ES2249221T3 - Procedimiento para la purificacion de s-adenosil-l-metionina y para la preparacion de sus sales farmaceuticamente aceptables. - Google Patents
Procedimiento para la purificacion de s-adenosil-l-metionina y para la preparacion de sus sales farmaceuticamente aceptables.Info
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Abstract
Un procedimiento para la purificación de S- adenosil-L-metionina a partir de levadura enriquecida que contiene, al menos 10 g/L de ella, que comprende: (a) ¿ ajustar el pH a 1, 8-2, 2; (b) - preparar un lisato acuoso de S-adenosil-L- metionina a partir de la levadura enriquecida, a una temperatura igual a 70-92ºC, hacer pasar la levadura a través de un cambiador de tipo placa, en contracorriente, durante un tiempo de contacto igual a 5-45 s; (c) - enfriar el lisato a una temperatura igual a 2- 30ºC; (d) - ultrafiltrar el lisato y, subsiguientemente, ajustar el pH a 3, 0-6, 8; (e) - adsorber, al menos 90 g/L del ultrafiltrado sobre una resina de ácido débil, en la que el tamaño de partícula es igual a malla 30-50, y eluir con una disolución 0, 1-2N de un ácido inorgánico; (f) - ajustar el pH a 2, 0-2, 5; (g) - decolorar el eluato; (h) - concentrar el eluato; (i) - deshidratar por congelación el eluato.
Description
Procedimiento para la purificación de
S-adenosil-L-metionina
y para la preparación de sus sales farmacéuticamente aceptables.
La invención se refiere a un procedimiento para
la purificación de
S-adenosil-L-metionina
(en lo sucesivo SAMe) y para la preparación de sus sales
farmacéuticamente aceptables. Particularmente, la invención se
refiere a un procedimiento para la purificación de SAMe y para la
preparación de sus sales farmacéuticamente aceptables a partir de
levadura enriquecida con SAMe.
Como es bien conocido, SAMe es un donador de
metilo fisiológico implicado en reacciones de transmetilación
enzimáticas, que se pueden encontrar en cualquier organismo vivo, y
que tienen efectos terapéuticos hacia patologías hepáticas crónicas,
adiposis, lipemia, arterioesclerosis y es deseable, por tanto,
producirla en grandes cantidades.
Sin embargo, se ha observado un obstáculo para el
uso de la molécula de interés, a escala industrial, debido a su
inestabilidad térmica, incluso a temperatura ambiente, y a la
complejidad de los procedimientos para su preparación y
purificación.
Se conocen varios procedimientos para la
purificación de SAMe y para la preparación de sus sales
farmacéuticamente aceptables.
Sin embargo, los procedimientos conocidos de
purificación comprenden el uso de resinas de ácidos fuertes
(documento JP 13680/1971) o resinas quelatadas (documento JP
20998/1978) o se usan reactivos caros tales como ácidos pícrico y
picrolínico (Patentes de EE.UU. 3.707.536 y 3.954.726).
También se conocen procedimientos de purificación
que usan resinas de ácidos débiles (documentos JP 14299/1981,
FR-A-2531714,
EP-A-0141914); sin embargo,
solamente permiten una separación parcial de SAMe y, por tanto, una
pureza insuficiente que no permite el uso farmacéutico del
producto.
Sin embargo, aun cuando alguno de los
procedimientos mencionados más arriba permite obtener una pureza más
alta, en algunos casos (documento FR-2531714), se
contempla el uso de bicarbonato potásico con el fin de extraer el
producto de las células, obteniendo la precipitación del perclorato
potásico como resultado, lo cual ocasiona, en primer lugar,
problemas relacionados con la separación y, después, residuos. Para
obtener un buen grado de pureza, en el caso del documento
EP-A-0141914, se dispone, en
efecto, el uso de columnas cromatográficas que comprenden resinas
de malla 100-200, lo cual supone altos costes en lo
que respecta a la inversión y al servicio.
En cuanto a las sales farmacéuticamente
aceptables de SAMe, los procedimientos conocidos (documentos US
3893999, US 3954726, US 4057686,
EP-A-0073376) se refieren
principalmente a la obtención de sales específicas y, no obstante,
resultan ser inapropiadas a escala industrial, también debido al uso
de reactivos caros y a los enormes volúmenes de reacción
requeridos.
También el documento
EP-A-0141914, a pesar del hecho de
que describe un procedimiento que permite la producción de sales de
SAMe estables, aplicables a escala industrial y con mejores
rendimientos en comparación con los que se pueden obtener por el
procedimiento escudriñado más arriba, ocasiona el enriquecimiento de
la levadura que contiene SAMe y la subsiguiente lisis de las células
en presencia de un disolvente orgánico (por ejemplo acetato de
etilo, acetona, etc.) usando, además, como ya se ha mencionado más
arriba, enormes cantidades de una resina que tiene un tamaño de
partícula de malla 100-200. El uso de disolventes
para la extracción de SAMe necesariamente ocasiona emplear
instalaciones antidetonantes, sistemas de recuperación y destilación
y sistema de recuperación de disolventes, además del secado
necesario del micelio extraído, con el fin de evitar descargarlo con
algún disolvente residual, que evidentemente ocasiona costes
adicionales de inversión y de producción.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente
invención se refiere a un procedimiento para la purificación de SAMe
a partir de levadura enriquecida, que contiene, al menos 10 g/L de
SAMe, que comprende:
- (a)
\;
- - ajustar el pH a 1,8-2,2;
- (b)
\;
- - preparar un lisato acuoso de SAMe a partir de levadura enriquecida, a u-na temperatura igual a 70-92ºC, permitir pasar la levadura a través de un cambiador de tipo de placa, en contracorriente, durante un tiempo de contacto de 5-45 s;
- (c)
\;
- - enfriar el lisato a una temperatura igual a 2-30ºC;
- (d)
\;
- - ultrafiltrar el lisato y el subsiguiente ajuste del pH a 3,0-6,8;
- (e)
\;
- - adsorber, al menos 90 g/L del ultrafiltrado sobre una resina de ácido débil, en la que el tamaño de partícula es igual a malla 30-50, y eluir con una disolución 0,1-2N de un ácido inorgánico;
- (f)
\;
- - ajustar el pH a 2,0-2,5;
- (g)
\;
- - decolorar el eluato;
- (h)
\;
- - concentrar el eluato;
- (i)
\;
- - deshidratar por congelación el eluato.
De acuerdo con un aspecto preferido, la
temperatura en la etapa (c) es igual a 6-8ºC, en
tanto que en la etapa (d) se ajusta a 4,8-5,2.
El ultrafiltrado que deriva de la etapa (d) se
adsorbe, preferiblemente, sobre la resina hasta su saturación.
El procedimiento de la invención permite evitar
el uso de disolventes orgánicos en la preparación del lisato, con
evidentes ventajas en cuanto a las etapas que se refieren a la
purificación de SAMe y/o sus sales farmacéuticamente aceptables, así
como también a la ecología y ambiente.
La presente invención permite, también, el uso de
cantidades reducidas de resina, que tiene también un tamaño de
partícula corriente igual a malla 30-50 y, por
tanto, resulta ser ventajoso económicamente.
Es posible, también, obtener las sales
farmacéuticamente aceptables de SAMe que tienen un rendimiento y
pureza mayores que los obtenibles por los procedimientos conocidos;
efectivamente, se obtiene un grado, al menos igual a 98% y un
rendimiento igual a, al menos 90%, basados en el producto de
fermentación
Debido a sus condiciones particulares, el
procedimiento de la invención permite evitar la degradación de SAMe
durante la preparación del lisato, logrando obtener una lisis con un
rendimiento superior a 98% y un contenido de productos secundarios,
el principal de los cuales es
5-deacil-5-metiltioadenosina,
inferior a 1%.
Al contrario de lo que se describe en la citada
técnica anterior (documento EP-0141914), se ha
observado, también, que la absorción de cantidades enormes, al menos
igual a 90 g/L de SAMe, y preferiblemente hasta que se alcanza la
saturación de la resina, en lugar de los 5-30 g/L
corrientes, en la que la resina muestra un tamaño de partícula igual
a malla 30-50, en lugar de malla
100-200, supone una notable rebaja de costes y la
reducción de la pérdida de carga a escala industrial.
Tales condiciones sorprendentes, que están
relacionadas con la carga de la resina, suponen, tal como ya se ha
mencionado, una purificación básicamente completa y, al mismo
tiempo, permiten rebajar drásticamente las cantidades de resina
requeridas.
El desprendimiento directo de impurezas durante
la absorción de, al menos 90 g/L sobre la resina ha resultado,
también, claramente y, como consecuencia, la inutilidad de realizar
levigaciones adicionales, contrariamente a lo dispuesto en la
técnica anterior mencionada más arriba, en el intento de obtener
directamente una gran cantidad del producto final.
Por ejemplo, SAMe se puede producir fermentando
un micro-organismo apropiado tal como
Saccharomyces pastorianus (antes conocido como
Saccharomyces carlsbergensis CBS 1513), Saccharomyces
cerevisiae (IFO 2044), Torulopsis utilis y Candida
utilis.
La levadura que contiene SAMe se puede enriquecer
por los procedimientos conocidos en la técnica, tales como por el
método de Schlenk descrito en "The Journal of Biological
Chemistry", vol. 29, pág. 1037, (1987).
La levadura enriquecida con SAMe, que contiene
aproximadamente, al menos 10 g/L de SAMe, con el fin de ser usada
ventajosamente en la realización de la presente invención, se somete
a un proceso de lisis celular, después de haber ajustado el pH a
1,8-2,2, y permitido que la levadura pase a través
de un cambiador de presión de tipo doble, a una temperatura igual a
70-92ºC y durante un tiempo de contacto de
5-45 s.
Después de haber sido enfriado a una temperatura
igual a 2-30ºC, el lisato resultante se somete a
ultrafiltración, y subsiguientemente se ajusta el pH a
3,0-6,8.
El ultrafiltrado se absorbe, luego, sobre una
resina de ácido débil, preferiblemente una carboxílica catiónica,
tal como IRC86 disponible de Rohm and Haas^{R}, que tiene un
tamaño de partícula igual a malla 30-50, hasta al
menos 90 g/L, y preferiblemente hasta saturación, y eluyendo
finalmente con una disolución de un ácido inorgánico tal como, por
ejemplo, ácido sulfúrico, clorhídrico, nítrico
0,1-2N, etc.
Después de ajustar el pH a
2,0-2,5, la decoloración del eluato se realiza, por
ejemplo, mediante una resina copolímera de
estireno-divinilbenceno, tal como Resindion^{R}
SP825L, o usando un tamiz molecular, realizando subsiguientemente la
concentración y finalmente la deshidratación por congelación de la
disolución resultante.
El SAMe así obtenido presenta una titulación
superior a 98% como media.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención describe un procedimiento para la preparación de las
sales, farmacéuticamente aceptables, de SAMe, el cual comprende la
purificación de SAMe de acuerdo con lo que ya se ha descrito y en el
que, después de decolorar el eluato en la etapa (g), cantidades
estequiométricas de ácidos farmacéuticamente aceptables, incluso en
mezcla entre ellos, preferiblemente ácido sulfúrico y ácido
paratoluensulfónico, se añaden a dicho eluato, con el fin de obtener
las correspondientes sales, farmacéuticamente aceptables, de
SAMe.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin
limitarla.
1.000 L de levadura obtenidos por fermentación de
Saccharomyces carlsbergensis, enriquecidos en SAMe de acuerdo
con el método de Schlenk (titulación media 10 g/L), y ajustados a pH
2 con H_{2}SO_{4}, se hicieron pasar a través de cambiadores de
dos placas (disponibles de ALFA-LAVAL; placas: 0,5
m^{2} + 3 m^{2}) mediante una bomba de dosificación (disponible
de CODIP) a la temperatura de 76ºC-78ºC, con una
disolución de agua caliente a 88ºC. Desde la temperatura ambiente
hasta 76ºC-78ºC, el tiempo de calentamiento fue de
aproximadamente 8 s, manteniendo tal temperatura durante
20-45 s. La disolución se enfrió, luego, usando
primero agua fría y, después, salmuera, hasta que la disolución se
llevó a una temperatura de aproximadamente 6ºC.
La disolución se hizo pasar a través de una
membrana de ultrafiltración HYDRO AIR para descargar el sólido que
consistía en subproductos de micelio.
El pH de la disolución se llevó, finalmente, a
4,8-5,2 añadiendo NH_{4}OH al 28%.
La absorción de columna sobre una resina IRC 86
(Rohm and Haas^{R} - malla 30-50) se llevó a cabo
con un flujo igual a 0,8-2 BV/h (cantidad de líquido
que pasa a través de la resina/hora) con respecto a 1.000 L de
resina.
La absorción se ha de llevar a cabo hasta que, al
menos 90 g/L se han cargado en la columna. De 60 g/L en adelante,
dada la selectividad del tipo de resina, las impurezas presentes en
las disoluciones absorbidas, y particularmente adenosina, se
desechan directamente durante la absorción.
A continuación se llevó a cabo levigación con
H_{2}SO_{4} 0,5N, y separación de las primeras fracciones que
contienen impurezas.
El eluato recogido se ajustó a un pH de
2-2,5 mediante NH_{4}OH, luego se hizo pasar a
través de un tamiz molecular para decoloración (y elución de
posibles trazas de metiltioadenosina). Se obtuvieron 93 KA
(kiloactividad) de SAMe, a lo que se añadieron las correspondientes
cantidades de ácido sulfúrico y ácido paratoluensulfónico.
A continuación, la disolución se condujo por
tubería a deshidratación por congelación; por término medio, se
obtuvieron 170-175 kg de
sulfato-paratoluensulfonato de SAMe con una
titulación \geq98%.
500 L de levadura obtenidos por fermentación de
Saccharomyces carlsbergensis enriquecida con
SAMe de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, que tiene una actividad igual a 12 g/L, se llevaron a una temperatura de aproximadamente 5ºC, con un pH \approx2, añadiendo ácido sulfúrico y, después, se hicieron pasar a través de dos cambiadores de placa disponibles de ALFA-LAVAL (0,25 m^{2} y 1,5 m^{2} respectivamente) y se mantuvieron a 78ºC durante 25 s.
SAMe de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, que tiene una actividad igual a 12 g/L, se llevaron a una temperatura de aproximadamente 5ºC, con un pH \approx2, añadiendo ácido sulfúrico y, después, se hicieron pasar a través de dos cambiadores de placa disponibles de ALFA-LAVAL (0,25 m^{2} y 1,5 m^{2} respectivamente) y se mantuvieron a 78ºC durante 25 s.
La disolución se enfrió con agua fría hasta
6-8ºC en la salida del cambiador.
La disolución, después de haberla hecho pasar a
través de una membrana de ultrafiltración HYDRO AIR, con el fin de
separar los sólidos suspendidos, se filtró, manteniendo siempre la
temperatura de aproximadamente 6-8ºC, y ajustando el
pH a 4,8-5,2 mediante adición de NH_{4}OH al
28%.
La composición de impurezas es, ahora, de 0,6%
de adenosina y de 0,5% de metiltioadenosina.
A continuación se llevó a cabo la absorción en
una columna que contenía 700 L de una resina IRC 86, disponible de
Rohm and Haas^{R} (malla 30-540).
La absorción se llevó a cabo hasta que se cargó
toda la disolución: cuando la resina llegó a saturación con SAMe,
desprendió la adenosina previamente retenida, que se desechó en la
misma etapa de absorción.
El eluato (la elución de llevó a cabo con
H_{2}SO_{4} al 1%) se hizo pasar directamente a través de una
resina Resindion^{R} SP825L con el fin de decolorarla y, después,
se llevó por tubería a deshidratación por congelación, después de
haberlo concentrado por nanofiltración, corregido el contenido de
H_{2}SO_{4} y añadido ácido paratoluensulfónico.
Se obtuvieron 100-105 kg de
bisulfato-paratoluensulfonato de SAMe, que tenía una
titulación \geq98%.
Claims (6)
1. Un procedimiento para la purificación de
S-adenosil-L-metionina
a partir de levadura enriquecida que contiene, al menos 10 g/L de
ella, que comprende:
(a) - ajustar el pH a
1,8-2,2;
(b) - preparar un lisato acuoso de
S-adenosil-L-metionina
a partir de la levadura enriquecida, a una temperatura igual a
70-92ºC, hacer pasar la levadura a través de un
cambiador de tipo placa, en contracorriente, durante un tiempo de
contacto igual a 5-45 s;
(c) - enfriar el lisato a una temperatura igual
a 2-30ºC;
(d) - ultrafiltrar el lisato y,
subsiguientemente, ajustar el pH a 3,0-6,8;
(e) - adsorber, al menos 90 g/L del
ultrafiltrado sobre una resina de ácido débil, en la que el tamaño
de partícula es igual a malla 30-50, y eluir con una
disolución 0,1-2N de un ácido inorgánico;
(f) - ajustar el pH a
2,0-2,5;
(g) - decolorar el eluato;
(h) - concentrar el eluato;
(i) - deshidratar por congelación el
eluato.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la temperatura en la etapa (c) es
6-8ºC.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que el pH en la etapa (d) es
4,8-5,2.
4. Un procedimiento ce acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el ultrafiltrado en la
etapa (e) se absorbe sobre la resina hasta saturación.
5. Un procedimiento para la preparación de sales
farmacéuticamente aceptables de
S-adenosil-L-metionina,
que comprende un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que, después de haber
decolorado el eluato en la etapa (g), cantidades estequiométricas de
ácidos farmacéuticamente aceptables, incluso en mezcla entre ellos,
se añaden a ello, con el fin de obtener las correspondientes sales,
farmacéuticamente aceptables, de
S-adenosil-L-metionina.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que el ácido farmacéuticamente aceptable se
elige entre ácido sulfúrico y ácido paratoluensulfónico.
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