueden tener diferentes actividades biológicas, diferente distribución tisular y pueden estar reguladas de manera diferente en condiciones fisiológicas y/o patológicas. El hecho de que se aislara mox1B (SEQ ID Nº 42) de células expuestas a angiotensina II, conocida por promover el estrés oxidativo y crecimiento vascular, sugiere que podría ser regulada positivamente por esta hormona y que podría haber sobreexpresión en la enfermedad. Por consiguiente, los equipos para diagnóstico de la presente invención pueden medir la expresión relativa de las dos isoformas de mox. Los equipos para diagnóstico pueden también medir o detectar la expresión relativa de las proteínas mox descritas en este documento (es decir, mox1 humana y/o mox2 humana).

Los fragmentos de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 41 que contienen la secuencia de hibridación relevante pueden sintetizarse sobre la superficie de una matriz de chip. Posteriormente se marcan fluorescentemente muestras de ADN, por ejemplo de tumores, y se hibridan en el chip para detección. Este enfoque puede usarse como diagnóstico para caracterizar los tipos de tumores y para diseñar tratamientos y/o proveer información acerca del pronóstico. Tal información sobre el pronóstico puede tener valor predictivo con relación a la progresión de la enfermedad y expectativa de vida y puede también afectar la elección del tratamiento.

La presente invención se ilustra además con los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Análisis de Secuencias y Clonación de ADNc de mox1 Humana (SEQ ID Nº 1) que Codifica la Producción de la Proteína mox1 Humana p65mox (SEQ ID Nº 2)

Usando gp91 como secuencia consultada, una porción secuenciada de 334 bases de la secuencia tag expresada (EST) 176696 (GenBank Número de Acceso AA305700) mostró 68,8% de identidad de secuencia al nivel predicho de aminoácidos con (h) gp91phox humana. Se adquirió la cepa bacteriana número 129134 conteniendo la secuencia EST en el vector pBluescript SK, en la American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Se clonó la secuencia EST originalmente de la línea celular de carcinoma de colon Caco-2 humana. Además se secuenció el ADN de EST176696 usando los promotores y cebadores T7 y T3 de los vectores, diseñados para coincidir con la secuencia 3' conocida. Los cebadores internos usados para la secuenciación fueron los siguientes: 5'-AAC AAG CGT GGC TTC AGC ATG-3' SEQ ID Nº 5 (251S, la numeración está basada en los nucleótidos a partir del extremo 5' de EST176696, y S indica la dirección con sentido), 5'-AGC AAT ATT GTT GGT CAT-3' SEQ ID Nº 6 (336S), 5'-GAC TTG ACA GAA AAT CTA TAA GGG-3' SEQ ID Nº 7 (393S), 5'-TTG TAC CAG ATG GAT TTC AA-3' SEQ ID Nº 8 (673A, A indica la dirección antisentido), 5'-CAG GTC TGA AAC AGA AAA CCT-3' SEQ ID Nº 9 (829S), 5'ATG AAT TCT CAT TAA TTA TTC AAT AAA-3' SEQ ID Nº 10 (1455A).La secuencia codificadora en EST176696 mostró homología con una extensión de 250 aminoácidos correspondiente al 44% del extremo N terminal de gp91phox humana, y contenía un codón de finalización correspondiente con la localización en gp91phox humana. La amplificación 5' rápida de extremos de ADNc (RACE) se llevó a cabo usando una biblioteca de ADNc de colon humano y el equipo de amplificación Marathon cDNA Amplification Kit (CIonTech) usando 5'-ATC TCA AAA GAC TCT GCA CA-3' SEQ ID Nº 11(41A) como cebador interno específico de gen (Frohman y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002). La 5' RACE dio como resultado un fragmento de 1,1 kb que representa la secuencia 5' completa, basado en la homología con gp91phox. La reamplificación se realizó con cebadores abarcando los codones de inicio putativo y de terminación, usando el producto de 5' RACE de 1,1 kb y pSK-EST176696 para el diseño del cebador. El fragmento amplificado de 1,7 kb se clonó por clonación TA en el vector PCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Nos referimos a este vector recombinante como PCR-mox.

La Figura 1 (a-d) presenta una comparación de las secuencias presentes de aminoácidos de gp91phox humana, bovina y murina con las proteínas mox1 humana y de rata de la presente invención y la proteína duox2 humana de la presente invención. También se muestran las secuencias de aminoácidos para proteínas enzimáticas relacionadas con plantas.

La hp65mox codificada (refiriéndose "mox" a oxidasa mitogénica y "65" a su peso molecular predicho) se presenta como SEQ ID Nº 2. h-gp91phox (SEQ ID Nº 12) y SEQ ID Nº 2 difieren en longitud por 3 restos y son una 70% idénticas en su secuencia de aminoácidos. h-gp91phox y SEQ ID Nº 2 muestran un porcentaje de identidad mayor en la mitad C terminal de la molécula que contiene los sitios de unión a NADPH y FAD putativos, y existen diversas extensiones relativamente largas con identidad completa dentro de esta región.

Un dendrograma (Figura 2) que compara las secuencias de aminoácidos de gp91phox de ratón y humana con la secuencia de mox1 SEQ ID Nº 2 muestra que la última probablemente representa una isoforma distinta de gp91phox. También se indican dos homólogos de la subunidad grande de citocromo b558 de plantas y representan relaciones más distantes con las secuencias humanas. La humana (y mox1 de rata más extensamente descrita a continuación) carece de sitios de glicosilación unidos a asparagina, que se observan en las gp91phox altamente glicosiladas de humano y de ratón. Además, los perfiles de hidrofobicidad de gp91phox humana y mox1 son prácticamente idénticos e incluyen cinco extensiones hidrófobas en la mitad amino terminal de las moléculas que se predice que son regiones que abarcan la membrana.

Ejemplo 2 Expresión de Mox1

Se hibridaron membranas de transferencia northern (MTN) y Human MTN Blot IV (CIonTech) de múltiples tejidos humanos con la región codificadora putativa del vector PCR-mox a 68ºC durante varias horas. La región que codifica mox se marcó por cebado aleatorio con [\alpha-^{32}P]dCTP (10 \muCi) usando el equipo Prime-It II (Stratagene). Para el análisis de expresión de mox1 en líneas celulares, se preparó ARN total a partir de 10^{6} células usando el equipo High Pure RNA Isolation Kit (Boehringer Mannheim) o el equipo RNeasy (Quiagen). Se separó el ARN total (10-20 \mug) en un minigel de agarosa 1% y formaldehído y se transfirió a un filtro Nytran (Biorad) y se inmovilizó por entrecruzamiento con luz ultravioleta.

La transferencia Northern reveló que la mayor localización de ARNm que codifica la proteína mox1 fue el colon. También se detectó el mensaje en próstata y útero. La línea celular de carcinoma de colon humano, Caco-2, también expresó grandes cantidades de mensaje de mox1. La transferencia Northern de ARNm de células de músculo liso de aorta de rata también mostraron fuerte hibridación, que aumentó al doble en 12 horas tras el tratamiento con factor de crecimiento derivado de plaquetas. Este aumento en la expresión de mox1 de rata es coherente con idea de que mox1 contribuye con los efectos estimulantes del crecimiento de PDGF.

Ejemplo 3 Transfección de Células NIH3T3 con SEQ ID Nº 1

Se subclonó la secuencia de nucleótidos (SEQ ID Nº 1) que codifica la producción de la proteína mox1 (SEQ ID Nº 2) en el sitio Not1 del vector pEF-PAC (obtenido en Mary Dinauer, Indiana University Medical School, Indianapolis, IN) que tiene un gen de resistencia a la puromicina. La transfección se realizó como describen Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volúmenes 1-3, 2º edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.,1989. Se transfectaron la SEQ ID Nº 1 en pEF-PAC y el vector vacío por separado en células NIH 3T3 usando Fugene 6 (Boeringer Mannheim). Se transfectaron aproximadamente 2 x 10^{6} células mantenidas en DMEM conteniendo 10% de suero de ternera con 10 \mug de ADN. Tras 2 días, se separaron las células y se seleccionaron en el mismo medio conteniendo 1 mg/ml de puromicina. Se subcultivaron las colonias supervivientes durante 10 a 14 días continuamente en presencia de puromicina.

Las células transfectadas exhibieron una morfología de tipo "transformada", similar a la observada con células transfectadas con (V12)Ras, caracterizadas por células similares a husos largos. Las células originales NIH 3T3 o células transfectadas con vectores vacíos mostraron morfología similar a fibroblastos.

Ejemplo 4 Expresión de Mox1 (SEQ ID Nº 1) en Células NIH 3T3 Transfectadas

Para verificar la expresión de ARNm de mox1 tras la transfección, se realizaron RT-PCR y transferencias Northern. Se preparó ARN total a partir de 10^{6} células usando el equipo High Pure RNA Isolation Kit (Boeringer Mannheim) o el equipo RNeasy (Qiagen), se prepararon DNAc de cada colonia a partir de 1-2 \mug de ARN total usando un equipo Advantage RT-PCR Kit (CIonTech). La amplificación por PCR se realizó usando cebadores, 5'-TTG GCTAAATCC CAT CCA-3' SEQ ID Nº 13 (NN459S, los números que tienen NN indican numeración a partir del codón de inicio de mox1) y 5'-TGC ATG ACC AAC AAT ATT GCT G-3' SEQ ID Nº 14 (NN1435A). Para la transferencia Northern, se separaron 10-20 \mug de ARN total en un gel de agarosa 1% y formaldehído y se transfirió a un filtro de nylon. Tras el entrecruzamiento por ultravioleta (UV), se usaron los filtros para en ensayo de transferencia Northern como se describió en el Ejemplo 2.

Se eligieron las colonias que expresaron la mayor cantidad de ARNm de mox1 para otros análisis. La expresión de ARNm para gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa fue normal en diversas líneas celulares.

Ejemplo 5 Formación de Colonias en Agar Blando

Se prepararon 10^{5} a 10^{3} células transfectadas de manera estable con gen de mox1 humana SEQ ID Nº 1 y con el vector vacío en solución al 0,3% de agar caliente (40ºC) conteniendo DMEM y 10% de suero de ternera. Se distribuyeron las células en placas de agar al 0,6% endurecido preparadas con DMEM y 10% de suero de ternera. Tras tres semanas en cultivo (37ºC, 5% de CO_{2}) se observó la formación de colonias por microscopía.

Las células transfectadas de manera estable con el vector vacío y cultivadas en agar blando durante 3 semanas como anteriormente, no mostraron crecimiento independiente del anclaje. Por el contrario, las células NIH 3T3 transfectadas de manera estable con mox1 (SEQ ID Nº 1) y cultivadas durante 3 semanas en agar blando demostraron crecimiento de colonias independiente del anclaje.

Ejemplo 6 Ensayo de Generación de Superóxido Dependiente de NADPH

En una forma de realización de la presente invención, se analizaron células NIH 3T3 transfectadas de manera estable con el gen de mox1 humana (SEQ ID Nº 1) para la generación de superóxido usando el ensayo de luminiscencia con lucigenina (Bis-N-metilacridinio) (Sigma, St. Louis, MO, Li y col. (1998) J. Biol. Chem. 273, 2015-2023). Se lavaron las células con solución de HANK fría y se homogeneizaron en tampón de HANHS conteniendo 15% de sacarosa sobre hielo usando un homogeneizador Dounce. Se congelaron inmediatamente los lisados celulares en un baño de hielo seco/etanol. Para el ensayo, se mezclaron 30 \mug de lisado celular con 200 \muM de NADPH y 500 \muM de lucigenina. Se controló la luminiscencia usando un LumiCounter (Packard) en tres intervalos sucesivos de un minuto y se usó el valor más elevado para comparación. Se determinó la concentración de proteína por el método de Bradford.

Se controló la generación de superóxido en lisados de algunas de las líneas celulares transfectadas y se comparó con la generación de superóxido en los lisados de células NIH 3T3 no transfectadas. Los resultados se muestran en la Tabla 4. Las líneas celulares 26, 27 y 28 dieron el mayor grado de cambios morfológicos por examen microscópico correspondiendo a los mayores grados de generación de superóxido. Se inhibió la señal luminiscente por medio de superóxido dismutasa y el inhibidor general de flavoproteínas difenilen yodonio, pero no se vio afectada por el agregado de p47phox, p67phox y Rac1 (GTP-\gammaS) recombinantes humanas, que son factores citosólicos esenciales para la oxidasa de explosión respiratoria de fagocitos.

TABLA 4

102

En una forma de realización alternativa de preferencia de la presente invención, se cultivaron las células transfectadas de manera estable con mox1(YA28) o con vector vacío (NEF2) en placas de cultivo tisular de 10 cm en medio conteniendo DMEM, 10% de suero de ternera, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y 1 \mug/ml de puromicina hasta una confluencia de aproximadamente 80%. Se lavaron las células (cinco placas de cultivo tisular de cada tipo celular) ligeramente con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación se disociaron de las placas con PBS conteniendo 5 mM de EDTA. Se sedimentaron las células por centrifugación breve
a 1000 g.

Para permeabilizar las células, se llevó a cabo la lisis por congelación-descongelación y posteriormente se pasaron las células a través de una aguja de pequeño calibre. Se retiraron los sobrenadantes y se congelaron las células en hielo seco durante 15 minutos. Tras descongelar las células, se agregaron 200 \mul de tampón de lisis (Solución Salina Tamponada de HANK HBBS) conteniendo una mezcla de inhibidores de proteasas de Sigma (Nº de Catálogo: P2714). Se pasaron las células en hielo 10 veces a través de una aguja de calibre 18 y se agregaron 200 \mul de tampón HBBS conteniendo 34% de sacarosa para dar una concentración final de sacarosa de 17%. Aparentemente la sacarosa mejora la estabilidad tras el almacenamiento. La combinación de congelación-descongelación y el pasaje a través de la aguja da como resultado la lisis de esencialmente todas las células, a este material lo llamamos "lisado celular".

Se ensayaron los lisados celulares para obtener la concentración de proteína usando el sistema de ensayo de proteínas de BioRad. Se analizaron los lisados celulares para quimioluminiscencia dependiente de NADPH combinando tampón HBBS, ácido araquidónico y 0,01-1 \mug de proteína en las placas de ensayo (placas de plástico de 96 pocillos). Se inició la reacción agregando 1,5 mM de NADPH y 75 \muM de lucigenina a la mezcla del ensayo para dar una concentración final de 200 \muM de NADPH y 10 \muM de lucigenina, y se controló inmediatamente la quimioluminiscencia. El volumen final del ensayo fue de 150 \mul. La concentración óptima de ácido araquidónico fue de entre 50 y 100 \muM. Se usó un luminómetro Packard Lumicount para medir la quimioluminiscencia de la reacción entre lucigenina y superóxido a 37ºC. Se controló la placa continuamente durante 60 minutos y se usó el valor máximo de unidad relativa de luminiscencia (RLU) para el gráfico.

La Figura 3 muestra RLU en varias concentraciones de lisados celulares de células transfectadas con mox1 (YA28) y células control de vector (NEF2). La presencia de NaCl o KCI dentro del intervalo de concentraciones de 50-150 \muM es importante para la actividad óptima. MgCl_{2} (1-5 mM) además mejoró la actividad en aproximadamente 2 veces. Este ensayo libre de células para actividad NADPH oxidasa de mox1 es útil para seleccionar moduladores (inhibidores o estimuladores) de la enzima mox1. El ensayo puede usarse también para detectar actividad NADPH oxidasa de mox y duox en general y para seleccionar moduladores (inhibidores o estimuladores) de la familia de enzimas mox y duox.

Ejemplo 7 Reducción de Nitroazul de Tetrazolio por Superóxido Generado por Células NIH 3T3 Transfectadas con ADNc de Mox1 (SEQ ID Nº 1)

Se controló la generación de superóxido por células intactas usando la reducción de nitroazul de tetrazolio sensible a superóxido dismutasa. Se plaquearon células NEF2 (control, vector solo), YA26 (transfectadas con mox1(SEQ ID Nº 1)) y YA28 (transfectadas con mox1 (SEQ ID Nº 1)) en seis placas a razón de 500.000 células por pocillo. Aproximadamente 24 más tarde, se retiró el medio de las células y se lavaron las células una vez con 1 ml de solución de Hanks (Sigma, St. Louis, MO). Se agregó aproximadamente 1 ml de Nitroazul de tetrazolio al 0,25% filtrado (NBT, Sigma) en solución de Hanks sin o con 600 unidades de superóxido dismutasa (Sigma) y se incubaron las células a 37ºC en presencia de 5% de CO_{2}. Tras 8 minutos, se rasparon las células y se sedimentaron a más de 10.000 g. Se resuspendió la pella en 1 ml de piridina (Sigma) y se calentó durante 10 minutos a 100ºC para disolver el NBT reducido. Se determinó la concentración de NBT reducido midiendo la absorbancia a 510 nm, usando un coeficiente de extinción de 11.000 M^{-}1 \cdot cm^{-1}. Algunos pocillos no se trataron y se usaron para determinar el número de células.

Los datos se presentan en la Tabla 5 y en la Figura 4 e indican que las células transfectadas con mox1 (SEQ ID Nº 1) generaron cantidades significativamente importantes de superóxido.

TABLA 5

104

Dado que no es probable que la superóxido dismutasa penetre en las células, el superóxido debe generarse extracelularmente. La cantidad de superóxido generada por estas células es aproximadamente el 5-10% del generado por neutrófilos humanos activados.

Ejemplo 8 Modificación de Componentes Intracelulares en Células Transfectadas con Mox1

Para probar si el superóxido generado por mox1 puede afectar "dianas" intracelulares, se controló la actividad aconitasa en células control y en líneas celulares transfectadas con mox como describen Suh y col. en (1999) Nature 401, 79-82. La aconitasa contiene un centro activo de cuatro hierros y cuatro azufres que es altamente susceptible de modificación por superóxido, dando como resultado la pérdida de actividad, y se ha usado como indicador de generación intracelular de superóxido. Se determinó la actividad aconitasa como describieron Gardner y col. en (1995) J. Biol. Chem. 270,13399-13405. La actividad aconitasa disminuyó significativamente en todas las líneas celulares transfectadas con mox designadas YA26, YA28 y YA212 en comparación con el control transfectado (Figura 5). Aproximadamente el 50% de la aconitasa en estas células es mitrocondrial, en base a la centrifugación diferencial, y las formas citosólica y mitocondrial fueron ambas afectadas. Las enzimas control citosólicas y mitocondriales que no contienen centros activos hierro azufre no fueron afectadas. El superóxido generado en las células transfectadas con mox1 es por lo tanto capaz de reaccionar con componentes celulares y modificarlos.

Ejemplo 9 Generación de Tumores en Ratones Desnudos Recibiendo Células Transfectadas con ADNc de mox1 Humana (SEQ ID Nº 1)

Se inyectaron aproximadamente 2 x 10^{6} células NIH 3T3 (transfectadas con mox1 con SEQ ID Nº 1 o células transfectadas usando vector vacío) por vía subdérmica en la cara lateral del cogote de ratones desnudos de 4-5 semanas. Se inyectaron tres a seis ratones para cada una de las líneas celulares transfectadas con mox1, y se inyectaron 3 ratones con células transfectadas con vector vacío (control). Tras 2 a 3 semanas, se sacrificaron los ratones. Se fijaron los tumores en formalina al 10% y se caracterizaron por análisis histológico. El tamaño promedio de los tumores fue de 1,5 x 1 x 1 cm y mostraron histología típica para tumores de tipo sarcoma. Además, los tumores resultaron muy vascularizados con capilares superficiales. Once de doce ratones inyectados con células transfectadas con gen de mox1 desarrollaron tumores, mientras que ninguno de los tres animales control desarrollaron tumores.

En otro estudio, se inyectaron 15 ratones con células NIH 3T3 transfectadas con mox1. De los 15 ratones inyectados, 14 mostraron grandes tumores en el transcurso de 17 días de la inyección, y los tumores mostraron expresión de ARNm de mox1. Histológicamente, los tumores se parecieron a fibrosarcomas y fueron similares a los tumores inducidos por ras. Por ello, ras y mox1 tuvieron potencia similar en relación a la capacidad de inducir tumorigenicidad de células NIH 3T3 en ratones atímicos.

Ejemplo 10 Demostración del Papel de Mox1 en el Crecimiento No Cancerosos

Se demostró un papel en el crecimiento normal en células de músculo liso vascular de aorta en ratas usando antisentido para mox1 de rata. La transfección con el ADN antisentido dio como resultado una disminución en la generación de superóxido y en el crecimiento dependiente de suero. Por consiguiente, mox1 está implicada en el crecimiento normal en este tipo celular.

Ejemplo 11 Expresión de Proteína Mox1 Humana (SEQ ID Nº 2) en un Sistema de Expresión de Baculovirus

SEQ ID Nº 2 también se expresó en células de insecto usando baculovirus recombinante. Para establecer el sistema de virus expresando p65mox1, se clonó inicialmente el gen de mox1 (SEQ ID Nº 1) en el vector pBacPAK8 (Clontech, Palo Alto, CA) y se construyó el baculovirus recombinante usando procedimientos convencionales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Brevemente, se clonó ADN de mox1 amplificado por PCR en los sitios KpnI y EcoRI del vector. Los cebadores usados para la amplificación por PCR fueron: 5'-CAA GGT ACC TCT TGA CCA TGG GAA ACT-3', SEQ ID Nº 15, y 5'-ACG AAT TCA AGT AAA TTA CTG AAG ATA C-3', SEQ ID Nº 16. Se infectaron células Sf9 de insecto (2 x 10^{6} células) con 0,5 mg de ADN de baculovirus linealizado comercializado bajo la marca registrada BACULOGOLD® (PharMingen, San Diego, CA) y 5 mg de pBacPACB-p65mox1 usando Tampones de Transfección A y B (PharMingen, San Diego, CA). Tras 5 días, se recogieron los sobrenadantes conteniendo los virus recombinantes y se amplificaron infectando células sf9 nuevas durante 7 días. La amplificación se realizó tres veces y la presencia de virus recombinante conteniendo ADN de mox1 se confirmó por PCR usando los mismos cebadores. Tras amplificar tres veces los virus, se realizó una purificación en placa para obtener valoraciones de virus elevadas. Se infectaron aproximadamente 2 x 10^{8} células sf9 en placas de agar durante 5 días con diluciones en serie de virus y se tiñeron con rojo neutro para facilitar la detección de placas de virus. Se extrajeron las placas de virus seleccionadas y se confirmó nuevamente la presencia de ADN de mox1 humana por PCR.

Ejemplo 12 Clonación de un Homólogo de p65mox de Rata (SEQ ID Nº 2)

Se obtuvieron clones de ADNc de p65mox de células de músculo liso de aorta de rata. Se realizó RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa) de la siguiente manera: la síntesis de la primer hebra de ADNc se realizó usando ARN total de células de músculo liso vascular de aorta de rata, cebador oligo dT y transcriptasa inversa superscript II, a continuación se incubó con RNasa H. Los cebadores de PCR degenerados se diseñaron para hibridar con áreas conservadas en las regiones de codificación de h-mox1 y gp91phox de origen humano (X04011), de ratón (U43384) y porcino (SSU02476). Los cebadores fueron: sentido 5'-CCIGTITGTCGIAATCTGCTSTCCTT-3', SEQ ID Nº 17 y antisentido 5'-TCCCIGCAIAICCAGTAGAARTAGATCTT-3', SEQ ID Nº 18. Se purificó un producto principal de PCR del tamaño esperado 1,1 kb por electroforesis en agarosa y se usó como molde en una segunda reacción de amplificación por PCR.

Se generaron extremos romos en una alícuota del producto de RT-PCR, se unieron a un vector Litmus 29 modificado y se usó para transformar E. coli XL10 competente. Se seleccionaron aproximadamente 120 colonias de bacterias para la presencia del inserto completo por PCR directa usando cebadores de vectores y polimerasa Taq. Se purificaron plásmidos de 25 colonias positivas y se mapearon por digestión con BamHI. Se secuenciaron parcialmente plásmidos representativos de cada patrón de digestión. Cinco de 25 clones contenían productos de amplificación no específicos y 20 contenían insertos idénticos a (h)mox1humana. Se determinó la secuencia completa de uno de los últimos clones y resultó ser 83% idéntico a (h)mox1 sobre 1060 nucleótidos. Se generó una sonda de 1,1 kb por amplificación con PCR del inserto de un clon de mox1 de rata con los cebadores degenerados descritos anteriormente y se usaron para hibridar a una Northem de ARN de células de músculo liso vascular de rata. Una banda única, migrando entre ARNr 28S y ARNr 18S, indicó la presencia de un mensaje con un tamaño compatible con el de mox1 humana
(2,6 kb).

Para obtener mox1 de rata en toda su extensión, se llevaron a cabo reacciones de amplificación rápida (RACE) 3' y 5' de los extremos de ADNc como se describió anteriormente, usando los cebadores específicos de gen 5'-TTGGCA
CAGTCAGTGAGGATGTCTTC-3', SEQ ID Nº 19 y 5'-CTGTTGGCTTCTACTGTAGCGTTCAAAGTT-3', SEQ ID Nº 20 para RACE 3' y 5', respectivamente. Se obtuvieron los productos principales de 1,5 km y 850 pb para RACE 3' y 5', respectivamente. Se purificaron estos productos por electroforesis en gel de agarosa y se reamplificó con polimerasa Taq. Se clonaron ambos productos en el vector pCR 2.1 y se usaron para transformar E. coli XL1 azul electrocompetente. Se secuenciaron los productos de RACE y se diseñaron cebadores terminales nuevos: sentido
5'-TTCTGAGTAGGTGTGCATTTGAGTGTCATAAAGAC-3' (SEQ ID Nº 43), y antisentido 5'TTTTCCGTCAAA
ATTATAACTTTTTATTTTCTTTTTATA ACACAT-3' (SEQ ID Nº 44). La amplificación por PCR de ADNc de VSMC de rata se realizó usando estos cebadores.

Se obtuvo un único producto de 2,6 kb, unido a pCR 2.1 y se usó para transformar E. coli XL1 azul electrocompetente. Se obtuvo la secuencia del inserto con 12 cebadores con sentido y 14 antisentido. Su longitud es de 2577 pb (incluyendo las secuencias de cebadores), comprendiendo un marco de lectura abierto de 1692 pb, 127 bp 5' y 758 pb 3' de regiones sin traducir. La presencia de seis codones de terminación dentro del marco en la región no traducida 5' sugiere que se obtuvo la región codificadora en toda su extensión. Las secuencias de poliadenilación de consenso están presentes en los nucleótidos 2201 y 2550. La traducción conceptual da un péptido de 563 aminoácidos, un resto más corto que la secuencia deducida humana. Esta nueva secuencia de aminoácidos es más similar a mox1 humana SEQ ID Nº 3 (82% de identidad) que a gp91 phox de ratón SEQ ID Nº 38 (55% de identidad), sugiriendo que es por cierto mox1 de rata (SEQ ID Nº 21). Este homólogo de rata (r) de la proteína p65mox es llamado r-p65mox o p65mox/rat.pep y se muestra como SEQ ID Nº 21. La secuencia de nucleótidos que codifica r-p65mox se muestra como SEQ ID Nº 22.

Ejemplo 13 Expresión de ARNm de (r)-p65mox de rata en Músculo Liso Vascular e Inducción por Angiotensina II, Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), y Ácido Forbol Mirístico (PMA)

Usando el clon de ADNc parcial de rata, se examinaron los cultivos de células de músculo liso de aorta de rata para la expresión del mensaje para r-p65mox. Se observó el ARNm para r-p65mox en estas células. Anteriormente se informó (Griendling y col. (1994) Circ. Res. 74,1141-1148; Fukui y col. (1997) Circ. Res. 80, 45-51; Ushio-Fukai y col. (1996) J. Biol. Chem. 271, 23317-23321) que el tratamiento in vitro o in vivo con angiotensina II (AII) es un estímulo de crecimiento para células de músculo liso vascular, y que AII induce un aumento de generación de superóxido en estas células. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y PMA son señales proliferativas para las células de músculo liso vascular. Se observó que el ARNm para r-p65mox se indujo aproximadamente 2-3 veces por angiotensina II (100 nM), correspondiendo al aumento del nivel de generación de superóxido. Por ello, el aumento de generación de superóxido en estas células se correlaciona con el aumento de expresión del ARNm para esta enzima. El ARNm para r-p65mox también aumentó 2 o más veces en respuesta al estímulo de crecimiento con PDGF (20 ng/ml), y 2-3 veces en respuesta a PMA. La cuantificación por densitometría reveló que se indujo el mensaje de mox1 de rata casi 4 veces a las 6 y 12 horas en respuesta a PDGF, y aproximadamente 2 veces a las 12 horas en respuesta a AII. Como control de recuperación para ARN se usó ARN 28S.

Ejemplo 14 Anticuerpos para Fragmentos de (h)-p65mox Humana (SEQ ID Nº 2)

Se generaron anticuerpos policlonales en ratones contra la mitad C terminal de h-p65mox (restos 233 hasta 564, SEQ ID Nº 23) que se predice que se pliega en un dominio citosólico conteniendo el sitio de unión para FAD y NADPH o NADH. Se expresó este dominio en E. coli como una proteína de fusión GST N terminal y se purificó en agarosa y glutatión por medio de procedimientos convencionales. Se generaron también dos anticuerpos antipéptidos contra h-p65mox (restos 243-256, llamado Péptido A, SEQ ID Nº 24) y h-65mox (restos 538-551, llamado Péptido B, SEQ ID Nº 25). Se conjugaron los péptidos con hemocianina de lapa (KLH) usando glutaraldehído.

Inicialmente se inyectaron los antígenos en diferentes conejos en adyuvante completo de Freund, y se estimularon 4 veces con antígeno en adyuvante incompleto de Freund en intervalos cada tres semanas. Se administró aproximadamente 0,5 mg a 1 mg de péptido en cada inyección. Se extrajo sangre 1 semana tras cada estímulo y se realizó una extracción de sangre final 2 semanas tras el último estímulo. Los anticuerpos para Péptido A y Péptido B se purificaron por afinidad por medio de cromatografía en columna a través de péptido A o péptido B conjugado a Afrigel 15 (Bio-Rad, Richmond, CA). Se entrecruzaron con enlaces covalentes 10 mg de péptido a 2 ml de resina Affigel 15 y se lavó el gel con 20 ml de tampón de unión (Hepes 20 mM/NaOH, pH 7,0, 200 mM de NaCl, y 0,5% de Triton X-100). Se bloqueó la N-hidrosuccinimida restante con 100 \mul de etanolamina 1 M. Tras lavar con 20 ml de tampón de unión, se incubaron 5 ml de antisuero con la resina Affigel conjugada con pep-A durante la noche a 4ºC. Se retiró la proteína no unida mediante lavado con 20 ml de tampón de unión. Se realizó la elución de los anticuerpos del gel con 6 ml de tampón de unión (glicina 100 mM/HCl, pH 2,5, 200 mM de NaCl, y 0,5% de Triton X-100). Posteriormente se neutralizó el eluato agregando 0,9 ml de Tris 1M/HCl, pH 8,0. La forma de fusión-GST de la proteína p65mox1 truncada (restos 233-566, SEQ ID Nº 23) se expresó en E. coli. Se llevó a cabo electroforesis en SDS-PAGE 12% de muestras (20 \mul cada una) previa inducción o tras 1 o 4 horas de la inducción con 100 \muM de IPTG (isopropil P-tiogalactósido).

Se sometió a las proteínas extraídas a inmunosondeo con antisuero para péptido A purificado por afinidad en una dilución 1:1000. La detección de antígenos se realizó usando un equipo mejorado de quimioluminiscencia (Amersham, Buckinghamshire, RU). El anticuerpo para mox1 (243-256, SEQ ID Nº 24) purificado por afinidad se usó en una dilución 1:1000 en una transferencia Western en la que se agregaron un total de 10 \mug de proteína a cada carril. La banda principal observada 4 horas tras la inducción con IPTG correspondió al tamaño de GST-mox1 expresado en bacterias conteniendo el vector pGEX-2T que codifica la proteína de fusión GST-mox1.

Ejemplo 15 Presencia de una NAD(P)H Oxidasa en Fibroblastos Transformados con Ras

Se detectó una actividad NADPH oxidasa generadora de superóxido en homogenados de células NIH 3T3, y esta actividad aumentó 10-15 veces en células NIH 3T3 transformadas con Ras (Tabla 6). Para establecer las líneas celulares transformadas con Ras de manera estable, se subclonó el ADN de Ras humano que codifica una mutación activadora en el aminoácido 12 (Valina, llamada V12Ras) en los sitios BamHI y EcoRI del vector pCDNA3 que tiene un gen de resistencia a neomicina. Se transfectó V12-Ras en pCDNA3 y vector vacío en células NIH 3T3 usando Lipofectamine Plus (Gibco). Se mantuvieron 2 x 10^{6} células con DMEM conteniendo 10% de suero de ternera y se transfectaron con 1 mg de ADN. Tras 2 días, se separaron las células y se seleccionaron con el mismo medio pero conteniendo 1 mg/ml de neomicina. Se subcultivaron las colonias supervivientes en el medio selectivo durante 10 a 14 días y se caracterizaron por análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos anti H-Ras humano. Se analizó la expresión de Ras en células transfectadas con vector pcDNA-3 solo o en las tres líneas celulares transfectadas con V12-Ras en el mismo vector en un análisis de transferencia Western. Se llamó a las tres líneas celulares V12-Ras-7, V12-Ras-4 y V12-Ras-8. La expresión de V12-Ras varió ampliamente entre las tres líneas celulares probadas. La línea celular V12-Ras-4 expresó el nivel más elevado deRas, seguida por la línea celular V12-Ras-8. La línea celular V12-Ras-7 expresó el nivel más bajo de Ras.

A continuación se prepararon lisados de cada una de las líneas celulares y se probaron para determinar su capacidad de generar superóxido. Para cada línea celular, se lavaron células con solución salina equilibrada de HANKS (HBSS), se recogieron por centrifugación, se mantuvieron en hielo seco durante más de 30 minutos y se lisaron suspendiéndolas en tampón de baja salinidad (LSB; 50 mM de Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM de PMSF y mezcla de proteasas de Sigma) y pasándolas diez veces a través de una aguja de jeringa (calibre 18). Se congelaron los lisados celulares en hielo seco inmediatamente tras determinar la concentración de proteínas.

La Tabla 6 muestra la generación de superóxido en las células transfectadas medida usando en ensayo de luminiscencia con lucigenina. Para este ensayo, se incubaron 5 \mug de lisado celular con la mezcla de reacción conteniendo 10 \muM de lucigenina (sonda luminiscente) y 100 \muM de NADPH (sustrato) en presencia o en ausencia de 100 \muM de araquidonato en ausencia o en presencia de 100 U de superóxido dismutasa (SOD) o 1 \muM de difenilen yodonio (DPI). Se controló la luminiscencia de la reacción durante 0,5 segundos con un LumiCounter (Packard) cuatro veces con intervalos de 3 segundos. RLU en la Tabla 5 se refiere a unidades relativas de luminiscencia.

Como se muestra en la Tabla 6, la luminiscencia se inhibió parcialmente por superóxido dismutasa, indicando que la señal se debió al menos en parte a la generación de superóxido. DPI, un conocido inhibidor de la actividad oxidasa NADPH en neutrófilos y en células diferentes a neutrófilos, inhibió completamente la actividad. La generación de superóxido se correlacionó con la expresión de Ras en las tres líneas celulares. Por ello, aparentemente Ras oncogénico induce una actividad generadora de superóxido dependiente de NADHP que es similar a la actividad catalizada por p65mox1.

TABLA 6

105

Ejemplo 16 Clonación Molecular de Otro ADNc de mox1 de Rata Llamado Raf mox1B

Se seleccionó una biblioteca de ADNc de rata en un esfuerzo por identificar nuevas secuencias de mox de rata. La biblioteca se construyó en un vector fago lambda ZAP express (Stratagene, La Jolla, CA) usando ARN aislado de células de músculo liso vascular de rata expuestas a 100 nM de angiotensina II durante 4 horas. Se seleccionó la biblioteca usando técnicas de hibridación mancha transferencia convencionales con la sonda mox1 de rata descrita anteriormente. Se obtuvieron quince clones individuales que se caracterizaron mediante PCR y mapeo de restricción. Se identificaron así dos tipos diferentes de clones y se secuenciaron representantes de cada tipo. Se encontró que un clon del primer tipo (representativo de 13) era similar al previamente identificado mox1 de rata y se llamó por ello mos1B de rata. Los clones del segundo tipo (representativo de 2) eran secuencias incompletas de mox de rata.

La longitud de la secuencia de nucleótidos de mox1B de rata es de 2619 pb y se presenta como SEQ ID Nº 41. El marco de lectura abierto único mayor de 1497 pb abarca los nucleótidos 362 a 1858. La presencia de dos codones de terminación dentro del marco en la región 5' sin traducir en los nucleótidos 74 y 257 indica que se ha aislado la región codificadora en toda su extensión. Están presentes dos sitios de poliadenilación putativos en las posiciones 2243 y 2592. El alineamiento de la secuencia de nucleótidos de mox1 de rata (SEQ ID Nº 22) y la secuencia de nucleótidos mox1B de rata (SEQ ID Nº 41) muestra que las dos secuencias de nucleótidos son idénticas excepto en sus extremos 5', sugiriendo que pueden representar dos mensajes alternativamente separados del mismo gen. La identidad de secuencia comienza en los nucleótidos 269 y 311, para mox1 de rata y mox1B de rata, respectivamente.

La traducción conceptual de la B secuencia de nucleótidos de mox1 de rata (SEQ ID Nº 41) da una secuencia de 499 aminoácidos con una predicción de peso molecular de 58 kDa. Esta secuencia de aminoácidos de la proteína mox1B de rata se muestra en SEQ ID Nº 42. El alineamiento de las secuencias deducidas de aminoácidos para mox1 de rata (SEQ ID Nº 21) y mox1B de rata (SEQ ID Nº 42) indica que mox1B de rata es idéntica a mox1A de rata, excepto por una extensión faltante de 64 restos en el extremo N terminal. Por consiguiente, aparentemente mox1B de rata es una variante separada derivada del mismo gen de mox1 de rata.

Ejemplo 17 Análisis de Secuencias y Clonación del ADNc de Mox2 Humano (SEQ ID Nº 3) que Codifica la Producción de la Proteína Mox2 Humana (SEQ ID Nº 4)

Nótese que la proteína mox2 descrita en este documento, se describió en la Solicitud Provisional de EEUU Nº de Serie 60/149.332 como mox3.

Se realizó una búsqueda usando la secuencia de mox1 como secuencia consultada. La secuencia identificada con esta búsqueda fue una secuencia presente en la base de datos GenBank que contiene regiones de homología con mox1 y gp91phox. La secuencia de GenBank localizada en la búsqueda fue una región secuenciada de 90,6 kb del cromosoma 6 humano (6q25.1-26) que se informó como una presentación directa de GenBank con fecha 9 de Febrero de 1999, y con Nº de Acceso AL031773. La determinación de la secuencia se llevó a cabo como parte del proyecto de secuenciación del genoma humano por S. Palmer, en Sanger Centre, en Hinxton, Cambridgeshire, RU. La secuencia de GenBank se informó como similar a "Citocromo B" y no se informó que tuviere homología o relación con una proteína mox. La secuencia contenía una secuencia teórica de aminoácidos derivada por ordenador usando un algoritmo que predice las fronteras intrón/exón y regiones codificadoras. La región predicha contenía una secuencia de 545 aminoácidos que fue 56% idéntica a mox1 y 58% idéntica a gp91phox.

En la presente invención, en base a la secuencia genómica de GenBank y las homologías descritas anteriormente, se diseñaron varios cebadores específicos y se usaron para determinar los patrones de expresión en tejidos de una proteína mox nueva, mox2, usando Paneles de PCR en Múltiples Tejidos Humanos (Clontech, Palo Alto, CA). Los cebadores fueron los siguientes: Cebador 1; 5'CCTGACAGATGTATTTCACTACCCAG-3' (SEQ ID Nº 49); Cebador 2: 5'-GGATCGGAGTCACTCCCTTCGCTG-3' (SEQ ID Nº 50); Cebador 3: 5'-CTAGAAGCTCTCCTTGTTGTAA
TAGA-3' (SEQ ID Nº 51); Cebador 4: 5'-ATGAACACCTCTGGGGTCAGCTGA-3' (SEQ ID Nº 52). Se determinó que mox2 se expresa primariamente en tejidos fetales, con la expresión más elevada en riñón fetal, también se observó expresión en hígado fetal, pulmón fetal, cerebro fetal, bazo fetal y timo fetal. Entre los 16 tejidos de adulto probados, se observó expresión de mox2 en cerebro, riñón, colon y pulmón, aunque los niveles de expresión fueron muy bajos.

Además, se usaron las técnicas 5'RACE (RACE = Amplificación Rápida de Extremos de ADNc) y 3' RACE para completar la secuencia de las regiones 5' y 3' de mox2. (El equipo 5' RACE y el equipo 3' RACE eran de Clontech, Palo Alto, CA y están descritos con más detalle en Frohman y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85, 8998-9002. Se realizaron las técnicas 5' RACE y 3'-RACE usando una biblioteca de riñón fetal humano (Biblioteca de ADNc Marathon-Ready, Cat. Nº7423-1), usando los siguientes cebadores específicos: 5'-RACE; Cebador 4: 5'-AT
GAACACCTCTGGGGTCAGCTGA-3' (SEQ ID Nº 53); Cebador 5: 5'-GTCCTCTGCAGCATTGTTCCTCTTA-3' (SEQ ID Nº 54); 3'-RACE: Cebador 1: 5'-CCTGACAGATGTATTTCACTACCCAG-3' (SEQ ID Nº 55); Cebador 2: 5'-GGATCGGAGTCACTCCCTTCGCTG-3' (SEQ ID Nº 56). Los procedimientos de RACE completaron exitosamente la secuencia 5' y confirmaron la secuencia 3'. La secuencia de codificación completa de mox2 se muestra en SEQ ID Nº 2, mientras que la secuencia predicha de aminoácidos de mox2 se muestra en SEQ ID Nº 4.

Al comparar las secuencias de la presente invención con las regiones codificadoras predichas de la secuencia de GenBank, la secuencia de GenBank no contiene un codón de inicio, faltan aproximadamente 45 pares de bases en el extremo N terminal, y contiene un diferencia más importante en la región codificadora predicha que podría haberse debido a imprecisión en la predicción por ordenador de las fronteras intrón/exón.

<110> Universidad de Emory

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<120> Reguladores Mitogénicos Nuevos

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<130> 05501-0103wp

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<140>

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<141>

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<160> 61

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2609

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (207)..(1901)

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<400> 1

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2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 564

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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7

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<210> 3

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<211> 2044

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (104)...(1810)

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<400> 3

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10

11

12

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<210> 4

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<211> 568

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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15

16

17

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<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 5

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aacaagcgtg gcttcagcat g

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21

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<210> 6

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 6

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agcaatattg ttggtcat

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18

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<210> 7

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 7

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gacttgacag aaaatctata aggg

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24

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<210> 8

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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ttgtaccaga tggatttcaa

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<210> 9

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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caggtctgaa acagaaaacc t

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<210> 10

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 10

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atgaattctc attaattatt caataaa

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27

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<210> 11

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 11

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atctcaaaag actctgcaca

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<211> 569

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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<210> 13

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

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ttggctaaat cccatcca

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<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcatgacca acaatattgc t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaggtacct cttgaccatg ggaaact

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgaattcaa gtaaattact gaagata

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> ()..)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 3 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> ()

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 6 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> ()

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 12 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccngtntgtc gnaatctgct stcctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 5 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 9 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n en posición 11 = inosina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccngcana nccagtagaa rtagatctt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggcacagt cagtgaggat gtcttc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgttggctt ctactgtagc gttcaaagtt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 563

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2577

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Glu Ser Phe Glu Met Trp Asp Asp Arg Asp Ser His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Leu Arg Lys Cys Cys His Arg Tyr Ser Ser Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagtggtgg gaggcgaaga cata

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgtcatac ctgggacggt ctgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcacagtg agatgcctgt tcag

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaggcagc agagagcaat gatg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatctgcga gcggcacttg caga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctcgtcaa caggcaggac cgagc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagtgcatc cacatcttca gcac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagctctg gagacacttg agttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgttctct ctggctgaca ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaatagcg agctccgctt cacgc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaggacatc aaccctgcac tctc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 570

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bovino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 570

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 944

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 590

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arroz

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2619

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 499

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctgagtag gtgtgcattt gagtgtcata aagac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador Sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttccgtca aaattataac tttttatttt ctttttataa cacat

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5508

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (155)..(4810)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1521

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (438)..(3134)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

55

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 899

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgacagat gtatttcact acccag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcggagt cactcccttc gctg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagaagctc tccttgttgt aataga

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaacacct ctggggtcag ctga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaacacct ctggggtcag ctga

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctctgca gcattgttcc tctta

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctgacagat gtatttcact acccag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcggagt cactcccttc gctg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatgacactg tactggaggc cacag

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccatcta ccacacggat ctgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttgccattc caaagcttcc atgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacaagtca ggacagtggg tgcg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggatgatgt cagccdgcca ctca

\hfill

24

Claims (16)

1. Una proteína asilada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

a) SEQ ID Nº 2

b) SEQ ID Nº 21

c) SEQ ID Nº 42

d) una de las secuencias de aminoácidos de a) hasta c) con una deleción en las mismas o una adición en las mismas de menos del 5% de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos, en la que dicha proteína es capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno, o

e) una proteína aislada capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de a) hasta c) con una sustitución conservativa seleccionada de los grupos 1) a 6), que son:

1)

alanina, serina o treonina, una por otra;

2)

ácido aspártico o ácido glutámico, uno por el otro;

3)

asparagina o glutamina, una por la otra;

4)

arginina o lisina, una por la otra;

5)

isoleucina, leucina, metionina o valina, una por la otra; y

6)

fenilalanina, tirosina o triptofano, uno por el otro, o

f) un fragmento de una secuencia de aminoácidos seleccionado de uno de a) hasta c), en el que dicho fragmento es capaz de generar intermediarios reactivos de oxígeno.

2. Una secuencia de nucleótidos aislada, que codifica la proteína que se definió en la reivindicación 1.

3. La secuencia de nucleótidos de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de nucleótidos está representada como SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 22 o SEQ ID Nº 41.

4. Un vector, que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 2 ó 3.

5. Una célula que contiene un vector de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un anticuerpo dirigido a una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos representada como a) SEQ ID Nº 2, b) SEQ ID Nº 21, c) SEQ ID Nº 42, o d) un fragmento antigénico de una secuencia de aminoácidos seleccionada de una de a) hasta c).

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. La proteína de la reivindicación 1 para estimular la formación de superóxido in vitro o in vivo.

9. La secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 para el desarrollo de secuencias de nucleótidos antisentido.

10. El vector de la reivindicación 4 para estimular la formación de superóxido in vitro o in vivo.

11. Un procedimiento para determinar la capacidad de un fármaco o compuesto químico para modular la actividad enzimática de una proteína como se definió en la reivindicación 1 para generar de intermediarios reactivos de oxígeno in vitro, que comprende poner en contacto la proteína definida en la reivindicación 1, o una célula huésped que expresa la proteína de la reivindicación 1 con el fármaco o producto químico, y medir la generación de intermediarios reactivos de oxígeno, determinando de esta manera la capacidad del fármaco o producto químico para modular la actividad enzimática para generar intermediarios reactivos de oxígeno.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende medir la actividad enzimática de la proteína definida en la reivindicación 1, para estimular la producción de superóxido tras el agregado del fármaco o producto químico.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la actividad enzimática es la generación de superóxido dependiente de NADPH o dependiente de NADH.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la actividad enzimática es la actividad diaforasa dependiente de NADPH o dependiente de NADH.

15. Un procedimiento de la reivindicación 11 que comprende medir la unión del fármaco o el producto químico a la proteína definida en la reivindicación 1.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la actividad enzimática se evalúa usando células intactas, células transfectadas o lisados de tales células.