ES2251043T3 - Metodo de transcripcion in vitro para el rastreo de productos naturales y otras sustancias quimicas. - Google Patents
Metodo de transcripcion in vitro para el rastreo de productos naturales y otras sustancias quimicas.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO AUTOMATIZABLE IN VITRO PARA EL ANALISIS DE LA TRANSCRIPCION DE GENES VIRALES Y CELULARES, EL CUAL ES APROPIADO PARA LA BUSQUEDA MASIVA DE ESTRUCTURAS QUIMICAS PILOTO QUE INFLUYEN SELECTIVAMENTE EN LA ACTIVIDAD GENICA DE FORMA REPRESENTABLE RACIONAL Y ECONOMICA. EL PROCEDIMIENTO PARA LA TRANSCRIPCION IN VITRO SIN CELULAS DE UN MOLDE DE ADN, QUE CONTIENE UNA SECUENCIA DE ADN QUE SE PUEDE TRANSCRIBIR, QUE ESTA BAJO EL CONTROL DE AL MENOS UN ELEMENTO REGULADOR GENICO, SE CARACTERIZA PORQUE A) PARA LA TRANSCRIPCION SE UTILIZA UN EXTRACTO ENRIQUECIDO Y EVENTUALMENTE PURIFICADO DE NUCLEOS CELULARES, QUE EVENTUALMENTE SE PUEDE COMPLETAR CON FACTORES DE TRANSCRIPCION Y/O COFACTORES O SUSTITUIR PARCIAL O TOTALMENTE Y AL MENOS UN NUCLEOTIDO MARCADO, B) A CONTINUACION DE LA TRANSCRIPCION LAS PROTEINAS OBTENIDAS EN EL ENSAYO EVENTUALMENTE SE SEPARAN Y/O SE DEGRADAN, C) EL TRANSCRIPTO MARCADO SE UNE A UN SOPORTE SOLIDO, D) LOS NUCLEOTIDOS MARCADOS SOBRANTES SE ELIMINAN Y E) SE DETERMINA LA CANTIDAD DE TRANSCRIPTO MARCADO.
Description
Método de transcripción in vitro para el
rastreo de productos naturales y otras sustancias químicas.
La invención se refiere a un procedimiento
automatizable in vitro para el análisis de la transcripción
de genes virales y celulares, que es adecuado de un modo racional y
económicamente justificable para un rastreo masivo para el hallazgo
de estructuras químicas conductoras específicas que influyen
selectivamente sobre la actividad del gen.
El rastreo de sustancias naturales en cuanto a
sustancias constitutivas biológicamente activas experimentó un
nuevo auge, después de haberse demostrado que con el solo diseño
racional de sustancias activas no es posible ninguna búsqueda
eficaz de sustancias activas. Así, junto a genotecas químicas de
sustancias y genotecas combinatorias, se encuentran de nuevo en el
centro de interés extractos clásicos de sustancias naturales como
fuentes de sustancias. Esto se debe, ante todo, a la diversidad de
las sustancias contenidas en estos extractos. Con métodos
analíticos modernos se puede determinar que extractos de una
fermentación microbiana contienen aproximadamente 500 clases de
compuestos fuertemente diferentes desde un punto de vista
estructural. Con ello, son ampliamente superiores en relación con su
diversidad a las genotecas de sustancias químicas y
combinatorias.
Limitante del aprovechamiento farmacológico del
rico y hasta ahora ampliamente inexplorado potencial de las
sustancias naturales es el número de procedimientos convincentes y
compatibles con los que se pueden someter a ensayo sustancias
activas potenciales. En particular, se requieren procedimientos que
puedan emplearse para la identificación de sustancias activas
farmacológicas muy específicas, cuya aplicación está ligada con
efectos secundarios lo más escasos posibles.
El procedimiento que se describe en lo que sigue
se basa en un principio, en el que las sustancias son sometidas a
ensayo en cuanto a su potencial, de intervenir ya en la primera
etapa de la reacción de la información genética, en la regulación
de la transcripción de genes. Con un procedimiento de este tipo se
han de identificar sustancias que puedan influir en la
transcripción, directa o indirectamente, de forma positiva o
negativa.
El poder de la transcripción de un gen se
determina por los elementos reguladores de este gen, en particular
por el promotor, por reforzadores o silenciadores. La actividad de
los elementos reguladores del gen es inducida y convertida por
parte de factores de transcripción y co-factores.
Estos factores de transcripción pueden influir sobre la tasa de
transcripción de un gen tanto de forma negativa como también
positiva y, con ello, cooperan en el poder de la transcripción.
Entretanto, se identificaron una pluralidad de factores de
transcripción como importantes "interruptores moleculares" en
el transcurso de muchos procesos celulares, incluidos la
transducción de señales, el control del ciclo celular, la
diferenciación y la muerte controlada de la célula (apoptosis).
La mayoría de las señales recibidas por la
célula, que influyen en el poder de la transcripción de genes, son
"registradas" por proteínas de la transmembrana, son
conducidas de forma intracelular por parte de cadenas de la
transducción de señales y son convertidas por factores de
transcripción. Ejemplos de proteínas que reciben señales externas
son proteínas que unen AMPc, sensores para señales de crecimiento
(tales como el factor de respuesta del suero, SRF), receptores de
hormonas o factores de transcripción que participan en la expresión
de citoquinas, las denominadas proteínas STAT (del inglés signal
transducers and activators of transcription - transductores de
señales y activadores de la transcripción).
Entretanto es conocida toda una serie de
sustancias que influye directa o indirectamente sobre el poder de la
transcripción de genes. Sustancias de este tipo se emplean, entre
otros, como principios activos farmacológicos en medicamentos, a
pesar de que el efecto de estas sustancias no es a menudo
específico. Por ello, la ingestión de medicamentos de este tipo va
ligada a menudo también con efectos secundarios indeseados.
Por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades
inmunológicas se emplean medicamentos que contienen derivados de
ciclosporina y esteroides como principios activos. La ciclosporina
A forma un complejo con ciclofilina. Este inhibe a calcineurina,
una fosfatasa ubicuitaria que desfosforila a las proteínas en
diferentes vías del metabolismo. La calcineurina regula, por
ejemplo, la transposición de una subunidad del factor de
transcripción NFAT del citosol al núcleo celular (Liu, J. (1993)
Immunology Today 14, 290-295). NFAT (del inglés
nuclear factor of activated
T-cells- factor nuclear de células T activadas) participa en la activación de algunos genes inmunológicamente relevantes. La ciclosporina A (CsA) regula de forma indirecta, a través de la influencia de NFAT (factor nuclear de células T activadas) la expresión de estos genes. Sin embargo, dado que la ciclosporina A sólo regula de forma indirecta, a saber a través de la calcineurina ubicuitaria, la actividad de NFAT, la ciclosporina A actúa a través de otras vías metabólicas también de forma vasoconstrictora, así como nefrotóxica y neurotóxica. Si se conociera una sustancia activa farmacológica con la que el NFAT se pudiera inhibir de forma específica, posiblemente directa, entonces un medicamento que contuviera este principio activo provocaría, previsiblemente, menos efectos secundarios.
T-cells- factor nuclear de células T activadas) participa en la activación de algunos genes inmunológicamente relevantes. La ciclosporina A (CsA) regula de forma indirecta, a través de la influencia de NFAT (factor nuclear de células T activadas) la expresión de estos genes. Sin embargo, dado que la ciclosporina A sólo regula de forma indirecta, a saber a través de la calcineurina ubicuitaria, la actividad de NFAT, la ciclosporina A actúa a través de otras vías metabólicas también de forma vasoconstrictora, así como nefrotóxica y neurotóxica. Si se conociera una sustancia activa farmacológica con la que el NFAT se pudiera inhibir de forma específica, posiblemente directa, entonces un medicamento que contuviera este principio activo provocaría, previsiblemente, menos efectos secundarios.
También los glucocorticoides pertenecen a los
principios activos farmacológicos que, junto al efecto deseado,
están asociados también con fuertes efectos secundarios. Los
glucocorticoides se emplean desde hace muchos años para la terapia
estándar en el caso de alergias, reuma, inflamaciones y otras
enfermedades que han de atribuirse a un sistema inmune
suprarreactivo. Estos determinan, entre otros, la inhibición de la
activación del factor de transcripción específico del tipo de
célula NFkB (Scheinmann, R.I., Cogswell, P.C., Lofquist, A.K. y
Baldwin Jr., A.S. (1995) Science 270, 283-286;
Auphan, N., DiDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A. y Karin M.
(1995) Science 270, 286-290), estimulando la
formación de un inhibidor celular de NFkB, la proteína IkB. De
nuevo, IkB impide la transferencia de dímeros de NFkB activos al
núcleo celular y, por consiguiente, la activación de importantes
genes diana inmunológicos. La influencia de glucocorticoides sobre
la expresión del gen es, de manera similar al caso de CsA,
relativamente inespecífica, ya que los glucocorticoides no actúan
sólo sobre NFkB, sino también sobre otras proteínas.
Estos ejemplos ponen de manifiesto que existe una
gran demanda de sustancias activas farmacológicas que presenten un
perfil de acción lo más específico posible. Con el fin de encontrar
nuevas estructuras químicas conductoras con propiedades
correspondientes, han de someterse a ensayo una pluralidad de
sustancias en cuanto a su actividad específica.
A pesar de una dotación idéntica del gen se
expresan siempre sólo determinadas proteínas en función del tipo de
célula y/o de determinadas enfermedades o defectos, así como del
respectivo grado de desarrollo y diferenciación de las células
individuales. Como fundamento de esta individualidad de células
puede considerarse el repertorio específico de proteínas
reguladoras de genes, por ejemplo la dotación específica del tipo
de célula y del desarrollo con determinados factores de
transcripción y co-factores (proteínas accesorias)
que regulan la transcripción coordinada y controlada de distintos
genes.
Por lo tanto, sustancias activas farmacológicas
específicas deberían activar o inhibir de forma selectiva la
transcripción de genes patológicamente relevantes en células de un
tipo definido. Con el fin de identificar las sustancias activas de
este tipo, se requiere un procedimiento de transcripción en el que
se pueda medir, en condiciones definidas, el efecto de las
sustancias activas a ensayar en cuanto a la transcripción de genes
individuales, es decir en cuanto a las proteínas que participan en
la regulación de la transcripción y en cuanto a los elementos
reguladores de genes. Dado que deben someterse a ensayo una
pluralidad de sustancias activas potenciales, el procedimiento
debería, además de ello, poderse llevar a cabo de forma sencilla y
automatizable.
El primer procedimiento de transcripción exento
de células se describió por Weil et al. (Weil, P.A., Luse,
D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18,
469-484). En este caso, para la transcripción in
vitro se emplearon extractos enriquecidos a base de núcleos de
células, los denominados extractos S100 (Weil, P.A., Segall, J.,
Harris, B. Ng, S.Y., Roeder, R.G. (1979) J. Biol. Chem. 254,
6163-6173) y ARN-polimerasa II
purificada. Sin ARN-polimerasa II exógena, estos
extractos del núcleo, enriquecidos pero no purificados
ulteriormente, no eran aptos para la transcripción (Weil, P.A.,
Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18,
469-484; Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S.,
Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101,
582-598).
Partiendo de extractos del núcleo de este tipo se
desarrollaron seguidamente procedimientos con los que se podían
aislar factores de la transcripción a través de operaciones de
purificación de varias etapas. Entre otros, estos procedimientos
contienen etapas de purificación en las que los extractos del
núcleo son purificados por vía cromatográfica a través de materiales
que unen proteínas del núcleo, tales como por ejemplo a través de
columnas de fosfocelulosa. Dignam et al. han descrito por
primera vez, en el marco de este complejo procedimiento de varias
etapas, para una de las etapas de purificación el empleo de
P11-Systems^{R} adquirible en el comercio
(Whatman, Maidstone, Inglaterra) (Dignam, J.D., Martin, P.L.,
Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101,
582-598).
Los procedimientos de purificación de varias
etapas se han ido adaptando cada vez más, de modo que entretanto es
posible aislar a partir de los extractos de núcleos de células, a
través de complejos procedimientos, factores de transcripción
individuales. Además de ello, factores individuales o bien sus
subunidades se encuentran ahora también disponibles de forma
recombinante, tales como por ejemplo TFIIA, TFIIB, TFIIE\alpha,
TFIIE\beta y TFIIF (Zawel, L. y Reinberg, D. (1995) Annu Rev.
Biochem. 64, 533-561).
Por lo tanto, existen hoy en día ya sistemas de
transcripción que consisten en una mezcla de factores recombinantes
y purificados naturales. Sin embargo, hasta ahora, para un
procedimiento de rastreo con una elevada producción de muestras,
sistemas de transcripción de este tipo son técnicamente demasiado
complejos y demasiado caros. En otros sistemas de transcripción,
por ejemplo utilizando extractos de núcleos de células en lugar de
factores recombinantes o purificados, se manifiestan por el
contrario muchas reacciones secundarias. En extractos del núcleo
insuficientemente o no purificados (extractos toscos), sobre todo
los ácidos nucleicos y las proteínas fijadoras de ADN, por ejemplo
represores tales como por ejemplo histonas, actúan de forma
perturbadora sobre la transcripción in vitro. En el caso de
los ácidos nucleicos contenidos en extractos toscos, actúan de
forma perturbadora en particular secuencias de ADN que codifican
ARN-t's. Dado que los genes para
ARN-t's son transcritos con una intensidad
aproximadamente 100 veces mayor que los ARNm's, estas secuencias
codificadores de ARN-t conducen a un exceso de
transcritos inespecíficos. Los transcritos inespecíficos han de
separarse entonces sólo mediante complejas etapas de purificación,
antes de que se puedan detectar los transcritos específicos.
Con el fin de poder determinar cuantitativamente
los resultados de transcripciones in vitro, se desarrollaron
vectores en los que la secuencia de ADN a transcribir no contenía
ninguna base guanina (una denominada secuencia exenta de G o casete
exenta de G), uniéndose a la secuencia exenta de G eventualmente un
segmento de secuencia que contiene mucha guanina. Mediante el
empleo de estos vectores, es posible llevar a cabo la transcripción
en ausencia de GTP. Con ello, se transcriben sólo secuencias
exentas de G, pero no otras secuencias con contenido en G. De esta
manera se obtienen transcritos específicos que, además de ello,
presentan una longitud (casi) unitaria. Sawadogo y Roeder han
descrito por primera vez el empleo de un vector para
transcripciones, en el que una secuencia de 400 nucleótidos de
longitud se encuentra presente bajo el control de promotor ML
(tardío principal de adenovirus). Con este vector se obtienen
transcritos con una longitud de aproximadamente 400 nucleótidos
(Sawadogo, M. y Roeder, R.G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
4394-4398).
Con ayuda de estos vectores se obtuvieron un
número claramente menor de transcritos inespecíficos, motivo por el
cual desde entonces se ha descrito de múltiples maneras el empleo
de estos vectores en reacciones de transcripción (Goppelt, A.,
Stelzer, G., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15,
3105-3115; Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich,
F., Meisterernst, M. (1994) Cell 78, 525-534;
Meisterernst, M., Roy, A.L., Lieu, H.M. y Roeder, R.G. (1991) Cell
66, 981-993).
No obstante, hasta ahora se utilizaron
exclusivamente vectores en los que lasecuencia exenta de G no
sobrepasa una longitud de 400 nucleótidos.
Con el fin de determinar cuantitativamente y
cualitativamente los resultados de los procedimientos de
transcripción hasta ahora descritos, la transcripción se lleva a
cabo en presencia de nucleótidos radiactivamente marcados, y los
transcritos radiactivamente marcados se separan sobre un gel después
de fenolización y precipitación. De este modo, se separan del
transcrito específico no sólo transcritos falsamente iniciados o
falsamente terminados, así como ácidos nucleicos inespecíficamente
marcados (por ejemplo transcritos provocados por el plásmido o
ARN-t's), sino también nucleótidos en exceso. La
relación de las actividades de nucleótidos radiactivamente marcados
en exceso a transcritos radiactivamente marcados asciende, en los
casos desfavorables, a aproximadamente 10.000:1, de modo que los
transcritos marcados deben enriquecerse en aproximadamente 10.000
veces. Este enriquecimiento del transcrito específico se consigue
mediante las etapas de precipitación y la separación
electroforética. Sin embargo, estas etapas de enriquecimiento no
son adecuadas para un rastreo masivo automatizado, por lo que deben
desarrollarse procedimientos alternativos con el fin de poder
separar nucleótidos marcados en una medida tal que permita todavía
una valoración cuantitativa de los resultados de la
transcripción.
La transcripción también se puede vigilar
mediante la aplicación de la solución de reacción sobre una
membrana, por ejemplo una membrana de DEAE-celulosa.
Los transcritos radiactivamente marcados pueden entonces detectarse
directamente sobre la membrana. No obstante, la utilización de
membranas se empleó con éxito hasta ahora sólo para la detección de
transcritos de transcripciones in vitro que fueron llevadas
a cabo en presencia de ARN-polimerasas II
purificadas (Roeder, R.G. (1974) J. Biol. Chem. 249,
241-248) o factores de transcripción basales
purificados (Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Horikoshi, M., Roeder. R.G.
(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9163-9167). No
existe ningún tipo de indicio de que los transcritos que se
obtienen con ayuda de extractos procedentes de núcleos de células
enriquecidos y eventualmente prepurificados, se pudieran detectar
de este modo.
En el documento WO 96/26959 ya se describió el
aprovechamiento de la transcripción de genes para un rastreo de
sustancias activas. En este documento se dan a conocer las
secuencias de NFAT's humanos (hNFAT) y su posible utilización en
ensayos de transcripción que, de nuevo, deben emplearse para el
rastreo masivo posiblemente automatizado de sustancias naturales. En
contraposición al procedimiento de transcripción descrito en lo que
sigue, en el caso de este ensayo de transcripción se trata de un
ensayo de fijación puro en el que no se lleva a cabo ninguna
reacción de transcripción.
Otro ensayo de fijación que puede ser utilizado
para el rastreo de sustancias que pueden inhibir la fijación de
factores de transcripción a ácidos nucleicos se describió en el
documento US 5.563.036. También en el caso de este ensayo no se
lleva a cabo ninguna transcripción.
Otro ejemplo para un ensayo de fijación, que
asimismo debe emplearse para el hallazgo de sustancias que pueden
inhibir la fijación de, en este caso, una proteína asociada al
receptor del factor de necrosis tumoral (TRADD) a determinadas
secuencias de ADN, se describe en el documente US 5.563.039.
Una misión de la presente invención es poner a
disposición un procedimiento a realizar de forma sencilla y
reproducible, universalmente aplicable, adecuado en particular para
un rastreo masivo para el análisis de la transcripción de genes,
por ejemplo de genes celulares y virales en determinadas condiciones
de la reacción.
La invención se refiere a un procedimiento para
la identificación de sustancias farmacológicamente activas que
abarca la transcripción in vitro exenta de células de un
molde de ADN que contiene una secuencia de ADN a transcribir que se
encuentra bajo el control de uno o varios elementos reguladores del
gen, en donde el procedimiento abarca:
a) la mezcla con al menos un nucleótido marcado,
un extracto de núcleo y uno a ensayar y realización de la reacción
de transcripción,
b) a continuación de la transcripción, se separan
y/o degradan las proteínas contenidas en la tanda,
c) el transcrito marcado se fija a un soporte
sólido,
d) los nucleótidos marcados en exceso se separan
y
e) se determina la cantidad de transcrito marcado
con relación a una tanda paralela, lo cual se lleva a cabo en
ausencia de la sustancia activa a ensayar.
El molde de ADN utilizado para el procedimiento
de acuerdo con la invención contiene lugares de corte singulares
para las endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, SacI, KpnI,
SacII, SwaI y SmaI, en donde cinco lugares de unión para la
proteína Gal 4 de levadura y la caja "TATA" del receptor de
células T humano V\beta 8.1 están incorporados por clonación
entre los lugares de corte por restricción para SacII y BamHI, la
región de INR (iniciador) del promotor ML (promotor tardío
principal de adenovirus) está incorporada por clonación entre los
lugares de corte por restricción para BamHI y SwaI, y una secuencia
exenta de G con una longitud de aproximadamente 800 nucleótidos
(pares de bases) está incorporada por clonación entre los lugares
de corte por restricción SwaI y SmaI en el plásmido pUC19.
El procedimiento incluye la reacción de
transcripción (a) propiamente dicha, la separación del transcrito
específico (b, c, d) y la detección del transcrito específico
(e).
El procedimiento incluye formas de realización
particulares para la separación del transcrito específico, siendo
la secuencia de b, c y d mencionada sólo una posibilidad. La
secuencia de la separación del transcrito específico también puede
ser eventualmente c, d, b o d, b, c.
Una característica particular del procedimiento
es que todas las etapas del procedimiento, es decir la reacción de
transcripción (transcripción) propiamente dicha, así como la
separación y detección del transcrito específico son
automatizables, siendo posible una determinación sencilla y fiable
de la cantidad del transcrito específico obtenido bajo las
respectivas condiciones de la reacción y, con ello, de la tasa de
transcripción.
La tasa de transcripción indica la frecuencia en
la que es transcrito un determinado gen por unidad de tiempo o, en
el procedimiento de transcripción descrito, la frecuencia en la que
es transcrita la secuencia de ADN a transcribir por unidad de
tiempo. Con el fin de determinar la tasa de transcripción, se
determina la cantidad de transcrito radiactivamente marcado que se
obtiene después de una unidad de tiempo definida.
El procedimiento incluye el que la transcripción
se lleve a cabo en presencia de activadores y/o inhibidores, es
decir en presencia de componentes que influyen de forma positiva o
negativa sobre la transcripción. De acuerdo con la invención, para
la transcripción basal se emplea un extracto de núcleos de células
capaz de transcribirse. Este sistema de transcripción basal puede
completarse mediante activadores y/o inhibidores. En comparación con
la transcripción basal, una inhibición de la transcripción conduce
a una tasa de transcripción reducida y, con ello, a una cantidad
menor que transcrito específico/unidad de tiempo, mientras que una
activación de la transcripción conduce a una tasa de transcripción
incrementada y, con ello, a una mayor cantidad de transcrito
específico/unidad de tiempo.
La transcripción de genes se puede dividir en
varias etapas - la formación del complejo de
pre-iniciación (PIC), la activación del PIC, la
iniciación, "aclaramiento del promotor", alargamiento y
terminación. Para la iniciación de la transcripción en eucariotas
son necesarias ARN-polimerasas (para la
transcripción de genes codificadores de proteínas,
ARN-polimerasa II) y proteínas fijadoras de ADN que
posibilitan la interacción específica de la
ARN-polimerasa II con el ADN. Estas proteínas
fijadoras de ADN se denominan factores de transcripción,
participando los factores de transcripción generales en esencia en
la interacción con el promotor, mientras que los factores de
transcripción específicos inducen la actividad de elementos
reguladores de genes que están localizados más abajo o más arriba
del promotor.
En la transcripción de genes eucariotas
participan los factores de transcripción generales TFIIA, TFIIB,
TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH. Una fracción de proteína capaz de
transcribirse, que es la responsable de una escasa actividad basal
de genes, contiene, en función del promotor, la totalidad o la
mayoría de estos factores de transcripción generales y
ARN-polimerasa II (ARN Pol II). Una actividad basal
del promotor ML se consigue, por ejemplo, por parte de TBP
(subunidad de TFIID que fija TATA), TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH y ARN
Pol II. Las fracciones de proteínas que provocan una actividad
basal de este tipo se denominan sistemas de transcripción basales.
Este concepto se utiliza en el sentido de la invención también para
un extracto de núcleos de células enriquecido y eventualmente
purificado. Una transcripción, que se lleva a cabo con ayuda de un
sistema de transcripción basal, se denomina una transcripción
basal. Con el fin de llevar a cabo una transcripción in vitro
exenta de células, se requiere al menos un sistema de transcripción
basal, nucleótidos y un molde de ADN a transcribir.
Para la transcripción activada se requieren,
además de los factores de transcripción generales o de un sistema
de transcripción basal, factores de transcripción y
co-factores específicos (proteínas accesorias)
(Kaiser, K., Stelzer, G. y Meisterernst, M. (1995) EMBO J. 14,
3520-3527). Los factores de transcripción
específicos están en condiciones de reforzar en un múltiplo la
transcripción basal sólo escasa de determinados genes y de controlar
la periodicidad de la iniciación de la transcripción. De este modo,
las proteínas fijadoras de ADN son responsables de forma
determinante de la frecuencia con la que se transcribe un gen (tasa
de transcripción). En este proceso de regulación participan también
otras proteínas que no se fijan directamente al ADN, sino que
influyen, a través de interacciones
proteína-proteína, sobre las actividades de
factores de transcripción o ARN-polimerasas II,
tales como por ejemplo co-factores.
El procedimiento incluye el que para la
transcripción basal se emplee un extracto enriquecido a base de
núcleos de células (extracto del núcleo de células o extracto del
núcleo). En relación con este parámetro, el procedimiento es
universalmente aplicable; esto es válido tanto para la célula
utilizada, como también para la especie eucariótica utilizada. Por
ejemplo, se pueden obtener, por ejemplo, extractos de núcleos
enriquecidos a partir de líneas de células derivadas de células
humanas o animales. En particular, son adecuadas células que pueden
cultivarse y multiplicarse en fermentadores a gran escala, tales
como por ejemplo células HeLa. Además, pueden utilizarse extractos
a base de los núcleos de células de tipos de células elegidos, en
particular de aquellos que se distinguen, por ejemplo, por su
dotación con factores de transcripción y/o
co-factores específica del tipo de célula,
específica del ciclo celular, específica del desarrollo, específica
de la diferenciación o específica de la enfermedad. En particular,
se pueden utilizar tipos de células a los que se les otorga un
papel central en la génesis de enfermedades, tales como por ejemplo
células del sistema inmune (por ejemplo células B y T).
Una particular ventaja del procedimiento es que
también se pueden aislar y utilizar extractos de núcleo procedentes
de tejidos o células tumorales. Esto es particularmente ventajoso
en los casos en los que no se encuentra disponible ninguna línea de
células adecuada. En particular, extractos de núcleo pueden
aislarse a partir de tejidos de fácil acceso, tales como a partir de
cordones umbilicales animales o humanos, productos de desecho de
trasplantes animales o humanos, material de biopsia animal o humano
o tejido tumoral animal o humano (por ejemplo tejido separado por
intervención quirúrgica), placenta animal o humana, y emplearse
para el procedimiento.
El procedimiento comprende el que para el
enriquecimiento de las proteínas del núcleo procedentes de los
núcleos de células frescas o profundamente congeladas o de núcleos
de células frescos o profundamente congelados, los extractos del
núcleo enriquecidos se preparan según procedimientos conocidos, por
ejemplo según un método que se describió por Dignam et al.
(Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983)
Methods in Enzymology 101, 582-598; Digman, J.D.,
Lebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Res. 11,
1475-1489). Una forma de realización particular del
procedimiento es que para la preparación de un extracto del núcleo
enriquecido se utilizan procedimientos que incluyen una
homogeneización de los núcleos de células con subsiguiente diálisis
del producto homogeneizado.
Una forma de realización importante del
procedimiento incluye que el extracto enriquecido procedente de
núcleos de células sea purificado por una o varias etapas de
purificación, en particular etapas de purificación sencillas, en tal
medida que sea capaz de transcribirse, es decir que en la
realización del procedimiento se obtenga un transcrito específico.
Por ejemplo, el extracto se puede purificar por cromatografía. La
purificación se puede efectuar, por ejemplo, a través de materiales
fijadores de proteínas del núcleo, tales como fosfocelulosa,
DEAE-celulosa o también
heparina-Sepharose. Alternativamente, para la
purificación se pueden emplear columnas de intercambiadores de
cationes y/o de aniones o columnas de afinidad específicas, por
ejemplo aquellas en las que al material de la columna están fijados
anticuerpos u oligonucleótidos.
Una forma de realización particular del
procedimiento incluye el que se purifique un extracto del núcleo
enriquecido a través de una columna de fosfocelulosa, en particular
una columna P11® (sistema P11®, Whatman, Maidstone, Inglaterra).
Otra forma de realización particular del procedimiento incluye que
el extracto del núcleo enriquecido sea purificado a través de una
sola etapa, por ejemplo a través de una única columna P11® o una
única columna con material de la columna que contiene
DEAE-celulosa o
heparina-Sepharose.
En una forma de realización especial de la
purificación con P11®, el extracto del núcleo se fija a la
fosfocelulosa primeramente en presencia de un tampón que, junto a
otros componentes, contiene KCl 0,05 a 0,15 M, preferiblemente 0,1
M. Mediante el lavado de la columna cargada con tampones adecuados,
preferiblemente con un tampón que contiene KCl 0,05 a 0,15 M,
preferiblemente KCl 0,1 M, los componentes inespecíficos y
perturbadores son arrastrados por lavado de la columna. Los
componentes capaces de transcribirse se eluyen de la columna
preferiblemente en dos fracciones, utilizándose primeramente un
tampón que contiene, por ejemplo, KCl 0,4 a 0,6 M, preferiblemente
KCl 0,5 M y, a continuación, un tampón que contiene por ejemplo KCl
0,7 a 1 M, preferiblemente KCl 0,85 M.
Una forma de realización especial del
procedimiento es que la transcripción se lleva a cabo con ayuda de
un extracto del núcleo enriquecido y eventualmente purificado en
presencia de ARN polimerasa II exógena. Como
ARN-polimerasa puede utilizarse preferiblemente
ARN-polimerasa eucariótica del tipo II
(ARN-polimerasa II), en particular
ARN-polimerasa II animal o humana.
Otra forma de realización del procedimiento
incluye el que un extracto del núcleo enriquecido y eventualmente
purificado pueda ser completado o bien reemplazado total o
parcialmente mediante la adición de proteínas, por ejemplo de
factores de transcripción y/o co-factores (proteínas
accesorias). Estas proteínas se pueden purificar por ejemplo a
partir de los núcleos de células o preparar de forma
recombinante.
Una forma de realización especial del
procedimiento es que el extracto del núcleo sólo se completa
mediante un factor de transcripción y/o co-factor.
En otro extremo, el procedimiento incluye el que una fracción de
proteína capaz de transcribirse (sistema de transcripción basal) se
constituya totalmente a partir de factores de transcripción y/o
co-factores purificados o preparados de forma
recombinante, así como ARN-polimerasas.
Como factores de transcripción se emplean, por
ejemplo, factores de transcripción generales y/o específicos o
parte de los mismos, eventualmente en forma de proteínas de
fusión.
En calidad de factores de transcripción generales
se pueden emplear, por ejemplo TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF,
TFIIH, TFIIJ y TBP (proteína fijadora de TATA).
Como factores de transcripción específicos se
pueden utilizar, por ejemplo, NFkB, AP1, NFAT, GATA3, TCD/Lef, CBF,
Tat, miembros de la familia fos/jun, de la familia Oct
(Oct-1, Oct-2) y, con ello, factores
interactuantes, tales como por ejemplo Bobl, OCA-B
u OBF, de la familia Ets, activadores de la familia de las
proteínas ARF/CREB, receptores nucleares, tales como por ejemplo
PPAR\alpha o las correspondientes isoformas específicas del tipo
de célula de factores de transcripción (Kel, O.V., Romaschenko,
A.G., Kel, A.E., Wingender, E., Kolachenov, N.A., (1995) Nucl.
Acids. Res. 20, 3-16).
Otros ejemplos de factores de transcripción
específicos son:
- 1.
- Protooncogenes, por ejemplo isoformas jun, fos, ets, myc, bc, y erb,
- 2.
- receptores de hormonas, por ejemplo (erb), receptores de glucocorticoides, estrógenos, ácido retinólico, vitamina D o
- 3.
- supresores de tumores, por ejemplo p53, NF1, WT1, RB,
- 4.
- agentes patógenos virales, por ejemplo proteínas del virus Herpes Simplex, tales como por ejemplo VP16 o ICP4, del papilomavirus, tales como por ejemplo E1, E2, E6 o E7, del adenovirus, tal como por ejemplo E1A o E2A, de los citomegalovirus, tales como por ejemplo IE86, del virus de la hepatitis B, tal como por ejemplo pX, del virus VIH, tal como por ejemplo Tat o Rev,
- 5.
- factores específicos del tipo de célula y/o de tejido, tales como por ejemplo factores miógenos, Pit-1, Oct-2, Pu-1, OCA-B o HNF's, o factores específicos de células T, tales como Ets-1, GATA3, TCF/Lef, CBF,
- 6.
- proteínas STAT (transductores de señales y activadores de la transcripción), por ejemplo factores de transcripción activados por citoquinas, tales como por ejemplo, IL-1 Stat, IL-2 Stat, IL-3 Stat, IL-4, IL-5 Stat, IL-6 Stat, IL-7 Stat, IL-8 Stat, IL-9 Stat, IL-10 Stat, IL-11 Stat, IL-12 Stat ("Stat" significa proteína que induce el efecto) o
- 7.
- proteínas que participan en cascadas de transducción de segundo mensajero, por ejemplo CREB o abl,
- 8.
- receptores nucleares, por ejemplo receptores de "segundo mensajero" (por ejemplo receptores de AMPc o IP_{3}, receptores dependientes de Ca^{2+}), receptores de ácido retinólico, receptores de glucocorticoides o receptores de esteroides,
- 9.
- activadores o inhibidores específicos de genes, por ejemplo activadores específicos del gen IL-2, tales como NFkB, AP1 o NFAT,
- 10.
- factores de transcripción específicos del desarrollo, específicos del ciclo celular y expresados en función de la diferenciación.
Los co-factores participan,
directa o indirectamente, en la transcripción a través de
interacciones de proteína-proteína y/o interacciones
de proteína-ADN. Algunos
co-factores ya están presentes en un sistema de
transcripción basal y otros sólo en un sistema de transcripción
activado. Los co-factores pueden influir positiva o
negativamente sobre la tasa de transcripción. Como
co-factores se pueden emplear, por ejemplo
- -
- factores asociados a TBP (TAF's), por ejemplo TAF_{II}30, TAF_{II}40, TAF_{II}55, TAF_{II}60, TAF_{II}110, TAF_{II}150, TAF_{II}250 (Verrijzer, C.P. y Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sci. 21, 338-342; los TAF's forman, junto con TBP, el complejo TFIID, pudiendo variar considerablemente la composición de los TFA's en TFIID);
- -
- mediadores, es decir co-factores que están asociados con ARN-polimerasa II, tales como por ejemplo proteínas que interactúan con CTD (dominio carboxiterminal) y/o represores y/o activadores de ARN-polimerasa II, en particular RAP 30, RAP 74, RAP 38, SR7 (supresor de la ARN-polimerasa B, SRB), ciclinas o quinasas (por ejemplo CKII);
- -
- co-factores generales;
- -
- co-factores que están contenidos en la fracción USA (actividad estimuladora aguas arriba) (Kaiser, K. y Meisterernst, M. (1996) Trends Biochem. Sci., 342-345);
- -
- co-factores positivos, por ejemplo PC1, PC2, PC4 (p15), PC5, PC6, Dr2 (represor D 2)/PC3, ACF (co-factor activante), CofA (co-factor A), proteínas HMG (proteínas del grupo de elevada movilidad asociadas a cromatina);
- -
- co-factores negativos, por ejemplo NC1, NC2 y/o
- -
- co-factores específicos.
El procedimiento incluye el que para la
transcripción se emplee un molde de ADN que contenga uno o varios
elementos reguladores de genes y una secuencia de ADN a
transcribir.
Un objeto de la invención es un molde de ADN que
puede ser empleado en el procedimiento descrito para la
transcripción exenta de células in vitro. El molde de ADN
contiene uno o varios elementos reguladores de genes y una
secuencia de ADN a transcribir.
Además de ello, el molde de ADN de acuerdo con la
invención contiene lugares de corte singulares para las
endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, SwaI,
SmaI, cinco lugares de unión para la proteína Gal 4 de levadura, la
caja "TATA" del receptor de células T humano V\beta 8.1 entre
los lugares de corte por restricción para SacII y BamHI, la región
de INR (iniciador) del promotor ML (promotor tardío principal de
adenovirus) entre los lugares de corte por restricción BamHI y
SwaI, y una secuencia exenta de G con una longitud de
aproximadamente 800 nucleótidos (pares de bases) en el plásmido
pUC19.
Un elemento regulador de genes puede ser un
elemento regulador de genes conocido o a investigar o una
construcción a base de uno o varios elementos reguladores de genes
conocidos y uno o varios elementos reguladores de genes a
investigar.
Un elemento regulador de genes puede contener
secuencias de ADN arbitrarias que participan en la regulación del
gen o segmentos de las mismas. En relación con el elemento
regulador de genes, el molde de ADN o el procedimiento es universal,
procediendo el elemento regulador de genes preferiblemente de un
gen eucariótico o bien correspondiendo a éste. El elemento
regulador de genes puede ser un elemento regulador de genes celular
o viral o un elemento regulador de genes sintético.
Preferiblemente, un elemento regulador de genes contiene, entre
otros, secuencias de ADN que representan los sitios de unión para
proteínas fijadoras de ADN (secuencias de ADN fijadoras de
proteínas, por ejemplo sitios de unión para factores de
transcripción o proteínas de fusión). Un elemento regulador de
genes puede contener un promotor (secuencia de promotor) y/o uno o
varios reforzadores (secuencia de reforzador) y/o uno o varios
silenciadores (secuencia de silenciador). Preferiblemente, el
elemento regulador de genes puede contener secuencias de promotor,
reforzador y/o silenciador o partes de las mismas dispuestas de
forma natural y/o artificial.
Un promotor puede contener una caja "TATA"
y/o una región de iniciación (INR) (punto de iniciación de la
transcripción). El promotor puede contener una caja "GC" y/o
una caja "GAAT".
De acuerdo con la invención, el elemento
regulador del gen del molde de ADN es un promotor modelo.
Un promotor modelo contiene un promotor y
secuencias de ADN fijadoras de proteínas adicionales y,
eventualmente, otros elementos reguladores de genes.
Preferiblemente, el promotor modelo contiene una caja "TATA" y
una región de iniciador. De acuerdo con la presente invención, el
promotor modelo contiene la caja "TATA" del receptor de
células T humano V\beta8.1 y la región de iniciador del promotor
ML. Estos dos elementos promotores basales posibilitan una
transcripción basal in vitro. Además de ello, este promotor
modelo especial tiene 5 puntos de unión para la proteína de
levadura Gal4. El promotor modelo puede modificarse arbitrariamente,
por ejemplo con ayuda de métodos de biología molecular, por ejemplo
completando el promotor modelo, por ejemplo, con un elemento
regulador de genes a investigar y/o reemplazando zonas individuales
del promotor modelo por otros elementos reguladores de genes, por
ejemplo un elemento regulador de genes a investigar.
Con el fin de posibilitar una manipulación del
promotor modelo, éste contiene, de acuerdo con la invención,
lugares de corte singulares para endonucleasas de restricción, en
donde al menos un punto de corte singular para una endonucleasa de
restricción está localizado entre la caja "TATA" y los puntos
de unión Gal4.
En el promotor modelo pueden integrarse,
adicionalmente a las secuencias fijadoras de proteína ya presentes
(por ejemplo adicionalmente a las secuencias de Gal4) otras
secuencias fijadoras de proteínas. Esto es particularmente
interesante cuando, por ejemplo, adicionalmente a un sistema de
transcripción ya investigado, se añaden otros factores de
transcripción a investigar, por ejemplo específicos.
El procedimiento incluye el que en combinación
con el promotor modelo también se puedan emplear proteínas de fusión
en calidad de activadores y/o inhibidores de la transcripción.
Proteínas de fusión de este tipo pueden consistir, por ejemplo, en
un dominio fijador de ADN, tal como por ejemplo los dominios
fijadores de ADN de la proteína de levadura Gal4 y de un dominio de
activación específico, tal como por ejemplo de los dominios de
activación del activador VP16 de VSH. Con ayuda de proteínas de
fusión pueden analizarse abiertamente activadores y/o inhibidores
definidos o bien partes de los mismos, por ejemplo sus dominios de
activación o inhibición con relación a un elemento regulador de
genes a investigar. Por ejemplo, esto es posible cuando los
dominios fijadores de ADN proceden de una proteína fijadora de ADN
que no está contenida en el sistema de transcripción utilizado (por
ejemplo el extracto del núcleo enriquecido). Por ejemplo, el
(dominio del) activador de un factor de transcripción, que está
presente como proteína de fusión con un dominio de fijación de
levadura Gal4, puede analizarse abiertamente cuando en el
procedimiento se emplean extractos de núcleo enriquecidos
procedentes de células de mamíferos, dado que los extractos del
núcleo procedentes de células de mamíferos no contienen Gal4.
Como elementos reguladores de genes y elementos
reguladores de genes a investigar pueden utilizarse elementos
reguladores de genes humanos y/o animales y/o virales definidos, en
particular los elementos reguladores de genes patológicamente
interesantes. Ejemplos de ellos son los elementos reguladores de
genes de los genes de moléculas de adhesión, factores de
crecimiento, fosfodiesterasas, fosfatasas, quinasas, ATPasas,
receptores de membrana, receptores segundo mensajero, receptores de
hormonas, por ejemplo receptores de esteroides, metaloproteasas,
inmunofilinas, NO-sintasas,
5-lipoxigenasas o dianas inmunológicas, tales como
los elementos reguladores de genes de citoquinas, por ejemplo de
interleuquinas, tales como los promotores de genes expresados de
forma específica de células T o B, por ejemplo del receptor CD4,
TCR o BCR (receptores de células T o B), tales como los promotores
de genes específicos de linfoides, por ejemplo de TNF (factor de
necrosis tumoral) o tales como los elementos reguladores de genes
de retrovirus específicos de células T, por ejemplo de
HTLV-1 o VIH-1.
Una ventaja particular del procedimiento o del
promotor modelo es que como elementos reguladores de genes se pueden
utilizar tanto promotores que contienen una caja "TATA", tales
como por ejemplo el promotor del gen que codifica la
interleuquina-2 (IL-2), como también
promotores que no contienen ninguna caja "TATA", tales como
por ejemplo el promotor del gen que codifica la cadena \beta del
receptor de células T. Por ejemplo, promotores que no contienen
ninguna caja "TATA" se pueden integrar en el promotor modelo o
en el plásmido informador universal pGS100 y emplear para la
transcripción.
La secuencia de ADN a transcribir se caracteriza
porque en esta secuencia no están contenidas una o varias
nucleobases. Preferiblemente, la secuencia de ADN a transcribir no
contiene, a elección, guanina o citosina o timina, es decir la
secuencia está exenta de G, exenta de C o exenta de T. Además, la
secuencia también puede no contener varias nucleobases, tales como
por ejemplo guanina y timina o guanina y citosina o citosina y
timina.
En particular se utilizan secuencias exentas de
G, exentas de T o exentas de C en las que la secuencia exenta de G,
exenta de T o exenta de C presenta una longitud de aproximadamente
800 nucleótidos.
El molde de ADN puede ser una secuencia de ADN
lineal o circular, por ejemplo el molde de ADN puede ser una
secuencia lineal preparada en una reacción en cadena con polimerasa
o puede ser un plásmido.
Una forma de realización es que el molde de ADN
es un plásmido y está constituido a partir de un vector completo o
una parte del mismo, un promotor modelo y una secuencia de ADN a
transcribir que, por ejemplo, está exenta de G, exenta de T o
exenta de C.
Es objeto de la invención un plásmido informador
universalmente empleable (plásmido informador universal). El
plásmido informador universal contiene lugares de corte singulares
para las endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, SacI, KpnI,
SacII, BamHI, SwaI, una parte del plásmido pUC19, cinco puntos de
unión para la proteína de levadura Gal4, la caja "TATA" del
receptor de células T humano V\beta8.1 entre los puntos de corte
de restricción para SacII y BamHI, la región INR (iniciador) del
promotor ML (promotor tardío principal de adenovirus) entre los
puntos de corte de restricción BamHI y SwaI y una secuencia exenta
de G con una longitud de aproximadamente 800 nucleótidos (pares de
bases). El promotor modelo en el plásmido informador universal es un
promotor sintético que contiene 5 puntos de unión de levadura Gal4,
los lugares de los puntos de corte singulares para PstI, EcoRI,
SacI, KpnI, SacII, BamHI y SwaI, la caja "TATA" del receptor
de célula T humano V\beta8.1 y la INR del promotor ML. Elementos
reguladores de genes a investigar arbitrarios pueden integrarse en
esta región del promotor. Partes del promotor modelo pueden
separarse y reemplazarse por elementos reguladores de genes a
investigar.
Una forma de realización del plásmido informador
universal se denomina pGS100 (figura 2).
Una forma de realización del plásmido informador
universal pGS100 se caracteriza porque el promotor sintético se
encuentra en la zona de la secuencia entre las posiciones de
nucleótidos 2168 y 2337. La zona de iniciador del promotor
adenovírico "tardío principal" (ML) se encuentra en las
posiciones de nucleótidos 2322 a 2337, y la zona con la caja TATA
del promotor receptor de células T humano V\beta8.1 en las
posiciones de nucleótidos 2289 a 2316. Los cinco puntos de unión
para la proteína de levadura Gal4 se encuentran entre las posiciones
de nucleótidos
2168 a 2260.
2168 a 2260.
Otra forma de realización del plásmido de
información universal pGS100 viene dada por la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO. 1) en la Tabla 1.
Otra forma de realización del plásmido informador
universal pGS100 se depositó en la DSMZ-Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg
1b, D-38124 Braunschweig bajo el número DSM 11450 de
acuerdo con las directrices del Tratado de Budapest sobre el
reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para
fines de procedimientos de patentes.
El procedimiento incluye el que proteínas que
perturban directa o indirectamente la detección del transcrito
específico, de manera que no sea ya posible ninguna detección clara
de los transcritos específicos, se separen y/o degraden a
continuación de la transcripción. La separación o degradación
incluye etapas de procedimiento a realizar de modo especialmente
sencillo, tales como por ejemplo aquellas en las que la reacción es
detenida por una etapa del procedimiento química y/o mecánica y/o
enzimáticas y los transcritos son liberados eventualmente al mismo
tiempo de proteínas perturbadoras de manera que a continuación de
esta etapa de procedimiento nucleótidos marcados en exceso puedan
separarse de los transcritos específicos, por ejemplo mediante
etapas de lavado.
Esta forma de realización del procedimiento
incluye el que, por ejemplo a continuación de la reacción de
transcripción, las proteínas se puedan degradar con ayuda de
proteasas. Como proteasas se pueden utilizar, por ejemplo,
proteasas de zinc, proteasas de serina, tiolproteasas y
carboxiproteasas. En particular, pueden emplearse la proteinasa K,
tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa A, papaína y pepsina. Una
forma de realización particular del procedimiento es que a
continuación de la transcripción se lleva a cabo una digestión con
proteinasa K.
Con el fin de poder determinar la magnitud de la
transcripción, es decir la tasa de transcripción, se ha de
determinar la cantidad de transcrito específico.
El procedimiento incluye el que la transcripción
se lleve a cabo en presencia de nucleótidos marcados o que se marque
el transcrito específico. El transcrito se puede marcar, por
ejemplo, de forma no radiactiva, cuando para la transcripción se
emplean correspondientes nucleótidos marcados de forma no
radiactiva. Como grupos de marcaje para nucleótidos pueden
utilizarse, por ejemplo, grupos fluorescentes, tales como derivados
de dansilo (=
N-dimetil-1-aminonaftil-5-sulfonilo),
fluoresceína o cumarina o grupos quimioluminiscentes, tales como
derivados de acridina. Los grupos de marcaje mencionados permiten
una detección directa del transcrito específico. Además de ello,
también se pueden utilizar grupos de marcaje que son adecuados para
una detección indirecta del transcrito. Ejemplos de ellos son
digoxigenina, que puede ser detectada con anticuerpos
anti-digoxigenina específicos, por ejemplo en el
ELISA, biotina que puede ser detectada a través del sistema
biotina/avidina y brazos de enlazador que contienen grupos
funcionales que permiten una derivatización posterior con un grupo
informador detectable. Un ejemplo para la posibilidad mencionada en
último lugar es, por ejemplo, un enlazador de aminoalquilo que, a
continuación de la transcripción, se puede hacer reaccionar con un
éster activo de acridinio para la muestra de quimioluminiscencia, y
se puede detectar.
Una forma de realización particular del
procedimiento es que la transcripción se lleva a cabo en presencia
de nucleótidos radiactivamente marcados. Los nucleótidos pueden
estar por ejemplo radiactivamente marcados con fósforo (^{32}P o
^{33}P), azufre (^{35}S) o tritio (^{3}H).
Una forma de realización particular del
procedimiento es que los transcritos específicos son separados de la
mezcla de reacción mediante unión a una fase sólida (soporte
sólido), por ejemplo mediante unión a una microplaca de titulación
o mediante unión del transcrito específico a filtros especiales,
membranas u otras fases sólidas, en particular mediante la unión a
una membrana cargada o a un filtro cargado, preferiblemente de
nilón o nitrocelulosa, de manera particularmente preferida mediante
unión a una membrana que contiene grupos cargados, tales como por
ejemplo grupos dietilaminoetilo, tales como por ejemplo una membrana
de DEAE-celulosa. Esta forma de realización incluye
el que los transcritos específicos unidos al soporte sólido puedan
ser liberados, mediante etapas de lavado, de nucleótidos marcados
en exceso en tal medida que sea posible una detección clara de los
transcritos específicos.
Sorprendentemente, con este procedimiento se
obtienen, en comparación con laseparación y detección habituales,
consistentes en la fenolización, precipitación y subsiguiente
separación de los transcritos sobre un gel desnaturalizante,
señales específicas asimismo claramente detectables (véase el
Ejemplo 7 y la figura 3).
El procedimiento es adecuado para generar señales
específicas, desencadenadas por ejemplo por la transcripción
específica en presencia de, por ejemplo, un activador
(transcripción activada) o de un inhibidor (transcripción inhibida)
que se desvían en al menos el factor 7, preferiblemente en el factor
8, en casos particulares incluso en el factor 9 ó 10 de la
intensidad de señal basal desencadenada por la transcripción basal,
por ejemplo sin la presencia del activador o inhibidor (véase el
Ejemplo 7 y la figura 3).
Una forma de realización importante del
procedimiento es que éste se puede emplear para el rastreo de
sustancias farmacológicamente activas. Con el fin de someter a
ensayo sustancias activas farmacológicas en relación con su
actividad (por ejemplo propiedad activante o inhibidora), la
transcripción se lleva a cabo en presencia de la sustancia activa a
ensayar. Eventualmente, componentes individuales, por ejemplo el
extracto del núcleo enriquecido, se pueden preincubar con la
sustancia activa a ensayar. Además de ello, la especificidad de la
sustancia activa a ensayar se puede caracterizar llevando a cabo
paralelamente la transcripción en presencia de la sustancia activa a
ensayar en varias tandas de transcripción, conteniendo cada tanda
diferentes componentes y determinando luego de forma comparativa la
tasa de transcripción.
Sustancias activas a ensayar pueden ser, por
ejemplo, sustancias naturales y/o sustancias procedentes de
bibliotecas de sustancias químicas y combinatorias. Las sustancias
naturales pueden aislarse, por ejemplo, de plantas, animales,
secreciones de plantas o animales y, en particular, de
microorganismos tales como por ejemplo de hongos, levaduras,
bacterias o algas.
Otra característica del procedimiento de acuerdo
con la invención es que la transcripción se lleva a cabo en
presencia de una sustancia activa a ensayar, de un factor de
transcripción, co-factor o extracto del núcleo
específico del tipo de célula y una tanda paralela en ausencia de
la sustancia activa a ensayar, factor de transcripción,
co-factor o extracto del núcleo específico del tipo
de la célula, pero por lo demás en condiciones iguales, y a partir
de la diferencia de las cantidades de transcrito marcado se calcula
la actividad (por ejemplo inhibidora, activante) o el efecto de la
sustancia activa a ensayar, del factor de transcripción,
co-factor o extracto del núcleo específico del tipo
de célula en relación con un elemento regulador de genes (o gen) a
investigar y/o un factor de transcripción y/o
co-factores.
El procedimiento incluye el que el efecto de una
proteína a investigar que participa en la regulación de genes, se
calcule con ayuda de transcripciones llevadas a cabo paralelamente
en condiciones iguales, estando contenida la proteína a ensayar
sólo en una de las dos tandas de reacción.
Una forma de realización del procedimiento
incluye el que
a) se lleven a cabo al menos dos transcripciones
paralelamente en condiciones iguales, en donde
b) las tandas de transcripción sólo se
diferencian en que contienen diferentes cantidades de la sustancia
activa a ensayar y/o de al menos un factor de transcripción y/o de
al menos un co-factor y/o de al menos un extracto
del núcleo enriquecido,
c) a continuación de la transcripción se
determina para cada tanda la cantidad obtenida de transcrito
marcado, y
d) a partir de la diferencia de las cantidades
obtenidas de transcrito marcado se calcula la actividad y/o
especificidad de la sustancia activa a ensayar, factor de
transcripción, co-factor y/o extracto del núcleo
enriquecido en relación con el elemento regulador de genes.
Con este procedimiento se puede ensayar de forma
preestablecida el efecto de cada uno de los componentes
individuales (por ejemplo sobre el extracto del núcleo (es decir
sobre un tipo de célula determinado) o un factor de transcripción
determinado) que está contenido en la tanda de transcripción. Por
ejemplo, se puede analizar el efecto de una sustancia activa a
investigar sobre un elemento regulador de genes definido. En este
caso es decisivo el que se puedan definir con exactitud las
condiciones de reacción de la transcripción.
El procedimiento ofrece la posibilidad de influir
de forma preestablecida en el efecto de factores individuales sobre
una expresión del gen patológica, dado que se pueden ajustar o
indicar con exactitud las correspondientes condiciones de la
reacción mediante la elección del elemento regulador de genes así
como de los factores de transcripción y/o
co-factores y/o extractos del núcleo específicos
del tipo de célula.
Una ventaja particular del procedimiento es que
de este modo se pueden identificar sustancias activas
farmacológicas que pueden influir positiva o negativamente sobre la
transcripción en condiciones definidas, en particular aquellas que
activan o inhiben la transcripción de genes (diana) definidos,
teniendo estas sustancias activas una actividad específica sobre
elementos reguladores de genes definidos y/o factores de
transcripción definidos, co-factores y/o extractos
del núcleo específicos del tipo de célula (o células).
La invención se refiere a un procedimiento para
la identificación de sustancias farmacológicamente activas
específicas. Por ejemplo, el procedimiento se puede utilizar con el
fin de caracterizar la sustancia activa a ensayar en condiciones
definidas. Por ejemplo, el procedimiento se puede utilizar con el
fin de caracterizar ulteriormente una sustancia activa identificada
de este modo en relación con su especificidad bajo condiciones
definidas. Por ejemplo, una sustancia farmacológicamente activa,
identificada con ayuda del procedimiento, debería inhibir o
activar, en condiciones definidas, la transcripción de la secuencia
de ADN a transcribir presente bajo el control del elemento regulador
de genes.
Otra propiedad particularmente ventajosa del
procedimiento es que todas las etapas se pueden automatizar de
forma sencilla. Por ejemplo, para ello se puede emplear el robot de
pipeteado Biomek 2000® (firma Beckman, München) conectado a un
módulo de robot de abastecimiento. Los transcritos unidos a una fase
sólida pueden entonces lavarse de forma manual o automática, por
ejemplo con ayuda de una cinta transportadora.
La presente invención incluye el que un robot de
pipeteado, por ejemplo el Biomek 2000®, sea equipado con los
componentes individuales de la reacción, tales como fracción de
proteínas (por ejemplo extracto del núcleo y otras proteínas),
molde de ADN, tampón de transcripción, sustancias a investigar en la
transcripción, puntas de pipetas, microplacas de titulación y
membranas. A partir de estos componentes se reúnen las distintas
tandas de reacción, por ejemplo en los pocillos de microplacas de
titulación, efectuándose todas las etapas de pipeteado de forma
automática. De este modo, en el caso de pequeños volúmenes de
muestra, en particular volúmenes menores que 100 \mul,
preferiblemente de 10 a 50 \mul, en particular 20 \mul, pueden
elaborarse al mismo tiempo 96 o más tandas de transcripción
diferentes por placa. Cada transcripción dura aproximadamente 1 a
1,5 horas, de modo que con el aprovechamiento óptimo de los tiempos
de incubación se pueden llevar a cabo de este modo hasta 1000 o más
transcripciones
por día.
por día.
La transcripción se puede llevar a cabo, por
ejemplo, a temperaturas de 20-50ºC. Es
particularmente preferida la realización de la transcripción a
aproximadamente 30ºC.
Dado que especialmente las sustancias activas,
los factores de transcripción, co-factores y
eventualmente también los extractos del núcleo enriquecidos a
investigar sólo están disponibles en pequeñas cantidades, pero estas
sustancias deben someterse a ensayo bajo las más diversas
condiciones de reacción en una pluralidad de transcripciones, es un
requisito exigido al procedimiento que para la reacción de
transcripción se requieran volúmenes de muestra lo más pequeños
posibles. Por ello, es de particular importancia que este
procedimiento sea también adecuado para ser llevado a cabo a una
escala de nanolitros, es decir un volumen de reacción de
aproximadamen-
te 50-500 nl.
te 50-500 nl.
El procedimiento de transcripción es aplicable de
forma universal. Puede utilizarse para la identificación y
caracterización de elementos reguladores de genes (es decir un gen
específico como diana), de factores de transcripción y/o
co-factores y/u otras proteínas que participen
directa o indirectamente en la regulación de la transcripción de
genes (es decir una proteína específica como diana) y/o de
extractos del núcleo enriquecidos (es decir un extracto del núcleo
específico o un tipo de célula específico como diana). En
particular, el procedimiento de transcripción puede utilizarse para
la identificación de nuevos elementos reguladores de genes
patológicamente interesantes y la coordinación de proteínas
reguladoras de genes que inducen la acción de estos elementos, con
los correspondientes elementos reguladores de genes.
En comparación con ensayos celulares, el
procedimiento de transcripción descrito presenta una especificidad
diana mayor. En contraposición a ensayos celulares, la inclusión
celular de componentes individuales no tiene ningún efecto sobre la
eficacia de la transcripción. Además de ello, el procedimiento
descrito se puede llevar a cabo de forma sencilla y rápida (por
ejemplo, los componentes individuales se pueden almacenar de forma
preparada y congelada). El procedimiento es fácil de estandarizar y
puede ser empleado universalmente, ya que se puede aplicar a casi
cualquier tipo de célula y cualquier gen.
Con ayuda del procedimiento se pueden identificar
sustancias activas farmacológicas que pueden utilizarse para la
preparación de medicamentos. Sustancias activas identificadas con
este procedimiento de transcripción deberían provocar, en
comparación con sustancias activas conocidas, efectos secundarios
en un número significativamente menor. Por ejemplo, pueden ensayarse
o identificarse sustancias activas que pueden emplearse para la
preparación de medicamentos, para el tratamiento de enfermedades
(auto)inmunes, enfermedades del metabolismo, cáncer,
enfermedades circulatorias del corazón, enfermedades infecciosas,
reumatismo, diabetes, enfermedades degenerativas y psíquicas, en
particular para la preparación de medicamentos para el tratamiento
de artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus,
alergias, asma, anafilaxia, dermatitis atópica, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, SIDA, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, epilepsia, esquizofrenia,
arterioesclerosis y tuberculosis.
Además de ello, este procedimiento universal
ofrece una pluralidad de otrasposibilidades de aplicación. Por
ejemplo, el procedimiento puede emplearse análogamente también en
la patología de animales, en la cría de animales, en la
fitoprotección o en el cultivo de plantas para el hallazgo de
sustancias activas farmacológicas específicas, cuando se emplean
los correspondientes sistemas de transcripción basales a partir de
los respectivos organismos y los elementos reguladores de genes
específicos, factores de transcripción y/o
co-factores y/u otras proteínas que participan
directa o indirectamente en la reacción de transcripción.
En principio, este procedimiento de transcripción
in vitro se puede utilizar análogamente también para la
identificación de sustancias que pueden encontrar aplicación en la
conservación de materiales y alimentos, cuando se utilizan de forma
correspondiente los elementos reguladores de genes, sistemas capaces
de transcribirse, factores de transcripción y/o
co-factores de microorganismos, por ejemplo de
levaduras, hongos, bacterias o de insectos.
Las figuras se describen como sigue:
Figura
1
Se muestra la comparación de dos promotores
estándares con el plásmido informador universal pGS100 (figura 2).
La reacción de transcripción se llevó a cabo tal como se describe
en el Ejemplo 6.
- A)
- Transcripción basal: cantidad de transcrito radiactivo [en unidades relativas] que se obtiene sin activación del promotor (intensidad de señal basal);
- B)
- Transcripción activada: cantidad de transcrito radiactivo [en unidades relativas] que se obtiene con la activación del promotor con Gal4-poliglutamina.
- I)
- Como plásmido informador se utilizó pMRG5 (Krezschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell 78, 525-534). El promotor sintético en pMRG5 contiene la caja TATA del promotor VIH, el iniciador del promotor ML y una secuencia exenta de G de aproximadamente 400 nucleótidos de longitud en pUC19.
- II)
- Como plásmido informador se utilizó pV\betaML. El plásmido informador pV\betaML está constituido como el plásmido informador pGS100, pero en lugar de la secuencia exenta de G de 800 nucleótidos de longitud contiene sólo una secuencia exenta de G de 400 nucleótidos de longitud.
- III)
- Como plásmido informador se utilizó el pGS100 que presenta una secuencia exenta de G de aproximadamente 800 nucleótidos.
En cada caso se compararon la transcripción basal
(A) con la transcripción activada (B). Como activador se empleó una
proteína de fusión consistente en un dominio de unión Gal4 (94
aminoácidos amino-terminales) y un dominio de
activación de poliglutamina (péptido sintético a base de 11 ácidos
glutámicos). Se registran los valores absolutos (en unidades
relativas, tales como se obtienen con ayuda de un phosphoimager),
después de la sustracción del fondo. En el caso de las reacciones
de transcripción en las que se utilizó pGS100 como plásmido
informador se midieron tanto valores absolutos superiores como
también, condicionado por la diferente constitución de los
promotores sintéticos, una capacidad de activación mejor en
comparación con pMRG5. Además de ello, resulta clara la influencia
positiva de la secuencia exenta de G que presenta una longitud de
más de 400 nucleótidos.
Figura
2
El plásmido informador universal pGS100 contiene
una zona de promotor sintética como promotor modelo delante de una
región exenta de G de aproximadamente 800 pares de bases de
longitud en pUC19. Dentro de los puntos de corte de restricción
para BamHI y SwaI se encuentra la zona de iniciador del promotor
adenovírico "tardío principal" (ML). Entre los puntos de corte
de restricción para SacII y BamHI se encuentra la zona con la caja
TATA del promotor del receptor de células T humano V\beta8.1.
Estos dos elementos de promotor basales (iniciador y caja TATA)
posibilitan la transcripción basal in vitro. Dado que éstos
pueden ser de una importancia específica en genes diana potenciales
para el rastreo, es posible intercambiar éstos individualmente por
las zonas correspondientes a los genes a investigar
(correspondientes a elementos reguladores de genes). En el
polienlazador situado más abajo del promotor basal, pueden
incorporarse zonas de genes diana reguladoras arbitrarias
(activación específica). Alternativamente, la totalidad de la zona
de promotor puede ser intercambiada. Situado más arriba del
polienlazador (SacII a PstI), pGS100 contiene cinco puntos de unión
para la proteína de levadura Gal4. Esta posibilita también el
análisis de activadores de la transcripción sintéticos, por ejemplo
de proteínas de fusión que consisten en un dominio de activación
arbitrario (por ejemplo del transactivador VP16 de Herpes Simplex)
y un dominio de unión de ADN de Gal4. Un eslabón esencial de pGS100
es la secuencia exenta de G.
Figura
3
La figura 3 muestra una comparación de las
intensidades de señal (como medida de la cantidad de transcrito y,
con ello, de la intensidad de la transcripción) que se obtienen en
diferentes condiciones de reacción. Las reacciones de transcripción
se llevan a cabo tal como se describe en el Ejemplo 7.
- A)
- Procedimiento de transcripción estándar habitual, en el que los transcritos específicos son liberados de proteínas y nucleótidos en exceso por fenolización, precipitación con etanol y subsiguiente electroforesis en gel desnaturalizante;
- B)
- procedimiento de transcripción in vitro descrito, en el que las proteínas son digeridas por proteinasa K, y los nucleótidos en exceso son separados por lavado de los transcritos específicos unidos a filtros de DEAE;
- I)
- para la transcripción se emplea un extracto de núcleos de células HeLa capaz de transcribirse y purificado a través de una columna P11® sin el correspondiente molde de ADN (experimento testigo);
- II)
- transcripción basal: a una tanda correspondiente a la tanda procedente de I se añade como molde de ADN el plásmido informador pMRG5 y se lleva a cabo la reacción de transcripción; de este modo se determina la intensidad de la señal basal;
- III)
- transcripción activada: a una tanda correspondiente a la tanda II se añade
- adicionalmente el activador de la transcripción, una proteína de fusión consistente en el dominio de unión de ADN de Gal4 y el dominio de activación de VP16 (Gal4-VP16) y se lleva a cabo la transcripción; de este modo se obtiene la intensidad de señal activada;
- IV)
- a una tanda correspondiente a la tanda de transcripción procedente de III se añadió \alpha-amanitina en calidad de inhibidor de ARN-polimerasa II (experimento testigo).
Una comparación de las intensidades de señal que
se obtuvieron bajo las diferentes condiciones de reacción con los
dos procedimientos diferentes demuestra que tanto la transcripción
basal (II) como también la activada (III) pueden ser medidas con el
procedimiento de transcripción in vitro descrito en esta
memoria, siendo equiparables las intensidades de señal con las
obtenidas con un procedimiento de transcripción habitual. El hecho
de que también se pueda medir la intensidad de señal basal es de una
importancia decisiva, con el fin de que el procedimiento de
transcripción descrito también pueda emplearse para el rastreo de
inhibidores de la transcripción. Con ayuda del inhibidor de
ARN- -polimerasa II específico \alpha-amanitina se consigue una reducción de aproximadamente 8 veces la señal (comparaciones III y IV).
ARN- -polimerasa II específico \alpha-amanitina se consigue una reducción de aproximadamente 8 veces la señal (comparaciones III y IV).
Los extractos de núcleos se preparan partiendo de
núcleos de células HeLa. Los núcleos de células HeLa se pueden
adquirir comercialmente de diferentes firmas (por ejemplo,
"4ºC", Mons; Sigma, München; Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg). La elaboración que se describe en lo que sigue de los
núcleos de células se efectúa a 4ºC (recinto refrigerado). Los
tampones se ajustan con Tris pH 6,8 a la temperatura ambiente (TA),
lo que corresponde a un pH de 7,3 a 4ºC. A los tampones se les
añade, antes del uso, DTT (solución patrón 1 M en agua) para la
concentración final de 5 mM y PMSF (solución patrón 200 mM en DMSO)
para la concentración final
de 1 mM.
de 1 mM.
La elaboración de los núcleos de células abarca
las siguientes etapas:
- 1.
- Congelar en hielo los núcleos de células y determinar el volumen NPV (volumen del sedimento nu- clear).
- 2.
- En cada caso 1/2 volumen de NPV en tampón KCl 0,02 M (tampón con un bajo contenido en sales: 20 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 250 ml de glicerol al 100%, 6,67 ml de KCl 3 M, 1,5 ml de MgCl_{2} 1 M, 0,4 ml de EDTA 0,5 M, H_{2}O hasta 1000 ml) y tampón KCl 1,2 M (tampón con un elevado contenido en sales: 20 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 250 ml de glicerol al 100%, 400 ml de KCl 3 M, 1,5 ml de MgCl_{2} 1 M, 0,4 ml de EDTA 0,5 M, H_{2}O hasta 1000 ml) se añaden a dos vasos de precipitados separados.
- A cada tampón se añaden 0,0007 x NPOV/2 \beta-mercaptoetanol y 0,001 x NPV/2 PMSF 0,2 M.
- El sedimento se resuspende en 1/2 volumen de tampón KCl 0,02 M y se homogeneiza suavemente con una mano de almirez (6 x).
- 3.
- Disponer el producto homogeneizado en un vaso de precipitados y mezclarlo gota a gota a lo largo de 30 min con tampón KCl 1,2 M bajo constante agitación. La extracción ha finalizado después de agitar durante otros 30 min. Separar por centrifugación (centrífuga Beckman, rotor SS34 a 14000 rpm, 30 min, 4ºC), elaborar ulteriormente de forma separada el sedimento y el material sobrenadante.
- 4.
- Dializar el material sobrenadante en el tampón 1 (40 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 400 ml de glicerol, 0,8 ml de EDTA 0,5 M, H_{2}O hasta 2000 ml) hasta que se haya alcanzado la conductividad del tampón 2 (40 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 400 ml de glicerol, 0,8 ml de EDTA 0,5 M, 66,7 ml de KCl 3 M, H_{2}O hasta 2000 ml) (45-55 min).
- 5.
- Separar por centrifugación el material sobrenadante dializado (Beckman, rotor SS34, 18000 rpm, 20 min, 4ºC). El extracto del núcleo HeLa se encuentra en el material sobrenadante (extracto nuclear HeLa = HeLa NE). Partes alícuotas del extracto se congelan en N_{2} líquido. Transferir al homogeneizador el sedimento procedente de la extracción del núcleo, mezclarlo con 10 ml de TGME/DTT 5 mM (TGME para 1 l: 250 ml de glicerol al 100%, 50 ml de Tris pH 7,3 TA, 5 ml de MgCl_{2} 1 M, 0,2 ml de EDTA 500 mM pH 8,0), homogeneizarlo (intensamente) durante 20 veces con una mano de almirez y congelarlo en N_{2} líquido (sedimento nuclear HeLa).
- 1.
- Lavar varias veces en agua el material de la columna P11®. Determinar el volumen del material expan- dido.
- 2.
- Añadir 5 volúmenes de NaOH 0,5 N, dejar reposar durante 5 min e inmediatamente después filtrar con succión a través de filtros de pliegues.
- 3.
- Lavar con agua hasta pH 11.
- 4.
- Añadir 25 volúmenes de HCl 0,5 N, dejar reposar durante 5 min e inmediatamente después filtrar con succión.
- 5.
- Lavar con agua hasta pH 3.
- 6.
- Lavar con Tris 1M pH 7 hasta pH constante a 7. Conservar el material de la columna a 4ºC. Optimamente, equilibrar durante una noche.
La capacidad del material P11® asciende a 10 mg
de proteína/1 ml de material. La cromatografía se lleva a cabo como
sigue:
- 1.
- Transferir a la columna material P11® y equilibrar en tampón 2 (con DTT y PMSF recién añadidos, véase el Ejemplo 1). Conectar la columna a la bomba.
- 2.
- Cargar el extracto del núcleo (en tampón 2) (con 1 volumen de columna (VC/h)).
- 3.
- Lavar la columna con 5 VC de tampón 2 (5-10 VC/h).
- 4.
- Eluir con tampón 3 (40 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 400 ml de glicerol, 0,8 ml de EDTA 0,5 M, 200 ml de KCl 3 M, H_{2}O hasta 2000 ml; 2 VC/h). Una vez que ya no eluye más proteína, permitir el paso de otros 2 VC de tampón 3.
- 5.
- Eluir con tampón 4 (40 ml de Tris 1 M pH 6,8 TA, 400 ml de glicerol, 0,8 ml de EDTA 0,5 M, 333 ml de KCl 3 M, H_{2}O hasta 2000 ml; 2 VC/h) y recoger las fracciones pico.
- 6.
- Eluir con tampón 5 (40 ml de Tris 1 M pH 6,8, TA, 400 ml de glicerol, 0,8 ml de EDTA 0,5 M, 567 ml de KCl 3 M, H_{2}O hasta 2000 ml; 2 VC/h) y recoger las fracciones pico.
- 7.
- Dializar los dos materiales eluidos en cada caso frente a tampón 2 hasta que la conductividad sea constante y luego congelar partes alícuotas en N_{2} líquido.
Una tanda de transcripción (20 \mul de volumen
final) puede consistir en los siguientes componentes:
a) factores de transcripción generales en forma
de extractos del núcleo previamente purificados o preparados de
forma recombinante, eventualmente completados por otros factores de
transcripción específicos, activadores, inhibidores o proteínas de
fusión;
b) molde de ADN (por ejemplo, vector pGS100 con
el elemento regulador de genes a investigar);
c) tampón de transcripción que contiene, por
ejemplo, la sustancia activa a investigar;
d) nucleótidos marcados y no marcados;
con respecto a a) material eluido de tampón 4 y
material eluido de tampón 5 (del Ejemplo 3) contienen el extracto
del núcleo capaz de transcribirse (todos los factores de
transcripción generales). Las cantidades óptimas de material eluido
de tampón 4 y material eluido de tampón 5 deben determinarse de
nuevo para cada preparación (aproximadamente 3 \mul de material
eluido de tampón 4 y 2 \mul de material eluido de tampón 5 por
tanda);
con respecto a b) habitualmente se emplean 100 ng
de molde de ADN (elemento regulador de genes en el plásmido
informador, por ejemplo en pGS100) por tanda;
con respecto a c) tampón de transcripción
(MgCl_{2} 5 mM, HEPES KOH 25 mM pH 8,2, 0,5 \mul de BSA
acetilado (original 20 mg/ml), glicerol aproximadamente al 10%, KCl
aproximadamente 70 mM, PMSF 0,2 mM, DTT 10 mM) en cada caso con 20 U
de inhibidor de RNasa por tanda;
con respecto a d) NTP's (ATP, UTP en cada caso
con una concentración final de 100 \muM, CTP, concentración final
5 \muM, o-m-GTP, concentración
final 20 \muM,
\alpha-^{32}P-CTP, concentración
final de aproximadamente 0,12 \muM,
3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml).
3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml).
- 1.
- El tampón de transcripción y los dNTP's se disponen y se añade el molde de ADN.
- 2.
- Se añaden el activador de la transcripción y materiales eluidos de tampón 4 y 5.
- 3.
- Para la realización de la reacción de transcripción, incubar durante 1 h a 30ºC.
- 4.
- Adición de 400 \mul de mezcla de detención (urea 7 M, Tris HCl 10 mM pH 7,8, EDTA 10 mM/NaOH pH 8, SDS al 0,5%, LiCl 100 mM, 100 \mug/ml de ARNt, acetato de Na 300 mM) y 400 \mul de fenol/cloroformo/al- cohol isoamílico (25/24/1). Mezclar y centrifugar (rotor SS34, centrífuga Beckman, 5 min, 14000 rpm, TA). Retirar el material sobrenadante y añadir 400 \mul de isopropanol y mezclar y luego incubar durante 1 h a -20ºC.
- 5.
- Centrifugar (rotor SS34, centrífuga Beckman, 14000 rpm, 30 min, 4ºC), lavar el sedimento en etanol al 70% y luego secar en el Speedvac.
- 6.
- Recoger el sedimento en 10 \mul de tampón de aplicación (955 \mul de formamida al 100% (desionizada), 10 \mul de EDTA 0,5 M, 20 \mul de Tris 1 M pH 7, en cada caso 0,003% de azul de bromofenol/xilenocianol, H_{2}O hasta 1 ml) e incubar durante 15 min a 50ºC.
- 7.
- Separación de los transcritos en gel de urea-poliacrilamida desnaturalizante al 5% con 1 x TBE como tampón de elución. Elución previa durante 20 min a 60 mA. Cargar el gel. Elución del gel, aproximadamente 1 h a 60 mA.
- 8.
- Fijar el gel en ácido acético al 10%, secar y exponer en una película de rayos X en un Phosphoimager®.
- 1.
- Se disponen previamente el tampón de transcripción y dNTP's y se añade el molde de ADN.
- 2.
- Se añaden material eluido de tampón 4 y de tampón 5 y eventualmente el activador de la transcripción o el inhibidor de la transcripción.
- 3.
- Para la realización de la reacción de transcripción se incuba durante 1 h a 30ºC.
- 4.
- Adición de 5 \mul de mezcla de proteínasa K (1 \mul de solución de proteinasa K [20 mg/ml], 1 \mul de SDS al 10%, 0,5 \mul de EDTA 0,5 M pH 8,1, 1 \mul de Tris 50 mM pH 7,8, H_{2}O hasta 5 \mul).
- 5.
- Incubación durante 15 min a 30ºC.
- 6.
- Lavar brevemente la membrana de DEAE Na 45® (Schleicher y Schuell) en tampón de lavado de membrana (tampón fosfato de sodio 100 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, 2% de pirofosfato de sodio).
- 7.
- Pipetear de la tanda 5 \mul a la membrana y dejar secar durante 5 min.
- 8.
- Sacudir ligeramente la membrana 4 x 15 min en aproximadamente 100 ml de tampón de lavado de membrana (+ 1% de Triton).
- 9.
- Transferir la membrana a papel Whatmann 3 MM® (firma Whatman, Maidstone, Inglaterra), dejar secar al aire, cubrir con una lámina y exponer los filtros a una película de rayos X con empleo de un Phosphoimager®.
La realización se efectúa como se ha descrito en
los Ejemplos 1 a 3 y 5. Como plásmidos informadores se utilizan el
pMRG5 (caja TATA del promotor de VIH, región de iniciador del
promotor ML y una casete exenta de G de aproximadamente 400
nucleótidos de longitud en pUC19 (Krezchmar, M., Kaiser, K.,
Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell. 78, 525- -534),
el pGS100 (figura 2) y el pV\betaML (constituido tal como pGS100,
pero contiene en lugar de la casete de 800 pb de longitud sólo una
casete exenta de G de 400 pb de longitud). Para las reacciones de
transcripción se emplean en cada caso 100 ng de molde de ADN y 3
\mul de las fracciones de P11® (material eluido de tampón 4 y
tampón 5). Las reacciones se llevan en cada caso paralelamente sin y
con activador (proteína de fusión consistente en el dominio de
unión de Gal4 y un dominio de activación de poliglutamina). Los
resultados están representados y explicados en la figura 1.
Las reacciones de transcripción se llevan a cabo
como se describe en los Ejemplos 1 a 5 y se analizan tandas de
reacción paralelas en el ensayo con filtro (Ejemplo 5) o bien en el
ensayo con gel (Ejemplo 4). Para las reacciones se emplean en cada
caso 200 ng de pMRG5 como molde de ADN. Algunas reacciones de
transcripción se llevan a cabo en presencia de 30 ng de
Gal4-VP16, que se emplea como activador. Los
resultados están representados y descritos en la figura 3.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hoechst Aktiengesellschaft
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: - -
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Frankfurt
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LAND FEDERAL: - -
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 65926
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 069-305-7072
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 069-35-7175
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: - -
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Procedimiento de transcripción in vivo para el rastreo de sustancias naturales y otras sustancias químicas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3130 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...3130
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1
Claims (6)
1. Procedimiento para la identificación de
sustancias farmacológicamente activas que abarca la transcripción
in vitro exenta de células que abarca
a) la puesta a disposición de un molde de ADN que
contiene una secuencia de ADN a transcribir que se encuentra bajo
el control de al menos un elemento regulador del gen, mezcla con al
menos un nucleótido marcado, un extracto de núcleo y una sustancia
activa a ensayar y realización de la reacción de transcripción,
b) separación y/o degradación de las proteínas
contenidas en la tanda, a continuación de la transcripción,
c) unión del transcrito marcado a un soporte
sólido,
d) separación de los nucleótidos marcados en
exceso y
e) determinación de la cantidad de transcrito
marcado con relación a una tanda paralela, lo cual se lleva a cabo
en ausencia de la sustancia activa a ensayar, en donde el molde de
ADN contiene lugares de corte singulares para las endonucleasas de
restricción PstI, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI, SwaI y SmaI, en
donde cinco lugares de unión para la proteína Gal 4 de levadura y la
caja "TATA" del receptor de células T humano V\beta 8.1
están incorporados por clonación entre los lugares de corte por
restricción para SacII y BamHI, la región de INR (iniciador) del
promotor ML (promotor tardío principal de adenovirus) está
incorporada por clonación entre los lugares de corte por
restricción para BamHI y SwaI, y una secuencia exenta de G con una
longitud de aproximadamente 800 nucleótidos (pares de bases) está
incorporada por clonación entre los lugares de corte por
restricción SwaI y SmaI en el plásmido pUC19.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el plásmido informador universal presenta la secuencia conforme
a SEQ ID Nº 1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el molde de ADN es el plásmido informador universal el cual fue
depositado bajo el número DSM 11450.
4. Molde de ADN que contiene lugares de corte
singulares para las endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, SacI,
KpnI, SacII, BamHI, SwaI y SmaI, cinco lugares de unión para la
proteína Gal 4 de levadura, la caja "TATA" del receptor de
células T humano V\beta 8.1 entre los lugares de corte por
restricción para SacII y BamHI, la región de INR (iniciador) del
promotor ML (promotor tardío principal de adenovirus) entre los
lugares de corte por restricción para BamHI y SwaI, y una secuencia
exenta de G con una longitud de aproximadamente 800 nucleótidos
(pares de bases) en el plásmido pUC19.
5. Molde de ADN según la reivindicación 4, con la
SEQ ID Nº 1.
6. Molde de ADN según la reivindicación 4, el
cual fue depositado bajo el número DSM 11450.
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