JPH10248585A - 天然物および他の化学物質をスクリーニングするためのインビトロ転写法 - Google Patents
天然物および他の化学物質をスクリーニングするためのインビトロ転写法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率的かつ経済的な大量スクリーニングに適
しているウイルスおよび細胞遺伝子の転写のインビトロ
分析法の提供。 【解決手段】 遺伝子調節要素によって制御されている
転写されるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ鋳型のインビ
トロ転写法であって、a) 細胞核由来の濃縮抽出物、お
よび少なくとも１種類の標識ヌクレオチドを転写に用
い、b) 適当ならば、転写の後に反応混合物中のタンパ
ク質を単離しおよび／または分解し、c) 標識した転写
体を固体マトリックスに結合させ、d) 過剰の標識した
ヌクレオチドを除き、e) 標識した転写体を定量するこ
とを含む方法。
しているウイルスおよび細胞遺伝子の転写のインビトロ
分析法の提供。 【解決手段】 遺伝子調節要素によって制御されている
転写されるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ鋳型のインビ
トロ転写法であって、a) 細胞核由来の濃縮抽出物、お
よび少なくとも１種類の標識ヌクレオチドを転写に用
い、b) 適当ならば、転写の後に反応混合物中のタンパ
ク質を単離しおよび／または分解し、c) 標識した転写
体を固体マトリックスに結合させ、d) 過剰の標識した
ヌクレオチドを除き、e) 標識した転写体を定量するこ
とを含む方法。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、自動化することができ、遺伝子活性に選択的
効果を有する特異的な化学的リード構造（lead structu
re）を見出だすための効率的かつ経済的な大量スクリー
ニングに適しているウイルスおよび細胞遺伝子の転写の
インビトロ分析法に関する。
効果を有する特異的な化学的リード構造（lead structu
re）を見出だすための効率的かつ経済的な大量スクリー
ニングに適しているウイルスおよび細胞遺伝子の転写の
インビトロ分析法に関する。
【０００２】背景技術 活性物質を合理的にデザインするだけでは、活性物質の
探索に成功することはできないことが明かになってか
ら、生物活性成分を目的とした天然物のスクリーニング
が著しく増加した。例えば、研究は化学物質のライブラ
リーおよび結合ライブラリーだけでなく、物質の起源と
しての天然物の伝統的抽出物にも集中している。これ
は、主としてこれらの抽出物が含む物質の多様性によ
る。モデル分析法は、微生物発酵の抽出物は約５００種
類の化合物を含んでおり、これらはその構造において著
しく異なっている。その多様性に関して、それらは化学
的および結合物質ライブラリーよりはるかに勝ってい
る。
探索に成功することはできないことが明かになってか
ら、生物活性成分を目的とした天然物のスクリーニング
が著しく増加した。例えば、研究は化学物質のライブラ
リーおよび結合ライブラリーだけでなく、物質の起源と
しての天然物の伝統的抽出物にも集中している。これ
は、主としてこれらの抽出物が含む物質の多様性によ
る。モデル分析法は、微生物発酵の抽出物は約５００種
類の化合物を含んでおり、これらはその構造において著
しく異なっている。その多様性に関して、それらは化学
的および結合物質ライブラリーよりはるかに勝ってい
る。
【０００３】様々なしかも十分には検討されていない可
能性のある天然物の薬理学的開発を制限する要因は、候
補の活性物質を試験することができる適用可能で意義の
ある方法が多数あることである。特に、特異性の高い薬
理活性物質であって、その適用が副作用をほとんど生じ
ないものを同定するのに用いることができる方法が必要
とされる。
能性のある天然物の薬理学的開発を制限する要因は、候
補の活性物質を試験することができる適用可能で意義の
ある方法が多数あることである。特に、特異性の高い薬
理活性物質であって、その適用が副作用をほとんど生じ
ないものを同定するのに用いることができる方法が必要
とされる。
【０００４】下記の方法は、物質を遺伝情報のまさに第
一段階に関与するその可能性、すなわち遺伝子転写の制
御について試験する方法に基づいている。このような方
法は、転写について直接または間接的、正または負の効
果を有する物質を同定しようとするものである。
一段階に関与するその可能性、すなわち遺伝子転写の制
御について試験する方法に基づいている。このような方
法は、転写について直接または間接的、正または負の効
果を有する物質を同定しようとするものである。
【０００５】遺伝子の転写力は、この遺伝子の遺伝子調
節要素、特にプロモーター、エンハンサー、サイレンサ
ーによって測定される。遺伝子調節要素の作用は、転写
因子および補因子によって介在されかつ転換される。こ
れらの転写因子は遺伝子の転写速度に対して負のあるい
は正の効果を有することができるので、転写力に寄与す
る。一方、多数の転写因子が、シグナル形質導入、細胞
サイクル制御、分化および制御された細胞死（アポトー
シス）などの多数の細胞工程中の重要な「分子スイッ
チ」として同定されている。
節要素、特にプロモーター、エンハンサー、サイレンサ
ーによって測定される。遺伝子調節要素の作用は、転写
因子および補因子によって介在されかつ転換される。こ
れらの転写因子は遺伝子の転写速度に対して負のあるい
は正の効果を有することができるので、転写力に寄与す
る。一方、多数の転写因子が、シグナル形質導入、細胞
サイクル制御、分化および制御された細胞死（アポトー
シス）などの多数の細胞工程中の重要な「分子スイッ
チ」として同定されている。
【０００６】細胞が受け取る、遺伝子の転写力に影響を
与えるシグナルの大半は、膜貫通タンパク質によって
「登録」され、シグナル伝達連鎖によって細胞内に伝達
され、転写因子によって転換される。外部シグナルを受
け取るタンパク質の例は、ｃＡＭＰ結合タンパク質、成
長シグナルのセンサー（例えば血清応答因子、ＳＲ
Ｆ）、ホルモンレセプターまたは転写因子であってサイ
トカイン発現に関与するいわゆるＳＴＡＴタンパク質
（シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因
子）である。
与えるシグナルの大半は、膜貫通タンパク質によって
「登録」され、シグナル伝達連鎖によって細胞内に伝達
され、転写因子によって転換される。外部シグナルを受
け取るタンパク質の例は、ｃＡＭＰ結合タンパク質、成
長シグナルのセンサー（例えば血清応答因子、ＳＲ
Ｆ）、ホルモンレセプターまたは転写因子であってサイ
トカイン発現に関与するいわゆるＳＴＡＴタンパク質
（シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因
子）である。
【０００７】一方、遺伝子の転写力に直接または間接的
効果を有する多数の物質が知られている。このような物
質は、とりわけ医薬品の薬理活性物質として用いられる
が、これらの物質の作用は特異的でないことが多い。し
たがって、このような医薬品を服用すると、望ましくな
い副作用が伴う。
効果を有する多数の物質が知られている。このような物
質は、とりわけ医薬品の薬理活性物質として用いられる
が、これらの物質の作用は特異的でないことが多い。し
たがって、このような医薬品を服用すると、望ましくな
い副作用が伴う。
【０００８】例えば、免疫疾患は、サイクロスポリンお
よびステロイド誘導体を活性物質として含んでなる医薬
品で治療される。サイクロスポリンＡはサイクロフィリ
ンと複合体を形成する。後者は遍在ホスファターゼであ
るカルシニューリンを阻害し、カルシニューリンは各種
の代謝経路によりタンパク質を脱リン酸化する。カルシ
ニューリンは、例えば転写因子のサブユニットＮＦＡＴ
のサイトゾルから核への輸送を調節する(Liu, J. (199
3) Immunology Today 14, 290-295) 。ＮＦＡＴ（活性
化したＴ細胞の核因子）は、ある種の免疫関連遺伝子の
活性化に関与する。サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、
ＮＦＡＴ（活性化したＴ細胞の核因子）に対するその効
果によりこれらの遺伝子の発現を間接的に調節する。し
かしながら、サイクロスポリンＡは間接的にのみ、すな
わち遍在カルシニューリンを介してＮＦＡＴ活性を調節
するので、サイクロスポリンＡは他の代謝経路を介して
血管収縮薬、および腎および神経毒としても作用する。
ＮＦＡＴを特異的に、場合によっては直接的に阻害する
ことができる薬理活性物質が知られていたならば、この
活性物質を含む医薬品は、恐らく副作用をほとんど起こ
さないであろう。
よびステロイド誘導体を活性物質として含んでなる医薬
品で治療される。サイクロスポリンＡはサイクロフィリ
ンと複合体を形成する。後者は遍在ホスファターゼであ
るカルシニューリンを阻害し、カルシニューリンは各種
の代謝経路によりタンパク質を脱リン酸化する。カルシ
ニューリンは、例えば転写因子のサブユニットＮＦＡＴ
のサイトゾルから核への輸送を調節する(Liu, J. (199
3) Immunology Today 14, 290-295) 。ＮＦＡＴ（活性
化したＴ細胞の核因子）は、ある種の免疫関連遺伝子の
活性化に関与する。サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、
ＮＦＡＴ（活性化したＴ細胞の核因子）に対するその効
果によりこれらの遺伝子の発現を間接的に調節する。し
かしながら、サイクロスポリンＡは間接的にのみ、すな
わち遍在カルシニューリンを介してＮＦＡＴ活性を調節
するので、サイクロスポリンＡは他の代謝経路を介して
血管収縮薬、および腎および神経毒としても作用する。
ＮＦＡＴを特異的に、場合によっては直接的に阻害する
ことができる薬理活性物質が知られていたならば、この
活性物質を含む医薬品は、恐らく副作用をほとんど起こ
さないであろう。
【０００９】所望な効果の他に、強力な副作用も伴う薬
理活性物質としては、糖質コルチコイドも挙げられる。
糖質コルチコイドは、アレルギー、リウマチ、炎症、お
よび過剰反応性の免疫系によって引き起こされる他の疾
患の標準的治療に長年に亙って用いられてきた。それら
は、とりわけ細胞ＮＦｋＢインヒビター、すなわちＩｋ
Ｂタンパク質の形成を刺激することによって細胞型特異
的転写因子ＮｆｋＢの活性化を阻害する(Scheinmann,
R.I., Cogswell, P.C., Lofquist, A.K. & Baldwin J
r.,A.S. (1995) Science 270, 283-286; Auphan, N., D
iDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A. & Karin
M. (1995) Science 270, 286-290) 。次いで、ＩｋＢ
は、活性なＮＦｋＢ二量体の核への移行、したがって重
要な免疫学的標的遺伝子の活性化を妨げる。ＣｓＡにつ
いて言われていることと同様に、糖質コルチコイドの遺
伝子発現に対する効果は、糖質コルチコイドがＮＦｋＢ
だけでなく他のタンパク質にも作用するので比較的非特
異的である。
理活性物質としては、糖質コルチコイドも挙げられる。
糖質コルチコイドは、アレルギー、リウマチ、炎症、お
よび過剰反応性の免疫系によって引き起こされる他の疾
患の標準的治療に長年に亙って用いられてきた。それら
は、とりわけ細胞ＮＦｋＢインヒビター、すなわちＩｋ
Ｂタンパク質の形成を刺激することによって細胞型特異
的転写因子ＮｆｋＢの活性化を阻害する(Scheinmann,
R.I., Cogswell, P.C., Lofquist, A.K. & Baldwin J
r.,A.S. (1995) Science 270, 283-286; Auphan, N., D
iDonato, J.A., Rosette, C., Helmberg, A. & Karin
M. (1995) Science 270, 286-290) 。次いで、ＩｋＢ
は、活性なＮＦｋＢ二量体の核への移行、したがって重
要な免疫学的標的遺伝子の活性化を妨げる。ＣｓＡにつ
いて言われていることと同様に、糖質コルチコイドの遺
伝子発現に対する効果は、糖質コルチコイドがＮＦｋＢ
だけでなく他のタンパク質にも作用するので比較的非特
異的である。
【００１０】これらの例から、その作用の概略ができる
だけ特異的である薬理活性物質が強く求められているこ
とは明かである。このような特性を有する新規な化学的
リード構造を見出だすには、多数の物質をその特異活性
について試験しなければならない。
だけ特異的である薬理活性物質が強く求められているこ
とは明かである。このような特性を有する新規な化学的
リード構造を見出だすには、多数の物質をその特異活性
について試験しなければならない。
【００１１】同一の遺伝的構築を行っても、個々の細胞
は常に、細胞の型および／またはある種の疾患または欠
損、およびこれらの細胞が発生し、分化するそれぞれの
程度によって、特異的タンパク質だけを発現する。細胞
のこの個性の基礎は、遺伝子調節タンパク質の特異的レ
パートリー、例えば細胞型特異的で発生特異的構築であ
ると考えられる。この構築は別個の遺伝子の調和して制
御された転写を調節するある種の転写因子および補因子
（アクセサリータンパク質）を提供すると考えられる。
は常に、細胞の型および／またはある種の疾患または欠
損、およびこれらの細胞が発生し、分化するそれぞれの
程度によって、特異的タンパク質だけを発現する。細胞
のこの個性の基礎は、遺伝子調節タンパク質の特異的レ
パートリー、例えば細胞型特異的で発生特異的構築であ
ると考えられる。この構築は別個の遺伝子の調和して制
御された転写を調節するある種の転写因子および補因子
（アクセサリータンパク質）を提供すると考えられる。
【００１２】したがって特異的な薬理活性物質は、画定
された型の細胞での病理学的に関連した遺伝子の転写を
選択的に活性化または阻害すべきである。このような活
性物質を同定するには、個々の遺伝子の転写に対する、
すなわち転写調節に関与するタンパク質および遺伝子調
節要素に対する候補の活性物質の効果を画定条件下で直
接測定することができる転写法が必要である。多数の候
補の活性物質を試験しなければならないので、他の前提
条件は、この方法が簡単に行うことができかつこれを自
動化することができることである。
された型の細胞での病理学的に関連した遺伝子の転写を
選択的に活性化または阻害すべきである。このような活
性物質を同定するには、個々の遺伝子の転写に対する、
すなわち転写調節に関与するタンパク質および遺伝子調
節要素に対する候補の活性物質の効果を画定条件下で直
接測定することができる転写法が必要である。多数の候
補の活性物質を試験しなければならないので、他の前提
条件は、この方法が簡単に行うことができかつこれを自
動化することができることである。
【００１３】最初の無細胞転写法はWeilらによって報告
された(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder,
R.G. (1979) Cell 18, 469-484)。この方法では、細胞
核からの濃縮抽出物（いわゆるＳ１００抽出物）(Weil,
P.A., Segall, J., Harris,B.Ng, S.Y., Roeder, R.G.
(1979) J. Biol. Chem. 254, 6163-6173) 、および精
製したＲＮＡポリメラーゼIIをインビトロ転写に用い
た。外来ＲＮＡポリメラーゼIIなしでは、これらの濃縮
したがこれ以上精製しない核抽出物は転写はできなかっ
た(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.
G. (1979) Cell 18, 469-484; Digman, J.D., Martin,
P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods i
n Enzymology 101, 582-598) 。
された(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder,
R.G. (1979) Cell 18, 469-484)。この方法では、細胞
核からの濃縮抽出物（いわゆるＳ１００抽出物）(Weil,
P.A., Segall, J., Harris,B.Ng, S.Y., Roeder, R.G.
(1979) J. Biol. Chem. 254, 6163-6173) 、および精
製したＲＮＡポリメラーゼIIをインビトロ転写に用い
た。外来ＲＮＡポリメラーゼIIなしでは、これらの濃縮
したがこれ以上精製しない核抽出物は転写はできなかっ
た(Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J., Roeder, R.
G. (1979) Cell 18, 469-484; Digman, J.D., Martin,
P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods i
n Enzymology 101, 582-598) 。
【００１４】このような核抽出物から出発して、数個の
精製段階を用いて転写因子を単離する方法が続いて開発
された。これらの方法は、とりわけ核タンパク質を結合
する材料、例えばホスホセルロースカラム上でのクロマ
トグラフィによって核抽出物を精製する精製段階を含ん
でいる。数段階を含むこれらの複雑な方法の範囲内で
は、Dignamらの文献は精製段階の一つに市販のP11 Syst
em（商標名）(Whatman,メイドストーン, 英国）の使用
を記載した最初のものであった(Dignam, J.D., Martin,
P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods
in Enzymology 101, 582-598) 。
精製段階を用いて転写因子を単離する方法が続いて開発
された。これらの方法は、とりわけ核タンパク質を結合
する材料、例えばホスホセルロースカラム上でのクロマ
トグラフィによって核抽出物を精製する精製段階を含ん
でいる。数段階を含むこれらの複雑な方法の範囲内で
は、Dignamらの文献は精製段階の一つに市販のP11 Syst
em（商標名）(Whatman,メイドストーン, 英国）の使用
を記載した最初のものであった(Dignam, J.D., Martin,
P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983) Methods
in Enzymology 101, 582-598) 。
【００１５】数段階を含むこれらの精製法は増々良好に
適用されて、細胞核の抽出物から個々の転写因子を複雑
な工程によって単離することができるほどになった。更
に、個々の因子またはそれらのサブユニットは、例えば
ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥα、ＴＦＩＩＥβ
およびＴＦＩＩＦのような組換体の形態でも入手可能で
ある(Zawel, L. and Reinberg, D. (1995) Annu Rev. B
iochem. 64, 533-561)。
適用されて、細胞核の抽出物から個々の転写因子を複雑
な工程によって単離することができるほどになった。更
に、個々の因子またはそれらのサブユニットは、例えば
ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥα、ＴＦＩＩＥβ
およびＴＦＩＩＦのような組換体の形態でも入手可能で
ある(Zawel, L. and Reinberg, D. (1995) Annu Rev. B
iochem. 64, 533-561)。
【００１６】したがって、現在では既に、組換えおよび
天然の精製因子の混合物からなる転写系が存在してい
る。しかしながら、このような転写系は技術的観点から
は複雑すぎ、高い試料処理量を有するスクリーニング法
には高価すぎる。対照的に、他の転写系、例えば組換体
または精製因子の代わりに細胞核からの抽出物を用いる
系では、多数の二次反応が認められる。不十分にまたは
精製されていない核抽出物（粗製抽出物）では、インビ
トロでの転写に悪影響を及ぼすので主として核酸および
ＤＮＡ結合タンパク質、例えばヒストンのようなリプレ
ッサーである。粗製抽出物に見られる核酸の中で、悪影
響を及ぼすのは、特にｔ−ＲＮＡをコードするＤＮＡ配
列である。ｔ−ＲＮＡについての遺伝子はｍＲＮＡの遺
伝子よりも約１００倍強く転写されるので、これらのｔ
−ＲＮＡコード配列は非特異的転写体が過剰となる。し
たがって、特異的転写体を検出できるようにするには、
非特異的転写体は複雑な精製段階によって除去しなけれ
ばならない。
天然の精製因子の混合物からなる転写系が存在してい
る。しかしながら、このような転写系は技術的観点から
は複雑すぎ、高い試料処理量を有するスクリーニング法
には高価すぎる。対照的に、他の転写系、例えば組換体
または精製因子の代わりに細胞核からの抽出物を用いる
系では、多数の二次反応が認められる。不十分にまたは
精製されていない核抽出物（粗製抽出物）では、インビ
トロでの転写に悪影響を及ぼすので主として核酸および
ＤＮＡ結合タンパク質、例えばヒストンのようなリプレ
ッサーである。粗製抽出物に見られる核酸の中で、悪影
響を及ぼすのは、特にｔ−ＲＮＡをコードするＤＮＡ配
列である。ｔ−ＲＮＡについての遺伝子はｍＲＮＡの遺
伝子よりも約１００倍強く転写されるので、これらのｔ
−ＲＮＡコード配列は非特異的転写体が過剰となる。し
たがって、特異的転写体を検出できるようにするには、
非特異的転写体は複雑な精製段階によって除去しなけれ
ばならない。
【００１７】インビトロ転写の結果を定量分析するた
め、転写を行うＤＮＡ配列がグアニン塩基（いわゆるＧ
欠如配列またはＧ欠如カセット）を欠いているベクター
であって、適当ならば、Ｇ欠如配列には多数のグアニン
を含む配列の断片が続くことができるものを開発した。
これらのベクターを用いることにより、ＧＴＰの非存在
下で転写を行うことができる。したがって、Ｇ欠如配列
だけが転写されるが、Ｇを含む他の配列は転写されな
い。これにより、更に長さが（実質的に）均一な特異的
転写体が得られる。Sawadogo and Roeder は、４００ヌ
クレオチドの長さの配列がＭＬ（アデノウイルス・メジ
ャー・レイト）プロモーターによって制御されている転
写にベクターの使用を最初に報告した。このベクターに
より、長さが約４００ヌクレオチドの転写体が得られる
(Sawadogo, M. and Roeder, R.G. (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 4394-4398) 。
め、転写を行うＤＮＡ配列がグアニン塩基（いわゆるＧ
欠如配列またはＧ欠如カセット）を欠いているベクター
であって、適当ならば、Ｇ欠如配列には多数のグアニン
を含む配列の断片が続くことができるものを開発した。
これらのベクターを用いることにより、ＧＴＰの非存在
下で転写を行うことができる。したがって、Ｇ欠如配列
だけが転写されるが、Ｇを含む他の配列は転写されな
い。これにより、更に長さが（実質的に）均一な特異的
転写体が得られる。Sawadogo and Roeder は、４００ヌ
クレオチドの長さの配列がＭＬ（アデノウイルス・メジ
ャー・レイト）プロモーターによって制御されている転
写にベクターの使用を最初に報告した。このベクターに
より、長さが約４００ヌクレオチドの転写体が得られる
(Sawadogo, M. and Roeder, R.G. (1985) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82, 4394-4398) 。
【００１８】これらのベクターにより非特異的転写体の
数は著しく少なくなった。これがそれ以来幾度も転写反
応におけるこれらのベクターの使用が報告されてきた理
由である(Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F.,
Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15, 3105-3115; Kr
etzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meister
ernst, M. (1994) Cell 78, 525-534; Meisterernst,
M., Roy, A.L., Lieu,H.M. and Roeder, R.G. (1991) C
ell 66, 981-993)。
数は著しく少なくなった。これがそれ以来幾度も転写反
応におけるこれらのベクターの使用が報告されてきた理
由である(Goppelt, A., Stelzer, G., Lottspeich, F.,
Meisterernst, M. (1996) EMBO J. 15, 3105-3115; Kr
etzschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meister
ernst, M. (1994) Cell 78, 525-534; Meisterernst,
M., Roy, A.L., Lieu,H.M. and Roeder, R.G. (1991) C
ell 66, 981-993)。
【００１９】しかしながら、今日までのところは、用い
られたベクターはＧ欠如配列の長さが４００ヌクレオチ
ドを越えない様なものに限られていた。
られたベクターはＧ欠如配列の長さが４００ヌクレオチ
ドを越えない様なものに限られていた。
【００２０】上記の転写法の結果の定性および定量分析
を行うため、転写は放射能標識したヌクレオチドの存在
下で行われており、放射能標識した転写体を最初にフェ
ノール化して沈澱した後、ゲル上で分離するのである。
これは、間違って開始されたまたは間違って停止した転
写体および非特異的に標識した核酸（例えば、プラスミ
ドによって生じた転写体またはｔＲＮＡ）だけでなく、
過剰のヌクレオチドも特異的転写体から除かれる。過剰
の放射能標識したヌクレオチド対放射能標識した転写体
の活性の比は好ましくない条件下では約１０，０００：
１であり、標識した転写体は約１０，０００倍に濃縮し
なければならない。この特異的転写体の濃度は沈澱段階
によって達成され、分離は電気泳動によって達成され
る。しかしながら、これらの濃縮段階は自動化大量スク
リーニングには向いていない。これが、代替法を開発し
て、転写結果の定量分析が可能な程度に標識したヌクレ
オチドを取り出せるようにしなければならない理由であ
る。
を行うため、転写は放射能標識したヌクレオチドの存在
下で行われており、放射能標識した転写体を最初にフェ
ノール化して沈澱した後、ゲル上で分離するのである。
これは、間違って開始されたまたは間違って停止した転
写体および非特異的に標識した核酸（例えば、プラスミ
ドによって生じた転写体またはｔＲＮＡ）だけでなく、
過剰のヌクレオチドも特異的転写体から除かれる。過剰
の放射能標識したヌクレオチド対放射能標識した転写体
の活性の比は好ましくない条件下では約１０，０００：
１であり、標識した転写体は約１０，０００倍に濃縮し
なければならない。この特異的転写体の濃度は沈澱段階
によって達成され、分離は電気泳動によって達成され
る。しかしながら、これらの濃縮段階は自動化大量スク
リーニングには向いていない。これが、代替法を開発し
て、転写結果の定量分析が可能な程度に標識したヌクレ
オチドを取り出せるようにしなければならない理由であ
る。
【００２１】転写は、反応溶液を例えばＤＥＡＥ−セル
ロース膜のような膜に適用することによっても観察する
ことができる。放射能標識した転写体は、膜上に直接検
出することができる。しかしながら、現在までのところ
は、膜の使用は、精製したＲＮＡポリメラーゼII (Roed
er, R.G. (1974) J. Biol. Chem. 249, 241-248)および
精製した基本転写因子(Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Hor
ikoshi, M., Roeder,R.G. (1990) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87, 9163-9167) の存在下で行われているイン
ビトロ転写から転写体を検出するのに成功しただけであ
った。細胞核からの濃縮し、適当ならば、予備精製した
抽出物によって得られる転写体がこの方法で検出するこ
とができることは指摘されていない。
ロース膜のような膜に適用することによっても観察する
ことができる。放射能標識した転写体は、膜上に直接検
出することができる。しかしながら、現在までのところ
は、膜の使用は、精製したＲＮＡポリメラーゼII (Roed
er, R.G. (1974) J. Biol. Chem. 249, 241-248)および
精製した基本転写因子(Ohkuma, Y., Sumimoto, H., Hor
ikoshi, M., Roeder,R.G. (1990) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87, 9163-9167) の存在下で行われているイン
ビトロ転写から転写体を検出するのに成功しただけであ
った。細胞核からの濃縮し、適当ならば、予備精製した
抽出物によって得られる転写体がこの方法で検出するこ
とができることは指摘されていない。
【００２２】活性物質をスクリーニングするための遺伝
子転写の開発は、ＷＯ９６／２６９５９号明細書に既に
記載されている。この公報には、ヒトＮＦＡＴ（ｈＮＦ
ＡＴ）の配列と、天然物の場合によっては自動化された
大量スクリーニングにも用いられる転写分析法における
それらの使用の可能性が開示されている。以下に記載す
る転写法とは異なり、この転写分析法は転写反応を全く
行わない純粋な結合分析法である。
子転写の開発は、ＷＯ９６／２６９５９号明細書に既に
記載されている。この公報には、ヒトＮＦＡＴ（ｈＮＦ
ＡＴ）の配列と、天然物の場合によっては自動化された
大量スクリーニングにも用いられる転写分析法における
それらの使用の可能性が開示されている。以下に記載す
る転写法とは異なり、この転写分析法は転写反応を全く
行わない純粋な結合分析法である。
【００２３】米国特許第５，５６３，０３６号明細書に
は、転写因子の核酸への結合を阻害することができる物
質のスクリーニングに用いることができるもう一つの結
合分析法が記載されている。この分析法でも、転写は行
われていない。
は、転写因子の核酸への結合を阻害することができる物
質のスクリーニングに用いることができるもう一つの結
合分析法が記載されている。この分析法でも、転写は行
われていない。
【００２４】米国特許第５，５６３，０３９号明細書に
は、この場合には腫瘍壊死因子レセプター（ＴＲＡＤ
Ｄ）と関連しているタンパク質のある種のＤＮＡ配列へ
の結合を阻害することができる物質を見出だすのにも用
いられる結合分析法のもう一つの例が記載されている。
は、この場合には腫瘍壊死因子レセプター（ＴＲＡＤ
Ｄ）と関連しているタンパク質のある種のＤＮＡ配列へ
の結合を阻害することができる物質を見出だすのにも用
いられる結合分析法のもう一つの例が記載されている。
【００２５】
【発明の概要】本発明の目的は、遺伝子、例えば細胞お
よびウイルス遺伝子の画定された反応条件下での転写の
分析法であって、特に大量スクリーニングに再現性よく
かつ普遍的に用いることができる簡単に実施される方法
を提供することである。
よびウイルス遺伝子の画定された反応条件下での転写の
分析法であって、特に大量スクリーニングに再現性よく
かつ普遍的に用いることができる簡単に実施される方法
を提供することである。
【００２６】本発明は、転写されるＤＮＡ配列であっ
て、１以上の遺伝子調節要素により制御されている配列
を含むＤＮＡ鋳型の無細胞のインビトロ転写の方法であ
って、 a) 好ましくは、転写因子および／または補因子によっ
て補足することができ、または転写因子および／または
補因子によって部分的にまたは完全に置換することがで
きる細胞核由来の濃縮し、好ましくは、精製した抽出物
と、少なくとも１種類の標識ヌクレオチドとを転写に用
い、 b) 転写の後に、好ましくは、反応混合物中のタンパク
質を単離しおよび／または分解し、 c) 標識された転写体を固体マトリックスに結合させ、 d) 過剰の標識ヌクレオチドを除き、 e) 標識した転写体を定量することを特徴とする、方法
に関する。
て、１以上の遺伝子調節要素により制御されている配列
を含むＤＮＡ鋳型の無細胞のインビトロ転写の方法であ
って、 a) 好ましくは、転写因子および／または補因子によっ
て補足することができ、または転写因子および／または
補因子によって部分的にまたは完全に置換することがで
きる細胞核由来の濃縮し、好ましくは、精製した抽出物
と、少なくとも１種類の標識ヌクレオチドとを転写に用
い、 b) 転写の後に、好ましくは、反応混合物中のタンパク
質を単離しおよび／または分解し、 c) 標識された転写体を固体マトリックスに結合させ、 d) 過剰の標識ヌクレオチドを除き、 e) 標識した転写体を定量することを特徴とする、方法
に関する。
【００２７】
【発明の具体的説明】この方法は、実際の転写反応(a)
、特異的転写体の単離(b, c, d) 、および特異的転写
体の検出(e) を包含している。この方法は、特異的転写
体の単離の具体的態様であって、上記のb, cおよびd の
順序だけが可能なものである態様を包含している。特異
的転写体の単離順序は、適当ならば、c, d, b またはd,
b, c とすることもできる。また、本発明の具体的態様
は個々の単離段階を省くこともできる。例えば、転写法
は、段階a, c, d およびe 、または段階a, cおよびe の
み、またはa, b, c およびe のみ、またはa, b, d およ
びe のみ、またはa, bおよびe のみ、またはa, dおよび
e のみを含んでなることができる。
、特異的転写体の単離(b, c, d) 、および特異的転写
体の検出(e) を包含している。この方法は、特異的転写
体の単離の具体的態様であって、上記のb, cおよびd の
順序だけが可能なものである態様を包含している。特異
的転写体の単離順序は、適当ならば、c, d, b またはd,
b, c とすることもできる。また、本発明の具体的態様
は個々の単離段階を省くこともできる。例えば、転写法
は、段階a, c, d およびe 、または段階a, cおよびe の
み、またはa, b, c およびe のみ、またはa, b, d およ
びe のみ、またはa, bおよびe のみ、またはa, dおよび
e のみを含んでなることができる。
【００２８】総ての工程段階、すなわち実際の転写反応
（転写）および特異的転写体の単離および検出を自動化
し、特定の反応条件下で得られる特異的転写体の量、し
たがって転写速度を簡単かつ信頼性よく定量することが
できることが本発明の方法の特別の特徴である。
（転写）および特異的転写体の単離および検出を自動化
し、特定の反応条件下で得られる特異的転写体の量、し
たがって転写速度を簡単かつ信頼性よく定量することが
できることが本発明の方法の特別の特徴である。
【００２９】転写速度は、特定の遺伝子が単位時間当た
りで幾度転写されるか、または上記転写法において、転
写されるＤＮＡ配列が単位時間当たりで幾度転写される
かを示す。転写速度を測定するには、画定された単位時
間後に得られる放射能標識した量を測定する。
りで幾度転写されるか、または上記転写法において、転
写されるＤＮＡ配列が単位時間当たりで幾度転写される
かを示す。転写速度を測定するには、画定された単位時
間後に得られる放射能標識した量を測定する。
【００３０】この方法の特徴は、転写が活性化因子およ
び／またはインヒビターの存在下、すなわち転写に正ま
たは負の効果を有する成分の存在下で行うことである。
例えば、転写することができる細胞核からの抽出物を基
本転写に用いることができる。この基本転写系は、活性
化因子および／またはインヒビターを補足することがで
きる。基本転写と比較して、転写阻害では転写速度が減
少し、したがって特異的転写体／単位時間の量が低下す
るが、転写活性化では転写速度が増加し、したがって特
異的転写体／単位時間の量が増加する。
び／またはインヒビターの存在下、すなわち転写に正ま
たは負の効果を有する成分の存在下で行うことである。
例えば、転写することができる細胞核からの抽出物を基
本転写に用いることができる。この基本転写系は、活性
化因子および／またはインヒビターを補足することがで
きる。基本転写と比較して、転写阻害では転写速度が減
少し、したがって特異的転写体／単位時間の量が低下す
るが、転写活性化では転写速度が増加し、したがって特
異的転写体／単位時間の量が増加する。
【００３１】遺伝子の転写は、幾つかの段階、予備開始
複合体（ＰＩＣ）の形成、ＰＩＣの活性化、開始、プロ
モータークリアランス、伸張および停止、に分けること
ができる。真核生物では、転写の開始には、ＲＮＡポリ
メラーゼ（タンパク質コード遺伝子の転写のためのも
の、ＲＮＡポリメラーゼII）およびＲＮＡポリメラーゼ
IIをＤＮＡと特異的相互作用させるＤＮＡ結合タンパク
質が必要である。これらのＤＮＡ結合タンパク質は転写
因子と呼ばれており、一般的転写因子は本質的にプロモ
ーターとの相互作用に関与しており、特異的転写因子は
プロモーターの下流または上流に位置する遺伝子調節要
素の作用に介在している。
複合体（ＰＩＣ）の形成、ＰＩＣの活性化、開始、プロ
モータークリアランス、伸張および停止、に分けること
ができる。真核生物では、転写の開始には、ＲＮＡポリ
メラーゼ（タンパク質コード遺伝子の転写のためのも
の、ＲＮＡポリメラーゼII）およびＲＮＡポリメラーゼ
IIをＤＮＡと特異的相互作用させるＤＮＡ結合タンパク
質が必要である。これらのＤＮＡ結合タンパク質は転写
因子と呼ばれており、一般的転写因子は本質的にプロモ
ーターとの相互作用に関与しており、特異的転写因子は
プロモーターの下流または上流に位置する遺伝子調節要
素の作用に介在している。
【００３２】一般的転写因子ＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦ
IIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦおよびＴＦIIＨは、真核生物
の遺伝子の転写で役割を担っている。遺伝子の低い基本
活性に関与する転写することができるタンパク質画分
は、プロモーターによって、これらの一般的転写因子の
総てまたは大半およびＲＮＡポリメラーゼII（ＲＮＡＰ
ｏｌII）を含んでいる。ＭＬプロモーターの基本活性
は、例えばＴＢＰ（ＴＦIIＤのＴＡＴＡ結合サブユニッ
ト）、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨおよび
ＲＮＡ ＰｏｌIIによって達成される。このような基本
活性を引き起こすタンパク質画分は、基本転写系と呼ば
れている。本発明の目的には、この用語は細胞核からの
濃縮して、適当ならば、精製した抽出物についても用い
られる。基本転写系によって行われる転写は、基本転写
と呼ばれる。インビトロでの無細胞転写を行うには、少
なくとも、１個の基本転写系、ヌクレオチド、および転
写を行うＤＮＡ鋳型が必要である。
IIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦおよびＴＦIIＨは、真核生物
の遺伝子の転写で役割を担っている。遺伝子の低い基本
活性に関与する転写することができるタンパク質画分
は、プロモーターによって、これらの一般的転写因子の
総てまたは大半およびＲＮＡポリメラーゼII（ＲＮＡＰ
ｏｌII）を含んでいる。ＭＬプロモーターの基本活性
は、例えばＴＢＰ（ＴＦIIＤのＴＡＴＡ結合サブユニッ
ト）、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨおよび
ＲＮＡ ＰｏｌIIによって達成される。このような基本
活性を引き起こすタンパク質画分は、基本転写系と呼ば
れている。本発明の目的には、この用語は細胞核からの
濃縮して、適当ならば、精製した抽出物についても用い
られる。基本転写系によって行われる転写は、基本転写
と呼ばれる。インビトロでの無細胞転写を行うには、少
なくとも、１個の基本転写系、ヌクレオチド、および転
写を行うＤＮＡ鋳型が必要である。
【００３３】活性化した転写は、一般的転写因子の他
に、かつ基本転写系の他に、特異的転写因子および補因
子（アクセサリータンパク質）を必要とする(Kaiser,
K., Stelzer, G. and Meisterernst, M. (1995) EMBO
J. 14, 3520-3527) 。特異的転写因子は極めて低い特異
的遺伝子の基本転写力を増加させることができ、転写開
始の頻度を支配することができる。したがって、ＤＮＡ
結合タンパク質は遺伝子が転写される頻度（転写速度）
に深く関わっている。ＤＮＡに直接結合しないが転写因
子またはＲＮＡポリメラーゼIIの活性にタンパク質−タ
ンパク質相互作用を介して影響を与える他のタンパク
質、例えば補因子も、この調節過程に役割を演じてい
る。
に、かつ基本転写系の他に、特異的転写因子および補因
子（アクセサリータンパク質）を必要とする(Kaiser,
K., Stelzer, G. and Meisterernst, M. (1995) EMBO
J. 14, 3520-3527) 。特異的転写因子は極めて低い特異
的遺伝子の基本転写力を増加させることができ、転写開
始の頻度を支配することができる。したがって、ＤＮＡ
結合タンパク質は遺伝子が転写される頻度（転写速度）
に深く関わっている。ＤＮＡに直接結合しないが転写因
子またはＲＮＡポリメラーゼIIの活性にタンパク質−タ
ンパク質相互作用を介して影響を与える他のタンパク
質、例えば補因子も、この調節過程に役割を演じてい
る。
【００３４】本発明の方法の１態様は、細胞核からの濃
縮した抽出物（細胞からの核抽出物、核抽出物）を基本
転写に用いることである。このパラメーターに関して、
この方法を普遍的に用いることができ、これは使用した
細胞および使用した真核生物種にも適用される。
縮した抽出物（細胞からの核抽出物、核抽出物）を基本
転写に用いることである。このパラメーターに関して、
この方法を普遍的に用いることができ、これは使用した
細胞および使用した真核生物種にも適用される。
【００３５】例えば、ヒトまたは動物細胞に由来する細
胞系から濃縮した核抽出物を得ることができる。特に好
適な細胞は、発酵装置で大量に成育させ、増殖させるこ
とができる細胞、例えばHeLa細胞である。更に、選択し
た細胞型の細胞核からの抽出物、特に転写因子および／
または補因子との細胞型特異的、細胞サイクル特異的、
発生特異的、分化特異的または疾患特異的組立てなどに
よって識別されるものを用いることができる。特に、疾
患の起源に重要な役割を演じている細胞型、例えば免疫
系の細胞（例えば、ＢおよびＴ細胞）を用いることがで
きる。
胞系から濃縮した核抽出物を得ることができる。特に好
適な細胞は、発酵装置で大量に成育させ、増殖させるこ
とができる細胞、例えばHeLa細胞である。更に、選択し
た細胞型の細胞核からの抽出物、特に転写因子および／
または補因子との細胞型特異的、細胞サイクル特異的、
発生特異的、分化特異的または疾患特異的組立てなどに
よって識別されるものを用いることができる。特に、疾
患の起源に重要な役割を演じている細胞型、例えば免疫
系の細胞（例えば、ＢおよびＴ細胞）を用いることがで
きる。
【００３６】この方法の特別な利点は、組織または腫瘍
細胞からの核抽出物を単離して用いることもできること
である。これは、適当な細胞系を用いることができない
場合には特に遊離である。特に、核抽出物は、動物また
はヒトの臍帯、動物またはヒトの移植廃棄生成物、動物
またはヒトの生験材料、または動物またはヒトの腫瘍組
織（例えば、外科手術中に除かれた組織）、または動物
またはヒトの胎盤などの容易に入手できる組織から単離
して、この方法に用いることができる。
細胞からの核抽出物を単離して用いることもできること
である。これは、適当な細胞系を用いることができない
場合には特に遊離である。特に、核抽出物は、動物また
はヒトの臍帯、動物またはヒトの移植廃棄生成物、動物
またはヒトの生験材料、または動物またはヒトの腫瘍組
織（例えば、外科手術中に除かれた組織）、または動物
またはヒトの胎盤などの容易に入手できる組織から単離
して、この方法に用いることができる。
【００３７】この方法の１態様は、濃縮した核抽出物
を、新鮮なまたは凍結した細胞の細胞核から、または新
鮮なまたは凍結した細胞核から、例えばDignam et al.
が報告した方法によってタンパク質を濃縮するための既
知の方法によって調製されることである(Dignam, J.D.,
Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983)M
ethods in Enzymology 101, 582-598; Dignam, J.D., L
ebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Re
s. 11, 1475-1489)。この方法の特別な態様は、濃縮し
た核抽出物を調製するため、細胞核のホモゲナイゼーシ
ョンの後に、ホモゲネートの透析を含んでなる方法を用
いることである。
を、新鮮なまたは凍結した細胞の細胞核から、または新
鮮なまたは凍結した細胞核から、例えばDignam et al.
が報告した方法によってタンパク質を濃縮するための既
知の方法によって調製されることである(Dignam, J.D.,
Martin, P.L., Shastry, B.S., Roeder, R.G. (1983)M
ethods in Enzymology 101, 582-598; Dignam, J.D., L
ebovitz, R.M., Roeder, R.G. (1983) Nucleic Acid Re
s. 11, 1475-1489)。この方法の特別な態様は、濃縮し
た核抽出物を調製するため、細胞核のホモゲナイゼーシ
ョンの後に、ホモゲネートの透析を含んでなる方法を用
いることである。
【００３８】本発明の方法の重要な態様の特徴は、細胞
核からの濃縮抽出物を１以上の精製段階、特に単一精製
段階によって、転写することができる、すなわちこの方
法を行うときに特異的転写体が得られる程度まで精製す
ることである。例えば、抽出物をクロマトグラフィによ
って精製することができる。精製は、例えば核タンパク
質結合材料、例えばホスホセルロース、ＤＥＡＥ−セル
ロース、またはヘパリン−セファロース上で行うことが
できる。あるいは、カチオン−および／またはアニオン
−交換カラムまたは特異的アフィニティカラム、例えば
抗体またはオリゴヌクレオチドがカラム材料に結合され
るものを、精製に用いることもできる。
核からの濃縮抽出物を１以上の精製段階、特に単一精製
段階によって、転写することができる、すなわちこの方
法を行うときに特異的転写体が得られる程度まで精製す
ることである。例えば、抽出物をクロマトグラフィによ
って精製することができる。精製は、例えば核タンパク
質結合材料、例えばホスホセルロース、ＤＥＡＥ−セル
ロース、またはヘパリン−セファロース上で行うことが
できる。あるいは、カチオン−および／またはアニオン
−交換カラムまたは特異的アフィニティカラム、例えば
抗体またはオリゴヌクレオチドがカラム材料に結合され
るものを、精製に用いることもできる。
【００３９】本発明の方法の特別な態様の特徴は、濃縮
した核抽出物がホスホセルロースカルビル、特にP11 カ
ラム（商標名）（P11 系、Whatman 、メイドストーン、
英国）上で精製されることである。この方法のもう一つ
の特別な態様の特徴は、濃縮した核抽出物が単一のP11
カラム（商標名）、またはＤＥＡＥ−セルロースまたは
ヘパリン−セファロースを含むカラム材料を有する単一
カラム上で単一段階だけによって精製されることであ
る。
した核抽出物がホスホセルロースカルビル、特にP11 カ
ラム（商標名）（P11 系、Whatman 、メイドストーン、
英国）上で精製されることである。この方法のもう一つ
の特別な態様の特徴は、濃縮した核抽出物が単一のP11
カラム（商標名）、またはＤＥＡＥ−セルロースまたは
ヘパリン−セファロースを含むカラム材料を有する単一
カラム上で単一段階だけによって精製されることであ
る。
【００４０】P11 （商標名）精製の具体的態様では、他
成分の他に０．０５〜０．１５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ
のＫＣｌを含んでなる緩衝液の存在下で、核抽出物を最
初にホスホセルロースに結合する。ロード（load）した
カラムを適当な緩衝液、好ましくは０．０５〜０．１５
ＭのＫＣｌ、好ましくは０．１Ｍ ＫＣｌを含んでなる
緩衝液で洗浄すると、非特異的および妨害成分がカラム
から洗い出される。転写することができる成分は、好ま
しくは２画分でカラムから溶出され、最初に例えば０．
４〜０．６Ｍ ＫＣｌ、好ましくは０．５Ｍ ＫＣｌを
含んでなる緩衝液を用いて、次いで例えば０．７〜１Ｍ
ＫＣｌ、好ましくは０．８５Ｍ ＫＣｌを含んでなる
緩衝液を用いて溶出される。
成分の他に０．０５〜０．１５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ
のＫＣｌを含んでなる緩衝液の存在下で、核抽出物を最
初にホスホセルロースに結合する。ロード（load）した
カラムを適当な緩衝液、好ましくは０．０５〜０．１５
ＭのＫＣｌ、好ましくは０．１Ｍ ＫＣｌを含んでなる
緩衝液で洗浄すると、非特異的および妨害成分がカラム
から洗い出される。転写することができる成分は、好ま
しくは２画分でカラムから溶出され、最初に例えば０．
４〜０．６Ｍ ＫＣｌ、好ましくは０．５Ｍ ＫＣｌを
含んでなる緩衝液を用いて、次いで例えば０．７〜１Ｍ
ＫＣｌ、好ましくは０．８５Ｍ ＫＣｌを含んでなる
緩衝液を用いて溶出される。
【００４１】本発明の方法の具体的態様は、外来ＲＮＡ
ポリメラーゼIIの存在下にて濃縮して、適当ならば、精
製した核抽出物によって転写を行うことである。用いら
れるＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは真核生物のII型
のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼII）、特に
動物またはヒトＲＮＡポリメラーゼIIである。
ポリメラーゼIIの存在下にて濃縮して、適当ならば、精
製した核抽出物によって転写を行うことである。用いら
れるＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは真核生物のII型
のＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼII）、特に
動物またはヒトＲＮＡポリメラーゼIIである。
【００４２】本発明の方法のもう一つの態様の特徴は、
濃縮して、適当ならば精製した核抽出物に、タンパク
質、例えば転写因子および／または補因子（アクセサリ
ータンパク質）を補足し、または完全にまたは部分的に
置換することである。例えば、これらのタンパク質は細
胞核から単離することができ、または組換え技術によっ
て調製することができる。
濃縮して、適当ならば精製した核抽出物に、タンパク
質、例えば転写因子および／または補因子（アクセサリ
ータンパク質）を補足し、または完全にまたは部分的に
置換することである。例えば、これらのタンパク質は細
胞核から単離することができ、または組換え技術によっ
て調製することができる。
【００４３】本発明の方法の具体的態様は、核抽出物を
転写因子および／または補因子だけを補足することであ
る。他の極端な場合には、この方法の特徴は、転写を行
うことができるタンパク質画分（基本転写系）が単離さ
れたまたは組換え技術によって調製された転写因子およ
び／または補因子と、ＲＮＡポリメラーゼだけからなっ
ていることである。
転写因子および／または補因子だけを補足することであ
る。他の極端な場合には、この方法の特徴は、転写を行
うことができるタンパク質画分（基本転写系）が単離さ
れたまたは組換え技術によって調製された転写因子およ
び／または補因子と、ＲＮＡポリメラーゼだけからなっ
ていることである。
【００４４】用いることができる転写因子は、例えば一
般的および／または特異的転写因子またはその部分であ
って、適当ならば、融合タンパク質の形態をしている。
般的および／または特異的転写因子またはその部分であ
って、適当ならば、融合タンパク質の形態をしている。
【００４５】用いることができる一般転写因子は、例え
ばＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦII
Ｆ、ＴＦIIＨ、ＴＦIIＪおよびＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タ
ンパク質）である。
ばＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦII
Ｆ、ＴＦIIＨ、ＴＦIIＪおよびＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タ
ンパク質）である。
【００４６】用いることができる特異的転写因子は、例
えばＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ
／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、Ｔａｔ、ｆｏｓ／ｊｕｎ類、Ｏｃｔ
類の一員（Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２）、およびそれらと
相互作用する因子、例えばＥｔｓ類のＢｏｂｌ、ＯＣＡ
−ＢまたはＯＢＦ、ＡＴＦ／ＣＲＥＢタンパク質類の活
性化因子、核レセプター、例えばＰＰＡＲα、または転
写因子の相当する細胞型特異的イソ形態である(Kel, O.
V., Romaschenko, A.G., Kel, A.E., Wingender, E., K
olachenov, N.A. (1995) Nucl. Acids. Res. 20, 3-16
）。
えばＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＮＦＡＴ、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ
／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、Ｔａｔ、ｆｏｓ／ｊｕｎ類、Ｏｃｔ
類の一員（Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２）、およびそれらと
相互作用する因子、例えばＥｔｓ類のＢｏｂｌ、ＯＣＡ
−ＢまたはＯＢＦ、ＡＴＦ／ＣＲＥＢタンパク質類の活
性化因子、核レセプター、例えばＰＰＡＲα、または転
写因子の相当する細胞型特異的イソ形態である(Kel, O.
V., Romaschenko, A.G., Kel, A.E., Wingender, E., K
olachenov, N.A. (1995) Nucl. Acids. Res. 20, 3-16
）。
【００４７】特異的転写因子の他の例は、下記のような
ものがある。 1. 原癌遺伝子（proto-oncogene）、例えばｊｕｎ、ｆ
ｏｓ、ｅｔｓ、ｍｙｃ、ｂｃｌ−イソ形態、およびｅｒ
ｂ、 2. ホルモンレセプター、例えば（ｅｒｂ）、糖質コル
チコイドレセプター、エストロゲンレセプター、レチン
酸レセプター、ビタミンＤレセプター、または 3. 腫瘍抑制因子、例えばｐ５３、ＮＦ１、ＷＴ１、Ｒ
Ｂ 4. ウイルス病原体、例えば単純ヘルペスウイルスのタ
ンパク質、例えばパピローマウイルスのＶＰ１６または
ＩＣＰ４、例えばアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ６ま
たはＥ７、例えばサイトメガロウイルスのＥ１Ａまたは
Ｅ２Ａ、例えばＢ型肝炎ウイルスのＩＥ８６、例えばＨ
ＩＶウイルスのｐＸ、例えばＴａｔまたはＲｅｖ、 5. 細胞型特異的および／または組織特異的因子、例え
ば筋形成因子、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｐｕ−１、Ｏ
ＣＡ−ＢまたはＨＮＦ、またはＴ細胞特異的因子、例え
ばＥｔｓ−１、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、 6. ＳＴＡＴタンパク質（転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよび活性化因子）、例えばサイトカインによっ
て活性化される転写因子、例えばＩＬ−１、Ｓｔａｔ、
ＩＬ−２Ｓｔａｔ、ＩＬ−３Ｓｔａｔ、ＩＬ−４、ＩＬ
−５Ｓｔａｔ、ＩＬ−６Ｓｔａｔ、ＩＬ−７Ｓｔａｔ、
ＩＬ−８Ｓｔａｔ、ＩＬ−９Ｓｔａｔ、ＩＬ−１０Ｓｔ
ａｔ、ＩＬ−１１Ｓｔａｔ、ＩＬ−１２Ｓｔａｔ（「Ｓ
ｔａｔ」は作用を媒介するタンパク質を意味する）、ま
たは 7. セカンドメッセンジャー形質導入カスケード、例え
ばＣＲＥＢまたはａｂｌ、 8. 核レセプター、例えばセカンドメッセンジャーレセ
プター（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３レセプター、Ｃ
ａ2+依存性レセプター）、レチン酸レセプター、糖質コ
ルチコイドレセプター、またはステロイドレセプター、 9. 遺伝子特異的転写因子、またはインヒビター、例え
ばＩＬ−２遺伝子の特異的活性化因子、例えばＮＦｋ
Ｂ、ＡＰ１またはＮＦＡＴ、 10. 発生特異的、細胞サイクル特異的および分化依存発
現転写因子。
ものがある。 1. 原癌遺伝子（proto-oncogene）、例えばｊｕｎ、ｆ
ｏｓ、ｅｔｓ、ｍｙｃ、ｂｃｌ−イソ形態、およびｅｒ
ｂ、 2. ホルモンレセプター、例えば（ｅｒｂ）、糖質コル
チコイドレセプター、エストロゲンレセプター、レチン
酸レセプター、ビタミンＤレセプター、または 3. 腫瘍抑制因子、例えばｐ５３、ＮＦ１、ＷＴ１、Ｒ
Ｂ 4. ウイルス病原体、例えば単純ヘルペスウイルスのタ
ンパク質、例えばパピローマウイルスのＶＰ１６または
ＩＣＰ４、例えばアデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ６ま
たはＥ７、例えばサイトメガロウイルスのＥ１Ａまたは
Ｅ２Ａ、例えばＢ型肝炎ウイルスのＩＥ８６、例えばＨ
ＩＶウイルスのｐＸ、例えばＴａｔまたはＲｅｖ、 5. 細胞型特異的および／または組織特異的因子、例え
ば筋形成因子、Ｐｉｔ−１、Ｏｃｔ−２、Ｐｕ−１、Ｏ
ＣＡ−ＢまたはＨＮＦ、またはＴ細胞特異的因子、例え
ばＥｔｓ−１、ＧＡＴＡ３、ＴＣＦ／Ｌｅｆ、ＣＢＦ、 6. ＳＴＡＴタンパク質（転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよび活性化因子）、例えばサイトカインによっ
て活性化される転写因子、例えばＩＬ−１、Ｓｔａｔ、
ＩＬ−２Ｓｔａｔ、ＩＬ−３Ｓｔａｔ、ＩＬ−４、ＩＬ
−５Ｓｔａｔ、ＩＬ−６Ｓｔａｔ、ＩＬ−７Ｓｔａｔ、
ＩＬ−８Ｓｔａｔ、ＩＬ−９Ｓｔａｔ、ＩＬ−１０Ｓｔ
ａｔ、ＩＬ−１１Ｓｔａｔ、ＩＬ−１２Ｓｔａｔ（「Ｓ
ｔａｔ」は作用を媒介するタンパク質を意味する）、ま
たは 7. セカンドメッセンジャー形質導入カスケード、例え
ばＣＲＥＢまたはａｂｌ、 8. 核レセプター、例えばセカンドメッセンジャーレセ
プター（例えば、ｃＡＭＰまたはＩＰ３レセプター、Ｃ
ａ2+依存性レセプター）、レチン酸レセプター、糖質コ
ルチコイドレセプター、またはステロイドレセプター、 9. 遺伝子特異的転写因子、またはインヒビター、例え
ばＩＬ−２遺伝子の特異的活性化因子、例えばＮＦｋ
Ｂ、ＡＰ１またはＮＦＡＴ、 10. 発生特異的、細胞サイクル特異的および分化依存発
現転写因子。
【００４８】補因子は、タンパク質−タンパク質相互作
用および／またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用により転
写において直接または間接的役割を果たしている。幾つ
かの補因子は、基本転写系に既に存在しており、他のも
のは、活性化した転写系だけに存在している。補因子は
転写速度に正または負の効果を有することができる。用
いることができる補因子は、例えば下記のようなもので
ある。ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）例えば、ＴＡＦII３
０、ＴＡＦII４０、ＴＡＦII５５、ＴＡＦII６０、ＴＡ
ＦII１１０、ＴＡＦII１５０、ＴＡＦII２５０（Verrij
zer, C.P. and Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sc
i. 21, 338-342;ＴＡＦはＴＢＰと共にＴＦIIＤ複合体
を形成し、ＴＦIIＤＩおけるＴＡＦの組成をかなり変化
させることが可能である）、メディエーター、すなわち
ＲＮＡポリメラーゼIIと関連している補因子、例えばＣ
ＴＤ（カルボキシ末端ドメイン）相互作用性タンパク
質、および／またはＲＮＡポリメラーゼIIのリプレッサ
ーおよび／または活性化因子、特にＲＡＰ３０、ＲＡＰ
７４、ＲＡＰ３８、ＳＲ７（ＲＮＡポリメラーゼＢのサ
プレッサー、ＳＲＢ）、サイクリンまたはキナーゼ（例
えばＣＫII）、一般的補因子、ＵＳＡ（上流刺激活性）
画分に含まれる補因子(Kaiser, K. and Meisterernst,
M. (1996) Trends Biochem. Sci., 342-345)、正の補因
子、例えばＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ４（ｐ１５）、ＰＣ
５、ＰＣ６、Ｄｒ２（Ｄリプレッサー２）／ＰＣ３、Ａ
ＣＦ（活性化補因子）ＣｏｆＡ（補因子Ａ）、ＨＭＧ−
タンパク質（クロマチン関連高速移動群タンパク質）、
負の補因子、例えばＮＣ１、ＮＣ２、および／または特
異的補因子。
用および／またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用により転
写において直接または間接的役割を果たしている。幾つ
かの補因子は、基本転写系に既に存在しており、他のも
のは、活性化した転写系だけに存在している。補因子は
転写速度に正または負の効果を有することができる。用
いることができる補因子は、例えば下記のようなもので
ある。ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）例えば、ＴＡＦII３
０、ＴＡＦII４０、ＴＡＦII５５、ＴＡＦII６０、ＴＡ
ＦII１１０、ＴＡＦII１５０、ＴＡＦII２５０（Verrij
zer, C.P. and Tjian, R. (1996) Trends Biochem. Sc
i. 21, 338-342;ＴＡＦはＴＢＰと共にＴＦIIＤ複合体
を形成し、ＴＦIIＤＩおけるＴＡＦの組成をかなり変化
させることが可能である）、メディエーター、すなわち
ＲＮＡポリメラーゼIIと関連している補因子、例えばＣ
ＴＤ（カルボキシ末端ドメイン）相互作用性タンパク
質、および／またはＲＮＡポリメラーゼIIのリプレッサ
ーおよび／または活性化因子、特にＲＡＰ３０、ＲＡＰ
７４、ＲＡＰ３８、ＳＲ７（ＲＮＡポリメラーゼＢのサ
プレッサー、ＳＲＢ）、サイクリンまたはキナーゼ（例
えばＣＫII）、一般的補因子、ＵＳＡ（上流刺激活性）
画分に含まれる補因子(Kaiser, K. and Meisterernst,
M. (1996) Trends Biochem. Sci., 342-345)、正の補因
子、例えばＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ４（ｐ１５）、ＰＣ
５、ＰＣ６、Ｄｒ２（Ｄリプレッサー２）／ＰＣ３、Ａ
ＣＦ（活性化補因子）ＣｏｆＡ（補因子Ａ）、ＨＭＧ−
タンパク質（クロマチン関連高速移動群タンパク質）、
負の補因子、例えばＮＣ１、ＮＣ２、および／または特
異的補因子。
【００４９】本発明の方法の特徴は、１個以上の遺伝子
調節要素および転写を行うＤＮＡ配列を含んでなるＤＮ
Ａ鋳型を転写に用いることである。
調節要素および転写を行うＤＮＡ配列を含んでなるＤＮ
Ａ鋳型を転写に用いることである。
【００５０】本発明の主題は、無細胞のインビトロでの
転写の上記方法に用いることができるＤＮＡ鋳型であ
る。このＤＮＡ鋳型は、１個以上の遺伝子調節要素と転
写を行うＤＮＡ配列を含んでなる。ＤＮＡ鋳型は、更
に、他の配列断片も含むことができる。
転写の上記方法に用いることができるＤＮＡ鋳型であ
る。このＤＮＡ鋳型は、１個以上の遺伝子調節要素と転
写を行うＤＮＡ配列を含んでなる。ＤＮＡ鋳型は、更
に、他の配列断片も含むことができる。
【００５１】遺伝子調節要素は、既知の遺伝子調節要素
または検討を行う遺伝子調節要素、または１種類以上の
既知の遺伝子調節要素と１種類以上の検討を行う遺伝子
調節要素の構築物であることができる。
または検討を行う遺伝子調節要素、または１種類以上の
既知の遺伝子調節要素と１種類以上の検討を行う遺伝子
調節要素の構築物であることができる。
【００５２】遺伝子調節要素は、遺伝子調節に関与する
任意のＤＮＡ配列またはその断片を含んでなることがで
きる。遺伝子調節要素に関して、ＤＮＡ鋳型、または方
法は普遍的であり、遺伝子調節要素は、好ましくは真核
生物遺伝子に由来するか、または後者に対応している。
遺伝子調節要素は、細胞またはウイルス遺伝子調節要素
または合成遺伝子調節要素であることができる。遺伝子
調節要素は、好ましくは、とりわけＤＮＡ結合タンパク
質の結合部位を表すＤＮＡ配列（タンパク質結合ＤＮＡ
配列、例えば転写因子または融合タンパク質の結合部
位）を含んでなる。遺伝子調節要素は１個のプロモータ
ー（プロモーター配列）および／または１種類以上のエ
ンハンサー（エンハンサー配列）および／または１種類
以上のサイレンサー（サイレンサー配列）を含んでなる
ことができる。好ましくは、遺伝子調節要素は、天然お
よび／または人工的に配置されたプロモーター、エンハ
ンサーおよび／またはサイレンサー配列またはその部分
を含んでなることができる。
任意のＤＮＡ配列またはその断片を含んでなることがで
きる。遺伝子調節要素に関して、ＤＮＡ鋳型、または方
法は普遍的であり、遺伝子調節要素は、好ましくは真核
生物遺伝子に由来するか、または後者に対応している。
遺伝子調節要素は、細胞またはウイルス遺伝子調節要素
または合成遺伝子調節要素であることができる。遺伝子
調節要素は、好ましくは、とりわけＤＮＡ結合タンパク
質の結合部位を表すＤＮＡ配列（タンパク質結合ＤＮＡ
配列、例えば転写因子または融合タンパク質の結合部
位）を含んでなる。遺伝子調節要素は１個のプロモータ
ー（プロモーター配列）および／または１種類以上のエ
ンハンサー（エンハンサー配列）および／または１種類
以上のサイレンサー（サイレンサー配列）を含んでなる
ことができる。好ましくは、遺伝子調節要素は、天然お
よび／または人工的に配置されたプロモーター、エンハ
ンサーおよび／またはサイレンサー配列またはその部分
を含んでなることができる。
【００５３】プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックスお
よび／またはイニシエーター領域（ＩＮＲ）（転写の開
始）を含んでなることができる。プロモーターは「Ｇ
Ｃ」ボックスおよび／または「ＧＡＡＴ」ボックスを含
んでなることができる。
よび／またはイニシエーター領域（ＩＮＲ）（転写の開
始）を含んでなることができる。プロモーターは「Ｇ
Ｃ」ボックスおよび／または「ＧＡＡＴ」ボックスを含
んでなることができる。
【００５４】ＤＮＡ鋳型の具体的態様では、遺伝子調節
要素はモデルプロモーターである。
要素はモデルプロモーターである。
【００５５】モデルプロモーターは、プロモーターおよ
び追加のタンパク質結合ＤＮＡ配列、および適当なら
ば、他の遺伝子調節要素を含んでなる。モデルプロモー
ターは、好ましくは「ＴＡＴＡ」ボックスおよびイニシ
エーター領域を含んでなる。具体的態様では、モデルプ
ロモーターはヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡ
ＴＡ」ボックスおよびＭＬプロモーターのイニシエータ
ー領域を含んでなる。これらの２個の基本プロモーター
要素により、インビトロでの基本転写を行うことができ
る。更に、この特異的モデルプロモーターは、酵母Ｇａ
ｌ４タンパク質についての５個の結合部位を有する。モ
デルプロモーターは、所望により、例えば分子生物学の
方法により、例えばモデルプロモーターに例えば試験さ
れる遺伝子調節要素を補足し、および／またはモデルプ
ロモーターの個々の区分を他の遺伝子調節要素、例えば
試験される遺伝子調節要素によって置換することによっ
て変更することができる。
び追加のタンパク質結合ＤＮＡ配列、および適当なら
ば、他の遺伝子調節要素を含んでなる。モデルプロモー
ターは、好ましくは「ＴＡＴＡ」ボックスおよびイニシ
エーター領域を含んでなる。具体的態様では、モデルプ
ロモーターはヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡ
ＴＡ」ボックスおよびＭＬプロモーターのイニシエータ
ー領域を含んでなる。これらの２個の基本プロモーター
要素により、インビトロでの基本転写を行うことができ
る。更に、この特異的モデルプロモーターは、酵母Ｇａ
ｌ４タンパク質についての５個の結合部位を有する。モ
デルプロモーターは、所望により、例えば分子生物学の
方法により、例えばモデルプロモーターに例えば試験さ
れる遺伝子調節要素を補足し、および／またはモデルプ
ロモーターの個々の区分を他の遺伝子調節要素、例えば
試験される遺伝子調節要素によって置換することによっ
て変更することができる。
【００５６】モデルプロモーターの操作を行うには、こ
れが制限エンドヌクレアーゼの１個以上の以上開裂部位
を含むのが好ましい。モデルプロモーターの具体的態様
では、制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１個の以上
開裂部位は、「ＴＡＴＡ」ボックスとＧａｌ４結合部位
との間に位置している。
れが制限エンドヌクレアーゼの１個以上の以上開裂部位
を含むのが好ましい。モデルプロモーターの具体的態様
では、制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１個の以上
開裂部位は、「ＴＡＴＡ」ボックスとＧａｌ４結合部位
との間に位置している。
【００５７】既に存在しているタンパク質結合配列の他
に（例えば、Ｇａｌ４配列の他に）他のタンパク質結合
配列をモデルプロモーターに組み込むことができる。こ
れは、例えば検討（試験）を行う他の転写因子、例えば
特異的転写因子を、既に検討してしまった転写系の他に
加える場合には特に興味深い。
に（例えば、Ｇａｌ４配列の他に）他のタンパク質結合
配列をモデルプロモーターに組み込むことができる。こ
れは、例えば検討（試験）を行う他の転写因子、例えば
特異的転写因子を、既に検討してしまった転写系の他に
加える場合には特に興味深い。
【００５８】本発明の方法の特徴は、融合タンパク質
を、転写活性化因子および／またはインヒビターとし
て、モデルプロモーターと組み合わせて用いることもで
きる。このような融合タンパク質は、例えば酵母Ｇａｌ
４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのようなＤＮＡ結合
ドメイン、および例えばＨＳＶ活性化因子ＶＰ１６の活
性化ドメインのような特異的活性化ドメインとを含んで
なることができる。融合タンパク質により、画定された
活性化因子および／またはインヒビター、またはそれら
の部分、例えばそれらの活性化または阻害ドメインをそ
れぞれ検討を行う遺伝子調節要素のバックグラウンドな
しに分析することができる。例えば、これは、ＤＮＡ結
合ドメインが、用いられる転写系（例えば、濃縮した核
抽出物）が欠けているＤＮＡ結合タンパク質に由来する
場合に、可能である。例えば、酵母のＧａｌ４結合ドメ
インとの融合タンパク質として存在する転写因子の活性
化因子（ドメイン）は、哺乳類細胞からの濃縮した核抽
出物をこの方法で用いるときには、哺乳類細胞からの核
抽出物はＧａｌ４を含まないので、バックグラウンドな
しに分析することができる。
を、転写活性化因子および／またはインヒビターとし
て、モデルプロモーターと組み合わせて用いることもで
きる。このような融合タンパク質は、例えば酵母Ｇａｌ
４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのようなＤＮＡ結合
ドメイン、および例えばＨＳＶ活性化因子ＶＰ１６の活
性化ドメインのような特異的活性化ドメインとを含んで
なることができる。融合タンパク質により、画定された
活性化因子および／またはインヒビター、またはそれら
の部分、例えばそれらの活性化または阻害ドメインをそ
れぞれ検討を行う遺伝子調節要素のバックグラウンドな
しに分析することができる。例えば、これは、ＤＮＡ結
合ドメインが、用いられる転写系（例えば、濃縮した核
抽出物）が欠けているＤＮＡ結合タンパク質に由来する
場合に、可能である。例えば、酵母のＧａｌ４結合ドメ
インとの融合タンパク質として存在する転写因子の活性
化因子（ドメイン）は、哺乳類細胞からの濃縮した核抽
出物をこの方法で用いるときには、哺乳類細胞からの核
抽出物はＧａｌ４を含まないので、バックグラウンドな
しに分析することができる。
【００５９】用いることができる遺伝子調節要素および
検討を行う遺伝子調節要素は、画定されたヒトおよび／
または動物および／またはウイルス遺伝子調節要素、特
に病理学的に興味深い遺伝子の遺伝子調節要素である。
例としては、接着分子、成長因子、ホスホジエステラー
ゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、膜レセ
プター、セカンドメッセンジャーレセプター、ホルモン
レセプター、例えばステロイドレセプター、メタロプロ
テアーゼ、イムノフィリン、ＮＯ−シンタ−ゼ、５−リ
ポキシゲナーゼ、または免疫学的標的の遺伝子の遺伝子
調節要素、例えばインターロイキンのようなサイトカイ
ンの遺伝子調節要素、例えばＣＤ４レセプターＴＣＲま
たはＢＣＲ（ＴまたはＢ細胞レセプター）のＴまたはＢ
細胞特異的発現遺伝子のプロモーター、例えばＴＮＦ
（腫瘍壊死因子）のようなリンパ系特異的遺伝子のプロ
モーター、または例えばＨＴＬＶ−１またはＨＩＶ−１
のようなＴ細胞特異的レトロウイルスの遺伝子調節要素
が挙げられる。
検討を行う遺伝子調節要素は、画定されたヒトおよび／
または動物および／またはウイルス遺伝子調節要素、特
に病理学的に興味深い遺伝子の遺伝子調節要素である。
例としては、接着分子、成長因子、ホスホジエステラー
ゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＡＴＰアーゼ、膜レセ
プター、セカンドメッセンジャーレセプター、ホルモン
レセプター、例えばステロイドレセプター、メタロプロ
テアーゼ、イムノフィリン、ＮＯ−シンタ−ゼ、５−リ
ポキシゲナーゼ、または免疫学的標的の遺伝子の遺伝子
調節要素、例えばインターロイキンのようなサイトカイ
ンの遺伝子調節要素、例えばＣＤ４レセプターＴＣＲま
たはＢＣＲ（ＴまたはＢ細胞レセプター）のＴまたはＢ
細胞特異的発現遺伝子のプロモーター、例えばＴＮＦ
（腫瘍壊死因子）のようなリンパ系特異的遺伝子のプロ
モーター、または例えばＨＴＬＶ−１またはＨＩＶ−１
のようなＴ細胞特異的レトロウイルスの遺伝子調節要素
が挙げられる。
【００６０】モデルプロモーターの本発明の方法の特別
な利点は、用いることができる遺伝子調節要素が「ＴＡ
ＴＡ」ボックスを含むプロモーター、例えばインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）をコードする遺伝子のプロモー
ターだけでなく、「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプ
ロモーター、例えばＴ細胞レセプターのβ鎖をコードす
る遺伝子のプロモーターでもあることである。例えば、
「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプロモーターをモデ
ルプロモーター中または万能レポータープラスミドｐＧ
Ｓ１００に組み込み、転写に用いることができる。
な利点は、用いることができる遺伝子調節要素が「ＴＡ
ＴＡ」ボックスを含むプロモーター、例えばインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）をコードする遺伝子のプロモー
ターだけでなく、「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプ
ロモーター、例えばＴ細胞レセプターのβ鎖をコードす
る遺伝子のプロモーターでもあることである。例えば、
「ＴＡＴＡ」ボックスを欠いているプロモーターをモデ
ルプロモーター中または万能レポータープラスミドｐＧ
Ｓ１００に組み込み、転写に用いることができる。
【００６１】転写を行うＤＮＡ配列の特徴は、それがこ
の配列中に１以上の核塩基を欠いていることである。転
写を行うＤＮＡ配列は、好ましくはグアニンまたはシト
シンまたはチミンを含まず、すなわち配列がＧ欠如配
列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である。更に、この配
列は２個以上の核塩基、例えばグアニンおよびチミン、
またはグアニンおよびシトシン、またはシトシンおよび
チミンを欠いていてもよい。
の配列中に１以上の核塩基を欠いていることである。転
写を行うＤＮＡ配列は、好ましくはグアニンまたはシト
シンまたはチミンを含まず、すなわち配列がＧ欠如配
列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である。更に、この配
列は２個以上の核塩基、例えばグアニンおよびチミン、
またはグアニンおよびシトシン、またはシトシンおよび
チミンを欠いていてもよい。
【００６２】用いられるＧ欠如配列、Ｃ欠如配列または
Ｔ欠如配列は、特にＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠
如配列の長さが４００ヌクレオチドを上回り、好ましく
は４００〜２０００ヌクレオチド以上であるものであ
る。特に、約５００、６００、７００、８００、９０
０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４０
０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９０
０、２０００、５０００以上のヌクレオチドの長さの配
列が用いられる。特異的核塩基を欠いている配列の特に
好ましい長さは、約８００、１２００、１６００または
２０００ヌクレオチドの長さである。
Ｔ欠如配列は、特にＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠
如配列の長さが４００ヌクレオチドを上回り、好ましく
は４００〜２０００ヌクレオチド以上であるものであ
る。特に、約５００、６００、７００、８００、９０
０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４０
０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９０
０、２０００、５０００以上のヌクレオチドの長さの配
列が用いられる。特異的核塩基を欠いている配列の特に
好ましい長さは、約８００、１２００、１６００または
２０００ヌクレオチドの長さである。
【００６３】ＤＮＡ鋳型は線形または環状ＤＮＡ配列で
あることができ、例えばＤＮＡ鋳型はポリメラーゼ連鎖
反応またはプラスミドによって生成した線状配列である
ことができる。
あることができ、例えばＤＮＡ鋳型はポリメラーゼ連鎖
反応またはプラスミドによって生成した線状配列である
ことができる。
【００６４】１態様では、ＤＮＡ鋳型はプラスミドであ
り、ベクター、モデルプロモーター、および例えばＧ欠
如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である転写を行う
ＤＮＡ配列の総てまたは部分から構築される。
り、ベクター、モデルプロモーター、および例えばＧ欠
如配列、Ｃ欠如配列またはＴ欠如配列である転写を行う
ＤＮＡ配列の総てまたは部分から構築される。
【００６５】本発明の目的は、普遍的に利用可能なレポ
ータープラスミド（万能レポータープラスミド）であ
る。この万能レポータープラスミドは、制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃII、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩの異常開裂部位、プラ
スミドｐＵＣ１９の一部、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５
つの結合部位、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ制限部位の間
のヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボッ
クス、ＢＡＭＨＩおよびＳｗａＩ制限部位の間のＭＬプ
ロモーター（アデノウイルスメジャーレイトプロモータ
ー）ののＩＮＲ（イニシエーター）領域、および長さが
約８００ヌクレオチド（塩基対）のＧ欠如配列を含んで
いる。普遍的レポータープラスミド中のモデルプロモー
ターは合成プロモーターであって、５個の酵母Ｇａｌ４
結合部位、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＳａｃII、ＢａｍｈｉおよびＳｗａＩの異常開裂部
位、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１のＴＡＴＡボック
ス、およびＭＬプロモーターのＩＮＲを含んでいる。検
討を行う任意の遺伝子調節要素は、このプロモーター領
域に組み込むことができる。モデルプロモーターの一部
または完全なモデルプロモーターを除いて、検討を行う
遺伝子調節要素に置換してもよい。
ータープラスミド（万能レポータープラスミド）であ
る。この万能レポータープラスミドは、制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃII、ＢａｍＨＩ、ＳｗａＩの異常開裂部位、プラ
スミドｐＵＣ１９の一部、酵母Ｇａｌ４タンパク質の５
つの結合部位、ＳａｃIIおよびＢａｍＨＩ制限部位の間
のヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボッ
クス、ＢＡＭＨＩおよびＳｗａＩ制限部位の間のＭＬプ
ロモーター（アデノウイルスメジャーレイトプロモータ
ー）ののＩＮＲ（イニシエーター）領域、および長さが
約８００ヌクレオチド（塩基対）のＧ欠如配列を含んで
いる。普遍的レポータープラスミド中のモデルプロモー
ターは合成プロモーターであって、５個の酵母Ｇａｌ４
結合部位、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＳａｃII、ＢａｍｈｉおよびＳｗａＩの異常開裂部
位、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．１のＴＡＴＡボック
ス、およびＭＬプロモーターのＩＮＲを含んでいる。検
討を行う任意の遺伝子調節要素は、このプロモーター領
域に組み込むことができる。モデルプロモーターの一部
または完全なモデルプロモーターを除いて、検討を行う
遺伝子調節要素に置換してもよい。
【００６６】万能レポータープラスミドの１態様は、ｐ
ＧＳ１００と呼ばれている（図２）。
ＧＳ１００と呼ばれている（図２）。
【００６７】万能レポータープラスミドｐＧＳ１００の
１態様では、合成プロモーターをヌクレオチド位置２１
６８および２３３７の間の配列領域に配置する。アデノ
ウイルスメジャーレイト（ＭＬ：major late）プロモー
ターのイニシエーター領域はヌクレオチド位置２３２２
〜２３３７に配置され、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．
１プロモーターのＴＡＴＡボックスを有する領域はヌク
レオチド位置２２８９〜２３１６に配置されている。酵
母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位は、ヌクレオチ
ド位置２１６８〜２２６０に配置されている。
１態様では、合成プロモーターをヌクレオチド位置２１
６８および２３３７の間の配列領域に配置する。アデノ
ウイルスメジャーレイト（ＭＬ：major late）プロモー
ターのイニシエーター領域はヌクレオチド位置２３２２
〜２３３７に配置され、ヒトＴ細胞レセプターＶβ８．
１プロモーターのＴＡＴＡボックスを有する領域はヌク
レオチド位置２２８９〜２３１６に配置されている。酵
母Ｇａｌ４タンパク質の５つの結合部位は、ヌクレオチ
ド位置２１６８〜２２６０に配置されている。
【００６８】万能レポータープラスミドｐＧＳ１００の
もう一つの態様は、図４〜６のヌクレオチド配列（配列
番号：１）によって示される。
もう一つの態様は、図４〜６のヌクレオチド配列（配列
番号：１）によって示される。
【００６９】万能レポータープラスミドｐＧＳ１００
は、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen
und Zellkulturen GmbH) 、マシェルオデール・ベグ１
ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュバイクに、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
の規定に基づき寄託された。受託番号はＤＳＭ第１１４
５０である。
は、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen
und Zellkulturen GmbH) 、マシェルオデール・ベグ１
ｂ、Ｄ−３８１２４ ブラウンシュバイクに、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
の規定に基づき寄託された。受託番号はＤＳＭ第１１４
５０である。
【００７０】本発明の方法の特徴は、特異的転写体の検
出を直接または間接的に妨害して、特異的転写体の明確
な検出を不可能にするタンパク質を転写後に除去しおよ
び／または分解させることである。除去または分解は、
特に簡単に行われる肯定段階、例えば反応を化学的およ
び／または機械的および／または酵素学的工程段階によ
って停止し、適当ならば、転写体を同時に妨害タンパク
質から取り除いて、過剰の標識したヌクレオチドを、こ
の工程段階の後に洗浄段階などによって特異的転写体か
ら除去することができるようにするものを含んでなる。
出を直接または間接的に妨害して、特異的転写体の明確
な検出を不可能にするタンパク質を転写後に除去しおよ
び／または分解させることである。除去または分解は、
特に簡単に行われる肯定段階、例えば反応を化学的およ
び／または機械的および／または酵素学的工程段階によ
って停止し、適当ならば、転写体を同時に妨害タンパク
質から取り除いて、過剰の標識したヌクレオチドを、こ
の工程段階の後に洗浄段階などによって特異的転写体か
ら除去することができるようにするものを含んでなる。
【００７１】本発明の方法のこの態様の特徴は、例え
ば、転写反応の後にタンパク質をプロテアーゼによって
分解することができることである。用いることができる
プロテアーゼは、例えば亜鉛プロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ、チオールプロテアーゼ、およびカルボキシプ
ロテアーゼである。特に、プロテイナーゼＫ、トリプシ
ン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ、パパ
インおよびペプシンを用いることができる。本発明の方
法の特別な態様は、プロテイナーゼＫによる消化を転写
の後に行うことである。
ば、転写反応の後にタンパク質をプロテアーゼによって
分解することができることである。用いることができる
プロテアーゼは、例えば亜鉛プロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ、チオールプロテアーゼ、およびカルボキシプ
ロテアーゼである。特に、プロテイナーゼＫ、トリプシ
ン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡ、パパ
インおよびペプシンを用いることができる。本発明の方
法の特別な態様は、プロテイナーゼＫによる消化を転写
の後に行うことである。
【００７２】転写の程度、すなわち転写速度を測定する
ことができるようにするには、特異的転写体の量を測定
しなければならない。
ことができるようにするには、特異的転写体の量を測定
しなければならない。
【００７３】本発明の方法の特徴は、転写を標識したヌ
クレオチドの存在下で行い、特異的転写体を標識するこ
とである。例えば、転写体は、適当な放射能標識し低な
いヌクレオチドを転写に用いる場合には、非放射能標識
体であることができる。用いることができるヌクレオチ
ドの標識基は、例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチル−１−
アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フルオレセ
イン誘導体またはクマリン誘導体のような蛍光基、また
はアクリジン誘導体のような化学発光基である。上記の
標識基により、特異的転写体を直接検出することができ
る。更に、転写体の間接検出に適する標識基を用いるこ
とも可能である。例としては、ＥＬＩＳＡなどにおける
特異的抗ジゴキシゲニン抗体で検出することができるジ
ゴキシゲニン、ビオチン／アビジン系によって検出する
ことができるビオチン、および官能基を含むリンカーア
ームであって、続いて検出可能なレポーター基と誘導体
京成することができるものである。最後に述べた可能性
の一例は、例えば転写の後に、アミノアルキルリンカー
であって、化学発光試験においてと反応して検出するこ
とができるものである。
クレオチドの存在下で行い、特異的転写体を標識するこ
とである。例えば、転写体は、適当な放射能標識し低な
いヌクレオチドを転写に用いる場合には、非放射能標識
体であることができる。用いることができるヌクレオチ
ドの標識基は、例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチル−１−
アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フルオレセ
イン誘導体またはクマリン誘導体のような蛍光基、また
はアクリジン誘導体のような化学発光基である。上記の
標識基により、特異的転写体を直接検出することができ
る。更に、転写体の間接検出に適する標識基を用いるこ
とも可能である。例としては、ＥＬＩＳＡなどにおける
特異的抗ジゴキシゲニン抗体で検出することができるジ
ゴキシゲニン、ビオチン／アビジン系によって検出する
ことができるビオチン、および官能基を含むリンカーア
ームであって、続いて検出可能なレポーター基と誘導体
京成することができるものである。最後に述べた可能性
の一例は、例えば転写の後に、アミノアルキルリンカー
であって、化学発光試験においてと反応して検出するこ
とができるものである。
【００７４】本発明の方法の特別な態様は、放射能標識
したヌクレオチドの存在下で転写を行うことである。ヌ
クレオチドは、例えばリン（32Ｐまたは33Ｐ）、硫黄（
35Ｓ）またはトリチウム（３Ｈ）で放射能標識すること
ができる。
したヌクレオチドの存在下で転写を行うことである。ヌ
クレオチドは、例えばリン（32Ｐまたは33Ｐ）、硫黄（
35Ｓ）またはトリチウム（３Ｈ）で放射能標識すること
ができる。
【００７５】本発明の方法の特別な態様は、特異的転写
体を、固相（固形マトリックス）に結合することによっ
て、例えば、マイクロタイタープレートに結合すること
によって、または特異的転写体を特殊フィルター膜また
は他の固相に結合することによって、特に、好ましくは
ナイロンまたはニトロセルロース製の帯電膜または帯電
フィルターに結合することによって、特に好ましくは、
例えばジエチルアミノエチル基のような帯電基を含む
膜、例えばＤＥＡＥ−セルロース膜に結合することによ
って、反応混合物から単離する。この態様の特徴は、固
形マトリックスに結合した特異的転写体を、特異的転写
体の明確な検出が可能な程度まで洗浄段階によって過剰
の標識したヌクレオチドから取り出すことができること
である。
体を、固相（固形マトリックス）に結合することによっ
て、例えば、マイクロタイタープレートに結合すること
によって、または特異的転写体を特殊フィルター膜また
は他の固相に結合することによって、特に、好ましくは
ナイロンまたはニトロセルロース製の帯電膜または帯電
フィルターに結合することによって、特に好ましくは、
例えばジエチルアミノエチル基のような帯電基を含む
膜、例えばＤＥＡＥ−セルロース膜に結合することによ
って、反応混合物から単離する。この態様の特徴は、固
形マトリックスに結合した特異的転写体を、特異的転写
体の明確な検出が可能な程度まで洗浄段階によって過剰
の標識したヌクレオチドから取り出すことができること
である。
【００７６】変性ゲル上での転写体のフェノール化、沈
澱およびその後の分離からなる通常の分離および検出と
比較して、本発明の方法は、意外なことには、均一に明
確に検出することができる特異的シグナルを生じる（例
７および図３を参照）。
澱およびその後の分離からなる通常の分離および検出と
比較して、本発明の方法は、意外なことには、均一に明
確に検出することができる特異的シグナルを生じる（例
７および図３を参照）。
【００７７】本発明の方法は、例えば活性化因子の存在
下での特異的転写（活性化因子転写）またはインヒビタ
ーの存在下での特異的転写（インヒビター転写）によっ
て誘発される特異的シグナルを発生するのに好適であ
り、このシグナルは、例えば活性化因子またはインヒビ
ターの非存在下で基本転写によって誘発される基本シグ
ナル強度とは少なくとも７倍、好ましくは８倍、特別の
場合には９または１０倍だけ異なる（例７および図３を
参照）。
下での特異的転写（活性化因子転写）またはインヒビタ
ーの存在下での特異的転写（インヒビター転写）によっ
て誘発される特異的シグナルを発生するのに好適であ
り、このシグナルは、例えば活性化因子またはインヒビ
ターの非存在下で基本転写によって誘発される基本シグ
ナル強度とは少なくとも７倍、好ましくは８倍、特別の
場合には９または１０倍だけ異なる（例７および図３を
参照）。
【００７８】本発明の方法の重要な態様は、薬理活性物
質のスクリーニングに用いることができることである。
候補の薬理活性物質をその活性（例えば、活性化または
阻害特性）について試験するには、試験を行う活性物質
の存在下で転写を行う。適当であれば、個々の成分、例
えば濃縮した核抽出物を、試験を行う活性物質と共に予
備インキュベーションすることができる。更に、試験を
行う活性物質の特異性を、複数の転写反応混合物であっ
て、それぞれの反応混合物が異なる成分を含んでなるも
のにおいて平行して試験を行う活性物質の存在下で転写
を行うことによって特性決定することができる。
質のスクリーニングに用いることができることである。
候補の薬理活性物質をその活性（例えば、活性化または
阻害特性）について試験するには、試験を行う活性物質
の存在下で転写を行う。適当であれば、個々の成分、例
えば濃縮した核抽出物を、試験を行う活性物質と共に予
備インキュベーションすることができる。更に、試験を
行う活性物質の特異性を、複数の転写反応混合物であっ
て、それぞれの反応混合物が異なる成分を含んでなるも
のにおいて平行して試験を行う活性物質の存在下で転写
を行うことによって特性決定することができる。
【００７９】試験を行う活性物質の例は、天然物および
／または化学的および結合性物質ライブラリーからの物
質であることができる。天然物は、植物、動物、植物分
泌物、動物分泌物、および特に真菌、酵母、細菌または
藻類のような微生物から単離することができる。
／または化学的および結合性物質ライブラリーからの物
質であることができる。天然物は、植物、動物、植物分
泌物、動物分泌物、および特に真菌、酵母、細菌または
藻類のような微生物から単離することができる。
【００８０】本発明の方法のもう一つの特別な態様は、
転写を、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または
細胞型特異的核抽出物の存在下で行い、平行な反応混合
物は、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または細
胞型特異的核抽出物の非存在下で、他の点では同一条件
下で行い、遺伝子調節要素（または遺伝子）および／ま
たは転写因子および／または補因子に対する試験を行う
活性物質、転写因子、補因子または細胞型特異的核抽出
物の活性（例えば、阻害、活性化）または効果を標識し
た転写体の量の差から決定する。
転写を、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または
細胞型特異的核抽出物の存在下で行い、平行な反応混合
物は、試験を行う活性物質、転写因子、補因子または細
胞型特異的核抽出物の非存在下で、他の点では同一条件
下で行い、遺伝子調節要素（または遺伝子）および／ま
たは転写因子および／または補因子に対する試験を行う
活性物質、転写因子、補因子または細胞型特異的核抽出
物の活性（例えば、阻害、活性化）または効果を標識し
た転写体の量の差から決定する。
【００８１】本発明の方法の特徴は、遺伝子調節に関与
しておりかつ検討を行うタンパク質の効果を、同一条件
下で平行して行った転写によって測定し、検討を行うタ
ンパク質は２個の反応混合物の一方だけに含まれている
ことである。
しておりかつ検討を行うタンパク質の効果を、同一条件
下で平行して行った転写によって測定し、検討を行うタ
ンパク質は２個の反応混合物の一方だけに含まれている
ことである。
【００８２】本発明の方法の１態様の特徴は、 a) 少なくとも２つの転写を同一条件下で平行して行
い、但し b) 転写反応混合物が、異なる量の試験される活性物
質、および／または少なくとも１個の転写因子、および
／または少なくとも１個の補因子、および／または濃縮
した核抽出物を含んでなることだけが異なり、 c) 標識した転写体の生成量を、転写後のそれぞれの反
応混合物について測定し、 d) 試験される活性物質、転写因子、補因子および／ま
たは濃縮核抽出物の遺伝子調節要素に対する活性および
／または特異性を、標識した転写体の生成量の差から測
定することである。
い、但し b) 転写反応混合物が、異なる量の試験される活性物
質、および／または少なくとも１個の転写因子、および
／または少なくとも１個の補因子、および／または濃縮
した核抽出物を含んでなることだけが異なり、 c) 標識した転写体の生成量を、転写後のそれぞれの反
応混合物について測定し、 d) 試験される活性物質、転写因子、補因子および／ま
たは濃縮核抽出物の遺伝子調節要素に対する活性および
／または特異性を、標識した転写体の生成量の差から測
定することである。
【００８３】この方法により、転写反応混合物が含んで
いるそれぞれの個々の成分（例えば、核抽出物（すなわ
ち特異的細胞型）に対する、または特異的転写因子に対
する）の効果を標的特異的に試験することができる。例
えば、検討を行う活性物質の画定された遺伝子調節要素
に対する効果を解析することができる。ここで決定的な
ことは、転写の反応条件を正確に定義することができる
ことである。
いるそれぞれの個々の成分（例えば、核抽出物（すなわ
ち特異的細胞型）に対する、または特異的転写因子に対
する）の効果を標的特異的に試験することができる。例
えば、検討を行う活性物質の画定された遺伝子調節要素
に対する効果を解析することができる。ここで決定的な
ことは、転写の反応条件を正確に定義することができる
ことである。
【００８４】本発明の方法は、遺伝子調節要素、および
転写因子および／または補因子および／または細胞型特
異的核抽出物を選択することによって好適な反応条件を
調節しまたは正確に設定することができるので、個々の
因子の病理が的遺伝子発現に対して標的特異的に影響を
与える方法を提供する。
転写因子および／または補因子および／または細胞型特
異的核抽出物を選択することによって好適な反応条件を
調節しまたは正確に設定することができるので、個々の
因子の病理が的遺伝子発現に対して標的特異的に影響を
与える方法を提供する。
【００８５】この方法が特に有利な点は、画定された条
件下で正または負の効果を発揮できる薬理活性物質、特
に画定された（標的）遺伝子の転写を活性化しまたは阻
害する活性物質であって、画定された遺伝子調節要素お
よび／または画定された転写因子、補因子および／また
は細胞型特異的核抽出物（または細胞）に特異的効果を
有する活性物質を同定することができることである。
件下で正または負の効果を発揮できる薬理活性物質、特
に画定された（標的）遺伝子の転写を活性化しまたは阻
害する活性物質であって、画定された遺伝子調節要素お
よび／または画定された転写因子、補因子および／また
は細胞型特異的核抽出物（または細胞）に特異的効果を
有する活性物質を同定することができることである。
【００８６】本発明は、特異活性物質の同定法の使用に
関する。例えば、この方法を用いて、試験する物質の特
性決定を行うことができる。例えば、この方法を用い
て、画定された条件下での試験する物質の特異性に関し
て特性決定することができる。この方法によって同定さ
れる薬理活性物質は、例えば遺伝子調節要素によって制
御されているＤＮＡ配列の転写を阻害または活性化する
ものである。
関する。例えば、この方法を用いて、試験する物質の特
性決定を行うことができる。例えば、この方法を用い
て、画定された条件下での試験する物質の特異性に関し
て特性決定することができる。この方法によって同定さ
れる薬理活性物質は、例えば遺伝子調節要素によって制
御されているＤＮＡ配列の転写を阻害または活性化する
ものである。
【００８７】本発明の方法のもう一つの特に有利な特徴
は、総ての段階を簡単な方法で自動化できることであ
る。例えば、供給ロボットモジュールに接続した試料採
取ロボットBiomek 2000 （商標名）（Beckman,ミュンヘ
ン）を用いることができる。次いで、固相に結合した転
写体を手動でまたは自動的に、例えばコンベアベルトに
よって洗浄することができる。
は、総ての段階を簡単な方法で自動化できることであ
る。例えば、供給ロボットモジュールに接続した試料採
取ロボットBiomek 2000 （商標名）（Beckman,ミュンヘ
ン）を用いることができる。次いで、固相に結合した転
写体を手動でまたは自動的に、例えばコンベアベルトに
よって洗浄することができる。
【００８８】本発明の特徴は、試料採取ロボット、例え
ばBiomek 2000 （商標名）が、タンパク質画分（例え
ば、核抽出物および他のタンパク質）、ＤＮＡ鋳型、転
写緩衝剤、転写において検討される物質、ピペットチッ
プ、マイクロタイタープレート、および膜のような個々
の反応成分を備えていることである。個々の反応は、例
えばマイクロタイタープレートのウェル中のこれらの成
分からなり、総ての試料採取段階は自動的に行われる。
この方法では、プレート当たり９６以上の異なる転写反
応混合物を同時に、小試料量、特に１００μｌ未満、好
ましくは１０〜５０μｌ、特に２０μｌと組み合わせて
処理することができる。それぞれの転写には約１〜１．
５時間かかるので、最良の可能なやり方でインキュベー
ション時間を用いると、この方法では１日当たり１００
０以上までの転写を行うことができる。
ばBiomek 2000 （商標名）が、タンパク質画分（例え
ば、核抽出物および他のタンパク質）、ＤＮＡ鋳型、転
写緩衝剤、転写において検討される物質、ピペットチッ
プ、マイクロタイタープレート、および膜のような個々
の反応成分を備えていることである。個々の反応は、例
えばマイクロタイタープレートのウェル中のこれらの成
分からなり、総ての試料採取段階は自動的に行われる。
この方法では、プレート当たり９６以上の異なる転写反
応混合物を同時に、小試料量、特に１００μｌ未満、好
ましくは１０〜５０μｌ、特に２０μｌと組み合わせて
処理することができる。それぞれの転写には約１〜１．
５時間かかるので、最良の可能なやり方でインキュベー
ション時間を用いると、この方法では１日当たり１００
０以上までの転写を行うことができる。
【００８９】転写は、例えば２０〜２５℃の温度で行う
ことができる。約３０℃で転写を行うのが特に好まし
い。
ことができる。約３０℃で転写を行うのが特に好まし
い。
【００９０】試験を行う活性物質、転写因子補因子、お
よび適当ならば、試験を行う濃縮した核抽出物は少量で
しか用いることができないが、これらの物質はこれらの
物質は多数の転写において各種の反応条件下で試験すべ
きであり、この方法は転写反応に要する試料量ができる
だけ少ないという要件に合うものでなければならない。
したがって、本発明の方法がナノリットルスケール、す
なわち約５０〜５００ｎｌの反応容積で行うのにも適し
ていることは、特に重要である。
よび適当ならば、試験を行う濃縮した核抽出物は少量で
しか用いることができないが、これらの物質はこれらの
物質は多数の転写において各種の反応条件下で試験すべ
きであり、この方法は転写反応に要する試料量ができる
だけ少ないという要件に合うものでなければならない。
したがって、本発明の方法がナノリットルスケール、す
なわち約５０〜５００ｎｌの反応容積で行うのにも適し
ていることは、特に重要である。
【００９１】転写法は普遍的に用いることができる。こ
の方法は、転写、および／または補因子、および／また
は遺伝子転写の調節に直接または間接的役割を果たして
いる他のタンパク質（すなわち、標的としての特異的タ
ンパク質）、および／または濃縮した核抽出物（すなわ
ち、標的としての特異的核抽出物または特異的細胞型）
の遺伝子調節要素（すなわち、標的としての特異的遺伝
子）を同定し、特性決定するのに用いることができる。
特に、この転写法は、病理学的に興味深い新規な遺伝子
調節要素を同定したり、これらの要素の効果を相当する
遺伝子調節要素に媒介する遺伝子調節タンパク質の指摘
に用いることができる。
の方法は、転写、および／または補因子、および／また
は遺伝子転写の調節に直接または間接的役割を果たして
いる他のタンパク質（すなわち、標的としての特異的タ
ンパク質）、および／または濃縮した核抽出物（すなわ
ち、標的としての特異的核抽出物または特異的細胞型）
の遺伝子調節要素（すなわち、標的としての特異的遺伝
子）を同定し、特性決定するのに用いることができる。
特に、この転写法は、病理学的に興味深い新規な遺伝子
調節要素を同定したり、これらの要素の効果を相当する
遺伝子調節要素に媒介する遺伝子調節タンパク質の指摘
に用いることができる。
【００９２】細胞分析法と比較して、上記の転写法は標
的特異性が一層高い。細胞分析法とは対照的に、個々の
成分の細胞への取り込みは、転写の効率に何んら影響し
ない。更に、上記の方法は簡単かつ速やかに行うことが
できる（例えば、個々の成分を調製して冷凍保管するこ
とができる）。この方法は、実質的にあらゆる細胞型お
よびあらゆる遺伝子に適用することができるので、標準
化が簡単であり、普遍的に用いることができる。
的特異性が一層高い。細胞分析法とは対照的に、個々の
成分の細胞への取り込みは、転写の効率に何んら影響し
ない。更に、上記の方法は簡単かつ速やかに行うことが
できる（例えば、個々の成分を調製して冷凍保管するこ
とができる）。この方法は、実質的にあらゆる細胞型お
よびあらゆる遺伝子に適用することができるので、標準
化が簡単であり、普遍的に用いることができる。
【００９３】この方法により、医薬品の調製に用いるこ
とができる薬理活性物質を同定できる。これらの転写法
によって同定された活性物質は、既知の活性物質と比較
して副作用がかなり低いものである。例えば、（自己）
免疫疾患、代謝疾患、癌、循環器疾患、伝染病、リウマ
チ、糖尿病、退行性および精神疾患の治療のための医薬
品の調製、特に慢性関節リウマチ、多発性硬化症、真性
糖尿病、アレルギー、喘息、アナフィラキシー、アトピ
ー性皮膚炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＩ
ＤＳ、クロイツフェルト−ヤーコブ病、癲癇、精神分裂
病、動脈硬化症、および結核の治療用の医薬品の調製に
用いることができる。
とができる薬理活性物質を同定できる。これらの転写法
によって同定された活性物質は、既知の活性物質と比較
して副作用がかなり低いものである。例えば、（自己）
免疫疾患、代謝疾患、癌、循環器疾患、伝染病、リウマ
チ、糖尿病、退行性および精神疾患の治療のための医薬
品の調製、特に慢性関節リウマチ、多発性硬化症、真性
糖尿病、アレルギー、喘息、アナフィラキシー、アトピ
ー性皮膚炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＩ
ＤＳ、クロイツフェルト−ヤーコブ病、癲癇、精神分裂
病、動脈硬化症、および結核の治療用の医薬品の調製に
用いることができる。
【００９４】更に、この普遍的な方法は、多数の他の可
能な用途を提供する。例えば、この方法は、動物病理学
および動物飼育に、穀物保護に、または植物育種にも同
様に用いて、問題の生物からの関連基本転写系、および
特異的遺伝子調節要素、転写因子および／または補因子
および／または転写反応に直接または間接的に関与して
いる他のタンパク質における特異的な薬理活性物質を見
出だすことができる。
能な用途を提供する。例えば、この方法は、動物病理学
および動物飼育に、穀物保護に、または植物育種にも同
様に用いて、問題の生物からの関連基本転写系、および
特異的遺伝子調節要素、転写因子および／または補因子
および／または転写反応に直接または間接的に関与して
いる他のタンパク質における特異的な薬理活性物質を見
出だすことができる。
【００９５】原則として、このインビトロ転写法は、酵
母、真菌、細菌などの微生物の、または昆虫の遺伝子調
節要素、転写の可能な系、転写因子および／または補因
子を用いる場合には、これに対応して、材料および食品
の保存に用いることができる物質の同定についても同様
に用いることができる。
母、真菌、細菌などの微生物の、または昆虫の遺伝子調
節要素、転写の可能な系、転写因子および／または補因
子を用いる場合には、これに対応して、材料および食品
の保存に用いることができる物質の同定についても同様
に用いることができる。
【００９６】
【実施例】例１： HeLa核抽出物の調製 HeLa細胞核から出発して、核抽出物を調製する。HeLa細
胞核は、様々な会社から市販されている（例えば、「４
℃」, Mons; Sigma 、ミュンヘン、Santa CruzBiotechn
ology、ハイデルベルグ）。以下に記載する細胞核の加
工は４℃（コールドルーム）で行う。緩衝液を、トリス
で４℃でｐＨ７．３に相当する室温（ＲＴ）でｐＨ６．
８に調整する。使用の前に、緩衝液ＤＴＴ（１Ｍ保存水
溶液）で処理して最終濃度を５ｍＭとし、ＰＭＳＦ（２
００ｍＭ保存溶液、ＤＭＳＯ中）で処理して最終濃度を
１ｍＭとする。
胞核は、様々な会社から市販されている（例えば、「４
℃」, Mons; Sigma 、ミュンヘン、Santa CruzBiotechn
ology、ハイデルベルグ）。以下に記載する細胞核の加
工は４℃（コールドルーム）で行う。緩衝液を、トリス
で４℃でｐＨ７．３に相当する室温（ＲＴ）でｐＨ６．
８に調整する。使用の前に、緩衝液ＤＴＴ（１Ｍ保存水
溶液）で処理して最終濃度を５ｍＭとし、ＰＭＳＦ（２
００ｍＭ保存溶液、ＤＭＳＯ中）で処理して最終濃度を
１ｍＭとする。
【００９７】細胞核の加工は、下記の段階を含んでな
る。 1. 氷上で細胞核を解凍し、ＮＰＶ容積（核ペレット容
積）を測定する。 2. ２個の異なるガラスビーカーに、それぞれの場合に
１／２ＮＰＶ容積の０．０２Ｍ ＫＣｌ緩衝液（低塩含
量の緩衝液：２０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２
５０ｍｌ １００％グリセロール、６．６７ｍｌ ３Ｍ
ＫＣｌ、１．５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌと
する）、および１．２Ｍ ＫＣｌ緩衝液（高塩含量の緩
衝液：２０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２５０ｍ
ｌ １００％グリセロール、４００ｍｌ ３Ｍ ＫＣ
ｌ、１．５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ ０．
５ＭＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）を
それぞれ加える。それぞれの緩衝液を０．０００７×Ｎ
ＰＶ／２ β−メルカプトエタノールおよび０．００１
×ＮＰＶ／２ ０．２Ｍ ＰＭＳＦで処理する。ペレッ
トを１／２容積の０．０２Ｍ ＫＣｌ緩衝液に再分散
し、乳棒を用いて緩やかにホモゲナイズする（６×）。 3. ホモゲネートをガラスビーカーに入れて、３０分間
連続攪拌しながら１．２Ｍ ＫＣｌ緩衝液を滴加して処
理する。更に３０分間攪拌した後、抽出を終了する。遠
心分離（Beckman 遠心分離機、SS34ローター、１４，０
００ｒｐｍ、３０分、４℃）を行い、ペレットおよび上
清を別個に更に処理する。 4. 上清を緩衝液１（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８
ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ
ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）中
で、緩衝液２の伝導率に到達するまで（４０ｍｌ １Ｍ
トリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．
８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、６６．７ｍｌ３Ｍ ＫＣ
ｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする）透析を行う
（４５〜５５分）。 5. 透析した上清を遠心分離する（Beckman 、SS34ロー
ター、１８，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。HeLa核抽
出物は上清中にある（HeLa核抽出物＝HeLaＮＥ）。この
抽出物の一部を液体Ｎ２で凍結する。核抽出からのペレ
ットをホモジナイザーに移して、１０ｍｌのＴＧＭＥ／
５ｍＭ ＤＴＴ（１リットルに対するＴＧＭＥ：２５０
ｍｌ １００％グリセロール、５０ｍｌトリスｐＨ７．
３ＲＴ、５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｌ ５０
０ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．０）で処理し、乳棒で２０×
（激しく）ホモゲナイズして、液体Ｎ２で凍結する（He
La核ペレット）。
る。 1. 氷上で細胞核を解凍し、ＮＰＶ容積（核ペレット容
積）を測定する。 2. ２個の異なるガラスビーカーに、それぞれの場合に
１／２ＮＰＶ容積の０．０２Ｍ ＫＣｌ緩衝液（低塩含
量の緩衝液：２０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２
５０ｍｌ １００％グリセロール、６．６７ｍｌ ３Ｍ
ＫＣｌ、１．５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌと
する）、および１．２Ｍ ＫＣｌ緩衝液（高塩含量の緩
衝液：２０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、２５０ｍ
ｌ １００％グリセロール、４００ｍｌ ３Ｍ ＫＣ
ｌ、１．５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．４ｍｌ ０．
５ＭＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）を
それぞれ加える。それぞれの緩衝液を０．０００７×Ｎ
ＰＶ／２ β−メルカプトエタノールおよび０．００１
×ＮＰＶ／２ ０．２Ｍ ＰＭＳＦで処理する。ペレッ
トを１／２容積の０．０２Ｍ ＫＣｌ緩衝液に再分散
し、乳棒を用いて緩やかにホモゲナイズする（６×）。 3. ホモゲネートをガラスビーカーに入れて、３０分間
連続攪拌しながら１．２Ｍ ＫＣｌ緩衝液を滴加して処
理する。更に３０分間攪拌した後、抽出を終了する。遠
心分離（Beckman 遠心分離機、SS34ローター、１４，０
００ｒｐｍ、３０分、４℃）を行い、ペレットおよび上
清を別個に更に処理する。 4. 上清を緩衝液１（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８
ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ
ＥＤＴＡ、Ｈ２Ｏを加えて１０００ｍｌとする）中
で、緩衝液２の伝導率に到達するまで（４０ｍｌ １Ｍ
トリスｐＨ６．８ＲＴ、４００ｍｌグリセロール、０．
８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、６６．７ｍｌ３Ｍ ＫＣ
ｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０００ｍｌとする）透析を行う
（４５〜５５分）。 5. 透析した上清を遠心分離する（Beckman 、SS34ロー
ター、１８，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）。HeLa核抽
出物は上清中にある（HeLa核抽出物＝HeLaＮＥ）。この
抽出物の一部を液体Ｎ２で凍結する。核抽出からのペレ
ットをホモジナイザーに移して、１０ｍｌのＴＧＭＥ／
５ｍＭ ＤＴＴ（１リットルに対するＴＧＭＥ：２５０
ｍｌ １００％グリセロール、５０ｍｌトリスｐＨ７．
３ＲＴ、５ｍｌ １Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｌ ５０
０ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．０）で処理し、乳棒で２０×
（激しく）ホモゲナイズして、液体Ｎ２で凍結する（He
La核ペレット）。
【００９８】例２： 核抽出物の単離のためのホスホセ
ルロースカラムの調製 1. P11 カラム（商標名）材料を水で繰り返し洗浄す
る。膨潤した材料の容積を測定する。 2. ０．５Ｎ ＮａＯＨを５倍容積加え、５分間放置し
た後、直ちに折り畳みフィルターで吸引濾過する。 3. 水でｐＨ１１になるまで洗浄する。 4. ０．５Ｎ ＨＣｌを２５倍容積加える。５分間放置
した後、直ちに吸引濾過する。 5. 水でｐＨ３になるまで洗浄する。 6. １ＭトリスｐＨ７でｐＨが一定になるまで洗浄す
る。カラム材料を４℃で保管する。最も好ましくは、一
晩平衡させる。
ルロースカラムの調製 1. P11 カラム（商標名）材料を水で繰り返し洗浄す
る。膨潤した材料の容積を測定する。 2. ０．５Ｎ ＮａＯＨを５倍容積加え、５分間放置し
た後、直ちに折り畳みフィルターで吸引濾過する。 3. 水でｐＨ１１になるまで洗浄する。 4. ０．５Ｎ ＨＣｌを２５倍容積加える。５分間放置
した後、直ちに吸引濾過する。 5. 水でｐＨ３になるまで洗浄する。 6. １ＭトリスｐＨ７でｐＨが一定になるまで洗浄す
る。カラム材料を４℃で保管する。最も好ましくは、一
晩平衡させる。
【００９９】例３： ホスホセルロースクロマトグラフ
ィによる核抽出物のクロマトグラフィ精製 P11 カラム（商標名）材料の容量は１０ｍｇタンパク質
／１ｍｌ材料である。クロマトグラフィは下記の方法で
行う。 1. P11 カラム（商標名）材料をカラムに充填し、緩衝
液２（ＤＴＴおよびＰＭＳＦを新たに加えたもの、例１
を参照）で平衡させる。カラムをポンプに取り付ける。 2. 核抽出物（緩衝液２中）を（１カラム容積（ＣＶ）
／時で）ロードする。 3. カラムを５ＣＶの緩衝液２で洗浄する（５〜１０Ｃ
Ｖ／時）。 4. 緩衝液３（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、２００ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出する。タンパク質
がそれ以上溶出しなくなった後、更に２ＣＶの緩衝液３
を流す。 5. 緩衝液４（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、３３３ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を
集める。 6. 緩衝液５（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、５６７ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を
集める。 7. ２種類の溶出物のそれぞれを伝導率が一定になるま
で緩衝液２に対して透析した後、一部を液体Ｎ２で冷凍
する。
ィによる核抽出物のクロマトグラフィ精製 P11 カラム（商標名）材料の容量は１０ｍｇタンパク質
／１ｍｌ材料である。クロマトグラフィは下記の方法で
行う。 1. P11 カラム（商標名）材料をカラムに充填し、緩衝
液２（ＤＴＴおよびＰＭＳＦを新たに加えたもの、例１
を参照）で平衡させる。カラムをポンプに取り付ける。 2. 核抽出物（緩衝液２中）を（１カラム容積（ＣＶ）
／時で）ロードする。 3. カラムを５ＣＶの緩衝液２で洗浄する（５〜１０Ｃ
Ｖ／時）。 4. 緩衝液３（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、２００ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出する。タンパク質
がそれ以上溶出しなくなった後、更に２ＣＶの緩衝液３
を流す。 5. 緩衝液４（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、３３３ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を
集める。 6. 緩衝液５（４０ｍｌ １ＭトリスｐＨ６．８ＲＴ、
４００ｍｌグリセロール、０．８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ、５６７ｍｌ ３Ｍ ＫＣｌ、Ｈ２Ｏを加えて２０
００ｍｌとする；２ＣＶ／時）で溶出し、ピーク画分を
集める。 7. ２種類の溶出物のそれぞれを伝導率が一定になるま
で緩衝液２に対して透析した後、一部を液体Ｎ２で冷凍
する。
【０１００】例４： 転写体を分離するためのポリアク
リルアミドゲルを用いる標準的転写法 転写反応混合物（最終容積２０μｌ）は下記の成分から
なることができる。 a) 予備精製した核抽出物の形態の、または組換え技術
によって産生し、適当ならば、追加の特異的転写因子、
活性化因子、インヒビター、または融合タンパク質を補
足した一般的転写因子、 b) ＤＮＡ鋳型（例えば検討を行う遺伝子調節要素を有
するベクターｐＧＳ１００）、 c) 例えば検討を行う活性物質を含んでなる転写緩衝
液、 d) 標識したおよび未標識ヌクレオチド。
リルアミドゲルを用いる標準的転写法 転写反応混合物（最終容積２０μｌ）は下記の成分から
なることができる。 a) 予備精製した核抽出物の形態の、または組換え技術
によって産生し、適当ならば、追加の特異的転写因子、
活性化因子、インヒビター、または融合タンパク質を補
足した一般的転写因子、 b) ＤＮＡ鋳型（例えば検討を行う遺伝子調節要素を有
するベクターｐＧＳ１００）、 c) 例えば検討を行う活性物質を含んでなる転写緩衝
液、 d) 標識したおよび未標識ヌクレオチド。
【０１０１】a)について、（例３の）緩衝液４の溶出物
および緩衝液５の溶出物は、転写できる核抽出物に含ま
れている（総ての一般的転写因子）。緩衝液４の溶出物
および緩衝液５の溶出物の最適量は、それぞれの個々の
調製について決定しなければならない（反応混合物当た
り約３μｌの緩衝液４の溶出物および２μｌの緩衝液５
の溶出物）。 b)について、反応混合物に対して、ＤＮＡ鋳型（レポー
タープラスミド、例えばｐＧＳ１００中の遺伝子調節要
素）１００ｎｇを通常用いる。 c)について、転写緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ ＫＯＨｐＨ８．２、０．５μｌＢＳＡ
アセチル化体（保存溶液２０ｍｇ／ｍｌ）、約１０％グ
リセロール、約７０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、１０ｍＭ ＤＴＴ）に、それぞれの場合に反応混合
物当たり２０ＵのＲＮアーゼインヒビターを加えたも
の。 d)について、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰをそれぞれの場合
に１００μｍの最終濃度、ＣＴＰを５μＭの最終濃度、
ｏ−ｍ−ＧＴＰを２０μＭの最終濃度、α−32Ｐ−ＣＴ
Ｐを約０．１２μＭの最終濃度、３０００Ｃｉ／ミリモ
ル、１０ｍＣｉ／ｍｌ）。
および緩衝液５の溶出物は、転写できる核抽出物に含ま
れている（総ての一般的転写因子）。緩衝液４の溶出物
および緩衝液５の溶出物の最適量は、それぞれの個々の
調製について決定しなければならない（反応混合物当た
り約３μｌの緩衝液４の溶出物および２μｌの緩衝液５
の溶出物）。 b)について、反応混合物に対して、ＤＮＡ鋳型（レポー
タープラスミド、例えばｐＧＳ１００中の遺伝子調節要
素）１００ｎｇを通常用いる。 c)について、転写緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ ＫＯＨｐＨ８．２、０．５μｌＢＳＡ
アセチル化体（保存溶液２０ｍｇ／ｍｌ）、約１０％グ
リセロール、約７０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳ
Ｆ、１０ｍＭ ＤＴＴ）に、それぞれの場合に反応混合
物当たり２０ＵのＲＮアーゼインヒビターを加えたも
の。 d)について、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＵＴＰをそれぞれの場合
に１００μｍの最終濃度、ＣＴＰを５μＭの最終濃度、
ｏ−ｍ−ＧＴＰを２０μＭの最終濃度、α−32Ｐ−ＣＴ
Ｐを約０．１２μＭの最終濃度、３０００Ｃｉ／ミリモ
ル、１０ｍＣｉ／ｍｌ）。
【０１０２】1. 転写緩衝液およびｄＮＴＰを導入し、
ＤＮＡ鋳型を加える。 2. 転写活性化因子および緩衝液４溶出物および緩衝液
５溶出物を加える。 3. 転写反応を行うため、３０℃で１時間インキュベー
ションする。 4. 停止混合物（７Ｍ尿素、１０ｍＭトリスｐＨ７．
８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ／ＮａＯＨｐＨ８．０、０．５
％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１００μｇ／ｍｌ
ｔＲＮＡ、３００ｍＭ 酢酸Ｎａ）４００μｌ、および
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２
５／２４／１）４００μｌを加える。混合して遠心分離
する（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、５分、１
４，０００ｒｐｍ、ＲＴ）。上清を抜き取り、イソプロ
パノール４００μｌを加えた後、−２０℃で１時間イン
キュベーションする。 5. 遠心分離（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、１
４，０００ｒｐｍ、３０分、ＲＴ）して、ペレットを７
０％エタノールで洗浄した後、Speedvacで乾燥する。 6. ペレットをロード用緩衝液（９５５μｌの１００％
ホルムアミド（脱イオン化）１０μｌ、０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ １０μｌ、１ＭトリスｐＨ７を２０μｌ、それぞ
れの場合に０．００３％ブロモフェノールブルー／キシ
レンシアノール、Ｈ２Ｏを加えて１ｍｌとする）１０μ
ｌに取り、５０℃で１５分間インキュベーションする。 7. 転写体を、１×ＴＢＥを有する５％強度の変性ポリ
アクリルアミドゲルを展開緩衝液として、分離する。６
０ｍＡで２０分間予備展開する。ゲルをロードする。ゲ
ルを６０ｍＡで約１時間展開する。 8. ゲルを１０％酢酸で固定し、乾燥して、Phosphoima
ger （商標名）中でＸ線フィルターに暴露する。
ＤＮＡ鋳型を加える。 2. 転写活性化因子および緩衝液４溶出物および緩衝液
５溶出物を加える。 3. 転写反応を行うため、３０℃で１時間インキュベー
ションする。 4. 停止混合物（７Ｍ尿素、１０ｍＭトリスｐＨ７．
８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ／ＮａＯＨｐＨ８．０、０．５
％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１００μｇ／ｍｌ
ｔＲＮＡ、３００ｍＭ 酢酸Ｎａ）４００μｌ、および
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２
５／２４／１）４００μｌを加える。混合して遠心分離
する（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、５分、１
４，０００ｒｐｍ、ＲＴ）。上清を抜き取り、イソプロ
パノール４００μｌを加えた後、−２０℃で１時間イン
キュベーションする。 5. 遠心分離（SS34ローター、Beckman 遠心分離機、１
４，０００ｒｐｍ、３０分、ＲＴ）して、ペレットを７
０％エタノールで洗浄した後、Speedvacで乾燥する。 6. ペレットをロード用緩衝液（９５５μｌの１００％
ホルムアミド（脱イオン化）１０μｌ、０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ １０μｌ、１ＭトリスｐＨ７を２０μｌ、それぞ
れの場合に０．００３％ブロモフェノールブルー／キシ
レンシアノール、Ｈ２Ｏを加えて１ｍｌとする）１０μ
ｌに取り、５０℃で１５分間インキュベーションする。 7. 転写体を、１×ＴＢＥを有する５％強度の変性ポリ
アクリルアミドゲルを展開緩衝液として、分離する。６
０ｍＡで２０分間予備展開する。ゲルをロードする。ゲ
ルを６０ｍＡで約１時間展開する。 8. ゲルを１０％酢酸で固定し、乾燥して、Phosphoima
ger （商標名）中でＸ線フィルターに暴露する。
【０１０３】例５： 転写体を結合するためのフィルタ
ーを用いて自動化できる上記のインビトロ転写法のプロ
トコール 1. 転写緩衝液およびｄＮＴＰを導入して、ＤＮＡ鋳型
を加える。 2. 緩衝液４溶出物および緩衝液５溶出物、および適当
ならば、転写活性化因子または転写インヒビターを加え
る。 3. 混合物３０℃で１時間インキュベーションして、転
写反応を行う。 4. ５μｌのプロテイナーゼＫ混合物（１μｌプロテイ
ナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ １０％ＳＤ
Ｓ、０．５μｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８、１μｌ
５０ｍＭ トリスｐＨ７．８、Ｈ２Ｏを加えて５μｌと
する）を加える。 5. ３０℃で１５分間インキュベーションする。 6. ＤＥＡＥ膜NA45（商標名）(Schleicher und Schuel
l)を膜洗浄緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ピロリン酸ナ
トリウム）で簡単に洗浄する。 7. この反応混合物から膜に５μｌを採取し、５分間乾
燥する。 8. 膜洗浄緩衝液（＋１％Triton）約１００ｍｌ中で膜
を緩やかに４×１５分間振盪する。 9. Whatmann 3 MM （商標名）濾紙(Whatmann 、メイド
ストーン、英国）に膜を移し、風乾し、フィルムで被覆
して、フィルターをPhosphoimager （商標名）を用いて
Ｘ線フィルムに暴露する。
ーを用いて自動化できる上記のインビトロ転写法のプロ
トコール 1. 転写緩衝液およびｄＮＴＰを導入して、ＤＮＡ鋳型
を加える。 2. 緩衝液４溶出物および緩衝液５溶出物、および適当
ならば、転写活性化因子または転写インヒビターを加え
る。 3. 混合物３０℃で１時間インキュベーションして、転
写反応を行う。 4. ５μｌのプロテイナーゼＫ混合物（１μｌプロテイ
ナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）、１μｌ １０％ＳＤ
Ｓ、０．５μｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８、１μｌ
５０ｍＭ トリスｐＨ７．８、Ｈ２Ｏを加えて５μｌと
する）を加える。 5. ３０℃で１５分間インキュベーションする。 6. ＤＥＡＥ膜NA45（商標名）(Schleicher und Schuel
l)を膜洗浄緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ピロリン酸ナ
トリウム）で簡単に洗浄する。 7. この反応混合物から膜に５μｌを採取し、５分間乾
燥する。 8. 膜洗浄緩衝液（＋１％Triton）約１００ｍｌ中で膜
を緩やかに４×１５分間振盪する。 9. Whatmann 3 MM （商標名）濾紙(Whatmann 、メイド
ストーン、英国）に膜を移し、風乾し、フィルムで被覆
して、フィルターをPhosphoimager （商標名）を用いて
Ｘ線フィルムに暴露する。
【０１０４】例６： フィルターを用いる上記のインビ
トロ転写法に続いて、転写反応を３種類の異なるレポー
タープラスミドを用いて平行して行う。 手続は、例１〜３および５に記載した通りである。用い
るレポータープラスミドはｐＭＲＧ５（ＨＩＶプロモー
ターのＴＡＴＡボックス、ＭＬプロモーターのイニシエ
ーター領域、およびｐＵＣ１９中の長さが約４００ヌク
レオチドの無Ｇカセット(Kretschmar, M., Kaiser, K.,
Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell. 78,
525-534) 、ｐＧＳ１００（図２）、およびｐＶβＭＬ
（ｐＧＳ１００と同様に構築されているが、８００ｂｐ
のＧ欠如カセットの代わりに４００ｂｐだけのＧ欠如カ
セットを含む）である。それぞれの場合に、ＤＮＡ鋳型
１００ｎｇ、およびP11 （商標名）画分（緩衝液４溶出
物および緩衝液５溶出物）３μｌを転写反応に用いる。
反応は、それぞれの場合に、活性化因子（Ｇａｌ４結合
ドメインとポリグルタミン活性化ドメインとからなる融
合タンパク質）を用いずにおよびを用いて平行して行
う。結果を、図１に示した。
トロ転写法に続いて、転写反応を３種類の異なるレポー
タープラスミドを用いて平行して行う。 手続は、例１〜３および５に記載した通りである。用い
るレポータープラスミドはｐＭＲＧ５（ＨＩＶプロモー
ターのＴＡＴＡボックス、ＭＬプロモーターのイニシエ
ーター領域、およびｐＵＣ１９中の長さが約４００ヌク
レオチドの無Ｇカセット(Kretschmar, M., Kaiser, K.,
Lottspeich, F., Meisterernst, M. (1994) Cell. 78,
525-534) 、ｐＧＳ１００（図２）、およびｐＶβＭＬ
（ｐＧＳ１００と同様に構築されているが、８００ｂｐ
のＧ欠如カセットの代わりに４００ｂｐだけのＧ欠如カ
セットを含む）である。それぞれの場合に、ＤＮＡ鋳型
１００ｎｇ、およびP11 （商標名）画分（緩衝液４溶出
物および緩衝液５溶出物）３μｌを転写反応に用いる。
反応は、それぞれの場合に、活性化因子（Ｇａｌ４結合
ドメインとポリグルタミン活性化ドメインとからなる融
合タンパク質）を用いずにおよびを用いて平行して行
う。結果を、図１に示した。
【０１０５】図１には万能レポータープラスミドｐＧＳ
１００（図２）を有する２種類の標準的プロモーターの
比較が示されている。転写反応は例６に記載した通りに
行った。
１００（図２）を有する２種類の標準的プロモーターの
比較が示されている。転写反応は例６に記載した通りに
行った。
【０１０６】図１のそれぞれの場合に比較したものは、
基本(A) および活性化転写(B) であった。用いた活性化
因子はＧａｌ４結合ドメイン（９４アミノ末端アミノ
酸）およびポリグルタミン活性化ドメイン（１１グルタ
ミン酸単位の合成ペプチド）からなる融合タンパク質で
あった。プロットしたデーターは、バックグラウンドを
差し引いた後の（ホスホイメージャー(phosphoimager)
によって得られる相対的単位での）絶対値である。ｐＧ
Ｓ１００をレポータープラスミドとして用いた転写反応
では、両方とも高い絶対値を示し、合成プロモーターの
構築が異なっているため、ｍＲＧ５より優れた活性が測
定された。更に、４００ヌクレオチドを上回る長さのＧ
欠如配列の正の効果は明らかである。
基本(A) および活性化転写(B) であった。用いた活性化
因子はＧａｌ４結合ドメイン（９４アミノ末端アミノ
酸）およびポリグルタミン活性化ドメイン（１１グルタ
ミン酸単位の合成ペプチド）からなる融合タンパク質で
あった。プロットしたデーターは、バックグラウンドを
差し引いた後の（ホスホイメージャー(phosphoimager)
によって得られる相対的単位での）絶対値である。ｐＧ
Ｓ１００をレポータープラスミドとして用いた転写反応
では、両方とも高い絶対値を示し、合成プロモーターの
構築が異なっているため、ｍＲＧ５より優れた活性が測
定された。更に、４００ヌクレオチドを上回る長さのＧ
欠如配列の正の効果は明らかである。
【０１０７】図２に示される万能レポータープラスミド
ｐＧＳ１００は、ｐＵＣ１９において長さが約８００塩
基対のＧ欠如領域のモデルプロモーター上流として合成
プロモーター領域を含む。ＢａｍＨＩおよびＳｗａＩ制
限部位内には、アデノウイルスメジャーレイト（ＭＬ）
プロモーターのイニシエーター領域が配置されている。
ＳａｃIIとＢａｍＨＩ制限部位の間には、ヒトＴ細胞レ
セプターＶβ８．１プロモーターのＴＡＴＡボックスを
有する領域が配置されている。これらの２個の基本プロ
モーター要素（イニシエーターおよびＴＡＴＡボック
ス）により、インビトロでの基本転写ができる。これら
の候補標的遺伝子はスクリーニングに特に重要であるこ
とがあるので、検討を行う遺伝子の相当する領域につい
て（相当する遺伝子調節要素）個々にそれらを交換する
ことができる。標的遺伝子の任意の調節領域を、基本プ
ロモーターのポリリンカー下流に導入することができる
（特異的活性化）。あるいは、全プロモーター領域を交
換することもできる。ポリリンカーの上流では（Ｓａｃ
II〜ＰｓｔＩ）ｐＧＳ１００は、酵母Ｇａｌ４タンパク
質の５個の結合部位を含んでいる。これにより、合成転
写活性化因子、例えば任意の所望な活性化ドメイン（例
えば、単純ヘルペストランスアクチベーターＶＰ１６）
およびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる融合タ
ンパク質を分析することもできる。無Ｇ配列はｐＧＳ１
００の本質的単位である。
ｐＧＳ１００は、ｐＵＣ１９において長さが約８００塩
基対のＧ欠如領域のモデルプロモーター上流として合成
プロモーター領域を含む。ＢａｍＨＩおよびＳｗａＩ制
限部位内には、アデノウイルスメジャーレイト（ＭＬ）
プロモーターのイニシエーター領域が配置されている。
ＳａｃIIとＢａｍＨＩ制限部位の間には、ヒトＴ細胞レ
セプターＶβ８．１プロモーターのＴＡＴＡボックスを
有する領域が配置されている。これらの２個の基本プロ
モーター要素（イニシエーターおよびＴＡＴＡボック
ス）により、インビトロでの基本転写ができる。これら
の候補標的遺伝子はスクリーニングに特に重要であるこ
とがあるので、検討を行う遺伝子の相当する領域につい
て（相当する遺伝子調節要素）個々にそれらを交換する
ことができる。標的遺伝子の任意の調節領域を、基本プ
ロモーターのポリリンカー下流に導入することができる
（特異的活性化）。あるいは、全プロモーター領域を交
換することもできる。ポリリンカーの上流では（Ｓａｃ
II〜ＰｓｔＩ）ｐＧＳ１００は、酵母Ｇａｌ４タンパク
質の５個の結合部位を含んでいる。これにより、合成転
写活性化因子、例えば任意の所望な活性化ドメイン（例
えば、単純ヘルペストランスアクチベーターＶＰ１６）
およびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる融合タ
ンパク質を分析することもできる。無Ｇ配列はｐＧＳ１
００の本質的単位である。
【０１０８】例７： 標準的転写法で得られる放射能標
識した転写体のシグナル強度（転写体の量、したがって
転写強度の尺度として）と上記のインビトロ転写法で得
られるシグナル強度との比較。 転写反応は、例１〜５に記載した通りに行い、平行反応
混合物をフィルター分析法（例５）またはゲル分析法
（例４）で分析する。それぞれの場合に、ｐＭＲＧ５
２００ｎｇを反応のＤＮＡ鋳型として用いる。幾つかの
転写反応を３０ｎｇのＧａｌ４−ＶＰ１６の存在下で行
い、これを活性化因子として用いる。結果を図３に示し
た。
識した転写体のシグナル強度（転写体の量、したがって
転写強度の尺度として）と上記のインビトロ転写法で得
られるシグナル強度との比較。 転写反応は、例１〜５に記載した通りに行い、平行反応
混合物をフィルター分析法（例５）またはゲル分析法
（例４）で分析する。それぞれの場合に、ｐＭＲＧ５
２００ｎｇを反応のＤＮＡ鋳型として用いる。幾つかの
転写反応を３０ｎｇのＧａｌ４−ＶＰ１６の存在下で行
い、これを活性化因子として用いる。結果を図３に示し
た。
【０１０９】図３は、様々な反応条件下で得られる（転
写体の量、したがって転写強度の尺度としての）シグナ
ル強度の比較を示している。転写反応は、例７に記載し
た通りに行う。
写体の量、したがって転写強度の尺度としての）シグナ
ル強度の比較を示している。転写反応は、例７に記載し
た通りに行う。
【０１１０】異なる反応条件下での２種類の異なる方法
で得られたシグナル強度の比較は、本明細書に記載のイ
ンビトロ転写法を用いる基本転写(II)だけでなく活性化
転写(III) も測定することができることを示しており、
シグナル強度は、通常の転写法を用いるときに得られる
ものと同様である。
で得られたシグナル強度の比較は、本明細書に記載のイ
ンビトロ転写法を用いる基本転写(II)だけでなく活性化
転写(III) も測定することができることを示しており、
シグナル強度は、通常の転写法を用いるときに得られる
ものと同様である。
【０１１１】基本シグナル強度も測定することができる
ということは極めて重要であり、上記転写法は転写イン
ヒビターのスクリーニングにも用いることができる。特
異的ＲＮＡポリメラーゼIIインヒビターα−アマニチン
により、シグナル強度は約８分の１に減少する（比較II
I およびIV）。
ということは極めて重要であり、上記転写法は転写イン
ヒビターのスクリーニングにも用いることができる。特
異的ＲＮＡポリメラーゼIIインヒビターα−アマニチン
により、シグナル強度は約８分の１に減少する（比較II
I およびIV）。
【０１１２】
配列番号：１ 配列の長さ：３１３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：exon 存在位置：１．．３１３０ 配列 TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA 60 AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA 120 CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC 180 GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 240 CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 300 TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 360 AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 420 CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 480 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 540 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 600 AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 660 GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 720 CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 780 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 840 TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 900 TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 960 CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 1020 TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1080 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 1140 TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 1200 CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 1260 CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 1320 TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 1380 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 1440 AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT 1500 ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 1560 TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA 1620 GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 1680 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG 1740 CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT 1800 TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG 1860 CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT 1920 ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 1980 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC 2040 ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA 2100 CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGGGGGACT AGAGTCTCCG 2160 CTCGGAGGAC AGTACTCCGC TCGGAGGACA GTACTCCGCT CGGAGGACAG TACTCCGCTC 2220 GGAGGACAGT ACTCCGCTCG GAGGACAGTA CTCCGACCTG CAGGAATTCG AGCTCGGTAC 2280 CCGCGGGGAT AAAATGTCAC AAAATTCATT TGGATCCTCA CTCTCTTCAT TTAAATATCC 2340 CATACCCTTC CTCCATCTAT ACCACCCTAC TCTCCTTTCC TCATTATTCC TCCTATTATC 2400 TTCTCCTCTT CTCTCCTTCT TCTATATTTC CCAAATCTAT CATCATTCAC TCTCATCCCC 2460 TCTTCCTTCA CTCCCATTCT ATTCTACTCC TTTCCCTTTC CATATCCCCT CCACCCCCCT 2520 TCCTCCCCTC TTTCAATCTT ATCCCCAATC ATAAAATTAT CTCAATTATA TTCTCCTTCC 2580 ATACCCCCTA TCATCCTCAT CCCTATCACC CCCTACTCAC CCAATACTCC CTACTCATCT 2640 CATATATCCT TATCCTCTCC TCACCTCTCC CTCCTCTATC TCCCCCCCTC ACACTCATTT 2700 CTCATTCCAC TCCCAAATAT CCCATACCCT TCCTCCATCT ATACCACCCT ACTCTCCTTT 2760 CCTCATTATT CCTCCTATTA TCTTCTCCTC TTCTCTCCTT CTTCTATATT TCCCAAATCT 2820 ATCATCATTC ACTCTCATCC CCTCTTCCTT CACTCCCATT CTATTCTACT CCTTTCCCTT 2880 TCCATATCCC CTCCACCCCC CTTCCTCCCC TCTTTCAATC TTATCCCCAA TCATAAAATT 2940 ATCTCAATTA TATTCTCCTT CCATACCCCC TATCATCCTC ATCCCTATCA CCCCCTACTC 3000 ACCCAATACT CCCTACTCAT CTCATATATC CTTATCCTCT CCTCACCTCT CCCTCCTCTA 3060 TCTCCCCCCC TCACACTCAT TTCTCATTCC ACTCCCGGGG ATCAGCTTGG CGTAATCATG 3120 GTCATAGCTG 3130
【図１】様々な長さのＧ欠如配列を有する各種の遺伝子
調節要素およびレポータープラスミドを用いた転写反応
の放射性カウントを示した図である。 A) 基本転写： プロモーターを活性化せずに得られる
放射性転写体の量（相対的単位）（基本的にシグナルの
強さ）；B) 活性化転写： Ｇａｌ４−ポリグルタミン
でプロモーターを活性化して得られる放射性転写体の量
（相対的単位）。 I) 用いたレポータープラスミドはｐＭＲＧ５であった
(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meist
erernst, M. (1994) Cell 78, 525-534)。ｐＭＲＧ５の
合成プロモーターはＨＩＶプロモーターのＴＡＴＡボッ
クス、ＭＬプロモーターのイニシエーター、およびｐＵ
Ｃ１９における長さが約４００ヌクレオチドのＧ欠如配
列を含む。II) 用いたレポータープラスミドはｐＶβＭ
Ｌであった。レポータープラスミドｐＶβＭＬの構築は
レポータープラスミドｐＧＳ１００についてと同様であ
るが、８００ヌクレオチドの代わりに長さが４００ヌク
レオチドだけのＧ欠如配列を含む。III) 用いたレポー
タープラスミドはｐＧＳ１００であり、これは約８００
ヌクレオチドのＧ欠如配列を含む。
調節要素およびレポータープラスミドを用いた転写反応
の放射性カウントを示した図である。 A) 基本転写： プロモーターを活性化せずに得られる
放射性転写体の量（相対的単位）（基本的にシグナルの
強さ）；B) 活性化転写： Ｇａｌ４−ポリグルタミン
でプロモーターを活性化して得られる放射性転写体の量
（相対的単位）。 I) 用いたレポータープラスミドはｐＭＲＧ５であった
(Kretschmar, M., Kaiser, K., Lottspeich, F., Meist
erernst, M. (1994) Cell 78, 525-534)。ｐＭＲＧ５の
合成プロモーターはＨＩＶプロモーターのＴＡＴＡボッ
クス、ＭＬプロモーターのイニシエーター、およびｐＵ
Ｃ１９における長さが約４００ヌクレオチドのＧ欠如配
列を含む。II) 用いたレポータープラスミドはｐＶβＭ
Ｌであった。レポータープラスミドｐＶβＭＬの構築は
レポータープラスミドｐＧＳ１００についてと同様であ
るが、８００ヌクレオチドの代わりに長さが４００ヌク
レオチドだけのＧ欠如配列を含む。III) 用いたレポー
タープラスミドはｐＧＳ１００であり、これは約８００
ヌクレオチドのＧ欠如配列を含む。
【図２】万能レポータープラスミドｐＧＳ１００を示し
た図である。
た図である。
【図３】通常の標準的転写法と上記の無細胞のインビト
ロ転写法との効率を比較した図である。 A) 特異的転写体が、フェノール処理、エタノール沈
澱、続いて変性ゲル電気泳動によりタンパク質および過
剰のヌクレオチドを含まない、通常の標準的転写法、B)
タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、過剰のヌク
レオチドを、ＤＥＡＥフィルターに結合している特異的
転写体の洗浄によって除去した、インビトロ転写法。I)
転写に用いられる材料は、転写が可能でありかつP11
カラム（商標名）上で精製したHeLa細胞核からの抽出物
であり、相当するＤＮＡ鋳型を持たない（コントロール
実験）。II) 基本転写： I の反応混合物に相当する
反応混合物をＤＮＡ鋳型としてのレポータープラスミド
ｐＭＲＧ５で処理し、転写反応を行う。基本シグナル強
度はこの方法で測定する。III) 活性化転写： 反応混
合物IIに相当する反応混合物を更に転写活性化因子であ
る、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６の活
性化ドメインからなる融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＶＰ
１６）で処理し、転写を行う。この方法で、活性化シグ
ナル強度が得られる。IV) III の転写反応混合物に相
当する反応混合物をＲＮＡポリメラーゼIIインヒビター
としてのα−アマニチンで処理した（コントロール実
験）。
ロ転写法との効率を比較した図である。 A) 特異的転写体が、フェノール処理、エタノール沈
澱、続いて変性ゲル電気泳動によりタンパク質および過
剰のヌクレオチドを含まない、通常の標準的転写法、B)
タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、過剰のヌク
レオチドを、ＤＥＡＥフィルターに結合している特異的
転写体の洗浄によって除去した、インビトロ転写法。I)
転写に用いられる材料は、転写が可能でありかつP11
カラム（商標名）上で精製したHeLa細胞核からの抽出物
であり、相当するＤＮＡ鋳型を持たない（コントロール
実験）。II) 基本転写： I の反応混合物に相当する
反応混合物をＤＮＡ鋳型としてのレポータープラスミド
ｐＭＲＧ５で処理し、転写反応を行う。基本シグナル強
度はこの方法で測定する。III) 活性化転写： 反応混
合物IIに相当する反応混合物を更に転写活性化因子であ
る、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６の活
性化ドメインからなる融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＶＰ
１６）で処理し、転写を行う。この方法で、活性化シグ
ナル強度が得られる。IV) III の転写反応混合物に相
当する反応混合物をＲＮＡポリメラーゼIIインヒビター
としてのα−アマニチンで処理した（コントロール実
験）。
【図４】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオ
チド配列を示した図である。
チド配列を示した図である。
【図５】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオ
チド配列を示した図である。図４の続きである。
チド配列を示した図である。図４の続きである。
【図６】レポータープラスミドｐＧＳ１００のヌクレオ
チド配列を示した図である。図５の続きである。
チド配列を示した図である。図５の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アービン、ビンクラー ドイツ連邦共和国リーダーバッハ、イン、 デン、アイヘン、40 (72)発明者 ミヒャエル、マイスターエルンスト ドイツ連邦共和国アイヘナウ、ヤーンシュ トラーセ、11
Claims (48)
- 【請求項１】少なくとも１個の遺伝子調節要素によって
制御されている転写されるＤＮＡ配列を含んでなるＤＮ
Ａ鋳型の無細胞下でのインビトロ転写法であって、 a) 好ましくは、転写因子および／または補因子によっ
て補足することができ、または転写因子および／または
補因子によって部分的にまたは完全に置換することがで
きる細胞核由来の濃縮し、好ましくは、精製した抽出物
と、少なくとも１種類の標識ヌクレオチドとを転写に用
い、 b) 好ましくは、転写の後に反応混合物中のタンパク質
を単離しおよび／または分解し、 c) 標識された転写体を固体マトリックスに結合させ、 d) 過剰の標識ヌクレオチドを除き、 e) 標識された転写体を定量することを含んでなる、方
法。 - 【請求項２】転写されるＤＮＡ配列がグアニン、シトシ
ンまたはチミンからなる群から選択される少なくとも１
種類の核塩基を欠いている（Ｇ欠如配列、Ｃ欠如配列、
またはＴ欠如配列）、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】Ｇ欠如配列、Ｃ欠如配列、またはＴ欠如配
列の長さが４００ヌクレオチド以上である、請求項１ま
たは２に記載の方法。 - 【請求項４】Ｇ欠如配列、Ｃ欠如配列、またはＴ欠如配
列の長さが約８００ヌクレオチドである、請求項１〜３
のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】遺伝子調節要素がプロモーターを含んでな
る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】プロモーターが「ＴＡＴＡ」ボックスおよ
び／またはイニシエーター領域を含んでなる、請求項１
〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】遺伝子調節要素がエンハンサーを含んでな
る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】遺伝子調節要素がサイレンサーを含んでな
る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】遺伝子調節要素がモデルプロモーターであ
る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】モデルプロモーターが「ＴＡＴＡ」ボッ
クス、イニシエーター領域、および追加のタンパク質結
合ＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一
項に記載の方法。 - 【請求項１１】モデルプロモーターがヒトＴ細胞レセプ
ターＶβ８．１の「ＴＡＴＡ」ボックス、ＭＬプロモー
ター（アデノウイルスの主要な後期プロモーター）のイ
ニシエーター（ＩＮＲ）領域および酵素Ｇａｌ４タンパ
ク質の５結合部位、および「ＴＡＴＡ」ボックスとＧａ
ｌ４結合部位との間に制限エンドヌクレアーゼの少なく
とも１個の特異的開裂部位を含んでなる、請求項１〜１
０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】モデルプロモーターの一部または総て
を、検討される少なくとも１個の遺伝子調節要素で置換
し、および／またはモデルプロモーターを検討される少
なくとも１個の遺伝子調節要素によって補足する、請求
項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】遺伝子調節要素および／または検討され
る遺伝子調節要素が、接着分子、成長因子、ホスホジエ
ステラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＡＴＰアー
ゼ、膜レセプター、セカンドメッセンジャーレセプタ
ー、ホルモンレセプター、ステロイドレセプター、メタ
ロプロテアーゼ、ＮＯ−シンタ−ゼ、５−リポキシゲナ
ーゼ、サイトカイン、インターロイキン、Ｔ細胞レセプ
ター、Ｂ細胞レセプター、核レセプター、ウイルスおよ
びレトロウイルス遺伝子の遺伝子調節要素、または上記
遺伝子の遺伝子調節要素の部分からなる群から選択され
る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】ＤＮＡ鋳型が万能レポータープラスミド
である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】ＤＮＡ鋳型が図２に示される万能レポー
タープラスミドｐＧＳ１００である、請求項１４に記載
の方法。 - 【請求項１６】万能レポータープラスミドが配列番号：
１の配列を有する、請求項１４または１５に記載の方
法。 - 【請求項１７】万能レポータープラスミドが受託番号Ｄ
ＳＭ第１１４５０号として寄託されている、請求項１４
または１５に記載の方法。 - 【請求項１８】細胞核由来の濃縮抽出物（濃縮核抽出
物）を少なくとも１回のクロマトグラフィ段階によって
精製する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項１９】濃縮核抽出物をホスホセルロース、ＤＥ
ＡＥ−セルロース、またはヘパリン−セファロースから
なる群から選択される核タンパク質結合材料上で精製す
る、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２０】濃縮核抽出物をＰ１１カラム（商標名）
上で精製する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項２１】濃縮抽出物に少なくとも１個の一般的お
よび／または１個の特異的転写因子を補足する、請求項
１〜２０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２２】濃縮核抽出物に、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩ
Ｂ、ＴＦＩＩＤまたはＴＢＰ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩ
Ｆ、ＴＦＩＩＨおよびＴＦＩＩからなる群から選択され
る少なくとも１個の一般的転写因子を補足する、請求項
１〜２１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２３】濃縮核抽出物に、原癌遺伝子、ホルモン
レセプター、腫瘍抑制因子、ウイルス病原体、ＳＴＡＴ
タンパク質、セカンドメッセンジャー形質導入カスケー
ドに関与するタンパク質、核レセプター、遺伝子特異的
転写因子、細胞型特異的転写因子、組織特異的転写因
子、分化依存発現転写因子、発生特異的発現および細胞
サイクル特異的発現転写因子からなる群、および上記転
写因子の部分であって、適当ならば、これらの部分を融
合タンパク質として用いることが可能であるものからな
る群から選択される少なくとも１種類の特異的転写因子
を補足する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項２４】濃縮核抽出物に、一般的補因子、特異的
補因子、正の補因子、負の補因子、ＴＡＦおよびメディ
エイターの群から選択される少なくとも１個の補因子を
補足する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項２５】転写反応混合物中のタンパク質を転写の
後に化学的および／または機械的および／または酵素的
工程段階によって取り出し、および／または分解させ
る、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２６】工程段階がプロテアーゼ消化である、請
求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】プロテイナーゼＫをプロテアーゼ消化に
用いる、請求項２５または２６に記載の方法。 - 【請求項２８】標識した転写体を帯電した固形マトリッ
クスに結合させる、請求項１〜２７のいずれか一項に記
載の方法。 - 【請求項２９】マトリックスがＤＥＡＥ−セルロース膜
である、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】少なくとも１個のヌクレオチドを放射能
標識する、１〜２９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３１】工程段階a)〜e)の総てまたは少なくとも
幾つかを自動装置によって行う、請求項１〜３０のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項３２】自動装置が Biomek 2000（商標名）であ
る、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】転写を、試験する活性物質の存在下にて
行う、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３４】試験する活性物質が転写を阻害する、請
求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】試験する活性物質が転写を活性化する、
請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３６】a) 少なくとも２つの転写を同一条件下
で平行して行い、但し b) 転写反応混合物が、試験される活性物質および／ま
たは少なくとも１個の転写因子および／または少なくと
も少なくとも１個の補因子および／または濃縮核抽出物
の様々な量を含んでなることだけが異なり、 c) 標識した転写体の生成量を、転写の後にそれぞれの
反応混合物について定量し、 d) 試験される活性物質、転写因子、補因子および／ま
たは濃縮核抽出物の遺伝子調節要素に対する活性および
／または特異性を、標識した転写体の生成量の差から定
量する、 請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項３７】細胞核からの抽出物を濃縮し、それ以上
精製しない、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項３８】転写されるＤＮＡ配列を含んでなり、少
なくとも１個の遺伝子調節要素によって制御されてお
り、転写されるＤＮＡ配列がグアニン、シトシンまたは
チミンからなる系から選択される少なくとも１個の核塩
基を欠き、転写されるＧ欠如配列、Ｃ欠如配列またはＴ
欠如配列の長さが４００ヌクレオチドを上回る、請求項
１に記載のＤＮＡ鋳型。 - 【請求項３９】転写されるＧ欠如配列、Ｃ欠如配列また
はＴ欠如配列の長さが約８００ヌクレオチドである、請
求項３８に記載のＤＮＡ鋳型。 - 【請求項４０】遺伝子調節要素が、プロモーターと、好
ましくは、エンハンサーおよび／またはサイレンサーと
を含んでなる、請求項３８または３９に記載のＤＮＡ鋳
型。 - 【請求項４１】ＤＮＡ鋳型が、図２に示されるレポータ
ープラスミドｐＧＳ１００である、請求項３８〜４０の
いずれか一項に記載のＤＮＡ鋳型。 - 【請求項４２】万能レポータープラスミドが配列番号：
１の配列を有する、３８〜４１のいずれか一項に記載の
ＤＮＡ鋳型。 - 【請求項４３】万能レポータープラスミドがＤＳＭ第１
１４５０号として寄託されている、請求項３８〜４１の
いずれか一項に記載のＤＮＡ鋳型。 - 【請求項４４】転写の方法において請求項３８〜４３の
いずれか一項に記載のＤＮＡ鋳型の使用。 - 【請求項４５】転写の方法が請求項１〜３７のいずれか
一項に記載の方法である、請求項４４に記載のＤＮＡ鋳
型の使用。 - 【請求項４６】特異的薬理活性物質の同定を目的とす
る、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法の使
用。 - 【請求項４７】薬理活性物質が、定められた条件下で遺
伝子調節要素によって制御されているＤＮＡ配列の転写
を阻害する、薬理活性物質の同定および特性決定のため
の請求項４６に記載の方法の使用。 - 【請求項４８】薬理活性物質が、定められた条件下で遺
伝子調節要素によって制御されているＤＮＡ配列の転写
を活性化する、薬理活性物質の同定および特性決定のた
めの請求項４６に記載の方法の使用。
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