ES2251746T3 - Diferenciacion condrogenica mejorada de celulas precursoras mesenquimatosas humanas. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION DE COMPONENTES QUIMICAMENTE DEFINIDOS QUE TIENEN ALTOS NIVELES DE AZUCARES SIMPLES QUE SOPORTAN LA CONDROGENESIS IN VITRO DE LAS CELULAS PROGENITORAS DE LA MESENQUIMA, UN PROCEDIMIENTO PARA LA INDUCCION CONDROGENICA IN VITRO DE DICHAS CELULAS PROGENITORAS Y UN PROCEDIMIENTO DE FORMACION DE CONDROCITOS HUMANOS IN VITRO A PARTIR DE DICHAS CELULAS PROGENITORAS.

Description

Diferenciación condrogénica mejorada de células precursoras mesenquimatosas humanas.

La presente invención se refiere al campo de los métodos y composiciones para dirigir las células progenitoras mesenquimatosas cultivas in vitro con el fin de que se diferencien en vías de linaje celular específicas, y particularmente a la inducción de linaje dirigido antes de, o en el momento de, su implante en un receptor o huésped para el tratamiento terapéutico de condiciones patológicas en humanos y otras especies.

Las células precursoras mesenquimatosas (MSCs) son el blasto formativo pluripotente o células tipo embriónico encontradas en la médula ósea, en la sangre, la dermis, y el periostio, que son capaces de diferenciarse en tipos específicos de tejidos mesenquimatosos o conectivos que incluyen los tejidos conectivos adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y fibroso. La vía de diferenciación específica en la que entran estas células depende de varias influencias entre influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas, y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huésped. Aunque estas células están normalmente presentes a frecuencias muy bajas en la médula ósea, un proceso para aislar, purificar y expandir mitósicamente las poblaciones de estas células en cultivo de tejido es mencionado en Caplan et al. Patentes U.S. números 5.197.985; 5.226.914; y 5.486.359. Mesenchymal stem cells. J. Orthoped. Res. 9: 641-650, 1991.

En los organismos prenatales, la diferenciación de las MSCs en células de tejido conectivo especializadas está bien establecida; por ejemplo las células mesenquimatosas de yema de miembro de pollito, ratón o humanas embrionarias se diferencian en el cartílago, hueso y otros tejidos conectivos (Caplan Al, Mesenchymal stem cells, J. Orthoped. Res. 9: 641-650, 1991. In 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, d. by S. Subtelney and U Abbott, pp 3768. New York, Alan R Liss Inc, 1981; Elmer et al., Teratology, 24:215-223, 1981; Hauschka SD, Dev Biol, 37:345-368, 1974; Solursh et al., Dev Biol, 83:9-19, 1981; Swalla et al, Dev Biol, 116:31-38, 1986). Además, una línea celular de bóveda craneal de feto de rata clonal ha mostrado también diferenciarse en músculo, grasa, cartílago, y hueso (Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269:274-283, 1991). La existencia de MSCs en organismos postnatales no ha sido ampliamente estudiada con el objetivo de mostrar la diferenciación de células postembrionarias en varios fenotipos mesodermatosos. Los pocos estudios que se han realizado implican la formación de hueso y cartílago por células de médula ósea después de su encierro en cámaras de difusión y en el trasplante in vivo (Ashton et al., Clin Orthop Rel Res, 151:294-307,(1980; Bruder et al., Bone Mineral, 11:141-151, 1990)). Recientemente, células de periostio del pollito han sido aisladas, expandidas en cultivo y, bajo condiciones de alta densidad in vitro, han demostrado diferenciarse en cartílago y hueso (Nakahara et al., Exp Cell Res, 195:492-503, 1991). Células mesequimatosas derivadas de la médula ósea de rata han demostrado tener la capacidad de diferenciarse en osteoblastos y condrocitos cuando se implantaron in vivo (Dennis et al., Cell Transpl, 1:2332, 1991; Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269: 274-283, 1991). Se ha informado de que los fenotipos de condrocitos en cultivo se ven influidos por las concentraciones de azúcares disponibles para la glicólisis y para el ciclo del ácido cítrico (P. Otte. "Basic cell metabolism of articular cartilage. Manometric studies." Z. Rheumatol 50:304-12, 1991; and J. M. Lane, C.T. Brighton, and B.J. Menkowitz. "Anaerobic and aerobic metabolism in articular cartilage." J Rheumatol. 4:334-42, 1977).

Recientemente, Johnstone et al. (Trans. Orthop. Res. Soc., 42:65, 1996) in vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal cells. Transactions of the Orthopaedic Research Society 21: 65;1996., han descrito las condiciones de cultivo bajo las cuales las MSCs de conejo desarrollarán un fenotipo parecido al condrocito in vitro. Las células se crían en condiciones de cultivo mínimas en ausencia de suero pero en presencia de dexametasona, ITS, y fosfato-ácido ascórbico. Cuando fueron hiladas las células a baja velocidad, formaron una capa que se desarrolla en una pella libremente flotante al cabo de 1-2 días. Durante un periodo de semanas, las células empezarán a sintetizar y segregar colágeno tipo II, las observaciones originales usando células humanas.

Se puede producir daño en las superficies articulares de las articulaciones sinoviales por trauma, por enfermedades tales como osteortritis, y como resultado del proceso de envejecimiento. Los costes sociales y económicos de las articulaciones dañadas son grandes, y serían bien venidas terapias efectivas que recuperaran la función articular venidas. El cartílago articular es creado y mantenido durante el crecimiento prenatal y postnatal por células mesenquimatosas que se han diferenciado en condrocitos articulares. Los individuos pueden perder su habilidad para reparar defectos sinoviales importantes cuando maduran porque a sus articulaciones les falta un número suficiente de células correctamente diferenciadas para regenerar el cartílago articular. Por tanto, ha surgido mucho interés en la hipótesis de que las superficies articulares dañadas pueden repararse implantando células autólogas que reconstituirán una matriz extracelular apropiada. Un estudio que implica la introducción de condrocitos cultivados en la rodilla pareció ser muy prometedor^{1}. Como apuntó el cirujano Joseph Buckwalter en un ensayo reciente, éste y esfuerzos similares han encontrado un éxito dudoso a largo plazo. (J.A. Buckwalter. "Regenerating articular cartilage: Why the sudden interest?" Orthopedics Today. Abril 12, 1996).

Por tanto, sigue existiendo una necesidad y oportunidad continuas de terapias de regeneración del cartílago.

WO 96/23059 describe Medio de Eagle Bajo en Glucosa, Modificado de Dulbecco para cultivar células precursoras mesenquimatosas humanas.

Sumario de la invención

Hasta la fecha, no ha sido posible hacer que grandes números de hMSCs se comprometan uniformemente con el linaje condrocítico. La composición usada en el proceso conforme a la reivindicación 1 ó 12 alcanza esta meta. Por tanto, esta invención representa un avance importante en el desarrollo de una tecnología de reparación del cartílago articular basada en MSC autólogas, que tiene una utilidad potencial muy amplia y significativa.

De acuerdo con la presente invención, los inventores han observado que las células precursoras mesenquimatosas humanas (hMSCs) mantienen su viabilidad y pueden ser inducidas a un compromiso y diferenciación notablemente mejorados cuando se ponen en contacto in vitro con ciertas composiciones de medios condroinductivos que tienen niveles elevados de azúcares simples u otros factores que contribuyan a la producción de ATP por el ciclo de ácido cítrico como se especifica en la reivindicación 1 ó 12. Las hMSCs están asociadas en un formato tridimensional, tal como una pella de células, en el proceso según la reivindicación 1 ó 12. El formato tridimensional contribuye a la condrogénesis in vitro de la invención. Y las células se condensan preferiblemente entre sí, por ejemplo, como una masa de células concentradas o peletizadas. Este proceso in vitro recapitula, según se cree, lo que ocurre in vivo y puede usarse para definir los acontecimientos moleculares que son importantes en el proceso de la condrogénesis.

Por tanto, la invención proporciona en un aspecto un proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 12, usando una composición para la condrogénesis in vitro de células precursoras mesenquimatosas humanas y la formación in vitro de condrocitos humanos a partir de ella, cuya composición comprende células precursoras mesenquimatosas humanas aisladas (en un formato tridimensional) y al menos un agente condroinductivo en un medio que tiene una concentración de azúcar simple de al menos aproximadamente 3 gramos/litro (g/l), preferiblemente de aproximadamente 3 g/l a 7 g/l en contacto con el mismo. Las células precursoras mesenquimatosas son preferiblemente células precursoras mesenquimatosas humanas, expandidas en cultivo y aisladas, en un entorno exento de suero químicamente definido y pueden condensarse en íntima proximidad, tal como bajo la forma de una masa de células tridimensional, por ejemplo, células concentradas o una pella de células centrífuga.

En otro aspecto de la invención se ha descubierto que el TGF-\beta3 es un agente condroinductivo más eficaz que los usados anteriormente tales como (i) un glucocorticoide tal como dexametasona; (ii) otros miembros de la superfamilia de factor de crecimiento transformante \beta tal como proteína morfogénica del hueso (preferiblemente BMP-2 o BMP-4), TGF-\beta1, inhibina A o factor de actividad estimulante condrogénico; (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa tal como colágeno I; o (iv) un análogo de vitamina A tal como ácido retinoico. El TGF-\beta3 se incluye en el medio en una cantidad eficaz para inducir la diferenciación de MSCs predominantemente en condrocitos. Tal concentración es de por lo menos aproximadamente 5 ng/ml de medio, preferiblemente 5-15 ng/ml de medio.

La invención proporciona también un proceso para producir condrocitos a partir de células precursoras mesenquimatosas poniendo en contacto las células precursoras mesenquimatosas con un agente condroinductivo in vitro en el medio mejorado anteriormente descrito como se especifica en la reivindicación 1, particularmente uno que tenga una concentración de glucosa o de lactosa mayor que la usada anteriormente para inducir la diferenciación condrogénica.

La invención proporciona también un proceso para inducir condrogénesis en las células precursoras mesenquimatosas por contacto de las células precursoras mesenquimatosas con la composición de la invención in vitro como se especifica en la reivindicación 12.

También se describe aquí condiciones de cultivo in vitro que permiten y fomentan la diferenciación y maduración ulteriores de condrocitos derivados de hMSC en condrocitos hipertróficos. Esto resulta útil, entre otros, para (i) estudios de factores implicados en la maduración de los condrocitos, (ii) estudios de alteraciones en la expresión de genes que ocurren durante la condrogénesis, (iii) identificación y estudios de factores producidos por la maduración de los condrocitos, (iv) evaluación de los efectos de los agentes farmacológicos en la maduración de los condrocitos, (v) determinación de la susceptibilidad de la maduración de los condrocitos a las metaloproteinasas de la matriz y otros enzimas de degradación comunes en enfermedades articulares tales como la osteoartritis y (vi) estudios de la expresión de genes introducidos en hMSCs con el propósito de mejorar la enfermedad de las articulaciones.

La habilidad de las hMSCs para sufrir diferenciación hipertrófica tiene relevancia directa para la reparación de defectos de espesor pleno del cartílago articular por hMSCs implantadas. El implante "se ancla" mejor al tejido adyacente, y su reparación resulta más permanente cuando cartílago hipertrófico, cartílago mineralizado y hueso reemplazan al material implantado en las áreas profundas del defecto. Los resultados in vitro aquí presentados constituyen una indicación importante de que tal sustitución es una opción clínica viable. Por tanto, parte de este aspecto de la invención ha sido modular el proceso de diferenciación condrogénica por identificación de las condiciones que fomentan un fenotipo específico, es decir, dirigir las células para que se conviertan en condrocitos hipertróficos, ya que ese fenotipo es pronunciado, e indica la maduración de las células más allá de la etapa del condroblasto.

En los métodos arriba indicados, las células precursoras mesenquimatosas son preferiblemente células precursoras mesenquimatosas humanas, expandidas en cultivo y aisladas en un entorno exento de suero químicamente definido y se condensan en íntima proximidad, de manera que formen una masa de células tridimensional, por ejemplo, células concentradas o una pella de células centrífuga. Además, la puesta en contacto comprende preferiblemente el cultivo de una pella de células precursoras mesenquimatosas humanas en un medio exento de suero químicamente definido como se expone en la reivindicación 1 ó 12. Los métodos arriba indicados pueden comprender también, preferiblemente, pasos en los que las células son cultivadas con la composición condroinductiva y posteriormente colocadas en una vasija porosa rígida, tal como un cubo de cerámica.

También es posible usar una preparación de células precursoras mesenquimatosas humanas no homogéneas ni cultivadas, aislada en la composición y métodos de la invención. Las MSCs pueden aislarse como preparaciones no homogéneas ni cultivadas, tal como por fraccionación de gradiente de densidad, a partir de tejido tal como médula ósea, sangre (incluida la sangre periférica) periostio y dermis, y otros tejidos de origen mesodérmico. A este respecto, se ha observado que estas células precursoras mesenquimatosas están normalmente presentes en la médula ósea, por ejemplo, en cantidades muy pequeñas y que estas cantidades disminuyen considerablemente con la edad (por ejemplo desde aproximadamente 1/10.000 células en un paciente relativamente joven hasta una cantidad tan pequeña como 1/2000000 en un paciente de edad), se puede aislar preparaciones de células precursoras mesenquimatosas humanas a partir de tejido, particularmente médula ósea, de manera que estén prácticamente exentas de otros tipos de células de la médula. Está contemplado que la preparación de fraccionación aislada comprenderá células de las que al menos un 90% aproximadamente, y con preferencia al menos aproximadamente un 95%, son células precursoras mesenquimatosas humanas.

También se describe condiciones de cultivo in vitro que permiten y promueven la diferenciación y maduración ulteriores de condrocitos derivados de hMSC en condrocitos hipertróficos. Esto resulta útil en estudios de los factores implicados en la maduración de los condrocitos, estudios de alteraciones en la expresión de genes que ocurren durante la condrogénesis, identificación y estudio de factores producidos por la maduración de los condrocitos, evaluación de los efectos de los agentes farmacológicos en la maduración de los condrocitos, determinación de la susceptibilidad de los condrocitos en curso de maduración a metaloproteinasas de matriz y otros enzimas degradadores comunes en las enfermedades de las articulaciones tales como la osteoartritis, estudios de la expresión de genes introducidos en hMSCs para mejorar la enfermedad de las articulaciones.

La secuencia de acontecimientos que ocurren en la inducción de condrogénesis y producción de condrocitos en los métodos in vitro anteriormente expuestos se parece a la de la condrogénesis en la formación del miembro embrionario. Dado que todos los componentes del sistema están definidos, se puede usar el sistema como una valiosa herramienta de investigación para estudios de los efectos de factores del crecimiento, etc, en la progresión de la condrogenesis. Es también aplicable a estudios del control molecular de la condrogénesis mamífera a partir de células progeni-
toras.

Breve descripción de los dibujos

Se va a describir ahora adicionalmente la invención con referencia a una breve descripción de cada una de las figuras, que no son en modo alguno limitativas del ámbito de la invención.

Figura 1. Cambios en el tamaño de las pellas de hMSC reflejan l importancia de la síntesis de los componentes de matriz extracelular. Cada pella fue formada por transferencia de una alicuota de 200.000 células en ½ ml de medio condrogénico con 1 g/l (5,5 mM) de glucosa (izquierda) o 4,5 g/l (25 mM) de glucosa (derecha).

Figura 2A. Secciones de 8 \mum de pellas de hMSC criadas en medio condrogénico con 1 g/l de glucosa después de una semana de cultivo. Se inmunotiñeron secciones para determinar la presencia de colágeno tipo II y se desarrollaron, pero no revelaron el producto de reacción marrón, visto en la pella criada con alto contenido de glucosa como se muestra en la figura 2B. Se tiñeron también secciones con hematoxilina. Aumento, 125x.

Figura 2B. Secciones de 8 \mum de pellas de hMSC criadas en medio condrogénico con 4,5 g/l de glucosa después de una semana de cultivo. Se inmunotiñeron secciones para determinar la presencia de colágeno tipo II y se desarrollaron, para revelar un producto de reacción marrón, visto únicamente en la pella cultivada con alto contenido de glucosa. Se tiñeron también secciones con hematoxilina. Aumento, 125x.

Figura 3A. Secciones finas de pellas de hMSC criadas en medio bajo en glucosa durante dos semanas. La inmunotinción muestra que la pella en las condiciones de bajo contenido de glucosa había acumulado menos colágeno tipo II que la pella en las condiciones de alto contenido de glucosa mostrada en la figura 3B. Aumento, 125x.

Figura 3B. Secciones finas de pellas de hMSC criadas en medio alto en glucosa durante dos semanas. La inmunotinción muestra que la pella en las condiciones de alto contenido de glucosa había acumulado más colágeno tipo II que la pella en las condiciones de bajo contenido de glucosa mostrada en la figura 3A. Aumento, 125x.

Figura 4A. Secciones finas de pellas de hMSC teñidas con azul de toluidina O después de tres semanas de crecimiento. La tinción "metacromática" púrpura característica de una matriz extracelular cartilaginosa es menos prominente que en la pella con alto contenido de glucosa mostrada en la figura 4A. Aumento, 125x.

Figura 4B. Secciones finas de pellas de hMSC teñidas con azul de toluidina O después de tres semanas de crecimiento. La tinción "metacromática" púrpura característica de una matriz extracelular cartilaginosa es más prominente en la pella con bajo contenido de glucosa (B) que en la pella con bajo contenido de glucosa mostrada en la figura 4A. Aumento, 125x.

Figura 5A. Tinción de viabilidad de pellas hMSC de 21 días. Pellas cultivadas fueron incubadas con 2 \muM de tinte homodímero de etidio durante 72 horas, y después fueron fijadas, seccionadas, y post-teñidas con un segundo tinte, DAPI. Los núcleos de células no viables incorporan homodímero de etidio y por tanto fluorescen de rojo. Las células viables fluorescen de azul con DAPI incorporado después de su fijación y seccionamiento. La muerte celular es un rasgo prominente de las pellas bajas en glucosa, como puede verse aquí. Aumento, 125x.

Figura 5B. Tinción de viabilidad de pellas hMSC de 21 días. Pellas cultivadas fueron incubadas con 2 \muM de tinte homodímero de etidio durante 72 horas, y después fueron fijadas, seccionadas, y post-teñidas con un segundo tinte, DAPI. Los núcleos de células no viables incorporan homodímero de etidio y por tanto fluorescen de rojo. Las células viables fluorescen de azul con DAPI incorporado después de su fijación y seccionamiento. La muerte celular es un rasgo prominente de las pellas bajas en glucosa, y se reduce notablemente por el cultivo en condiciones de alto contenido de glucosa, en comparación con la figura 5A. Aumento, 125x.

La figura 6 muestra pellas de hMSCs, preparadas como se ha descrito en el ejemplo 4, en cultivo condrogénico que contenía regiones de células con una morfología hipertrófica. Por tanto, las hMSCs pueden experimentar hipertrofia bajo condiciones de cultivo para diferenciación condrogénica. Como se muestra, una pella de hMSC experimentó diferenciación condrogénica incompleta después de 21 días de cultivo. DMEM alto en glucosa fue enriquecido con TGF-\beta3, dexametaxona, y otros agentes, como se ha descrito. La sección fue inmunoteñida para colágeno tipo II. La mancha marrón incompleta indicó que solamente parte de la pella contenía células que segregaban este marcador del cartílago. Sin embargo, esta región positiva de colágeno tipo II contenía células dentro de grandes lagunas. Tal morfología sugirió que las hMSCs en cultivo en pella son capaces de experimentar diferenciación hipertrófica. Aumento final, 150x.

Las figuras 7A y 7B muestran también pellas de células, preparadas como se describe en el ejemplo 5, que mostraron una hipertroficidad mucho mayor que las de la figura 6. Estas figuras muestran que el tratamiento secuencial de las hMSCs en cultivo en pella con dos medios induce hipertrofia. Después de 14 días de cultivo en medio condrogénico, la pella de la figura 7A fue cambiada a un medio al que le faltada TGF-\beta3, y que contenía 10^{-9} M de dexametasona, 50 nM de tiroxina, y 20 mM de fosfato de \beta-glicerol. La pella de la figura 7B permaneció en el medio original. A los 28 días, ambas pellas fueron recolectadas, seccionadas y teñidas con anticuerpo contra colágeno tipo II. El colágeno tipo II es prominente en ambas pellas. El número extensivo de células dentro de lagunas agrandadas en la pella de la figura 7A indicó que la diferenciación hipertrófica de hMSCs era la vía predominante en este régimen de cultivo en dos etapas. En contraste, la pella de la figura 7B tenía relativamente pocos condrocitos hipertróficos. Aumento final, 60x.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Se va a describir ahora la invención con más detalle en lo que respecta a numerosas realizaciones y ejemplos en apoyo de la misma.

Las células precursoras mesenquimatosas (MSCs) son el blasto formativo pluripotente o células tipo embriónico encontradas en la médula ósea, en la sangre, la dermis, y el periostio que son capaces de diferenciarse en tipos específicos de tejidos mesenquimatosos o conectivos que incluyen los tejidos conectivos adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y fibroso. La vía de diferenciación específica en las que entran estas células depende de varias influencias de entre influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas, y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huésped. Aunque estas células están normalmente presentes a frecuencias muy bajas en la médula ósea, un proceso para aislar, purificar y expandir mitósicamente la población de estas células en cultivo de tejido es mencionado en Caplan et al. Patentes U.S. números 5.197.985; 5.226.914; y 5.486.359. Mesenchymal stem cells. J. Orthoped. Res. 9: 641-650, 1991.

Las células precursoras mesenquimatosas humanas son capaces de producir múltiples tipos de células mesenquimatosas, y en particular cartílago. Este rasgo, junto con otros dos, hace a estas células atractivos candidatos para usar en la terapia celular autóloga para la reparación de superficies articulares. En primer lugar, estas MSCs humanas pueden obtenerse con relativa facilidad a partir de aspirados de médula ósea. En segundo lugar, estas células tienen una habilidad demostrada para experimentar una expansión de muchas veces mil en cultivo. (S.P. Bruder, N. Jaiswal, and S.E. Haynesworth. "Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subultivation and following cryopreservation". Journal of Cellular Biochemistry, 1996, en prensa).

Se describe aquí una mejora con respecto a los métodos corrientes usados para inducir la diferenciación condrogénica de células precursoras mesenquimatosas humanas, primarias y pasadas (hMSCs) in vitro. Esta mejora se realiza en el protocolo de tejido en "cultivo en pella" que fue desarrollado para promover la rediferenciación de condrocitos cultivados (Y. Kato, M. Iwamoto, T. Koike, F. Suzuki, and Y. Takano. "Terminal differentiation and calcification in rabbit chondrocyte cultures grown in centrifuge tubos: regulation by transforming growth factor beta and serum factors" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9552-56, 1988; R.T Ballock and A.H. Reddi. "Thyroxine is the serum factor that regulates morphogenesis of columnar cartilage from isolated chondrocytes in chemically defined médium." J. Cell Biol. 126:1311-18, 1994; and C. Xu, B.O. Oyajobi, A. Frazer, L.D. Kozaci, R.G.G. Russell, y A.P. Hollander, "Effects of growth factors and interleukin-1\alpha on proteoglycan and type II collagen turnover in bovine nasal and articular chondrocyte pellet cultures." Endocrinology 137:3357-65, 1996). Describimos también un ensayo para valorar la viabilidad de las células que prueba la utilidad de nuestro método de cultivo. Estas mejoras aportan nuevos descubrimientos relativos a la diferenciación de las hMSCs, incluida la identificación de genes relacionados con nuevas modalidades terapéuticas.

En los experimentos aquí expuestos, ponemos de manifiesto que el incremento de la concentración de glucosa del medio condrogénico desde la concentración estándar presente en "DMEM bajo en glucosa" (1 g/l, 5 mM) a la cantidad presente en "DMEM alto en glucosa" (4,5 g/l, 25 mM), altera considerblemente la diferenciación de hMSCs cultivadas. Se investigó también el efecto de altas concentraciones de otros azúcares en la condrogénesis. El enriquecimiento de medio bajo en glucosa con 3,5 g/l de fructosa o con 6 g/l de glucosa da la misma mejora a la diferenciación condrogénica in vitro que el medio alto en glucosa (4,5 g/l de glucosa).

Esta invención tiene múltiples usos y ventajas. Una de tales ventajas reside en la habilidad para dirigir y acelerar la diferenciación de MSC antes de su nuevo implante en huéspedes autólogos. Por ejemplo, MSCs que son dirigidas in vitro para hacerse células condrogénicas sintetizarán matriz de cartílago en un sitio de implante más rápida y uniformemente que las MSCs que deben ser reclutadas primeramente en el linaje y después progresar a través de los pasos de diferenciación clave. Tal tratamiento ex vivo proporciona también la aplicación uniforme y controlada de factores bioactivos a las MSCs purificadas, conduciendo al compromiso y diferenciación de linaje uniformes. La disponibilidad in vivo de factores bioactivos endógenos no puede asegurarse o controlarse tan fácilmente. Un paso de tratamiento tal como se describe aquí evita esto. Además, pretratando las MSCs antes del implante, se evita efectos secundarios potencialmente dañinos asociados con la administración sistémica o local de factores bioactivos exógenos. Otro uso de esta técnica reside en la habilidad para dirigir regeneración del tejido basada en la etapa de diferenciación en la que se encuentran las células en el momento del implante. Es decir,con respecto al cartílago, el estado de las células en el implante puede controlar el tipo de tejido final formado.

Según se usa aquí, el término "azúcar simple" se refiere a aldosas tales como D-glucosa, D-manosa y D-galactosa y cetosas tales como D-fructosa.

Según se usa aquí, los términos "agente condroinductivo" o "factor condroinductivo" se refieren a cualquier compuesto químico o bioquímico natural o sintético, orgánico o inorgánico combinación o mezcla de compuestos, o cualquier otro dispositivo mecánico o físico, contenedor, influencia o fuerza que se pueda aplicar a las células precursoras mesenquimatosas humanas que están en un formato tridimensional con el fin de efectuar su inducción condrogénica in vitro o la producción de condrocitos. Los agentes condroinductivos conocidos son, por ejemplo, (i) un glucocorticoide tal como dexametasona, (ii) un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta tal como una proteína morfogénica del hueso (preferiblemente BMP-2 o BMP-4), TGF-\beta1, inhibina A o un factor de actividad estimuladora condrogénica CSA; (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa tal como colágeno I (particularmente en forma de gel); y (iv) un análogo de vitamina A tal como ácido retinoico.

Según se usa aquí, el término (medio químicamente definido) se refiere a un medio de mantenimiento, crecimiento o cultivo en el que la composición de la invención puede sufrir condrogénisis in vitro, particularmente de acuerdo con los métodos de la invención, e incluye medio esencial mínimo, ascorbato, una fuente de hierro, insulina o un factor de crecimiento parecido a la insulina, al menos un agente o factor condroinductivo, y un azúcar simple, estando presente dicho azúcar simple en dicho medio en una cantidad de 3 g/l a 7 g/l.

Según se usa aquí, el término "medio esencial mínimo" se refiere a cualquier preparación o medio de cultivo de células animales sin suero de composición conocida que soporte la viabilidad de células precursoras mesenquimatosas humanas in vitro. Constituyen ejemplos cualquier de los medios basados en Eagle, es decir medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM); Medio de Eagle Modificado por Iscove, Medio de Eagle alfa-Modificado, y también McCoy 5a y BGJ_{b} (Modificación Fitton-Jackson).

Según se usa aquí, el término fuente de hierro se refiere a cualquier especie que libere la forma ferrosa reducida de hierro en el medio, incluyendo la transferrina, FeSO_{4} o ferritina aunque sin limitarse a ellas.

Según se usa aquí, el término "insulina" se refiere a cualquiera de las diversas insulinas conocidas. Las insulinas se dividen en tres categorías de acuerdo con la prontitud, duración e intensidad de la acción después de la administración subcutánea, es decir, como se ha mencionado anteriormente, acción rápida, intermedia o larga. Se prepara insulina regular cristalina por precipitación en presencia de cloruro de cinc y se han desarrollado formas modificadas para alterar el patrón de actividad. La insulina de protamina de cinc (PZI) es el resultado de la reacción de la insulina y el cinc con la proteína básica, protamina, para formar un complejo proteico que se disuelve y es absorbido más lentamente que la insulina regular cristalina, pero es altamente fiable para absorción a una cadencia constante. El isofano es una insulina de protamina de cinc cristalina, modificada cuyos efectos son comparables a una mezcla de insulina predominantemente regular con una porción menor de insulina de protamina de cinc. Las suspensiones de insulina-cinc extendidas y rápida son también contempladas para su uso en la invención. La insulina puede ser, por ejemplo, de origen humano, bovino, ovino u otro animal, o puede ser un producto recombinante.

La insulina humana está ahora disponible con gran facilidad como resultado de su producción por técnicas de ADN recombinante; en teoría, debería ser algo menos inmunógena que la insulina porcina purificada, que a su vez debería ser menos inmunógena que la insulina bovina. La insulina bovina se diferencia de la insulina humana en tres residuos de aminoácidos, mientras que la porcina difiere de la insulina humana en un solo aminoácido en el término carboxilo de la cadena \beta. Sin embargo, cuando están muy purificadas, las tres insulinas tienen una capacidad relativamente baja, pero medible, para estimular la respuesta inmune.

Las insulinas de acción corta o rápida son simplemente soluciones de insulina de cinc cristalina, regular (inyección de insulina) disuelta en un tampón a pH neutro. Las mismas tienen el comienzo de acción más rápido pero la duración más breve, es decir, los niveles de glucosa alcanzan un punto bajo al cabo de 20-30 minutos y vuelven al valor original en aproximadamente 2-3 horas.

Se formula insulinas de acción intermedia de manera que se disuelvan más gradualmente cuando se administran por vía subcutánea. Sus duraciones de acción son por tanto más largas. Las dos preparaciones usadas más frecuentemente son la insulina de protamina neutra Hagedorn (NPH) de proteína neutra (suspensión de insulina isofana) e insulina lenta (suspensión de cinc insulina). La insulina (NPH) es una suspensión de insulina en un complejo con cinc y protamina en un tampón de fosfato. La insulina lenta es una mezcla de insulina cristalizada (ultralenta) y amorfa (semilenta) en un tampón de acetato, que minimiza la solubilidad de la insulina, las preparaciones tienen perfiles farmacocinéticos similares.

La insulina ultralenta (suspensión de cinc insulina extendida) y suspensión de insulina de cinc protamina son insulinas de larga acción; tienen un comienzo muy lento y un pico de acción prolongado ("plano"). Se dice que estas insulinas proporcionan una baja concentración basal de insulina durante todo el día.

Según se usa aquí, el término insulina es contemplado también para abarcar los análogos de insulina. El reciente desarrollo de insulina que han alterado las tasas de absorción ha suscitado interés. La insulina con aspartato y glutamato sustituido en las posiciones B9 y B27, respectivamente, cristaliza pobremente y ha sido llamada "insulina monómera". Esta insulina es absorbida más rápidamente que a partir de depósitos subcutáneos y puede ser así útil para satisfacer demandas postprandriales. En contraste, otros análogos de insulina tienden a cristalizar en el sitio de inyección y son absorbidos más lentamente. Se han producido insulinas con potencia mejorada por sustitución del aspartato por histidina en posición B10 y por modificación de los residuos carboxilo terminales de la cadena B.

Un ejemplo de los componentes de los medios condrogénicos de la invención está representado en la tabla 1.

TABLA 1

Composición de medio condrogénico usada en estos experimentos
Ingrediente	Proveedor	Stock	Dilución	Concentración final
DMEM (alto en glucosa)	GIBCO/BRL	como se suministra	ninguna	puro
ITS+suplemento	Collaborative	como se suministra	1:99	6,25 \mul/ml insulina
				bovina
Dexametasona	Sigma	1 mM en EtOH	2 x 1:99	100 nM
Factor de crecimiento transformante	Calbiochem	40 \mug/ml	1:4000	10 ng/ml
Ácido ascorbido-2-fosfato	Wako	5 \mug/ml	1:99	5 \mug/ml
Piruvato sódico	GIBCO/BRL	100 mM	1:99	1 mM
Prolina	Sigma	4 mg/ml	1:99	40 \mug/ml
Antibiótico-antimicótico	GIBCO/BRL	según se suministra	1:99	100 U/ml penicilina

Ejemplo 1

El medio alto en glucosa incrementa la matriz extracelular.

Producción durante la diferenciación condrogénica

Cuando las hMSCs se diferencian a lo largo del linaje condrogénico, se altera el metabolismo de la célula, y se altera las actividades anabólicas de las células. Una manifestación de esto es el incremento ren la producción de matriz extracelular. Es esta matriz extracelular la que es responsable de las propiedades únicas de los condrocitos y les permite servir de tejido lubricante, portador de peso entre huesos adyacentes, y es esta superficie la que enferma en la osteoartritis. La matriz extracelular se compone de proteína y proteoglicanos sulfatados que se expresan de una manera temporal cuando se desarrolla la célula en un condrocito. Las proteína, y proteoglicanos incluyen agrecano, proteína oligomatriz de cartílago (COMP), ácido hialurónico, sulfato de ceratan, proteína de enlace y colágeno tipo II así como otros. Estas moléculas se ensamblan extracelularmente y rodean el cuerpo de la célula.

Las hMSCs en cultivo en pella que están sufriendo diferenciación condrogénica expresan los proteoglicanos de matriz extracelular mencionados más arriba. En esta memoria ponemos de manifiesto que el medio que contiene 4,5 g/l de glucosa da lugar a una mayor viabilidad de la célula y mayor producción de componentes de matriz extracelular como se muestra. En la figura 1, el incremento en el tamaño de la pella de células es evidente cuando el medio contiene "glucosa alta". Cambios en el tamaño de las pellas de hMSC reflejan la extensión de la síntesis de los componentes de matriz extracelular. Cada pella fue formada por transferencia de una alicuota de 200.000 células en ½ ml de medio condrogénico con 1 g/l (5,5 mM) de glucosa (izquierda) o 4,5 g/l (25 mM) de glucosa (derecha). El medio condrogénico consistió en DMEM con la concentración indicada de glucosa y los siguientes suplementos: 100 nM de dexametasona, 10 ng/ml de Factor de Crecimiento Transformante \beta, 1 mM de piruvato sódico, 5 \mug/ml de ácido ascórbido-2-fosfato, y 40 \mug/ml de prolina. Una dilución 1:99 de "ITS+" suministró 6,25 \mug/ml de insulina bovina, 6,25 \mug/ml de transferrina, 6,25 \mug/ml de ácido selenioso, 5,33 \mug/ml de ácido linoleico y 1,25 mg/ml de albúmina de suero bovino. Concentraciones finales de 100 U/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina y 250 ng/ml de anfotericina B fueron suministradas por una dilución 1:99 de una solución antibiótica concentrada.

Las células y el medio fueron colocados dentro de un tubo centrífugo de fondo cónico de polipropileno de 15 ml, y centrifugados suavemente (500 x g durante 5 minutos), después de lo cual los tubos con cápsulas aflojadas fueron colocados en una incubadora humidificada al 5% de CO_{2} a 37ºC. Durante las 12 horas siguientes, las células del fondo del tubo se reorganizaron en una pella esférica con un diámetro de aproximadamente 1 mm.

Los "cultivos en pella" fueron mantenidos por suministro de las células con medio fresco. Tres veces a la semana se aspiró medio del tubo y se añadió 0,5 ml de medio fresco. El tubo fue agitado suavemente para asegurarse de que la pella era libremente flotante y no se agarraba al lado del tubo. Para la figura 1, se fijaron pellas, después de un crecimiento de 2 semanas durante 60 minutos en 4% de paraformaldehido en solución salina tamponada con fosfato, y se fotografiaron antes de la inclusión y congelación. La pella formada por hMSCs en medio condrogénico con 1 g/l de glucosa tiene 0,8 mm de diámetro (izquierda). La pella cultivada con 4,5 g/l de glucosa tiene un diámetro de 1,6 mm (derecha). El tamaño incrementado de la pella de hMSC en medio que contenía 4,5 g/l de glucosa es debida a la gran cantidad de matriz extracelular producida, en vez de deberse a proliferación celular incrementada. Aumento final, 40x. Para examinar diferentes condiciones condrogénicas, las pellas de células fueron fijadas, seccionadas a 5-8 micras, y sometidas a tinción histológica e inmunohistológica.

Como se muestra en la figura 2, el comienzo de expresión de colágeno tipo II característico del cartílago fue más avanzado en hasta 1 semana en células cultivadas en medio condrogénico que contenía 4,5 g/l de medio alto en glucosa. Por ejemplo, las hMSCs mostraron poca evidencia de expresión de esta proteína después de la primera semana de cultivo en medio condrogénico con 1 g/l de glucosa (figura 2A). En contraste, el comienzo de síntesis de colágeno tipo II fue fácilmente detectado dentro de pellas crecidas en el medio condrogénico con 4,5 g/l de glucosa (figura 2B). Al punto temporal de dos semanas, estaba presente colágeno tipo II en áreas restringidas en pellas crecidas en medios con 1 g/l de glucosa (figura 3A), mientras que se detectó evidencia de síntesis de colágeno tipo II claramente por todas las pellas crecidas con 4,5 g/l de glucosa (figura 3B).

La formación de matriz extracelular con una alta concentración de proteoglicanos sulfatado fue demostrada por tinción con Safranina O (no mostrado) y azul de toluidina O. Cuando se tiñeron con azul de toluidina O, secciones de pellas con una matriz extracelular cartilaginosa presentan metacromasia, un color más bien purpurino que azul que demuestra la presencia de elementos de matriz cargados negativamente, tales como los encontrados en el cartílago y mencionados anteriormente. Aunque las pellas de hMSC en medio condrogénico con 1 g/l de glucosa mostraron evidencia de esta mancha metacromática púrpura después de dos semanas de cultivo (Figura 4A) cuando se seccionaron y tiñeron, la extensión de esta tinción fue mucho más prominente cuando el medio de cultivo contenía 4,5 g/l de glucosa (figura 4B).

Ejemplo 2

El alto contenido de glucosa incrementa la viabilidad de hMSC durante la condrogénesis

Hay muchas explicaciones posibles para la diferenciación condrogénica mejorada de hMSCs cultivadas en medio que contenía 4,5 g/l de glucosa. Sin embargo, este ejemplo muestra que este medio con mayor contenido de glucosa fomenta la supervivencia de las células en un grado mucho mayor que el medio con 1 g/l de glucosa. La alta viabilidad puede dar lugar a una mayor condrogénesis simplemente porque un mayor número de células vivas son capaces de segregar componentes de matriz extracelular cartilaginosa. Además, los mayores niveles de supervivencia de las células parecen reflejar una población de células más robustas, en la que cada célula viva contribuye con más proteína de matriz extracelular, proteoglicano, y carbohidrato a su vencindad. Como el cartílago es un órgano avascular, esta necesidad de una concentración relativamente alta de azúcar en el medio de cultivo puede reflejar las características metabólicas inusuales de los condrocitos in vivo.

Se ensayó la viabilidad de hMSCs en cultivo en pella modificando el ensayo de exclusión de tinte desarrollado por Poole et al.(C.A. Poole, H.H. Brookes, R.T. Gilbert, B.W. Beaumont, A. Crowther, L. Scout, and M.J. Merrilees. "Detection of viables and non-viable cells in connective tissue explants using the fixable fluoroprobes 5-chloromethylfluorescein diacetate and ehidium homodimer-1." Connective Tissue Research 33:233-241, 1996) para examinar la supervivencia de las células en el cultivo del órgano. 72 horas antes de la recolección de pellas, se añadió al medio tinte homodímero de etidio (1 mM stock en DMSO) a una concentración final de 2 \muM. Las pellas fueron devueltas entonces a condiciones de incubación estándar. En la recolección, las pellas fueron enjuagadas 4 x 30 min. en solución salina tamponada con fosfato, después fijadas durante 1 hora en 4% formaldehido, incluidas en una solución de inclusión de sección congelada, enfriadas en un baño de nitrógeno líquido y crioseccionadas. Secciones de 8 \mum fueron contra-teñidas con 500 ng/ml de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) antes del montaje acuoso y la observación por microscopía de fluorescencia.

En estas condiciones de incubación en tinte homodímero de etidio, únicamente las células desprovistas de plasma intacto permitieron la entrada del tinte dentro de sus núcleos. Estos núcleos fluorescen de rojo cuando se excitan con luz de 490 nm. La incubación de las secciones fijas con DAPI fluorescente azul (1 \mug/ml) permite la intercalación de este segundo tinte dentro del ADN de todos los otros núcleos, donde los sitios de ligazón intra-hélice no están ocupados por homodímero de etidio. Por tanto, los núcleos de células que eran viables en el momento de la incubación con homodímero de etidio y la fijación brillan de rojo, mientras que las células viables brillan de azul cuando se observan por microscopía de epi-fluorescencia.

El examen de secciones de pellas tratadas con homodímero de etidio revela que los núcleos rojizos de células no viables son predominantes en pellas cultivadas con 1 g/l de glucosa (figura 5A). En marcado contraste, pellas equivalentes, cultivadas con 4,5 g/l de glucosa, contienen pocos núcleos rojizos (figura 5B).

Ejemplo 3

El TGF-\beta3 es un agente condrogénico superior para MSCs

Los experimentos aquí expuestos investigaron la condrogénesis de las MSCs a partir de un número relativamente grande de conejos (aproximadamente 16), bajo diversas condiciones.

El TGF-\beta1 ha sido conocido desde hace tiempo como un potente promotor de formación del cartílago (veáse, por ejemplo, informe por Kato [2]). En efecto, el TGF-\beta1 ha sido usado en implantes para efectuar la reparación del cartílago en una serie de estudios, tales como el de O'Driscoll [3], donde ha demostrado inducir condrogénesis en tejidos de origen mesenquimatoso (tales como periostio y músculo). Hay también otros informes sobre el uso del TGF-\beta1 en implantes osteocondrales [4, 5]. Recientemente, Brian Johnstone informó de que el TGF-\beta1, cuando se añadió a células primarias en cultivo en pella, superó el problema de la falta de consistencia y condujo a resultados más reproducibles. Esto constituyó un importante desarrollo y ha reforzado el hallazgo original.

El TGF-\beta3 ha demostrado tener un efecto pronunciado sobre las células de leiomioma uterino [6]. Los leiomiomas son tumores benignos del músculo liso caracterizados por la formación de grandes cantidades de matriz extracelular por células hipertróficas con un bajo índice mitósico. Existe al menos un caso citado de leiomioma que muestra un fenotipo de cartílago. Basándonos en estas observaciones hemos investigado el efecto del TGF-\beta3 en la diferenciación condrogénica de células precursoras mesenquimatosas.

Se cultivaron células precursoras mesenquimatosas derivadas de médula ósea humana, bajo condiciones estándar en presencia de 10% de FBS hasta hacerse confluentes. Las células fueron tripsinizadas, lavadas dos veces con medio condrogénico, y resuspendidas a una densidad de 200.000 células/ml en tubos de polipropileno de 15 ml en medio condrogénico que contenía 10 ng/ml de TGF-\beta1, de TGF-\beta3 o ninguno de éstos. Las células fueron hiladas para formar una capa, el medio fue reemplazado cada 3-4 días y las células fueron recolectadas a los 7, 14 y 21 días. Secciones congeladas (8 mm) fueron teñidas con azul de toluidina. Fueron teñidas también para lo que sigue usando protocolos inmunocitoquímicos estándar: colágeno tipo 11, colágeno I, y proteína de matriz oligomérica de cartílago (COMP).

Células del mismo donante fueron cultivadas en el medio condrogénico con o sin TGF-\beta1 o TGF-\beta3. Al día cero (es decir, antes de hilar las células para formar una capa) se observó expresión de colágeno tipo I en íntima proximidad a las células, pero estaba ausente tinción para colagenando COMP tipo II. Después de 8 días en cultivo en pella en ausencia de factores de crecimiento añadidos, la expresión de COMP fue abundante en la matriz extracelular, pero no fue evidente el colágeno tipo II. En presencia de TGF-\beta1 seguía sin haber expresión de colágeno tipo II. Con TGF-\beta3 presente, una pequeña área de la pella de había vuelto acelular y algunas células expresaron colágeno tipo II. A los 14 días hubo evidencia de alguna diferenciación condrogénica en presencia de TGF-\beta1, como lo pone de manifiesto la expresión localizada de colágeno tipo II. Sin embargo, cuando se cultivaron en presencia de TGF-\beta3, las pellas mostraron una apariencia notablemente diferente. En este caso, las pellas eran de mayor tamaño debido a la presencia de abundante matriz extracelular. Una gran proporción de las células eran hipertróficas y hubo expresión de colágeno tipo II en todas partes, excepto en un área central donde las células estaban todavía indiferenciadas. Alrededor del perímetro de las pellas, las células adoptaron una configuración oblonga con intensa tinción tipo II, parecido al pericondrio.

Después de 21 días en cultivo en presencia de TGF-\beta1 hubo tinción por toda la pella excepto en su perímetro, que fue negativo. Con TGF-\beta3 hubo una tinción muy fuerte, particularmente en la matriz interterritorial. La tinción con COMP fue similar, con tinción pericelular reducida y tinción interterritorial incrementada.

Esto pone de manifiesto que el TGF-\beta3 tiene un efecto importante en la diferenciación condrogénica de las MSCs humanas in vitro y estimula el desarrollo de abundante matriz extracelular parecida al cartílago. Después de 21 días en cultivo, el tejido tiene una morfología que se parece al cartílago articular maduro. La expresión específica de COMP en la matriz interterritorial es especialmente reminiscente de cartílago maduro. Además, la abundante expresión de colágeno tipo II sugiere que estas células se han diferenciado en un linaje condrogénico. El efecto es más pronunciado en presencia de TGF-\beta3 comparado con TGF-\beta1.

Ejemplo 4

Experimento de cultivo en pella Cultivo adherente de hMSC

MSCs humanas fueron aisladas y expandidas como se ha descrito anteriormente (Bruder, et al.) Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. Journal of Cellular Biochemistry 64: 278-294, 1997 y cultivadas como células adherentes. El medio fue Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) conteniendo 1 g/l de glucosa, y enriquecido con 10% de suero bovino fetal de lotes seccionados (Lennon et al., 1996) S. E. Haynesworth, S. P. Bruder, N. Jaiswal, and A.L.Caplan. Células progenitoras mesenquimatosas humanas y animales procedentes de médula ósea: idenficación del suero para selección y proliferación ópticas. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 32: 602-611, 1996, y 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, y 250 ng/ml de anfotericina B). Las células fueron cultivadas en una atmósfera con 5% de CO_{2} a 37ºC. Las células fueron usadas en el pasaje 1, correspondiente a aproximadamente 13 duplicaciones de población (Bruder et al., 1997). Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. Journal of Cellular Biochemistry 64: 278-294, 1997.

Cultivo en pella de hMSC

Se promovió condrogénesis cambiando las hMSCs a un formato de cultivo tridimensional, denso de manera que 250.000 células formaran una pella esferoidal de aproximadamente 1 mm de diámetro inicial. Para formar estas pellas, las hMSCs adherentes fueron tripsinizadas, lavadas en medio que contenía suero, después resuspendidas en medio condrogénico libre de suero, usando técnicas de cultivo de tejido estándar. Este medio fue como el descrito en la Solicitud Provisional de Osiris número 640100-129 [High glucose DMEM supplemented with 10 ng/ml transforming growth facto beta-3, (TGF-\beta3) Oncogene Research Products, Cambridge, MA), 100 nM de dexametasona (Sigma, St. Louis, MO), 50 \mug/ml de ácido ascórbico 2-fosfato (WAKO Puro Chemicals, Tokyo, Japan), 100 \mug/ml de piruvato sódico, 40 \mug/ml de prolina, y 6,25 \mug/ml de insulina bovina, 6,25 \mug/ml de transferrina, 6,25 \mug/ml de ácido selenioso, 5,33 \mug/ml de ácido linoleico, 1,25 \mug/ml de albúmina de suero bovino (ITS-plus, Collaborative Biomedical Products, Cambridge, MA)].

Se produjeron pellas condrogénicas de hMSCs del siguiente modo. Alícuotas de 250.000 células suspendidas en 0,5 ml de medio condrogénico libre de suero fueron distribuidas a tubos centrífugos de 15 ml de propileno cónicos (VWR). Las células fueron centrifugadas durante 5 minutos a 600 x g y dejadas en el fondo del tubo. Los tubos fueron colocados en una incubadora con cápsulas aflojadas para permitir el intercambio de gas. Las células sedimentadas formaron una pella esférica en el fondo del tubo en 24 horas. El medio se sustituyó tres veces por semana, y las células fueron cultivadas de esta manera por espacio de hasta 4 semanas.

Inducción de hipertrofia

Se indujo diferenciación hipertrófica después de haber cultivado las pellas durante 7 ó 14 días bajo condiciones condrogénicas estándar. En ese momento, el medio condrogénico fue reemplazado por un medio de maduración que contenía 50 ng/ml de tiroxina (Sigma). Para inducir más hipertrofia, se bajó la concentración de dexametasona a 10^{-9} M (Quarto et al., 1992), y se añadieron (Dieudonne et al., 1994). C.M. Semeins, S.W. Goei, S. Vukicevic, J.K. Nulend, TK. Sampath, M. Helder, and E.H. Burger. Opposite effects of osteogenic protein and transforming growth factor-b on chondrogenesis in cultured long bone rudiments. J. Bone Min. Res. 9: 771-780, 1994, 20 M de fosfato de beta-glicerol (Sigma).

Otros experimentos preliminares indican que el T3 y la tiroxina son ambos eficaces para inducir hipertrofia. Agentes tales como ácido retinoico y sus derivados pueden ser también eficaces de este modo.

Análisis de pellas

Pellas de células fueron recolectadas por fijación durante 1 hora en 4% de paraformaldehído en PBS. Fueron transferidas entonces muestras en 70% de etanol, deshidratadas en series de etanol y xileno, e incluidas en parafina. Se cortaron secciones de 5 \mum a través del centro de cada pella.

Se usaron anticuerpos monoespecíficos para detectar proteínas de matriz extracelular características de la diferenciación condrogénica. Las secciones fueron digeridas durante 30 minutos con 50 mU/ml de condroitinasa ABC (Seikagaku America, Ijamsville, MD) en 100 mM tris-acetato pH 7,6, 0,1% albúmina de suero bovino. Se identificó colágeno tipo II con anticuerpo monoclonal de ratón C4F6, usado a 2 mg/ml (Srinivas et al., 1993). Srinivas, G.R., H.J. Barrach, and C.O. Chichester. Inmunoensayos cuantitativos para colágeno del tipo II y sus péptidos de bromuro cianógeno. J. Immunol. Methods 159: 53-62, 1993. Se identificaron los tipos de colágeno X y IX con monoclonales de ratón X 53 (Quartett, Berlin, FRG) (Girkontaite et al., 1996) S. Frischholz, P. Lammi, K. Wagner, B. Swoboda, T Aigner, and K. Von der Mark. Immunolocalization of type X collagen in normal fetal and adult osteoarthritic cartilage with monoclonal antibodies. Matrix Biology 15: 231-238, 1996. and \alphaCIX (C.O. Chichester et al., manuscrito en preparación), respectivamente, después de la digestión en pepsina. Antes del tratamiento con condroitinasa, se incubaron secciones con 2 mg/ml de pepsina (Sigma) en 0,5 M de ácido acético durante 1 hora a 22ºC.

Para toda la inmunotinción, se detectó reactividad incubando en serie de secciones con anticuerpo anti-ratón o anti-conejo de cabra biotinilado, seguido por peróxidasa de rabano picante (HRP) estreptavidina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD). Se desarrolló señal como el producto de reacción de peroxidasa de 3,3'-diaminobencidina (DAB) y H_{2}O_{2}.

Se detectaron proteoglicanos sulfatados aniónicos por tinción con safranina O y metacromasia de azul de toluidina. Estas manchas caracterizaron la deposición de una matriz cartilaginosa (Sheehan and Hrapchak, 1980). Sheehan, D.C. and B.B. Hrapchak. Theory and Practice of Histochemistry, 2nd ed. Battelle Press, Columbus, OH. 481 pp. 1980.

Ejemplo 5

El tratamiento secuencial de hMSCs en cultivo en pella con dos medios induce hipertrofia

Las MSCs humanas sometidas a diferenciación condrogénica pueden madurar como células hipertróficas, ya sea debido a un programa interno de expresión de genes o como respuesta a condiciones ambientales. Para inducir hipertrofia, se alteraron las condiciones de cultivo in vitro después de dos semanas de diferenciación condrogénica. Withdrawing TGF-\beta3 (Serra et al., 1997) Johnson, E.H. Filvaroff, J. LaBorde, D.M. Sheehan, R. Derynck, and H.L. Moses.

La expresión de un receptor truncado de TGF-\beta tipo II, defectuoso en cinasa en tejido esquelético de ratón promueve la diferenciación de condrocitos terminales y osteoartritis. J. Cell Biol. 139: 541-552, 1997, y añadiendo 50 nM de tiroxina (Ballock and Reddi, 1994). La tiroxina es el factor del suero que regula la morfogénesis del cartílago columnar a partir de condrocitos aislados en medio químicamente definido. J. Cell Biol. 126: 1311-18, 1994, al medio tuvo un efecto hipertrófico pronunciado después de dos semanas más de cultivo. La hipertrofia fue más prominente cuando se combinaron estas condiciones con la adición de 20 mM de fosfato de \beta-glicerol y una reducción en la concentración de dexametasona a 10^{-9} M. Estas pellas contenían regiones con células hipertróficas rodeadas por grandes acumulaciones pericelulares de ECM (figura 2). Comparadas con las pellas mantenidas en medio condrogénico estándar durante 28 días, las pellas tratadas mostraron una intensa tinción para colágenos tipo II y tipo IX, así como un incremento irregular pero pronunciado en la deposición de colágeno tipo X detectado por anticuerpo X53 (figura 2).

Claims (22)

1. Proceso para producir condrocitos a partir de células precursoras mesenquimatosas por cultivo de células precursoras mesenquimatosas en un medio libre de suero químicamente definido in vitro, en el que las células precursoras mesenquimatosas están asociadas en un formato tridimensional, y en el que dicho medio libre de suero químicamente definido comprende (1) un medio esencial mínimo químicamente definido; (2) ascorbato; (3) una fuente de hierro; (4) insulina o un factor de crecimiento parecido a la insulina; (5) al menos un agente o factor condroinductivo; y (6) un azúcar simple, estando presente dicho azúcar simple en dicho medio en una cantidad de 3 g/l a 7 g/l.

2. Proceso según la reivindicación 1, en el que dichas células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas humanas aisladas, expandidas en cultivo.

3. Proceso según la reivindicación 1, en el que las células precursoras mesenquimatosas son condensadas en íntima proximidad.

4. Proceso según la reivindicación 3, en el que las células precursoras mesenquimatosas están presentes como células concentradas o en una pella de células centrífuga.

5. Proceso según la reivindicación 1, en el que se selecciona al menos dicho agente o factor condroinductivo dentro del grupo consistente en (i) un glucocorticoide; (ii) un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta; (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa; y (iv) un análogo de vitamina A.

6. Proceso según la reivindicación 1, en el que al menos dicho agente condroinductivo es una combinación de dexametasona y TGF-\beta1.

7. Proceso según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la colocación de dichas células en una vasija porosa rígida.

8. Proceso según la reivindicación 7, en el que dicha vasija porosa y rígida es un cubo cerámico.

9. Proceso según la reivindicación 1, en el que dicho azúcar simple es glucosa.

10. Proceso según la reivindicación 9, en el que dicha glucosa está presente en dicho medio libre de suero en una cantidad de 4,5 g. por litro.

11. Proceso según la reivindicación 1, en el que al menos un agente o factor condroinductivo comprende TGF-\beta3.

12. Proceso para inducir condrogénesis en células precursoras mesenquimatosas por cultivo de células precursoras mesenquimatosas en un medio libre de suero químicamente definido in vitro, en el que las células precursoras mesenquimatosas están asociadas en un formato tridimensional, y en el que dicho medio libre de suero químicamente definido comprende (1) un medio esencial mínimo químicamente definido; (2) ascorbato; (3) una fuente de hierro; (4) insulina o un factor de crecimiento parecido a la insulina; (5) al menos un agente o factor condroinductivo; y (6) un azúcar simple, estando presente dicho azúcar simple en dicho medio en una cantidad de 3 g/l a 7 g/l.

13. Proceso según la reivindicación 12, en el que dichas células precursoras mesenquimatosas son células precursoras mesenquimatosas humanas aisladas, expandidas en cultivo.

14. Proceso según la reivindicación 12, en el que las células precursoras mesenquimatosas son condensadas en íntima proximidad.

15. Proceso según la reivindicación 14, en el que las células precursoras mesenquimatosas están presentes como células concentradas o en una pella de células centrífugas.

16. Proceso según la reivindicación 12, en el que se selecciona al menos dicho agente condroinductivo dentro del grupo consistente en (i) un glucocorticoide; (ii) un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta; (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa; y (iv) un análogo de vitamina A.

17. Proceso según la reivindicación 12, en el que al menos dicho agente condroinductivo es una combinación de dexametasona y TGF-\beta1.

18. Proceso según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente la colocación de dichas células en una vasija porosa rígida.

19. Proceso según la reivindicación 18, en el que dicha vasija porosa y rígida es un cubo cerámico.

20. Proceso según la reivindicación 12, en el que dicho azúcar simple es glucosa.

21. Proceso según la reivindicación 20, en el que dicha glucosa está presente en dicho medio libre de suero en una cantidad de 4,5 g. por litro.

22. Proceso según la reivindicación 12, en el que al menos un agente o factor condroinductivo comprende TGF-\beta3.