ES2249825T3 - Polipeptido que tiene actividad de canal de agua y secuencia de adn. - Google Patents
Polipeptido que tiene actividad de canal de agua y secuencia de adn.Info
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Abstract
Polipéptido que tiene actividad de canal de agua teniendo dentro de su molécula, la secuencia de aminoácidos, mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 1.
Description
Polipéptido que tiene actividad de canal de agua
y secuencia de ADN.
La presente invención se refiere a un nuevo
polipéptido derivado del tejido adiposo humano que tiene actividad
de canal de agua y a una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido.
La permeación del agua a través de una membrana
celular se produce en general lentamente por medio de la difusión
dentro de la bicapa de lípido que es la estructura principal de la
membrana celular. Sin embargo, recientemente se ha descubierto que,
en ciertas clases de células, el agua se transfiere rápidamente a
través de la membrana celular, sugiriendo la implicación en el
fenómeno antes citado de alguna proteína de la membrana
selectivamente permeable al agua. Posteriormente, tales proteínas de
membrana de varias clases han sido aisladas verdaderamente. Tales
proteínas de membrana son designadas canales de agua. En esta
descripción, la función de los mencionados canales de agua, que
tienen permeación selectiva del agua a través de la membrana
celular, es llamada "actividad de canal de agua". Los canales
de agua pueden ser pemeables al agua sola o permeables no solamente
al agua sino también a sustancias de bajo peso molecular tales como
glicerol y urea.
Como proteína de membrana que tiene tal actividad
de canal de agua, se ha aislado un grupo de proteínas de membrana
conocidas por acuaporinas (AQPs). Adicionalmente, algunos genes de
acuaporina han sido clonados hasta aquí, y se ha descubierto
acuaporinas tales como AQP1 hasta AQP5, FA-CHIP y
AQP-\gammaTIP en mamíferos, anfibios, plantas,
etc. [véase, por ejemplo, Akira Sasaki, Igaku no Ayumi (Advances in
Medicine), vol. 173, nº 9, 1995].
P. Agre y cols, informaron, en Science (vol. 256,
pp 385 a 387, 1992) que ovocitos Xenopus laevis en los que
se había introducido el ARN transcripto para CHIP 28, cuya
designación actual es AQP1, mostraron permeabilidad al agua
incrementada. En Science (vol. 264, pp 92 a 95, 1994), B.A. van Oost
y cols. describieron la secuencia de aminoácidos de la AQP2 humana
y sugirieron que ésta debería estar implicada en la concentración de
orina dependiente de la vasopresina.
En Proc. Natl. Acad. Sci. USA (vol. 91, pp 6269 a
6273, 1994) Ishibashi y cols. describieron la secuencia de
nucleótidos del gen para la recogida renal de AQP3 derivada de
túbulos y la secuencia de aminoácidos que la codificó. Ishibashi y
cols., confirmaron su actividad de canal de agua inyectando el ARNc
de AQP3 en ovocitos Xenopus laevis y midiendo su
permeabilidad al agua. Ishibashi y cols informaron de que esta AQP3
transportó no solamente agua sino también pequeñas moléculas no
iónicas tales como urea y glicerol.
En Proc. Natl. Acad. Sci. USA (vol. 91, pp 13052
a 13056, 1994), J.S. Jung y cols. informaron sobre el aislamiento
de AQP4. Es sabido que esta AQP4 se presenta muy abundantemente en
cerebros de mamíferos y tiene resistencia al mercurio. En J. Biol.
Chem. Vol. 270, pp 1908 a 1912, 1995), S. Raina y cols., quienes
prepararon ADNc de AQP5 derivada de glándula salivar de la rata,
describen la secuencia de nucleótidos del ADNc y la secuencia de
aminoácidos codificada por la misma. S. Raina y cols clonaron el
ADNc utilizando la ocurrencia de una secuencia NPA y confirmaron su
función observando que el ARNc mejora la permeabilidad al agua de
los ovocitos Xenopus laevis.
Se considera que la familia de acuaporinas
mencionadas más arriba está implicada en el metabolismo del agua en
mamíferos y, por ejemplo, se ha confirmado que la AQP2 se encuentra
únicamente en la membrana luminal de los túbulos de recogida renal,
lo que es indicativo de su íntima asociación con el sistema de
concentración de vasopresina-urea, y se ha
reconocido también su implicación en enfermedades renales. Por
consiguiente, tales proteínas de membrana que tienen actividad de
canal de agua son de importancia en cualquier intento para
desarrollar nuevas terapias destinadas a las enfermedades asociadas
con el agua.
Mientras tanto, la expresión de la familia de
acuaporinas mencionadas más arriba ha sido confirmada en órganos
tales como el riñón, el cerebro, la vesícula biliar, el ojo, el
intestino, la glándula salivar y el bronquio pero todavía no existe
informe acerca de la ocurrencia de proteínas de membrana que tengan
actividad de canal de agua en otros órganos o tejidos
particularmente en el tejido adiposo.
En vista del estado actual de la técnica que se
acaba de mencionar, la presente invención tiene por objeto
proporcionar una nueva proteína de membrana que tenga actividad de
canal de agua y una secuencia de ADN que codifique el
polipéptido.
La presente invención está relacionada con un
nuevo polipéptido que tiene actividad de canal de agua que tiene la
secuencia de aminoácidos, dentro de su molécula, mostrada en el
listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 1.
La presente invención está igualmente relacionada
con una secuencia de nucleótidos propiamente dicha que codifica un
polipéptido que tiene, dentro de su molécula, la secuencia de
aminoácidos mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 1 y
que tiene actividad de canal de agua.
La presente invención está también relacionada
con la secuencia de ADN mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ
ID Nº: 2.
La presente invención está así mismo relacionada
con un polipéptido que tiene actividad de canal de agua que tiene la
secuencia de aminoácidos, dentro de su molécula, codificada por los
nucleótidos Nº 173 a Nº 1198 de la secuencia de nucleótidos mostrada
en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 2.
En lo que sigue se describirá con detalle la
presente invención.
El polipéptido de la presente invención tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en el listado de secuencia bajo
SEQ ID Nº: 1. Este polipéptido tiene una secuencia compuesta de tres
aminoácidos, a saber,
asparragina-prolina-alanina, como
los aminoácidos número 195 a 197. Sin embargo, el rasgo
característico común a las AQPs conocidas hasta ahora, de que dicha
secuencia de
asparragina-prolina-alanina ocurre
dos veces, no se encuentra en el polipéptido de la presente
invención. Se puede confirmar que este polipéptido tiene actividad
de canal de agua por el hecho de que mejora la permeabilidad al agua
de los ovocitos Xenopus laevis.
El mencionado polipéptico puede ser generado por
traducción mediante un sistema de síntesis de proteínas constituido,
in vivo o in vitro, basado en la secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de dicho
polipéptido. La secuencia de nucleótidos de la presente invención
tiene sustancialmente una región que codifica la secuencia de
aminoácidos de dicho polipéptido y, cuando sea necesario, puede
contener una o más regiones adicionales tales como una región
promotora. En la síntesis de proteína basada en información
genética, la información portada por el ADN del gen se transcribe en
ARNm como resultado de la síntesis de ARN dependiente de ADN ayudada
por ARN polimerasa. Y, este ARNm se traduce en la secuencia de
aminoácidos por un sistema de síntesis de proteína que contiene
ARNt. Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos de la presente
invención incluye no solamente la secuencia de ADN, sino también la
secuencia de ARN. Adicionalmente, dado que generalmente es sabido
que, para un aminoácido, existe uno o una pluralidad de codones
correspondientes al mismo, resulta evidente que la secuencia de
nucleótidos antes mencionada no se limita solamente a una secuencia,
sino que puede incluir secuencias de nucleótidos resultantes de la
sustitución de otro codón sinónimo que codifique el mismo
aminoácido.
El mencionado polipéptido puede formarse
basándose en la información genética portada por la secuencia de ADN
mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 2. Este
polipéptido es codificado por la porción de la secuencia de
nucleótido mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 2 que
está comprendida entre los nucleótidos número 173 y número 1198.
De la secuencia de ADN mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ
ID Nº: 2, las secuencias de nucleótidos distintas de la porción de
dichos números de nucleótidos son regiones no codificadoras, entre
las cuales la secuencia de consenso de poliadenilación AATAAA ocurre
en los nucleótidos número 1234 a número 1239. Se puede excluir de la
consideración otros posibles marcos de lectura de dicha secuencia de
ADN mostrada bajo SEQ ID Nº: 2, puesto que los polipéptidos
codificados son de tamaño muy pequeño, por lo que se consideran
incapaces de ejecutar cualquier función de canal de agua.
Los inventores han confirmado que la secuencia de
longitud completa de las bases de ácidos nucleicos antes mencionadas
no tiene secuencia de contrapartida en GenBank ni en dbEST.
El polipéptido de la presente invención tiene
actividad de canal de agua en el tejido adiposo. Aunque el tejido
adiposo está distribuido en varias partes del organismo viviente, el
polipéptido de la presente invención tiene una acción para controlar
la transferencia de agua en tal tejido adiposo y se espera que sea
efectivo en mantener las funciones normales del tejido adiposo en
varios sitios.
La secuencia de ADN anteriormente mencionada,
dada bajo SEQ ID Nº: 2, corresponde a la secuencia de nucleótidos de
ADNc obtenida a partir de tejido adiposo humano por clonación. El
tejido adiposo humano es un tejido que acumula grasa como reserva
de energía. Es sabido que en este tejido adiposo se forman varias
proteínas. Una biblioteca de ADN 3'-dirigida es
conocida como biblioteca ADNc de la que los genes se expresan
actualmente en este tejido adiposo o, en otras palabras, la
composición de ARNm en este tejido adiposo puede copiarse fielmente.
Esta biblioteca de ADN 3'-dirigida contiene
únicamente las regiones 3'-terminales especificadas
de los ARNm que van del sitio poli(A) a Mbol que es un
sitio de reconocimiento de enzima de restricción aguas arriba de
dicho poli(A) y, por consiguiente, dicha biblioteca es
apropiada para la preparación de plantilla por la técnica RCP. Por
consiguiente, extrayendo un clon de esta biblioteca y usándolo para
determinar una secuencia de nucleótido más larga, que incluye la
región codificadora del aminoácido a partir de esta biblioteca
completa de ADNc de tejido adiposo, es posible obtener la
información genética concerniente a la proteína que se forma
realmente en el tejido adiposo. La secuencia de ADN de la presente
invención mostrada bajo la SEQ ID Nº: 2 antes mencionada se
encuentra en tal clonación. Se describe ahora con detalle un método
de obtención del ADNc por clonación a partir de tejido adiposo
humano.
Es conocido como dicho método, por ejemplo, el
método descrito en Biochem. Biophys. Res. Commun., 221, 286 a
289, 1996). De acuerdo con este método, primeramente se separa el
ARN total del tejido adiposo y, cuando sea necesario, se purifica
para dar poli(A) ARN. Para esta purificación puede usarse
kits de purificación comercialmente disponibles. Por ejemplo, puede
emplearse juiciosamente el kit de purificación de ARNm Pharmacia's
Quick prep o similar en el que se usa
oligo(dT)-celulosa y varios tampones en
combinación. Después se sintetiza un ADNc de doble hebra usando un
cebador vector de sistema pUC19 y el ADNc de doble hebra así
sintetizado es disociado selectivamente con el enzima de restricción
Mbol (que reconoce la secuencia de nucleótido GATC). En esa
ocasión, la secuencia GATC en el lado de la molécula vector, que se
puede metilar para dar G^{m}ATC cuando se efectúa replicación en
células bacterianas dam^{+} no se disocia con Mbol. Cuando
se somete a auto-ciclización el ADNc disociado,
usando ligasa de E. coli, se completa un plásmido conteniendo
un fragmento de ADNc que se extiende desde el sitio poli(A)
hasta el Mbol más cercano. Este plásmido se introduce en
Escherichia coli, seguido por el cultivo y la selección de
una colonia de E. coli transformante. Entonces se amplifica
el ADNc en dicha colonia por la técnica RCP usando cebadores RCP
apropiados.
Por otro lado, el ADNc de doble hebra y longitud
completa sintetizado usando el cebador vector del sistema pUC19 se
disocia en el extremo 5' usando T4 polimerasa y se somete a
ciclización usando T4 ligasa e introducción en Escherichia
coli para su transformación. De entre las colonias
transformantes así obtenidas, la colonia deseada se obtiene por
cribaje usando, como sonda, una forma rotulada del ADNc específico
del tejido adiposo obtenido a partir de dicha biblioteca de ADN
3'-dirigida por el método mencionado más arriba. El
ADNc inserto en esta colonia es amplificado por la técnica RCP
usando cebadores RCP apropiados. El producto de amplificación es
purificado y, después de la sonicación, subclonado en el fago
M13.
La secuencia de nucleótidos del ADNc así clonado
puede determinarse, por ejemplo, por reacción con un tinte cebador,
purificación y análisis usando un secuenciador automatizado o
similar. De esta manera, se puede obtener la secuencia de ADN de la
presente invención.
El polipéptido de la presente invención tiene
actividad de canal de agua. Esta actividad de canal de agua puede
confirmarse observando una mejoría de la permeabilidad al agua en
ovocitos Xenopus laevis. Es sabido que en ovocitos Xenopus
laevis no se ha expresado gen alguno de la familia AQP, y por
consiguiente, cualquier incremento en la permeabilidad al agua
causado por el ARNm inyectado puede confirmarse fácilmente. Por
esta razón dichos ovocitos se usan profusamente en la confirmación
de la actividad de canal de agua. Por ejemplo, en Proc. Natl. Acad.
Sci, USA, vol. 91, pp. 6269 a 6273 (1994), Ishibashi y cols.
confirmaron la actividad de canal de agua insertando el AQP3 ADNc
dentro del vector BlueScript derivado de pSP64T, sintetizando el
ARNc usando T7 ARN polimerasa, inyectando este ARNc dentro de
ovocitos Xenopus Laevis, después de 48 a 62 horas de
incubación de la inyección, observando un incremento en la
permeabilidad al agua y en el volumen del ovocito.
El polipéptido codificado por la secuencia de ADN
de la presente invención puede ser identificado analizando la
secuencia de aminoácidos del polipéptido sintetizado en un sistema
de síntesis de proteína Escherichia coli, constituido in
vitro. En este caso, se puede emplear los métodos de
identificación de secuencias N- y C-terminales de
productos de expresión como se describen en Shin Seikagaku Jikken
Koza (Experiments in Biochemistry, A New Course) 1 (publicado por
Tokyo Kagaku Dojin), páginas 22 a 24.
Los ejemplos siguientes ilustran la presente
invención con más detalle. Estos ejemplos no son sin embargo
limitativos en modo alguno del alcance de la presente invención.
De acuerdo con un informe reciente [Biochem.
Biophys. Res. Commun., 221, 286 a 289 (1996)], se ha clonado
un ADN para un factor parecido a colágeno específico de tejido
adiposo usando una biblioteca de ADN 3'-dirigida que
sólo contenía las regiones 3'-terminales
especificadas de moléculas de ARN que van desde poly(A) hasta
el sitio Mbol del enzima de restricción aguas arriba del
mismo. [Nature Genet, 2, 173 a 179 (1992)], cuya biblioteca
posibilita no solamente identificar el gen bajo expresión sino
igualmente examinar la frecuencia de expresión o cantidad de
expresión. De acuerdo con el método descrito en el informe antes
citado, se determinó la secuencia de nucleótidos de ADN de la
presente invención usando una biblioteca de ADN
3'-dirigida especifica del tejido adiposo.
Se añadió transcriptasa inversa a
poly(A)+ARN separada y purificada de tejido adiposo humano
usando un kit de purificación Quick prep ARNm, seguido por la
inserción en \lambdaZAP II conteniendo el sistema vector pUC19
pBluescrip e introducción en Escherichia coli. El cribaje
llevado a cabo usando un ADN parcial específico del tejido adiposo
como sonda dio una colonia de Escherichia coli transformante.
Luego, junto con dos cebadores (SK:5'CGCTCTAGAACTA
GTGGATC3'; T7: 5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3'), se llevó a cabo RCP [reacción en cadena de polimerasa; (30 segundos a 95ºC+30 segundos a 50ºC + 60 segundos a 70ºC) x 15 ciclos, seguido por (30 segundos a 95ºC + 60 segundos a 70ºC) x 15 ciclos], y, después de sonicación, se subclonó el producto en M13. Se le añadió un tinte cebador y, después de la purificación, se analizó la secuencia de nucleótidos del ADN usando un secuenciador automatizado. La secuencia de nucleótidos obtenida es mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 2.
GTGGATC3'; T7: 5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3'), se llevó a cabo RCP [reacción en cadena de polimerasa; (30 segundos a 95ºC+30 segundos a 50ºC + 60 segundos a 70ºC) x 15 ciclos, seguido por (30 segundos a 95ºC + 60 segundos a 70ºC) x 15 ciclos], y, después de sonicación, se subclonó el producto en M13. Se le añadió un tinte cebador y, después de la purificación, se analizó la secuencia de nucleótidos del ADN usando un secuenciador automatizado. La secuencia de nucleótidos obtenida es mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 2.
En lo que respecta a estudios sobre la
permeabilidad al agua de la familia AQP, hay informes acerca de AQP1
[Science, 256, 385-387 (1992)] y AQP3 [Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91, 6269-6273 (1994)] en los que se
introdujo ARN en ovocitos Xenopus laevis, en los que no se
habían expresado genes de la familia AQP, y después se calculó la
permeabilidad al agua a partir de cambios en el área superficial y
volumen de dichos ovocitos en un medio de cultivo hipotónico. Por
consiguiente, la proteína de membrana codificada por el ADN de la
presente invención fue comprobada para determinar la permeabilidad
al agua de acuerdo con el método descrito en la referencia citada
anteriormente.
El ARN (10 ng) obtenido en el ejemplo 1 a partir
de tejido adiposo humano fue introducido en ovocitos Xenopus
laevis por microinyección y los ovocitos fueron incubados a 20ºC
durante tres días en un medio de cultivo isotónico (aproximadamente
200 mOsm). Los ovocitos cultivados fueron transferidos a un medio de
cultivo hipotónico (aproximadamente 40 mOsm). Se fotografío 20
segundos y 40 segundos después de la trasferencia, y se determinó el
área seccional y volumen de cada ovocito usando un analizador de
imágenes. Se calculó la permeabilidad al agua de la proteína de
membrana como sigue:
Permeabilidad
(cm/seg) = [(V_{40} \ -V_{20})/20]/[(A_{20}x \ 10^{-2} \
x4)x1,384]
donde V_{20} denota el volumen de
ovocitos (cm^{3}) después de 20 segundos, V_{40} denota el
volumen de ovocitos (cm^{3}) después de 40 segundos, y A_{20}
denota el área seccional de ovocitos (mm^{2}) después de 20
segundos.
El resultado se muestra en la Tabla 1. Se muestra
también la permeabilidad al agua hallada cuando se usó agua
purificada para la microinyección en vez del ARN.
Adicionalmente, se confirmó la expresión del
polipéptido de la presente invención en dichos ovocitos por un
inmunoensayo de región C-terminal usando el
antisuero de conejo obtenido utilizando el polipéptido de la
presente invención sintetizado in vitro.
| Permeación al agua (cm/seg) | |
| Grupo en el que no se realizó la introducción de ARN | 30,0x 10^{-4} |
| Grupo en el que se realizó la introducción de ARN | 292,5x10^{-4} |
Como resulta evidente en la Tabla 1, el
polipéptido codificado por la secuencia de ADN de la presente
invención produjo un incremento en la permeabilidad al agua después
de su introducción en los ovocitos. Este resultado indica que el
polipéptido de la presente invención tiene actividad de canal de
agua.
La presente invención proporciona una nueva
proteína que tiene actividad de canal de agua y una nueva secuencia
de ADN que codifica la proteína. Dicha proteína es una que se
encuentra en el tejido adiposo humano para la que no se ha informado
todavía de la ocurrencia de canales de agua. La presente invención
posibilita el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades
asociadas con el metabolismo del agua o de la grasa en las que está
implicado dicho tejido.
SED ID Nº 1
| \hskip0,3cm Longitud: 342 |
| \hskip0,3cm Tipo: Aminoácido |
| \hskip0,3cm Topología: lineal |
| \hskip0,3cm Especie: Péptido |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
SEG ID Nº 2
| \hskip0,3cm Longitud: 1258 |
| \hskip0,3cm Tipo: Nucleótido |
| \hskip0,3cm Tipo de hebra: Doble hebra |
| \hskip0,3cm Topología: Lineal |
| \hskip0,3cm Especie: ADNc a ARNm |
| \hskip0,3cm Fuente original |
| \hskip1,1cm Organismo: Humano |
| \hskip1,1cm Tipo tejido: Tejido adiposo |
| \hskip0,3cm Información distintiva |
| \hskip1,1cm Nombre/clave: Péptido |
| \hskip1,1cm Localización: 173...1198 |
| \hskip1,1cm Método de identificación: E |
\newpage
Secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (4)
1. Polipéptido que tiene actividad de canal de
agua teniendo dentro de su molécula, la secuencia de aminoácidos,
mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 1.
2. Secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene, dentro de su molécula, la secuencia de
aminoácidos mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº: 1 y
que tiene actividad de canal de agua.
3. Secuencia de ADN mostrada en el listado de
secuencia bajo SEQ ID Nº: 2.
4. Polipéptido que tiene actividad de canal de
agua que presenta la secuencia de aminoácido, dentro de su molécula,
codificada por el nucleótido número 173 a 1198 de la secuencia de
nucleótidos mostrada en el listado de secuencia bajo SEQ ID Nº:
2.
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