ES2249273T3 - Moleculas reporteras y metodos para ensayar la actividad de proteasas de especificidad elevada. - Google Patents

Moleculas reporteras y metodos para ensayar la actividad de proteasas de especificidad elevada.

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Abstract

Una molécula reportera de polipéptido, que comprende: A) al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal; B) al menos un sitio de reconocimiento de proteasas; C) al menos un dominio de anclaje que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana o compartimento subcelular; en la que el sitio de reconocimiento de proteasas es un sitio reconocido por una proteasa de especifidad elevada que escinde no más de 1 de 100 proteínas que se producen de forma natural escogidas al azar en un organismo; y en la que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas provoca o altera una señal desde el dominio de detección.

Description

Moléculas reporteras y métodos para ensayar la actividad de proteasas de especificidad elevada.
La presente invención se refiere a moléculas reporteras de polipéptidos capaces de asociarse con membranas artificiales o celulares. Esta invención se refiere adicionalmente a moléculas reporteras de polipéptidos que son también escindibles por proteasas de especifidad elevada. En cada realización, las moléculas reporteras de polipéptidos de la invención son particularmente útiles para el descubrimiento y diagnosis de fármacos.
La mayoría de las moléculas proteináceas y otras sustancias en una célula no están distribuidas en cantidades iguales por toda la célula. Por el contrario, la mayoría de las sustancias y especialmente las sustancias proteináceas están más eficazmente localizadas en ciertas partes de una célula. Por ejemplo, muchas proteínas están efectivamente localizadas en o cerca de la membrana de plasma de una célula. Para al menos una parte de las moléculas proteináceas y otras sustancias localizadas, la distribución correcta en una célula es de importancia crucial para la función de dicha molécula o dicha otra sustancia en una célula.
La correcta distribución de una molécula proteinácea u otra sustancia en una célula puede ser asegurada mediante un cierto número de formas diferentes. Una forma de dirigir a diana una molécula proteinácea a un lugar particular en una célula es a través de la modificación de dicha molécula durante o después de su síntesis. Las modificaciones como la glicosilación, fosforilación, escisión proteolítica etc., durante o después de la síntesis de proteínas, han sido estudiadas extensivamente en el pasado. Una modificación de proteínas catalizada por enzimas más recientemente descubierta es la unión covalente de moléculas de lípidos. Mediante esta modificación hidrófoba, proteínas predominantemente hidrófilas que carecen de estructuras de unión a membranas son convertidas en proteínas hidrófobas y es favorecida la unión de proteínas modificadas a membranas (por ejemplo envoltura nuclear, membrana de plasma), afectando así a la actividad biológica de la proteína (Schimdt 1989).
Por ejemplo, los ácidos grasos saturados, ácidos esteárico, palmítico y mirístico, se encuentran principalmente que están unidos a proteínas en células eucarióticas (McIlhinney 1990). Cada uno de estos ácidos grasos etiqueta sub-poblaciones diferentes de un número limitado de proteínas celulares (Sepp-Lorenzino y otros 1989, Maltese y otros 1987, Maltese 1990). El ácido mirístico está normalmente unido a una glicina N-terminal de proteínas a través de un enlace de amida durante su síntesis (Wilcox y otros 1987). El ácido mirístico unido es estable y tiene una semi-vida análoga a la de la proteína a la que se une (McIlhinney 1990). En la palmitoilación, los ácidos grasos se unen a proteínas post-translacionalmente a través de un enlace éster lábil en medio alcalino. Este enlace es habitualmente lábil con un retroceso más rápido que el de la proteína (McIlhinney 1990).
Las proteínas preniladas están modificadas en un átomo de carbono 15 (C15) isoprenoide, farnesilo (F) o un átomo de carbono 20 (C20) isoprenoide, geranilgeranilo (GG). La secuencia de aminoácidos en el C terminal de las proteínas que va a ser modificada sirve para dirigir la adición de cualquiera de estos isoprenoides (Maltese 1990, Gomset y otros 1990). De esta forma, las moléculas señalizadoras, incluidas las proteínas Ras y G, son dirigidas a diana a la hojuela interna de la membrana de plasma mediante una secuencia de modificaciones post-translacionales del resto CAAX en el C terminal [C=cisteína, A=residuo alifático (val o ile), X=variable].
El reconocimiento de secuencias reconocibles mínimas, como el resto CAAX, incluye un enlace covalente obligatorio de un lípido al grupo sulfhidrilo de cisteína (C) ubicado a cuatro aminoácidos del C terminal (Casey y otros 1989, Reiss y otros 1990), seguido de la separación de proteasa de los tripéptidos AAX y la esterificación metílica de la terminación cisteína-carboxilo prenilada resultante (Hancock y otros 1989). Las proteínas que terminan con cajas CAAX, en que X es leucina o isoleucina, son modificadas con el pirofosfato de geranilgeranilo del C20 (GGPP) por la enzima geranilgeraniltransferasa I (GGTasa I) (Yokoyama y otros 1991). En las proteínas en que X es lo más a menudo metionina (M), serina (S), cisteína (C), alanina (A) o glutamina (E), el farnesilo isoprenoide en C15 es transferido desde pirofosfato de farnesilo (FPP) mediante la enzima farnesiltransferasa (FTasa) (Reiss y otros 1990, Reiss y otros 1991, Moores y otros 1991). Por tanto, las proteínas que contienen CAA en el C terminal (MSCAE) y CAAL son preniladas por FTasa y GGTasa respectivamente (Clarke 1992, Schafer y otros 1992, Zhang y otros 1996).
Aunque la FTasa y GGTasa I se pueden unir tanto a FPP como a GGPP, solamente la GGTasa I es capaz de transferirse a los dos sustratos de proteínas. Por el contrario, la FTasa solamente puede farnesilar algunos sustratos de GGTasa I (Armstrong y otros 1995). Una tercera prenil-transferasa relacionada, la GGTasa II, no reconoce cajas CAAX sino que en su lugar transfiere GG desde GGPP hasta proteínas que terminan en XXCC o XCXC que son doblemente geranilgeraniladas (Seabra y otros 1992, Khosravi-Far y otros 1992), X y C tienen el significado anteriormente mencionado.
Intervención de localización dirigida por lípidos y Ras en cáncer
Las células responden a señales de estímulos extracelulares a través de una complicada red de acontecimientos altamente regulados denominados colectivamente trayectorias de transducción de señales. La estimulación de estas trayectorias da lugar a cambios en la actividad transcripcional (Karin y otros 1995, Hill y otros 1995). Mientras las células normales responden apropiadamente a los estímulos extracelulares, muchas células precancerígenas y cancerígenas han perdido esta capacidad y muestran una señalización aberrante. La Ras, un miembro de la gran superfamilia de proteínas de unión GTP (proteínas G), desempeña una función central como un conector molecular, haciendo de superficie interfacial entre los receptores extracelulares y las proteínas efectoras intracelulares que a su vez regulan las trayectorias reguladoras del crecimiento (Lowy y otros 1993). Uno de estos efectores es una serina/treonina-quinasa, Raf (Pronk y otros 1994), que fosforila la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).
La Ras es activa cuando se une a GTP e inactiva cuando se une a GDP. La ciclación de la forma activa a la inactiva es realizada mediante la actividad intrínseca de GTPasa de la proteína. Algunas mutaciones en la Ras anulan la actividad de GTPasa y dan lugar a formas constitutivamente activas de la proteína. Por tanto, las proteínas Ras que están adheridas en el estado activo unidas a GTP, transmiten constitutivamente señales de crecimiento y muestran su actividad oncogénica (Lowy y otros 1993, Koshravi-Far 1994). Sin embargo, la actividad oncogénica puede resultar también de la sobreexpresión de proteínas Ras normales (Barbacid 1987).
Hay tres genes Ras de mamíferos que codifican cuatro proteínas de 21 kDa altamente homólogas: H-, N-, K(i4)A- y K(i4)B-Ras. Las K(i4)A- y K(i4)B-Ras son codificadas por variantes de escisión del gen Ki-Ras (Barbacid 1987, Lowy y otros 1993). Las mutaciones oncogénicas en genes Ras, especialmente Ki4B-Ras y N-Ras, contribuyen a la formación de un 30% de diversas enfermedades malignas humanas. Los genes Ras mutantes fueron encontrados en un 50% de cánceres colorrectales, 90% de páncreas y 20% de pulmón. Por tanto, la interrupción de la trayectoria señalizadora podría tener una capacidad potencial significativa como una estrategia quimiopreventiva del cáncer (Bos 1988, Bos 1989, Barbacid 1987).
Han sido consideradas muchas aproximaciones para inhibir la función oncogénica de Ras, pero el mayor progreso hacia el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos contra la transformación celular inducida por Ras se ha centrado en la inhibición de la enzima FTasa. Esta estrategia está basada en la observación de que las cuatro proteínas Ras, sintetizadas como proteínas citosólicas biológicamente inactivas, requieren una modificación post-translacional con un resto farnesilo para la actividad oncogénica. De hecho, ha sido conocido durante algún tiempo que la asociación de Ras a la hojuela interna de la membrana de plasma es necesaria para su actividad transformadora (Willumsen y otros 1984). Sin embargo, hasta que de desveló la bioquímica de las modificaciones post-translacionales de Ras que condujeron a la asociación de membranas (Casey y otros 1989, Hancock y otros 1989, Schafer y otros 1989) no se comenzó a identificar la capacidad potencial de las dianas de fármacos anti-neoplásticos (anticancerígenos).
Modificaciones de lípidos adicionales de las cisteínas en dirección ascendente de CAAX con un grupo palmitoilo estabilizan adicionalmente la asociación de proteínas H-, N- y KiA-Ras con la membrana de plasma (Hancock y otros 1990). Por otra parte, la KiB-Ras no está palmitoilada, pero contiene una extensión de polilisina en dirección ascendente de la cisteína farnesilada, que se cree que estabiliza adicionalmente la interacción de la proteína con la membrana de plasma (Hancock y otros 1990). Aunque están involucradas varias etapas en la dirección a diana de Ras hacia la membrana de plasma, parece que la farnesilación es la única etapa que es necesaria y suficiente para una actividad transformadora de Ras (Jackson y otros 1990, Kato y otros 1992). Por lo tanto, la FTasa se ha convertido en una de las dianas más buscadas posteriormente para desarrollar nuevos fármacos anti-cancerígenos. El objetivo terapéutico es capitalizar esta nueva información y traducirla en nuevos agentes biológicos y farmacéuticos que demostrarán una mayor eficacia y una toxicidad inferior que los fármacos citotóxicos cancerígenos actualmente disponibles (Gibbs y otros 1997).
El diseño racional de inhibidores de FTasa puede ser subdividido también en tres categorías amplias (Gibbs y otros 1997, Keloff y otros 1997): (i) compuestos competitivos con la FPP isoprenoide, (ii) compuestos competitivos con la CAAX tetrapéptida y (iii) análogos de bisustratos que combinan características tanto de miméticos de CAAX como de FPP. El problema con (i) es que los compuestos competitivos con respecto a FPP necesitan superar la elevada avidez de la FTasa por FPP. La FTasa se une a FPP con una baja afinidad nanomolar, mientras que las concentraciones celulares de FPP son casi micromolares. Por tanto, los inhibidores de FTasa requieren una Ki muy elevada y tendrían que ser muy selectivos para la FTasa sobre otras enzimas que utilizan FPP (por ejemplo escualeno-sintasa). Los problemas con peptidomiméticos CAAX (ii) son la inestabilidad en proteasa celular y la permeabilidad de membrana dificultada provocada por el carboxilato del C terminal. Diversas modificaciones de enlaces péptidos y diseño de profármacos por enmascaramiento temporal de la carga de carboxilato demostraron ser suficientes para generar fármacos activos de células. Sin embargo, muchos de estos compuestos contenían todavía un grupo tiol que es sometido a oxidación y es metabólicamente reactivo. Los inhibidores de bisustratos (iii) fueron deducidos de estudios enzimológicos de FTasa que pusieron de manifiesto un mecanismo secuencial. Esto hizo surgir la idea de que los compuestos que emulan el complejo ternario FTasa-FPP-CAAX del estado de transición serían potentes inhibidores de FTasa. Han sido encontrados inhibidores de bisustratos potentes, pero el gran tamaño de estas moléculas puede comprometer sus propiedades farmacológicas in vivo.
Otras aproximaciones para obtener inhibidores de cualquier enzima se refieren a selecciones al azar dirigidas a diana a partir de cualesquiera productos naturales (microorganismos, terrenos, plantas, etc.) o bibliotecas químicas sintéticas. Estas selecciones presentan una inmensa colección de estructuras para la selección al azar y presentan un poderoso medio para obtener derivaciones químicas que puedan ser modificadas por química medicinal tradicional para un desarrollo adicional (Sebti y otros 1997). Fue identificado un cierto número de inhibidores de FTasa mediante una diversidad de selecciones al azar. Por ejemplo, una clase de nuevos inhibidores de FTasa tricíclicos que no son de sulfhidrilo y no péptidos que son inhibidores competitivos con respecto a FPP fueron encontrados en una colección de antihistaminas (Bishop y otros 1995). Sin embargo, estos compuestos exhiben una potencia relativamente baja en comparación con emuladores de CAAX que no les hace adecuados para una evaluación en vivo (Gibbs y otros 1994). Más recientemente, ha sido descubierta una nueva clase de inhibidores de FTasa competitivos en el transcurso de otros inhibidores de enzimas FPP-miméticos (escualeno sintasa) (Aoyama y otros 1998). La actividad de análogos químicamente optimizados es comparable con los inhibidores de FTasa CAAX-miméticos. En las células, los inhibidores de FPTasa bloquean la farnesilación celular. En estos estudios, la farnesilación y la geranilgeranilación de proteínas son examinadas mediante la incubación de cultivos celulares con el precursor de FPP [3H]mevalonato (Hancock y otros 1989, Kohl y otros 1993, James y otros 1993). No obstante, en ensayos celulares, la concentración de inhibidores de FTasa necesaria para conseguir su acción es a menudo 1000 veces mayor que la IC50 para la inhibición de FTasa in vitro, indicando graves limitaciones para la actividad celular. La inhibición de efectos celulares mediados por Ras por inhibidores de FTasa ha sido análogamente demostrada en ensayos de cultivos celulares que verifican fenotipos clave de transformación celular: crecimiento dependiente (plástico, Kohl y otros 1993, James y otros 1993) e independiente (agar blando, Kohl y otros 1993) del anclaje, la rapidez del crecimiento en monocapa (James y otros 1993), transformación morfológica y alteraciones en el citoesqueleto (Prendergast y otros 1994).
La especificad bioquímica de los inhibidores de FTasa es incuestionable, ya que estos agentes no bloquean la geranilgeranilación de proteínas (Gibbs y otros 1993, Kohl y otros 1993, James y otros 1993, Bishop y otros 1995, Cox y otros 1994). Sin embargo, es importante apreciar que la mutación del estado de Ras de los tumores humanos se ha informado que no se correlaciona con su sensibilidad a inhibidores de FTasa. Además de ello, es incorrecto hacer referencia a los inhibidores de FTasa como inhibidores de Ras específicos, ya que los inhibidores de FTasa dirigen a diana al menos a 18 proteínas farnesiladas, de las que algunas son importantes para la transformación maligna (James y otros 1994). Un ejemplo es la supresión de la trasformación src por inhibidores de FTasa (James y otros 1993). El mecanismo bioquímico mediante el cual los inhibidores de FTasa conducen a la inhibición tumoral es, por tanto, un aspecto importante. La capacidad de los inhibidores de FTasa para bloquear la cascada de MAPK de activación constitutiva dependiente de Ras está actualmente bien establecida (Cox y otros 1994, James y otros 1994).
La Ha-Ras oncogénica no farnesilada puede exhibir un efecto negativo dominante y puede inhibir la función de Ras unida a membrana en algunas circunstancias (Stacey y otros 1991). Los inhibidores de FTasa pueden inducir la acumulación de complejos citosólicos de Ras cerrada con GTP con sus efectores, como Raf (Lerner y otros 1995, Miyake y otros 1996). Esto conduce finalmente al secuestro de dianas efectoras de Ras. Por tanto, en tumores en los que Ras está cerrada con GTP, la Ras citosólica se puede acumular como una proteína negativa dominante que inhibirá adicionalmente el crecimiento tumoral. Como la Ras citosólica mediada por inhibidores de FTasa naturales no secuestra sus efectores y por tanto no muestra el fenotipo negativo dominante, la inhibición observada sería selectiva para células tumorales. Además de ello, diversos estudios informaron que las concentraciones de inhibidores de FTasa como BZA-5B y FTI-277, requeridas para bloquear las actividades de enzimas en la trayectoria de MAP-quinasa, eran inferiores a las necesarias para inhibir completamente el tratamiento de Ras. Esto sugiere también que la H-Ras activada no farnesilada es un inhibidor dominante de la acción de H-Ras activada farnesilada en las células tratadas con inhibidores de FTasa. Por tanto, una inhibición parcial del tratamiento de Ras podría dar lugar a una inhibición selectiva de la señalización oncogénica, pero no normal (James y otros 1994, Lerner y otros 1995).
Un inconveniente de los estudios que usan células transformadas con Ras oncogénica para la investigación del mecanismo de acción de los inhibidores de FTasa es que se usó H-Ras y se descubrió pronto que la K-Ras más predominante era considerablemente resistente a los inhibidores de FTasa (James y otros 1994, Lerner y otros 1995). Son necesarias concentraciones mucho más elevadas de inhibidor para inhibir KB-Ras en lugar de H-Ras. Un mecanismo atractivo para esta resistencia es que KB-Ras es tratado por GGTasa-I cuando FTasa es bloqueada (Lerner y otros 1995, Whyte y otros 1997, Rowell y otros 1997). In vitro, KB-Ras es un sustrato para GGTasa-I (James y otros 1995b). Los inhibidores de GGTasa-I bloquean el tratamiento de KB-Ras en células transformadas con KB-Ras proporcionando una evidencia farmacológica de que se puede estar produciendo la prenilación cruzada en las células (Lerner y otros 1995b). Estas observaciones subvaloran la necesidad de usar células transformadas con KB-Ras para ensayar inhibidores potenciales in vitro e in vivo.
Muy recientemente, se mostró que la exposición conjunta de inhibidores de FTasa y GGTasa-I en tumores humanos era necesaria para la inhibición de la prenilación de KB-Ras oncogénica, mientras que cada inhibidor solo es suficiente para suprimir el crecimiento tumoral humano en xenoinjertos de ratones desprovistos de sistema inmunológico (Sun y otros 1998). El hecho de que los inhibidores de GGTasa-I tengan actividad antitumoral por sí mismos sugiere que algunos sustratos para GGTasa-I son importantes para las transformaciones malignas (Sun y otros 1998). También, los inhibidores de FTasa, que no son capaces de inhibir el tratamiento de KB-Ras, son eficaces en la inhibición del crecimiento tumoral, sugiriendo que existen otras proteínas farnesiladas distintas de Ras importantes para la transformación maligna (Sun y otros 1998).
En un segundo modelo in vivo, un inhibidor de FTasa indujo una enorme regresión de carcinomas mamarios y salivares en un modelo de ratón oncogénico de Ha-Ras viral (Kohl y otros 1996). En estos ratones transgénicos, los inhibidores de FTasa son administrados a tumores previamente existentes, en contraste con los modelos de tumores en ratones desprovistos de sistema inmunológico. La administración crónica del inhibidor fue necesaria, ya que los tumores volvían a aparecer tras el cese del tratamiento (Kohl y otros 1996). En los modelos tanto de ratones desprovistos de sistema inmunológico como de ratones oncogénicos, se consiguió la eficacia en ausencia de una gran toxicidad microscópica, sugiriendo que los inhibidores de FTasa pueden ser agentes eficaces y seguros para el tratamiento de cánceres humanos (Omer y otros 1997). Hasta ahora, no se había informado de toxicidad en ratones tratados con cualquiera de los inhibidores de FTasa ensayados. Esta observación contrasta fuertemente con los descubrimientos que desarrollaron previamente agentes quimioterapéuticos, que a menudo deben ser usados a su dosis máxima tolerada para obtener una actividad antitumoral (Gibbs y otros 1997).
Aunque los resultados biológicos observados con los inhibidores de FTasa están ampliamente aceptados, las razones precisas para la falta de toxicidad hacia células normales en cultivo, así como los estudios en animales, no han sido establecidas. Por ejemplo, el crecimiento de células de cultivos transformadas con Ras es mucho más sensible a inhibidores de FTasa en comparación con sus células parentales normales. Dado que la función de Ras parece que es esencial para todas las células, es algo inesperado que las células normales deban ser relativamente insensibles a los inhibidores de FTasa. Gibbs y otros (1997) han sugerido un cierto número de posibles explicaciones para estos efectos: (i) retículos de factores de crecimiento funcionalmente redundantes en células normales que les permiten tolerar la infrarregulación de la función de Ras. Dicho de otro modo, la proliferación de células normales depende de más de un factor de crecimiento y un factor de crecimiento activa múltiples trayectorias señalizadoras intracelulares (Keloff y otros 1997). (ii) En el caso de KB-Ras, podría tener lugar la geranilgeranilación en lugar de la farnesilación y la KB-Ras de tipo salvaje puede proporcionar también funciones biológicas críticas. Sin embargo, la prenilación cruzada (geranilgeranilación) de Ras no mutada en ausencia de FTasa funcional no es una explicación satisfactoria, ya que entonces hay que considerar el motivo por el que las células con N o Ki-Ras mutadas son sensibles a inhibidores de FTasa (Omer y otros 1997, Gibbs y otros 1997). (iii) No todas las proteínas farnesiladas tienen el mismo grado de inhibición de FTasa en las células. Por tanto, la inhibición selectiva de señalización mediada por H- frente a KB-Ras puede permitir el crecimiento continuado de células normales (James y otros 1995b). (iiii) De acuerdo con el apartado (iii), la función de las proteínas farnesiladas involucradas en la transformación celular puede ser más sensible a la acción de un inhibidor de FTasa de lo que lo son las funciones de las mismas proteínas en células normales. Por tanto, la relación cuantitativa entre una función de una proteína específica y su grado de farnesilación puede variar, lo que a su vez determina el grado de inhibición de la farnesilación que es necesario para bloquear la función biológica.
Los cánceres humanos que tienen Ras mutada normalmente tienen otras alteraciones genéticas como pérdida de supresores tumorales (Gibbs y otros 1996). Una cuestión crítica ha sido si el comprometer la función de Ras en un fondo genético complejo produciría un efecto antitumoral. Un trabajo de Shirasawa y otros (1993) ha proporcionado una evidencia de que la Ras mantiene una función crítica en células tumorales que tienen mutaciones en otros oncogenes o genes supresores de tumores. Específicamente, Shirasawa interrumpió genéticamente el gen KB-Ras mutado en diversas líneas celulares de colon humano que se conoce que tienen otras mutaciones y observó que las células ya no eran tumorigénicas en un modelo de explante tumoral en ratón desprovisto de sistema inmunológico (Shirasawa y otros 1993).
El hecho de que los inhibidores de GGTasa I inhiben también el crecimiento tumoral humano, si bien con menos eficacia que los inhibidores de FTasa, sugiere que aparte de las proteínas farnesiladas, las proteínas geranilgeraniladas desempeñan también una función importante en la transformación maligna.
Los efectos biológicos de los inhibidores de FTasa sugieren que no son apropiadamente considerados como inhibidores específicos de Ras (Gibbs y otros 1997). No obstante, los inhibidores de FTasa han demostrado un índice terapéutico considerable en el cultivo celular y en ratones (Gibbs y otros 1994, Kohl y otros 1994). Finalmente, un aspecto clínico importante es si la administración de inhibidores de FTasa conducirá a la resistencia a los fármacos. La resistencia a inhibidores de FTasa ha sido observada tanto en cultivo celular como en animales (Kohl y otros 1995, Prendergast y otros 1996). Por tanto, la consideración final de la utilidad de FTasa será cuando los compuestos con perfiles farmacológicos adecuados sean ensayados clínicamente (Omer y otros 1997).
Agentes anti-cancerígenos y apoptosis
La apoptosis o muerte celular programada sirve como un mecanismo principal para la regulación precisa del número de células, y como un mecanismo de defensa para suprimir células indeseadas y potencialmente peligrosas, como células infectadas con virus o células con deterioro de ADN o desregulación de crecimiento que podrían convertirse en precursores de células tumorales. Por tanto, los defectos en la activación o ejecución de la trayectoria apoptótica pueden conducir al desarrollo de la oncogénesis. Un acontecimiento importante en el progreso de muchas enfermedades malignas es la pérdida de la función del gen supresor de tumores p53. La proteína p53, una proteína de unión a ADN nuclear, está involucrada en la inducción de la apoptosis provocada por el deterioro de ADN y la activación inapropiada de oncogenes. Es un activador transcripcional de un conjunto específico de genes dianas, que incluyen los inhibidores del crecimiento celular p21WAF1 y Gadd45, e interacciona directamente con muchas proteínas celulares (Wang y Harris 1997). El gen p53 es frecuentemente mutado en la mayoría de las enfermedades malignas humanas, sugiriendo la importancia de la apoptosis dependiente de p53 en el control del crecimiento del cáncer
(Bellamy 1996).
Recientemente ha resultado ampliamente aceptado que la destrucción celular inducida por agentes anticancerígenos es el resultado de la muerte celular programada (Weinberg 1996). La proteína supresora tumoral p53, en particular, parece que está íntimamente asociada a la activación de una trayectoria apoptótica en respuesta al tratamiento con radiación o quimioterapia. Parece que los fármacos con modos diferentes de acción inician respuestas que manejan apoptosis (Smets 1994). Los antimetabolitos como la purina y análogos de citidina, y los inhibidores de topoisomerasa provocan la inducción de la muerte celular mediante interferencia con la replicación e inhibición de ADN. Distintos de los agentes que deterioran el ADN, los fármacos taxoides, que dirigen a diana la estabilización del sistema de microtúbulos, mueven las células a la apoptosis a través de trayectorias independientes de p53. La observación interior del mecanismo de acción de la quimioterapia anti-cancerígena actual ha conducido a una búsqueda de agentes inductores de apoptosis, a través de proteínas p53 u otras reguladoras.
La apoptosis es regulada mediante una serie de acontecimientos que conducen a cambios bioquímicos y morfológicos estereotípicos que incluyen el engrosamiento de membranas, contracción de células, condensación de cromatina, escisión de ADN y fragmentación de la célula en estructuras apoptóticas unidas a membranas. El acontecimiento central en la trayectoria apoptótica es la activación de una jerarquía de intercelucina-1B (IL-1B) que convierte proteasas de tipo enzimático (ICE) o caspasas, una familia de cisteína-proteasas con un requisito absoluto para la escisión después de un residuo de ácido aspártico (para más explicaciones, véase Cohen 1997, Thornberry y Lazebnek 1998). Estas proteasas de elevada especifidad son sintetizadas como proenzimas inactivas y son convertidas en enzimas activas mediante escisión en residuos Asp específicos seguida de asociación con una subunidad grande y pequeña para formar un heterodímero.
Las caspasas son homólogos próximos del producto génico ced-3 de Caenorhabditis elegans, que se ha mostrado que es esencial para la apoptosis durante el desarrollo nematodal (Shaham y Horvitz 1996). Median la proteolisis de un número discreto de proteínas específicas que conducen a una obligación irreversible de que las células experimenten la apoptosis. La escisión dependiente de caspasa inactiva las proteínas involucradas en mecanismos reparadores del ciclo celular (incluidas las proteínas nucleares, poli ADP-ribosa polimerasa (PARP) y quinasa dependiente de ADN), conduce a la degradación de proteínas estructurales como laminas, o activa proteínas para que se hagan proapoptóticas (quinasa activada por p21 y las propias caspasas). También las proteínas de transducción de señales MEKK1, quinasa 2 activada por p21, la quinasa de adhesión focal, proteína activadora de RAS-GTPasa y Raf-1 se mostró que eran sustratos de caspasa (Idmann y otros 1998). La función esencial de la actividad de caspasa en la fase de ejecución del procedimiento apoptótico es ilustrada por el hecho de que la inhibición de caspasas conduce generalmente a la inhibición de la apoptosis. Sin embargo, las diferentes caspasas contribuyen diferencialmente al programa apoptótico en diferentes tipos de células.
Las caspasas dirigen a diana proteínas para la escisión basadas en la presencia de un resto de reconocimiento de tetrapéptido, una secuencia mínima necesaria para la proteolisis. La secuencia de este resto difiere significativamente entre las caspasas, y algunas proteínas que contienen la secuencia de tetrapéptido opcional no son eficazmente escindidas, lo que implica que los elementos estructurales terciaros pueden tener una influencia sobre el reconocimiento del sustrato (Thornberry 1997). No obstante, cualesquiera dificultades con la proteolisis de un péptido particular pueden ser superadas añadiendo secuencias de aminoácidos adicionales correspondientes a la secuencia diana que flaquea el tetrapéptido.
Las catorce caspasas de mamíferos identificadas hasta la fecha pueden ser clasificadas como caspasas de inicio o en dirección ascendente (por ejemplo caspasas-2, -8 y -10) o como caspasas efectoras o en dirección descendente (por ejemplo caspasa-3, -6 y -7), siendo últimas las ejecutoras clave de la trayectoria apoptótica. Los inhibidores de péptidos específicos de caspasa-3 y -7 como Z-DEVD-fluorometilcetona interfieren con la mayoría de las formas de apoptosis de mamíferos (Gurtu y otros 1997). El factor de necrosis tumoral, ligando FAS y fármacos quimioterapéuticos son capaces de inducir la apoptosis por activación de caspasa-3 (Nagata 1997), que es responsable completamente o en parte de la proteolisis de un gran número de sustratos, incluido PARP. La caspasa-3 reconoce un resto de tipo Asp-Xaa-Xaa-Asp (DXXD) (DEVD en PARP y quinasa dependiente de ADN), con un requisito de Asp en la posición P1 y una preferencia destacada de un Asp en la posición P4. La caspasa 1 por el contrario se escinde en la secuencia producida de forma natural: Y-V-H-D-*-A, en que "*" indica el sitio de escisión.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a dos realizaciones principales de nuevas moléculas reporteras de polipéptidos. La primera realización se refiere a una molécula reportera de polipéptido que comprende al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal y al menos un dominio de anclaje. El dominio de anclaje a la membrana favorece directa o indirectamente la asociación de la molécula reportera de polipéptido con un compartimento subcelular, o preferentemente con una membrana. El grado y la velocidad de asociación de membrana de la molécula reportera de polipéptido pueden ser verificados o ensayados analizando la señal emitida por el dominio de detección. Esta señal proporciona un marcador para el estado de la asociación de membrana de la parte de anclaje a la membrana, o de la molécula reportera de polipéptido en su conjunto. Por tanto, los tratamientos o agentes pueden ser ensayados en cuanto a su capacidad de alterar la asociación o localización de membrana observando o midiendo la señal emitida por el dominio de detección. Por ejemplo, las moléculas reporteras de polipéptidos de la primera realización son particularmente útiles para ensayar un compuesto que altera la lipidación por medio de:
A) proporcionar una membrana;
B) proporcionar una molécula reportera de polipéptido que comprenda al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal fluorescente, luminiscente, radioactiva o cromática, o capaz de absorber una energía de resonancia que es seguidamente transferida (emitida) a una segunda molécula que emite una señal detectable; y al menos un dominio de anclaje a la membrana que comprenda suficiente secuencia de aminoácido de un gen ras, o una variante del mismo para favorecer la farnesilación:
C) proporcionar condiciones que permitan que la molécula reportera de polipéptido se asocie con la membrana;
D) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
E) observar o medir la señal emitida por el dominio de detección;
F) duplicar las etapas A) a E) en presencia de un compuesto que va a ser ensayado;
G) comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del compuesto ensayado para determinar el efecto del compuesto sobre la lipidación.
Las moléculas reporteras de polipéptidos de la primera realización general son análogamente útiles para ensayar la sensibilidad de una células a un agente quimioterapéutico por medio de:
A) proporcionar una molécula reportera de polipéptido que comprenda al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal fluorescente, luminiscente, radioactiva o cromática, o capaz de absorber una energía de resonancia que es seguidamente transferida (emitida) a una segunda molécula que emite una señal detectable; y al menos un dominio de anclaje a la membrana que comprenda suficiente secuencia de aminoácido para favorecer la lipidación;
B) proporcionar una célula que va a ser ensayada;
C) proporcionar condiciones que permitan que la molécula reportera de polipéptido se asocie con las membranas celulares;
D) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
E) observar o medir la señal emitida por el dominio de detección;
F) duplicar las etapas A) a E) en presencia del agente que va a ser ensayado;
G) comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del agente ensayado con el fin de valorar la sensibilidad de la célula al agente o agentes quimioterapéuticos ensayados.
Además de ello, cuando las células valoradas en cuanto a su sensibilidad hacia un agente quimioterapéutico son células malignas de un paciente, la presente invención proporciona adicionalmente un método para seleccionar una terapia anti-neoplástica apropiada par ensayar ese paciente.
La segunda realización principal se refiere a una molécula reportera de polipéptido que comprende adicionalmente al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada. La proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoca o altera una señal desde el dominio de detección. Específicamente, la molécula reportera de polipéptido comprende:
- al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal;
- al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada;
- al menos un dominio de anclaje a membranas, que favorezca la asociación de la molécula reportera de polipéptido con un compartimento de membrana o subcelular; en que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoque o altere una señal desde el dominio de detección.
En toda la segunda realización, se entiende que el dominio de anclaje a membrana puede estar sustituido con un dominio de anclaje subcelular, que favorezca la asociación de la molécula reportera de polipéptido con un compartimento subcelular. El compartimento subcelular no necesita ser membranoso y, por tanto, incluye la parte soluble de: el núcleo, citosol, matriz y espacios intermembranas de mitocondria, vacuolas, lisosomas, aparato de Golgi, peroxisomas y otros compartimentos subcelulares. No obstante, la escisión de un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada altera la señal desde el dominio de detección, preferentemente liberando la parte de la molécula reportera de polipéptido del dominio de anclaje, preferentemente permitiendo que el dominio de detección se difunda por toda la célula, o se desplace a un compartimento subcelular diferente.
La molécula reportera de polipéptido de la segunda realización proporciona una herramienta para un cierto número de métodos descritos en la presente memoria descriptiva. Por tanto, la presente invención proporciona adicionalmente métodos para valorar proteasas de especifidad elevada, métodos para valorar los efectos de agentes bioactivos sobre la proteolisis por proteasas de actividad específica elevada y métodos para verificar los efectos biológicos de la proteolisis de especifidad elevada, como la tendencia de una célula a experimentar apoptosis.
En el contexto de las realizaciones principales, es un objeto de la invención encontrar un agente capaz de redistribuir una sustancia y/o una molécula proteinácea en una célula. Este agente debe ser capaz de alterar al menos en parte la función de dicha sustancia y/o molécula proteinácea en dicha célula. La alteración de dicha función de dicha sustancia y/o molécula proteinácea en dicha célula puede conducir a un fenotipo alterado al menos en parte de dicha célula. Un agente capaz de alterar al menos en parte el fenotipo de una célula puede ser usado para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad. Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo como el cáncer, un agente capaz de redistribuir una o más moléculas proteináceas en células cancerígenas es proporcionado a dichas células, como consecuencia de lo cual el fenotipo maligno de dichas células cancerígenas es al menos en parte disminuido. La presente invención proporciona para un experto ordinario en la técnica herramientas y métodos para verificar la redistribución de una molécula proteinácea en una célula o entre compartimentos celulares, seleccionado así agentes eficaces para el tratamiento de cánceres y otras anormalidades
celulares.
La capacidad de verificar la redistribución de una molécula proteinácea en una célula puede ser también de importancia para el desarrollo de tratamientos para otras enfermedades como enfermedades infecciosas o enfermedades hereditarias. Un ejemplo no limitativo de esta enfermedad hereditaria es la Fibrosis Cística, en la que una mutación que se produce frecuentemente de una proteína CFTR parece tener un defecto de distribución. La CFTR normal es transportada a la membrana de plasma de una célula en la que puede ejercer su función como un canal de iones. Dicha CFTR mutada que se produce frecuentemente no parece localizar correctamente la membrana de plasma. Los medios y métodos de la invención, por lo tanto, pueden ser usados también para seleccionar agentes con la capacidad de alterar la distribución de dicha CFTR mutada en forma de una distribución de membrana de plasma adecuada con el fin de desarrollar medicamentos para el tratamiento de la Fibrosis Cística.
En un aspecto, la invención utiliza una molécula proteinácea que comprende una parte o dominio de localización, en que dicho dominio de localización provoca una cierta distribución de dicha molécula proteinácea en una célula, para determinar si un agente proporcionado a dicha célula es capaz de alterar la distribución de dicha molécula proteinácea en dicha célula.
Es un objeto de la invención encontrar un agente capaz de interferir al menos en parte con y/o cambiar al menos en parte la distribución de dicha molécula proteinácea en una célula. Preferentemente, dicho agente es capaz de cambiar la función de dicha molécula proteinácea en dicha célula.
Un objeto adicional de la presente invención es desarrollar ensayos para encontrar agentes que interfieran o cambien al menos en parte la distribución de una molécula proteinácea en una célula y, por tanto, al menos preseleccionar agentes con eficacia potencial para alterar la función de dicha molécula en una célula. Preferentemente, dichos ensayos son adecuados para seleccionar un gran número de diferentes agentes preferentemente en un ajuste de producción elevada.
Es un objeto adicional de la presente invención desarrollar productos farmacéuticos que comprendan al menos uno o más de dichos agentes para el tratamiento de una enfermedad.
Es también un objeto de la invención desarrollar ensayos para la caracterización fenotípica de una célula, basados en la capacidad de un agente para redistribuir al menos en parte una molécula proteinácea en dicha célula.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Células K562 LNC-EGFP-RasF que expresan EGFP dirigido a diana de membrana a un aumento bajo (A, 240x) y elevado (B, 480x). La dirección a diana de EGFP es evidente por delineación de la membrana. Algunas células exhiben manchas de brillo excéntricas que pueden ser localizadas en el aparato de Golgi.
Figura 2. Adición del inhibidor de farnesil-transferasa bien conocido, FTI-276 (5 \muM) a células K562 LNC-EGFP-RasF a un aumento bajo (A, 240x) y elevado (B, 480x). La inhibición de la farnesilación da lugar a la interrupción de la localización de membranas.
Figura 3. Células MT4-LNC-EFGP-DEVD-RasF (A) expresan EGFP dirigido a diana de membranas. DEVD es un sitio de reconocimiento para caspasas 3 y 7, enzimas claves involucradas en la apoptosis, y está colocado entre la secuencia de la señal de farnesilación y EGFP. La escisión de esta secuencia conectora por caspasas después de la exposición a la estaurosporina inductora de apoptosis indica la apoptosis. (B) La inducción de apoptosis (estaurosporina 10 \muM, 4 h) en células MT4-LNC-EFGP-DEVD-RasF es evidente por dirección a diana de membrana de EGFP reducida.
Figura 4. (A) Las células MT4-LNC-EFGP-RasF también expresan EGFP en altura de la membrana. La proteína no contiene DEVD entre la secuencia de la señal de farnesilación y EGFP. (B) La inducción de apoptosis por estaurosporina (4 h) alteró la morfología celular pero no dio lugar a una translocación destacada de EGFP en comparación con la figura 3B.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a moléculas reporteras de polipéptidos que comprenden al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal y al menos un dominio de anclaje a membrana. El dominio de anclaje a membrana favorece directa o indirectamente la asociación de la molécula reportera de polipéptido a una membrana. El grado y la velocidad de asociación a membrana de la molécula reportera de polipéptido pueden ser verificados o ensayados analizando la señal emitida por el dominio de detección. En algunas realizaciones, la molécula reportera de polipéptido comprende adicionalmente al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada. La proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoca o altera una señal desde el dominio de detección.
En un aspecto, la invención proporciona un método para determinar la capacidad de un agente para interferir al menos en parte con la distribución de una sustancia en relación con una o más membranas, o compartimentos de membranas, que comprende:
A) proporcionar una membrana;
B) proporcionar una molécula reportera de polipéptido que comprende una parte de detección que puede ser detectada, y al menos una parte de localización capaz de favorecer directa o indirectamente la asociación de la parte de detección con una membrana;
C) proporcionar condiciones que permitan que la molécula reportera de polipéptido se asocie con la membrana;
D) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde la parte de detección;
E) observar o medir la señal emitida por la parte de detección;
F) duplicar las etapas A) a E) en presencia de un agente que va a ser ensayado;
G) comparar las señales emitidas en presencia y en ausencia del compuesto ensayado.
En una realización, la molécula reportera de polipéptido, o su parte de detección, contiene una multiplicidad de dominios de detección, que pueden ser iguales o diferentes, y pueden emitir las mismas o diferentes señales. En una realización, una señal emitida por un dominio de detección cambia en respuesta a una alteración (como una escisión, fosforilación o unión a ligandos) en alguna parte de la molécula. Dicha parte de detección, o dominio, puede ser la misma parte que dicho dominio de localización o diferente. La función de un dominio de detección es permitir la detección de la molécula reportera de polipéptido, en particular visualizar su distribución. En una realización de la invención, dicha molécula reportera de polipéptido comprende dicha molécula proteinácea o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. En una realización preferida, dicha molécula reportera comprende un dominio de localización que es dicha molécula proteinácea o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma y una parte de detección.
En una realización adicional, una molécula reportera de polipéptido dentro del alcance de la invención tiene una distribución localizada en una célula antes de que a dicha célula se le proporcione un agente. Sin embargo, pueden ser usadas también para la invención moléculas reporteras de polipéptidos con una distribución sustancialmente uniforme en una célula antes de que a dicha célula se le proporcione dicho agente, por ejemplo para determinar la capacidad de un agente para inducir una distribución localizada de una molécula reportera de polipéptido con una distribución uniforme en una célula. Preferentemente, una molécula reportera de polipéptido está localizada en una membrana de una célula, lo más preferentemente la membrana de plasma.
Dentro del alcance de la invención, un agente puede ser añadido a una célula para prevenir o inducir una separación de una parte que determine al menos en parte la distribución de una molécula proteinácea en una célula de otra(s)
parte(s) de dicha molécula proteinácea, con lo que al menos en parte se altera la distribución de dicha(s) otra(s)
partes(s). En una realización preferida, dicha prevención o inducción de dicha separación altera al menos en parte una función de dicha célula. Un método preferido de prevenir o inducir una separación es prevenir o inducir la escisión proteolítica, preferentemente de una secuencia corta específica de aminoácidos en dicha molécula proteinácea. Preferentemente, dicha escisión proteolítica es una escisión de caspasa. Lo más preferentemente, la escisión proteolítica está mediada por una proteasa de especifidad elevada.
En la práctica de una realización de la invención, una molécula reportera de polipéptido comprende una o más secuencias de aminoácidos que codifican una secuencia de reconocimiento para una proteasa de especifidad elevada y, por tanto, actúa como una diana o sustrato para la proteasa de especifidad elevada. Dicha secuencia de reconocimiento se puede producir en cualquier lugar en el reportero, preferentemente en el dominio de detección o entre los dominios de detección y de anclaje a la membrana. Por tanto, la secuencia de reconocimiento puede comprender una extensión separada de aminoácidos o comprender una parte de los dominios de anclaje o detección. Dicha secuencia de reconocimiento puede ser un único sitio de escisión de especifidad elevada, o múltiples sitios para las mismas o diferentes escisiones de especifidad elevada. Los ejemplos de disposiciones son redundantes y los sitios de escisión anidados son descritos por Nicholson (1999).
En una realización, el dominio de detección es una proteína fluorescente en la que ha sido insertada una secuencia de reconocimiento corta. En otra realización, los aminoácidos de la proteína fluorescente han sido mutados para codificar un dominio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada mediante mutagénesis dirigida al sitio. Aunque la yuxtaposición de los dominios de reconocimiento y detección es improbable que afecte adversamente a su función, un experto en la técnica reconocerá que algunas moléculas reporteras de polipéptidos que comprenden un sitio de escisión de especifidad elevada dentro de un dominio de detección puede que no sean activas. No obstante, el diseño y ensayo de las construcciones apropiadas está dentro de la técnica del experto, además, las moléculas reporteras de polipéptidos descritas en la presente memoria descriptiva pueden ser construidas usando métodos rutinarios como los descritos por Sambrook y otros (1989).
Como se usa en la presente memoria descriptiva, una proteasa de especifidad elevada es una proteasa que se produce de forma natural o que está genéticamente alterada que reconoce una estructura de proteínas de orden superior (secundario, terciario o cuaternario) o, más preferentemente, una secuencia limitada de aminoácidos lineales. En una realización altamente preferida, una proteasa de especifidad elevada reconoce y escinde un polipéptido en una o unas pocas secuencias discretas de aminoácidos. Estas secuencias de aminoácidos son suficientemente complejas y no se producen frecuentemente en la naturaleza, consecuentemente, cuando la proteasa reconoce una secuencia de aminoácidos, la secuencia de reconocimiento comprende al menos tres, y preferentemente, cuatro o más aminoácidos. Por tanto, una proteasa de especifidad elevada escinde no más de 1 de cada 100, preferentemente, no más de 1 de cada 500, más preferentemente, no más de 1 de cada 1000 y, todavía más preferentemente, no más de 1 de cada 5000 proteínas que se producen de forma natural escogidas al azar en un organismo. Lo más preferentemente, una proteasa de especifidad elevada escinde menos de 2, 3, 4, 5, 10 ó 20 proteínas que se producen de forma natural en un organismo. Cualquier sitio de escisión (reconocimiento) de proteasas de especifidad elevada puede ser usado en la práctica de esta invención. Estos sitios pueden comprender secuencias que se producen de forma natural o secuencias de consenso derivadas.
Debe apreciarse adicionalmente no es necesario que el sitio preciso de escisión para una proteasa de especifidad elevada sea determinado para la práctica de la invención. De hecho, en la medida en que se determine la secuencia de aminoácidos de la zona escindida, esa zona, o una parte de esa zona, puede ser incorporada en una molécula reportera de polipéptido dentro del alcance de la invención. Contrariamente, tampoco es necesario conocer la identidad de una proteasa de especifidad elevada distinta de su propensión a escindir una proteína cuya secuencia puede ser determinada. Si una zona diana puede ser definida, la actividad de cualquier proteasa de especifidad elevada puede ser detectada o determinada según la presente invención. Consecuentemente, comparando la actividad de una proteasa de especifidad elevada en presencia y ausencia de un agente, definido en la presente memoria descriptiva, puede ser valorado el efecto del agente sobre la proteasa.
Los sitios de reconocimiento para proteasas de mamíferos y seres humanos son preferidos e incluyen proteasas tanto solubles como asociadas a membranas. En una realización, una actividad de proteasa generalmente soluble puede resultar asociada a una membrana como una proteína de fusión recombinante, mediante la introducción de una secuencia de anclaje a membrana heteróloga.
En una realización preferida, el sitio de reconocimiento de especifidad elevada es escindido por una proteasa involucrada en la apoptosis, por ejemplo una caspasa (por ejemplo caspasa-1, caspasa-2, caspasa-3, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, caspasa-11, caspasa-12, caspasa-13 (ERICE) o caspasa-14), u otras membranas de la familia de genes ICE-ced3 (véase Thornberry y otros 1997). Para los fines de esta invención, el activador de caspasas, granzima B, es denominado también en la presente memoria descriptiva como una caspasa. También es preferida una parte del dominio citosólico de la proteína precursora amoloide beta (APP) (Cescato y otros 2000), especialmente la zona que contiene el consenso de reconocimiento de tipo caspasa, (IVL)ExD (Weidemann y otros 1999), y zonas que contienen sitios de secretasa alfa, beta o gamma; secuencias que codifican el sitio de escisión carboxipeptidasa A1 (CPA) (Hamstra y otros 1999), otras proteínas dianas de caspasas preferidas son descritas en la Tabla 1 de Stroh y Schulz-Osthoff (1998).
Los sitios de escisión que se producen de forma natural y de consenso para las caspasas son bien conocidos en la técnica, y pueden ser derivadas secuencias dianas adicionales mediante la exploración posicional de bibliotecas combinatoriales (Thornberry y otros 1997) o, más tradicionalmente, secuenciando los sitios de escisión de sustratos que se producen de forma natural. Los sitios de escisión representativos y las secuencias circundantes son proporcionados por Nicholson 1999; Stennicke y Salvesen 1999; Stroh y Schulze-Osthoff 1998; y la publicación PCT WO 99/18856. Ejemplos de sustratos incluyen WEHD (caspasa-1); DEHD (caspasa-2), W/LEGD (caspasa-4 y -5), VEHD (caspasa-6), LETD (caspasa-7), IETD (caspasa-8), LEHD (caspasa-9), (I/L/V/P)EHD (caspasa-11) y IEPD (granzima B).
Proteasas de especifidad elevada adicionales y no limitativas para las que los sitios de reconocimientos son conocidos o están suficientemente definidos para la práctica de esta invención son definidas en "Handbook of Proteolytic Enzymes", A.J. Barrett. N.D. Rawlings y J.F. Woessner Eds. (Academic Press, Londres 1998). Los sitios de reconocimiento diana aceptables son conocidos también por: Catepsinas como: Catepsina B, que son cisteína-proteasas implicadas en el cáncer y que tienen una amplia especifidad caracterizada por aminoácidos hidrófobos grandes o arginina en P2; Catepsina D, proteasas aspárticas de sitios activos implicadas en cánceres de mamas y otros, específicas para aminoácidos hidrófobos en P1 y P1'; Catepsina K, una cisteína-proteasa potencialmente involucrada en la osteoporosis, cuyo sitio de reconocimiento/escisión requiere un aminoácido hidrófobo en P2. También son aceptables cualquiera de las secuencias de reconocimiento para las 18 metaloproteasas de matriz implicadas en diversos aspectos del cáncer, desplazamiento celular e inflamación, que incluyen MMP-2 (colagenasa IV), cuyo sustrato óptimo está proporcionado por la fórmula: Hyp-Xaa-Pro-Leu-Ala-*-Met-Phe-Gly-Xaa-Hyp. Secuencias adicionales incluyen la secuencia de reconocimiento de trombina de fibrinógeno: Val-Pro-Arg-*-Ser-Phe-Arg; la secuencia altamente específica D-R-V-Y-I-H-P-F-H-L-*-L-V-Y-S de la renina (una proteasa aspártica que regula la presión sanguínea escindiendo y activando angiotensinógeno); la secuencia de reconocimiento C-P-G-R-*-V-V-G-G-S de uroquinasa (una serina-proteasa y activador de plasminógeno implicado en el cáncer); también, triptasas, como la secuencia de reconocimiento de consenso Gln(Glu)-X-Arg de triptasa Clara (Kido y otros 1999). Las triptasas son serina-proteasas implicadas en la inflamación alérgica y el asma, cuyos sitios de reconocimiento están generalmente caracterizados por Lys o Arg en P2 y Pro en P3 o P4. También son aplicables las secuencias de reconocimiento para elastasas, en particular la serina-proteasa, elastasa de leucocitos, que está implicada en la enfermedad pulmonar y asma y cuyo sitio de reconocimiento está caracterizado por Leu, Val, Ala, Ser o Cys en P1. También son aplicables los sitios de reconocimiento para cualquiera de las proteasas, predominantemente de tipo serina, involucradas en la coagulación, quinina/kalikreina y cascadas de complementos, así como las de diversas moléculas de adhesión celular (CAMS) (por ejemplo Hoffman y otros 1998); antígeno específico de la próstata (PSA) (Coombs y otros 1998); y las secretasas beta y gamma, implicadas en la enfermedad de Alzheimer (Selkoe y Wolfe 2000; Capell y otros 2000; y Sudoh y otros 2000).
Los sitios de reconocimientos para proteasas virales y bacterianas son también preferidos para la práctica de la invención. Los sitios de escisión aplicables incluyen, pero no limitados al sitio de escisión de consenso D(E)-X-X-X-X-C(T)-*-S de la serina-proteasa HCV, sitios de escisión de la familia de serina-proteasa de Herpevirus, incluyendo la secuencia de escisión de consenso V(L,A)-N(D,Q,E)-A-*-S y sitios de reconocimiento para proteasas de Coronavirus y poliovirus y cisteína-proteasas de rinovirus 3C que escinden entre los residuos Gln y Gly. Son análogamente aplicables los sitios de escisión de proteasa HIV-1 como, por ejemplo, IRKILFLDGI (Christopher y otros, Biochemistry 1989, 28(26), 9881-90) y el sitio de escisión de consenso HSV-1 LVLASSSF (O'Boyle y otros 1997).
También son preferidos sitios de reconocimiento para metaloproteasas de S. macescens, L. pneumophila, P. aeruginosa y otras bacterias características de infecciones oportunistas. El sitio de escisión de P. aeruginosa sigue el consenso X-F-*-F(L,Y,V)-A. También son preferidas las secuencias de reconocimiento de las proteasas específicas de IgA de diversas bacterias patógenas como las serinas-proteasas de N. gonorrhoeae, N. meningitidis y H. influenzae, y las metaloproteasas de S. pneumoniae y S. sanguis, que escinden los enlaces Pro-Thr y Pro-Ser en las zonas de bisagra con elevado contenido de prolina de IgA. También es aplicable el sitio de reconocimiento para la dipeptidasa D-Ala-D-Ala, VanX, una metaloproteasa de bacterias gram-positivas que destruye una diana de unión a vancomicina.
Los sitios de reconocimiento para proteasas parásitas son también preferidos, incluyendo las proteasas plasmepsinas-aspárticas de la malaria involucradas en la degradación de la hemoglobina, que prefieren residuos Phe o Leu hidrófobos en P1 y P1' así como sitios para las proteasas aspártica de Shistosoma y cisteína de Leismania.
La presente invención se refiere también a la asociación, o disociación, de la totalidad o una parte de una molécula reportera de polipéptido y una membrana. En una realización, la membrana comprende un lisado celular. En otra realización, la membrana comprende membranas celulares purificadas o parcialmente purificadas, por ejemplo membranas nucleares, de plasma, mitocondriales, endosomales o de Golgi, o vesículas. En otra realización, la membrana comprende una membrana lípida artificial, como una vesícula, liposoma o mono- o bi-capa lípida.
En una realización preferida, las membranas están contenidas en una célula intacta. Las células apropiadas incluyen células procarióticas y eucarióticas que incluyen, pero no limitadas a células de E. coli, levaduras, insectos y mamíferos. Con respecto a las células de animales multicelulares, una célula intacta abarca células tanto in vivo como ex vivo y, por tanto, incluye la gama completa de células cultivadas inmortalizadas o recientemente aisladas en pacientes intactos.
En una realización preferida, la célula es de un paciente, definido para ello como cualquier persona o animal no humano. Estos animales no humanos incluyen todos los vertebrados domesticados y salvajes, preferentemente, pero no limitados a ratón, ratas, conejos, pescado, pájaros, hámsteres, perros, gatos, cerdo, oveja, caballos, ganado y primates no humanos. En una realización altamente preferida, el paciente es un ser humano.
En otra realización preferida, la membrana es de o están en una célula tumoral, preferentemente una célula maligna o cancerosa transformada, preferentemente de un paciente. La célula tumoral puede ser de un tumor sólido o no sólido que se origine en cualquier tipo de célula o sitio del cuerpo incluyendo, pero no limitado a células derivadas de cánceres del cerebro, pulmón (por ejemplo células pequeñas y células no pequeñas), ovario, mama, próstata, piel y colon, así como carcinomas y sarcomas. También son preferidas las células metastáticas y células del sitio de origen de un tumor. Como es reconocido por un experto en la técnica, en algunas realizaciones es deseable obtener un clon de células, o múltiples células tumorales del mismo paciente, metástasis, masa celular o línea celular, para uso en ensayos múltiples, repetidos o comparativos.
Las condiciones que permiten la asociación de una molécula reportera de polipéptido con una membrana son proporcionadas generalmente por un lisado de células intactas o células completas. Cuando el dominio de localización comprende una señal para lipidación catalizada por enzima, la célula o lisado intacto contendrán una enzima de lipidación apropiada. Cuando la membrana comprende un componente de membrana subcelular altamente purificado, preferentemente en una solución acuosa, puede ser preferible complementar la membrana con una enzima lipidante, por ejemplo añadiendo una fracción celular soluble de un lisado celular. Cuando el dominio de localización favorece una asociación directa con una molécula asociada a membrana, como una proteína, lipoproteína o glicoproteína, las condiciones apropiadas comprenden una membrana que contiene la molécula apropiada asociada a membrana, preferentemente en una solución acuosa o tampón. Naturalmente, si el dominio de localización a dirige una asociación directa con componentes lípidos de la membrana, las condiciones apropiadas pueden comprender una solución acuosa de lípidos de membrana derivados de fuentes naturales o sintéticos, que pueden ser glicerolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos, colesterol, colinas, etanolaminas, mio-inositol y similares, o sus combinaciones.
Las condiciones que permiten la emisión de una señal desde la parte de detección dependen del sistema de detección escogido pero, no obstante, son bien entendidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas intrínsecamente fluorescentes son detectadas mejor en un entorno acuoso, mientras que la detección de señales enzimáticas (por ejemplo de fosfatasa alcalina, luciferasa o beta-galactosidasa) puede requerir la adición de sustratos exógenos.
Ejemplos no limitativos de moléculas reporteras de polipéptidos que pueden ser usadas para la presente invención son quimeras de fusión K-Ras-GFP. K-Ras, una proteína de unión a GTP pequeña, dirige a diana GFP a la membrana de plasma mediante un grupo farnesilo en el C terminal y una zona polibásica cercana. La quimera de fusión K-Ras-GFP se mostró que existe en un equilibrio dinámico que cambia rápidamente entre una forma unida a membrana de plasma y una forma citosólica (Yokoe y otros 1996). La GFP no ha sido comúnmente usada como un marcador de co-transfección porque se escapa de las células después de la fijación y permeabilización con etanol. Para evitar este problema, Jiang y otros (1998) fusionaron GFP con la secuencia que proporciona las señales de farnesilación y palmitoilación para dirigir a diana la H-Ras a la membrana de plasma.
Otro ejemplo no limitativo de una molécula reportera de polipéptido es EGFP-(DEVD)-RasF, en la que DEVD es una secuencia de señal de reconocimiento de escisión de caspasa que conduce a una escisión proteolítica de una parte de detección de dicha molécula reportera de polipéptido que puede ser detectada. Naturalmente, en una realización alternativa, la señal de reconocimiento de DEVD puede estar colocada en el dominio de detección, de forma que el reportero retenga las características luminiscentes hasta que sea escindido por una caspasa.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, una parte de localización comprende uno o más dominios de localización. Un dominio de localización comprende cualquier secuencia de aminoácidos que directa o indirectamente favorezca una asociación con una membrana artificial o celular, o un compartimento subcelular, que puede ser soluble. No obstante, como se usa en la presente memoria descriptiva, un dominio de localización se entiende que abarca una multiplicidad de secuencias de aminoácidos separables, cada una de las cuales pueden favorecer directa o indirectamente la asociación con una membrana o compartimento subcelular. En realizaciones preferidas, los dominios de localización proporcionan medios para anclar un dominio de detección a una membrana. Por tanto, cuando se incorpora en las moléculas reporteras de polipéptidos descritas en la memoria descriptiva, un dominio de localización comprende preferentemente al menos un dominio de anclaje, preferentemente al menos un dominio de anclaje a membrana. En las realizaciones preferidas, el dominio de anclaje a membrana comprende una o más señales para una lipidación catalizada por enzimas, que incluyen, pero no limitadas a señales para miristoilación, palmitoilación y, más preferentemente, geranilgeranilación o farnesilación, anteriormente
expuestas.
En las realizaciones preferidas, la señal de lipidación deriva de una secuencia ras, preferentemente H-, N-, K(i4)A- o K(i4)B-Ras, más preferentemente, Ki4B-Ras y N-Ras. En una realización, la secuencia de la señal de lipidación comprende una secuencia de señal de farnesilación de una proteína Ras o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. En las realizaciones preferidas, la secuencia ras comprende la zona de polilisina de Ki4B-Ras o N-Ras, incluidas sus variantes. Como se usa en la presente memoria descriptiva, una variante comprende una secuencia de aminoácidos similares que tiene sustituciones de aminoácidos conservadoras, pero que tiene esencialmente la misma tendencia asociativa a membranas. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático con otro, como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn (véase Zubay 1983).
Las señales de lipidación aceptables adicionales pueden derivarse de partes de proteínas de unión a GTP y pueden incluir péptidos que codifican el resto MGC o subunidades de proteína G alfa (por ejemplo subunidades alfa de G_{i}, G_{0} y G_{z}) (Galbiati y otros 1999; Parenti y otros 1993; y Koegl y otros 1994); proteínas quinasas dependientes de cAMP, y diversas proteínas de capas retrovirales. En una célula intacta, la señal de miristoilación, palmitoilación, geranilgeranilación y farnesilación tenderá a favorecer la asociación preferente de una molécula reportera de polipéptido con la hojuela interna de membranas de plasma. Por el contrario, un dominio de anclaje a membrana que comprende una señal para la adición de glicosilfosfatidilinositol (GPI) tenderá a dirigir a diana la molécula reportera de polipéptido hacia la hojuela externa de la membrana de plasma en una célula intacta. (Por ejemplo Seaton y otros 2000; y Marcic y otros 2000).
Un dominio de anclaje a membrana comprende adicionalmente secuencias que se asocian directamente con una membrana o componentes de membrana. En una realización, el dominio de anclaje a membrana es un resto lípido, esteroide, alifático o de alguna otra forma lipófilo. En otra realización, el dominio de anclaje a membrana es una secuencia de péptido, lipopéptido o glicopéptido que interacciona específicamente con un componente de la membrana. En una realización, el dominio de anclaje a membrana es una lecitina que se une a un resto de carbohidrato de una proteína asociada a la membrana. En una realización preferida, el dominio de anclaje a membrana comprende una secuencia de péptido que es específicamente reconocida por una proteína asociada a la membrana. Ejemplos no limitativos incluyen el sistema receptor de andrógenos descrito por Georget y otros (1997); secuencias de proteínas quinasas, incluidas las secuencias de proteína quinasa C (PKC), como es descrito por Sakai y otros (1997); secuencias de unión a caveolina (por ejemplo Galbiati y otros 1999); receptores acoplados a proteínas G de membrana de plasma como el receptor paratiroide (Conway y otros 1999); secuencias virales asociadas con membranas como la zona de anclaje de Nef (Welker y otros 1998).
En otra realización preferida, el dominio de anclaje a membrana comprende una secuencia de señal de polipéptido para la inserción co-translacional o post-translacional de un polipéptido directamente en una membrana. Dichas secuencias de señales son bien conocidas en la técnica e incluyen el péptido líder de factor \gamma de Saccharomyces; la secuencia de señal para IL-7 descrita en la patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia de señal para el receptor IL-2 descrita por Cosman y otros (1984); el péptido de señal de IL-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido de señal receptor IL-1 de tipo I descrito en la patente de EE.UU. 4.968.607; y el péptido de señal receptor IL-1 de tipo H descrito en el documento EP 460.846.
También son aceptables las secuencias líderes para la inserción post-translacional en membranas mitocondriales y secuencias de dirección a diana específicas para retículo endoplásmico, aparato de Golgi, membranas nucleares de peroxisoma o cualquier otro subcompartimento celular membranoso.
Alternativamente, la molécula reportera de polipéptido puede contener una señal de dirección a diana para un compartimento subcelular, en lugar de un anclaje a membrana. La señal de dirección a diana proporciona un dominio de anclaje para mantener el reportero en un compartimento subcelular soluble como el núcleo. El dominio de dirección a diana puede ser de una proteína de unión a ADN (por ejemplo un factor de transcripción, helicasa, topoisomerasa o polimerasa) o proteína asociada a ADN como una proteína nucleosomal o nucleolar. Por ejemplo, una proteína fluorescente pequeña como GFP puede ser fusionada a NF_{kappa}B a través de una secuencia conectora corta que comprende un sitio de escisión de caspasa-3. Cuando es expresado en una célula, el reportero es dirigido a diana al núcleo mediante el anclaje NF_{kappa}B, y puede ser observado mediante la expresión de una señal desde el dominio de detección. Sin embargo, tras la escisión en el sitio 3 de caspasa, GFP es liberada desde su anclaje nuclear y se difunde a través de la célula.
Dado que las caspasas o cualquier proteasa pueden ser activas en el núcleo, se podría concebir que los genes reporteros dirigidos a diana al núcleo podrían ser "desdirigidos a diana" mediante la supresión de una señal de dirección a diana a través de la escisión de la proteasa. Por tanto, además de la dirección a diana a membrana, los productos de genes reporteros pueden ser específicamente dirigidos a diana a otros lugares incorporando un dominio de anclaje para un lugar subcelular deseado (Chatterjee y otros 1997). De hecho, los polipéptidos que están destinados para el núcleo, portan señales de dirección a diana específicas denominadas señales de localización nucleares (NLS) que catalizan la translocación a través de la envoltura nuclear. Los productos de genes reporteros, particularmente los de menos de aproximadamente 70 kDa, conectados a una NLS mediante un sitio de escisión de proteasas se espera que se difundan desde el núcleo hasta el citoplasma tras la escisión de la proteasa. Inversamente, los productos de genes reporteros, de menos de aproximadamente 70 kDa, conectados unos a otros mediante sitios de escisión de proteasas para formar una proteína de fusión de más de 70 kDa, se espera que se difundan desde el citosol hasta el núcleo tras la escisión.
La escisión de la enzima nuclear poli-(ADP ribosa) polimerasa (PARP) es un indicador útil de la muerte celular programada. Se escinde desde una forma de 116 kDa hasta 24 kDa y fragmentos de 89 kDa. La caspasa-3 y caspasa-7 se cree que son principalmente responsables de la escisión de PARP durante la apoptosis (Cohen y otros 1997). Por tanto, en una realización, un dominio de anclaje nuclear puede comprender la totalidad o una parte de PARP que contiene un NLS. Una proteína de fusión que comprende un dominio de detección de GFP conectado mediante un sitio de escisión de caspasa a PARP (o un NLS de PARP) se localizaría en el compartimento nuclear. Tras la escisión por una caspasa, la parte de GFP se difundiría desde el núcleo, emitiendo así una señal de detección alterada.
Las composiciones y los métodos de la presente invención se pueden aplicar a uno o una multitud de agentes, es decir, uno o más agentes. Como se usa en la presente memoria descriptiva, los agentes comprenden compuestos que incluyen: productos químicos; moléculas pequeñas como péptidos y ácidos nucleicos; extractos de plantas, bacterias, hongos o animales que pueden contener moléculas bioactivas; agentes carcinógenos conocidos y sospechados; inhibidores, ligandos o sustratos de enzimas involucradas en la proteolisis, glicosilación, fosforilación, lipidación y proteolisis; y agentes quimioterapéuticos conocidos y sospechados, y sus combinaciones. Los agentes quimioterapéuticos conocidos incluyen radiación ionizante, cisplatino-transferrina, fluoxetina, estaurosporinas, vinblastina, metotrexato, 5-fluorouracilo y leucovorina, ejemplos adicionales de los cuales pueden encontrarse en Physicians' Desk Reference (2000).
Como se usan en la presente memoria descriptiva, los agentes pueden comprender adicionalmente ciclos o tratamientos con radiación y/o compuestos, que incluyen aproximaciones in vitro de ciclos de tratamiento en un paciente. Un ciclo de tratamiento puede tener en cuenta factores como el tiempo, el orden, la concentración, la dosis y el método de administrar cada componente de un tratamiento.
Por tanto, un agente de la invención puede ser cualquier agente bioactivo, por ejemplo, pero sin limitación, un compuesto como una molécula, un péptido o una molécula proteinácea. Un agente puede ser también un virus, fago, prion, célula procariótica o eucariótica, o una o más longitudes de onda de radiación electromagnética. Preferentemente, dicho agente es un compuesto. Preferentemente, dicho agente es usado en una cantidad que sea no tóxica para una célula normal. Preferentemente, dicho agente es capaz de traspasar la membrana de plasma de una célula.
En una realización, un agente es una molécula proteinácea. En otra realización, un agente es una molécula proteinácea codificada por un ácido nucleico, en que el agente se proporciona a la célula a través de la provisión a la célula de un ácido nucleico que codifique la molécula proteinácea. Un agente puede actuar directa o indirectamente sobre una molécula reportera de polipéptido. Una posible acción indirecta es, por ejemplo, la activación de una vía señalizadora mediante un agente, en la que la señalización da lugar a un cambio en la célula que tiene como resultado una redistribución de la molécula reportera de polipéptido, según se indica mediante la medición o detección de cambios en una señal emitida por la parte de detección.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, una parte de detección comprende uno o más dominios de detección. Un dominio de detección es cualquier secuencia de aminoácido, molécula o parte de la misma capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un dominio de detección se entiende también que abarca una multiplicidad de secuencias de aminoácidos separables, moléculas o partes de la misma, cada una de las cuales puede generar directa o indirectamente una señal detectable.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, una parte de detección o dominio, puede ser una sonda o resto resonante, coloreado, colorogénico, inmunogénico, fluorescente, luminiscente o radioactivo. Una parte de detección puede ser también una molécula proteinácea que puede ser detectada, como una enzima de tipo beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, beta-lactamasa, etc. Una parte de detección puede ser también cualquier molécula que pueda ser detectada con técnicas convencionales usadas para etiquetar moléculas proteináceas, incluyendo, pero no limitadas a la aplicación de anticuerpos específicos para epitopos y la conjugación de moléculas fluorescentes pequeñas. En una realización, una parte de detección abarca un regulador transcripcional, como el sistema reportero heterólogo descrito en la patente de EE.UU. nº 5.776.675 de Broad.
Preferentemente, un dominio de detección es un resto fluorescente, radioactivo, luminiscente y/o coloreado. Preferentemente, dicho resto fluorescente es una proteína fluorescente, definida en la presente memoria descriptiva como cualquier polipéptido capaz de emitir una señal fluorescente detectable por encima de la fluorescencia de fondo de una célula o composición de membrana intacta. Las proteínas fluorescentes adecuadas incluyen Proteína Fluorescente Roja (RFP) de las especies de anémona Discosoma del mar Indopacífico, Proteína Fluorescente Verde (GFP) derivada de Aequorea victoria, y partes funcionales, derivados, análogos y/o versiones funcionalmente mejoradas de las mismas. Un ejemplo no limitativo de una versión funcionalmente mejorada de GFP es la Proteína Fluorescente Verde mejorada (EGFP) como se describe por Yang y otros (1996). Las RFP, GFP y versiones mejoradas de GFP (EYFP, EGFP, ECFP y EBFP) están disponibles en la empresa Clonetech. Para los fines de esta invención, estos polipéptidos pueden ser usados de forma intercambiable, y pueden ser denominados en la presente memoria descriptiva colectivamente GFP.
Las RFP y GFP son proteínas intrínsecamente fluorescentes que generan fluorescencia sin necesidad de ninguno de los factores celulares que hacen que las proteínas sean ideales para los estudios en un tejido vivo. La aplicación más satisfactoria de GFP ha sido la fusión en marco con proteínas y posterior expresión en células para verificar su distribución y destino. La GFP ha sido dirigida a diana satisfactoriamente a prácticamente cualquier organelo principal de la célula, incluida la membrana de plasma (Tsien 1998). La GFP ha sido dirigida a diana a la membrana de plasma por fusión de K-Ras (Yokoe y otros 1996), hasta los últimos 20 residuos de aminoácidos de H-Ras (Jiang y otros 1998), a un dominio de homología de pleckstrina (PH) (Stauffer y otros 1998) o al anclaje de glicosilfosfatidil-inositol (De Angelis y otros 1998). De Angelis y colaboradores descubrieron que cuando se ponen juntas dos moléculas GFP ocurren cambios espectrales que los permiten definir un índice radiométrico de autoasociación (De Angelis y otros 1998). Este aspecto puede ser usado para diseñar ensayos de selección de producción elevada.
Otras aplicaciones potenciales de GFP etiquetada en la selección de fármacos citotóxicos es la quimera de fusión con una proteína de membrana de poros nuclear (Imreh y otros 1998) o helicasa de ARN nuclear (Valdez y otros 1998). La fusión de la proteína de membrana de poros nuclear integral POM121-GFP es correctamente dirigida a diana a los poros nucleares en diversas líneas celulares, y se puede usar como un marcador para estudios no invasivos de distribución de poros nucleares y dinámicas de envolturas nucleares. Verificando la envoltura nuclear, es posible también distinguir entre procedimientos apoptóticos y necróticos, que pueden ser útiles en la selección de productos químicos tóxicos. La fluorescencia de POM121-GFP alrededor de la periferia nuclear es más débil o está ausente en células apoptóticas en contraste con la fluorescencia no afectada en células necróticas. También, la translocación inducida por fármacos de la helicasa de ARN nucleolar/proteína de fusión GFP del nucleolo al nucleoplasma puede ser útil para determinar la eficacia de agentes citotóxicos (Valdez y otros 1998). Otra detección basada en GFP de muerte celular programada (apoptosis) fue descrita por Xu y otros (1998).
Para la práctica de esta invención, la absorbancia y transferencia de energía, con la posterior emisión de una señal detectable, son funcionalmente equivalentes a la emisión o producción directa o indirecta de una señal por un dominio de detección. Y, en una realización de la invención, el dominio de detección puede comprender uno o más componentes de un sistema de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Dichos espectros también pueden ser usados para diseñar ensayos de detección de producción elevada. La FRET es un procedimiento en el que un fluoróforo excitado (un donante de resonancia) transfiere su energía de estado excitado a una molécula de absorción de luz (un aceptor de resonancia).
En la práctica de la presente invención, los donantes y aceptores de resonancia puede estar en las mismas o diferentes moléculas. En una realización, una molécula reportera de polipéptido que comprende un dominio de dirección a diana de membrana, al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada, y un dominio de detección donante de resonancia puede comprender una primera molécula. El componente restante del sistema de FRET puede comprender entonces un dominio de dirección a diana de membrana y un dominio aceptor de resonancia. Esta segunda molécula puede contener, aunque no necesariamente, un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada. La escisión de la primera molécula por la proteasa de especifidad elevada altera la asociación común de membranas de las dos moléculas, cambiando así la señal de resonancia. Naturalmente, otras combinaciones de sistemas de FRET de dos partes son fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Los sistemas de transferencia resonantes que pueden ser útiles en la generación y detección de una señal del dominio de detección incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. 5.047.321, 5.340.716 y 5.709.994 de Loken, Ullman y Pease, respectivamente.
La transferencia resonante se puede producir entre dos mutantes de colores diferentes de GFP cuando se ponen en estrecha proximidad (Mitra y otros 1996). La interrupción de la asociación espacial entre las proteínas elimina el efecto de FRET. Por ejemplo, cuando la GFP y la proteína fluorescente azul (BFP), un derivado azul de GFP, están unidos por un péptido corto que contiene la secuencia de reconocimiento de caspasa-3 DEVD, la activación de la caspasa-3 de proteasa intracelular durante la apoptosis puede ser verificadamente el ensayo de FRET. Respecto a la función clave de la caspasa-3, la verificación del procedimiento de apoptosis en células vivas esta comúnmente basada en la detección de la activación de caspasa-3, usando sustratos de proteasas fluorogénicas que contienen la secuencia de reconocimiento de DEVD.
Como se describe en la presente memoria descriptiva, una alteración, o falta de alteración, en la localización subcelular o asociación a membrana de una molécula reportera de polipéptido puede ser ensayada detectando o determinando la señal emitida por uno o más dominios de detección. La detección se refiere a la presencia o ausencia de una señal en una célula particular, membrana o compartimento subcelular, por ejemplo la aparición de una señal en donde previamente no fue emitida ninguna, o la desaparición de una señal previamente observable. La determinación abarca detectar pero supone adicionalmente alguna medición de la intensidad relativa o velocidad de cambio de una señal.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, un dominio de localización puede ser cualquier molécula o sustancia capaz de manifestar la distribución de una molécula proteinácea u otra sustancia en una célula intacta, lisado celular que contiene membrana, solución que contiene membrana, compartimento subcelular o parte soluble de uno organelo. Preferentemente, dicho dominio de localización está en una molécula proteinácea de una célula o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.
Dicha célula puede ser una célula procariótica o una célula eucariótica. En una realización, una molécula reportera de polipéptido dentro del alcance de la invención es generada o está mezclada con un lisado de dicha célula que comprende membranas celulares, que pueden ser purificadas o enriquecidas según métodos estándar. En otra realización, la molécula reportera de polipéptido es expuesta a una membrana lípida artificial, como una micela. Un ejemplo no limitativo de una célula intacta es una bacteria patógena. Un cambio en la distribución de una molécula proteinácea codificada por bacteria patógena puede alterar al menos en parte la patogenicidad de dicha bacteria patógena. Cuando dicha célula está en una célula de animal o ser humano, es preferido que dicha molécula proteinácea esté involucrada al menos en parte en una enfermedad de dicho animal o ser humano.
En una realización dicha célula es una célula tumoral, célula transformada, neoplasma, célula de cáncer o derivado de la misma como línea celular establecida de una célula tumoral o cancerígena. Dicha línea celular puede ser generada como nueva a partir de células cultivadas o células de un paciente, o dicha línea celular puede ser obtenida a partir de una empresa de recogida de tejidos. En otra realización, dicha célula comprende un agente patógeno, en el que dicha molécula proteinácea es una molécula codificada por un ácido nucleico de dicho agente patógeno. Un ejemplo no limitativo de este agente patógeno es un virus. Un cambio en la distribución de una molécula proteinácea codificada por un virus pueden alterar al menos en parte la virulencia de dicho virus. Un ejemplo no limitativo de un dominio de localización que puede ser usado en la presente invención es el dominio de homología de pleckstrina (PH) (Stauffer y otros 1998). Los dominios de PH pueden ser encontrados en una diversidad de enzimas. Se cree que se unen a lípidos de fosfatidilinositol en membranas. De esta forma, el dominio de PH de fosfolipasa C d1 sirve como un módulo de localización uniéndose a 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol en membranas. Una fusión de GFP-PH se mostró que se disociaba de la membrana de plasma a continuación de la estimulación del receptor, mostrando que el 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol puede tener una segunda función mensajera (Stauffer y otros 1998). Este último estudio describía una disociación transitoria de GFP-PH de la membrana de plasma, seguida de una rápida redistribución para la membrana de plasma (3-8 minutos), lo que hace relativamente poco práctico seleccionar en cuanto a inhibidores potenciales de ambos procedimientos. De forma preferente aunque no necesaria, los dominios de localización de la invención se redistribuyen después de más de 10 minutos hasta su localización original, después de proporcionar a una célula un agente de la invención. Lo más preferentemente, los dominios de localización de la invención no se redistribuyen significativamente a su localización original después de proporcionar a una célula un agente de la
invención.
La distribución puede estar limitada a uno o más organelos específicos u otra parte discriminable en una célula o lisado celular. Sin embargo, dicha distribución puede ser también una distribución por toda la célula completa o una distribución citoplásmica.
Una localización, o dominio de anclaje, preferentemente un dominio de anclaje a membrana, es una parte capaz de localizarse a sí mismo y/o a una molécula unida, a una cierta localización en una célula o a una membrana subcelular. Un dominio de anclaje a membrana puede comprender una parte proteinácea con la capacidad intrínseca de localizarse a sí misma y/o a una molécula asociada a una cierta localización en una célula. Alternativamente, un dominio de anclaje a membrana puede ser una parte con la capacidad de unirse a una molécula diferente, en que dicha molécula diferente está localizada en una cierta localización en una célula. Además de ello, un dominio de anclaje a membrana puede comprender también una secuencia de señal para modificar dicho dominio de localización y/o una molécula conectada, en que dicha modificación afecta y preferentemente cambia la distribución del dominio de anclaje a membrana y/o molécula conectada con respecto a una membrana celular. Preferentemente, la secuencia de señal para modificar el dominio de anclaje a membrana y/o molécula conectada es una secuencia de señal capaz de ser reconocida por una maquinaria enzimática celular para unir uno o más restos hidrófobos al dominio de anclaje a membrana y/o molécula conectadas.
Preferentemente, un resto hidrófobo de la invención es un ácido graso, un isoprenoide y/o un lípido. Preferentemente, un resto hidrófobo de la invención es un lípido de inositol, preferentemente un lípido de fosfatidilinositol o un lípido de glicosil-fosfatidilinositol. Es adicionalmente preferido un resto hidrófobo que sea un ácido graso, preferentemente un ácido graso saturado como ácido esteárico, palmítico o mirístico. Es adicionalmente preferido un resto hidrófobo que sea un isoprenoide, preferentemente un isoprenoide farnesilo (F) de 15 átomos de carbono (C_{15}) o un isoprenoide geranilgeranilo (GG) de 20 átomos de carbono (C_{20}). Generalmente es preferido un resto hidrófobo que comprende unidades de isopreno (C5) y sus derivados y/o análogos.
En una realización preferida de la invención, un dominio de anclaje a membrana comprende un dominio de localización de una proteína Ras. Las proteínas Ras comprenden una secuencia de señal de farnesilación que el menos en parte determina la distribución de dichas proteínas Ras en la membrana de plasma. Las aproximaciones para desarrollar inhibidores de farnesilación de Ras como agentes quimioterapéuticos potenciales para el tratamiento de cáncer relacionado con Ras incluyen ensayos in vitro y in vivo. Basándose en las diferencias en las afinidades de las proteínas Ras para proteína farnesilo transferasa (FPTasa), es particularmente importante establecer la actividad inhibidora hacia K-Ras, la forma de Ras más a menudo mutada en cánceres humanos (Kelloff y otros 1997).
La inhibición de la actividad de FPTasa puede ser determinada midiendo la incorporación de farnesil-pirofosfato tritiado en proteínas Ras recombinantes o péptidos relacionados Ras. Para estos ensayos (Reiss y otros 1990, Gibbs y otros 1993, Kohl y otros 1994, James y otros 1995), se obtuvo FPTasa de extractos purificados o (semi)brutos de E. coli o líneas celulares de mamíferos (Prendergast y otros 1994). La selectividad de los inhibidores hacia FTasa, relativa a geranilgeranil transferasas (GGTasas), puede ser determinada a través de la incorporación de geranilgeranil-pirofosfato tritiado en sustratos aceptores apropiados. La selectividad de los inhibidores de FTasa hacia escualeno sintasa, que cataliza la dimerización reductora de FPP para formar escualeno, es normalmente determinada (Cohen y otros 1995).
La inhibición del tratamiento de Ras se hace tradicionalmente en células intactas que sobre-expresan proteínas Ras y metabólicamente marcadas con mevalonato tritiado. Los metabolitos de ácido mevalónico, como farnesil-pirofosfato, son incorporados en proteínas (Hancock y otros 1989). Las proteínas radiomarcadas, como Ras, pueden ser posteriormente inmunoprecipitadas con anticuerpos específicos (Hancock y otros 1989). Otros ensayos celulares que demuestran la actividad biológica de los inhibidores de FTasa (Gibbs y otros 1996) incluyen la inhibición de los efectos celulares mediados por Ras como el crecimiento independiente del anclaje (Kohl y otros 1993, Kohl y otros 1994), inversión (James y otros 1993) de fenotipo morfológico (por ejemplo aglutinación multicapas de glóbulos, Seeburg y otros 1984) y alteraciones en el citoesqueleto (Prendergast y otros 1994).
La actividad de los inhibidores de FPT sobre el crecimiento de tumores dependientes de Ras que se originan a partir de líneas celulares humanas (xenoinjerto) o de roedores (isoinjerto) transformadas que portan genes Ras mutantes puede ser evaluada en ratones desprovistos de sistema inmunológico (Hara y otros 1993). Otro modelo de cáncer in vivo incluye alojar en ratones transgénicos un gen Ha-Ras activado bajo el control del promotor del virus tumoral mamario del ratón. Estos onco-ratones desarrollan carcinomas mamarios y salivares estocásticamente. En este modelo, los inhibidores de FTasa provocan la regresión tumoral (Kohl y otros 1996). La asociación de genes Ras activados con la transformación oncogénica en animales experimentales está bien establecida (Barbacid 1990). La actividad quimiopreventiva de los inhibidores de FTasa puede ser ensayada en modelos tumorales químicamente inducidos relacionados con los genes Ras mutados de ratón (Matzinger y otros 1995), rata (Singh y otros 1994) y hámster (van Kranen y otros 1991).
En una realización, la invención proporciona una molécula reportera de polipéptido que comprende dos o más dominios de anclaje a membranas en los que preferentemente uno comprende una secuencia de señal para la modificación lípida del dominio de localización y un segundo comprende una extensión de polilisina.
El cultivo de una célula que comprende cualquier molécula reportera de polipéptido de la invención puede ser realizado mediante cualquier método adecuado para cultivar dicha célula, con la condición de que el tiempo entre la provisión de dicho agente a dicha célula y la determinación de la distribución de al menos parte de dicha molécula reportera de polipéptido en dicha célula sea suficientemente largo para permitir la detección o determinación de un cambio en la distribución de dicha molécula reportera de polipéptido.
Un cambio en la distribución de una molécula reportera de polipéptido en una célula como consecuencia de proporcionar a la célula un agente se refiere, en el contexto de la invención, a un resultado final observado y no a un método en el que se consigue dicho resultado. Por ejemplo, dicho resultado puede estar provocado por una cambio real en la distribución de dicha molécula reportera de polipéptido particular desde una localización en una célula a otra localización en una célula. Alternativamente, una redistribución aparente de una molécula reportera de polipéptido puede estar provocada por un redireccionamiento de moléculas reporteras de polipéptidos recientemente sintetizadas, en algunos casos modificadas, a una nueva localización en una célula como consecuencia de proporcionar un agente a una célula. En este ejemplo no limitativo, las moléculas reporteras de polipéptidos sintetizadas antes de proporcionar a una célula un agente pueden desaparecer a través de una transformación de las moléculas anteriormente sintetizadas. Un cambio en la distribución de moléculas reporteras de polipéptidos puede estar provocado también por una combinación de estos procedimientos a través de procedimientos completamente diferentes.
La señal o cambio en la señal de una molécula reportera de polipéptido puede proporcionar un marcador para una función celular. Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un método para determinar la capacidad de un agente para afectar al menos en parte a una función específica en una célula, que comprende:
- proporcionar a una célula o membrana una molécula reportera de polipéptido que comprende una parte de detección que puede ser detectada y un dominio de localización capaz de determinar al menos en parte la distribución de dicha molécula reportera de polipéptido en dicha célula,
- proporcionar a una célula o membrana dicho agente,
- cultivar la célula o incubar la membrana, y
- detectar la distribución de al menos la parte de detección en la célula o membrana.
Análogamente, otro aspecto de la invención proporciona un método para determinar la capacidad de uno o más agentes para interferir, al menos en parte, con la distribución de una molécula proteinácea en una célula, que comprende:
- proporcionar a una célula o membrana una molécula reportera de polipéptido que comprende una parte de detección que puede ser detectada y al menos un dominio de localización capaz de determinar al menos en parte la distribución de dicha molécula proteinácea en dicha célula;
- proporcionar a dicha célula o membrana dichos uno o más agentes,
- cultivar la célula o incubar la membrana, y
- determinar la distribución de al menos parte de dicha molécula reportera de polipéptido en la célula o membrana.
Preferentemente, una molécula reportera de polipéptido proporcionada a una célula está efectivamente presente solo cerca de la membrana de plasma antes del contacto con uno o más agentes. Preferentemente, la distribución de dicha molécula reportara de polipéptido es alterada a través de una modificación del dominio de localización.
En una realización, dicho dominio de localización comprende una secuencia de señal de lipidación, preferentemente una secuencia de señal de farnesilación. En una realización preferida, dicha secuencia de señal de lipidación es una parte, derivado y/o análogo de una secuencia de señal de farnesilación de una proteína pequeña de unión a GTP, preferentemente una proteína Ras, lo más preferentemente una proteína c-Ha-ras.
Una molécula reportera de polipéptido puede ser proporcionada a una membrana, por ejemplo mediante la provisión de una célula intacta con un ácido nucleico que codifica dicha molécula reportera de polipéptido, o, alternativamente, dicha molécula reportera de polipéptido puede ser una molécula proteinácea codificada por el genoma de dicha célula. Dicha molécula reportera de polipéptido puede ser proporcionada también a una célula o solución de membrana en la forma de una molécula proteinácea. Cuando una molécula proteinácea es proporcionada directamente a una célula puede ser presentada, por ejemplo, a una célula o membrana en forma de una solución, coloide, una partícula capaz de ser incorporada en una célula por fagocitosis, pinocitosis, electroporación o fusión con otra célula o vesícula de membrana. Cuando una molécula reportera de polipéptido es proporcionada a una membrana en ausencia de una célula intacta, dicho reportero puede ser trascrito y/o traducido in situ, o mezclado con la membrana en la forma de una molécula proteinácea.
De este modo, una molécula reportera de polipéptido puede ser proporcionada a una membrana en cualquier vector (vehículo) adecuado para introducir dicha molécula reportera de polipéptido en dicha membrana. Como se usa en la presente memoria descriptiva, un vector comprende cualquier medio, virus, solución, partícula, episoma, transgen, ADN o ARN adecuado para introducir una molécula reportera de polipéptido en una membrana. Por ejemplo, la molécula reportera de polipéptido puede ser proporcionada a una membrana en una célula a través del contacto de la célula con la molécula reportera de polipéptido, con lo que posteriormente la molécula reportera de polipéptido entra en la célula. Sin embargo, una célula puede ser provista también con una molécula reportera de polipéptido a través de un procedimiento que comprende poner en contacto la célula con un vehículo de suministro de ácidos nucleicos que comprende ácido nucleico que codifica la molécula reportera de polipéptido. Un vehículo de suministro de ácidos nucleicos puede ser cualquier tipo de vehículo de suministro de ácidos nucleicos que incluye, pero no limitado a un preparado de fosfato de calcio o liposomas. Una solución acuosa adecuada para la electroporación de ácido nucleico en una célula en la presente invención también es considerada un vehículo adecuado de suministro de ácidos nucleicos. Preferentemente, el vehículo de suministro de ácidos nucleicos es una partícula de virus o parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Preferentemente, el vehículo de suministro de ácidos nucleicos es una partícula de adenovirus, una partícula de virus adeno-asociado o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. En una realización preferida, el vehículo de suministro de ácido nucleico es una partícula de retrovirus producida por la línea celular de estructura estable PT67 LNC-EGFP-(DEVD)-RasF o PT67 LNC-EGFP-RasF.
La célula puede ser cualquier tipo de célula que se desee hacer capaz de cambiar una función u observar un cambio en una función. La célula puede ser una célula procariótica o una célula eucariótica. En una realización de la invención, la célula es una célula cancerígena. En otra realización, la célula se sospecha que tiene una baja sensibilidad por dicho agente, por ejemplo, pero sin limitación, una célula cancerígena que se sospecha que tiene una baja sensibilidad por un agente anti-cancerígeno. En una realización, la célula tiene una baja sensibilidad por un primer agente, por ejemplo debido a que la célula es una célula resistente al fármaco o resistente a múltiples fármacos, y uno o más agentes son añadidos para determinar si la baja sensibilidad por el primer agente puede ser alterada cambiando la distribución de una molécula proteinácea involucrada en un procedimiento que provoca la baja sensibilidad de dicha célula por dicho primer agente.
Con la descripción de esta invención, un experto en la técnica puede seleccionar agentes con la capacidad de alterar la distribución de una molécula reportera de polipéptido en una célula. En una realización preferida, la invención proporciona el uso de un medio y/o un método para un procedimiento de descubrimiento de fármacos de producción elevada capaz de seleccionar un gran número de agentes diferentes para su efecto sobre la distribución de una molécula reportera de polipéptido de la invención. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "producción elevada" se refiere a un ajuste en el que un método de la invención es realizado un gran número de veces en un corto período de tiempo que hace posible, por ejemplo, pero no limitado a, la automatización de al menos una parte significativa de dicho método. En dichas realizaciones, un método de la invención puede ser realizado repetidamente en un período de tiempo relativamente corto para valorar la capacidad de una pluralidad de agentes para efectuar la distribución de una molécula reportera de polipéptido en una célula.
Muchas variaciones de selección de producción elevada son conocidas en la técnica y aplicables a la práctica de los presentes métodos. Los métodos generalmente aplicables incluyen el uso de microscopía confocal, el sistema de selección de elevado contenido ArrayScan (Cellomics, Pittsburgh, PA) (véase Conway y otros 1999), y las técnicas de microscopía de autoenfoque de Leblans y Van Donink descritas en la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/521.618, presentada el 8 de marzo de 2000.
En una realización, la invención proporciona el uso de un agente capaz de afectar al menos en parte a la distribución de una sustancia de una molécula proteinácea en una célula, para determinar si dicho agente es capaz de alterar al menos en parte una función de dicha célula. En otra realización, la invención proporciona el uso de un agente capaz de afectar al menos en parte a la distribución de una sustancia o una molécula proteinácea en una célula y capaz de alterar al menos en parte una función en la célula para la preparación de un medicamento.
En un aspecto, la invención proporciona medios y métodos para la caracterización fenotípica de una célula y un método para medir un fenotipo de una célula. En una realización de la invención dicha célula es un tumor, neoplasma o célula cancerígena. El método puede ser usado para determinar la capacidad de una célula para responder a un agente o tratamiento particular. En una realización preferida, la célula deriva de un paciente. Preferentemente, el método es usado para determinar la sensibilidad de una célula de un paciente a un agente o tipo de tratamiento particular. Las observaciones relativas a la sensibilidad de las células del paciente pueden ser seguidamente usadas para adaptar un esquema de tratamiento para tratar el paciente en cuanto a una enfermedad o riesgo de enfermedad. En una realización, el fenotipo medio puede ser un fenotipo resistente a fármacos, preferentemente un fenotipo de resistencia a la inhibición de la farnesilación. En otra realización, el fenotipo medido es una sensibilidad a un agente o tratamiento. La invención proporciona análogamente un método para medir un fenotipo de sensibilidad medicinal. Preferentemente, dicha caracterización incluye la determinación de la sensibilidad de una célula a un agente
particular.
En una realización de la invención, dicha célula se sospecha que tiene una baja sensibilidad por dicho agente, preferentemente una célula cancerígena que se sospecha que tiene una baja sensibilidad por un agente anti-canceríge-
no.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de medios y métodos de la invención para el descubrimiento de fármacos de producción elevada.
En una realización de la invención, se proporciona una célula con una molécula reportera de polipéptido poniendo en contacto la célula con un vehículo de suministro de ácidos nucleicos que comprende ácido nucleico expresable que codifica dicha molécula reportera de polipéptido y cultivar la célula para obtener la expresión de la molécula reportera de polipéptido. Preferentemente, dicho vehículo de suministro de ácidos nucleicos es una partícula de virus o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, preferentemente una partícula de adenovirus, un virus adeno-asociado o una partícula de retrovirus. Más preferentemente, dicho vehículo de suministro de ácidos nucleicos es una partícula de retrovirus producida por las líneas celulares de envoltura estable PT67 LNC-EGFP-(DEVD)-RasF o PT67 LNC-EGFP-RasF.
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En una realización preferida, esta invención proporciona un método para ensayar un compuesto que altera la actividad de una proteasa de especifidad elevada, que comprende:
- proporcionar una membrana;
- proporcionar una molécula reportera de polipéptido que comprende al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal; al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada; y al menos un dominio de anclaje a membrana que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana; en la que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoca o altera una señal desde el dominio de detección;
- proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
- detectar o determinar la señal emitida por el dominio de detección;
- duplicar las etapas anteriores en presencia de un compuesto que va a ser ensayado;
- comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del compuesto ensayado.
En otra realización preferida, la invención comprende un método para valorar la sensibilidad de una célula a un agente quimioterapéutico, que comprende:
- proporcionar una célula que va a ser ensayada;
- expresar una molécula reportera de polipéptido que comprende al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal; al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada; al menos un dominio de anclaje a membrana, que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana; en que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoca o altera una señal desde el dominio de detección en la célula;
- detectar o determinar la señal emitida por el dominio de detección;
- duplicar las etapas anteriores en presencia de un agente quimioterapéutico que va a ser ensayado;
- comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del agente ensayado.
Todavía, otra realización preferida comprende un método para seleccionar una terapia quimioterapéutica, que comprende:
- proporcionar una multiplicidad de células malignas a partir de un paciente;
- introducir en las células una molécula reportera de polipéptido que comprende al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal; al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada; al menos un dominio de anclaje a membrana que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana; en que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada provoca o altera una señal desde el dominio de detección;
- valorar la sensibilidad detectando o determinado la señal emitida por el dominio de detección en presencia y ausencia de al menos un agente quimioterapéutico; y
- seleccionar una terapia quimioterapéutica apropiada para tratar el paciente.
En otro aspecto de la invención, una molécula reportera de polipéptido es introducida en una célula exponiendo la célula a un vector que comprende un ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de dicha molécula reportera de polipéptido.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula reportera de polipéptido que comprende una parte de detección y un dominio de localización, que comprende adicionalmente una parte conectora que conecta dicha parte de detección y dicho dominio de localización. Preferentemente, dicha parte conectora comprende una secuencia de aminoácidos específicamente escindible, preferentemente una secuencia de reconocimiento de proteasas de especifidad elevada. Preferentemente, dicha secuencia de aminoácidos es capaz de ser escindida por una caspasa. Preferentemente, dicho dominio de localización comprende un dominio de localización de RasF o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Preferentemente, dicha parte de detección comprende una proteína intrínsecamente fluorescente, como una proteína fluorescente verde mejorada o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma. Más preferentemente, dicha molécula reportera de polipéptido es Proteína Fluorescente Verde Mejorada (DEVD)-RasF o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.
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En una realización, la invención proporciona una Proteína Fluorescente Verde Mejorada RasF o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.
En otra realización, la invención proporciona una célula que comprende una molécula reportera de polipéptido según la invención. En una realización preferida, la molécula reportera de polipéptido es expresada en la célula.
Todavía, en otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica una molécula reportera de polipéptido de la invención, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.
Todavía, en otra realización, la invención proporciona un vehículo de suministro de ácidos nucleicos, o vector, que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula reportera de polipéptido de la invención, o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.
En un aspecto, la invención proporciona el uso de un dominio de localización de una molécula proteinácea celular en una molécula reportera de polipéptido, para seleccionar un agente capaz de afectar al menos en parte a la distribución de dicha molécula proteinácea en una célula que comprende dicha molécula proteinácea, de un grupo de agentes.
Con la expresión "secuencia de señal de lipidación", como se usa en la presente memoria descriptiva se quiere decir una secuencia de señal como consecuencia de la cual una molécula es provista con uno o más restos de lípidos.
La presente invención es ilustrada en los siguientes Ejemplos, que son meramente ilustrativos y no están destinados a ser limitantes en modo alguno.
Ejemplos Construcciones y líneas celulares
La idea era dirigir a diana la EGFP a la membrana de plasma usando una secuencia de señal de farnesilación. El resto CAAX parece ser el único sitio de reconocimiento para la enzima farnesil-transferasa; por tanto, la adición de secuencias de CAAX a las proteínas ectópicas las convierte en sustratos para la farnesilación. Los 20 últimos aminoácidos de c-Ha-Ras proporcionan la farnesilación y palmitoilación para dirigir a diana la proteína Ras a la membrana de plasma. Se fusionó la secuencia de señal de dirección a diana de membrana C-terminal de c-Ha-ras1 humana (J00277, NCBI) sobre el C terminal de EGFP (Clontech).
Ensayo de farnesilación
Se añadieron veinte aminoácidos del extremo del C terminal de c-Ha-ras1 localizados en exón 4 al C terminal de la secuencia codificadora de EGFP por clonación mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR).
La amplificación por PCR de EGFP se hizo con un cebador en 3' (antisentido) (SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2) que contiene las siguientes zonas mostradas a continuación en sentido: (i) los codones de los 6 residuos de aminoácidos C-terminales de EGFP, (ii) seguidos en dirección descendente de codones correspondientes a 20 residuos de aminoácidos C terminales de c-Ha-ras1 (iii) seguidos a su vez de un sitio de corte (adaptador) Hind III, (iiii) terminando con una secuencia tctgtc irrelevante que se cree que facilita la digestión de Hind III. Debe apreciarse que mediante esta PCR, el sitio de clonación múltiple de pEGFP-C1 fue suprimido y es incluido el codón (*) de detención de c-Ha-ras1.
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100 
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El oligonucleótido antisentido usado en la reacción de PCR fue
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Ensayo de caspasas
Para la construcción de la apoptosis, se usó el mismo cebador, con la excepción de que se incluyó una secuencia codificadora DEVD (es decir, sitio de escisión de caspasa-3 y caspasa-7) entre EGFP y la secuencia de señal de dirección a membrana de plasma Ras (SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 5).
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membrana de plasma
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El oligonucleótido antisentido usado en la reacción de PCR fue:
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El mismo cebador en 5' (sentido) fue usado en el ensayo de farnesilación y en el ensayo de caspasa. En este primer cebador, mostrado con posterioridad, una secuencia Kozak es incorporada porque el pLNCX, el vector de expresión para el EGFP-(DEVD)-farnesilo, no contiene una secuencia Kozak. Esta secuencia se cree que mejora la traducción. De 5' a 3', el cebador contiene (i) una secuencia gacaga irrelevante que flanquea el sitio Hind III, que se cree que facilita la digestión de Hind III (ii) una zona que hace coincidir la secuencia Kozak (subrayada) y (iii) 15 oligonucleótidos de secuencia codificadora de EGFP correspondiente a los 5 residuos de aminoácidos N-terminales que se solapan a la secuencia Kozak. El oligonucleótido sentido en la reacción de PCR era igual a este proporcionado a continuación.
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La PCR produjo fragmentos denominados EGFP-(DEVD)-RasF que fueron clonados en el sitio Hind III del vector retroviral pLNCX. La construcción resultante, pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF fue confirmada por análisis de secuencias. El pLNCX, derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MuLV), está diseñado para el suministro y expresión de genes retrovirales (Miller y Rosman, 1989). Este vector contiene un gen de resistencia a la neomicina (N) controlado por LTR viral en 5' (L) para la selección de antibióticos en células eucarióticas y un sitio de clonación X (Hind III, HpaI y ClaI) en dirección descendente desde un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (C). La secuencia y es una señal de envoltura viral extendida necesaria para que el trascripto del vector viral sea envuelto en viriones. El pLNCX no contiene los genes estructurales virales (gag-pol y env) necesarios para la formación y replicación de partículas. Sin embargo, pueden ser proporcionados en trans en líneas celulares de envoltura que expresa establemente estos genes. Una de estas líneas celulares disponibles en el comercio, PT67, expresa los genes gag-pol y env desde dos plásmidos separados. El gen env (envoltura) que determina el tropismo viral permite que las partículas virales formadas por las células PT67 infecten una amplia diversidad de tipos de células dianas. Después de la infección, se producen la transcripción inversa e integración cromosomal del factor viral en la célula diana. Cuando las células dianas no contienen genes virales complementarios, el factor retroviral, que contiene el (o los) gen(es) de interés permanecen(n) integrado(s) en la forma de un provirus incompetente para la replicación.
La línea celular PT67 (Clontech) de envoltura anfotrópica fue transfectada (Pfx-2, Invitrogen) con pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF y seleccionada en 400 \mug/ml de G418. En las colonias supervivientes, la transcripción se produce desde un(os) plásmido(s) establemente integrado(s) pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF. El mARN de LNC-EGFP-(DEVD)-RasF resultante es traducido en EGFP-(DEVD)-RasF y la proteína de resistencia a neomicina y es envuelto también en viriones incompetentes para la replicación. Por tanto, el PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF produce constitutivamente partículas virales, capaces de transmitir el EGFP-(DEVD)-RasF y el gen de resistencia a la neomicina al mismo tiempo. Estos viriones anfotrópicos proporcionan la flexibilidad para desarrollar rápidamente nuevas líneas celulares que expresan proteínas EGFP-(DEVD)-RasF. De esta forma, las líneas celulares K562 y MT4 (suspensión) fueron conjuntamente cultivadas durante 96 h con células PT67-pLNC-EGFP-RasF (adherente) y PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF, respectivamente. La transferencia de genes citada como transducción en células K562 y MT4 fue fácilmente observada por microscopía de fluorescencia.
Células K562 (MT4) fueron separadas de PT67-pLNC-EGFP-(DEVD)-RasF y K562 (MT4) no traducidas mediante selección en 400 \mug/ml de G418. Las células K562 (MT4) fluorescentes restantes fueron directamente clonadas en placas de 96 pocillos mediante clasificación de células activadas por fluorescencia usando una unidad automática de depósito de células. El accionamiento fue ajustado de forma que solamente las células altamente fluorescentes fueran depositadas en pocillos que contenían 50 \mul de suero de ternera fetal al 100%. Después de 1 h, se añadieron 200 \mul de medio RPMI (+ 10% de suero de ternera fetal) que contenía G418, teniendo en cuenta una concentración final de 400 \mul/ml. Dos semanas después, se seleccionaron clones apropiados por inspección visual usando un microscopio de fluorescencia y denominados K562-LNC-EGFP-RasF o MT4-LNC-EGFP-(DEVD)-RasF. El mismo esquema de transducción puede ser aplicado en principio a cualquier línea celular de interés. Cuando una línea celular diana es adherente como el productor, se puede concebir un cultivo conjunto sin contacto físico.
Ensayo de inhibición de farnesil-transferasa
Si EGFP-RasF es sustrato para farnesil-transferasa y por tanto está farnesilado, se espera observar que la fluorescencia de EGFP sea vista al mismo nivel de membrana de plasma. El examen microscópico cercano de células K562 (figura 1, aumento 240X (A) y 480X (B)) muestra claramente que éste es de hecho el caso. Por tanto, la delineación de la membrana de plasma indica que la modificación de EGFP con una señal de dirección a diana de membrana provocó que la EGFP se volviera a localizar en la membrana de plasma. En células que expresan EGFP sin una secuencia de señal de farnesilación, se observa fluorescencia a través de la célula. En lo que se refiere a las manchas brillantes en las células, se especula que esto representa EGFP dirigido a diana alrededor del aparato de Golgi.
La interrupción de la farnesilación y consecuentemente de la distribución de membrana debe ser verificada en estas células tras la exposición a inhibidores de farnesil-transferasa. El efecto del inhibidor de farnesil-transferasa bien conocido FTI-276 (Calbiochem) es mostrado en la Figura 2 (aumento 240X (A) y 480X (B)). A concentraciones suficientemente elevadas (> 5 \muM), la compartimentación de EGFP desaparece casi completamente tras la adición del inhibidor. La inhibición de farnesil-transferasa da lugar aparentemente a un desprendimiento de EGFP-(DEVD)-RasF de la hojuela interna de la membrana de plasma y se distribuye uniformemente por toda la célula. Esta translocación de EGFP es suficientemente llamativa para suponer que un análisis de formación de imágenes (digital) y de las imágenes apropiadas debe permitir cuantificar este procedimiento. Teniendo en cuenta que las proteínas Ras requieren una modificación de post-traducción con un resto farnesilo para la actividad oncogénica y que los inhibidores de farnesil-transferasa se considera que tienen capacidad potencial como agentes anti-cancerígenos, este ensayo celular está muy bien adecuado para el descubrimiento de nuevos fármacos que interfieran específicamente con la farnesilación.
Ensayo de caspasa
La incorporación de un sitio de reconocimiento de caspasa (DEVD) entre el C terminal y la secuencia de la señal de farnesilación da lugar también a la dirección a diana de la membrana de plasma de células MT4 (figura 3A). La secuencia de DEVD aparentemente no confiere farnesilación. La escisión del pentapéptido DEVD por caspasa-3 y/o caspasa-7 es una indicación establecida de apoptosis. Se escogieron células MT4 porque fueron previamente capaces de mostrar actividad de caspasa-3 inducida por estaurosporina en estas células usando el sustrato fluorogénico Ac(N-acetil)-DEVD-AMC (Pharmingen, resultados no mostrados). Después de la exposición de las células MT4-LNC-EGFP-DEVD-RasF a estaurosporina 10 \muM durante 4 horas, desaparece parcialmente la dirección a diana de membrana de EGFP (figura 3B), según se infiere a partir de la distribución uniforme de la fluorescencia en las células.
Esta observación puede ser explicada cuando se supone la escisión por caspasa 3/7 del sitio de DEVD, rompiendo así la conexión entre EGFP y la señal de dirección a diana de la membrana. Si la translocación de EGFP está provocada por el inductor de apoptosis bien conocido estaurosporina, no se espera que este fenómeno se produzca en células MT4-LNC-EGFP-RasF que carezcan del sitio de escisión de DEVD. La Figura 4B muestra que este es de hecho el caso. En esta figura se observa que aunque la estaurosporina afecta a la morfología de las células en horas, según se deduce a partir de la forma más redondeada en comparación con células de forma irregular en la figura 4A (sin adición de estaurosporina), no se produce ninguna translocación prominente de EGFP. La única diferencia entre MT4-LNC-EGFP-RasF y MT4-LNC-EGFP-DEVD-RasF es la presencia o no del sitio de escisión de DEVD, indicando que el DEVD y por tanto actividad de caspasa 3/7 están involucrados en la separación de EGFP de la membrana de plasma.
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<210> 1
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atggacgagc tgtacaagga cgaggtggac aagctgaacc ctcct 
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gacagaaagc tttcgccacc atggtgagca agggc 
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35 
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Claims (37)

1. Una molécula reportera de polipéptido, que comprende:
A) al menos un dominio de detección capaz de emitir una señal;
B) al menos un sitio de reconocimiento de proteasas;
C) al menos un dominio de anclaje que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana o compartimento subcelular;
en la que el sitio de reconocimiento de proteasas es un sitio reconocido por una proteasa de especifidad elevada que escinde no más de 1 de 100 proteínas que se producen de forma natural escogidas al azar en un organismo; y
en la que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en dicho al menos un sitio de reconocimiento de proteasas provoca o altera una señal desde el dominio de detección.
2. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 1, en la que la proteolisis de la molécula reportera de polipéptido en un sitio de reconocimiento de proteasas altera la asociación entre el dominio de detección y la membrana o compartimento.
3. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, en la que un sitio de reconocimiento de proteasas está localizado en el dominio de detección.
4. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, en la que un sitio de reconocimiento de proteasas conecta los dominios de detección y anclaje.
5. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-4, en la que al menos un dominio de detección emite una señal fluorescente, luminiscente o cromática.
6. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-5, en la que al menos un dominio de detección emite una señal de energía resonante que es transferida a un segundo dominio de detección que emite una señal.
7. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-6, en la que al menos un dominio de detección comprende al menos una enzima escogida entre las siguientes enzimas, incluidas sus partes funcionales, derivados o variantes: beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina y beta-lactamasa.
8. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-7, en la que al menos un dominio de detección comprende una proteína fluorescente, parte funcional, derivado o variante de la misma.
9. La molécula receptora de polipéptido de las reivindicaciones 1-8, en la que al menos un dominio de anclaje es un dominio de anclaje nuclear, y el compartimento subcelular es un núcleo.
10. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-9, en la que al menos un dominio de anclaje es un dominio de anclaje de membrana, que favorece la asociación de la molécula reportera de polipéptido con una membrana.
11. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-10, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas comprende un sustrato para una proteasa asociada a membrana.
12. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-10, en la que al menos un dominio de anclaje de membrana comprende al menos una señal para una lipidación catalizada por enzimas.
13. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 12, en la que al menos una señal es para una miristoilación o palmitoilación.
14. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 12, en la que al menos una señal es para una geranilgeranilación o farnesilación.
15. La molécula receptora de polipéptido de la reivindicación 12, en que al menos una señal comprende suficiente secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a GTP, o una variante de la misma, para favorecer la prenilación.
16. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 15, en la que la proteína de unión a GTP es una proteína ras.
17. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-10, en la que al menos un dominio de anclaje a membrana comprende al menos un miembro del grupo escogido entre la región de polilisina de KiB-Ras y la secuencia de señal de dirección a diana de membrana de plasma c-Ha-Ras, o sus variantes funcionalmente equivalentes.
18. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-17, en la que al menos un dominio de anclaje a membrana se une específicamente a una proteína asociada a membrana.
19. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-18, en la que al menos un dominio de anclaje a membrana es insertado en la membrana.
20. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-19, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas es un sustrato para una enzima involucrada en la apoptosis.
21. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-20, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas es una caspasa.
22. La molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-21, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas es escindido por al menos una enzima escogida entre caspasa-1, caspasa-2, caspasa-3, caspasa.4, caspasa-5, caspasa-6, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-10, caspasa-11, caspasa-12, caspasa-13, caspasa-14 y granzima B.
23. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 22, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas comprende un sustrato para caspasa-3 y caspasa-7.
24. La molécula reportera de polipéptido de la reivindicación 23, en la que al menos un sitio de reconocimiento de proteasas contiene el tetrapéptido Asp-Glu-Val-Asp.
25. Un ácido nucleico, que codifica la molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-24.
26. Un vector de ácidos nucleicos, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 25.
27. Una célula, que comprende la molécula reportera de polipéptido de las reivindicaciones 1-24.
28. Un método in vitro para ensayar la actividad de proteasas, que comprende:
A) proporcionar una membrana;
B) proporcionar la molécula reportera de polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24;
C) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
D) observar o medir el cambio en la intensidad, duración, frecuencia o localización en el tiempo de la señal; y
E) correlacionar la observación o medición de la etapa D) con la actividad de una proteasa;
en el que la proteasa es una proteasa de especifidad elevada que escinde no más de 1 de 100 proteínas que se producen de forma natural escogidas al azar en un organismo.
29. Un método in vitro para verificar la apoptosis, que comprende:
A) proporcionar una célula que va a ser ensayada;
B) proporcionar la molécula reportera de polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24;
C) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
D) observar o medir el cambio en la intensidad, duración frecuencia o localización en el tiempo de la señal; y
E) correlacionar la observación o medición de la etapa D) con la actividad apoptótica.
30. Un método in vitro para ensayar un compuesto que altera la actividad de proteasa, que comprende:
A) proporcionar una membrana o un compartimento subcelular;
B) proporcionar la molécula reportera de polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24;
C) proporcionar condiciones que permitan la emisión de una señal desde el dominio de detección;
D) observar o medir la señal emitida por el dominio de detección;
E) duplicar las etapas A) a D) en presencia de un compuesto que va a ser ensayado; y
F) comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del compuesto ensayado;
en el que la proteasa es una proteasa de especifidad elevada que escinde no más de 1 de 100 proteínas que se producen de forma natural escogidas al azar en un organismo.
31. Un método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el compuesto que altera la actividad de proteasa es un inhibidor de caspasa.
32. El método de las reivindicaciones 28-31, en que el método es un método de producción elevada.
33. El método de las reivindicaciones 28 y 30-32, en el que la membrana está en una célula.
34. El método de la reivindicación 33, en el que la célula es maligna.
35. Un método in vitro para valorar la sensibilidad de una célula a un agente quimioterapéutico, que comprende:
A) proporcionar una célula que va a ser ensayada;
B) expresar la molécula reportera de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-24 en la célula;
C) observar o medir la señal emitida por el dominio de detección;
D) duplicar las etapas A) a C) en presencia del agente quimioterapéutico que va a ser ensayado;
E) comparar las señales emitidas en presencia y ausencia del agente ensayado; y
F) valorar la sensibilidad de la célula al agente.
36. Un método in vitro para seleccionar una terapia quimioterapéutica, que comprende:
A) proporcionar al menos una célula maligna de un paciente;
B) exponer la al menos una célula maligna al vector de ácidos nucleicos de la reivindicación 26 o el ácido nucleico de la reivindicación 25, de forma que la célula contenga la molécula reportera de polipéptido;
C) valorar la sensibilidad de dicha al menos una célula maligna a un agente quimioterapéutico comparando la señal emitida por la molécula reportera de polipéptido en presencia y ausencia de la terapia quimioterapéutica;
D) seleccionar una terapia quimioterapéutica apropiada para tratar el paciente.
37. El método de las reivindicaciones 35 ó 36, en el que las células son expuestas a diferentes agentes quimioterapéuticos.
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