ES2249840T3 - Nueva beta-glucanasa procdente de bacillus. - Google Patents

Nueva beta-glucanasa procdente de bacillus.

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ES2249840T3 ES98942588T ES98942588T ES2249840T3 ES 2249840 T3 ES2249840 T3 ES 2249840T3 ES 98942588 T ES98942588 T ES 98942588T ES 98942588 T ES98942588 T ES 98942588T ES 2249840 T3 ES2249840 T3 ES 2249840T3
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Abstract

El objeto de la invención es extender el campo de aplicación de las beta-glucanasas, que se emplean normalmente en un medio ligeramente ácido a neutro, de forma que también se han hecho suficientemente estables en condiciones alcalinas para emplearlas en procedimientos técnicos que se realizan en estas condiciones. De acuerdo con esta condición se puede emplear una enzima obtenida a partir del Bacilus alcalofilus DSM 9956, que muestra la acción glucanolítica.

Description

Nueva \beta-glucanasa procedente de Bacillus.
La presente invención trata de una enzima que puede desdoblar glucanos mixtos, que están enlazados alternativamente en enlaces 1,3- y 1,4-\beta-glucosídicos, hidrolíticamente en oligosacáridos, así como de los microorganismos que forman esta enzima.
Este tipo de enzimas pertenecen a la clase de las endo-1,3-1,4-\beta-D-glucano-4-glucanohidrolasas (EC 3.2.1.73; liquenasas) o de las endo-1,3-\beta-D-glucosidasas (EC 3.2.1.39; laminarinasas). En el sentido de la presente invención tales enzimas se denominan aquí como \beta-glucanasa o beta-glucanasa.
Los polímeros de glucanos mixtos del tipo anteriormente mencionado están contenidos en prácticamente todos los productos de cereales, en diferentes proporciones. Las enzimas, que son capaces de desdoblarlos, son necesarias en los sectores de la industria alimenticia, productos de bebidas, pienso para animales, industria textil y producción de almidón (R. Borriss, "\beta-Glucan-spaltende Enzyme", en H. Ruttloff, "Industrielle Enzyme", Capítulo 11.5, Behr's Verlag, Hamburgo, 1994). Una de las aplicaciones más importantes de las \beta-glucanasas se encuentra en el sector de la industria de bebidas y de la cerveza, en el que tales enzimas emplean para la degradación del \beta-glucano de malta y cebada. Las enzimas que se utilizan para ello provienen convencionalmente de Bacillus subtilis, como se describe por ejemplo en la patente alemana DD 226 012 A1, o Bacillus amyloliquefaciens, aunque se conocen también \beta-glucanasas de otros microorganismos, por ejemplo Achromobacter lunatus, Arthrobacter luteus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Disporotrichum dimorphosporum, Humicola insolens, Penicilliun emersonii, Penicillium funiculosum o Trichoderma reesei. Se oferta, por ejemplo, un producto usual en el mercado, con la designación de Cereflo® (fabricante: Novo Nordisk A/S) para el empleo en la industria de la cerveza.
Las \beta-glucanasas conocidas hasta ahora presentan un pH óptimo en intervalos de pH de ligeramente ácidos a neutros, de modo que su empleo en los procedimientos está limitado a estos valores de pH.
Una endo-\beta-1,3-1,4-glucanasa con un pH óptimo de 7,5 y estable en el intervalo de pH alcalino, se deduce de la publicación "Cloning and DNA Sequencing of bgaA, a Gene Encoding an Endo-\beta-1,3-1,4-Glucanase, from an Alkalophilic Bacillus Strain (N137)" de C. Tabernero et al. (1994) en Appl. Envir. Microbiol., volumen 60, páginas 1213-1220. Presenta con respecto a las \beta-glucanasas descritas en la presente solicitud, en el plano del ADN, una identidad del 67,4% y, en el plano de las proteínas, una identidad del 65%, respectivamente para la pre-proteína completa.
La solicitante se ha propuesto como objetivo ampliar el campo de aplicación de las \beta-glucanasas y desarrollar una \beta-glucanasa que, con respecto a una aplicación en procesos técnicos que tienen lugar en un medio alcalino, presenten también una estabilidad suficiente en estas condiciones.
El objeto de la presente invención es una enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1, el microorganismo Bacillus alkalophilus DSM 9956 que produce la \beta-glucanasa y el gen que codifica la \beta-glucanasa mencionada que, en el marco de los trabajos que han conducido a la presente invención, ha sido identificado y secuenciado (SEQ ID-Nº: 2). Este gen se puede clonar si se desea en otras bacterias de la manera en principio conocida, y allí expresar las \beta-glucanasas. Otro objeto de la invención Essen también, por tanto, microorganismos obtenidos a través de procedimientos microbiológicos, que contienen el gen mencionado. La secuencia de aminoácidos, que se deduce de la secuencia del gen de \beta-glucanasa de Bacillus alkalophilus DSM 9956, de la \beta-glucanasa obtenida según la invención a partir de estos microorganismos (SEQ ID-Nº: 1), se reproduce en la figura 1 en un código de letras. La \beta-glucanasa de Bacillus alkalophilus DSM, incluyendo el péptido señal, que se separa después del transporte a través de la pared celular del microorganismo, a través de una peptidasa señal y que, según la comparación con los datos conocidos de la literatura [M.E. Louw, S.J. Reid, Watson, Appl. Microbiol. Biotech. 39 (1993), 507-513] comprende supuestamente 31 aminoácidos, consta de 308 aminoácidos. El correspondiente microorganismo es gram positivo, su forma celular es en forma de varitas (anchura aprox. de 0,7 \mum hasta 0,9 \mum, longitud aprox. de 2,5 \mum hasta 4,0 \mum); fue depositado por la solicitante el 13/04/1995 en la Colección Alemana de cultivos y microorganismos tipo (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig y se le dio el número de depósito DSM 9956.
Una \beta-glucanasa según la invención presenta preferiblemente una homología de aproximadamente el 70%, preferiblemente del 75% hasta el 99% respecto a la \beta-glucanasa de Bacillus alkalophilus DSM 9956. Lo correspondiente se aplica al gen tomado como base. Un campo de acción preferido para la enzima según la invención se encuentra en la industria del sector alimentario, especialmente en el sector de las bebidas y la industria de la cerveza y especialmente en su empleo para la eliminación de glucano y/o liquenano en la limpieza de membranas y otros dispositivos de esta rama industrial.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para la eliminación de glucano y/o liquenano en la limpieza de membranas y otros dispositivos de la industria alimenticia, especialmente de la industria cervecera, empleando una \beta-glucanasa según la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
El ADN cromosómico de Bacillus alkalophilus C/M2-3 se digirió parcialmente con Sau3A y se aisló una fracción de fragmentos de tamaños de 4 a 8 kb mediante electroforesis en gel. Después de ligar, en el sitio BamH1 del plásmido pMK4, un vector lanzadera de E. coli-Bacillus [M.A. Sullivan et al., Gene 29 (1984), 21-26] se transforma en células E. coli DH5\alpha competentes. Se identificaron clones recombinantes con actividad \beta-glucanasa a través de tinción con rojo congo sobre placas LB con un 0,2% de liquenina (pH 8,5).
La \beta-glucanasa se extrajo por lavado de la célula soporte de un clon en E. Coli DH 5 \alpha pmK4. Después de la diálisis del soporte libre de células concentra un tampón fosfato de sodio 20 mM (pH 7,5), se unió el producto de la diálisis con Q-Sefarosa (Pharmacia) y se diluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M en un tampón fosfato de sodio 25 mM (pH 7,5 o pH 9,0).
La comprobación y la determinación de la actividad glucolítica se basa en la modificación de los procedimientos descritos por M. Lever en Anal. Biochem. 47 (1972), 273-279 y Anal. Biochem. 81 (1977), 21-27. Para ello se utiliza una disolución al 0,5 por ciento en peso de \beta-glucano (Sigma nº G6513) en un tampón glicina 50 mM (pH 9,0). A 250 gl de esta disolución se añaden 250 \mum de una disolución que contiene el medio que se está sometiendo a prueba por su actividad glucolítica, y se incuba durante 30 minutos a 40ºC. A continuación, se añaden 1,5 ml de una disolución al 1 por ciento en peso de hidracida de ácido hidroxibenzoico (PAHBAH) en NaOH 0,5 M, que contiene nitrato de bismuto 1 mM y tartrato de sodio 1 mM y se calienta a 70ºC durante 10 minutos. Después del enfriamiento (2 minutos, 0ºC) se determina a temperatura ambiente la absorción a 410 nm (por ejemplo empleando un fotómetro Uvikon® 930), mediante el uso de una curva de calibración de la glucosa frente a un valor de blanco. Como valor de blanco se recurre a una disolución que se preparó como disolución de medición con la diferencia de que se añade la disolución de glucano justo después de la adición de la solución PAH-BAH. 1U corresponde a la cantidad de enzima que crea 1 \mumol de glucosa por minuto en estas condiciones.
La actividad específica de la enzima así obtenida se encuentra en 4390 mU por mg de proteína, mientras que la disolución inicial había mostrado una actividad inferior en un factor 152. La enzima se coloreó (color plateado) en forma de bandas homogéneas en la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Con ayuda de proteínas marcadoras (citocromo c, mioglobina de caballo, quimiotripsinógeno, ovalbúmina, seroalbúmina bovina) como estándar interno se estimó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS el peso molecular de la \beta-glucanasa de Bacillus alkalophilus DSM 9956 en aproximadamente 30000.
En el enfoque isoeléctrico (pH 3 hasta 9) el punto isoeléctrico de la \beta-glucanasa se determinó por medio de tinción por actividad en un pH 5,2.
Ejemplo 2
Perfil de pH
La determinación de la actividad glucanolítica con distintos valores de pH se realizó en un tampón universal Davies (21,01 g de ácido cítrico H_{2}O, 13,61 g de KH_{2}PO_{4}, 19,07 g de Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10 H_{2}O, 12,11 g de Tris y 7,46 g KCl en 1 l de agua destilada; 50 ml de esa solución madre se ajustan con NaOH 0,4 N al pH adecuado y se rellena con agua destilada hasta 200 ml) a 40ºC y en una incubación durante 30 minutos. Tal como queda claro en el perfil de pH que se reproduce en la figura 2 (trazado de la actividad glucanolítica relativa, Act. rel., frente al valor de pH) la enzima es más activa entre los rangos de pH 6 y pH 10,5. El óptimo se encuentra en un pH 9.
Ejemplo 3 Perfil de temperatura
Se midió la dependencia a la temperatura de la actividad glucolítica de la \beta-glucanasa obtenida de Bacillus alkalophilus DSM 9956 en glicina/NaOH con un pH 9 con 15 minutos de incubación. El valor de pH de la disolución de prueba resultó adecuado ya que el tampón presenta una dependencia a la temperatura aproximadamente de pH 0,033 por ºC. El máximo de la actividad glucanolítica se encuentra en 60ºC, como se observa en la figura 3, en la que se traza la actividad glucanolítica relativa (Act. Rel.) de la enzima en función de la temperatura (T).
PROTOCOLO DE SECUENCIA
DATOS GENERALES
\hskip1cm SOLICITANTE:
NOMBRE Cognis Gesellschaft für Biotechnologie mbH
CALLE HenkelstraBe 67, Edificio Y 20
LUGAR Düsseldorf
ESTADO FEDERADO DE LA REPÚBLICA ALEMANA Nordheim-Westfalen
CÓDIGO POSTAL 40589
TELÉFONO 0211 - 7976763
TELEFAX 0211 - 7987607 
\vskip1.000000\baselineskip
TÍTULO DE LA INVENCIÓN. Nueva \beta-glucanasa procedente de Bacillus
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
DIRECCIÓN POSTAL:
DESTINATARIO Cognis Gesellschaft für Biotechnologie mbH
CALLE HenkelstraBe 67, Edificio Y 20
LUGAR Düsseldorf
ESTADO FEDERADO DE LA REPÚBLICA ALEMANA Nordheim-Westfalen
CÓDIGO POSTAL 40589 
\vskip1.000000\baselineskip
VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
SOPORTE INFORMÁTICO Disquete
ORDENADOR PC compatible IBM
SISTEMA OPERATIVO MS-WINDOWS
SOFTWARE MS WORD 97 
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SEQ ID-Nº: 1:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip1cm LONGITUD: 308 aminoácidos
\hskip1cm TIPO: aminoácidos
\hskip1cm TOPOLOGÍA: desconocida
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
HIPOTÉTICO: No
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº: 1: 
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
DATOS DE LA SEQ ID-Nº: 2:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\hskip1cm LONGITUD: 927 pares de bases
\hskip1cm TIPO: ácidos nucleicos
\hskip1cm TIPO DE CADENA: doble
\hskip1cm TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICO: No.
ANTISENTIDO: No
PROCEDENCIA DE ORIGEN:
CEPA: Bacillus alkalophilus DSM 9956
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID-Nº: 2: 
\vskip1.000000\baselineskip
2

Claims (11)

1. Microorganismo Bacillus alkalophilus DSM 9956 que produce \beta-glucanasa.
2. Enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica, caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura. 1.
3. Enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica, caracterizada porque presenta una homología de más del 70% con respecto a la enzima con la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID-Nº: 1.
4. Enzima según la reivindicación 3, caracterizada porque presenta una homología del 75% al 99% con respecto a la enzima con la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID-Nº:1.
5. Gen que codifica una enzima con actividad \beta-glucanolítica, caracterizado porque presenta la secuencia reproducida en la SEQ ID-Nº: 2 o una homología de más del 70% de esa secuencia.
6. Gen según la reivindicación 5, caracterizado porque presenta una homología del 75% al 99% de la secuencia reproducida en la SEQ ID-Nº: 2.
7. Microorganismo obtenible por procedimientos microbiológicos que contiene un gen según una de las reivindicaciones 5 a 6.
8. Uso de una enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica que presenta la secuencia mostrada en la figura 1 para eliminar glucano y/o liquenano en la limpieza de membranas y dispositivos en la industria alimenticia, especialmente en la industria cervecera.
9. Uso de una enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica que presenta una homología de más del 70% con respecto a la de la enzima con la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID-Nº: 1, para eliminar glucano y/o liquenano en la limpieza de membranas y dispositivos en la industria alimenticia, especialmente en la industria cervecera.
10. Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque la enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica presenta una homología del 75% al 99% con respecto a la de la enzima con la secuencia de aminoácidos reproducida en SEQ ID-Nº: 1.
11. Procedimiento para eliminar glucano y/o liquenano en la limpieza de membranas y dispositivos en la industria alimenticia, especialmente en la industria cervecera, caracterizado porque se utiliza una enzima que presenta actividad \beta-glucanolítica, que presenta una secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 o una homología de más del 70% con respecto a la de la enzima con la secuencia de aminoácidos reproducida en la SEQ ID-Nº: 1.
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