PL196578B1 - Sposób identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmujący bezkomórkową transkrypcję in vitro i matryca DNA - Google Patents

Abstract

1. Sposób identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmuj acy bezkomórkow a tran- skrypcj e in vitro, znamienny tym, ze a) przygotowuje si e matryc e DNA zawieraj ac a przeznaczon a do transkrypcji sekwencj e DNA znajduj ac a si e pod kontrol a co najmniej jednego elementu regulato- rowego genu, miesza si e matryc e z co najmniej jednym znakowanym nukleotydem, ekstraktem j a- drowym i badan a substancj a czynn a, po czym prowadzi si e reakcj e transkrypcji, b) po transkrypcji zawarte w próbce bia lka oddziela si e i/lub degraduje, c) znakowany transkrypt wi aze si e ze sta lym no snikiem, d) nadmiarowe znakowane nukleotydy usuwa si e i e) okre sla si e ilo sc znakowanego tran- skryptu wzgl edem próby równoleg lej bez badanej substancji czynnej, przy czym matryca DNA obej- muje sekwencj e SEQ ID No.: 1 lub stanowi uniwersalny plazmid reporterowy, zdeponowany pod numerem DSM 11450. PL PL PL PL

Description

(21) Numer zgłoszenia: 325343

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 12.03.1998 (51) Int.Cl.

C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01)

Sposób identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmujący bezkomórkową transkrypcję in vitro i matryca DNA

(30) Pierwszeństwo: 12.03.1997,DE,19710159.3	(73) Uprawniony z patentu: Hoechst Aktiengesellschaft, Frankfurt nad Menem,DE (72) TwSrca(y) wynalazku: Bernd Kirschbaum,Mainz,DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Wilhelm Stahl,Idstein,DE
14.09.1998 BUP 19/98	Irvin Winkler,Liederbach,DE Michael Meisterernst,Eichenau,DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik: Iwona Sierzputowska, SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA, Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j.

(57) 1 . Soosóbidentykaccj i uubstancj i farmaoologiznnie zyynncch oeejmująyyezkoomóroową rranskrypcję in vitro, znamienny tym, że a) przygotowuje się matrycę DNA zawierającą przeznaczoną do transkrypcji sekwencję DNA znajdującą się pod kontrolą co najmniej jednego elementu regulatorowego genu, miesza się matrycę z co najmniej jednym znakowanym nukleotydem, ekstraktem jądrowym i badaną substancją czynną, po czym prowadzi się reakcję transkrypcji, 0) po transkrypcji zawarte w próbce białka oddziela się i/lub degraduje, c) znakowany transkrypt wiąże się ze stałym nośnikiem, d) nadmiarowe znakowane nukleotydy usuwa się i e) określa się ilość znakowanego transkryptu względem próby równoległej Uez badanej substancji czynnej, przy czym matryca DNA obejmuje sekwencję SEQ ID No.: 1 lub stanowi uniwersalny plazmid reporterowy, zdeponowany pod numerem DSM 11450.

PL 196 578 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sposób identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmujący bezkomórkową transkrypcję in vitro i matryca DNA. Wynalazek umożliwia analizę genów wirusowych i komórkowych i jest użyteczny w masowych badaniach przesiewowych, do racjonalnego i ekonomicznego wyszukiwania specyficznych chemicznych struktur wpływających selektywnie na aktywność genów.

Badania przesiewowe związków naturalnych pod kątem zwartości związków biologicznie czynnych zyskały nowy impuls gdy okazało się, że samo racjonalne planowanie związków czynnych nie umożliwia skutecznego ich poszukiwania. Tak więc oprócz bibliotek substancji chemicznych i bibliotek kombinatorycznych znowu w centrum uwagi znalazły się ekstrakty związków naturalnych jako źródła tych substancji. Wynika to przede wszystkim z mnogości substancji zawartych w tych ekstraktach. Za pomocą nowoczesnych metod analitycznych daje się wykazać, że ekstrakty z fermentacji mikroorganizmów zawierają około 500 klas bardzo różnych połączeń. Tak więc są znacznie lepsze ze względu na swoją różnorodność od bibliotek chemicznych i kombinatorycznych innych substancji.

Wykorzystanie farmakologicznego bogatego i dotychczas w znacznym stopniu nie przebadanego potencjału związków naturalnych jest ograniczone brakiem odpowiednich, dających przewidywalne rezultaty procedur, za pomocą których można testować związki potencjalnie czynne. Szczególnie potrzebne są sposoby, które służą do identyfikacji wysoce specyficznych związków farmakologicznie czynnych, których stosowanie daje możliwie najmniejsze efekty uboczne.

Podstawą niżej opisanego sposobu jest próba, w której substancje badane są pod kątem swego potencjału działania już w pierwszym etapie przekształcania informacji genetycznej, regulacji transkrypcji genów. Tym sposobem mają być zidentyfikowane substancje, które bezpośrednio wpływają na transkrypcję stymulująco bądź hamująco.

Siła transkrypcji genu jest określana przez elementy regulatorowe tego genu, w szczególności przez promotor, enhancer lub silencer. W działaniu elementów regulatorowych genu pośredniczą i przenoszą je czynniki transkrypcyjne i kofaktory. Te czynniki transkrypcyjne mogą wpływać zarówno pozytywnie, jak i negatywnie na tempo transkrypcji genu i w ten sposób wpływać na siłę transkrypcji. Wiele czynników transkrypcyjnych identyfikowano dotąd jako ważne „molekularne przełączniki w przebiegu szeregu procesów komórkowych, w tym przenoszeniu sygnału, kontroli cyklu komórkowego, różnicowaniu i programowaniu śmierci komórek (apoptozie).

Większość odbieranych przez komórki sygnałów wpływających na siłę transkrypcji genów jest „rejestrowana przez białka transmembranowe, przekazywana wewnątrz komórki przez łańcuchy transdukcji sygnału i przekształcana przez czynnik transkrypcyjny. Przykładami białek, które odbierają sygnały z zewnątrz, są białka wiążące cAMP, sensory dla sygnałów wzrostu (jak czynnik odpowiedzi na surowicę, SRF), receptory hormonów lub czynniki transkrypcyjne, które biorą udział w ekspresji cytokin i tzw. białka STAT (signal transducers and activators of transcription - przekaźniki sygnałów i aktywatory transkrypcji).

W międzyczasie poznano wiele substancji, które wpływają bezpośrednio lub pośrednio na siłę transkrypcji genów. Takie substancje są m.in. stosowane jako związki czynne w lekach, choć działanie tych substancji często nie jest specyficzne. Dlatego przyjmowanie takich leków jest często związane z niepożądanymi efektami ubocznymi.

Przykładowo do leczenia chorób immunologicznych stosowane są leki, które zawierają jako związki czynne cyklosporynę i pochodne steroidów. Cyklosporyna A tworzy kompleks z cyklofiliną. Kompleks ten hamuje kalcyneurynę, wszędzie obecną fosfatazę, która defosforyluje białka w różnych szlakach metabolicznych. Kalcyneuryna reguluje m.in. przemieszczanie podjednostki czynnika transkrypcyjnego NFAT z cytosolu do jądra komórkowego (Liu, J. (1993) Immunology Today 14, 290-295). NFAT (nuclear factor of activated T-cells) bierze udział w aktywacji pewnych immunologicznie istotnych genów. Cyklosporyna A (CsA) reguluje pośrednio poprzez wpływ na NFAT działanie tych genów. Ponieważ cyklosporyna A tylko pośrednio, to znaczy poprzez wszędzie obecną kalcyneurynę, reguluje aktywność NFAT, cyklosporyna A działa poprzez inne szlaki metaboliczne, powodując zwężanie naczyń oraz działając nefro- i neurotoksycznie. Gdyby znany był związek farmakologicznie czynny, który by specyficznie, i o ile możliwie bezpośrednio, działał hamująco na NFAT, można by przewidywać, że podawanie leku zawierającego ten związek w formie czynnej dawałoby mniej efektów ubocznych.

Także glukokortykoidy zaliczają się do czynnych związków farmakologicznych, które oprócz pożądanego działania związane są z silnymi działaniami ubocznymi. Glukokortykoidy są od wielu lat

PL 196 578 B1 stosowane w standardowej terapii alergii, reumatyzmu, zapaleń i innych chorób, spowodowanych przez nadmiernie reagujący układ immunologiczny. Powodują one między innymi hamowanie aktywności komórkowo-specyficznego czynnika transkrypcyjnego NFkB (Scheinmann, R.I., Cogswell, P.C., Lofguist, A. K. & Baldwin Jr. , A.S. (1995) Science 270, 283-286; Auphan, N., DiDonato, J.A., Rosette, C, Helmberg, A & Karin M. (1995) Science 270, 286-290), ponieważ stymulują tworzenie komórkowego inhibitora NFkB, białka IkB. IkB z kolei hamuje przenoszenie aktywnych dimerów NFkB do jądra komórkowego i w ten sposób hamuje aktywację ważnych immunologicznie genów docelowych. Wpływ glukokortykoidów na ekspresję genów jest, podobnie jak w przypadku CsA, stosunkowo niespecyficzny, ponieważ glukokortykoidy działają nie tylko na NFkB, ale także na inne białka.

Te przykłady pokazują, że istnieje wielkie zapotrzebowanie na farmakologicznie czynne związki o możliwie specyficznym profilu działania. Aby znaleźć nowe podstawowe struktury chemiczne z odpowiednimi właściwościami trzeba przebadać wiele substancji pod kątem specyficzności ich działania.

Mimo identycznego garnituru genowego, w zależności od typu komórki i/lub określonych chorób lub defektów, jak i stopnia rozwoju i zróżnicowania danej komórki, wyrażane są tylko określone białka. Jako podstawę tej indywidualności komórek można uznać obecność specyficznych białek regulujących geny, np. istnienie konkretnych czynników transkrypcji i kofaktorów (białka dodatkowe) zależnych od typu komórki i stadium rozwoju, regulujących skoordynowaną i kontrolowaną transkrypcję konkretnych genów.

Specyficzne, farmakologiczne związki czynne powinny więc selektywnie aktywować lub hamować transkrypcję ważnych z uwagi na ich patologiczny charakter genów w komórkach konkretnego typu. Aby zidentyfikować takie związki czynne istnieje potrzeba znalezienia takiego sposobu transkrypcji, w wyniku którego wpływ testowanych związków czynnych na pojedyncze geny, czyli na regulację powstawania odpowiednich białek i na elementy regulatorowe w warunkach określonych, jest bezpośrednio mierzalny. Ponieważ konieczne jest przeprowadzenie badań wielu potencjalnie czynnych związków, sposób ten powinien być prosty do przeprowadzenia i zautomatyzowania.

Pierwszy bezkomórkowy układ transkrypcyjny opisał Weil i wsp. (Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, 469-484). W nim zastosowano wzbogacone ekstrakty jądrowe, tzw. ekstrakty S100 (Weil, P.A., Segall, J., Harris, B., Ng, S.Y., Roeder, R.G. (1979) J. Biol. Chem. 254, 6163-6173) i polimerazę II RNA do transkrypcji in vitro. Bez dodatku egzogennej polimerazy II RNA te wzbogacone, ale dalej nie czyszczone ekstrakty jądrowe nie były zdolne do transkrypcji (Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.G. (1979) Cell 18, 469-484); Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101,582-598).

Wychodząc z takich ekstraktów jądrowych opracowano następnie układy, w których poprzez wieloetapowe oczyszczanie izolowano czynniki transkrypcyjne. W tych układach dokonano między innymi prób oczyszczenia, przy czym ekstrakty jądrowe czyszczono drogą chromatografii przy użyciu materiałów wiążących białka jądrowe, np. w kolumnach z fosfocelulozą. Dignam i wsp. w ramach tego pracochłonnego i wieloetapowego procesu opisali po raz pierwszy zastosowanie dostępnego w handlu systemu P 11® (Whatman, Maidstone, Anglia) (Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101,582-598).

Wieloetapowe procedury czyszczenia doskonalono coraz bardziej, toteż w międzyczasie stało się możliwe, z użyciem pracochłonnych procedur, wyizolowanie z ekstraktów jądrowych pojedynczych czynników transkrypcyjnych. Co więcej, te pojedyncze czynniki lub ich podjednostki są obecnie także dostępne w formie zrekombinowanej, jak np. TFIIA, TFIIB, TFIIEa, TFIIE3 i TFIIF (Zawel, L. i Reinberg, D. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 533-561).

Na dzień dzisiejszy istnieją już więc układy transkrypcyjne składające się z mieszaniny oczyszczonych zrekombinowanych i naturalnych czynników transkrypcyjnych. Zastosowanie takich układów transkrypcyjnych w systemie do badań przesiewowych z szybkim przerobem próbek jest niecelowe, gdyż przygotowanie ich jest zbyt pracochłonne i drogie. W innych układach transkrypcyjnych, np. przy zastosowaniu ekstraktów z jąder, zachodzi natomiast zbyt wiele reakcji ubocznych. W niedostatecznie oczyszczonych lub nie czyszczonych ekstraktach jądrowych (ekstrakty surowe) przeważnie kwasy nukleinowe, ale i białka wiążące DNA np. represory, takie jak histony, działają zaburzająco na transkrypcję. W kwasach nukleinowych zawartych w surowych ekstraktach „przeszkadzają przede wszystkim sekwencje DNA, które kodują tRNA. Ponieważ geny dla tRNA są około 100 razy silniej transkrybowane niż geny dla mRNA, te sekwencje kodujące tRNA powodują powstanie nadmiaru niespecyficznych transkryptów. Niespecyficzne transkrypty muszą zostać usunięte poprzez pracochłonne etapy oczyszczania zanim będzie można wykazać obecność specyficznych transkryptów.

PL 196 578 B1

W celu ilościowego określenia wyników transkrypcji in vitro opracowano wektory, w których sekwencja mająca ulec transkrypcji nie zawiera zasad guaninowych (tzw. sekwencja wolna od G albo kaseta wolna od G), gdzie do sekwencji wolnej od G przyłączony jest odcinek sekwencji, który zawiera bardzo liczne guaniny. Dzięki zastosowaniu tego wektora możliwe jest prowadzenie transkrypcji pod nieobecność GTP. W ten sposób ulegają transkrypcji tylko sekwencje wolne od G, a nie inne sekwencje zawierające G. Prowadzi to do uzyskania specyficznych transkryptów, które ponadto wszystkie są niemal takiej samej długości. Sawadogo i Roeder po raz pierwszy opisali zastosowanie do transkrypcji wektora, w którym sekwencja o długości 400 nukleotydów jest pod kontrolą ML (główny późny promotor adenowirusa). Stosując ten wektor uzyskuje się transkrypty o długości około 400 nukleotydów (Sawadogo M. i Roeder R.G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4394-4398).

Z użyciem tej procedury uzyskano wyraźnie mniej niespecyficznych transkryptów, a zastosowanie tych wektorów w reakcjach transkrypcji opisano od tego czasu wielokrotnie (Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15, 3105-3115; Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell, 78, 525-534; Meisterernst, M., Roy, A.L., Lieu, H.M. i Roeder, R.G. (1991) Cell 66, 981-993).

Dotychczas stosowano jednak wyłącznie wektory, w przypadku których sekwencja wolna od G miała długość nie przekraczającą 400 nukleotydów.

Aby ocenić wyniki dotychczas opisanych procedur transkrypcji w sposób ilościowy i jakościowy, transkrypcję przeprowadzano w obecności znakowanych radioaktywnie nukleotydów, a radioaktywne transkrypty po fenolowaniu i strąceniu rozdzielano na żelu. W ten sposób nie tylko oddziela się od specyficznego transkryptu błędnie rozpoczęte lub zakończone transkrypty, jak i niespecyficznie wyznakowane kwasy nukleinowe (np. transkrypty pochodzące z plazmidu lub tRNA), ale także nadmiarowe nukleotydy. Stosunek aktywności nadmiarowych radioaktywnie znakowanych nukleotydów do radioaktywnie znakowanych transkryptów wynosi w niekorzystnych przypadkach około 10000:1, toteż znakowane transkrypty muszą być wzbogacone około 10000 razy. To wzbogacenie specyficznych transkryptów zostaje uzyskane przez etap wytrącania i rozdziału elektroforetycznego. Te etapy wzbogacania są jednak nieprzystosowane do masowych zautomatyzowanych badań, tak więc istnieje zapotrzebowanie na inne procedury usuwania znakowanych nukleotydów w stopniu nadal pozwalającym na ilościową ocenę wyników transkrypcji.

Transkrypcję można też przeprowadzić przez naniesienie roztworu reakcyjnego na błonę, przykładowo z DEAE-celulozy.

Znakowane radioaktywnie transkrypty mogą być wtedy bezpośrednio wykrywane na membranie. Jednak dotychczas pozytywny efekt dawało stosowanie membrany tylko do wykrywania transkryptów w transkrypcjach in vitro odbywających się w obecności oczyszczonej polimerazy II RNA (Roeder, R.G. (1974) J. Biol. Chem. 249, 241-248) lub oczyszczonych podstawowych czynników transkrypcyjnych (Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Hirokoshi, M., Roeder, R. G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9163-9167). Nie istniały jednak żadne przesłanki co do tego, że można w ten sposób wykrywać transkrypty uzyskiwane z użyciem wzbogaconych i ewentualnie wstępnie oczyszczonych ekstraktów jądrowych.

Wykorzystanie transkrypcji genów do badań przesiewowych na składniki czynne opisano już w WO 96/26959. Ujawniono tam sekwencje ludzkiego NFAT (hNFAT) i ich możliwe zastosowanie w oznaczeniach transkrypcji, które to sekwencje nadawały się do stosowania w możliwie zautomatyzowanych masowych badaniach przesiewowych związków naturalnych. W przeciwieństwie do poniżej opisanego sposobu transkrypcji, w tym oznaczeniu transkrypcyjnym chodziło o czyste oznaczenie wiązania, przy którym nie przeprowadzano reakcji transkrypcji.

Inny sposób oznaczania w badaniach przesiewowych wiązania substancji, które mogą hamować wiązanie czynników transkrypcyjnych do kwasów nukleinowych, opisano w US 5563036. Także w tym oznaczeniu nie przeprowadzano transkrypcji.

Dalszy przykład oznaczania wiązania, nadający się także do wyszukiwania mogących hamować substancji, w tym przypadku wiązania białka związanego z receptorem czynnika nekrotycznego nowotworów (TRADD) do określonych sekwencji DNA, opisano w US 5563039.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie łatwego, powtarzalnego i uniwersalnie stosowalnego sposobu analizy transkrypcji genów, np. genów komórkowych i wirusowych, szczególnie w masowych badaniach przesiewowych w określonych warunkach reakcji.

Zatem wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmującego bezkomórkową transkrypcję in vitro, który charakteryzuje się tym, że a) przygotowuje się maPL 196 578 B1 trycę DNA zawierającą przeznaczoną do transkrypcji sekwencję DNA znajdującą się pod kontrolą co najmniej jednego elementu regulatorowego genu, miesza się matrycę z co najmniej jednym znakowanym nukleotydem, ekstraktem jądrowym i badaną substancją czynną, po czym prowadzi się reakcję transkrypcji, b) po transkrypcji zawarte w próbce białka oddziela się i/lub degraduje, c) znakowany transkrypt wiąże się ze stałym nośnikiem, d) nadmiarowe znakowane nukleotydy usuwa się i e) określa się ilość znakowanego transkryptu względem próby równoległej bez badanej substancji czynnej, przy czym matryca DNA obejmuje sekwencję SEQ ID No.: 1 lub matryca DNA stanowi uniwersalny plazmid reporterowy, zdeponowany pod numerem DSM 11450.

Ponadto wynalazek dotyczy matrycy DNA mającej sekwencję SEQ ID No. : 1.

Ponadto wynalazek dotyczy matrycy DNA, zdeponowanej pod numerem DSM 11450.

Sposób obejmuje właściwą reakcję transkrypcji w etapie a), oddzielenie specyficznego transkryptu w etapach b), c), d) i detekcję specyficznego transkryptu w etapie e).

Wymieniona kolejność b), c) i d) jest tylko jedną z możliwych sekwencji poszczególnych procesów oddzielenia specyficznego transkryptu. Wydzielenie specyficznego transkryptu można także realizować w kolejności c), d), b) lub d), b), c).

Szczególną cechą sposobu jest to, że wszystkie jego etapy, a więc zarówno właściwą reakcję transkrypcji, jak i rozdział i detekcję specyficznego transkryptu, można zautomatyzować, przy czym jest możliwe proste i wiarygodne oznaczenie ilości specyficznych transkryptów uzyskanych w danych warunkach reakcji, a dzięki temu oznaczenie szybkości transkrypcji.

Szybkość transkrypcji świadczy o tym, jak często określony gen jest transkrybowany na jednostkę czasu albo, w opisanym sposobie transkrypcji, jak często na jednostkę czasu ulega transkrypcji sekwencja DNA. W celu określenia szybkości transkrypcji oznacza się ilość radioaktywnie znakowanego transkryptu otrzymanego w określonym czasie.

Transkrypcję można prowadzić w obecności aktywatorów i/lub inhibitorów, tzn. w obecności składników, które wpływają pozytywnie lub negatywnie na transkrypcję. Przykładowo zdolny do transkrypcji ekstrakt jądrowy może być użyty do transkrypcji podstawowej. Ten układ transkrypcji podstawowej może być uzupełniony przez aktywatory i/lub inhibitory. W odniesieniu do transkrypcji podstawowej hamowanie powoduje obniżenie szybkości transkrypcji, a zatem prowadzi do zmniejszenia ilości specyficznego transkryptu na jednostkę czasu, podczas gdy aktywacja prowadzi do podwyższenia szybkości transkrypcji, a zatem do zwiększenia ilości specyficznego transkryptu na jednostkę czasu.

Transkrypcja genów daje się podzielić na szereg etapów, wiązanie kompleksu preinicjacyjnego (PIC), aktywacje PIC, inicjację, „klirens promotora, elongację i terminację. Do inicjacji transkrypcji u Eukariota potrzebne są polimerazy RNA (dla genów kodujących białka polimeraza II RNA) i białka wiążące DNA, które umożliwiają specyficzne oddziaływanie polimerazy II RNA z DNA. Te białka wiążące DNA określa się jako czynniki transkrypcyjne, przy czym ogólne czynniki transkrypcyjne w znaczącym stopniu są związane oddziaływaniem z promotorem, podczas gdy specyficzne czynniki transkrypcyjne pośredniczą w działaniu elementów regulatorowych znajdujących się przed lub za promotorem.

W transkrypcji genów eukariotycznych biorą udział ogólne czynniki transkrypcyjne TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Zdolna do transkrypcji frakcja białek, która jest odpowiedzialna za ograniczoną, podstawową aktywność genów, zawiera w zależności od promotora wszystkie lub większość tych ogólnych czynników transkrypcyjnych i polimerazę II RNA (RNA Pol II). Podstawowa aktywność promotora ML uzyskiwana jest np. przez TBP (wiążąca TATA podjednostka TFIID), TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH i RNA pol II. Frakcje białkowe, które wywołują taką podstawową aktywność są określane jako podstawowe systemy transkrypcyjne. To pojęcie stosowane jest, w znaczeniu wynalazku, także dla wzbogaconego i ewentualnie wstępnie oczyszczonego ekstraktu jądrowego. Transkrypcja, którą prowadzi się z użyciem podstawowego systemu transkrypcyjnego, nazywa się transkrypcją podstawową. Aby przeprowadzić transkrypcję w układzie bezkomórkowym, potrzebny jest co najmniej podstawowy układ transkrypcji, nukleotydy i mająca ulec transkrypcji matryca DNA.

Dla aktywowanej transkrypcji, potrzebne są dodatkowo, oprócz ogólnych czynników transkrypcyjnych i oprócz podstawowego układu transkrypcyjnego, specyficzne czynniki transkrypcyjne i kofaktory (białka dodatkowe) (Kaiser, K., Stelzer, G. i Meisterernst, M. (1995) EMBO J. 14, 3520-3527). Specyficzne czynniki transkrypcyjne są w stanie wzmocnić wielokrotnie niską transkrypcję podstawową określonych genów i sterować częstością inicjacji transkrypcji. Białka wiążące DNA są w ten sposób odpowiedzialne w znacznym stopniu za to jak często dany gen jest transkrybowany (szybkość

PL 196 578 B1 transkrypcji). W tym procesie regulacyjnym biorą także udział inne białka, takie jak np. kofaktory, które nie wiążą się bezpośrednio z DNA, ale poprzez interakcje białko-białko wpływają na aktywność czynników transkrypcyjnych lub polimeraz II RNA.

W sposobie według wynalazku stosuje się w transkrypcji podstawowej wzbogacony ekstrakt z jąder komórkowych (zwany tu „ekstraktem jądrowym). Jeśli chodzi o ten parametr, sposób ma zastosowanie uniwersalne, co dotyczy zarówno komórek, jak i stosowanych gatunków eukariotycznych.

Przykładowo, mogą być stosowane wzbogacone ekstrakty jądrowe z komórek ludzkich lub zwierzęcych pochodzące z pewnych linii komórkowych. Szczególnie odpowiednie są komórki, które mogą być hodowane i namnażane w dużych ilościach w fermentorach, np. komórki HeLa. Ponadto mogą być stosowane ekstrakty z jąder komórek wielu typów, szczególnie takich, które wyróżniają się czynnikami transkrypcyjnymi i/lub kofaktorami, np. specyficznymi w odniesieniu do typu komórki, cyklu komórkowego, stadium rozwoju, różnicowania lub specyficznymi dla choroby. W szczególności mogą być stosowane typy komórek, które odgrywają kluczową rolę w powstawaniu chorób, jak np. komórki układu odpornościowego (np. komórki B i T).

Szczególną zaletą sposobu według wynalazku jest to, że mogą być także izolowane i używane ekstrakty z tkanek lub z komórek nowotworowych. Jest to szczególnie korzystne w przypadkach, gdy nie jest dostępna odpowiednia linia komórkowa. W szczególności mogą być stosowane ekstrakty jądrowe izolowane z łatwo dostępnych tkanek, pępowin, zwierzęcych lub ludzkich, odpadów potransplantacyjnych ludzkich lub zwierzęcych organów, materiał pochodzący z biopsji, ludzkich lub zwierzęcych, czy też ludzkich lub zwierzęcych tkanek nowotworowych usuniętych operacyjnie, bądź ludzkie lub zwierzęce łożysko.

Przygotowanie bogatych w białka jądrowe ekstraktów ze świeżych lub zamrożonych komórek lub ze świeżych lub zamrożonych jąder prowadzi się znanymi sposobami, np. według metody opisanej przez Dignama i wsp. (Dignam, J.D., Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods in Enzymology 101, 582-598; Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Res. 11, 1475-1489). Do sporządzania wzbogaconego ekstraktu jądrowego można stosować procedury, które obejmują homogenizację jąder komórkowych a następnie dializę homogenatu.

Można ponadto prowadzić, prostymi metodami, jeden lub więcej etapów oczyszczania ekstraktu jądrowego, w których ekstrakt jądrowy zostaje oczyszczony w takim stopniu, że staje się zdolny do transkrypcji, dzięki czemu sposobem według wynalazku można uzyskać specyficzny transkrypt. Przykładowo ekstrakt może być czyszczony chromatograficznie. Czyszczenie może np. zachodzić na materiałach wiążących białka jądrowe, takich jak fosfoceluloza, DEAE-celuloza lub heparyna-sefaroza. Alternatywnie, do czyszczenia mogą być stosowane kolumny jonowymienne z wymianą kationów lub anionów lub specyficzne kolumny powinowactwa, np. takie, przy których do materiału z kolumny wiązane są przeciwciała lub oligonukleotydy.

Czyszczenie wzbogaconego ekstraktu korzystnie prowadzi się w kolumnie z fosfocelulozą, zwłaszcza w kolumnie P-11® (P11® System, Whatman, Maidstone, Anglia). Ekstraktu można też oczyszczać w jednym tylko etapie, np. w pojedynczej kolumnie P11®, lub w pojedynczej kolumnie z materiałem zawierającym DEAE-celulozę lub heparynę-sefarozę.

Korzystnie oczyszczanie prowadzi się z użyciem kolumny P11®. Najpierw ekstrakt jądrowy jest wiązany do kolumny fosfocelulozowej w obecności buforu, który oprócz innych składników zawiera 0,05 do 0,15 M, korzystnie 0,1 M KCl. Przez płukanie załadowanej kolumny odpowiednimi buforami, które zawierają 0,05 do 0,15 M KCl, korzystnie 0,1 M KCl, wypłukuje się z kolumny niespecyficzne i hamujące związki. Składniki zdolne do transkrypcji są korzystnie eluowane z kolumny w dwu frakcjach, przy czym najpierw stosuje się bufor zawierający przykładowo od 0,4 do 0,6 M KCl, korzystnie 0,5 KCl, a następnie bufor zawierający 0,7 do 1 M KCl, korzystnie 0,85 M KCl.

Transkrypcję wzbogaconego, ewentualnie oczyszczonego ekstraktu jądrowego można też prowadzić w obecności egzogennej polimerazy II RNA. Stosowaną polimerazą RNA może być eukariotyczna polimeraza RNA typu II (polimeraza II RNA), w szczególności zwierzęca lub ludzka polimeraza II RNA.

Wzbogacony i ewentualnie podczyszczony ekstrakt jądrowy można uzupełnić lub częściowo zastąpić przez dodanie białek, np. czynników transkrypcyjnych i kofaktorów. Te białka mogą być np. czyszczone z jąder komórek lub wytwarzane w sposób zrekombinowany.

Ekstrakt jądrowy można wzbogacić tylko jednym czynnikiem transkrypcyjnym lub kofaktorem. Można też stosować zdolną do transkrypcji frakcję białek (podstawowy układ transkrypcyjny) złożoną

PL 196 578 B1 całkowicie z oczyszczonych lub zrekombinowanych czynników transkrypcyjnych i kofaktorów oraz polimeraz RNA.

Czynnikami transkrypcyjnymi mogą być przykładowo ogólne i/lub specyficzne czynniki transkrypcyjne lub ich części, ewentualnie jako białka fuzyjne.

Ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi mogą być np. TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ i TBP (białko wiążące TATA).

Specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi mogą być np. NFkB, AP1, NFAT, GATA3, TCF/Lef, CBF, Tat, członkowie rodziny fos/jun, rodziny Oct (Oct-1, Oct-2) i działające zamiennie z nimi czynniki takie jak np. BobI, OCA-B lub OBF, rodzina Ets, aktywatory rodziny białek ATF/CREB, receptory jądrowe takie jak np. PPARa lub odpowiednie komórkowo-specyficzne izoformy czynników transkrypcyjnych (Kel, O.V., Romaschenko A.G., Kel, A.E., Wingender, E., Kolachenov, H.A. (1995) Nucl. Acids. Res. 20, 3-16.

Dalszymi przykładami specyficznych czynników transkrypcyjnych są:

1. protoonkogeny, np. jun, fos, ets, myc, izoformy bc i erb;

2. receptory hormonów erb np. (erb), receptory glukokortykoidów, estrogenów, kwasu retynolowego, witaminy D lub

3. supresory nowotworów, np. p53, NF1, WT1, RB;

4. patogeny wirusowe, np. białka wirusa opryszczki, jak np. VP16 lub ICP4, wirusa brodawczaka, jak np. E1, E2, E6 lub E7, adenowirusa jak np. E1A lub E2A cytomegalowirusa jak np. IE86, wirusa zapalenia wątroby typu B, jak np. pX, wirusa HIV jak np. Tat lub Rev;

5. czynniki specyficzne w stosunku do typu komórek i/lub tkanki, jak np. czynniki miogenne, Pit-1, Oct-2, Pu-1, OCA-B lub HNF lub czynniki specyficzne dla komórek T jak Ets-1, GA-TA3, TCF/Lef, CBF;

6. białka STAT (signal transducers and activators of transcription - przekaźniki sygnału i aktywatory transkrypcji) np. czynniki transkrypcyjne aktywowane przez cytokinę jak np. IL-1 Stat, IL-2 Stat, IL-3 Stat, IL-4, IL-5 Stat, IL-6 Stat, IL-7 Stat, IL-8 Stat, IL-9 Stat, IL-10 Stat, IL-11 Stat, IL-12 Stat (Stat oznacza białko, które przekazuje działanie) lub

7. białka, które biorą udział w kaskadach przekazywania sygnałów drugiego messengera, np. CREB lub abl;

8. receptory jądrowe, np. receptory „drugich messengerów (np. receptory cAMP lub IP3, receptory zależne od Ca²⁺), receptory kwasu retinolowego, receptory glukokortykoidów lub receptory steroidów;

9. specyficzne dla genu aktywatory lub inhibitory, np. specyficzne aktywatory genu IL-2 takie jak NFkB, AP1 lub NFAT;

10. czynniki transkrypcyjne o ekspresji specyficznej w stosunku do rozwoju, cyklu komórkowego lub zależne od różnicowania.

Kofaktory są przykładowo związane z transkrypcją bezpośrednio lub pośrednio przez oddziaływania białko-białko i/lub białko-DNA. Niektóre kofaktory są już obecne w podstawowym, a inne dopiero w aktywowanym układzie transkrypcyjnym. Kofaktory mogą wpływać pozytywnie albo negatywnie na szybkość transkrypcji. Kofaktorami mogą być np.

- czynniki związane z TBP (TAFy), np. TAF_H30, TAF_H40, TAF_H55, TAF_H60, TAF_H110, TAF_H150, TAF_h250, (Verrijzer, C.P. i Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sci. 338-342. TAFy tworzą wraz z TBP kompleks TFIID, przy czym skład TAFów w TFII może znacznie się zmieniać;

- mediatory, tzn. kofaktory, które są zasocjowane z polimerazą II RNA, jak np. białka oddziałujące z CTD (C-końcową domeną) i/lub represory i/lub aktywatory polimerazy II RNA, w szczególności RAP 30, RAP 74, RAP 38, SR7 (supresor polimerazy B RNA, SRB), cykliny lub kinazy (np. CKII);

- ogólne kofaktory;

- kofaktory, zawarte we frakcji USA („upstream stymulatory activity - aktywność stymulująca sekwencje flankujące 5') (Kaiser, K. i Meisterernst, M. (12996) Trends Biochem. Sci. 342-345);

- kofaktory stymulujące np. PC1, PC2, PC4(p15), PC5, PC6, Dr2 (represor D 2), PC3, ACF (aktywujący kofaktor), Cofa (kofaktor A), białka HMG (związana z chromatyną grupa białek o wysokiej ruchliwości);

- kofaktory hamujące, np. NC1, NC2 i/lub

- kofaktory specyficzne.

Do transkrypcji można stosować matrycę DNA zawierającą jeden lub więcej elementów regulatorowych i sekwencję mającą ulec transkrypcji. Taka matryca może zawierać dodatkowo inne odcinki sekwencji.

PL 196 578 B1

Matryca DNA według wynalazku ma sekwencję SEQ ID No.: 1 lub stanowi uniwersalny plazmid reporterowy, zdeponowany pod numerem DSM 11450.

Element regulatorowy genu może być znanym lub badanym elementem regulatorowym genu lub konstruktem jednego lub więcej znanych lub jednego lub więcej badanych elementów regulatorowych.

Element regulatorowy genu może zawierać dowolne, związane z regulacją genów sekwencje DNA lub ich odcinki. W stosunku do elementu regulatorowego genu matryca DNA i procedura z jej użyciem mają zastosowanie uniwersalne, przy czym korzystnie element regulatorowy pochodzi z genu eukariotycznego lub mu odpowiada. Element regulatorowy genu może być komórkowym lub wirusowym elementem regulatorowym genu lub elementem syntetycznym. Element regulatorowy genu korzystnie zawiera, między innymi, sekwencje DNA mające miejsca wiązania dla białek wiążących DNA (sekwencje DNA wiążące białka, np. miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych lub fuzji białkowych). Element regulatorowy genu może zawierać promotor (sekwencję promotorową) i/lub jeden lub więcej enhancerów (sekwencji enhancerowych) i/lub jeden lub więcej silencerów (sekwencji silencerowych). Korzystnie element regulatorowy genu zawiera naturalne i/lub sztucznie przygotowane sekwencje promotorowe, enhancerowe i/lub silencerowe lub ich części.

Promotor może zawierać sekwencję TATA i/lub region inicjatorowy (INR) (miejsce punktu startu transkrypcji). Promotor może zawierać sekwencję „GC i/lub „GAAT.

W specjalnej odmianie matrycy DNA element regulatorowy genu jest promotorem modelowym.

Promotor modelowy zawiera właściwe sekwencje promotora, dodatkowe sekwencje DNA wiążące białko i ewentualnie dalsze elementy regulatorowe. Korzystnie, jeśli promotor modelowy zawiera sekwencję TATA i region inicjatorowy. W specjalnej postaci promotor otrzymuje sekwencję TATA ludzkiego receptora komórek T νβ 8.1 i region inicjatorowy promotora ML. Oba te podstawowe elementy promotora umożliwiają podstawową transkrypcję in vitro. Dodatkowo, ten specjalny promotor modelowy posiada 5 miejsc wiązania dla białka Gal4 drożdży i może być dowolnie modyfikowany za pomocą metod biologii molekularnej, np. gdy promotor jest uzupełniany przez badany element regulatorowy genu i/lub pojedyncze regiony promotora modelowego są zastępowane dalszymi elementami regulatorowymi genu, np. badanym elementem regulatorowym genu.

Dla umożliwienia manipulacji korzystne jest występowanie w sekwencji promotora modelowego jednego lub wielu pojedynczych miejsc cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych. W specjalnej postaci promotora modelowego występuje co najmniej jedno pojedyncze miejsce cięcia dla endonukleazy restrykcyjnej pomiędzy sekwencją TATA i miejscami wiązania Gal4.

W promotorze modelowym, oprócz już obecnych miejsc wiążących białka (np. dodatkowo oprócz sekwencji Gal4), mogą być wprowadzane dalsze sekwencje wiążące białka. Jest to szczególnie interesujące gdy np. do już przebadanego układu transkrypcji są dodawane dodatkowe, mające być badane, np. specyficzne czynniki transkrypcyjne.

W kombinacji z modelowym promotorem można stosować białka fuzyjne jako aktywatory i/lub inhibitory transkrypcji. Takie białka fuzyjne mogą np. składać się z domeny wiążącej DNA białka Gal4 drożdży i specyficznej domeny aktywującej, np. domeny aktywującej aktywator HSV VP16. Z użyciem fuzji białkowych mogą być analizowane określone aktywatory i/lub inhibitory lub ich części, np. których domeny aktywujące lub hamujące mają być analizowane bez tła pod kątem wpływu na badany element regulatorowy genu. Przykładowo, jest to możliwe gdy domena wiążąca DNA pochodzi od białka wiążącego DNA, które nie jest obecne w użytym układzie transkrypcyjnym (np. wzbogaconym ekstrakcie jądrowym). Przykładowo aktywator (domenę) czynnika transkrypcyjnego, który istnieje w formie fuzji z domeną wiążącą Gal4 z drożdży, można analizować bez tła, jeśli w procesie stosuje się wzbogacone ekstrakty jądrowe z komórek ssaków, gdyż ekstrakty jądrowe z komórek ssaków nie zawierają Gal4.

Elementami regulatorowymi genów i badanymi elementami regulatorowymi genów, które można stosować, mogą być zdefiniowane ludzkie i/lub zwierzęce i/lub wirusowe elementy regulatorowe genów, w szczególności elementy regulatorowe genów interesujących ze względu na swą patogenność. Przykładem są tu elementy regulatorowe genów cząsteczek adhezyjnych, czynników wzrostu, fosfodiesteraz, fosfataz, kinaz, ATPaz, receptorów błonowych, receptorów drugich messengerów, receptorów hormonów, np. receptorów steroidów, metaloproteaz, immunofilin, syntaz NO, 5-lipoksygenaz lub celów immunologicznych, takie jak elementy regulatorowe genów cytokin, np. interleukin, takie jak promotory genów specyficznie eksprymowanych w komórkach T lub B, np. receptora CD4, TCR lub BCR (receptory komórek T lub B), takie jak promotory genów specyficznych komórek limfoidalnych,

PL 196 578 B1 np. TNF (czynnik martwicy nowotworu) lub elementy regulatorowe genów retrowirusów specyficznych w stosunku do komórek T, np. HTLV-1 lub HIV-1.

Szczególną zaletą sposobu według wynalazku lub promotora modelowego jest to, że elementami regulatorowymi genu mogą być promotory zawierające sekwencję TATA, np. promotor genu, który koduje interleukinę 2 (IL-2), jak i promotory, które nie zawierają sekwencji TATA, np. promotor genu, który koduje łańcuch β receptora komórek T. Przykładowo, promotory, które nie zawierają sekwencji TATA mogą być integrowane w modelowym promotorze lub w uniwersalnym plazmidzie reporterowym pGS100 i użyte do transkrypcji.

Mająca ulec transkrypcji sekwencja DNA charakteryzuje się tym, że nie zawiera w sobie jednej lub więcej zasad nukleotydów. Korzystnie sekwencja mająca ulec transkrypcji nie zawiera guaniny, cytozyny lub tyminy, tzn. sekwencja jest wolna od G, wolna od C lub wolna od T. Sekwencja może nie zawierać więcej niż jednej zasady nukleotydowej, np. guaniny i tyminy albo guaniny i cytozyny albo cytozyny i tyminy. W szczególności można stosować sekwencję wolną od G, wolną od C albo wolną od T o długości większej niż 400 nukleotydów, korzystnie o długości 400 - 2000 nukleotydów lub dłuższą. Szczególnie korzystne są sekwencje o długości około 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 5000 lub więcej nukleotydów. Szczególnie korzystne długości dla sekwencji nie zawierających jednego nukleotydu wynoszą około 800, 1200, 1600, 2200 nukleotydów.

Matryca DNA może być sekwencją DNA liniową lub kolistą. Matryca ta może być przygotowana za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z sekwencją liniową lub plazmidem.

Matryca DNA jest plazmidem i zbudowana jest z całości lub z części wektora, promotora modelowego i mogącej ulec transkrypcji sekwencji, która np. jest wolna od G, wolna od T albo wolna od C.

Plazmid reporterowy o uniwersalnym zastosowaniu (uniwersalny plazmid reporterowy) zawiera pojedyncze miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych Pstl, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI, Swal, część plazmidu pUC19, 5 miejsc wiązania białka z drożdży Gal4, sekwencję TATA ludzkiego receptora komórek T ν β 8.1 między miejscami restrykcyjnymi dla SacII i BamHI, region i-nicjatorowy (INR) promotora ML (główny późny promotor adeno-wirusa) między miejscami restrykcyjnymi BamHI i Swal i sekwencję wolną od G o długości około 800 nukleotydów (par zasad). Promotor modelowy w uniwersalnym wektorze jest promotorem syntetycznym, który zawiera 5 miejsc wiązania Gal4 z drożdży, pojedyncze miejsca cięcia dla Pstl, EcoRI, SacI, KpnI, SacII, BamHI i Swal, sekwencję TATA ludzkiego receptora komórek T ν β 8.1 i INR z promotora ML. Dowolne badane elementy genetyczne mogą być zintegrowane z tym regionem promotorowym. Można też usunąć części promotora modelowego lub cały promotor modelowy i zastąpić badanymi elementami regulatorowymi genów.

Uniwersalny plazmid reporterowy jest określany jako pGS100 (fig. 2).

Postać uniwersalnego plazmidu reporterowego pGS100 charakteryzuje się tym, że syntetyczny promotor znajduje się w obszarze sekwencji pomiędzy pozycjami nukleotydów 2168 i 2337. Region inicjatorowy głównego późnego promotora (ML) adenowirusa znajduje się w pozycji nukleotydowej od 2332 do 2337, a region z TATA, z ludzkiego receptora komórek T ν β 8.1, między pozycjami nukleotydów 2289 i 2316. Pięć miejsc wiązania dla białka Gal4 z drożdży znajduje się między pozycjami nukleotydów 2168 do 2260.

Inna postać uniwersalnego plazmidu reporterowego pGS100 jest podana jako sekwencja nukleotydów (SEQ ID No.: 1) w tabeli 1.

Uniwersalny plazmid pGS100 został zdeponowany w DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig pod numerem DSM 11450 zgodnie z Ustaleniami Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznaniu deponowania mikrooganizmów do celu procedur patentowych.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku białka, które przeszkadzają bezpośrednio lub pośrednio w wykrywaniu specyficznego transkryptu, w taki sposób, że staje się niemożliwym jednoznaczne wykazanie specyficznych transkryptów, zostają oddzielone i/lub zdegradowane po transkrypcji. Oddzielanie lub degradacja to etapy procedury łatwe w realizacji, przykładowo w których reakcję zatrzymuje się chemicznie i/lub mechanicznie i/lub enzymatycznie, z równoczesnym uwolnieniem transkryptów od przeszkadzających białek tak, że po tym etapie nadmiarowe znakowane nukleotydy mogą być oddzielone od specyficznych transkryptów, np. poprzez płukanie.

Sposób według wynalazku umożliwia degradację białek za pomocą proteaz po zakończeniu reakcji transkrypcji. Jako proteazy mogą być stosowane np. proteazy cynkowe, proteazy serynowe, proteazy tiolowe i karboksyproteazy. W szczególności mogą być stosowane: proteinaza K, trypsyna,

PL 196 578 B1 chymotrypsyna, karboksypeptydaza A, papaina i pepsyna. W szczególnej postaci sposobu prowadzi się trawienie proteinaza K po zakończeniu transkrypcji.

W celu zmierzenia wydajności transkrypcji, tzn. szybkości transkrypcji, muszą być oznaczone ilości specyficznego transkryptu.

Transkrypcję prowadzi się w obecności znakowanych nukleotydów lub znakuje się specyficzny transkrypt. Przykładowo transkrypt może nie być znakowany radioaktywnie, gdy do transkrypcji stosuje się odpowiednie nukleotydy nie znakowane radioaktywnie. Jako grupy znakujące dla nukleotydów mogą być stosowane np. grupy fluoryzujące, takie jak dansyl (= N-dimetylo-1-aminonaftylo-sulfonylo-), pochodne fluoresceiny lub kumaryny lub grupy chemiluminescencyjne, takie jak pochodne akrydyny. Wymienione grupy do znakowania pozwalają na bezpośrednie wykrycie specyficznego transkryptu. Ponadto mogą być stosowane grupy znakujące, które są odpowiednie dla pośredniego wykrycia transkryptu. Przykładami są tu digoksygenina, którą można wykryć za pomocą specyficznych przeciwciał anty-digoksygenina, np. za pomocą ELISA, biotyna, którą można wykryć za pomocą systemu biotyna/awidyna i grupy typu „linker arm, które zawierają grupy funkcjonalne pozwalające na późniejsze podstawienie wykrywalną grupą reporterową. Przykładem ostatniej wymienionej możliwości jest np. linker aminoalkilowy, który po transkrypcji może być przekształcony za pomocą czynnego estru akrydyny, a następnie jego obecność można wykryć z użyciem sondy chemiluminescencyjnej.

Transkrypcję można prowadzić w obecności radioaktywnie znakowanych nukleotydów. Nukleo^tydy mo^{gą być} n^p. zna^kowane ra^oaHywrne fosforem (^{32p l}u^b ^P), sfor^ką (³⁵ί5) fo^{b t}rytem (³H).

Szczególną postacią sposobu jest oddzielenie specyficznych transkryptów przez związanie z fazą stałą (stałym nośnikiem). Zostają one wydzielone z mieszaniny reakcyjnej np. przez związanie z płytką do mikromiareczkowania lub przez związanie specyficznego transkryptu ze specjalnymi filtrami, membranami lub innymi fazami stałymi, w szczególności przez wiązanie z naładowaną membraną lub naładowanym filtrem, korzystnie z nylonu lub nitrocelulozy, szczególnie korzystnie przez wiązanie z membraną, która zawiera takie naładowane grupy jak np. grupy dietyloaminoetylowe, np. membraną z DEAE-celulozy. Związane ze stałymi nośnikami specyficzne transkrypty mogą być uwolnione od nadmiarowych znakowanych nukleotydów w takim stopniu, że jest możliwa ich jednoznaczna detekcja.

Nieoczekiwane jest to, że podobnie jak w zwykłych metodach rozdziału i detekcji drogą fenolizacji, strącania i rozdziału transkryptów na żelu denaturującym, dzięki sposobowi według wynalazku uzyskuje się specyficzne sygnały, które tak jak we wspomnianych metodach pozwalają na jednoznaczną detekcję (patrz przykład 7 i fig. 3).

Sposób według wynalazku pozwala odróżnić specyficzne sygnały wywołane przez obecność np. aktywatora (aktywowana transkrypcja) lub inhibitora (hamowana transkrypcja), które różnią się od podstawowego sygnału, np. pod nieobecność aktywatora lub inhibitora, co najmniej o czynnik 7, korzystnie o czynnik 8, a w szczególnych przypadkach o czynnik 9 lub 10 (patrz przykład 7 i fig. 3).

Ważnym aspektem sposobu według wynalazku jest to, że może być on stosowany do badań przesiewowych farmakologicznie czynnych związków. W celu badania potencjalnie czynnych związków pod kątem ich aktywności (np. aktywujących lub hamujących), transkrypcję prowadzi się w obecności testowanego związku. Ewentualnie prowadzi się także preinkubację poszczególnych komponentów, np. wzbogaconego ekstraktu jądrowego, z testowanym związkiem czynnym. Ponadto specyficzność badanego związku czynnego można scharakteryzować przez prowadzenie transkrypcji w obecności testowanego związku czynnego równolegle w kilku transkrypcyjnych mieszaninach zawierających różne składniki i następnie przez oznaczenie i porównanie szybkości transkrypcji.

Badanymi związkami czynnymi mogą być np. naturalne związki i/lub substancje z bibliotek chemicznych i kombinatorycznych. Związki naturalne mogą przykładowo być izolowane z roślin, zwierząt, wydzielin roślin lub zwierząt i, w szczególności, z mikroorganizmów, np. grzybów, drożdży, bakterii lub glonów.

W sposobie według wynalazku transkrypcję prowadzi się w dwóch próbkach w tych samych warunkach, przy czym jedna próbka zawiera badany związek czynny, czynnik transkrypcyjny, kofaktor lub ekstrakt jądrowy specyficznego typu komórek, a druga nie zawiera badanego związku czynnego, czynnika transkrypcyjnego, kofaktora lub ekstraktu jądrowego specyficznego typu komórek. Na podstawie różnic w ilości znakowanego transkryptu ustala się aktywność (np. hamującą, aktywującą), tzn. działanie badanego związku czynnego, czynnika transkrypcyjnego, kofaktora lub ekstraktu jądrowego specyficznego typu komórek w stosunku do badanego elementu regulatorowego genu (lub genu) i/lub czynnika transkrypcyjnego i/lub kofaktora.

PL 196 578 B1

Sposobem według wynalazku określa się badane oddziaływanie danego białka biorącego udział w regulacji genów drogą procedur transkrypcji realizowanych równolegle w tych samych warunkach, przy czym badane białko obecne jest tylko w jednej z próbek.

Zgodnie z jedną z postaci sposobu według wynalazku:

a) prowadzi się co najmniej dwie transkrypcje równolegle w tych samych warunkach, przy czym

b) mieszaniny transkrypcyjne różnią się tylko tym, że zawierają różne ilości badanej substancji czynnej i/lub co najmniej jednego czynnika transkrypcyjnego i/lub co najmniej jednego kofaktora i/lub co najmniej jednego wzbogaconego ekstraktu jądrowego,

c) po transkrypcji oznacza się otrzymaną dla każdej próby ilość znakowanego transkryptu,

d) z różnicy w otrzymanej ilości znakowanego transkryptu ustala się skuteczność i/lub specyficzność badanego związku czynnego, czynnika transkrypcyjnego, kofaktora i/lub wzbogaconego ekstraktu jądrowego w stosunku do elementu regulatorowego genu.

Z użyciem sposobu według wynalazku można badać w sposób ukierunkowany działanie poszczególnych składników (np. na ekstrakt jądrowy, tzn. z określonego typu komórek, lub na określony czynnik transkrypcyjny) obecnych w badanej próbce transkrypcyjnej. Przykładowo może być analizowany wpływ testowanej substancji czynnej na konkretny element regulatorowy genu. Decydujące jest przy tym, by warunki reakcji transkrypcji mogły być precyzyjnie zdefiniowane.

Sposób według wynalazku pozwala wpływać w sposób ukierunkowany na oddziaływanie poszczególnych czynników na patologiczną ekspresję genów, ponieważ umożliwia dobranie i dokładne ustalenie odpowiednich warunków reakcji poprzez dobór elementów regulatorowych genu i czynników transkrypcyjnych i/lub kofaktorów i/lub komórkowo specyficznych ekstraktów jądrowych.

Szczególną zaletą sposobu według wynalazku jest możliwość identyfikacji związków farmakologiczne czynnych, które potrafią w zdefiniowanych warunkach wpływać pozytywnie albo negatywnie na transkrypcję, w szczególności takich, które aktywują lub hamują transkrypcję zdefiniowanych (docelowych) genów, przy czym te związki czynne mają specyficzne działanie na zdefiniowane elementy regulatorowe genów i/lub określone czynniki transkrypcyjne, kofaktory i/lub ekstrakty jądrowe (lub komórki) ze specyficznych typów komórek.

Sposób według wynalazku umożliwia identyfikację specyficznych związków farmakologicznie czynnych. Przykładowo można go stosować dla scharakteryzowania substancji, która ma być badana, np. pod kątem jej specyficzności w określonych warunkach. Przykładowo zidentyfikowany sposobem według wynalazku farmakologicznie czynny związek może w zdefiniowanych warunkach hamować lub aktywować transkrypcję sekwencji DNA zachodzącą pod kontrolą elementów regulatorowych leżących przed sekwencją.

Dalszą zaletą sposobu według wynalazku jest to, że wszystkie etapy mogą być łatwo zautomatyzowane. Przykładowo może być do tego wykorzystany robot pipetujący Biomek 2000® (Firma Beckman, Monachium). Transkrypty związane z fazą stałą mogą być płukane manualnie lub automatycznie (np. taśmowo).

Robot pipetujący np. Biomek 2000® może być wyposażony w poszczególne składniki reakcji, takie jak frakcja białkowa (np. ekstrakt jądrowy i inne białka), matrycę DNA, bufor do transkrypcji, badaną drogą transkrypcji substancję, końcówki do pipet, płytki do mikromiareczkowania i membrany. Z tych składników przygotowywane są pojedyncze próbki reakcyjne, np. w zagłębieniach płytek do mikromiareczkowania, przy czym wszystkie etapy pipetowania prowadzi się automatycznie. Przy małej objętości próbek, zwłaszcza mniejszej niż 100 μ|, np. od 10 do 50 μ|, a szczególnie 20 μ|, można równocześnie obrabiać 96 lub więcej różnych prób transkrypcji na płytce. Każda transkrypcja trwa około 1 do 1,5 godziny, toteż przy optymainym wykorzystaniu czasu transkrypcji można przeprowadzić do 1000 iub więcej transkrypcji dziennie. Transkrypcję można np. prowadzić w temperaturze 20 - 50°C. Szczególnie korzystnie transkrypcję prowadzi się w około 30°C.

Badane związki czynne, czynniki transkrypcyjne, kofaktory i ewentualnie wzbogacone ekstrakty jądrowe są dostępne tylko w ograniczonych ilościach, a trzeba je badać w różnorodnych warunkach reakcji, w wielu procesach transkrypcji. Sposób według wynalazku umożliwia stosowanie bardzo małych objętości w reakcji transkrypcji i jest on odpowiedni do prowadzenia transkrypcji w skali nanolitrowej, tzn. w mieszaninach reakcyjnych o objętości około 50 - 500 nl.

Sposób według wynalazku ma uniwersalne zastosowanie. Może on służyć do identyfikacji i charakterystyki elementów regulatorowych genów (gdy celem jest specyficzny gen), czynników transkrypcyjnych i/lub kofaktorów i/lub innych białek, które są związane bezpośrednio lub pośrednio z regulacją transkrypcji genów (gdy celem jest konkretne białko) i/lub wzbogaconych ekstraktów jądrowych (gdy

PL 196 578 B1 celem jest specyficzny ekstrakt jądrowy lub specyficzny typ komórki). W szczególności sposób transkrypcji może służyć do identyfikacji nowych interesujących ze względu na patologię elementów regulatorowych genów i przyporządkowaniu białek, które przekazują działanie tych elementów do odpowiednich elementów regulatorowych genów.

W porównaniu z metodami oznaczeń komórkowych sposób według wynalazku wykazuje wyższą specyficzność w stosunku do celu. W przeciwieństwie do oznaczeń komórkowych, w sposobie tym pobieranie przez komórkę poszczególnych komponentów nie ma wpływu na wydajność transkrypcji. Sposób ten można więc realizować łatwo i szybko (np. poszczególne składniki mogą być przygotowane i przechowywane w formie zamrożonej). Sposób według wynalazku jest łatwy do standaryzacji i uniwersalnie stosowalny, gdyż daje się stosować do prawie każdego rodzaju komórek i każdego genu.

Sposób według wynalazku umożliwia identyfikację farmakologicznie czynnych związków, które mogą być stosowane do wytwarzania leków. Zidentyfikowane tym sposobem związki czynne powinny wywoływać znacząco mniej działań ubocznych w porównaniu ze znanymi związkami czynnymi. Przykładowo można testować lub identyfikować związki czynne stosowane do wytwarzania leków w terapii chorób autoagresywnych (układu immunologicznego), zaburzeń na tle przemiany materii, raków, chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób zakaźnych, reumatyzmu, cukrzycy, chorób degeneracyjnych i psychicznych, a w szczególności do wytwarzania leków stosowanych w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, alergii, astmy, szoku anafilaktycznego, atopowego zapalenia skóry, choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, AIDS, choroby Creutzfeldta-Jakoba, padaczki, schizofrenii, stwardnienia tętnic i gruźlicy.

Ponadto ten uniwersalny sposób daje liczne dalsze możliwości stosowania. Przykładowo może być on analogicznie stosowany w różnego typu patologiach lub hodowli zwierząt i roślin dla wyszukiwania specyficznych substancji farmakologicznie czynnych z użyciem odpowiednich układów transkrypcyjnych z tych organizmów oraz specyficznych elementów regulatorowych genów, czynników transkrypcyjnych i/lub kofaktorów i/lub innych białek bezpośrednio lub pośrednio związanych z transkrypcją.

Omawiany sposób transkrypcji in vitro można analogicznie stosować do identyfikacji substancji, które mogą znaleźć zastosowanie do konserwacji materiałów i środków spożywczych, z użyciem odpowiednich elementów regulatorowych genów, układów zdolnych do transkrypcji, czynników transkrypcyjnych i/lub kofaktorów mikroorganizmów, np. drożdży, grzybów, bakterii lub owadów.

Na fig. 1 rysunku przedstawiono radioaktywny produkt reakcji transkrypcji, w której zastosowano różne elementy regulatorowe genów i plazmidy reporterowe mające sekwencje wolne od G różnej długości.

Pokazano porównanie dwóch promotorów standardowych z uniwersalnym plazmidem reporterowym pGS100 (fig. 2). Reakcję transkrypcji przeprowadzono jak opisano w przykładzie 6.

A) Transkrypcja podstawowa: Ilość radioaktywnego transkryptu (w jednostkach względnych) uzyskiwana bez aktywacji promotora (natężenie podstawowego sygnału);

B) Transkrypcja aktywowana: Ilość radioaktywnego transkryptu (w jednostkach względnych) otrzymywana po aktywacji promotora Gal4-poliglutaminą.

I) Jako pl^^rmd reporterowy pMRG5 (Kretzschmar, IM.. K. Lottspeich, F..

Meisterernst, M. (1994) Cell 78, 525-534). Syntetyczny promotor w pMRG5 zawiera sekwencję TATA promotora HIV, inicjator promotora ML i około 400 nukleotydową sekwencję wolną od G w pUC19.

II) Jako plazmid reporterowy zastosowano pV3ML. Plazmid reporterowy pV3ML jest zbudowany podobnie do plazmidu reporterowego pGS100 jednak zamiast sekwencji wolnej od G o długości 800 nukleotydów zawiera sekwencję wolną od G tylko o długości 400 nukleotydów.

III) Jako plazmid reporterowy zastosowano pGS100, który zawiera sekwencję wolną od G o długości 800 nukleotydów.

Każdorazowo porównywano transkrypcję podstawową (A) z transkrypcją aktywowaną (B). Jako aktywator zastosowano białko fuzyjne składające się z domeny wiążącej Gal4 (94 aminokwasy N-końcowe) i domeny aktywującej poliglutaminowej (syntetyczny peptyd zawierający jedenaście jednostek kwasu glutaminowego). Podano wartości absolutne po odjęciu tła (uzyskane w jednostkach względnych tak jak się je otrzymuje z zastosowaniem aparatu Phosphoimager®). W reakcjach transkrypcji, w których zastosowano pGS100 jako plazmid reporterowy, mierzono zarówno wyższe wartości bezwzględne jak i, z uwagi na różnorodną budowę syntetycznych promotorów, zdolność do aktyPL 196 578 B1 wacji lepszą niż w przypadku pMRG5. Ponadto widoczny jest dodatni wpływ sekwencji wolnej od G o długości większej od 400 nukleotydów.

Na fig. 2 przedstawiono uniwersalny plazmid reporterowy pGS100. Uniwersalny plazmid reporterowy pGS100 zawiera syntetyczny region promotora jako promotor modelowy przed sekwencją wolną od G o długości około 800 par zasad w pUC19. Między miejscami restrykcyjnymi dla BamHI i Swal znajduje się region inicjatora głównego późnego promotora (ML) adenowirusa. Między miejscami restrykcyjnymi dla SacII i BamHI znajduje się region z sekwencją TATA promotora ludzkiego receptora komórek T ν β 8.1. Oba te podstawowe elementy promotora (inicjator i sekwencja TATA) umożliwiają podstawową transkrypcję in vitro. Ze względu na to, iż elementy te mogą mieć znaczenie w potencjalnych genach docelowych do przeprowadzania badań przesiewowych można je pojedynczo wymienić na odpowiednie regiony badanych genów (odpowiednie elementy regulatorowe genów). Do polilinkera za promotorem podstawowym można wprowadzać dowolne regiony regulatorowe genów docelowych (aktywacja specyficzna). Można także wymieniać cały region promotora. Przed polilinkerem (SacII do Pstl) pGS100 zawiera pięć miejsc wiązania drożdżowego białka Gal4. To umożliwia także analizę syntetycznych aktywatorów transkrypcji, przykładowo białek fuzyjnych złożonych z dowolnej żądanej domeny aktywującej (np. transaktywatora VP16 wirusa opryszczki) i domeny wiążącej DNA Gal4. Niezbędnym elementem pGS100 jest sekwencja wolna od G.

Na fig. 3 przedstawiono porównanie wydajności znanego standardowego sposobu transkrypcji ze sposobem transkrypcji in vitro według wynalazku. Fig. 3 przedstawia porównanie natężenia sygnału (jako miary ilości transkryptu, a zatem siły transkrypcji), które uzyskano w różnych warunkach reakcji transkrypcji. Reakcje transkrypcji przeprowadzono jak opisano w przykładzie 7.

A) Znany standardowy sposób transkrypcji, w którym specyficzne transkrypty oddziela się od białek i nadmiarowych nukleotydów na drodze podziałania fenolem, strącania z użyciem etanolu, a następnie denaturacji z zastosowaniem elektroforezy żelowej;

B) Sposób transkrypcji in vitro według wynalazku, w którym białka są trawione proteinazą K, a nadmiarowe nukleotydy usuwa się na drodze płukania związanych na DEAE-filtrze specyficznych transkryptów.

I) Materiał stosowany do transkrypcji stanowił ekstrakt z jąder komórkowych Hela, zdolny do transkrypcji oraz oczyszczony na kolumnie P11®, bez odpowiedniej matrycy DNA (doświadczenie kontrolne);

II) Transkrypcja podstawowa: do mieszaniny reakcyjnej odpowiadającej mieszaninie reakcyjnej z punktu I dodano plazmidu reporterowego pMGR5 jako matrycę DNA i prowadzono reakcję transkrypcji; w ten sposób otrzymano natężenie podstawowego sygnału;

III) Transkrypcja aktywowana: do mieszaniny reakcyjnej odpowiadającej mieszaninie reakcyjnej z punktu II dodano dodatkowo czynnika transkrypcyjnego, białka fuzyjnego złożonego z domeny wiążącej Gal4 i domeny aktywującej VP16 (Gal4-VP16) i prowadzono transkrypcję; w ten sposób otrzymano natężenie zaktywowanego sygnału;

IV) Do mieszaniny reakcyjnej odpowiadającej mieszaninie reakcyjnej z punktu III dodano α-amanityny jako inhibitora polimerazy II RNA (doświadczenie kontrolne).

Z porównania natężenia sygnałów, które uzyskano dwoma różnymi sposobami w różnych warunkach reakcji wynika, że można zmierzyć nie tylko transkrypcję podstawową (II) lecz również transkrypcję aktywowaną (III) przy pomocy opisanego tu sposobu transkrypcji in vitro, a natężenia sygnałów są podobne do tych, które otrzymuje się gdy stosuje się znany sposób transkrypcji.

Istotne znaczenie ma fakt, iż można zmierzyć także natężenie podstawowego sygnału, tym samym opisany powyżej sposób transkrypcji można również zastosować do badań przesiewowych inhibitorów transkrypcji. Za pomocą specyficznego inhibitora polimerazy II RNA α-amanityny uzyskuje się około ośmiokrotne obniżenie sygnału (porównanie III i IV).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1. Przygotowanie ekstraktów jądrowych HeLa

Ekstrakty jądrowe przygotowano z jąder komórkowych HeLa.

Jądra komórkowe HeLa można nabyć od różnych firm (np. „4°C, Mons; Sigma, Monachium; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg). Opisaną poniżej obróbkę jąder komórkowych prowadzono w temperaturze 4°C (chłodnia). Bufory nastawiano z użyciem Tris pH 6,8 w temperaturze pokojowej, co odpowiada pH 7,3 w temperaturze 4°C. Przed użyciem na bufory działano DTT (1M roztwór podstawowy w wodzie) do stężenia końcowego 5 mM i PMSF (200 mM roztwór podstawowy w DMSO) do stężenia końcowego 1 mM.

PL 196 578 B1

Obróbka jąder obejmowała następujące etapy:

1. Jądra rozmrożono na lodzie i określono objętość osadu jąder (NPV) .

2. Do dwóóC róóżyyC ssZlanyyC zlewekwprowaadzno,w i lośśi oodPwiaadjącej ppłowie oojętości NPV, odpowiednio 0,02M buforu KCI (bufor o niskiej zawartości soli: 20 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 250 ml 100% glicerolu, 6,67 ml 3M KCl, 1,5 ml 1M MgCl₂, 0,4 ml 0,5M EOTA, H2O do 1000 ml) i 1,2M buforu KCl (bufor o wysokiej zawartością soli: 20 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 250 ml 100% glicerolu, 400 ml 3M KCl, 1,5 ml 1M MgCl₂, 0,4 ml 0,5M EOTA, H₂O do 1000 ml).

Oo każdego buforu dodano 0,0007 x NPV/2 β-merkaptoetanolu i 0,001 x NPV/2 0,2M PMSF.

Osad przeprowadzono w stan suspensji w połowie objętości 0,02M buforu KCl i łagodnie homogenizowano z użyciem tłuczka (6x).

3. Homogenat umieszczono w zlewce i w trakcie intensywnego mieszania wkraplano 1,2M bufor KCl przez 30 minut. Po mieszaniu przez kolejne 30 minut ekstrakcję zakończono. Następnie prowadzono wirowanie (wirówka Beckman, rotor SS34 przy 14000 obrotach/minutę, 30 minut, 4°C). Osad i supernatant dalej obrabiano oddzielnie.

4. Supernatant dializowano w buforze 1 (40 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 400 ml glicerolu, 0,8 ml 0,5M EOTA, H₂O do 2000 ml) aż do uzyskania przewodnictwa buforu 2 (40 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 400 ml glicerolu, 0,8 ml 0,5M EOTA,66,7 ml 3M KCl, H₂O do 2000 ml) (45-55 minut).

5. Supernatant po dializie odwirowano (Beckman, rotor SS34, 18000 obrotów/minutę, 20 minut, 4°C). Ekstrakt jądrowy HeLa znajdował się w supernatancie (ekstrakt jądrowy HeLa = HeLa NE). Porcje ekstraktu zamrożono w ciekłym azocie. Osad z ekstrakcji przeniesiono do homogenizatora, dodano 10 ml TGME/5 mM OTT (TGME na 1 litr: 250 ml 100% glicerolu, 50 ml 1M Tris pH 7,3 (temperatura pokojowa), 5 ml 1M MgCl₂, 0,2 ml 500 mM EOTA pH 8,0), homogenizowano 20x z użyciem tłuczka (energicznie) i zamrożono w ciekłym azocie (osad jądrowy HeLa).

P r z y k ł a d 2. Przygotowanie kolumny z fosfocelulozą do wyodrębniania ekstraktu jądrowego

1. Materiał kolumny P11® przepłukano kilkakrotnie wodą. Określono objętość spęcznionego materiału.

2. Oodano 5 objętości 0,5N NaOH, odstawiono na 5 minut, a następnie natychmiast odsączono na sączku karbowanym.

3. Przepłukano wodą aż do pH 11.

4. Oodano 25 objętości 0,5N HCl. Odstawiono na 5 minut, po czym natychmiast przesączono.

5. Przepłukano wodą aż do pH 3.

6. Przepłukano 1M Tris pH 7 do stałego pH 7. Materiał kolumny przechowywano w 4°C. Materiał najlepiej pozostawić na noc dla osiągnięcia stanu równowagi.

P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie chromatograficzne ekstraktu jądrowego metodą chromatografii na kolumnie z fosfocelulozą.

Pojemność materiału P11® wynosiła 10 mg białka/1 ml materiału.

Chromatografię przeprowadzono w następujący sposób:

1. Umieszczono materiał P11® w kolumnie i równoważono w buforze 2 (ze świeżo dodanym OTT i PMSF, patrz przykład 1). Podłączono kolumnę do pompy.

2. Załadowano ekstrakt jądrowy (jedna objętość kolumny -(CV)/godzinę) (w buforze 2).

3. Kolumnę przemyto 5 CV buforu 2 (5-10 CV/godzinę).

4. Eluowano buforem 3 (40 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 400 ml glicerolu, 0,8 ml 0,5M EOTA, 200 ml 3M KCl, H₂O do 2000 ml; 2 CV/godzinę). Gdy białko nie było już eluowane, przepuszczono dalsze 2 CV buforu 3.

5. Eluowano buforem 4 (40 ml 1M Tris pH 6.8 (temperatura pokojowa), 400 ml glicerolu, 0,8 ml 0,5M EOTA, 333 ml 3M KCl, H₂O do 2000 ml; 2 CV/godzinę) i zbierano frakcje szczytowe.

6. Eluowano buforem 5 (40 ml 1M Tris pH 6,8 (temperatura pokojowa), 400 ml glicerolu, 0,8 ml 0,5M EOTA, 567 ml 3M KCl, H₂O do 2000 ml; 2 CV/godzinę) i zbierano frakcje szczytowe.

7. Oba eluaty dializowano względem buforu 2 aż do uzyskania stałego przewodnictwa, a następnie próbki zamrożono w ciekłym azocie.

P r z y k ł a d 4. Standardowy sposób transkrypcji z zastosowaniem żelu poliakryloamidowego do rozdziału transkryptów

Mieszanina reakcyjna transkrypcji (objętość końcowa 20 μΙ) może zawierać następujące składniki:

PL 196 578 B1

a) ogólne czynnikitranskrypcyjnew postaci wstępnie oczyszczonych ekstraktów jądrowych lub wytworzone metodami rkSgmbinazji, ewentualnie bybokłnignk o dalkze kokzcfizynk zycnniSi trankSrcozcjnk, aktywatory, inhibitory lub białka fbzcjne;

b) matryza DNA wektor oGS1OO z badanymi elementami regulatorowymi genów); z) bufor do tranktryczji, który np. zawiera badany związek zzynny;

d) znakowane i nieznaSowane nuSleotcdc.

Ad a) Eluat buforem 4 i eluat buforem 5 (z przykładu 3) zawierały zdolny do trankSrcozji eSktraSt jądrowy (wkzyztkie ogólne zzynniki trankkryczyjne). Optymalne ilośzi eluatu buforem 4 i eluatu buforem 5 powinny być uktalane dla każdego preparatu (około 3 μΙ eluatu buforem 4 i 2 μΙ eluatu buforem 5 na próbę)

Ad b) Na ogół ktokowano 100 ng matryzy DNA (element regulatorowy genu w plazmidzie reporterowym np. pGS100) na próbę.

Ad z) Bufor do trankkrypzji (5 mM MgCh, 25 mM HEPES KOH pH 8,2, 0,5 μl azetylowanej BSA (roztwór podktawowy 20 mg/ml), około 10% glizerol, około 70 mM KCl, 0,2 mM PMSF, 10 mM DTT) z dodatkiem 20 U inhibitora RNAzy na próbkę.

Ad d) NTP-y (ATP, UTP ktpżenie końzowe 100 μΜ, CTP ktpżenie końzowe 5 μΜ, o-m-GTP ktpżenie końzowe 20 μΜ, a-³²P-CTP ktpżenie końzowe około 0,12 μΜ 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml).

1. Wprowadzono bufor do trankkrypzji i dNTP-y i dodano matryzy DNA.

2. Dodano aktywatora trankkrypzji i eluowano buforem 4 i buforem 5.

3. W zelu przeprowadzenia trankkrcozji prowadzono inkubazjp przez 1 godzinp w 30°C.

4. Dodano 400 μl miekzaniny ktopujdzej (7M mozznik, 10 mM Trik HCl pH 7,8, 10 mM EDTA/NaOH pH 8, 0,5% SDS, 100 mM LiCl, 100 μg/ml tRNA, 300 mM oztan kodu) i 400 μl miekzaniny fenol:zhloroform:alkohol izoamylowy (25/24/1). Zmiekzano i odwirowano (rotor SS34, wirówka Bezkman, 5 minut, 14000 obrotów/minutp, temperatura pokojowa). Supernatant odzidgnipto, dodano 400 μl izopropanolu i załość zmiekzano, po zzym pozoktawiono w temperaturze -20°C na 1 godzinp.

5. Odwirowano (rotor SS34, wirówka Bezkman, 1400 obr/min, 30 minut, 4°C). Okad przepłukano 70% etanolem i wykukzono w aparazie Speedvaz.

6. Okad roztworzono w 10 μl buforu obzidżajdzego (955 μl 100% formamidu (dejonizowany), 10 μl 0,5M EDTA, 20 μl 1M Trik pH 7, w każdym przypadku po 0,003% błpkitu bromofenolowego/kkclenozcjanolu, H₂O do 1 ml) i inkubowano przez 15 minut w 50°C.

7. Trankkrypty rozdzielono na 5% denaturujdzym żelu mozznikowo-ooliakrcloamidowcm z użyziem 1 x TBE jako buforu robozzego. Preelektroforezp prowadzono przez 20 minut przy 60 mA. Naniekiono próbki na żel. Elektroforezp prowadzono przez około 1 godzinp przy 60 mA.

8. Żel utrwalono w 10% kwakie oztowym, wykukzono i ekkponowano na klikzp rentgenowkkd w aparazie Phokohoimager®.

P r z y k ł a d 5. Protokół automatyzowalnego kpokobu trankkrypzji in vitro z zaktokowaniem filtru do widzania trankkrcotu

1. Wprowadzono bufor do trankkrypzji i dNTPk i dodano matryzy DNA.

2. Prowadzono eluowanie z użyziem bufora 4 i 5 i dodawano odpowiednio aktywatora trankkrypzji lub inhibitora trankkrcozji.

3. Miekzaninp inkubowano przez 1 godzinp w temperaturze 30°C w zelu przeprowadzenia reakzji trankkrcozji.

4. Dodano 5 μl miekzaniny Proteinazy K (1 μl roztworu proteinazy K [20 mg/ml], 1 pl, 10% SDS, 0,5 pl 0,5M EDTA pH 8, 1 pl 50 mM Trik pH 7,8, H₂O do 5 pl).

5. Inkubazjp prowadzono przez 15 minut w 30°C.

6. Membranp DEAE przepłukano krótko NA 45® (Szhleizher und Szhuell) w buforze do płukania membrany (100 mM bufor fokforan kodu pH 7,5, 250 mM NaCl, 2% oirofokforan kodu).

7. Za pomozd pipety naniekiono 5 μΙ miekzaniny reakzyjnej na membranp, po zzym pozoktawiono do wykzhnipzia na 5 minut.

8. Membranp lekko wytrzdkano 4 x 15 minut w około 100 ml buforu do płukania membran (+ 1% Triton).

9. Membranp przeniekiono na bibułp Whatmann 3 MM® (Whatman, Maidktone, Anglia), wykukzono na powietrzu, przykryto folid i ekkponowano na klikzp rentgenowkkd z zaktokowaniem aparatu Phokohoimager®.

P r z y k ł a d 6. Reakzjp trankkrcozji przeprowadzono kpokobem in vitro z zaktokowaniem filtru równolegle z trzema plazmidami reporterowymi

PL 196 578 B1

Zastosowano taką samą procedurę jak opisano w przykładach 1 - 3 i 5. Jako plazmidy reporterowe zastosowano pMRG5 (sekwencja TATA promotora HIV, region inicjacji promotora ML i kaseta wolna od G o długości około 400 nukleotydów w pUC 19 (Kretzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell, 78, 525-534), pGS100 (fig. 2) i pV3ML (skonstruowany jak pGS100, ale zawiera tylko kasetę wolną od G o długości 400 bp zamiast kasety 800 bp). Do reakcji transkrypcji zastosowano po 100 ng matrycy DNA i 3 μΙ frakcji z P11® (eluaty buforem 4 i buforem 5). Reakcje prowadzono równolegle z użyciem aktywatora lub pod jego nieobecność (białko fuzyjne złożone z domeny wiążącej Gal4 i domeny aktywującej poliglutaminowej). Wyniki przedstawiono i wyjaśniono na fig. 1.

P r z y k ł a d 7. Porównanie natężenia sygnału (jako miary ilości transkryptu, zatem siły transkrypcji) radioaktywnie znakowanych transkryptów uzyskanych za pomocą standardowego sposobu transkrypcji z tym, który jest uzyskany za pomocą opisanego sposobu transkrypcji in vitro

Reakcje transkrypcji przeprowadzono w sposób opisany w przykładach 1 - 5 i równolegle próbki reakcji analizowano na filtrze (przykład 5) lub żelu (przykład 4). W reakcji zastosowano po 200 ng pMRGS jako matrycy DNA. Niektóre reakcje transkrypcji przeprowadzono w obecności 30 ng Gal4-VP16, który został dodany jako aktywator. Wyniki przedstawiono i opisano na fig. 3.

T a b e l a 1: SEQ ID No.: 1

Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: Hoechst Aktiengesellschaft (B) Ulica: (C) Miasto: Frankfurt (D) Land: (E) Państwo: Niemcy (F) Kod pocztowy: 65926 (G) Telefon: 069-305-7072 (H) Telefaks: 069-35-7175 (I) Teleks:

(ii) Tytuł zgłoszenia:

Sposób identyfikacji substancji farmakologicznie czynnych obejmujący bezkomórkową transkrypcję in vitro i matryca DNA (iii) Liczba sekwencji: 1 (iv) Sposób odczytu komputerowego:

(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln #1.0, wersja #1.25 (EPA) (2) Informacja o SEQ ID No.: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3130 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: kolista (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: egzon (B) położenie: 1..3130 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID No.: 1

PL 196 578 B1

TTTCCTGTGT	gaaattgtta	TCCGCTCACA AATCCAAAAA	ACATACGAGC	CCGGAAGCCA	60
aagtgtaaag	CCTGGGGTGC	CTCATGAGTG ACGCTACCTA	CACTtATTGC	GGTGCGCCCA	120
CTGCCCGCTT	TCCAGTCGGG	A7CCCTGTCG TGCCACCTGC	atttactgjcit	CGGGCCACGC	180
GCGGGGAGAG	GCGGTTTGCG	TATTGGGCGC TCTTCCGCCT	CCTCGCTCAC	TGGCCCGCTG	240
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGCGCGGTC TCCGCTCCCT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	300
TCCACAGCAT	CAGGGGATAA	CGCCGGCACG CCCCTGTGCG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	360
AGGAACCGTA	CAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG tttttccata	GGCTCCGCCC	CCCTGCCGCG	420
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	ACGTCCGCGG TGGCGAAACC	CGCCAGGACT	ATAAAGATCC	430
CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	540
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGC CGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	600
AGGTATCTCA	GTTCGGTGTC	GGTCGTTCGC tccaagctgg	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	660
GTTCAGCCCG	CCCGCTGCGC	CTTCTCCGGT acctatcgtc	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	720
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	agcagcccct ggtcacaggc	TTCGCAGAGC	GAGGTCTGTA	780
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG CCTAACTACG	GCTCCACTAG	AAGGACAGTA	340
TTTGGTATCT	GCGGTCTGCT	GACGCCAGTT CCCTTCGGCA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGC	900
TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTCGCGGT GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGCTTACG	960
CGCAGAAAAA	CAGGATCTCC	AGCAGATCCT TTGCTCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCCG	1020
.TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	CGGGATTTTG GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GCTCTTCACC	1080
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGACGTTTT CAATCCATCT	' AAAGTATATC	. TGCGTAAACT	1140
TGGTCTGACA GTTACCAATG	CTTAATCCGT GCGGCACCTC TCTCAGCGAT CTGTCTCTTT	1200
CGTTCATCCA TAGTTGCCTG	1 CCTCCCCGTC GTGTCGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTC	1260

PL 196 578 Β1

CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 1320

TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 1380

GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 1440

AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT 1500

ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTC 1560

TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA 1620

GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 1680

AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG 1740

CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT 1800

TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG 1860

CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT 1920 actttcacca gcgtttctgg GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 1980

ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC 2040

ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA 2100

CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGGGGGACT AGAGTCTCCG 2160

CTCGGAGGAC AGTACTCCGC TCGGAGGACA GTACTCCGCT CGGAGGACAG TACTCCGCTC 2220_;

GGAGGACAGT ACTCCGCTCG GAGGACAGTA CTCCGACCTG CAGGAATTCG AGCTCGGTAC 2280

CCGCGGGGAT AAAATGTCAC AAAATTCATT TGGATCCTCA CTCTCTTCAT TTAAATATCC 2340

CATACCCTTC CTCCATCTAT ACCACCCTAC TCTCCTTTCC TCATTATTCC TCCTATTATC 2400

TTCTCCTCTT CTCTCCTTCT TCTATATTTC CCAAATCTAT CATCATTCAC TCTCATCCCC 2460

TCTTCCTTCA CTCCCATTCT ATTCTACTCC TTTCCCTTTC CATATCCCCT CCACCCCCCT 2520

TCCTCCCCTC TTTCAATCTT ATCCCCAATC ATAAAATTAT CTCAATTATA TTCTCCTTCC 2580

PL 196 578 B1

ATACCCCCTA	TCATCCTCAT	CCCTATCACC	CCCTACTCAC	CCAATACTCC	CTACTCATCT	2640
CATATATCCT	TATCCTCTCC	TCACCTCTCC	CTCCTCTATC	TCCCCCCCTC	ACACTCATTT	2700
CTCATTCCAC	TCCCAAATAT	CCCATACCCT	TCCTCCATCT	ATACCACCCT	ACTCTCCTTT	2760
CCTCATTATT	CCTCCTATTA	TCTTCTCCTC	TTCTCTCCTT	CTTCTATATT	TCCCAAATCT	2820
ATCATCATTC	ACTCTCATCC	CCTCTTCCTT	CACTCCCATT	CTATTCTACT	CCTTTCCCTT	2880
TCCATATCCC	CTCCACCCCC	CTTCCTCCCC	TCTTTCAATC	TTATCCCCAA	TCATAAAATT	2940
ATCTCAATTA	TATTCTCCTT	CCATACCCCC	TATCATCCTC	ATCCCTATCA	CCCCCTACTC	3000
ACCCAATACT	CCCTACTCAT	CTCATATATC	CTTATCCTCT	CCTCACCTCT	CCCTCCTCTA	3060
TCTCCCCCCC	TCACACTCAT	TTCTCATTCC	ACTCCCGGGG	ATCAGCTTGG	CGTAATCATG	3120
GTCATAGCTG						3130

Zastrzeżenia patentowe

Claims (3)

1. Sposób identyfikacji substancji farmakologiccme czynnych obejmujący bezkomórkową transkrypcję in vitro, znamienny tym, że a) przygotowuje się matrycę DNA zawierającą przeznaczoną do transkrypcji sekwencję DNA znajdującą się pod kontrolą co najmniej jednego elementu regulatorowego genu, miesza się matrycę z co najmniej jednym znakowanym nukleotydem, ekstraktem jądrowym i badaną substancją czynną, po czym prowadzi się reakcję transkrypcji, b) po transkrypcji zawarte w próbce białka oddziela się i/lub degraduje, c) znakowany transkrypt wiąże się ze stałym nośnikiem, d) nadmiarowe znakowane nukleotydy usuwa się i e) określa się ilość znakowanego transkryptu względem próby równoległej bez badanej substancji czynnej, przy czym matryca DNA obejmuje sekwencję SEQ ID No.: 1 lub stanowi uniwersalny plazmid reporterowi, zdeponowany pod numerem DSM 11450.

2. Matryca DNA mająca sekwencję SEQ ID No.: 1.

3. Matryca DNA zdeponowana pod numerem DSM 11450.