ES2250989T3 - Dna que codifica canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato. - Google Patents

Abstract

SE HA CLONADO Y CARACTERIZADO ADN QUE CODIFICA CANALES DE CLORURO SENSIBLES A LA AVERMECTINA Y AL GLUTAMATO. LA PROTEINA ES CAPAZ DE FORMAR CANALES QUE SE ABREN DE FORMA SELECTIVA CON AVERMECTINA O CON GLUTAMATO. EL ADNC SE HA EXPRESADO EN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES QUE PRODUCEN LA PROTEINA RECOMBINANTE ACTIVA. LA PROTEINA RECOMBINANTE TAMBIEN SE PURIFICA A PARTIR DE LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES. ADEMAS, LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES SE UTILIZAN PARA ESTABLECER UN PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICAR MODULADORES DE LA ACTIVIDAD DE UN RECEPTOR, Y SE IDENTIFICAN MODULADORES DE UN RECEPTOR. LOS MODULADORES DE UN RECEPTOR ACTIVOS DEL PROCEDIMIENTO DESCRITO EN LA PRESENTE RESULTAN UTILES COMO AGENTES ECTOPARASITICIDAS, ANTIPARASITARIOS, ANTIHELMINTICOS, ACARICIDAS E INSECTICIDAS.

Description

DNA que codifica canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato.

Antecedentes de la invención

Se han identificado canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato, o receptores de H, en nervios y músculos de artrópodos [Lingle, C. y Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. y Beadle, D.J. Neurosci. Lett. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A. y Sattelle, D.B. J. Exp. Bio. 144, 449-462 (1989)], [Lea, T.J. y Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], y se clonaron a partir del netatodo del suelo Caenorhabditis elegans [Cully, D.F., Vassilatis, D.K., Liu, K.K., Paress, P.S., Van der Ploeg, L.H.T., Schaeffer, J.M. y Arena, J.P. Nature 371, 707-711 (1994)]. Son importantes dianas para los compuestos antihelmínticos e insecticidas de clase avermectina ampliamente usados. Las avermectinas son una familia de lactonas macrocíclicas originalmente aisladas del actinomiceto Streptomyces avermitilis. El derivado de avermectina semisintético, ivermectina (22,23-dihidro-avermectina B_{1a}), se usa por todo el mundo para tratar helmintos parásitos y plagas de insectos del hombre y los animales. Descubiertas unos 15 años atrás, las avermectinas siguen siendo los endectocidas de amplio espectro más potentes que muestran baja toxicidad para el huésped. Las avermectinas muestran una interacción esencialmente irreversible con un sitio de alta afinidad en membranas de nemátodos [Schaeffer, J.M. y Haines, H.W. Biochem. Pharm. 38, 2329-2338 (1989); Cully, D.F. y Paress P.S., Molecular Pharm. 40:326-332 (1991)] e insectos [Rohrer, S.P., Meinke, P.T., Hayes, E.C., Mrozik, H. y Schaeffer, J.M. Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 4168-4172 (1992)] e induce un incremento en permeabilidad a cloruro de membranas en nemátodos [Martin, R.J. y Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989)], artrópodos [Scott, R.H. y Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985)], [Duce, I.R. y Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85, 395-401 (1985)] y crustáceos [Zufall, F., Franke, C. y Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)]. Las avermectinas han mostrado activar directamente canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato a partir de C. elegans [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. y Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. y Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992); Cully, D.F., Vassilatis, D.K., Liu, K.K., Paress, P.S., Van der Ploeg, L.H.T., Schaeffer, J.M. y Arena, J.P. Nature 371, 707-711 (1994)], y para activar o potenciar directamente corriente de canal de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato en músculo de langosta [Scott, R.H. y Duce, I.R. Pestic, Sci. 16, 599-604 (1985); Aydar, E., Harding, L., Beadle, D.J. y Bermudez, I. Proceedings of the British Pharmacological Society p24 (1993)].

Sumario de la invención

Una diana de la acción de avermectina en artrópodos se ha clonado y caracterizado y representa un nuevo miembro de la clase de canales con apertura y cierre regulados por ligando canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato. Usando una aproximación de PCR de transcripción reversa se ha aislado una molécula de DNA funcional que codifica el canal de cloruro sensible a glutamato y avermectina de Drosophila. Las propiedades electrofisiológicas y estructurales de la proteína, como es la secuencia de aminoácidos y nucleótidos, se describen. La proteína recombinante es útil para identificar moduladores del canal. Los moduladores identificados en este procedimiento son útiles como agentes terapéuticos, incluyendo insecticidas, ectoparasiticidas, endoparasiticidas, acaracidas y antihelmínticos.

Breve descripción del dibujo

Figura 1 - Se muestra la secuencia de nucleótidos de Dros GluCl.

Figura 2 - Se muestra la secuencia de aminoácidos de Dros GluCl.

Figura 3 - Se muestran las propiedades electrofisiológicas de Dros GluCl expresadas en oocitos de Xenopus.

Figura 4 - Se muestra la estructura del Compuesto-1.

Figura 5 - Se muestra un análisis fiogenético de Dros GluCl.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a DNA que codifica un canal de cloruro sensible a glutamato y avermecnica de artrópodo (GluCl) el cual se aisló a partir de las células productoras de GluCl. GluCl, como se usa en el presente documento, se refiere a proteína la cual puede funcionar específicamente como un canal de aniones con apertura y cierre regulados mediante glutamato o avermectina.

La secuencia de aminoácidos del Dros GluCl no se conocía previamente, ni se conocía la secuencia de nucleótidos que codifica Dros GluCl. Esta es la primera clonación comunicada de un canal de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato de artrópodos. Dros GluCl está relacionado con los previamente clonados GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans [Cully, D.F., Vassilatis, D.K., Liu, K.K., Paress, P.S., Van der Ploeg, L.H.T., Schaeffer, J.M. y Arena, J.P. supra]. A diferencia del canal de C. elegans el Dros GluCl requiere sólo un único polipéptido para la activación directa con avermectina o glutamato. Además, Dros GluCl se activa directamente mediante el agente insecticida, Compuesto-1 (Fig. 5) el cual es el sujeto de la patente de los Estados Unidos 5.399.582 y se describe completamente en ella. Se predice que todos los organismos relacionados con clorofila sensibles a las avermectinas contendrán los canales sentibles a glutamato y avermectina descritos. Las células de Drosophila capaces de producir GluCl incluyen, pero no se limitan a células nerviosas o musculares aisladas de organismos que muestran sensibilidad a las avermectinas. Los animales sensibles a las avermectinas son diversos e incluyen invertebrados que pertenecen a los filos Arthropoda y Nematoda.

Otras células y líneas celulares también pueden ser adecuadas para usar para aislar cDNA de GluCl. La selección de células adecuadas se puede hacer rastreando actividad GluCl en extractos celulares. La actividad GluCl se puede someter a seguimiento llevando a cabo un ensayo de unión de invermectina marcada radiactivamente o Compuesto-1 marcado radiactivamente, o derivado de los mismos, (Cully y Paress, supra; Rohrer y col., supra) o mediante medida electrofisiológica directa de un canal de cloruro sensible a glutamato, Compuesto-1 o avermectina [Martin, R.J. y Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989); Scott, R.H. y Duce, I.R. Pestic. Sci. 16, 599-604 (1985); Duce, I.R. y Scott, R.H. Brit. J. Pharmacol. 85, 395-401 (1985); Zufall, F., Franke, C. y Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)]. Células las cuales poseen actividad GluCl en este ensayo pueden ser adecuadas para el aislamiento de DNA o RNA de GluCl.

Cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para clonar molecularmente el DNA de GluCl. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, expresión funcional directa de los genes GluCl tras la construcción de una biblioteca de DNA que contiene GluCl en un sistema vector de expresión adecuado. Otro procedimiento es rastrear biblioteca de DNA que contiene GluCl construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido con una sonda oligonucleotídica marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína GluCl. Un procedimiento adicional consiste en rastrear una biblioteca de DNA que contiene GluCl construida en un vector lanzadera bacteriófago o plásmido con un cDNA parcial que codifica la proteína GluCl. Este cDNA parcial se obtiene mediante la amplificación mediante PCR específica de fragmentos de DNA de GluCl a través del diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos de las proteínas GluCl purificadas.

Otro procedimiento es aislar RNA de las células que producen GluCl y traducir el RNA en proteína por medio de un sistema de traducción in vitro o un sistema de traducción in vivo. La traducción del RNA en un péptido o una proteína dará como resultado la producción de al menos una parte de la proteína GluCl la cual se puede identificar mediante, por ejemplo, la reactividad inmunológica con un anticuerpo anti-GluCl o mediante actividad biológica de proteína GluCl. En este procedimiento, se analizan reservas de RNA aisladas de células productoras de GluCl en busca de la presencia de un RNA el cual codifica al menos una parte de la proteína GluCl. El fraccionamiento adicional de la reserva del RNA se puede hacer para purificar el RNA de GluCl a partir del RNA que no es de GluCl. El péptido o proteína producidos a partir de este procedimiento se pueden analizar para proporcionar secuencias de aminoácidos las cuales se usan sucesivamente para proporcionar cebadores para la producción del cDNA de GluCl, o el RNA usado para la traducción se puede analizar para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican GluCl y producen sondas para esta producción de cDNA de GluCl. Este procedimiento se conoce en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

Es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que otros tipos de bibliotecas, igual que las bibliotecas construidas a partir de otras células o tipos celulares, pueden ser útiles para aislar DNA que codifica GluCl. Otros tipos de bibliotecas incluyen, pero no se limitan a, biliotecas de cDNA derivadas de otras células, y bibliotecas de DNA genómico que incluyen bibliotecas de YAC (cromosoma artificial de levaduras) y bibliotecas de cósmidos.

Es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que bibliotecas de cDNA apropiadas se pueden preparar a partir de células o líneas celulares las cuales tienen actividad GluCl. La selección de células o líneas celulares para usar en preparar una biblioteca de cDNA para aislar cDNA de GluCl cDNA se puede hacer midiendo primero la actividad de GluCl asociada a células usando la medida electrofisiológica de avermectina y canales de cloro sensibles a avermectina o glutamato o usando un ensayo de unión a ligando de glutamato o avermectina.

La preparación de bibliotecas de cDNA se puede llevar a cabo mediante técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Se pueden encontrar técnicas de construcción de librerías de cDNA bien conocidas por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

También es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que el DNA que codifica GluCl se puede aislar también a partir de una biblioteca de DNA genómico adecuada. Se puede llevar a cabo construcción de bibliotecas de DNA genómico mediante técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Se pueden encontrar técnicas de construcción de bibliotecas de DNA genómico bien conocidas en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

Con el fin de clonar el gen GluCl mediante los procedimientos anteriores, la secuencia de aminoácidos de GluCl puede ser necesaria. Para llevar a cabo esto, la proteína GluCl se puede purificar y la secuencia partial de aminoácidos se puede determinar mediante secuenciadores automatizados. No es necesario determinar la secuencia completa de aminoácidos, pero la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína se determina por la producción de cebadores para la amplificación mediante PCR de un fragmento de DNA de GluCl parcial.

Una vez se han identificado secuencias adecuadas de aminoácidos, se sintetizan las secuencias de DNA capaces de codificarlas. Debido a que el código genético es degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos se puede codificar mediante cualquiera de un grupo de oligonucleótidos de DNA similares. Sólo un miembro del grupo sería idéntico a la secuencia de GluCl paro será capaz de hibridar a DNA de GluCl DNA incluso en la presencia de oligonucleótidos de DNA con apareamientos desajustados. Los oligonucleótidos de DNA con apareamientos desajustados pueden aún hibridar suficientemente al DNA de GluCl para permitir identificación y aislamiento de DNA que codifica GluCl. Se puede usar DNA aislado mediante estos procedimientos para rastrear bibliotecas de DNA a partir de una diversidad de tipos celulares, a partir de fuentes de invertebrados y vertebrados, y para aislar genes homólogos.

El GluCl biológicamente activo purificado puede tener varias formas físicas diferentes. GluCl puede existir como un polipéptido en toda su longitud naciente o no procesado, o como polipéptidos parcialmente procesados o combinaciones de polipéptidos procesados. El polipéptido en toda su longitud naciente se puede modificar postraduccionalmente mediante eventos de escisión proteolítica específicos los cuales dan como resultado la formación de fragmentos del polipéptido en toda su longitud naciente. Un fragmento, o asociación física de fragmentos puede tener la actividad biológica plena asociada con GluCl (canal sensible a glutamato, avermectina o Compuesto-1). Sin embargo, el grado de actividad GluCl puede variar entre fragmentos de GluCl individuales y fragmentos polipeptídicos de GluCl físicamente asociados.

El DNA de GluCl obtenido por los procedimientos descritos en el presente documento se puede expresar recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de transcripción apropiados, y se transfirió en células huésped procariotas o eucariotas para producir GluCl recombinante. Las técnicas para tales manipulaciones se describen totalmente en Sambrook, J., y col., supra, y son bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión se definen en el presente documento como secuencias de DNA que se requieren para la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus mRNAs en un huésped apropiado. Tales vectores se pueden usar para expresar genes eucariotas en una diversidad de huéspedes tales como bacterias que incluyen E. coli, algas verdeazuladas, células de plantas, células de insectos, células de hongos que incluyen células de levaduras, y células animales.

Los vectores específicamente diseñados permiten el traslado del DNA entre huéspedes tales como bacterias-levaduras o bacterias-células animales o bacterias-células fúngicas o bacterias-células de invertebrados. Un vector de expresión apropiadamente construido contendría: un origen de replicación para replicación autónoma en células del huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, un potencial para número de copias alto, y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de DNA que dirige a la RNA polimerasa para unirse a DNA e iniciar la síntesis de RNA. Un promotor fuerte es uno el cual causa que los mRNA se inicien a alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos específicamente diseñados o virus.

Una diversidad de vectores de expresión de mamíferos se pueden usar para expresar GluCl recombinante en células de mamíferos. Los vectores de expresión en mamíferos comercialmente disponibles pueden ser adecuados para expresión de GluCl recombinante, incluyendo pero no limitados a, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y lZD35 (ATCC 37565).

Se puede usar una diversidad de vectores de expresión bacterianos para expresar GluCl en células bacterianas. Los vectores de expresión bacteriana comercialmente disponibles los cuales pueden ser adecuados para expresión de GluCl recombinante incluyen, pero no se limitan a vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen).

Se puede usar una diversidad de vectores de expresión en células fúngicas para expresar GluCl recombinante en células fúngicas tales como levadura. Los vectores de expresión fúngica comercialmente disponibles los cuales pueden ser adecuados para expresión de GluCl recombinante incluyen, pero no se limitan a pYES2 (Invitrogen) y vectores de expresión Pichia (Invitrogen).

Se puede usar una diversidad de vectores de expresión en células de insecto para expresar GluCl recombinante en células de insecto. Los vectores de expresión en células de insecto comercialmente disponibles los cuales pueden ser adecuados para expresión recombinante de GluCl incluyen pero no se limitan a pBlueBacII (Invitrogen).

El DNA que codifica GluCl puede también clonarse en un vector de expresión para la expresión en una célula huésped recombinante. Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluidas pero no limitadas a bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de mamíferos que incluyen pero no se limitan a líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, simio y roedor, y células de insecto que incluyen pero no se limitan a líneas celulares derivadas de Drosophila y gusano de seda. Las líneas celulares derivadas de especies de mamíferos las cuales pueden ser adecuadas y las cuales están comercialmente disponibles, incluyen pero no se limitan a, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), células L, y HEK-293 (ATCC CRL1573).

El vector de expresión se puede introducir en células huéspedas por medio de una cualquiera de un número de técnicas que incluyen pero no se limitan a transformación, transfección, fusión de protoplastos, lipofección, y electroporación. Las células que contienen vector de expresión se propagan clonalmente y se analizan individualmente para determinar si producen proteína GluCl. La identificación de clones de células huésped que expresan GluCl se puede hacer por varios medios, incluyendo pero no limitados a reactividad inmunológica con anticuerpos anti-GluCl, y la presencia de actividad de GluCl asociada a célula huésped.

Se puede llevar a cabo expresión de DNA de GluCl usando mRNA sintético producido in vitro. El mRNA sintético o el mRNA aislado de células productoras de GluCl se puede traducir eficientemente en diversos sistemas libres de células, incluyendo pero no limitados a extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, igual que se puede traducir eficientemente en sistemas basados en células, incluyendo pero no limitados a microinyección en oocitos de rana, con microinyección en oocitos de rana prefiriéndose.

Para determinar la(s) secuencia(s) que producen niveles óptimos de actividad GluCl y/o proteína GluCl, se pueden construir moléculas de DNA de GluCl que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: la fase de lectura abierta en toda su longitud del cDNA de GluCl que codifica la proteína GluCl (correspondiente al primer nucleótido de la primera metionina y al último nucleótido antes del primer codón de terminación) y construcciones que contienen partes del cDNA que codifican proteína GluCl. Todas las construcciones se pueden diseñar para contener nada, todo o partes de la región 5' no traducida o la región 3' no traducida del cDNA de GluCl. La actividad GluCl y los niveles de expresión de la proteína se pueden determinar tras la introducción, tanto aisladamente como en combinación, de estas construcciones en células huésped apropiadas. Tras la determinación del cartucho de DNA de GluCl que produce expresión óptima en ensayos transitorios, esta construcción de DNA de GluCl se transfiere a una diversidad de vectores de expresión, para expresión en células huéspedas incluyendo, pero no limitadas a, células de mamífero, células de insectos infectadas por baculovirus, E. coli, y la levadura S. cerevisiae.

Las células huésped transfectantes y los oocitos microinyectados se pueden someter a ensayos para conocer tanto los niveles de actividad de canal GluCl como los niveles de proteína GluCl mediante los procedimientos siguientes. En el caso de células huésped recombinantes, esto implica la cotransfección de uno o posiblemente dos o más plásmidos, que contienen el DNA de GluCl. En el caso de oocitos, esto implica la inyección de RNA o DNA sintéticos para una o más proteínas GluCl. Tras un periodo de tiempo apropiado para permitir la expresión, la proteína celular está metabólicamente marcada con por ejemplo ^{35}S-metionina durante 24 horas, después de lo cual los lisados celulares y los sobrenadantes de cultivos celulares se recogen y someten a inmunoprecipitación con anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína GluCl.

Otros procedimientos para detectar actividad GluCl implican la medida directa de la actividad GluCl en células completas transfectadas con cDNA de GluCl u oocitos inyectados con mRNA de GluCl. La actividad GluCl se mide mediante unión específica a ligando y características electrofisiológicas de las células huésped que expresan DNA de GluCl. En el caso de células huésped recombinantes que expresan GluCl se pueden usar técnicas de pinzamiento de voltaje zonal de membrana para medir actividad de canales de cloruro y cuantificar proteína GluCl. En el caso de oocitos se pueden usar técnicas de pinzamiento zonal de membrana igual que técnicas de pinzamiento de voltaje de dos electrodos para medir actividad de canales de cloruro y cuantificar proteína GluCl.

Se cuantificaron los niveles de proteína GluCl en células huésped mediante inmunoafinidad y/o técnicas de afinidad de ligando. Las células que expresan GluCl se pueden someter a ensayo para determinar el número de moléculas de GluCl expresadas midiendo la cantidad de unión de glutamato radiactivo o ivermectina a membranas celulares. Las perlas de afinidad específicas de GluCl o los anticuerpos específicos de GluCl se usan para aislar por ejemplo proteína GluCl marcada con ^{35}S-metionina o no marcada. La proteína GluCl marcada se analizó mediante SDS-PAGE. La proteína GluCl no marcada se detecta mediante ensayos con prueba de manchas de western, ELISA o RIA que emplean anticuerpos específicos de GluCl.

Debido a que el código genético es degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos se puede codificar mediante cualquiera de un grupo de oligonucleótidos de DNA similares. Sólo un miembro del grupo sería idéntico a la secuencia de GluCl pero será capaz de hibridar a DNA de GluCl incluso en la presencia de oligonucleótidos de DNA con apareamientos desajustados bajo condiciones apropiadas. Bajo condiciones alteradas, los oligonucleótidos de DNA con apareamientos desajustados pueden aún hibridar al DNA de GluCl para permitir identificación y aislamiento de DNA que codifica GluCl.

El DNA que codifica GluCl de un organismo particular se puede usar para aislar y purificar homólogos de GluCl a partir de otros organismos. Para llevar a cabo esto, el primer DNA de GluCl se puede mezclar con una muestra que contiene DNA que codifica homólogos de GluCl bajo condiciones de hibridación apropiadas. El complejo de DNA hibridado se puede aislar y el DNA que codifica el DNA homólogo se puede purificar a partir de él.

Se sabe que hay una cantidad sustancial de redundancia en los diversos codones los cuales codifican para aminoácidos específicos. Por lo tanto, esta invención se refiere también a aquellas secuencias de DNA las cuales contienen codones alternativos los cuales codifican para la traslación eventual del aminoácido idéntico. Para los propósitos de esta especificación, una secuencia que lleva uno o más codones reemplazados se definirá como una variación degenerada. También están incluidas en el alcance de esta invención mutaciones bien en la secuencia de DNA o en la proteína traducida las cuales no alteran sustancialmente las propiedades físicas definitivas de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina, o asparragina por glutamina puede no causar un cambio en la funcionalidad del polipéptido.

Se sabe que las secuencias de DNA que codifican para un péptido se pueden alterar tal como para codificar para un péptido que tenga propiedades que son diferentes de aquellas secuencias del péptido que se da en la naturaleza. Los procedimientos de alterar las secuencias de DNA incluyen, pero no se limitan a la mutagénesis dirigida a sitio. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen pero no se limitan a cambios en la afinidad de una enzima por un sustrato o un receptor por un ligando.

Como se usa en el presente documento, un "derivado funcional" de GluCl es un compuesto que posee una actividad biológica (bien funcional o bien estructural) que es sucesivamente similar a la actividad biológica de GluCl. El término "derivados funcionales" se desea para incluir los "fragmentos," "variantes," "variantes degeneradas," "análogos" y "homólogos" o a "derivados químicos" de GluCl. El término "fragmento" se desea para referir un subgrupo de polipéptidos de GluCl. El término "variante" se desea para referirse a una molécula sustancialmente similar en estructura y función bien a la molécula GluCl entera o bien a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente similar" a GluCl si ambas moléculas tienen sustancialmente estructuras similares o si ambas moléculas poseen actividad biológica similar. Por lo tanto, si las dos moléculas poseen sustancialmente actividad similar, se consideran variantes incluso si la estructura de una de las dos moléculas no se encuentra en la otra o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El término "análogo" se refiere a una molécula sustancialmente similar en función tanto a la molécula GluCl entera o a un fragmento de la misma.

Tras la expresión de GluCl en una célula huésped recombinante, se puede recuperar proteína GluCl para proporcionar GluCl en forma activa. Varios procedimientos de purificación están disponibles y son adecuados para usar. Como se describe anteriormente para purificación de GluCl a partir de fuentes naturales, el GluCl recombinante se puede purificar a partir de lisados y extractos celulares, o a partir de medio de cultivo acondicionado, mediante diversas combinaciones de, o aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción a hidroxiapatito y cromatografía de interacción hidrófoba.

Además, el GluCl recombinante se puede separar de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para GluCl naciente de longitud total, fragmentos polipeptídicos de GluCl o proteínas GluCl.

Se purifican anticuerpos monoespecíficos para GluCl a partir de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos contra GluCl o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con GluCl usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). El anticuerpo monoespecífico como se usa en el presente documento se define como una especie de anticuerpo individual o como especies de anticuerpo múltiples con características de unión homogéneas para GluCl. La unión homogénea como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de las especies de anticuerpos para unir un antígeno o epítopo específico, tal como aquellos asociados con el GluCl, como se describe anteriormente. Los anticuerpos específicos de GluCl se estimulan inmunizando animales tales como ratones, ratas, conejillos de Indias, conejos, cabras, caballos y similares, con conejos prefiriéndose, con una concentración apropiada de GluCl bien con o bien sin un coadyuvante inmunitario.

El suero preinmune se recoge previamente a la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1000 mg de GluCl asociados con un coadyuvante inmune aceptable. Tales coadyuvantes aceptables incluyen, pero no se limitan a, coadyuvante de Freund completo, coadyuvante de Freund incompleto, precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y RNAt. La inmunización inicial consiste en GluCl en, preferiblemente, coadyuvante de Freund's completo en múltiples sitios bien subcutáneamente (SC), bien intraperitonealmente (IP) o bien de ambas formas. Cada animal se sangra a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente, para determinar la valoración del anticuerpo. Los animales pueden o no pueden recibir inyecciones de dosis adicionales tras la inmunización inicial. A aquellos animales que reciben inyecciones adicionales se les da generalmente una cantidad equivalente del antígeno en coadyuvante de Freund's incompleto mediante la misma ruta. Las inyecciones adicionales se dan a aproximadamente intervalos de tres semanas hasta que se obtienen valoraciones máximas. A aproximadamente 7 días después de cada inmunización adicional o aproximadamente semanalmente después de una inmunización individual, los animales se sangraron, el suero se recogió, y las alícuotas se almacenaron a aproximadamente -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con GluCl se prepararon inmunizando ratones endogámicos, preferiblemente Balb/c, con GluCl. Los ratones se inmunizaron mediante la vía intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC) con de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, preferiblemente aproximadamente 1 mg, de GluCl en aproximadamente 0,5 ml de tampón o disolución salina incorporada en un volumen igual de un coadyuvante aceptable, como se discute anteriormente. Se prefiere al coadyuvante de Freund's completo. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día 0 y se dejan descansar durante de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 semanas. A los ratones inmunizados se suministran una o más inmunizaciones adicionales de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg de GluCl en una disolución tampón tal como disolución salina tamponada con fosfato mediante la vía intravenosa (IV). Los linfocitos, de ratones positivos a anticuerpos, preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtuvieron eliminando bazos de ratones inmunizados mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. Las células de hibridoma se producen mezclando los linfocitos espécnicos con un compañero de fusión apropiado, preferiblemente células de mieloma, bajo condiciones las cuales permitirán la formación de hibridomas estables. Los compañeros de fusión pueden incluir, pero no se limitan a: mielomas de ratones P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, con Sp 2/0 prefiriéndose. Las células productoras de anticuerpos y mieloma se fusionaron en polietilenglicol, aproximadamente 1000 mol. de peso., a concentraciones de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan mediante cultivo en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la técnica (DMEM). Los fluidos sobrenadantes se recogen a partir de pocillos de crecimiento positivo en aproximadamente los días 14, 18, y 21 y se rastrean en busca de producción de anticuerpos mediante un inmunoensayo tal como un inmunorradioensayo en fase sólida (SPIRA) usando GluCl como el antígeno. Los fluidos de cultivo se probaron también en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb. Las células del hibridoma de pocillos positivos en anticuerpo se clonaron mediante una técnica tal como la técnica del agar blando de MacPherson, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.

Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo mediante inyección de ratones Balb/c preparados con pristano, aproximadamente 0,5 ml por ratón, con aproximadamente 2 x 10^{6} a aproximadamente 6 x 10^{6} de células de hibridoma aproximadamente 4 días después de la preparación. El fluido de ascites se recoge a aproximadamente 8-12 tras la transferencia celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante técnicas conocidas en la técnica.

La producción in vitro del mAb anti-GluCl se lleva a cabo cultivando el hibridoma en DMEM que contiene aproximadamente suero fetal de ternera aproximadamente al 2% para obtener cantidades suficientes del mAb específico. El mAb se purificó mediante técnicas conocidas en la técnica.

Las valoraciones de anticuerpos de ascites o fluidos de cultivo de hibridoma se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos los cuales incluyen, pero no se limitan a, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de anticuerpo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Ensayos similares se usan para detectar la presencia de GluCl en fluidos corporales o extractos de tejidos y extractos de células.

Es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que los procedimientos anteriormente descritos en la técnica para producir anticuerpos monoespecíficos se pueden utilizar para producir anticuerpos específicos para fragmentos polipeptídicos de GluCl, o para polipéptido de GluCl naciente de longitud total. Específicamente, es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que los anticuerpos monoespecíficos que se pueden generar los cuales son específicos para sólo una proteína GluCl o el canal de cloruro sensible a glutamato, Compuesto-1, o avemectina plenamente funcional.

Las columnas de afinidad por anticuerpos GluCl se hicieron añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel el cual se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida tales que los anticuerpos forman uniones covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después al gel por medio de enlaces de amida con el brazo separador. Los ésteres que permanecen activados se desactivan después con etanolamina 1M HC1 (pH 8). La columna se lava con agua seguida por glicina 0,23 M HC1 (pH 2,6) para eliminar cualquer anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) y los sobrenadantes del cultivo celular o extractos celulares que contienen GluCl o fragmentos de proteína GluCl se hacen pasar lentamente a través de la columna. La columna se lava después con disolución salina tamponada con fosfato hasta que su densidad óptica (A_{280}) cayó a la precedente, después la proteína se eluyó con glicina-HC1 (pH 2,6) 0,23 M. La proteína GluCl purificada se dializa después frente a disolución salina tamponada con fosfato.

Los clones de DNA, denominados pGluCl, se identifican, los cuales codifican proteínas que, cuando se expresan en oocitos de Xenopus como canales homoméricos, o como canales heteroméricos con otros miembros de la familia GluCl, se activaron directamente con glutamato, o avermectina. Canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato se han comunicado sólo en invertebrados y se encuentran en músculo y soma neuronal de insecto, músculo de crustáceo, y se expresa en poly (A)^{+} de RNA de oocitos de músculo de insecto [Lingle, C. y Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Horseman, B.G., Seymour, C., Bermudez, I. y Beadle, D.J. Neurosci. Lett. 85, 65-70 (1988)], [Wafford, K.A., y Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Lea, T.J. y Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. [Fraser, S.P., y col., Mol. Brain Res. 8, 331-341 (1990)] y se han clonado del nemátodo del suelo C. elegans [Cully, D.F., Vassilatis, D.K., Liu, K.K., Paress, P.S., Van der Ploeg, L.H.T., Schaeffer, J.M. y Arena, J.P.]. La terminología receptor H (hiperpolarización) se usa para distinguir canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato de los receptores de glutamato D (despolarización) excitadores de músculo de langosta [Lea, T.J. y Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333-350 (1973)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)]. De forma similar a oocitos inyectados con RNA de Dros GluCl RNA, los receptores-H de artrópodo se activan característicamente con ibotenat, se bloquean con picrotoxina de baja afinidad, y no se activan con GABA [Lingle, C. y Marder, E. Brain Res. 212, 481-488 (1981)], [Wafford, K.A. y Sattelle, D.B. J. Exp. Biol. 144, 449-462 (1989)], [Cull-Candy, S.G. J. Physiol. 255, 449-464 (1976)], [Lea, T.J. y Usherwood, P.N.R. Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351-363 (1973)]. Los receptores-H de músculo de langosta se activan directamente con avermectinas como son canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato expresados a partir de poli (A)^{+} de RNA de C. elegans [Scott, R.H. y Duce, I.R. Pestic, Sci. 16, 599-604 (1985); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. Schaeffer, J.M. y Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Además, se potencian canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glutamato en soma neuronal de langosta, y se activan directamente mediante avermectina [Aydar, E., Harding, L., Beadle, D.J. y Bermudez, I. Proceedings of the British Pharmacological Society p24 (1993)]. Por lo tanto, Dros GluCl parece estar relacionado con los receptores de artrópodos. Este canal representa la diana para avermectinas y Compuesto-1 en Drosophila.

Los análisis filogenéticos sugierne que Dros GluCl también se refiere a los canales GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans los cuales representan una única subclase de canales de cloruro con apertura y cierre regulados por ligando que pueden estar relacionados con la glicina \alpha y \beta, Lym \zeta y proteínas Dros rdl. Aunque estas proteínas están relacionadas filogenéticamente, responden a diferentes ligandos y son farmacológicamente distintos [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. y Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)], [ffrench-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. y Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)], [Grenningloh, G., y col., Neuron 4, 963-970 (1990)], [Hutton, M.L, Harvey, R.J. Earley, F.G.P., Barnard, E.A. y Darlison, M.G. FEBS Letters 326, 112-116 (1993)]. Se ha comunicado que las avermectinas interaccionan con otros miembros de la familia de canales de cloruro con apertura y cierre regulados por ligando. En nemátodos e insectos las avermectinas bloquean en general el canal sensible a GABA mientas que en cangrejo de río las avermectinas activan directamente un canal de cloruro con apertura y cierre regulados por multitransmisores (glutamato, acetilcolina, GABA) [Martin, R.J. y Pennington, A.J. Br. J. Pharmacol. 98, 747-756 (1989)], [Zufall, F., Franke, C. y Hatt, H. J. Exp. Biol. 142, 191-205 (1989)], [Holden-Dye, L. y Walker, R.J. Parasitology 101, 265-271 (1990)], [Bermudez, I., Hawkins, C.A., Taylor, A.M. y Beadle, D.J. Journal of Receptor Research 11, 221-232 (1991). En oocitos que expresan cerebro de pollo las avermectinas de receptor GABA_{a} potencian la respuesta GABA [Sigel, E. y Baur, R. Mol. Pharmacol. 32, 749-752 (1987)]. Además, las avermectinas inhiben la unión de estricnina a receptores de glicina de mamíferos [Graham, D., Pfeiffer, F. y Betz, H. Neurosci. Letters 29, 173-176 (1982)]. Sin embargo, las proteínas GluCl son los únicos miembros de la familia de canales de cloruro con apertura y cierre regulados por ligando que muestran características farmacológicas únicas con respecto a glutamato e ibotenato, y por lo tanto representan una nueva subclase de canales iónicos con apertura y cierre regulados por ligando.

La presente invención se refiere también a procedimientos para rastrear en busca de compuestos los cuales modulan la expresión de DNA o RNA que codifican GluCl igual que la función de proteína GluCl in vivo. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser DNA, RNA, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no proteicas. Los compuestos pueden modular incrementando o atenuando la expresión de DNA o RNA que codifican GluCl, o la función de la proteína GluCl. Los compuestos que modulan la expresión de DNA o RNA que codifican GluCl o la función de proteína GluCl se pueden detectar mediante una diversidad de ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo "sí/no" para determinar si hay un cambio en expresión o función. El ensayo puede hacerse cuantitativo comparando la expresión o función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o función en una muestra estándar. Los moduladores identificados en este procedimiento son útiles como agentes terapéuticos, insecticidas y antihelmínticos.

Se pueden preparar kits que contienen DNA de GluCl, anticuerpos para GluCl, o proteína GluCl. Tales kits se usan para detectar DNA el cual hibrida con DNA de GluCl o para detectar la presencia de proteína GluCl o fragmentos peptídicos en una muestra. Tal caracterización es útil para una diversidad de propósitos que incluyen pero no se limitan a análisis forenses y estudios epidemiológicos.

Las moléculas de DNA, moléculas de RNA, proteína recombinante y anticuerpos de la presente invención se pueden usar para rastrear y medir niveles de DNA de GluCl, RNA de GluCl o proteína GluCl. Las proteínas recombinantes, moléculas de DNA, moléculas de RNA y anticuerpos se prestan a la formulación de kits adecuados para la detección y escritura de la secuencia de GluCl. Un kit tal comprendería un vehículo compartimentalizado adecuado para llevar en confinamiento cerrado al menos un recipiente. El transportador comprende adicionalmente reactivos tales como proteína recombinante o anticuerpos anti-GluCl adecuados para detectar GluCl. El vehículo puede contener también un medio para detección tal como antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Se pueden sintetizar secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia de DNA que codifica GluCl para terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser DNA, derivados estables de DNA tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, RNA, derivados estables de RNA tales como 2'-O-alquilRNA, u otros mimetizadores de oligonucleótidos antisentido de GluCl. Se pueden introducir moléculas antisentido de GluCl dentro de células mediante microinyección, encapsulación de microsomas o mediante expresión de vectores que contienen la secuencia antisentido. La terapia antisentido con GluCl puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades donde es beneficioso reducir actividad GluCl.

El DNA de GluCl se puede usar para introducir GluCl dentro de las células de organismos diana. El gen GluCl se puede ligar en vectores virales los cuales median la transferencia del DNA de GluCl mediante infección de células huésped receptoras. Los vectores virales adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus herpes, virus vaccinia, virus de la polio y similares. Alternativamente, el DNA de GluCl se puede transferir dentro de células mediante técnicas no virales que incluyen transferencia de DNA dirigida mediada por receptor usando conjugados ligando-DNA o conjugados adenovirus-ligando-DNA, fusión de membranas por lipofección o microinyección directa. Estos procedimientos y variaciones de los mismos son adecuados para terapia génica ex vivo igual que in vivo. La terapia génica de GluCl puede ser particularmente útil donde es beneficiosa para elevar actividad GluCl.

Se pueden formular composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden DNA de GluCl, RNA de GluCl, o proteína GluCl, o moduladores de actividad del receptor GluCl, se pueden formular de acuerdo con procedimientos conocidos tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales vehículos y procedimientos de formulación se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente estable para administración efectiva, tales composiciones contendrán una cantidad efectiva de la proteína, DNA, RNA, o modulador.

Las composiciones terapéuticas o diagnósticas identificadas usando la invención se administraron a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos en los cuales se indica la modulación de actividad relacionada con GluCl. La cantidad efectiva puede variar de acuerdo con una diversidad de factores como la condición, el peso, el sexo y la edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar al individuo mediante una diversidad de vías tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular.

El término "derivado químico" describe una molécula que contiene restos químicos adicionales los cuales no son normalmente una parte de la molécula base. Tales restos pueden proporcionar la solubilidad, vida media, absorción, etc. de la molécula base. Alternativamente los restos pueden atenuar efectos secundarios indeseables de la molécula base o disminuir la toxicidad de la molécula base. Ejemplos de tales restos se describen en una diversidad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Los compuestos identificados de acuerdo a los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar sólo en dosificaciones apropiadas definidas mediante realización de pruebas de rutina con el fin de obtener inhibición óptima del receptor de GluCl o su actividad minimizando mientras cualquier toxicidad potencial. Además, la co-administración o administración secuencial de otros agentes puede ser deseable.

El procedimiento de la presente invención tiene también el objetivo de proporcionar formulaciones farmacéuticas adecuadas tópicas, orales, sistémicas y parenterales para usar en los procedimientos novedosos de tratamiento de la presente invención. Las composiciones que contienen compuestos identificados de acuerdo con esta invención como el ingrediente activo para usar en la modulación de los receptores GluCl se pueden administrar en una amplia variedad de formas de dosificación terapéutica en vehículos convencionales para administración. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar en formas de dosificación oral tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación programada y de liberación continuada), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, disoluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Asimismo, se pueden administrar también en forma intravenosa (tanto por inyección ultrarrápida como por infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o en forma intramuscular, todas las fórmulas que se usan son bien conocidas para aquellos de habilidad normal en las técnicas farmacéuticas. Una cantidad efectiva pero no tóxica del compuesto deseado se puede emplear como un agente modulador de GluCl.

La dosificación diaria de los productos se puede variar en un amplio rango de 0,001 a 1.000 mg por paciente, por día. Para administración oral, las composiciones se proporcionan preferiblemente en forma de comprimidos marcados o no marcados que contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, y 50,0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente a tratarse. Una cantidad efectiva del fármaco se suministra de ordinario a un nivel de dosificación de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones de los moduladores del receptor de GluCl se ajustan cuando se combinan para lograr efectos deseados. Por otro lado, las dosificaciones de estos diversos agentes se pueden optimizar independientemente y combinar para lograr un resultado sinérgico en el cual la patología se reduce más de lo que lo haría si ambos agentes se usaran solos.

Ventajosamente, los compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención se pueden administrar en una dosis diaria única, o la dosificación diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Además, dichos compuestos se pueden administrar en forma intranasal por medio de uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o por medio de vías transdérmicas, usando aquellas formas de parches de la piel transdérmicos bien conocidas por aquellos de habilidad normal en la técnica. Para administrarse en forma de un sistema de administración transdérmica, la administración de la dosificación será, por supuesto, contínua más que intermitente por todo el régimen de dosificación.

Para el tratamiento de combinación con más de un agente activo, donde los agentes activos están en formulaciones de dosificación separadas, los agentes activos se pueden administrar concurrentemente, o se pueden administrar cada uno a tiempos separados por fases.

El régimen de dosificación que utiliza los compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y afección médica del paciente; la gravedad de la afección a tratarse; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular del mismo empleado. Un médico o veterinario de habilidad normal puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco requerido para prevenir, contrarrestar o arrestar el progreso de la afección. La precisión óptima en lograr concentraciones de fármaco en el intervalo que produce eficacia sin toxicidad requiere un régimen basado en las cinéticas de la disponibilidad de los fármacos para los sitios diana. Esto implica una consideración de la distribución, equilibrio, y eliminación de un fármaco.

Los compuestos identificados mediante los procedimientos de la presente invención se administran típicamente en mezcla con diluyentes, excipientes o transportadores farmacéuticos (referidos colectivamente en el presente documento como materiales "transportadores") adecuadamente seleccionados con respecto a la forma de dosificación deseada, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes y similares, y consistentes con prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para administración oral en forma de un comprimido o cápsula, el componente fármaco activo se puede combinar con un transportador inerte farmacéuticamente aceptable oral, no tóxico tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se desea o es necesario, se pueden incorporar también en la mezcla agentes aglutinantes, lubricantes, disgregantes adecuados y agentes colorantes. Los aglutinantes adecuados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes del maíz, cauchos naturales y sintéticos tales como goma arábiga, goma de tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen sin limitación, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Los desintegradores incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantama y similares.

Para formas líquidas el componente fármaco activo se puede combinar en agentes en dispersión o en suspensión adecuadamente aromatizados tales como los cauchos sintéticos y naturales, por ejemplo, goma de tragacanto, goma arábiga, metilcelulosa y similares. Otros agentes dispersantes los cuales se pueden emplear incluyen glicerina y similares. Para administración parenteral, se desean suspensiones y disoluciones estériles. Las preparaciones isotónicas las cuales contienen generalmente conservantes adecuados se emplean cuando se desea administración intravenosa.

Las preparaciones tópicas que contienen el componente fármaco activo se pueden mezclar con una diversidad de materiales transportadores bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, alcoholes, gel de aloe vera, alantoína, glicerina, aceites de vitaminas A y E, aceite mineral, propionato de miristilo, PPG2, y similares, para formar, por ejemplo, disoluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas de limpieza, geles cutáneos, lociones cutáneas, y champúes en formulaciones de crema o de gel.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención se pueden administrar también en forma de sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas se pueden formar a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

Se pueden administrar también compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los cuales se acoplan las moléculas del compuesto. Los compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención se pueden acoplar también con polímeros solubles como vehículos de fármacos dirigibles. Tales polímeros pueden incluir polivinil-pirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxi-propilmetacril-amidafenol, polihidroxi-etilaspartamidefenol, o polietil-eneoxidepolilisina sustituida con residuos de palmitoilo. Además, los compuestos identificados mediante el procedimiento de la presente invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles en lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, caprolactona poliépsilon, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidro-piranos, polcianoacrilatos y copolímeros bloqueantes entrecruzados o anfipáticos de hidrogeles.

Los compuestos que se identifican mediante los procedimientos de la presente invención son útiles como agentes antiparasitarios contra endo y ectoparásitos, en particular helmintos y artrópodos, los cuales causan numerosas enfermedades parasitarias en humanos, animales, y plantas.

Las enfermedades parasitarias pueden estar causadas bien por endoparásitos o bien por ectoparásitos. Los endoparásitos son aquellos parásitos que viven dentro del cuerpo del huésped, bien dentro de un órgano (tal como el estómago, pulmones, corazón, intestinos, etc.) o simplemente bajo la piel. Los ectoparásitos son aquellos parásitos los cuales viven en la superficie externa del huésped pero aún así sacan nutrientes del huésped.

Las enfermedades endoparasitarias generalmente referidas como helmintiasis se deben a la infección del huésped con gusanos parásitos conocidos como helmintos. La helmintiasis es un problema económico mundial prevalente y grave debido a la infección de animales domésticos tales como puerco, oveja, caballos, ganado vacuno, cabras, perros, gatos y aves de corral. Muchas de estas infecciones están causadas por el grupo de gusanos conocidos como nemátodos los cuales causan enfermedades en diversas especies de animales por todo el mundo. Estas enfermedades son frecuentemente graves y pueden dar como resultado la muerte del animal infectado. Los géneros más comunes de nemátodos que infectan los animales referidos anteriormente son Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, y Parascaris. Muchos parásitos son específicos de especie (infectan sólo un huésped) y la mayoría también tiene un sitio preferido de infección en el animal. Así Haemonchus y Ostertagia infectan primariamente el estómago mientras que Nematodirus y Cooperia atacan mayoritariamente los intestinos. Otros parásitos prefieren residir en el corazón, ojos, pulmones, vasos sanguíneos, y similares mientras que aún otros son parásitos subcutáneos. La helmintiasis puede conducir a debilidad, pérdida de peso, anemia, daño intestinal, malnutrición, y daño a otros órganos. Si estas enfermedades permanecen sin tratar pueden dar como resultado la muerte del animal.

Las enfermedades causadas por artrópodos ectoparásitos tales como garrapatas, ácaros, piojo, moscas de los establos, moscas de los cuernos, moscardas de la carne, pulgas, y otros insectos que pican tales como Tenophalides, Ixodes, Psoroptes, Lucilia, y Hemotobia, son también un problema grave. La infección y la infestación mediante estos parásitos dan como resultado pérdida de sangre, lesiones cutáneas, y pueden interferir con los hábitos de alimentación normales causando pérdida de peso. Estas infecciones pueden dar como resultado también transmisión de enfermedades graves tales como encefalitis, anaplasmosis, queratoconjuntivitis infecciona porcina, y similares las cuales pueden ser fatales. Los compuestos que son activos en el procedimiento descrito en el presente documento son útiles para la prevención y tratamiento de estas infecciones e infestaciones.

Los animales pueden estar infectados por varias especies de parásitos al mismo tiempo dado que la infección con un parásito puede debilitar al animal y hacerle más susceptible a infección por una segunda especie de parásito. Así un compuesto con un amplio espectro de actividad es ventajoso en particular en el tratamiento de estas enfermedades. Los compuestos identificados usando esta invención tienen actividad contra estos parásitos, y además son también activos contra Dirofilaria en perros, Nematospiroides y Syphacia en roedores, insectos que pican, y larvas de dípteros que migran tales como Hypoderma sp. en ganado vacuno, y Gastrophilus en caballos.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento también es útil contra endo y ecto parásitos los cuales causan enfermedades parasitarias en humanos. Ejemplos de tales endoparásitos los cuales infectan al hombre incluyen parásitos gastrointestinales de los géneros Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, y similares. Otros endoparásitos los cuales infectan al hombre se encuentran en la sangre o en otros órganos. Ejemplos de tales parásitos son los gusanos filariales Wucheria, Brugia, Onchocerca, y similares igual que fases extra-intestinales de los gusanos intestinales Strongylides y Trichinella. Los ectoparásitos los cuales parasitan al hombre incluyen artrópodos tales como garrapatas, pulgas, ácaros, piojo, y similares y, como con animales domésticos, las infecciones por estos parásitos pueden dar como resultado transmisión de enfermedades graves e incluso fatales. Los compuestos activos se activan contra estos endo y ecto parásitos y además son también activos contra insectos que pican y otras plagas de dípteros los cuales molestan a los seres humanos.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento son también útiles contra las plagas caseras comunes tales como Blatella sp. (cucaracha), Tineola sp. (polilla de la ropa), Attagenus sp. (escarabajo de las alfombras), Musca domestica (mosca común) y contra Solenopsis invicta (hormiga de fuego roja importada).

Los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento son además útiles contra las plagas agrícolas tales como áfidos (Acyrthiosiphon sp.), langostas, arañitas rojass, y gorgojos igual que contra plagas de insectos las cuales atacan los granos almacenados tales como Tribolium sp. y Tenebrio sp., y contra estados inmaduros de insectos que viven en tejidos vegetales. Los compuestos son también útiles como un nematodicida para el control de nemátodos del suelo y parásitos vegetales tales como Meloidogyne sp., los cuales pueden ser importantes agrícolamente.

Para usar un agente antiparasitario en animales los compuestos se pueden administrar internamente bien oralmente, o bien mediante inyección, o bien tópicamente como un líquido empapador o como un champú.

Para administración oral, los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento pueden administrarse en forma de cápsula, comprimido, o inyección ultrarrápida o alternativamente se pueden mezclar en los alimentos de los animales. Las cápsulas, comprimidos, e inyecciones ultrarrápidas están comprendidas en el ingrediente activo en combinación con un vehículo transportador apropiado tal como almidón, talco, estearato de magnesio, o foafato dicálcico. Estas unidades de dosificación se prepararon íntimamente mezclando el ingrediente activo con ingredientes inertes finamente pulverizados adecuados que incluyen diluyentes, agentes de carga, agentes disgregantes, y/o aglutinantes de tal forma que se obtiene una mezcla uniforme. Un ingrediente inerte es uno que no reaccionará con los compuestos y el cual no es tóxico para el animal que se está tratando. Los ingredientes inertes adecuados incluyen almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, cauchos y aceites vegetales, y similares. Estas formulaciones pueden contener una cantidad ampliamente variable de los ingredientes activos e inactivos que depende de numerosos factores tales como el tamaño y tipo de las especies animales a tratarse y el tipo y gravedad de la infección. El ingrediente activo se puede determinar también como un aditivo a los alimentos simplemente mezclando el compuesto con los piensos o aplicando el compuesto a la superficie de los alimentos. Alternativamente el ingrediente activo se puede mezclar con un vehículo inerte y la composición resultante se puede después bien mezclar con los alimentos o bien darse a comer directamente al animal. Los vehículos inertes adecuados incluyen harina de maíz, harina de agrios desecados, residuos de fermentación, grits de soja, granos secos y similares. Los ingredientes activos se mezclan íntimamente con estos vehículos inertes picando, agitando, moliendo, o removiendo de tal forma que la composición final contiene del 0,001 al 5% en peso del ingrediente activo.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento se pueden administrar alternativamente parenteralmente por medio de inyección de una formulación que consta del ingrediente activo disuelto en un transportador líquido inerte. La inyección puede ser bien intramuscular, bien intraruminal, bien intratraqueal, o bien subcutanea. La formulación inyectable consta del ingrediente activo mezclado con un vehículo líquido inerte apropiado. Los vehículos líquidos adecuados incluyen los aceites vegetales tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo y similares igual que disolventes orgánicos tales como solketal, formalglicerol y similares. Como una alternativa, se pueden usar también las formulaciones acuosas parenterales. Los aceites vegetales son los vehículos líquidos preferidos. Las formulaciones adecuadas se preparan disolviendo o poniendo en suspensión el ingrediente activo en el transportador líquido de tal forma que la formulación final contiene del 0,005 al 10% en peso del ingrediente activo.

La aplicación tópica de los compuestos identificada mediante el procedimiento descrito en el presente documento es posible a través del uso de un empapador líquido o un champú que contiene los compuestos inmediatos como una disolución, dispersión o suspensión acuosa. Estas formulaciones contienen generalmente un agente en suspensión tal como bentonita, un agente humectante o excipiente similar, y normalmente contendrán también un agente antiespumante. Las formulaciones que contienen del 0,001 al 1% en peso del ingrediente activo son aceptables. Las formulaciones preferidas son aquellas que contienen del 0,01 al 1% en peso de los compuestos activos.

Los compuestos activos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento son útiles ante todo como agentes antiparasitarios para el tratamiento y/o prevención de helmintiasis en animales domésticos tales como ganado vacuno, oveja, caballos, perros, gatos, cabras, puerco, y aves de corral. También es útil en la prevención y el tratamiento de infecciones parasitarias de estos animales por ectoparásitos tales como garrapatas, ácaros, piojo, pulgas y similares. Son también efectivas en el tratamiento de infecciones parasitarias de humanos. En tratar tales infecciones los compuestos se pueden usar individualmente o en combinación entre sí o con otros agentes antiparasitarios no relacionados. La dosificación de los compuestos requerida para los mejores resultados dependerá de varios factores tales como la especie y tamaño del animal, el tipo y gravedad de la infección, el procedimiento de administración y el compuesto usado. La administración oral de los compuestos a un nivel de dosis de aproximadamente 0,0005 a 10 mg por kg de peso corporal del animal, bien en una dosis única o bien en varias dosis separadas unos pocos días aparte, generalmente da buenos resultados. Una dosis única de uno de los compuestos normalmente da control excelente sin embargo se pueden dar dosis repetidas para combatir la reinfección o para parasitar especies las cuales son inusualmente persistentes. Las técnicas para administrar estos compuestos a animales se conocen por aquellos expertos en el campo veterinario.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento descrito en el presente documento se pueden usar también para combatir plagas agrícolas las cuales atacan cultivos bien en el campo o bien en almacenaje. Los compuestos se aplican para tales usos como pulverizaciones, polvos, emulsiones, y similares bien a las plantas en cultivo o bien a las cosechas recogidas. Las técnicas para aplicar estos compuestos en esta manera se conocen por aquellos expertos en las técnicas agrícolas.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin, sin embargo, limitar la misma a ellos.

Ejemplo 1 Aislamiento de RNA de Drosophila

El RNA de poli(A)^{+} se preparó a partir de cabezas de la cepa Oregon R de Drosophila melanogaster. Las cabezas se congelaron rápidamente en N_{2} líquido y se molieron con un mortero y almirez mientras se sumergieron en N_{2} líquido. El tejido Drosophila congelado, pulverizado se añadió a una disolución que contenía tiocianato de guanidinio 4 M, citrato de sodio 5 mM a pH 7,0, y \beta-mercaptoetanol 0,1 M (1 gm de tejido/10 ml de disolución), y se mezcló con un homogeneizador de polytron. Después de un minuto de homogenización, se añadió sarkosyl sódico al 0,5% y se mezcló bien y la disolución se centrifugó and a 10.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se colocó como una capa sobre un cojín de CsCl 5,7 M y se centrifugó durante 18 horas a 33.000 rpm. El sedimento de RNA se lavó con etanol al 70%, se resuspendió en H_{2}O y se extrajo con cloroformo:isobutanol, 4:1 y precipitó con etanol. El RNA de Poly (A)^{+} se aisló mediante dos rondas de purificación sobre columnas de oligo (dT)-celulosa.

Ejemplo 2 Clonado y caracterización del producto de PCR GluCl de Drosophila

Se usaron cebadores oligonucleotídicos de DNA 5'TGGGT(AGCT)(TA)(CG)(AGCT)TT(CT)TGGTT-3'

[SEQ. ID. Nº.: 1] (Cebador 1) y 5'GC(TGCA)CC(TGA)ATCCA(TGCA)AC(GA)TC(TGA)AT-3'

[SEQ. ID., Nº.: 2] (Cebador 2) en una reacción de PCR en condiciones de baja restrictividad para amplificar una secuencia del gen GluCl de Drosophila. Estos oligonucleótidos codifican las secuencias de aminoácidos las cuales están presentes en los dominios M1 y M3 del gen GluCl\alpha de C. elegans (Cully y col., supra). El RNA de poli (A)^{+} de Drosophila RNA (1 ug en 17 \mul de H_{2}O) se calentó a 65ºC 3 minutos y se situó en hielo. Los siguientes reactivos se añadieron en hielo: 3 \mul de RNasin (40 u/\mul), 8 \mul de tampón RT 5x (Tris-HCl 250 mM a pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2}15 mM, BRL), 4 \mul de DTT 0,1 M, 4 \mul de dNTP 20 mM, 2 \mul de Cebador 2 oligonucleotídico 20 \muM y 0,5 \mul de trasncriptasa reversa del virus de la Leucemia Murina Moloney 200 unidades/\mul. La reacción se incubó durante 90 minutos a 42ºC, y la reacción se paró calentando a 65ºC durante 10 minutos. La primera hebra de cDNA que resultó se usó en una reacción en cadena de la polimerasa como sigue: 3 \mul de cDNA se incubaron en una reacción de 50 \mul con 2,5 unidades de DNA polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) en tampón de reacción de Tac (MgCl_{2}1,5 mM, KCl 50 mM, TrisHCl 10 mM a pH 8,3, dNTP 400 \muM) con 1,2 \muM de cada cebador (secuencias de DNA 1 y 2) y 20 \muCi de ^{32}P-dCTP. La reacción se incubó en un termociclador Perkin Elmer Cetus programado para 25 ciclos a 94º (1') 37º (2') 72º (3'). La reacción se mezcló con 1 \mug de tRNA, acetato de sodio 3 M en 1/10 del volumen, y 2 volúmenes de etanol 100%, incubado a -20ºC durante 16 horas, se centrifugó 30 minutos a 11.000 x g, y se lavó con etanol al 70%. El sedimento se secó y resuspendió en 3 \mul de H_{2}O y 3 \mul de disolución de parada (formamida al 95%, EDTA 20 mM, Azul de Bromofenol al 0,05%, Xylele Cyanol FF 0,05%), se calentaron a 70ºC 2 minutos, y se sometieron a electroforesis sobre un gel de secuenciación de acrilamida-urea al 6% (Maniatis) hasta que el marcador de Xylene Cyanol estuvo en el fondo del gel (40 cm). Un DNA de control se secuenció (kit de secuenciación de DNA USB Sequenase Versión 2.0) y corrieron en el gel como marcadores de tamaño. El gel se removió y empapó durante 15 minutos en metanol al 10%; ácido acético al 7%, se transfirió a papel de filtro de 3 mm Whatman, se secó, y se expuso a película de rayos X. El gel correspondiente a la región de 152 bases se recortó y empapó en 400 \mul de H_{2}O durante 2 horas a 22ºC. El DNA eluído (30 \mul) se usó como una plantilla en 100 \mul de una mezcla de reacción de PCR que contenía tampón de reacción de Taq, 1,0 \muM de cada cebador (secuencia de DNA 1 y 2) y 5 unidades de Taq polimerasa. El programa del termociclador fue como anteriormente. Una alícuota de 30 \mul de esta reacción de PCR se usó como una plantilla para una segunda reacción de PCR idéntica.

El fragmento de 152 pares de bases amplificado mediante PCR se precipitó a partir de la mezcla de reacción con 1/10 de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol al 100% a -20ºC durante 16 horas, se centrifugó 30 minutos a 11.000 x g, y se lavó con etanol al 70%. El sedimento se secó y resuspendió en 10 \mul de TE (Tris-HCl a pH 8,0; EDTA 1 mM) y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa NuSieve TAE al 4% (Tris-HCl 40 mM a pH 8,0; acetato de sodio al 20 mM; EDTA 2 mM) (FMC BioProducts). El fragmento de DNA se escindió del gel y se purificó usando un kit de extracción de gel QIAEX (Qiagen, Inc.). El fragmento de DNA purificado se ligó dentro del vector pCR usando el Sistema de Clonación TA (Invitogen Corp.). El DNA ligado se precipitó con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol 100% y se incubó a -20ºC, se centrifugó, se lavó y se resuspendió en 2 \mul de agua como se describe anteriormente. Una alícuota de 1 \mul de DNA se usó para transformar en 40 \mul de células electrocompetentes INV\alphaF' (Invitrogen Corp) mediante electroporación usando un Gene-Pulser (BioRad) a 2,5 KV, capacitancia de 25 \muF, y 200 ohms de resistencia, después de lo cual se añadió 1 ml de medio of SOC (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989) y las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las células transformadas se plaquearon en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de ampicilina y 40 \mug/ml X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido) y se incubaron 18 horas a 37ºC. Se recogieron colonias blancas y diez de estas, conteniendo cada una un vector con un inserto de aproximadamente pares de bases 152, se secuenciaron usando un kit de secuenciación de DNA USB Sequenase Versión 2.0. Se eligió el clon pPCR-2 como una sonda para identificar un clon de cDNA de longitud completa. La secuencia de DNA de pPCR-2 es SEQ. ID. No.: 4, la cual codifica para un péptido de secuencia predicha de aminoácidos:

WVTFWLDQGAVPARVSLGVTTLLTMATQTSGINASLPPVSYTKAIDVWIG. [SEQ. ID. Nº.: 3]

Ejemplo 3 Aislamiento e identificación del cDNA de Dros GluCl

Se hizo una biblioteca de cDNA a partir de cabezas de la cepa Oregon R de Drosophila en el vector de clonación fagómido (Stratagene). Esta biblioteca se transfectó en células de E. coli BB4, se plaqueó sobre medio NZY (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.), y se incubó 18 horas a 37ºC. Las placas resultantes se transfirieron a membranas de Durulose (Stratagene). Las membranas se prehibridaron en disolución de prerhibridación (formamida al 50%; reactivo de Denhardts 2x; SSPE 5x; SDS 0,1%; DNA de esperma de arenque de cadena simple 100 \mug/ml) durante 16 horas a 42ºC, y se hibridaron durante 65 horas a 42ºC en 50 ml de disolución de hibridación (disolución de prehibridación que contiene sulfato de dextrano al 10%)que contiene 2x10^{7} cpm del fragmento de inserto EcoRI del Clon pPCR-2 el cual estaba marcado con ^{32}P-dCTP mediante cebado aleatorio usando un Kit de Marcado de DNA Aleatorio (Boehringer Mannheim). Las membranas se expusieron a una película de rayos X. Se identificaron treintaiseis clones de fago positivos y se convirtieron en plásmidos mediante escisión in vivo y por el protocolo de Stratagene. Se encontró que un clon, pDros GluCl contenía un inserto de 3958 bases. La secuencia de cDNA de GluCl de Dros se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 4 Estructura Primaria del Canal GluCl de Dros

La secuencia de nucleótidos de pDros GluCl reveló una fase de lectura abierta grande única de aproximadamente 1518 pares de bases. El cDNA tiene una región 5' no traducida de aproximadamente 254 nucleótidos y una región 3' no traducida de aproximadamente 2186 nucleótidos. La primera metionina dentro de la fase (base 405) se designa como el codón de iniciación para la fase de lectura abierta que finaliza en el codon de parada TAA (base 1773). La proteína predicha GluCl (Figura 2) tiene una masa molecular (M_{r}) estimada de aproximadamente 52.344 daltons. La proteína contiene residuos aminoterminales hidrófobos con secuencias altamente predictivas de sitios de escisión de señal que resultarían en una proteína madura que se inicia en aproximadamente el aminoácido 23.

La proteína GluCl de Dros se alineó con las bases de datos de nucleótidos y proteínas y se encontró que estaba relacionada con GluCl\alpha, GluCl\beta, y a los receptores de glicina y GABA_{A}de C. elegans. Se encontraron también en las secuencias Dros GluCl los restos conservados encontrados en esta familia de canales, tales como un dominio extracelular NH_{2}-terminal grande y cuatro dominios transmembrana hidrófobos de M1 a M4. La proteína GluCl de Dros contenía los residuos conservados de cisteína hallados en el dominio extracelular de todos canales de cloruro con apertura y cierre regulados por ligando. Estaban presentes dos residuos adicionales de cisteína (aminoácidos 356 y 367) que también se encuentran en canales de cloruro con apertura y cierre regulados por glicina y en las GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans. La proteína GluCl Dros contenía dos secuencias consenso fuertes para los sitios de fosforilación de la proteínquinasa C situados entre los dominios que atraviesan la membrana teóricos M3 y M4. En las proteínas del receptor GABA_{A}, se localizaron sitios de fosforilación similares en el dominio intracelular entre M3 y M4 y se cree que juegan una papel en regulación de canales [Leidenheimer, N.J., McQuilkin, S.J., Hahner, L.D., Whiting, P. y Harris, R.A. Mol. Pharm. 41, 1116-1123 (1992), [Kellenberger, S., Malherbe, P. y Sigel, E. J. Biol. Chem. 267, 24660-25663 (1992)]. Como se encuentra en las secuencias de los receptores de GABA_{A} y glicina, la proteína GluCl contenía sitios de glicosilación unidos al extremo N-terminal teóricos en el dominio en el dominio extracelular propuesto.

Se llevó a cabo un análisis filogenético con la secuencia completa de la proteína GluCl Dros, las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans, las proteínas receptoras GABA_{A} y glicina, y secuencias de proteínas de invertebrados relacionadas (Figura 5). Una división evolutiva diferenciada en esta familia de proteínas se mostró mediante una divergencia en dos ramas principales que resultó en la división de las proteínas de GABA_{A} \alpha y \gamma de las restantes proteínas. Dentro de estas ramas principales hay subramas que agrupan las proteínas en las subclases respectivas, tales como las GABA_{A} \alpha, \beta, \gamma, \delta, \rho, y glicina \alpha y \beta.

Aunque la proteína GluCl Dros está filogenéticamente relacionada con las proteínas GluCl\alpha y GluCl\beta de C. elegans, glicina \alpha y \beta, Lym \zeta y proteínas rdl Dros, son farmacológicamente distintas y se agrupan con las proteínas GluCl. Los estudios de expresión en oocitos de Xenopus muestran que se forman canales de cloruro homoméricos funcionales mediante las proteínas glicina \alpha que son sensibles a glicina [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P.R. y Betz, H. EMBO Journal 8, 695-700 (1989)] y a la proteína rdl Dros que es sensible a GABA [ffrench-Constant, R.H., Rocheleau, T.A., Steichen, J.C. y Chalmers, A.E. Nature 363, 449-451 (1993)]. Los canales homoméricos glicina \beta se forman con muy baja eficiencia [Grenningloh, G., y col., Neuron 4, 963-970 (1990)], y la proteína Lym \zeta no forma canales homoméricos funcionales [Hutton, M.L., Harvey, R.J., Earley, F.G.P., Barnard, E.A. y Darlison, M.G. FEBS letters 326, 112-116 (1993)].

Ejemplo 5 Expresión de la Proteína GluCl Dros en oocitos de Xenopus

La pDros GluCl se hizo lineal mediante digestión con la endonucleasa de restricción SalI. Se sintetizó RNA in vitro a partir de 0,5 \mug de este plásmido en una reacción que contiene Tris-HCl 40 mM, a pH 7,5; MgCl_{2}6 mM; espermidina 2 mM; NaCl 10 mM; DTT 10 mM; seroalbúmina bovina 0,05 mg/ml; 2 unidades/ul de RNasin; cada uno de ATP, CTP, y UTP, 800 \muM; GTP 200 \muM; m7G(5')ppp(5')G 800 \muM; ^{32}P-CTP 5 \muCi; y 50 unidades de T3 RNA polimerasa en un volumen final de 50 \mul. La reacción se incubó durante 3 horas a 37ºC seguidos por una incubación adicional de 15 minutos con 20 unidades de DNasa libre de RNasa y extracción con fenol, fenol:cloroformo, y cloroformo. El RNA se precipitó con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, almacenado a -20ºC durante 16 horas, lavado con etanol 70% y resuspendido en agua a una concentración de 1 mg/ml por inyección en oocitos de Xenopus laevis.

Los oocitos de Xenopus laevis se prepararon e inyectaron usando procedimientos estándar previamente descritos y conocidos en la técnica [Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S. y Cully, D.F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J.P., Liu, K.K., Paress, P.S., Schaeffer, J.M. y Cully, D.F. Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)]. Los Xenopus laevis femeninos adultos se anestesiaron con metanosulfonato de tricaína al 0,17% y los ovarios se retiraron quirúrgicamente y situaron en una placa que consta de (mM): NaCl 82,5, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 5 ajustado a pH 7,5 con NaOH (OR-2). Los lóbulos ováricos se estallaron, se aclararon varias veces, y se agitaron suavemente en OR-2 que contenía colagenasa al 0,2% (Sigma, Tipo 1A) durante 2-5 horas. Cuando se eliminaron aproximadamente el 50% de las capas foliculares, se seleccionaron oocitos de Fase V y VI y se situaron en medios que constan de (mM): NaCl 86, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 5, piruvato de Na 2,5, teofilina 0,5, gentamicina 0,1 ajustado a pH 7,5 con NaOH (ND-96) durante 24-48 horas antes de la inyección. Los oocitos se inyectaron con 50 nl de RNA de GluCl Dros (0,01-1 mg/ml). Los oocitos control se inyectaron con 50 nl de agua. Los oocitos se incubaron durante 2-10 días en ND-96 antes de registrar. Las incubaciones y la digestión con colagenasa se llevaron a cabo a 18ºC.

Los registros se hicieron a temperatura ambiente en disolución salina de ranas estándar que consta de (mM): NaCl 115, KCl 2, MgCl_{2} 1, CaCl_{2} 1,8, HEPES 10, ajustados a pH 7,5 con NaOH. Los oocitos se sometieron a pinzamiento de voltaje usando un amplificador de dos microelectrodos estándar (Dagan 8500 o TEV-200, Mineápolis, MN). Las pipetas se rellenaron con KCl 3 M y tuvieron resistencias entre 0,5 y 3,0 megaohms. Una cámara de registro de plexiglass (volumen 200 \mul) se sometió constantemente a perfusión a una velocidad de 10 ml/minuto. La cámara de registro se conectó a tierra con un electrodo Ag/AgCl. Los datos se adquirieron y analizaron usando PCLAMP con un interfaz TL-1 (Axon Instruments, Foster City, CA). Se registró la corriente de membrana a un potencial de contención de -80 mV. La amplitud de corriente sensible a fármacos se determinó restando la corriente de contención a -80 mV de la corriente pico obtenida en presencia de fármaco. Los datos se filtraron a 30 Hz y se muestrearon a 16,6 Hz. Las relaciones corriente/voltaje (I/V) y los potenciales de inversión (E_{rev}) se determinaron usando una rampa de aceleración de lazo abierto de voltaje de 1-3 segundos por encima del intervalo de voltaje de -110 a +80 mV. Para las rampas de aceleración de lazo abierto, los datos se filtraron a 0,3-3 kHz y se muestrearon a 160 Hz. La corriente en disolución libre de fármacos se restó de la corriente en presencia de fármaco para obtener las relaciones de corriente sensible a fármacos/voltaje.

Los oocitos que expresan proteína GluCl Dros mostraron una corriente sensible a glutamato que se activa rápidamente y se desensibiliza rápidamente (Figura 4). La CE_{50} para glutamato fue de 30 \muM con un coeficiente de Hill de 1,3. El intervalo de desensibilización fue dependiente de la concentración de glutamato que llega a ser más rápida a concentraciones más altas de glutamato.

IVMPO_{4} también activó directamente corriente en oocitos que expresan GluCl de Dros (Figura 3). La activación de corriente con IVMPO_{4} fue irreversible durante hasta 10 minutos después de lavar IVMPO_{4} del baño. La corriente se activó al máximo con IVMPO_{4} 1 \muM, y con 10 nM se activó el 20-40% de la corriente máxima.

El Compuesto-1 insecticida (Figura 4) como se describe totalmente en la patente de los Estados Unidos 5.399.582 activa directamente también la corriente de membrana (Figura 3). La corriente obtenida con Compuesto-1 fue lentamente reversible, tardando hasta 10 minutos en volver totalmente a los niveles basales.

Se activó también reversiblemente GluCl Dros con el análogo de glutamato ibotenato (activación máxima con 100 \muM), y con el aminoácido aspartato relacionado (8% de la activación máxima con 1mM). Los oocitos inyectados con RNA GluCl Dros fueron insensibles a GABA, glicina, kainato, histamino, y ácido N-metil-D-aspártico probado a concentraciones de 1 mM o mayores. La corriente obtenida con IVMPO_{4} se bloqueó débilmente con el bloqueante de canal de cloruro con apertura y cierre regulados por ligando picrotoxina (bloqueo del 13% a 500 \muM).

Ejemplo 6 Clonación del cDNA de GluCl Dros en Vectores de Expresión de E. coli

La proteína GluCl Dros recombinante se produce en E. coli tras la transferencia del cartucho de expresión de GluCl en vectores de expresión de E. coli, incluyendo pero no limitados a, la serie pET (Novagen). Los vectores pET situaron la expresión de Dros GluCl bajo el control del promotor del bactereriófago T7 estrechamente regulado. Tras la transferencia de esta construcción dentro de un huésped E. coli la cual contiene una copia cromosómica del gen de la RNA polimerasa de T7 conducida mediante el promotor lac inducible, se indujo expresión de Dros GluCl cuando un sustrato lac apropiado (IPTG) se añada al cultivo. Los niveles de GluCl Dros expresados se determinaron mediante los ensayos descritos anteriormente.

El cDNA que codifica la fase de lectura abierta completa para GluCl Dros se insertó dentro del sitio NdeI de pET [16]11a. Las construcciones en la orientación positiva se identificaron mediante análisis de secuencia y se usaron para transformar la cepa huésped de expresión BL21. Se usaron después los transformantes para inocular cultivos para la producción de proteína GluCl Dros. Los cultivos se pueden cultivar en medios M9 o ZB, cuya formulación se conoce por aquellos expertos en la técnica. Después de cultivar hasta una DO_{600}= 1,5, se indujo expresión de GluCl Dros con IPTG 1 mM durante 3 horas a 37ºC.

Ejemplo 7 Expresión de GluCl Dros en Líneas Celulares de Mamíferos

El cDNA de GluCl de Dros se subclonó dentro de los vectores de expresión de mamíferos pMAMneo y pcDNA3. pMAMneo se digirió con la endonucleasa de restricción NheI y se trató con la enzima Klenow para rellenar el saliente 5'. El DNA se digirió después con SalI para crear un vector lineal con un extremo romo y un sitio SalI, y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternera para prevenir la autoligazón. El vector se purificó mediante gel en un gel de agarosa al 0,7%. Se digirió pDros GluCl con SmaI y SalI para eliminar el inserto del vector, y después corrió en un gel de agarosa al 0,7% para purificar el inserto. El inserto que contiene el cDNA se ligó al vector pMAMneo purificado y se seleccionaron y usaron los recombinantes para transfectar células L de mamíferos mediante precipitación con CaPO_{4}.

El pcDNA3 se digirió con NotI y se trató con enzima Klenow para rellenar el saliente 5'. El DNA se digirió después con BamHI para crear un vector lineal con un extremo romo y un sitio BamHI, y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternera para prevenir la autoligazón. Se digirió pDros GluCl con SalI y se trató con enzima Klenow para rellenar el saliente 5'. El DNA se digirió después con BamHI para crear un fragmento cDNA con un extremo romo y un sitio BamHI, compatible con el vector pcDNA3 vector. Tanto el vector como el inserto se purificaron mediante gel en un gel de agarosa al 0,7% y se ligaron después juntos. Los recombinantes se seleccionaron y usaron para transfectar células L de mamíferos mediante precipitación con CaPO_{4}.

Se seleccionaron clones celulares estables mediante crecimiento en presencia de G418. Los clones resistentes de G418 individual se aislaron y mostraron contener el gen GluCl Dros intacto. Los clones que contienen los cDNA de GluCl Dros se analizaron para expresión usando técnicas inmunológicas, tales como inmunoprecipitación, prueba de manchas de western, e inmunofluorescencia usando anticuerpos específicos para las proteínas GluCl. Se obtiene anticuerpo de conejos inoculados con péptidos que se sintetizan a partir de la secuencia de aminoácidos predicha a partir de las secuencias GluCl Dros. La expresión se analiza también usando técnicas electrofisiológicas de pinzamiento zonal de membrana, un ensayo de flujo aniónico, y ensayos de unión de ^{3}H-ivermectina y ^{3}H-glutamato.

Las células que expresan Cells GluCl Dros estable o transitoriamente, se usan para poner a prueba la expresión de canales de cloruro sensibles a avermectina, glutamato, Compuesto-1 y para actividad de unión a ligando. Estas células se usan para identificar y examinar otros compuestos por su capacidad para modular, inhibir o activar el canal de cloruro sensible a avermectina, glutamato, Compuesto-1 y para competir por la unión con derivados de avermectina, glutamato, Compuesto-1 radiactivos. Estas células se usan para identificar y examinar otros compuestos los cuales modulan la actividad de GluCl con un ensayo de flujo aniónico

Los cartuchos que contienen el CDNA de GluCl Dros en la orientación positiva con respecto al promotor se ligan en los sitios de restricción apropiados 3' del promotor y se identifican mediante mapeo y/o secuenciación de sitios de restricción. Estos vectores de expresión de cDNA se introducen en células huésped fibroblásticas por ejemplo COS-7 (ATCC# CRL1651), y CV-1 tat [Sackevitz y col., Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC# CRL6362)] mediante procedimientos estándar incluyendo pero no limitados a electroporación, o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrano, fostato de calcio). Las células transfectadas y los sobrenadantes de cultivos celulares se pueden recoger y analizar para la expresión de GluCl Dros como se describe en el presente documento.

Todos los vectores usados para expresión transitoria en mamíferos se pueden usar para establecer líneas celulares estables que expresan GluCl Dros. Las construcciones de cDNA de GluCl Dros inalteradas clonadas en vectores de expresión se esperan para programar células huésped para fabricar proteína GluCl Dros. Además, GluCl Dros se expresa extracelularmente como una proteína segregada que liga construcciones de cDNA GluCl Dros al DNA que codifica la secuencia señal de una proteína segregada. Las células huésped de transfección incluyen, pero no se limitan a, CV-1-P [Sackevitz y col., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wigler, y col., Cell 11: 223 (1977)], NS/0, y dHFr- CHO [Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].

La cotransfección de cualquier vector que contiene cDNA de GluCl Dros con un plásmido de selección de fármacos que incluyen, pero no se limitan a G418, aminoglicósido fosfotransferasa; higromicina, higromicina-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforibosil-transferasa, permitirá la selección de clones transfectados de forma estable. Los niveles de GluCl Dros se cuantificaron mediante los ensayos descritos en el presente documento.

Las construcciones de cDNA de GluCl están también ligadas dentro de vectores que contienen marcadores de resistencia a fármaco amplificables para la producción de clones de células de mamífero que sintetizan los niveles de GluCl Dros más altos posibles. Tras la introducción de estas construcciones en las células, los clones que contienen el plásmido se seleccionan con el agente apropiado, y el aislamiento de un clon que se sobreexpresa con un número de copias elevado de plásmidos se lleva a cabo mediante selección con dosis crecientes del agente.

La expresión de GluCl Dros recombinante se logra mediante transfección de cDNA de GluCl Dros de longitud total dentro de una célula huésped de mamífero.

Ejemplo 8 Clonación de cDNA de GluCl Dros dentro de un Vector de Expresión de Baculovirus para Expresión en Células de Insecto

Los vectores de baculovirus, los cuales se derivan del genoma del virus AcNPV, se diseñan proporcionando alto nivel de expresión de cDNA en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRL# 1711). Los baculovirus recombinantes que expresan cDNA GluCl Dros se producen mediante los siguientes procedimientos estándar (InVitrogen Maxbac Manual): las construcciones de cDNA GluCl Dros se ligaron en el gen de polihedrina en una diversidad de vectores de transfección de baculovirus, incluyendo el pAC360 y el vactor BlueBac (InVitrogen). Los baculovirus recombinantes se generan mediante recombinación homóloga tras la co-transfección del vector de transferencia de baculovirus y DNA genónico AcNPV linealizado [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] dentro de células Sf9. Los virus pAC360 recombinantes se identificaron mediante la ausencia de cuerpos de inclusión en células infectadas y se identificaron virus pBlueBac recombinantes sobre la base de expresión de \beta-galactosidasa (Summers, M. D. y Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nº. 1555). Tras la purificación de placa, la expresión de GluCl Dros se mide mediante los ensayos descritos en el presente documento.

El cDNA que codifica la fase de lectura abierta completa para GluCl de Dros se insertó en el sitio BamHI de pBlueBacII. Las construcciones en la orientación positiva se identificaron mediante análisis de secuencia y se usaron para transfectar células Sf9 en la presencia de AcNPV lineal de DNA de tipo suave.

Se encuentra GluCl Dros activo, auténtico, en el citoplasma de las células infectadas. El GluCl Dros activo se extrajo de células infectadas mediante lisis hipotónica o detergente.

Ejemplo 9 Clonación de cDNA de GluCl Dros dentro de un vector de expresión de levaduras

Se produce GluCl Dros recombinante en la levadura S. cerevisiae tras la inserción del cistrón de cDNA de GluCl Dros óptimo dentro de los vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de las proteínas heterólogas. En el caso de expresión intracelular, los vectores tales como EmBLyex4 o similares se ligaron al cistrón de GluCl Dros [Rinas, U. y col., Biotechnology 8: 543-545 (1990); Horowitz B. y col., J. Biol. Chem. 265: 4189-4192 (1989)]. Para la expresión extracelular, el cistrón de Dros GluCl se ligó dentro de vectores de expresión de levaduras los cuales fusionan una señal de secreción (un péptido de levadura o mamífero) al extremo NH_{2} de la proteína GluCl Dros [Jacobson, M. A., Gene 85: 511-516 (1989); Riett L. and Bellon N. Biochem. 28: 2941-2949 (1989)].

Estos vectores incluyen, pero no se limitan a pAVE1-6, los cuales fusionan la señal de seroalbúmina humana al cDNA expresado [Steep O. Biotechnology 8: 42-46 (1990)], y el vector pL8PL el cual fusiona la señal de lisozima humana al cDNA expresado [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728-2732)]. Además, GluCl Dros se expresa en levadura como una proteína de fusión conjugada a ubiquitina que utiliza el vector pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705-709 (1989), McDonnell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517-5523 (1989)]. Los niveles de GluCl Dros se determinan mediante los ensayos descritos en el presente documento.

Ejemplo 10 Purificación de Glu Dros Recombinante

La Glu Dros recombinantemente producida se puede purificar mediante cromatografía de afinidad por anticuerpo.

Las columnas de afinidad por anticuerpo de GluCl Dros se fabrican añadiendo los anticuerpos anti-GluCl Dros a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel el cual se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida de tal forma que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después al gen por medio de puentes de amida con el brazo separador. Los ésteres activados restantes se desactivaron después con HCl etanolamina 1 M (pH 8). La columna se lavó con agua seguida por HCl glicina 0,23 M (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,3) conjuntamente con agentes que solubilizan membrana apropiados tales como detergentes y los sobrenadantes de cultivos celulares o extractos celulares que contienen GluCl Dros solubilizada se hacen pasar lentamente a través de la columna. La columna se lava después con disolución salina tamponada con fosfato con detergentes hasta que la densidad óptica (A280) cae hasta la precedente, después la proteína se eluye con HCl glicina 0,23 M (pH 2,6) conjuntamente con detergentes. La proteína purificada GluCl Dros se dializa después frente a disolución salina tamponada con fosfato.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Cully, Doris F.

\hskip3,9cm

Arena, Joseph P.

\hskip3,9cm

Paress, Philip S.

\hskip3,9cm

Liu, Ken K.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DNA QUE CODIFICA CANALES DE CLORURO CON APERTURA Y

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CIERRE REGULADOS POR GLUTAMATO

\hfill

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Jody M. Giesser

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 126 East Lincoln Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rahway

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva Jersey

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 07065-0907

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: Patente en Publicación #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

REPRESENTANTE/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Giesser, Jody M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.838

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 19264 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (908) 594-3046

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (908) 594-4720

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGTNWSNT TYTGGTT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNCCDATCC ANACRTCDAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 3:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 152 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3958 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 456 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 6:

7

8

Claims (13)

1. Una molécula de DNA aislada y purificada que codifica una proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila la cual funciona como un canal aniónico con apertura y cierre regulados por glutamato en la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ.ID.Nº.: 6.

2. Una molécula de DNA purificada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de DNA comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ.ID.Nº.: 5.

3. Un vector de expresión que expresa una proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila en una célula huésped recombinante en la que dicho vector de expresión comprende la molécula de DNA de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una célula huéspeda la cual expresa una proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila en la que dicha célula huésped contiene el vector de expresión de la reivindicación 3.

5. La molécula de DNA purificada de reivindicación 1 o reivindicación 2 en la que la molécula de DNA es DNA genómico.

6. Un procedimiento para la expresión de una proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila, que comprende:

(a) transfectar el vector de expresión de la reivindicación 3 dentro de una célula huésped adecuada; y

(b) cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila a partir de dicho vector de expresión.

7. Una proteína, en forma sustancialmente pura la cual funciona como proteína de unión a avermectina y/o a glutamato de Drosophila y como un canal aniónico con apertura y cierre regulados por glutamato y comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ.ID.Nº.: 6.

8. Un anticuerpo monoespecífico inmunológicamente reactivo con proteína de unión a avermectina y/o glutamato de Drosophila en la que dicha proteína funciona como un canal aniónico con apertura y cierre regulados por glutamato y comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ.ID.Nº.: 6.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo bloquea la actividad del canal aniónico con apertura y cierre regulados por glutamato.

10. Un procedimiento de identificar compuestos que modulan actividad de proteína de unión a avermectina y/o glutamato, que comprende:

(a) combinar un modulador de actividad de proteína de unión a avermectina y/o glutamato de Drosophila con una proteína de unión a avermectina y/o glutamato recombinante expresada mediante el procedimiento de la reivindicación 6; y

(b) medir un efecto del modulador sobre la proteína.

11. El procedimiento de la Reivindicación 10, en el que el efecto del modulador sobre la proteína es la inhibición o unión incrementada de ligandos de canales aniónicos con apertura y cierre regulados por glutamato.

12. El procedimiento de la Reivindicación 10, en el que el efecto del modulador sobre la proteína es estimulación o inhibición del flujo aniónico medido por canales aniónicos con apertura y cierre regulados por glutamato.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el flujo aniónico es flujo de cloruro de membrana.