ES2249065T3 - Medicion de hidruro mediante el uso de compuestos quimioluminiscentes de acridinio. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de ensayo quimioluminiscente para detectar o cuantificar hidruro, dicho ensayo comprende medir la cantidad de quimioluminiscencia generada a partir de un compuesto quimioluminiscente en una reacción en la cual dicho compuesto bioluminiscente reacciona con un hidruro generado a partir de una reacción catalizada químicamente, bioquímicamente o enzimáticamente.

Description

Medición de hidruro mediante el uso de compuestos quimioluminiscentes de acridinio.

Antecedentes de la invención

Los ésteres de acridinio (AE) han proporcionado un procedimiento extremadamente sencillo de detección y se han usado extensivamente como etiquetas quimioluminiscentes tanto en inmunoensayos como en ensayos de ácidos nucleicos. Los Ésteres de Arilacridinio Polisustituidos hidrolíticamente estables (PAAE) han demostrado ser útiles como etiquetas analíticas (patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 4.745.181; 4.918.192; y 5.110.932) con una diversidad de enlaces (patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 5.241.070; 5.538.901; y 5.663.074) y fueron los primeros compuestos quimioluminiscentes de acridinio para satisfacer los requerimientos estrictos de los ensayos de unión a ligandos comerciales. La utilidad de PAAE se logró adicionalmente con el advenimiento de PAAE Hidrófilos Funcionalizados (patente de los Estados Unidos 5.656.426) los cuales incrementan el rendimiento cuántico de PAAE y potencian la función de las parejas de unión etiquetadas con PAAE en términos de la señal observada para razones de ruido y las sensibilidades de diversos ensayos de unión. Adicionalmente, la introducción de grupos ionizables en el resto fenoxi produjo otra subclase de PAAE hidrófilos (patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 5.227.489; 5.449.556; y 5.595.875).

M. Kawaguichi y col. (Bioluminescence y Chemiluminescence, Procedings of 9^{th} International Symposium 1996, Ed. Hastings, Kricka and Stanley, John Wiley & Sons, 1997, páginas 480-484) han descrito ésteres de fenilacridinio estabilizados para ensayos quimioluminiscentes. Los derivados AE con sustituciones de metilo adicionales en C-1, las cuales son opcionales en C-3 del núcleo acridinio con adecuación de las sustituciones mono o dimetilo en las posiciones orto del resto fenoxi, donde muestran tener excelente estabilidad en disolución acuosa.

Los documentos EP 0324.202 A1 y subsiguientemente EP 0609.885 A1 describen ambos ésteres de acridinio con grupos funcionales sustituidos en el átomo de nitrógeno del núcleo de acridinio. La última aplicación describe adicionalmente alternar sustituyentes tales como los restos bifenilo o naftilo como posibles sustitutos para el grupo fenilo.

Mattingly, y col. (patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 5.468.646 y 5.543.524) describen sales de acridinio, y sus aplicaciones en inmunoensayos. Estas sales de aridinio pertenecen a otra clase de compuestos llamados sulfonamidas de acridinio (o carboxamidas de N-sulfonilacridinio). Las sulfonilamidas de acridinio (AS) tienen estabilidades acuosas las cuales son comparables con PAAE. Mattingly, y col. describen adicionalmente sales de acridinio quimioluminiscentes y sus aplicaciones en inmunoensayos. Estas sales de acridinio pertenecen a otra clases de compuestos llamados sulfonilamidas de acridinio (o carboxamidas de N-sulfonilacridinio). Las sulfonilamidas de acridinio (AS) tienen estabilidades acuosas las cuales son comparables con PAASE. Mattingly, y col. describen adicionalmente y reivindican las sales de fenantridio quimioluminiscentes análogas, y sus aplicaciones en inmunoensayos, en las patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 5.545.739; 5.565.570, y 5.669.819. Adicionalmente, en estas patentes se describe una estructura general de sulfonilamidas de acridinio mostrando posibles sustituyentes en un grupo de Markush en el núcleo de acridinio.

Los compuestos convencionales de acridinio, tales como aquellos descritos en las mencionadas patentes y bibliografía, emiten luz con máxima a aproximadamente 428 nm en reacción con peróxido de hidrógeno en disolución alcalina fuerte. Los compuestos acridinio los cuales emiten luz de longitud de onda máxima > 500 nm se han descrito también en las técnicas previas. Las patentes de los Estados Unidos Nº^{s}. 5.395.752; 5.702.887 y 5.879.894 describen ésteres de acridinio de emisión larga (LEAE) novedosos, donde se emplea un sistema de benzacridinio fusionado para extender la longitud de onda de emisión del éster de acridinio. En la solicitud PCT WO9854574 en trámite junto con el presente documento Jiang y col. han extendido adicionalmente la emisión máxima de PAAE bien dentro de la región de 600-700 nm utilizando el principio de transferencia de energía. Esto supone la unión covalente de luminóforos al éster de acridinio. Cuando las reacciones quimioluminiscentes de estos conjugados se iniciaron mediante tratamiento con peróxido alcalino, se observó la emisión de luz a longitudes de onda largas donde la longitud de onda máxima depende de la estructura del luminóforo. En la solicitud PCT WO0009487 en trámite junto con el presente documento más reciente, Natrajan y col. describen compuestos acridinio novedosos que tienen emisión máxima intrínseca cerca de o en la región infrarroja cercana (> 590 nm). Se describen los requerimientos estructurales para tales compuestos de acridinio que emiten en longitud de onda larga.

Los ésteres de N-alquilacridan obtenidos a partir de la reducción de ésteres de acridinio se han usado como indicadores de sustratos de enzimas para la determinación de fosfatasas y oxidasas y sus sustratos o productos. Los ésteres de fosfato de alquilacrida se han manipulado como sustratos para la detección de concentraciones insignificantes de fosfatasa alcalina (Akhavan-Tafti, H. y col. "Lumagen™ APS: New Substrates for the Chemiluminescent Detection of Phosphatase Enzymes"; Proc. 9^{th} Internat'l. Symp. Bioluminiscence and Chemiluminiscence; (1996); Hastings, J.W.; Kricka, L. J.; Stanley; P. E., (Eds.); John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY; páginas 311-314). De forma similar, se han aplicado ésteres de N-alquilacridancarboxilato como indicadores oxidables para la peroxidasa del rábano picante, donde la quimioluminiscencia del producto éster de acridinio oxidado se usó para cuantificar bien peroxidasa de rábano picante o bien oxidasas y sus sustratos en reacciones enzimáticas acopladas (Akhavan-Tafti, H. y col.; Chemiluminescent Detection of Oxidase Encimes by Peroxidase-mediated Oxidation ofAcridan Compounds; Proc. 9^{th} Internat'l. Symp. Bioluminiscence and Chemiluminiscence; (1996); Hastings, J.W.; Kricka, L. J.; Stanley; P. E., (Eds.); John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY; páginas 501-504).

Luminoles junto con peroxidasa se han usado como detectores quimioluminiscentes de peróxido de hidrógeno generados a partir de deshidrogenasa y sus cofactores (documento WO 95/29255).

Se han descrito diversas clases de indicadores reducibles por hidruro, cromogénicos (Ottaway, J. M.; Oxidation-Reduction Indicators; Internat'l Ser. Monographs Anal. Chem.; (1968); Belcher, R.; Frieser, H., (Eds.); Plenum; páginas 469-529) (Bird, C. L.; Kuhn, A. T.; Electrochemistry of the Viologens; Chem. Soc. Rev.; (1981), 10, páginas 49-82). Varias de estas, incluyendo las sales oxidadas de fenazinas, fenoxazinas y fenotiazinas, se han usado como indicadores cromogénicos de hidruro de los cofactores de nicotinamida reducidos (dinucleótido dihidronicotinamida adenina, NADH, y dinucleótido dihidronicotinamida adeninafosfato, NADPH) y los factores de flavina reducidos (mononucleótido de dihidroflavina, FMNH_{2} y dihidroflavina adenina dinucleótido, FADH_{2}) generadas por actividad enzimatica de deshidrogenasas (Czerlinski, G. H., y col., "Coupling of Redox Indicator Dyes into an Enzimatic Reaction Cycle", J. Biochem. Biophys. Methods, (1988) 15, páginas 241-248) (Nakamura, S., y col., "Use of 1-Methoxi-5-metilphenaziniummethylsulfate in the Assay of Some Enzymes of Diagnostic Importance", Clin. Chem. Acta, (1980), 101, página 321).

Breve sumario de la invención

La presente invención describe un procedimiento para la medida de hidruro que usa un compuesto quimioluminiscente. La molécula quimioluminiscente preferida es un compuesto de acridinio. La fuente de hidruro para la reducción del compuesto de acridinio puede ser de origen químico o bioquímico, o el resultado de catalizadores enzimáticos. La fuente química de hidruro, por ejemplo, puede ser hidruros metálicos, tales como NaBH_{4}. Una fuente bioquímica de hidruro puede ser aquella derivada de NADH, NADPH, FMNH_{2} o FADH_{2}, mientras una fuente enzimática sería la clase de oxidorreductasas llamadas deshidrogenasas las cuales convierten en reacciones redox desde NAD, NADP, FMN o FAD a NADH, NADPH, FMNH_{2} o FADH_{2}.

Hay numerosas aplicaciones potenciales para compuestos acridinio como indicadores quimioluminiscentes de hidruro. Cualesquiera pruebas aplicadas de ensayos diagnósticos, en los cuales hidruro está presente bien en la aparición de o bien se genera a través del curso de una reacción, se beneficiarían de la presente invención. Tales pruebas, las cuales pudieron comprender muchos formatos diferentes como se discute anteriormente en detalle, pueden implicar la cuantificación o detección de hidruros metálicos, o cofactores enzimáticos tales como NADH, NADPH, FMNH_{2}, o FADH_{2}. De particular importancia, son aquellos ensayos diagnósticos los cuales pueden usar deshidrogenasas como reactivos, indicadores, marcadores diagnósticos o como etiquetas. Etanol, por ejemplo, se pudo detectar con quimioluminiscencia de éster de acridinio a través de la reacción de alcohol deshidrogenasa en etanol, dicha reacción produce NADH. Como una etiqueta, la deshidrogenasa se puede usar en un ELISA para la detección de un analito específico con éster de acridinio proporcionando la respuesta señal. Los ensayos de ácidos nucleicos que usan deshidrogenasa como una etiqueta se preveen también. Los ensayos para la detección de deshidrogenasas clínicamente relevantes tales como glutamato deshidrogenasa elevada como un indicador de daño hepatocelular se desarrollan también.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es la reacción que muestra la adición de hidruro al C-9 del núcleo de acridinio.

La figura 2 muestra la reducción de 2',6'-dimetilfenil-10-metil acridinio-9-carboxilato con NADH en DMF/fosfato 0,1 M a pH 7,4 a temperatura ambiente durante 10 minutos.

La figura 3 muestra la estructura general de los compuestos de acridinio principales útiles como indicadores quimioluminiscentes de la presente invención.

La figura 4 muestra las estructuras adicionales que se pueden unir a R_{2} y R_{3} para formar un anillo adicional.

La figura 5 muestra el resto arilo polisustituido identificado como Y.

La figura 6 muestra ejemplos del grupo saliente R_{10}.

La figura 7 muestra la estructura general de compuestos fenantridinio y quinolinio útiles como los indicadores quimioluminiscentes de la presente invención.

La figura 8 muestra la adición de un hidruro a un resto éster deficiente en electrones para formar un resto rico en electrones.

La figura 9 muestra la adición de hidruro a un compuesto de emisión de longitud de onda larga para formar un compuesto de emisión de longitud de onda corta.

La figura 10 muestra un núcleo de acridinio en el que la reducción del desactivador de cadena lateral se logra preferencialmente.

La figura 11 muestra un núcleo de acridinio en el que la reducción del fluoróforo de cadena lateral se logra preferencialmente.

La figura 12 muestra un procedimiento analítico en el que la formación de NADH se puede cuantificar.

La figura 13 muestra un inmunoensayo homogéneo usando un compuesto acridinio como un indicador de hidruro.

La figura 14 muestra un ensayo en el cual las sustancias que interfieren se eliminan por medio del uso de una fase sólida en el ensayo.

La figura 15 ilustra ensayos heterogéneos usando la presente invención.

La figura 16 muestra el ensayo de teofilina Emit® quimioluminométrico que usa NSP-DMAE_{4}-BSA como un indicador de hidruro.

La figura 17 muestra el ensayo de valproato Emit® quimioluminométrico que usa NSP-DMAE_{4}-BSA como un indicador de hidruro.

La figura 18 muestra el ensayo de quinidina Emit® quimioluminométrico que usa NSP-DMAE_{4}-BSA como un indicador de hidruro.

La figura 19 muestra el ensayo de teofilina Emit® quimioluminométrico que usa DMAE-\phi como un indicador de hidruro.

La figura 20 muestra el ensayo de valproato Emit® quimioluminométrico que usa DMAE-\phi como un indicador de hidruro.

La figura 21 muestra concentración referida frente a determinada de analitos para controles.

La figura 22 muestra un ensayo de etanol quimioluminométrico.

Descripción detallada de la invención

El descubrimiento de los inventores de que la actividad quimioluminiscente de un compuesto acridinio se puede modular (aumentar o disminuir) mediante hidruro es principal para la presente invención. Aunque los ejemplos discutidos en el presente documento dan como resultado un decrecimiento en la actividad quimioluminiscente, se contemplan varios mecanismos en los que alguien verá un incremento de la actividad quimioluminiscente. Por ejemplo, en la sección B2 y en parte de la sección B3, más adelante, la quimioluminiscencia se puede incrementar cuando el detector es sensible a un intervalo selectivo de emisión de longitud de onda. Si la reacción da como resultado un cambio de la emisión a una longitud de onda donde un detector es más sensible, se observará quimioluminiscencia incrementada. En la otra parte de la sección B3, más adelante, se observa un incremento debido a que el resto que causa la desactivación se reduce e inactiva mediante el hidruro.

A. Indicadores de quimioluminiscencia novedosos de hidruro

Hemos descubierto que la reducción de éster de acridinio con hidruro suprime la actividad quimioluminiscente del éster de acridinio. La reducción en actividad quimioluminiscente es el resultado de la adición de hidruro a C-9 del núcleo acridinio (véase figura 1). El producto, el cual es el acridán, es incapaz de participar en la reacción generadora de luz con peróxido de hidrógeno alcalino. Otros compuestos de acridinio o análogos quimioluminiscentes (por ejemplo, compuestos de benzacridinio, fenantridinio, quinolinio o isómeros) y sus derivados, igual que compuestos quimioluminiscentes tales como lucigenina y sus derivados, comparten los mismos o similares mecanismos de ataque con hidruro al núcleo de acridinio deficiente en electrones para formar los acridán reducidos.

Nuestros estudios iniciales se centraron en la reducción de 2',6'-dimetilfenil-10-metil acridinio-9-carboxilato (DMAE-\phi) con el borohidruro de sodio reductor químico en disolvente metanol. El análisis cromatográfico (HPLC) de esta reacción de reducción reveló conversión limpia al N-metilacridán correspondiente, correlacionando con un descenso en actividad quimioluminiscente cuando la mezcla de reacción se trató con peróxido alcalino. Se observó también un resultado similar cuando el NADH donante de hidruro se empleó para reducir el éster de acridinio. El análisis cromatográfico de esta reacción reveló también formación limpia del acridán con una pérdida concomitante de actividad quimioluminiscente. Se encontró que la extensión de este decrecimiento depende de la concentración de NADH. Como se muestra en la tabla en la figura 2, cantidades crecientes de NADH se acompañaron por un decrecimiento correspondiente en la actividad quimioluminiscente de la mezcla de reacción. La reducción de la reacción se completó en menos de 10 minutos.

La medida de hidruro generado en sistemas enzimáticos se ha usado en la técnica previa para idear análisis sensibles. Por ejemplo, Cook y col., en Clin. Chem. 1993, 39/6, 965-971 describen un sistema de amplificación enzimático para detectar la proinsulina humana en plasma humano. Este ensayo implicó usar fosfatasa alcalina como la etiqueta primaria la cual se usa para defosforilar NADP^{+} a NAD^{+}. El último compuesto se emplea después como un cofactor en un ciclo redox que usa las enzimas alcohol deshidrogenasa y diaforasa. Mientras la primera enzima utiliza NAD^{+} para oxidar etanol a acetaldehído con generación de NADH, la última enzima diaforasa utiliza el NADH para la reducción de una tinción de tetrazolio para producir una tinción de formazán coloreada. Usando este sistema, Cook y col., fueron capaces de detectar 1 zemoptol de fosfatasa alcalina y 0,017 pmol/l de proinsulina humana. El mismo sistema se empleó por Johannsson y col. (J. Immunol. Meth. 1986, 87, 7-11) para idear un ensayo altamente sensible para TSH (sensibilidad de 0,0013 \boxemptyIU/l). Ambos ensayos anteriores usan una tinción coloreada como un indicador. Dado que los indicadores de quimioluminiscencia tales como ésteres de acridinio son mucho más sensibles, medir el hidruro usando estos compuestos es prometedor para producir ensayos más sensibles. Los inventores preveen otras aplicaciones interesantes y útiles de su hallazgo los cuales elaborarán en detalle más tarde.

La reducción de éster de 2',6'-dimetilfenil-10-metilacridinio con NADH implica adición de hidruro a C-9 para generar el acridán no quimioluminiscente. Es evidente que los compuestos de acridinio y análogos con modificaciones estructurales ampliamente diferentes pero que contienen el mismo núcleo acridinio esencial o los núcleos benzacridinio, fenantridinio, o quinolinio análogos serán susceptibles de esta transformación. Tales compuestos se pueden generalizar con la/las estructura/estructuras, las cuales se describen en todas las referencias de las técnicas previas en el presente documento en la sección de los antecedentes al comienzo de esta descripción. Estas estructuras no sólo incluyen compuestos de acridinio y sus análogos con emisión azul (aproximadamente 420-490 nm), sino también compuestos de acridinio y sus análogos con emisión verde (aproximadamente 490-570 nm), amarilla (aproximadamente 570-580 nm), naranja (aproximadamente 580-595 nm) y roja (aproximadamente 595-780 nm).

Para ilustración adicional, la estructura general de los compuestos acridinio principales útiles como los indicadores quimioluminiscentes de la presente invención se pueden representar esquemáticamente como se muestra en la figura 3, en la que

R_{1}, es un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene opcionalmente hasta 20 heteroátomos; preferiblemente R_{1} es grupo metilo o sulfoalquilo.

R_{2},R_{2}', y R_{3} son idénticos o diferentes, seleccionados de hidrógeno, -R, arilo sustituido o insustituido (ArR o Ar), haluro, amino, hidroxilo, nitro, sulfonato, -CN, -COOH, -SCN, -OR, -SR, -SSR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR o -NHC(O)R;

A lo largo de esta realización, R se selecciona del grupo que consta de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, y aralquilo que contiene opcionalmente hasta 20 heteroátomos;

Alternativamente, R_{2} y R_{3} se pueden unir como se muestra en figura 4, tal como para formar un anillo adicional condensado con los núcleos de acridinio anclados. Las peri-posiciones de los núcleos acridinio C_{1}, C_{2},C_{3}, C_{4},C_{5}, y C_{8}, se sustituyen opcionalmente como se representa mediante R_{2}'.

A^{-} es un contraión el cual se introduce a la par con el nitrógeno cuaternario del núcleo de acridinio bien como un resultado de cuaternarizar el anillo acridina de nitrógeno mediante el uso de agentes alquilantes durante la síntesis, modificación del R_{1}, o bien del intercambio subsiguiente que se lleva a cabo durante el desarrollo de las mezclas de reacción y purificación de los compuestos deseados en una disolución de fluido que contiene cantidad en exceso de otros aniones. Ejemplos de los contraiones incluyen CH_{3}SO_{4}^{-}, FSO_{3}^{-}, CF_{3}SO_{3}^{-}, C_{4}F_{9}SO_{3}^{-}, CH_{3}C_{6}H_{4}SO_{3}^{-}, haluro, CF_{3}COO^{-}, CH_{3}COO^{-}, y NO_{3}^{-},

X es nitrógeno, oxígeno o azufre;

Cuando X es oxígeno o azufre, Z se omite e Y es un resto arilo polisustituido mostrado en la figura 5, donde R_{4} y R_{8} pueden ser (1) hidrógeno o (2) alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR), o grupos amino sustituidos que sirven para estabilizar el enlace -COX- entre el núcleo de acridinio y el resto Y, durante los efectos estéricos o electrónicos. Preferiblemente, uno de ellos es como se define más adelante mientras que el otro es un hidrógeno, si la posición C_{1} a C_{8} del núcleo de acridinio se sustituye con un grupo alquilo inferior, preferiblemente metilo. Más preferiblemente, R_{4} y R_{8} son alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo (-OR), alquiltiol (-SR), o grupos amino sustituidos que sirven para estabilizar el enlace -COX- entre el núcleo de acridinio y el resto Y durante los efectos estéricos y/o electrónicos. Más preferiblemente R_{4} y R_{8} son alquilo inferior (por ejemplo, un grupo metilo).

R_{5} y R_{7} son cualquiera de R_{2}, R_{2}', y R_{3} anteriormente definidos.;

R_{6} es también cualquiera de R_{2}, R_{2}', y R_{3} anteriormente definido, cuando el compuesto de acridinio se usa como un indicador quimioluminiscente libre.

Alternativamente, los compuestos de acridinio se pueden unir covalentemente a un polímero más soluble en agua (natural o sintético) o biopolímeros (por ejemplo proteínas, polisacáridos, glicoproteínas y ácidos nucleicos) en una forma conjugada para potenciar su solubilidad en agua para indicador práctico, de utilidad comercial como quimioluminiscente. Será entonces necesario impartir un grupo funcional reactivo, preferiblemente sobre R_{6} para facilitar formación de enlace covalente entre el compuesto acridinio y el polímero soluble en agua o biopolímero de elección.

Así, R_{6} puede ser también -R_{9}-R_{10}-, donde R_{9} no se requiere pero opcionalmente puede ser alquilo ramificado o de cadena lineal, arilo sustituido o insustituido o aralquilo que contiene opcionalmente hasta 20 heteroátomos, y R10 es un grupo saliente o un grupo electrófilo funcional unido con un grupo saliente que incluye pero no se limita a aquellos mostrados en la figura 6. R_{10} puede ser también -Q-R-Nu, -Q-R-(I)nNu, -Q-Nu, -R- Nu, o - Nu, donde n es un número de al menos valor 1, Nu es un grupo nucleofílico, Q es un enlace funcional, I es un grupo iónico o hidrolizable; se pueden encontrar definiciones detalladas de Nu, Q e I en la patente de los Estados Unidos Nº.: #5,241.070, desde columna 3, línea 45 hasta columna 3, línea 16. Las reacciones contempladas para Nu se describieron también en la misma patente, columna 3, línea 48 a columna 4, línea 18.

R_{5} y R_{6}, y R_{6} y R_{7} son intercambiables; y

Cuando X es nitrógeno entonces Z es .SO_{2}-Y', Y' tiene la misma definición de Y como se describe anteriormente, y ambos pueden ser el mismo o diferentes. Adicionalmente, Y por sí misma puede ser un alquilo ramificado o de cadena lineal que contiene opcionalmente hasta 20 átomos de carbono, halogenado o no halogenado o un arilo sustituido, o sistema de anillo heterocíclico.

De forma similar, la estructura general de los compuestos fenantridinio y quinolinio útiles como los indicadores quimioluminiscentes de la presente invención se pueden representar esquemáticamente como se muestra en la figura 7. Todas las definiciones de los sustituyentes y el contraión de los núcleos fenantridinio y quinolinio descritos anteriormente son los mismos que aquellos descritos para los compuestos acridinio anteriores, excepto por las peri-posiciones posibles para sustituyente R_{2}'que se han rediseñado en las posiciones C_{1}, C_{2}, C_{3}, C_{4}, C_{6}, y C_{9} del núcleo fenantridinio t y posiciones C_{2}, C_{3}, C_{5} y C_{8} del núcleo quinolinio.

B. Modos alternativos de modulación de hidruros de los compuestos quimioluminiscentes acridinio

Además de la reducción de ésteres de acridinio a acridán, el hidruro tal como NADH se puede emplear también para modular la actividad quimioluminiscente de los compuestos acridinio en otras formas novedosas e interesantes las cuales son potencialmente útiles. Varias de tales aproximaciones se resumen más adelante todo lo cual requiere selectividad química (regioselectividad) en la reacción de reducción.

1. Modulación de la labilidad de excisión de éster de acridinio o sulfonilamida

En una aproximación, el hidruro se puede dirigir al resto éster o sulfonilamida (en vez de al núcleo acridinio) del compuesto acridinio para efectuar un cambio en las características del compuesto. Es bien conocido que los ésteres de acridinio con grupos salientes pobres son pobremente quimioluminiscentes. Los grupos salientes pobres son típicamente ricos en electrones y se pueden generar mediante adición de hidruros a grupos funcionales pobres en electrones. Empleando este procedimiento, un éster acridinio o una sulfonilamida que contienen un éster deficiente en electrones o resto sulfonilamida se puede convertir en uno el cual es rico en electrones, convirtiendo así un compuesto fuertemente quimioluminiscente en uno débil. La figura 8 ilustra como se logra esto. Mientras que se transportan algunos de los sustituyentes básicos necesarios y el contraión como se define en la sección A anterior, el núcleo acridinio en la ilustración se manipula deliberadamente para ser rico en electrones mediante el anclaje de uno o más grupos donantes de electrones (relacionados con hidrógeno y designados con la letra D), los cuales son como se define en "Advanced Organic Chemistry" Jerry March Ed., 4º edición, página 18-19, en una o más posiciones óptimas del núcleo acridinio, tal que se logre preferentemente la reducción del resto N-metilpiridinio. Si más de un grupo donante de electrones (D) se sustituye en el núcleo acridinio, los D pueden ser las mismas o diferentes. Para transmitir otras características estructurales importantes o deseables (por ejemplo, hidrofilicidad, grupo funcional, etc.), son permisibles otros sustituyentes adicionales en las peri-posiciones del núcleo acridinio, mientras el efecto electrónico combinado de todos los sustituyentes es aquel de donar electrones. Obviamente, las mismas enseñanzas se aplican a los análogos del éster de acridinio y sulfonilamida como se describe anteriormente en la sección A.

2. Modulación de máxima longitud de onda de emisión de compuestos acridinio

La reducción se puede usar también para alterar la longitud de onda de emisión de un compuesto acridinio. La longitud de onda de emisión de compuestos de acridinio que emiten en azul se puede cambiar a longitudes de onda largas creando un sistema de conjugación electrónica extendido en el núcleo de acridinio como se discute en la solicitud PCR WO 0009487. Dirigiendo la reducción para alterar el sistema conjugado extendido en un compuesto acridinio, la longitud de onda de emisión del compuesto acridinio puede alterarse de longitud de onda larga a corta, variando así la intensidad quimioluminiscente del intervalo de longitud de onda seleccionado bajo seguimiento. La figura 9 ilustra el principio anterior. De nuevo, mientras transportamos algunos de los sustituyentes básicos necesarios y el contraión como se define en la sección A anterior, el núcleo acridinio en la ilustración se manipula deliberadamente para ser rico en electrones mediante el anclaje de uno o más grupos donantes de electrones (relacionados con hidrógeno y designados con la letra D), en una o más posiciones óptimas del núcleo de acridinio, tal que se logre preferentemente la reducción del sistema de conjugación extendida de cadena lateral. Si más de un grupo donante de electrones (D) se sustituye en el núcleo acridinio, los D pueden ser los mismos o diferentes. Para transmitir otras características estructurales importantes o deseables (por ejemplo, hidrofilicidad, grupo funcional, etc.), son permisibles otros sustituyentes adicionales en las peri-posiciones del núcleo acridinio, mientras el efecto electrónico combinado de todos los sustituyentes es aquel de donar electrones. Obviamente, las mismas enseñanzas se aplican a los análogos del éster de acridinio y sulfonilamida como se describe anteriormente en la sección A.

\newpage

3. Modulación del resto desactivador/fluoróforo de los compuestos acridinio

Otros modos de modular la actividad quimioluminiscente se ilustran en el esquema en la figura 9 donde el hidruro resultante de una reacción enzimática altera la estructura del desactivador hidruro-reducible que se une covalentemente al resto acridinio que tiene grupo D, el propósito del cual se describió anteriormente, y así alteró el efecto desactivador. El prerrequisito del desactivador aquí es su capacidad de desactivar la actividad quimioluminiscente del compuesto de acridinio por medio de transferencia de energía de resonancia dipolo-dipolo u otros mecanismos, y su capacidad para reducirse mediante hidruro preferencialmente sobre la reducción del resto acridinio. La reducción en rendimiento cuántico debida al efecto desactivador del desactivador se puede revertir mediante la interacción de hidruro con el desactivador. Así, en la presencia de hidruro, se incrementará el rendimiento cuántico del resto acridinio del conjugado. Una ventaja obvia de modular la actividad quimioluminiscente mediante hidruro usando conjugado de acridinio-desactivador es la correlación positiva entre la concentración del hidruro y la actividad quimioluminiscente del conjugado.

De nuevo, mientras transportamos algunos de los sustituyentes básicos necesarios y el contraión como se define en la sección A anteriormente, el núcleo acridinio en la figura 10 se puede unir con uno o más grupos donantes de electrones, D en una o más posiciones óptimas del núcleo de acridinio, de tal forma que se logra preferencialmente la reducción del desactivador de cadena lateral. Si más de un grupo donante de electrones (D) se sustituye en el núcleo de acridinio, los D pueden ser el mismo o diferentes. De forma similar, para impartir otras características estructurales importantes o deseables (por ejemplo hidrofilicidad, grupo funcional, etc.), son permisibles otros sustituyentes adicionales en las peri-posiciones del núcleo de acridinio, mientras el efecto electrónico combinado de todos los sustituyentes es aquel de donar electrones. Obviamente, la misma enseñanza se aplica también a los análogos del éster de acridinio y sulfonilamida como se describen anteriormente en la sección A.

Un modo alternativo similar al uso del conjugado compuesto de acridinio-desactivador es reemplazar al desactivador con un fluoróforo para formar el conjugado E-fluoróforo. Los conjugados acridinio-fluoróforo, donde el fluoróforo está unido al núcleo acridinio, en sus reacciones quimioluminiscentes, emiten luz en una región del espectro característica del fluoróforo. Esto ocurre por medio de transferencia de energía de resonancia a partir del resto de acridona electrónicamente excitado al fluoróforo. El principio y los ejemplos de los conjugados de AE-fluoróforo se describen en mayor detalle en la solicitud PCT WO 9854574. Una de las plantillas de esta nueva clase de compuestos es el conjugado de éster de acridinio con rodamina como se muestra a continuación. El conjugado emite luz a 628 nm debido a transferencia de energía eficiente desde el resto AE a rodamina después de que ésta se trata con peróxido de hidrógeno en disolución alcalina fuerte. El resto acridinio se puede modificar variando el grupo D de forma que el resto rodamina se reduce selectivamente o preferencialmente mediante hidruro. Como un resultado de la reducción, la intensidad de emisión de la luz a longitud de onda larga debida al resto de rodamina puede disminuir y la intensidad de emisión de la luz a longitud de onda corta debida al resto acridinio puede incrementarse. Así, la cuantificación de hidruro se hace posible bien detectando el decrecimiento de la señal de emisión larga o detectando el incremento de la señal de emisión corta.

De nuevo, mientras transportamos algunos de los sustituyentes básicos necesarios y contraiones como se definen en la sección A anteriormente, los núcleos de acridinio en la figura 11 se pueden unir con uno o más grupos donantes de electrones deseados, D en una o más posiciones óptimas del núcleo acridinio, de tal forma que la reducción del resto fluoróforo de cadena lateral se logra preferencialmente. Si se sustituye más de un grupo donante de electrones (D) en el núcleo acridinio, los D pueden ser el mismo o diferentes. De forma similar, para transmitir otras características estructurales importantes o deseables (por ejemplo, hidrofilicidad, grupo funcional, etc.), otros sustituyentes adicionales son permisibles como las peri-posiciones del núcleo de acridinio, mientras el efecto electrónico combinado de todos los sustituyentes es aquel de donar electrones. Obviamente, la misma enseñanza se aplica también a los análogos del éster de acridinio y sulfonilamida como se describen anteriormente en la sección A.

C. Aplicaciones de los indicadores de quimioluminiscencia del hidruro 1. Conversión de un ensayo Emit® colorimétrico a quimioluminiscente

Modular la actividad quimioluminiscente de compuestos de acridinio con hidruro tiene numerosas aplicaciones en medidas analíticas. Como se mencionó anteriormente, las moléculas indicadoras coloreadas para realizar seguimiento de formación de NADH se han usado para idear inmunoensayos sensibles (véase anteriormente). Hemos descubierto que la formación de NADH (y por analogía de cualquier hidruro) en un sistema se puede cuantificar usando éster de acridinio (y por analogía cualquier compuesto de tipo acridinio), la presente invención describe un procedimiento analítico como se muestra en la figura 12. Aquí, A y AH representan formas oxidadas y reducidas de un compuesto acridinio cuyas propiedades de emisión quimioluminiscente son distinguibles. La fuente de hidruro puede ser química o biológica. Además, el hidruro se puede transferir bien directamente al compuesto acridinio o bien indirectamente a través de la intervención de una enzima tal como diaforasa.

Un beneficio adicional de usar la invención actual es que permite a un laboratorio medir la generación de hidruro por medio del uso de un instrumento que mide quimioluminiscencia, eliminando así la necesidad de usar un espectrofotómetro UV-visible, el cual se necesitó en el pasado para medir la generación de hidruros.

Una prueba diagnóstica comercial, ampliamente usada, llamada Emit® (Emit® es una marca registrada de Behring Diagnostics GMBH y se define más adelante, Schneider, R. S. "Recent Advances in Enzyme Immunoassay" en Ligand Assay; Langan, J. Y Clapp, J.; editores: Masson Publishing USA, Inc. 1981) emplea un formato de inmunoensayo homogéneo y realiza un seguimiento y cuantifica la formación de NADH (directamente mediante espectrofotometría UV) cuya concentración se correlaciona en última instancia con la concentración del analito.

Para demostrar la utilidad de los compuestos de acridinio como u indicador excelente, cuantitativo de NADH, utilizamos esta prueba comercial para tres analitos (teofilina, quinidina y valproato). De forma similar, un ensayo enzimático para la determinación de etanol se da también en el ejemplo 8 para demostrar la utilidad de esta aproximación. También escogemos emplear la reducción directa del compuesto de acridinio con el NADH generado en el ensayo aunque es obvio que la reducción puede llevarse a cabo también a través de la intervención de diaporasa.

Los indicadores hidruros quimioluminiscentes modelo usados para este estudio fueron 2',6'-dimetilfenil-10-metil-acridinio-9-carboxilato (DMAE-\phi) libre de etiqueta y 2',6'-dimetilfenil-10-(3'-sulfopropil)-acridinio-9-carboxilato (NSP-DMAE) conjugado por medio de un enlace carboxamida a seroalbúmina bovina (BSA). Se describe más adelante una demostración específica de la utilidad de ésteres de acridinio como indicadores redox quimioluminiscentes de hidruro donde la señal quimioluminiscente de NSP-DMAE o DMAE-\phi se usa en un inmunoensayo enzimático para la cuantificación de teofilina, quinidina y valproato en suero y también en ensayo enzimático para la cuantificación de etanol en suero. Para este propósito se ha desarrollado un ensayo prototipo en la Bayer Diagnostics Corp. ACS:180® (ACS:180® es una marca registradade Bayer Corporation para el Analizador Quimioluminiscente Automatizado: un sistema de ensayo inmunodiagnóstico totalmente automatizado) usando reactivos de ensayo valproato de modelo 1 y teofilina de Behring Diagnostics Emit® 2000 y también reactivos de ensayo quinidina de Bayer Corporation Immuno 1™ Emit® 2000 igual que un ensayo enzimático para la determinación de etanol en suero con la inclusión de un reactivo Indicador de Redox Quimioluminiscente adicional. Los conjugados DMAE-\phi o NSP-DMAE-BSA son útiles para aplicaciones tanto en medios acuosos como orgánicos. Dado que una amplia diversidad de compuestos acridinio los cuales incluyen AE hidrófilos de la técnica previa como se describe anteriormente han sido bien documentados, los usuarios de la presente invención pueden seleccionar un compuesto acridinio altamente soluble en agua para eliminar el uso de disolventes orgánicos el cual es potencialmente perjudicial para el ensayo. Por lo tanto, el usuario se proporciona con un número de opciones para selección del indicador hidruro quimioluminiscente con solubilidad apropiada para aplicación en una matriz de ensayo con una polaridad dada.

Alternativamente el compuesto acridinio seleccionado como el indicador quimioluminiscente para hidruro se puede conjugar a cualquier número de moléculas pequeñas, macromoléculas o particulados covalentemente o de otro modo, para mejorar o transmitir propiedades tales como, pero no limitadas a, solubilidad, rendimiento cuántico, estabilidad y transferencia de energía resonante.

La técnica de inmunoensayo multiplicada enzimáticamente (Emit®) se desarrolló originalmente por Syva Co. Inc. como una tecnología bioanalítica y se comercializa actualmente en kits por Dade-Behring, Inc., principalmente para realizar seguimientos de fármacos terapéuticos (TDM) con alguna aplicación menor para la detección de fármacos de abuso. Las serie de ensayos de Behring Diagnostics Inc. Emit® homogéneas, automatizadas es actualmente uno de los sistemas diagnósticos preferidos para los analitos TDM. En estos ensayos, un fármaco presente en una muestra de paciente competirá con un conjugado de fármacos-enzimas para una cantidad limitada de anticuerpo, dirigida contra el fármaco. La actividad enzimática conjugada, la cual en este caso es aquella de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G8PDH) de Leuconostoc mesenteroides, se inhibe parcialmente cuando se une al anticuerpo específico para el fármaco. G6PDH cataliza la reducción de adenina nicotinamida dinucleótido (NAD) a su forma reducida, NADH, mediante transferencia de hidruro a partir de glucosa-6-fosfato (G6P) y se realiza un seguimiento mediante la absorbancia UV incrementada a 340 nm debida a la formación de NADH. Una muestra endógena de G6PHD requiere NADP, no NAD, para actividad catalítica y por lo tanto no interferirá con reducción de NAD. Consecuentemente, la actividad catalítica G6PHD del conjugado se correlaciona con la concentración de fármaco en la muestra del paciente a través de la velocidad de formación de NADH, por ejemplo \DeltaA_{340 nm}/minuto. Un kit de ensayo de Behring Diagnostics Inc. Emit® lleva dos reactivos: el reactivo A contiene una disolución tamponada de G6P (sustrato), NAD (cofactor enzimático), y anticuerpos monoclonales murinos reactivos con un analito de fármaco particular, mientras el reactivo B consta de una disolución tamponada de conjugado fármaco-G6PDH.

Dado que el sistema de lectura Bayer Diagnostics ACS:180® emplea un tubo fotomultiplicador para cuantificar señal de quimioluminiscencia, la adaptación de un ensayo Behring Diagnostics Inc. Emit® al Bayer Diagnostics ACS:180® requiere un reactivo original para transducción de la señal colorimétrica a quimioluminiscencia. Este reactivo adicional se llama un indicador redox quimioluminiscente de hidruro (CHI), y el CHI es un compuesto de acridinio. Los siguientes experimentos han indicado que varios derivados ésteres de acridinio se reducen mediante transferencia de hidruros (más probablemente a la posición C-9 del núcleo N-metilacridinio) a partir de una concentración equimolar de NADH en el rango milimolar o micromolar. La velocidad de reducción es lenta, más probablemente debido a que la forma seudobase no es susceptible de reacción de hidruros, asegurando que la disminución diferencial en la quimioluminiscencia se observa incluso en presencia de un gran exceso de hidruro disponible. Por ejemplo, DMAE-\phi reducido (N-alquilacridán) es débilmente quimioluminiscente, cuando se compara con DMAE-\phi y produce señal un poco detectable cuando resplandece; por lo tanto, aunque la concentración comparativa de NADH introducida dentro de una mezcla puede ser mucho mayor que aquella de DMAE-\phi, la concentración relativa NADH se correlaciona con el decrecimiento en la quimioluminiscencia total. Esta correlación se ha establecido. DMAE-\phi, igual que NSP-DMAE, debería, por lo tanto, funcionar como un indicador redox quimioluminiscente de hidruro en un ensayo tipo Emit®, donde las concentraciones del analito incrementadas incrementarían la velocidad de formación de NADH, disminuyendo de este modo la quimioluminiscencia de una cantidad fija de compuesto acridinio incluida en la reacción de ensayo.

La capacidad para medir cambios en las concentraciones de NADH los cuales están en el intervalo de micromolar a milimolar con compuestos acridinio o conjugados en el intervalo nanomolar, han permitido a los inventores medir cambios en las concentraciones del analito (como se reflejan en cambios en concentraciones de NADH) directamente, sin tener bien que diluir las muestras que contienen NADH o bien que añadir un reactivo sumergido secundario para recoger el exceso enorme de NADH en muestras no diluidas.

Una representación esquematica del ensayo anterior se muestra en la figura 13 y se miden ejemplos de tres analitos (teofilina, quinidina y valproato) usando la técnica anteriormente mencionada descrita en detalle en los ejemplos 5-8 igual que para un ensayo enzimático para la cuantificación de etanol. Los datos indican claramente que los compuestos acridinio son indicadores de hidruro cuantitativos, verdaderamente excelentes.

3. Disolver la interferencia del ensayo a partir de una muestra de sangre completa con la inserción de una etapa de captura en fase sólida

Los ensayos homogéneos descritos anteriormente miden la actividad quimioluminiscente residual en la mezcla del ensayo, es decir, concentraciones crecientes del analito conducen a niveles decrecientes de la actividad quimioluminiscente que permanece en la mezcla del ensayo. Dado que el ensayo es homogéneo, sustancias extrañas en la muestra por ejemplo de una muestra de sangre completa, pudieron interferir potencialmente o inhibir la reacción quimioluminiscente del compuesto acridinio con peróxido de hidrógeno. En el evento en que esto se observa, es posible manipular el ensayo de tal forma que esta interferencia/inhibición se elimina. Esto se puede llevar a cabo en un modo más directo como se lustra en la figura 14. En este ensayo, una fase sólida tal como partículas paramagnéticas se introdujo en el extremo del ensayo homogéneo. Las partículas se recubrieron con un anticuerpo el cual es específico para los compuestos acridinio (ref.: U. Piran, y col., patente de los Estados Unidos Nº.: 5.445.936, "Method for Non-Competitive Binding Assays"). Tras la completación del ensayo homogéneo, las partículas se introducen para capturar el compuesto acridinio. Las partículas se pueden lavar después para eliminar las sustancias interfirientes previas a la activación de la reacción quimioluminiscente con peróxido de hidrógeno.

4. Ensayos Emit® quimioluminiscentes heterogéneos

Los ensayos que emplean un formato heterogéneo se pueden también acoplar a la presente invención. La figura 15 ilustra como se puede llevar a cabo esto. Para un ensayo en sándwich que utiliza dos anticuerpos, uno de ellos se puede acoplar al hidruro generando sistemas tales como G6PDH, alcohol deshidrogenasa, etc. La concentración de la etiqueta enzimática en el ensayo se mide después usando el NADH generado por la enzima para reducir la molécula indicadora del compuesto de acridinio. Alternativamente, en un ensayo competitivo para un analito pequeño, el sistema generador de hidruro tal como G6PDH se puede acoplar al analito para usar en el ensayo como un trazador, La lectura de señales en el ensayo se lleva a cabo en una manera similar que en el ensayo en sándwich.

También es obvio que utilizar el sistema generador de hidruro tal como la enzima G6PDH como una etiqueta para los ácidos nucleicos permitirá ensayos de ácidos nucleicos para idearse con compuestos de acridinio como el indicador de hidruro.

Aquellos con experiencia relevante reconocerán variaciones adicionales las cuales son consistentes con la invención descrita. Esta invención se ilustra, pero no se limita, mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 2',6'-dimetilcarbonilfenil 19-metacridinio-9-carboxilato trifluorometanosulfonato (DMAE-\phi) Síntesis de 2',6'-dimetilfenil acridina-9-carboxilato

El ácido acridina-9-carboxílico (5 g) se sometió a reflujo con cloruro de tionilo (\simeq 25 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno en un baño de aceite. El reflujo se mantiene hasta que la reacción se vuelve clara. La disolución se enfría después a temperatura ambiente y se vierte en benceno (200 ml, anhidro). La suspensión de benceno se congeló en el refrigerador durante toda una noche para completar la participación del cloruro ácido el cual se aisló mediante filtración y se aclaró con éter anhidro. Producción = 5,3 g (cuant.).

El cloruro ácido (5,3 g) se mezcló con 2,6-dimetilfenol, dimetilaminopiridina (0,5 g) en piridina anhidra (40 ml). La reacción se calentó en un baño de aceite a 100ºC durante 3 horas. La reacción se enfrió después a temperatura ambiente y el producto en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando acetato de etilo en hexanos 1:4 como eluyente. La concentración de las fracciones ultrarrápidas proporcionó e producto como un polvo amarillo brillante.

\newpage

Síntesis de 2',6'-dimetilfenil 10-metilacridinio-9-carboxilato trifluorometanosulfonato

Una disolución de 2',6'-dimetilfenilacridina-9-carboxilato (20 mg, 0,061 mmol) en diclorometano anhidro (\simeq 2 ml) se trató con trifluorometanosulfonato de metilo (0,175 ml, 25 eq.). La reacción se agito a temperatura ambiente. Se empezó a formar un precipitado amarillo en \simeq 1 hora. La reacción se agito durante \simeq 16 horas y después se añadió éter anhidro (\simeq 50 ml) para precipitar el producto el cual se recogió mediante filtración y se aclaró con éter y después se secó al aire. Rendimiento = 29 mg, MALDI-TOF EM observada: 342,9. (calculada: 342,4.).

Ejemplo 2 2',6'-dimetilfenil 10-metilacridán-9-carboxilato

Síntesis: una disolución de 2',6'-dimetilfenil 10-metilacridinio-9-carboxilato trifluorometanosulfonato (50 mg, 0,105 mmol) en metanol (20 ml, disolución parcial) se enfrió en un baño de hielo y se trató con borohidruro de sodio (20 mg, 0,525 mmol). El color amarillo de la disolución se blanqueó instantáneamente. Después de 1 hora se añadió borohidruro de sodio adicional (20 mg) y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante \simeq 16 horas. La reacción se desactivó después con ácido acético (1 ml) y se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en acetonitrilo. El análisis de HPLC en una columna C18 de 3,9 x 300 mm, con un gradiente de 30 minutos de 10 \rightarrow 100% MeCN/agua (0,05% de TFA en cada una) a una velocidad de flujo de 1 l/minuto y la detección de UV a 260 nm mostraron Tr = 27 minutos (acridán), Tr = 18 minutos (éster de acridinio). El producto se purificó mediante HPLC preparativa y las fracciones de HPLC se liofilizaron a sequedad para proporcionar un polvo blanco. Rendimiento = 30 mg (60%).

Ejemplo 3 Conjugado 2',6'-dimetilfenil 10-(3'-sulfopropil)-acridinio-9-carboxiamidil-BSA

Síntesis: la seroalbúmina bovina (1,65 mg, 25 nmol) se disolvió en 475 \mul de NaHCO_{2} 0,20 M, pH 9,0. Se disolvió NSP-DMAE-NHS (patente de los Estados Unidos 5,656.426) (0,61 mg, 1,03 \mumol) en 103 \mul de N,N-dimetilformamida DMF para hacer una disolución 10 mM. Se mezclaron veinticinco microlitros del NSP-DMAE-NHS con los 475 \mul de disolución BSA y se incubaron a 4ºC durante 16 horas. El conjugado se aisló en agua mediante SEC. La incorporación de NSP-DMAE en BSA fue aproximadamente cuatro etiquetas por molécula de proteína como se calculó a partir de la actividad quimioluminiscente específica de la etiqueta y determinación de proteínas usando el ensayo de proteína Bradford (6,4 \muM).

Ejemplo 4 Preparación de Indicador de Hidruro Quimioluminiscente

a. Se disolvieron nueve miligramos (32 \mumoles) de N(10)-metilacridinio tretrafluoroborato (NMA, Sigma-Aldrich) en 320 \mul de N,N-dimetilformamida (DMF) para hacer una disolución 0,10 M. Una masa de 6,25 mg (13 \mumoles) de DMAE-\phi se disolvió en 2,607 ml de metanol, y se diluyó seriamente en metanol a una concentración de 0,50 \muM. Se mezclaron trescientos microlitros del NMA 0,10 M con 750 \mul del DMAE-\phi 0,50 \muM en 1,95 ml de agua. Alternativamente, NMA y otros dos sumergidos en hidruro, cloruro de cetilpiridio y ácido crotónico, se disolvieron en tampón de glicina 0,20 M, 0,1% BgG, pH 7,4, cuando el indicador quimioluminescente de hidruro usado fue un conjugado covalente de éster de acridinio e IgG (Bayer Diagnostics). El conjugado de éster de acridinio-IgG se diluyó a 12 nM en el mismo tampón.

b. Alternativamente, el conjugado NSP-DMAE_{4}-BSA se diluyó a una concentración de 12 nM en un tampón de glicina 0,20 M, 1,0%(p/v) BSA, pH 7,4.

Ejemplo 5 Ensayo de teofilina usando éster de acridinio como un indicador de quimioluminiscencia de hidruro

En este inmunoensayo enzimático homogéneo automatizado, la teofilina presente en una muestra de un paciente competirá con un conjugado de teofilina-G6pDH para unir a una cantidad limitada de anticuerpo monoclonal anti-teofilina, murino. La unión del anticuerpo antiteofilina al conjugado teofilina-G6PDH inhibe parcialmente la actividad enzimática. G6PDH cataliza la reducción de dinucleótido adenina nicotinamida oxidada (NAD) a la forma reducida NADH mediante transferencia de hidruro a partir de glucosa-6-fosfato (G6P). El hidruro se transfirió después químicamente del NADH al DMAE-\phi o NSP-DMAE conjugado a BSA. Consecuentemente, la actividad catalítica G6PDH del conjugado está correlacionada con la concentración de teofilina en la muestra del paciente e inversamente correlacionada con la quimiolumuniscencia residual de la reacción de ensayo.

El siguiente ensayo se hizo funcionar en su totalidad mediante el Bayer Diagnostics ACS:180® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). Las cubetas se cargaron en la prueba, después se añadieron 10 \mul de los estándares o controles del ensayo de teofilina ACS de Bayer Diagnostics Corp. a sus cubetas respectivas en repeticiones de tres. Los estándares contenían teofilina en concentraciones de 0,00, 13,9, 27,8, 55,5, 111 y 222 \muM. Los controles de ligando de Bayer Diagnostics 1, 2 y 3 contenían teofilina en concentraciones especificadas en la siguiente tabla. A cada cubeta, se añadieron 300 \mul del reactivo 1 del ensayo de teofilina Behring Diagnostics Emit® 2000, que contiene una disolución tamponada de G6P, NAD, y anticuerpo antiteofilina, y se incubaron a 37ºC durante 2 minutos y 40 segundos. A esto se añadieron 150 \mul del reactivo 2 del ensayo de teofilina Behring Diagnostics Emit® 2000, que consta de una disolución tamponada de conjugado teofilina-G6PDH. Las cubetas se incubaron a 37ºC durante otros 2 minutos y 40 segundos, después se añadieron 20 \mul del indicador quimioluminiscente, que contiene bien NMA 10 mM y DMAE-\phi 125 nM en DMF acuoso al 10% (v/v) y metanol al 25% (v/v) o bien conjugado NSP-DMAE_{4}-BSA 12 nM, glicina 0,20 M, BSA al 1,0% (p/v), pH 7,4, para una incubación final a 37ºC durante 5 minutos. Dado que el ensayo es homogéneo se cambiaron los lavados 1 y 2, igual que las situaciones de vacío 1, 2 y 3. Las mezclas de reacción se mezclaron secuencialmente con reactivos 1 (HNO_{3} 0,1 N, H_{2}O_{2} 0,5% (p/v)) y 2 (NaOH 0,25 N, 0,5% (p/v) tensioactivo cloruro de N,N,N,N-hexadeciltrimetilamonio) de ACS de Bayer Diagnostics para iniciar la reacción quimioluminiscente.

Ejemplo 6 Ensayo de valproato que usa éster de acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro

En este inmunoensayo enzimático homogéneo automatizado, el valproato presente en una muestra de un paciente competirá con un conjugado de valproato-G6pDH para unir a una cantidad limitada de anticuerpo monoclonal anti-valproato, murino. La unión del anticuerpo antivalproato al conjugado valproato-G6PDH inhibe parcialmente la actividad enzimática. G6PDH cataliza la reducción de dinucleótido adenina nicotinamida oxidada (NAD) a la forma reducida NADH mediante transferencia de hidruro a partir de glucosa-6-fosfato (G6P). El hidruro se transfirió después químicamente del NADH al DMAE-\phi o NSP-DMAE conjugado a BSA. Consecuentemente, la actividad catalítica G6PDH del conjugado está correlacionada con la concentración de valproato en la muestra del paciente e inversamente correlacionada con la quimiolumuniscencia residual de la reacción de ensayo.

El siguiente ensayo se hizo funcionar en su totalidad mediante el Bayer Diagnostics ACS:180® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). Las cubetas se cargaron en la prueba, después se añadieron 10 \mul de los estándares o controles internos del ensayo de valproato ACS de Bayer Diagnostics Corp. a sus cubetas respectivas en repeticiones de tres. Los estándares contenían valproato en concentraciones de 0,000, 86,7, 173, 347, 693 y 1387 \muM. Los controles A, B y C TDM internos de Bayer Diagnostics contenían valproato en las concentraciones especificadas de la siguiente tabla. A cada cubeta, se añadieron 225 \mul del reactivo 1 del ensayo de valproato Behring Diagnostics Emit® 2000, que contiene una disolución tamponada de G6P, NAD, y anticuerpo antivalproato, y se incubaron a 37ºC durante 2 minutos y 40 segundos. A esto se añadieron 225 \mul del reactivo 2 del ensayo de valproato Behring Diagnostics Emit® 2000, que consta de una disolución tamponada de conjugado valproato-G6PDH. Las cubetas se incubaron a 37ºC durante otros 2 minutos y 40 segundos, después se añadieron 20 \mul del indicador quimioluminiscente, que contiene bien NMA 10 mM y DMAE-\phi 125 nM en DMF acuoso al 10% (v/v) y metanol al 25% (v/v) o bien conjugado NSP-DMAE_{4}-BSA 12 nM, glicina 0,20 M, BSA al 1,0% (p/v), pH 7,4, para una incubación final a 37ºC durante 5 minutos. Dado que el ensayo es homogéneo se cambiaron los lavados 1 y 2, igual que las situaciones de vacío 1, 2 y 3. Las mezclas de reacción se mezclaron secuencialmente con reactivos 1 (HNO_{3} 0,1 N, H_{2}O_{2} 0,5% (p/v)) y 2 (NaOH 0,25 N, 0,5% (p/v) tensioactivo cloruro de N,N,N,N-hexadeciltrimetilamonio) de ACS de Bayer Diagnostics para iniciar la reacción quimioluminiscente. Los datos de quimioluminescencia de recogieron durante 5 segundos como fotones detectados por el luminómetro ACS y se expresan en unidades de luz relativas (RLUs).

Ejemplo 7 Ensayo de quinidina que usa éster de acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro

En este inmunoensayo enzimático homogéneo automatizado, la quinidina presente en una muestra de un paciente competirá con un conjugado quinidina-G6pDH para unir a una cantidad limitada de anticuerpo monoclonal anti-quinidina, murino. La unión del anticuerpo antiquinidina al conjugado quinidina-G6PDH inhibe parcialmente la actividad enzimática. G6PDH cataliza la reducción de dinucleótido adenina nicotinamida oxidada (NAD) a la forma reducida NADH mediante transferencia de hidruro a partir de glucosa-6-fosfato (G6P). El hidruro se transfirió después químicamente del NADH al DMAE-\phi o NSP-DMAE conjugado a BSA. Consecuentemente, la actividad catalítica G6PDH del conjugado está correlacionada con la concentración de quinidina en la muestra del paciente e inversamente correlacionada con la quimioluminiscencia residual de la reacción de ensayo.

El siguiente ensayo se hizo funcionar en su totalidad mediante el Bayer Diagnostics ACS:180® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). Las cubetas se cargaron en la prueba, después se añadieron 10 \mul de los estándares o controles del ensayo de quinidina ACS de Bayer Diagnostics Corp. a sus cubetas respectivas en repeticiones de tres. Los estándares contenían quinidina en concentraciones de 0,00, 0,77, 1,5, 3,1, 6,2, 12, 18 y 25 \muM. A cada cubeta, se añadieron 160 \mul del reactivo 1 del ensayo de quinidina Behring Diagnostics Emit® 2000, que contiene una disolución tamponada de G6P, NAD, y anticuerpo antiquinidina, y se incubaron a 37ºC durante 2 minutos y 40 segundos. A esto se añadieron 80 \mul del reactivo 2 del ensayo de quinidina Behring Diagnostics Emit® 2000, que consta de una disolución tamponada de conjugado quinidina-G6PDH. Las cubetas se incubaron a 37ºC durante otros 2 minutos y 40 segundos, después se añadieron 20 \mul del indicador quimioluminiscente, que contiene conjugado NSP-DMAE_{4}-BSA 12 nM, glicina 0,20 M, BSA al 1,0% (p/v), pH 7,4, para una incubación final a 37ºC durante 5 minutos. Dado que el ensayo es homogéneo se cambiaron los lavados 1 y 2, igual que las situaciones de vacío 1, 2 y 3. Las mezclas de reacción se mezclaron secuencialmente con reactivos 1 (HNO_{3} 0,1 N, H_{2}O_{2} 0,5% (p/v)) y 2 (NaOH 0,25 N, 0,5% (p/v) tensioactivo cloruro de N,N,N,N-hexadeciltrimetilamonio) de ACS de Bayer Diagnostics para iniciar la reacción quimioluminiscente. Los datos de quimioluminiscencia se recogieron durante cinco segundos como fotones detectados mediante luminómetro ACS y expresados en unidades de luz relativa (RLUs).

Ejemplo 8 Ensayo enzimático para etanol homogéneo, quimioluminométrico usando un éster de acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro

En este inmunoensayo enzimático homogéneo automatizado, el etanol presente en una muestra de un paciente se oxida a acetaldehído a través de la acción catalítica de una cantidad fija de deshidrogenasa de alcohol de levaduras (ADH) con reducción de hidruro concurrente del cofactor dinucleótido de adenina nicotinamida (NAD) a NADH. El equilibrio a favor de la oxidación del etanol a acetaldehído se promueve adicionalmente con la adición de un captador de aldehído hidracida. El hidruro se transfiere químicamente al NADH al NSP-DMAE conjugado a BSA. Consecuentemente, la concentración del etanol se correlaciona con formación NADH y se realciona inversamente von la quimioluminiscencia residual de la reacción de ensayo.

El siguiente ensayo se hizo funcionar en su totalidad mediante el Bayer Diagnostics ACS:180® (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). Las cubetas se cargaron en la prueba, después se añadieron 10 \mul de los estándares preparados mediante dilución seriada de etanol en suero a sus cubetas respectivas en repeticiones de tres. Los estándares contenían etanol en concentraciones de 0,00, 0,025, 0,050, 0,10, 0,20 y 0,40% (p/v). A cada cubeta se añadieron 150 \mul de reactivo A de ensayo de etanol, conteniendo fosfato de sodio 0,15 M, clorhidrato de hidrazinacarboxamida 0,15 M, pH 9,0, y se incubaron a 37ºC durante 2 minutos y 40 segundos. A esto se añadieron 150 \mul de reactivo B de ensayo de etanol, que constó de 22 mM de glicina, 12 mM de NAD, 14 \muM de ADH, 1,0 mg/ml de BSA, pH 7,0. Las cubetas se incubaron a 37ºC durante otros 2 minutos y 40 segundos, después se añadieron 20 \mul del indicador quimioluminiscente, que contiene conjugado NSP-DMAE_{4}-BSA 12 nM, glicina 0,20 M, BSA al 1,0% (p/v), pH 7,4, para una incubación final a 37ºC durante 5 minutos. Dado que el ensayo es homogéneo se cambiaron los lavados 1 y 2, igual que las situaciones de vacío 1, 2 y 3. Las mezclas de reacción se mezclaron secuencialmente con reactivos 1 (HNO_{3} 0,1 N, H_{2}O_{2} 0,5% (p/v)) y 2 (NaOH 0,25 N, 0,5% (p/v) tensioactivo cloruro de N,N,N,N-hexadeciltrimetilamonio) de ACS de Bayer Diagnostics para iniciar la reacción quimioluminiscente. Los datos de quimioluminiscencia se recogieron durante cinco segundos como fotones detectados mediante luminómetro ACS y expresados en unidades de luz relativa (RLUs).

Procedimiento de calcular los parámetros del ensayo. Las medias aritméticas de RLU resultan de la concentración de un analito específico, representado aquí como \mu, se calcularon a partir de tres repeticiones. Existe una relación inversa, no lineal, entre la concentración del analito presente en el estándar y los RLU detectados,

y = y_{0} + \frac{(y_{\infty} - y_{0})}{(1 + 10^{-m \ log \ x-b})}

donde x es la concentración del analito, e y es la señal observada generada como RLU (Rocbard, David; Ligand Análisis; (1981); Langon, J.; Clapp, J. (Eds.); Masson Publishing, Inc., Nueva York; páginas 45-101) (Nix, Barry; The Immunoassay Handbook; (1994); Wild, David (Ed.); Stockton Press, Inc., Nueva York; páginas 17-123) (Van Lente, Frederick, Galen, Robert, S.; Enzyme-immunoassay; (1980); Maggio, Edward T. (Ed.); CRC Press, Inc., Boca Ratón; páginas 135-153).

Adicionalmente, hay cuatro parámetros, a saber la constante de regresión, b, el coeficiente de regresión, m, el límite asintomático de la dosis infinita, y_{\infty}, el límite asintomático de la dosis cero, y_{0}. Los tres últimos de estos parámetros se calcularon directamente usando la función de análisis iterativa, estándar, logística de cuatro parámetros del programa DOSECALC.EXE Rev.1.73 (Bayer Diagnostics Corp., Walpole, MA). La media aritmética de la constante de regresión b se determinó sobre el intervalo entero de concentraciones de analito según se calcularon a partir de la expresión de respuesta de dosis reescrita como

b = -log \frac{y_{\infty} - y}{y - y_{0}} - mlogx.

Las concentraciones de analito de compuestos desconocidos se calcularon subsiguentemente usando la respuesta a dosis establecida como

X = 10^{\{log[(y_{\infty}- y)/(y - y_{0})]+b\}/-m}.

Curvas estándar de ensayo teofilina, quinidina y valproato que usan éster de acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro. Un gráfico de los RLU frente a la concentración de analitos ilustra la relación inversa, no lineal entre quimioluniniscencia y concentración de analito. La posición fue buena, estando por debajo del 5% de C.V. para todos los puntos.

Claramente, los compuestos de acridinio funcionarán como indicadores quimioluminiscentes de hidruro bien como indicadores libres disueltos en disolventes orgánicos o bien como conjugados hidrófilos cuando se unen covalentemente a proteína.

Precisión de ensayo en determinación de concentraciones de teofilina y valproato. Las concentraciones de analito se determinaron por los controles de ligando usando la función estándar 4 PL. Los valores determinados se compararon con los intervalos establecidos en la literatura asociada a producto, como se muestra en la figura 21.

La variación en intervalos de analito especificados entre diferentes productos de ensayo es considerable para un número de controles de ligando multinivel debido a la diferente susceptibilidad al efecto en la matriz. Dado que los intervalos aceptables de las concentraciones de analito no se han establecido bien para el nuevo formato de ensayo descrito en la presente invención, se espera alguna diferencia. Los valores determinados son suficientemente similares a los límites de control referidos de forma que los inventores pueden demostrar la utilidad de un compuesto acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro para la cuantificación de teofilina y valproato en un inmunoensayo enzimático homogéneo.

Ejemplo 9 Curvas estándar de ensayo de etanol que usan éster de acridinio como un indicador quimioluminiscente de hidruro

Un gráfico de los ERU frente a concentración de analito (véase figura 22) ilustra la relación inversa, no lineal, entre quimioluminiscencia y concentración de analito. Como con los ensayos Emit® quimiolumimétricos, la precisión en el ensayo del etanol estuvo bien por debajo del 5% de C.V. para todos los puntos.

Claims (19)

1. Un procedimiento de ensayo quimioluminiscente para detectar o cuantificar hidruro, dicho ensayo comprende medir la cantidad de quimioluminiscencia generada a partir de un compuesto quimioluminiscente en una reacción en la cual dicho compuesto bioluminiscente reacciona con un hidruro generado a partir de una reacción catalizada químicamente, bioquímicamente o enzimáticamente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el cual dicho compuesto quimioluminiscente es un compuesto de acridinio, benzacridinio, fenantridinio, quinolinio o lucigenina, o el conjugado de dicho acridinio, benzacridinio, fenantridinio, quinolinio o lucigenina.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el cual dicho hidruro reacciona con el núcleo de dicho compuesto quimioluminiscente.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el cual dicho hidruro reacciona con el conjugado de dicho compuesto quimioluminiscente.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el cual dicho hidruro reacciona con el derivado éster o sulfonilamida de dicho compuesto quimioluminiscente.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el cual dicho hidruro reacciona con dicho compuesto quimioluminiscente que contiene

(a) un sistema de conjugación electrónico extendido,

(b) un desactivador hidruro-reducible,

(c) uno o más grupos donantes de electrones, o

(d) un aceptor de energía de resonancia fluorescente.

7. Un procedimiento para determinar la cantidad de hidruro producido en una reacción que comprende

(a) añadir una cantidad conocida de un compuesto quimioluminiscente a dicha mezcla de reacción,

(b) medir la cantidad de quimioluminiscencia emitida desde dicha mezcla de reacción después de la adición de reactivos los cuales liberan dicha quimioluminiscencia,

(c) comparar la cantidad de quimioluminiscencia producida con la quimioluminiscencia esperada en ausencia de hidruro, y

(d) calcular la cantidad de dicho hidruro presente por comparación con una curva estándar.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho hidruro se genera en un procedimiento de ensayo para un analito.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 en el cual dicho compuesto quimioluminiscente es un compuesto de acridinio, benzacridinio, fenantridinio, quinolinio o lucigenina, o el conjugado de dicho acridinio, benzacridinio, fenantridinio, quinolinio o lucigenina.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el cual dicho compuesto de acridinio o benzacridinio es un éster de acridinio o un éster de benzacridinio, sulfonilamida de acridinio o sulfonilamida de benzacridinio.

11. El procedimiento de la reivindicación 7 en el cual dicho hidruro se produce en una reacción redox bioquímica de un cofactor enzimático.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el cual dicho cofactor es NAD+, NADP+, FMN o FAD.

13. Un procedimiento para determinar la cantidad de un analito en una muestra determinando la cantidad de hidruro producida en una reacción que comprende

(a) añadir una cantidad conocida de un compuesto quimioluminiscente a dicha mezcla de reacción,

(b) medir la cantidad de quimioluminiscencia emitida desde dicha mezcla de reacción después de la adición de reactivos los cuales liberan dicha quimioluminiscencia,

\newpage

(c) comparar la cantidad de quimioluminiscencia producida con la quimioluminiscencia esperada en la ausencia de hidruro, y

(d) calcular la cantidad de dicho analito presente mediante comparación con una curva estándar.

14. El procedimiento de la reivindicación 13 en el cual dicho analito es teofilina, valproato, quinidina o etanol y dicha muestra es suero.

15. Un procedimiento de determinación quimioluminiscente de analito en una muestra que comprende

(a) añadir secuencialmente a dicha muestra los reactivos a partir de un ensayo colorimétrico para hidruro y un indicador quimioluminiscente de hidruro,

(b) medir la quimioluminiscencia generada y

(c) comparar dicha luminiscencia generada con una curva de calibración para determinar la cantidad de analito en cada muestra.

16. Un kit que comprende

(a) los reactivos para un ensayo colorimétrico para hidruro y

(b) un indicador quimioluminiscente de hidruro.

17. El procedimiento de la reivindicación 15 en el cual dicha quimioluminiscencia generada se mide en un analizador de quimioluminiscencia o sistema diagnóstico.

18. El procedimiento de la reivindicación 13 para eliminación de interferencia que resulta de la presencia de sangre entera que comprende, antes de la medida de quimioluminiscencia,

(a) la adición de una fase sólida recubierta con un antibiótico específico para un compuesto acridinio,

(b) incubación de la mezcla de reacción para permitir la captura de dicho compuesto acridinio,

(c) separar dicha fase sólida y lavar dicha fase sólida separada para eliminar dicha sustancia que interfiere.

19. El procedimiento de la reivindicación 15 para eliminación de interferencia que resulta de la presencia de sangre entera que comprende, antes de la medida de quimioluminiscencia,

(a) la adición de una fase sólida recubierta con un anticuerpo específico para un compuesto acridinio,

(b) incubación de la mezcla de reacción para permitir la captura de dicho compuesto acridinio,

(c) separar dicha fase sólida y lavar dicha fase sólida separada para eliminar dicha sustancia que interfiere.