ES2238077T3 - Induccion condrogenica in vitro de celulas madre mesenquimatosas humanas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA COMPOSICION DE COMPUESTOS QUIMICOS DEFINIDOS QUE PERMITE LA CONDROGENESIS IN VITRO DE CELULAS PROGENITORAS MESENQUIMALES, UN METODO PARA LA INDUCCION CODROGENICA IN VITRO DE TALES CELULAS PROGENITORAS Y UN METODO PARA FORMAR CONDROCITOS HUMANOS IN VITRO A PARTIR DE TALES CELULAS PROGENITORAS.

Description

Inducción condrogénica in vitro de células madre mesenquimatosas humanas.

La presente invención se refiere al campo de los métodos y composiciones para dirigir células progenitoras mesenquimatosas cultivadas in vitro para que se diferencien en rutas específicas de linaje celular y, particularmente, a tal inducción de linaje dirigida antes de, o en el momento de, su implantación en un receptor o huésped, para el tratamiento terapéutico de estados patológicos en seres humanos y otras especies.

Las células madre mesenquimatosas (MSC) son los blastocitos pluripotenciales formativos o células embrionarias similares encontradas en la médula ósea, sangre, dermis y periostio que pueden diferenciarse en tipos específicos de tejidos mesenquimatosos o conjuntivos, incluyendo tejidos adiposos, óseos, cartilaginosos, elásticos, musculares y conjuntivos fibrosos. La ruta de diferenciación específica que comienzan estas células depende de diversas influencias, de entre influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas, y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huéspedes. Aunque estas células normalmente están presentes en frecuencias muy bajas en la médula ósea, en Caplan et al. patentes de los EE.UU. números 5.197.985 y 5.226.914, se informa de un procedimiento para aislar, purificar y expandir mitóticamente la población de estas células en cultivos tisulares.

En organismos prenatales, la diferenciación de MSC en células de tejido conjuntivo especializadas está bien establecida; por ejemplo, las células mesenquimatosas embrionarias germinales de extremidad de pollo, ratón o ser humano se diferencian en cartílago, hueso y otro tejido conjuntivo (Caplan AI, En: 39th Annual Symposium of the Society for Developmental Biology, editado por S. Subtelney y U Abbott, pág. 3768. Nueva York, Alan R Liss Inc., 1981; Elmer et al., Teratology, 24:215-223, 1981; Hauschka SD, Dev Biol, 37: 345-368, 1974; Solursh et al., Dev Biol, 83:9-19, 1981; Swalla et al., Dev Biol, 116:31-38, 1986). Además, también se ha demostrado que una línea celular craneal de feto de rata clonal se diferencia en músculo, tejido adiposo, cartílago, y hueso (Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269:274-283, 1991). La existencia de MSC en organismos posnatales no se ha estudiado ampliamente con el objetivo de demostrar la diferenciación de células pos-embrionarias en varios fenotipos mesodérmicos. Los pocos estudios que se han realizado incluyen la formación de hueso y cartílago por células de la médula ósea tras encerrarlas en cámaras de difusión y trasplante in vivo (Ashton et al., Clin Orthop Rel Res, 151:294-307, 1980; Bruder et al., Bone Mineral, 11:141-151, 1990). Recientemente, células de periostio de pollo se han aislado, expandido en cultivo y, en condiciones de alta densidad in vitro, se ha demostrado que se diferencian en cartílago y hueso (Nakahara et al., Exp Cell Res, 195:492-503, 1991). Se ha demostrado que las células mesenquimatosas derivadas de médula ósea de rata tienen capacidad para diferenciarse en osteoblastos y condrocitos cuando se implantan in vivo (Dennis et al., Cell Transpl, 1.2332, 1991; Goshima et al., Clin Orthop Rel Res, 269:274-283, 1991). Aunque se ha obtenido evidencia indirecta de su capacidad condrogénica a partir de estudios de implantación, no se han desarrollado sistemas in vitro en los que estas células se diferencien en condrocitos.

Según la presente invención, los inventores han observado que cuando las células madre mesenquimatosas humanas se asocian en un formato tridimensional, pueden inducirse a obligarlas a diferenciarse a lo largo de la ruta condrogénica cuando se ponen en contacto in vitro con ciertos agentes o factores inductores de la condrogénesis. El formato tridimensional es crítico para la condrogénesis in vitro de la invención y las células se condensan preferiblemente entre sí, por ejemplo, como una masa celular empaquetada o agrupada. Se cree que este proceso in vitro resume lo que se produce in vivo y puede utilizarse para definir los acontecimientos moleculares que son importantes en el proceso de condrogénesis.

Por tanto, en un aspecto la presente invención proporciona una composición para la condrogénesis in vitro de células precursoras mesenquimatosas humanas y la formación in vitro de condrocitos humanos a partir de las mismas, cuya composición comprende células madre mesenquimatosas humanas aisladas en un formato tridimensional y al menos un agente inductor de la condrogénesis en contacto con las mismas. Las células madre mesenquimatosas son preferiblemente células madre mesenquimatosas humanas, aisladas y sometidas a expansión en cultivo en un medio sin suero definido químicamente y condensadas en proximidad cercana, tal como en la forma de una masa celular tridimensional, por ejemplo, células empaquetadas o un sedimento de células centrifugadas.

El agente inductor de la condrogénesis se selecciona preferiblemente, individualmente o en combinación, del grupo que consiste en (i) un glucocorticoide tal como dexametasona; (ii) un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta, tal como una proteína morfogenética ósea (preferiblemente BMP-2 o BMP-4), TGF-\beta1, inhibina A o factor de actividad estimulante de la condrogénesis; (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa, tal como colágeno I (particularmente en la forma de un gel); y (iv) un análogo de la vitamina A, tal como ácido retinoico. Particularmente preferida es la combinación de dexametasona y TGF-\beta1.

La invención también proporciona un procedimiento para producir condrocitos a partir de células madre mesenquimatosas poniendo en contacto las células madre mesenquimatosas con un agente de inducción de la condrogénesis in vitro en el que las células madre se asocian en un formato tridimensional.

La invención también proporciona un procedimiento para inducir la condrogénesis en células madre mesenquimatosas poniendo en contacto las células madre mesenquimatosas con un agente inductor de la condrogénesis in vitro en el que las células madre se asocian en un formato tridimensional.

En los métodos anteriores, las células madre mesenquimatosas son preferiblemente células madre mesenquimatosas humanas, aisladas y sometidas a expansión en cultivo en un medio sin suero definido químicamente y condensadas en proximidad cercana, tal como en la forma de una masa celular tridimensional, por ejemplo, células empaquetadas o un sedimento de células centrifugadas. Además, la puesta en contacto comprende preferiblemente cultivar una agrupación de células precursoras mesenquimatosas humanas en un medio sin suero definido químicamente, que comprende (1) un medio esencial mínimo definido químicamente; (2) ascorbato o un análogo del mismo; (3) una fuente de hierro; (4) insulina o un factor de crecimiento similar a la insulina; y (5) al menos un agente o factor inductor de la condrogénesis. Los métodos anteriores también pueden comprender preferiblemente etapas en las que las células se cultivan con la composición inductora de la condrogénesis y después se colocan en un recipiente poroso y rígido, tal como un cubo de cerámica.

También es posible utilizar una preparación de células madre mesenquimatosas humanas, no homogéneas, no cultivadas, aisladas, en la composición y métodos de la invención. Las MSC pueden aislarse como preparaciones no homogéneas, no cultivadas, tal como mediante fraccionamiento por gradiente de densidad, a partir de tejido tal como médula ósea, sangre (incluyendo sangre periférica), periostio y dermis, y otros tejidos que tengan orígenes mesodérmicos. A este respecto, se ha encontrado que, aunque estas células madre mesenquimatosas normalmente están presentes en la médula ósea, por ejemplo, en cantidades muy pequeñas y que estas cantidades disminuyen enormemente con la edad (es decir, desde aproximadamente 1/10.000 células en un paciente relativamente joven, hasta tan solo 1/2.000.000 en un paciente anciano), las preparaciones de células madre mesenquimatosas humanas pueden aislarse de tejido, particularmente de médula ósea, de manera que estén sustancialmente libres de otros tipos de células en la médula ósea. Se contempla que la preparación de fraccionamiento aislada comprenderá células de las que al menos aproximadamente el 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, son células madre mesenquimatosas humanas.

La secuencia de acontecimientos que se producen en la inducción de la condrogénesis y la producción de condrocitos en los métodos in vitro anteriores se asemeja a la condrogénesis en la formación embrionaria de las extremidades. Puesto que se definen todos los componentes del sistema, el sistema puede utilizarse como una herramienta de búsqueda valiosa para estudios de los efectos de los factores de crecimiento etc. en la progresión de la condrogénesis. También es aplicable a estudios de control molecular de la condrogénesis en mamíferos a partir de células progenitoras.

La invención se describirá ahora adicionalmente haciendo referencia a una breve descripción de cada una de las figuras, que en modo alguno constituyen una limitación del alcance de la invención.

Figura 1. Tinción con azul de toluidina de una sección a través de una esponja de colágeno cargada de células progenitoras mesenquimatosas, recogidas tres semanas después de la implantación subcutánea en un ratón desnudo. Se hicieron crecer células derivadas de médula ósea de conejo durante catorce días en un cultivo monocapa antes de cargarlas en la esponja.

Figuras 2A-2C. Tinción con azul de toluidina de secciones de células progenitoras mesenquimatosas, agrupadas, derivadas de médula ósea de conejo de cultivos +DEX a los 7 (figura 2A), 14 (figura 2B) y 21 (figura 2C) días.

Figuras 3A-3G. Inmunohistoquímica de células progenitoras mesenquimatosas, agrupadas, en cultivo, derivadas de médula ósea de conejo. Inmunotinción para colágeno de tipo II en los días 7 (figura 3A), 14 (figura 3B) y 21 (figura 3C). La figura 3D es una sección de una agrupación de 21 días inmunoteñida para colágeno de tipo X. La inmunotinción también se muestra para los glucosaminoglucanos: sulfato de condroitina (7-D-4 en la figura 3E; 3-B-3(+) en la figura 3F) y sulfato de queratano (5-D-4 en la figura 3G).

Figura 4. Hibridación Northern de ARN de células progenitoras mesenquimatosas de conejo con sondas de moléculas de la matriz. El ARN celular total procedente de las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de la médula ósea de conejo (carriles 1, 3) y fibroblastos dérmicos de conejo (carriles 2, 4) se hibridó con una sonda de colágeno humano \alpha1(I) (carriles 1, 2) y una sonda específica de conejo para el colágeno \alpha2(I) (carriles 3, 4). No pudieron detectarse bandas de ARNm cuando los mismos resultados de la inmunotransferencia se volvieron a sondar con sondas de agrecano específico de conejo y humano \alpha1(II) y sondas proteínas de unión.

La invención se describirá ahora en más detalle con respecto a las numerosas realizaciones y ejemplos en apoyo de la misma.

Esta invención tiene múltiples usos y ventajas. Una de tales ventajas se refiere a la capacidad de dirigir y acelerar la diferenciación de las MSC antes de la implantación de nuevo en huéspedes autólogos. Por ejemplo, las MSC que se dirigen in vitro para que se conviertan en células condrogénicas sintetizarán matriz de cartílago en un sitio de implante más rápida y uniformemente que las MSC que deben recogerse primero en el linaje y después hacer que progresen a través de etapas de diferenciación claves. Tal tratamiento ex vivo también proporciona una aplicación uniforme y controlada de factores bioactivos para MSC purificadas, lo que conduce a una asignación y diferenciación uniforme del linaje. La disponibilidad in vivo de los factores bioactivos endógenos no puede garantizarse ni controlarse fácilmente. Una etapa de tratamiento previo, tal como se describe en el presente documento, evita esto. Además, mediante el pretratamiento de las MSC antes de la implantación, se evitan efectos secundarios potencialmente nocivos asociados con la administración sistémica o local de factores bioactivos exógenos. Otro uso de esta técnica radica en la capacidad de dirigir la regeneración tisular basándose en la fase de diferenciación en que se encuentren las células en el momento de la implantación. Es decir, con respecto al cartílago, el estado de las células en la implantación puede controlar el tipo tisular final formado.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "agente inductor de la condrogénesis" o "factor inductor de la condrogénesis" se refieren a cualquier compuesto químico o bioquímico, orgánico o inorgánico, natural o sintético, o combinación o mezcla de compuestos, o a cualquier dispositivo, recipiente, influencia o fuerza, mecánicos o físicos, que pueda aplicarse a las células madre mesenquimatosas humanas que están en un formato tridimensional, de manera que realicen su inducción de la condrogénesis o la producción de condrocitos in vitro. El agente de inducción de la condrogénesis se selecciona preferiblemente, individualmente o en combinación, del grupo que consiste en (i) un glucocorticoide tal como dexametasona; (ii) un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta, tal como una proteína morfogenética ósea (preferiblemente BMP-2 o BMP-4), TGF-\beta1, inhibina A o factor de actividad estimulante de la condrogénesis (CSA); (iii) un componente de la matriz extracelular colagenosa, tal como colágeno I (particularmente en la forma de un gel); y (iv) un análogo de la vitamina A, tal como ácido retinoico.

Tal como se usa en el presente documento, el término "medio definido químicamente" se refiere a un medio de mantenimiento, crecimiento o cultivo, en el que la composición de la invención puede experimentar condrogénesis in vitro, particularmente según los métodos de la invención, e incluye un medio esencial mínimo definido químicamente, ascorbato o un análogo del mismo, una fuente de hierro, insulina o un factor de crecimiento similar a la insulina.

Tal como se usa en el presente documento, el término "medio esencial mínimo" se refiere a cualquier preparación o medio de cultivo de células animales, sin suero, de composición conocida, que soporte la viabilidad de células madre mesenquimatosas humanas in vitro. Ejemplos son cualquiera de los medios basados en Eagle, es decir, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); medio Eagle modificado por Iscove, Eagle modificado por alfa, y también McCoy 5A y BGJb (modificación de Fitton-Jackson).

Tal como se usa en el presente documento, el término "fuente de hierro" se refiere a cualquier especie que libere la forma férrica reducida del hierro en el medio incluyendo, pero no limitándose a, transferrina, FeSO_{4} o ferritina.

Tal como se usa en el presente documento, el término "insulina" se refiere a cualquiera de las diversas insulinas que se conocen. Las insulinas se dividen en tres categorías según la prontitud, duración e intensidad de la acción tras la administración subcutánea, es decir, tal como se mencionó anteriormente, la acción inmediata, intermedia y prolongada. La insulina cristalina regular se prepara por precipitación en presencia de cloruro de cinc y se han desarrollado formas modificadas para alterar el patrón de actividad. La insulina zinc protamina (PZI) es el resultado de la reacción de la insulina y el zinc con la proteína básica protamina, para formar un complejo proteico que se disuelve y se absorbe más lentamente que la insulina cristalina regular, pero que es altamente fiable para la absorción a una tasa constante. La insulina isofánica es una insulina zinc protamina cristalina modificada cuyos efectos son comparables a una mezcla de insulina predominantemente regular con una parte menor de insulina zinc protamina. También se contemplan las suspensiones extendidas e inmediatas de insulina-zinc para su uso en la invención. La insulina puede ser, por ejemplo, de origen humano, bovino, ovino o de otro animal, o puede ser un producto recombinante.

La insulina humana está ahora ampliamente disponible como resultado de su producción mediante técnicas de ADN recombinante; en teoría, debería ser ligeramente menos inmunogénica que la insulina porcina purificada, que a su vez debería ser menos inmunogénica que la insulina bovina. La insulina bovina difiere de la insulina humana en tres residuos de aminoácidos, mientras que la porcina difiere de la insulina humana en un solo aminoácido del extremo carboxilo terminal de la cadena \beta. Sin embargo, cuando está altamente purificada, las tres insulinas tienen una capacidad relativamente baja, pero medible, para estimular la respuesta inmunitaria.

Las insulinas de acción inmediata o rápida son simplemente disoluciones de insulina zinc, cristalina y regular (inyección de insulina) disuelta en un tampón a pH neutro. Estas tienen el comienzo de acción más rápido, pero la duración más corta, es decir, los niveles de glucosa alcanzan un punto bajo en un plazo de 20 - 30 minutos y vuelven al nivel inicial en aproximadamente 2 - 3 horas.

Las insulinas de acción intermedia se formulan de manera que se disuelvan más gradualmente cuando se administran por vía subcutánea; por tanto, sus duraciones de acción son más largas. Las dos preparaciones utilizadas con más frecuencia son la insulina protamina neutra de Hagedorn (NPH) (suspensión de insulina isofánica) y la insulina Lente (suspensión de insulina zinc). La insulina NPH es una suspensión de insulina en un complejo con zinc y protamina en tampón fosfato. La insulina Lente es una mezcla de insulinas cristalizadas (Ultralente) y amorfas (Semilente) en tampón de acetato, lo que minimiza la solubilidad de la insulina. Las preparaciones tienen perfiles farmacocinéticos similares.

La insulina Ultralente (suspensión extendida de insulina zinc) y la suspensión de insulina protamina zinc son insulinas de acción prolongada; tienen un comienzo de acción muy lento y un pico de acción prolongado ("plano"). Estas insulinas se recomiendan para proporcionar una concentración basal baja de insulina durante todo el día.

Tal como se usa en el presente documento, también se contempla que el término insulina englobe a los análogos de la insulina. El reciente desarrollo de la insulina que tiene tasas de absorción modificada ha alcanzado interés. La insulina con el aspartato y el glutamato sustituidos en las posiciones B9 y B27, respectivamente, cristaliza escasamente y se ha denominado "insulina monomérica". Esta insulina se absorbe más rápidamente a partir de depósitos subcutáneos y, por tanto, puede ser útil para satisfacer las demandas posprandiales. Por el contrario, otros análogos de insulina tienden a cristalizar en el lugar de la inyección y se absorben más lentamente. Se han producido insulinas con potencia intensificada mediante la sustitución del aspartato por histidina en la posición B10 y mediante la modificación de los residuos del extremo carboxilo terminal de la cadena B.

Aislamiento, purificación y expansión en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas

Las células madre mesenquimatosas humanas aisladas y purificadas, tal como se describe en el presente documento, pueden derivarse, por ejemplo, de la médula ósea, la sangre, la dermis o el periostio. Cuando se obtienen de la médula ósea, puede ser la médula de varias fuentes diferentes, incluyendo tapones de fragmentos de hueso esponjoso de la cabeza femoral procedentes de pacientes con enfermedad degenerativa articular durante la cirugía de artroplastia de cadera o de rodilla, o de médula ósea aspirada procedente de donantes sanos y pacientes oncológicos a los que se les ha recogido médula para un futuro trasplante de médula ósea. La médula ósea recogida se prepara entonces para el cultivo celular. El proceso de aislamiento supone el uso de un medio especialmente preparado que contiene agentes que permiten, no sólo el crecimiento de las células madre mesenquimatosas sin diferenciación, sino también la adherencia directa únicamente de las células madre mesenquimatosas a la superficie de plástico o vidrio del recipiente de cultivo. Mediante la creación de un medio que permita la unión selectiva de las células madre mesenquimatosas deseadas que están presentes en las muestras de tejido mesenquimatoso en cantidades muy pequeñas, entonces puede llegar a ser posible separar las células madre mesenquimatosas de otras células (es decir, eritrocitos y leucocitos, otras células mesenquimatosas diferenciadas, etc.) presentes en el tejido mesenquimatoso de origen.

La médula ósea es el tejido blando que ocupa las cavidades medulares de los huesos largos, algunos canales haversianos y los espacios entre las trabéculas del hueso esponjoso. La médula ósea es de dos tipos: roja, que se encuentra en todos los huesos al principio de la vida y en localizaciones restringidas en el adulto (es decir, en el hueso esponjoso) y que se ocupa de la producción de las células de la sangre (es decir, de la hematopoyesis) y la hemoglobina (por tanto, el color rojo); y amarilla, que consiste en buena parte en adipocitos (por tanto, el color amarillo) y en tejido conjuntivo.

En conjunto, la médula ósea es un tejido complejo que comprende células hematopoyéticas, incluyendo las células madre hematopoyéticas, y eritrocitos y leucocitos y sus precursores; y un grupo de células incluyendo las células madre mesenquimatosas, fibroblastos, reticulocitos, adipositos y células endoteliales que contribuyen a la red de tejido conjuntivo denominado "estroma". Las células del estroma regulan la diferenciación de las células hematopoyéticas mediante la interacción directa a través de las proteínas de la superficie celular y la secreción de factores de crecimiento y participan en la base y el soporte de la estructura ósea. Estudios que utilizaron modelos de animales sugirieron que la médula ósea contiene células "pre-estromales" que tienen capacidad para diferenciarse en cartílago, hueso, y otras células del tejido conjuntivo. (Beresford, J.N.: Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone y Marrow, Clin. Orthop., 240:270, 1989). Pruebas recientes indican que estas células, denominadas células madre estromales pluripotenciales o células madre mesenquimatosas, tienen la capacidad de generar varios tipos diferentes de líneas celulares (es decir, osteocitos, condrocitos, adipocitos, etc.) tras la activación, dependiendo de la influencia de varios factores bioactivos. Sin embargo, las células madre mesenquimatosas están presentes en el tejido en cantidades muy pequeñas con una amplia variedad de otras células (es decir, eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, adipocitos, etc.).

Como resultado, se ha desarrollado un procedimiento para aislar y purificar células madre mesenquimatosas humanas a partir de tejido antes de la diferenciación y después someter a expansión en cultivo las células madre mesenquimatosas para producir una herramienta valiosa para el tratamiento musculoesquelético. El objetivo de tal manipulación es aumentar enormemente el número de células madre mesenquimatosas y utilizar estas células para redirigir y/o reforzar la capacidad de reparación normal del organismo. Las células madre mesenquimatosas se someten a expansión hasta grandes números y se aplican a las zonas de lesión del tejido conjuntivo para intensificar o estimular el crecimiento in vivo para la regeneración y/o la reparación, para mejorar la adhesión del implante a diversos dispositivos protésicos mediante la posterior activación y diferenciación, o intensificar la producción de células hematopoyéticas, etc.

Se han preparado varios medios que son particularmente muy adecuados para la unión selectiva deseada y que se denominan en el presente documento "medios completos" cuando se complementan con suero, tal como se describe más adelante. Uno de tales medios es una versión ampliada del medio Eagle modificado por Dulbecco - baja glucosa (DMEM-LG), que es bien conocido y fácilmente disponible en el comercio.

La formulación comercial se complementa con 3700 mg/l de bicarbonato de sodio y 10 ml/l de 100x antibiótico - antimicótico que contiene 10.000 unidades de penicilina (base), 10.000 \mug de estreptomicina (base) y 25 \mug de anfotericina B/ml, utilizando penicilina G (sal sódica), sulfato de estreptomicina, y anfotericina B como FUNGIZONE® en solución salina al 0,85%.

El medio descrito anteriormente se prepara y se almacena en botellas de 90 ml por 100 ml o 450 ml por 500 ml a 4ºC hasta que esté listo para su utilización. Para su uso, se añaden 10 ml o 50 ml de suero bovino fetal (de lotes seleccionados) a las botellas de medio para dar un volumen final de 10% de suero. El medio se calienta hasta 37ºC antes de su uso.

A este respecto, también se encontró que el medio BGJ_{b} (Gibco, Grand Island, NY) con lotes probados y seleccionados de 10% de suero bovino fetal (J.R. Scientific, Woodland, CA, u otros proveedores) era muy adecuado para su uso en la invención. Este medio, que también era un "medio completo", contenía factores que también estimulaban el crecimiento de las células madre mesenquimatosas sin diferenciación y permitían la unión selectiva a través de sitios de unión de proteínas específicas, etc. de sólo las células madre mesenquimatosas a las superficies de plástico de las placas de Petri.

Además, también se encontró que el medio de mezcla de nutrientes F-12 (Ham) (Gibco, Grand Island, NY) mostraba las propiedades deseadas para la separación selectiva de las células madre mesenquimatosas.

Tal como se indicó anteriormente, el medio completo puede utilizarse en varios procedimientos de aislamiento diferentes, dependiendo del tipo específico de procedimientos de recogida inicial utilizados con el fin de preparar la médula ósea recogida para la separación de cultivo celular. A este respecto, cuando se utilizaron tapones de médula ósea esponjosa, la médula se añadió al medio completo y agitó en vórtex para formar una dispersión que después se centrífugo para separar las células de la médula de los fragmentos de hueso, etc. Las células de la médula (que consisten predominantemente en eritrocitos y leucocitos, y una cantidad muy pequeña de células madre mesenquimatosas, etc.) se disociaron entonces en células individuales mediante pasos secuenciales al medio completo que contenía las células de la médula a través de jeringas en las que se habían colocado agujas de calibre 16, 18, y 20. Se cree que la ventaja obtenida mediante la utilización del procedimiento de separación mecánica, en oposición a cualquier procedimiento de separación enzimática, era que el procedimiento mecánico producía escaso cambio celular, mientras que un procedimiento enzimático producía una lesión celular particularmente en los sitios de unión de proteínas, necesarios para la adherencia del cultivo y la separación selectiva, y/o a los sitios de proteínas necesarios para la producción de anticuerpos monoclonales específicos para dichas células madre mesenquimatosas. La suspensión de células individuales (que se obtuvo de aproximadamente 50 - 100 x 10^{6} células nucleadas) se sembró posteriormente en placas de 100 mm con el objeto de separar selectivamente y/o de aislar las células madre mesenquimatosas a partir de las células restantes encontradas en la suspensión.

Cuando se utilizó aspirado medular como la fuente de las células madre mesenquimatosas humanas, las células madre mesenquimatosas (que contenían pocas o ninguna astilla de hueso pero una gran cantidad de sangre) se añadieron al medio completo y se fraccionaron con gradientes de Percoll (Sigma, San Luis, MO). Los gradientes de Percoll separaron un gran porcentaje de los eritrocitos y las células hematopoyéticas mononucleadas de la fracción de plaquetas de baja densidad, que contenía las células madre mesenquimatosas derivadas de la médula. A este respecto, la fracción de plaquetas, que contenía aproximadamente 30 - 50 x 10^{6} células, se componía de una cantidad indeterminada de plaquetas, 30 - 50 x 10^{6} células nucleadas, y sólo aproximadamente 50 - 500 células madre mesenquimatosas, dependiendo de la edad del donante de médula. La fracción de plaquetas de baja densidad se cultivó en placa entonces, en la placa de Petri para la separación selectiva basada en la adhesión celular.

A este respecto, las células de la médula obtenidas de aspirado de hueso esponjoso o ilíaco (es decir, los cultivos primarios) se hicieron crecer en medio completo y se permitió que se adhirieran a la superficie de las placas de Petri durante de uno a siete días, según las condiciones expuestas en el ejemplo 1 de más adelante. Puesto que se observó un desprendimiento celular mínimo después del tercer día, se eligieron tres días como la duración de tiempo estándar en la que las células no adheridas se eliminaron de los cultivos sustituyendo el medio completo original por medio completo nuevo. Los cambios de medio posteriores se realizaron cada cuatro días hasta que las placas de cultivo se volvieron confluentes, lo que normalmente requirió 14 - 21 días. Esto representaba un aumento de 10^{3} - 10^{4} veces en el número de células madre mesenquimatosas humanas no diferenciadas.

Entonces, se separaron las células de las placas de cultivo utilizando un agente de liberación tal como tripsina con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM (1X), Gibco, Grand Island, NY). El agente de liberación se inactivó entonces y las células madre mesenquimatosas no diferenciadas, cultivadas y separadas, se lavaron con medio completo para su uso posterior.

Aislamiento de células madre mesenquimatosas humanas no cultivadas

También es posible utilizar una preparación de células madre mesenquimatosas humanas, no homogéneas, no cultivadas y aisladas, en la composición y métodos de la invención. Las MSC pueden aislarse como preparaciones no homogéneas, no cultivadas, tal como mediante fraccionamiento con gradiente de densidad, de tejido tal como la médula ósea, la sangre (incluyendo sangre periférica), el periostio y la dermis, y otros tejidos que tienen orígenes mesodérmicos. A este respecto, se ha encontrado que aunque estas células madre mesenquimatosas están presentes normalmente en la médula ósea, por ejemplo, en cantidades mínimas y que estas cantidades disminuyen mucho con la edad (es decir, desde aproximadamente 1/10.000 células en un paciente relativamente joven hasta tan sólo 1/2.000.000 en un paciente anciano), las preparaciones de células madre mesenquimatosas humanas pueden aislarse del tejido, particularmente de la médula ósea, de modo que estén sustancialmente libres de otros tipos de células de la médula. Se contempla que la preparación con fraccionamiento aislada comprenderá células, de las cuales al menos aproximadamente el 90%, y preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, son células madre mesenquimatosas humanas.

Se obtiene la médula de fragmentos de hueso esponjoso de la cabeza femoral procedentes de pacientes con enfermedad degenerativa articular durante la cirugía de artroplastia de cadera o de rodilla. Además, también se obtiene la médula mediante aspirado ilíaco de donantes sanos y pacientes oncológicos a los que se les ha recogido médula para un futuro trasplante de médula ósea. Todos los pacientes oncológicos tienen cáncer no relacionado con las células estromales y sus células estromales expresan el cariotipo normal.

La médula ósea se aspira desde varios lugares del esternón, costilla y cresta ilíaca en condiciones estériles de trabajo. La aspiración es lenta para evitar la coagulación en la jeringa. Múltiples sitios de aspiración del hueso con uno o dos lugares de penetración en la piel proporcionan recuentos elevados de células nucleadas contaminadas con un volumen relativamente pequeño de sangre periférica diluida. La jeringa se dota con una aguja de aspiración esternal convencional, una aguja de trócar de aspiración de médula ósea de calibre 12 o aguja de trépano utilizadas para la recogida de médula ósea. Se recogen veinticinco ml de médula ósea en jeringas heparinizadas en 91000 unidades/litro de solución salina estéril).

La médula ósea humana se transfiere entonces a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifuga a baja velocidad hasta producir un sedimento celular. Se eliminan la grasa y el plasma del tubo de centrífuga mediante aspiración. El sedimento celular se resuspende en una disolución estéril que contiene base de Tris 20 mM y un 0,7% de cloruro de amonio. El pH se ajusta a 7,2 y la suspensión se centrifuga luego a baja velocidad para producir un sedimento celular. La disolución de Tris-NH_{4}Cl se aspira del sedimento celular y el sedimento se resuspende en 10 ml de medio DMEM. El sedimento resuspendido se estratifica cuidadosamente en un tubo de 50 ml que contiene 35 ml de Percoll^{MR} al 70%. El tubo se centrifuga a 460 x g durante 15 minutos. Se recoge con una pipeta el 25% superior del gradiente o 12,5 ml del gradiente de Percoll que contiene células madre mesenquimatosas, plaquetas y otras células. Esta fracción se trasfiere a un tubo de centrífuga de 50 ml al cual se han añadido 25 ml de medio. El tubo se invierte varias veces para suspender las células y luego se vuelve a centrifugar a baja velocidad para producir un sedimento. Este proceso se repite dos veces con nuevo medio.

La muestra de médula ósea humana se concentra entonces para eliminar el plasma y el aclarado de los eritrocitos, o bien mediante tratamiento con NH_{4}Cl tal como se describió anteriormente o bien mediante el paso de las muestras por un filtro Leukosorb^{MR} contenido en una jeringa, filtro de cartucho que elimina la grasa, los eritrocitos y el plasma. La fracción celular retenida por el filtro se eluye del filtro utilizando un tampón que contiene citrato sódico. Las células enriquecidas en MSC que eluyen del filtro se enriquecen entonces adicionalmente mediante su paso por una columna de hidroxiapatita que une preferentemente las MSC. El eluato del filtro de la jeringa que contiene médula ósea sin eritrocitos se pasa por una jeringa cargada con hidroxiapatita. La hidroxiapatita utilizada en este ejemplo se obtiene de Interpore Corp. (IP200). Se utilizan gránulos de hidroxiapatita porosa que tienen un tamaño mínimo de poro de 200 micrómetros y un tamaño máximo de poro de hasta 500 micrómetros. Las células se cargan en la jeringa que contiene hidroxiapatita en una etapa de transferencia estéril. Se permite que las células se unan durante 15 minutos y se deja que fluya a su través el tampón presente en las células. Entonces, se lava la jeringa una vez con 15 ml de medio (DMEM). La base de la jeringa que está roscada se desenrosca y el material del implante se empuja fuera de la jeringa con el émbolo, para el tratamiento adicional o para la aplicación intraoperatoria directa a un sitio de injerto.

Entonces, se realiza una separación de anticuerpos monoclonales, tal como sigue. Se acoplan Dynabeads M-450 (perlas magnéticas) (Dynal (r) Inc. Lake Success, NY) a anticuerpos monoclonales anti-MSC que tienen el número de registro de la ATCC HB 10743, HB 10744 y HB 10745, incubando el anticuerpo con Dynabeads recubiertas de anticuerpo secundario (2,0 \mug de anticuerpo anti-MSC/mg de Dynabead) en PBS durante 30 minutos a 4ºC. Se utiliza una disolución de perlas que contiene 1 x 10^{7} Dynabeads/ml. Se incuba el anticuerpo. Se recogen las Dynabeads poniendo la disolución que contiene las perlas y los anticuerpos en un concentrador de partículas magnéticas (Dynal MPC). Se elimina el sobrenadante mientras que las Dynabeads se mantienen en la pared del tubo de ensayo con el imán. Las Dynabeads se aclaran del anticuerpo libre lavando 5 veces con PBS. Tras el último lavado, las Dynabeads se recogen y se elimina el sobrenadante. A los 80 ml de Dynabeads se añaden 35 ml de médula ósea heparinizada. Las células se incuban con las Dynabeads durante 15 minutos con agitación. Las Dynabeads con las MSC unidas se recogen entonces utilizando el Dynal MPC. Se elimina el sobrenadante y las partículas magnéticas se lavan por concentración con PBS. Se recogen aproximadamente 200 x 10^{6} células sobre las Dynabeads. Las células se separan de las perlas incubando las perlas en 50 ml de una disolución que contiene un 1% de EDTA. La disolución de EDTA se elimina de las células mediante centrifugación a baja velocidad y da como resultado un sedimento celular adecuado para su uso en la invención.

Ejemplo 1 Condrogénesis in vitro utilizando dexametasona

En los estudios preliminares, se ha encontrado que las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula ósea de conejo, cultivadas durante 14 días y luego sembradas en cubos de cerámica o esponjas de colágeno e implantadas por vía subcutánea en ratones desnudos producirán hueso y cartílago en un plazo de 3 semanas (figura 1).

La presente invención contempla que la creación de una condensación precartilaginosa in vitro estimula la condrogénesis en las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula ósea posnatal, en la que tales poblaciones contienen células madre o progenitoras para los condrocitos. Esto se consiguió utilizando el sistema de cultivo de sedimento, que se desarrolló para su uso con células aisladas de placas de crecimiento (Kato et al., PNAS, 85:9552-9556, 1988; Ballock y Reddi, J Cell Biol, 126:1311-1318, 1994) y también se ha utilizado para mantener la expresión del fenotipo de cartílago de los condrocitos situados en cultivo (Solursh, J Cell Biochem, 45:258-260, 1991).

Se utilizaron células derivadas de médula ósea tanto humana como de conejo. Las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula ósea se recogieron de la tibia o cresta ilíaca de conejo blanco de Nueva Zelanda, mediante aspiración con una jeringa que contenía 3000 U de heparina. Estas células se cultivaron en placa a 20 millones/placa de 100 mm, en DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal y se hicieron crecer durante 14 días a 37ºC en CO_{2} al 5%, con cambios de medio cada cuatro días. Se realizó en primer lugar una selección de sueros para identificar los lotes de suero que apoyan la proliferación de estas células y producen la mayoría del hueso y cartílago de las células de primer paso en el ensayo de cubos de cerámica in vivo al que se hizo referencia anteriormente. Tras formarse las colonias de células adheridas sobre las placas de cultivo (aproximadamente 10 - 14 días), las células se retiraron de las placas con tripsina y se contaron. Se centrifugaron alícuotas de 200.000 células a 500 x g durante 10 minutos, en tubos cónicos de polipropileno de 15 ml en DMEM con un 10% de suero, ascorbato-2-fosfato 50 ng/ml, +/- dexametasona (DEX) 10^{-7} M y se incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante hasta 3 semanas. Después de 24 horas, cierta parte de las células había formado sedimentos en los tubos, quedando algunas células en una monocapa en los laterales del tubo. Después de 3 semanas, muchos de los sedimentos se habían desecho. De los sedimentos que quedaban, ninguno contenía células con el aspecto de condrocitos y no se encontró la tinción de colágeno de tipo II. Como alternativa al suero, se probó un complemento de medio definido (ITS + Premix^{MR}, Collaborative Biomedical Products). Este complemento se había utilizado previamente para el cultivo de sedimento de los condrocitos hechos crecer en placa (Ballock y Reddi, J Cell Biol, 126:1311-1318, 1994). El complemento consiste en DMEM con insulina (6,25 \mug/ml), transferrina (6,25 \mug/ml), ácido selenioso (6,25 \mug/ml), ácido linoleico (1,25 \mug/ml) y albúmina de suero bovino (5,35 \mug/ml), (las concentraciones dadas son las finales). A esto se añadió piruvato (1 mM), ascorbato-2-fosfato (50 \mug/ml), con o sin dexametasona (DEX) 10^{-7} M. Para algunos experimentos, no se sustituyó el medio que contenía un 10% de FBS. Las células centrifugadas se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se obtuvieron células de médula humana de donantes sanos mediante aspiración de la cresta ilíaca. Las condiciones de cultivo fueron idénticas a las utilizadas con las células de conejo. En un plazo de 24 horas de incubación, las células formaron un sedimento. Los cambios de medio se llevaron a cabo cada 2 días. Cuando se recogieron los sedimentos en los puntos de tiempo a los 21 días, se determinó la actividad fosfatasa alcalina de cada sedimento mediante incubación con fosfato de p-nitrofenilo y determinación de la absorbancia a 405 nm. Los valores de absorbancia obtenidos en un experimento típico para sedimentos incubados +/- DEX aumentaron de tres a cinco veces durante los primeros 14 días de cultivo y permanecieron en un nivel elevado hasta el día 21. Para los análisis histológicos e inmunohistoquímicos, se congelaron los sedimentos en OCT y se cortaron secciones de 5 \mum. Se realizaron la tinción con azul de toluidina y la inmunohistoquímica, esta última con anticuerpos contra los componentes de la matriz extracelular (figuras 2 y 3) incluyendo: anticuerpos anti-colágeno de tipos I, II y X y anti-glucosaminoglucano 3-B-3, 7-D-4 (sulfato de condroitina) y 5-D-4 (sulfato de queratano). Se detectó la reactividad o bien con anticuerpos secundarios unidos a FITC y microscopía de fluorescencia, o bien con anticuerpos unidos a fosfatasa alcalina y sustrato. También se extrajeron los sedimentos en guanidina 4 M, acetato de sodio 20 mM que contenía inhibidores de la proteasa y se sometieron a inmunolocalización tras separación mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia ("Western blotting").

Hacia el día 7 de cultivo, pudieron observarse algunas tinciones metacromáticas de partes de los sedimentos de medio definido +DEX con azul de toluidina. Hacia el día 14, los sedimentos +DEX contenían una evidente tinción metacromática alrededor de una región de células localizadas en el interior, que tenían el aspecto de condrocitos hipertróficos. Aquellas células en la periferia de los sedimentos siguieron siendo planas y no mostraron metacromatismo. Hacia el día 21, los sedimentos +DEX parecían un ovillo de condrocitos hipertróficos. Por el contrario, los sedimentos del medio definido -DEX se redujeron todos en tamaño y en muchos casos se deshicieron a los 21 días en cultivo. No fueron evidentes células hipertróficas obvias en ningún sedimento -DEX.

La inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra el colágeno de tipo II fue positiva en los sedimentos del medio definido +DEX ya a los 7 días en algunas muestras (figura 3A). Hacia el día 14, la matriz de la región de las células de tipo hipertrófico se tiñeron de manera positiva para el colágeno de tipo II (figura 3B). En algunos experimentos, todo el sedimento se tiñó de manera positiva para el colágeno de tipo II cuando se analizaron en el día 21 (figura 3C). En otros, una delgada región externa era aún negativa para el colágeno de tipo II. También se observó la tinción positiva para el colágeno de tipo X en el día 14 (figura 3D). La matriz de las células hipertróficas también se tiñó de manera positiva para el sulfato de condroitina (7-D-4 en la figura 3E; 3-B-3 en la figura 3F) y sulfato de queratano (5-D-4 en la figura 3G), con algunas diferencias en la distribución de la tinción. Ninguno de los sedimentos hechos crecer en ausencia de DEX tuvo una tinción positiva para el colágeno de tipo II. La inmunotinción de los extractos de sedimento, sometidos a inmunotransferencia y separados mediante SDS-PAGE, con anticuerpo anti-tipo II dio una banda positiva con la migración de cadenas \alpha (II) (figura 4). En experimentos posteriores, se encontró que este mismo medio definido, + DEX, no produjo condrogénesis ni en cultivos en monocapa ni en micromasas. Estas observaciones son importantes e indican que se requieren interacciones intercelulares iniciales para la condrogénesis. Por tanto, mediante una combinación de la creación de una condensación celular in vitro y la adición de los factores permisivos apropiados, se ha podido producir la condrogénesis en células procedentes de una fuente de médula ósea de mamífero posnatal.

Lo anterior muestra un sistema de cultivo en el que las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de médula ósea humana o de conejo se diferencian en condrocitos hipertróficos. La secuencia de acontecimientos se parece a la de la condrogénesis en la formación embrionaria de las extremidades. Puesto que se definen todos los componentes, el sistema puede utilizase para estudios de los efectos de los factores de crecimiento, etc., sobre la progresión de la condrogénesis. También es aplicable a estudios del control molecular de la condrogénesis de mamíferos desde las células progenitoras.

Este sistema utiliza una fuente posnatal y amplía los datos concernientes a las células progenitoras derivadas de la médula ósea. Se han utilizado sistemas in vitro por otras personas para mostrar que estas poblaciones celulares tienen potencial osteogénico y adipocítico; se demostró en el presente documento que al menos un subconjunto de esa población tiene potencial condrogénico. Este sistema facilitará el estudio del control de la condrogénesis y puede conducir a una comprensión de qué factores se requieren para estimular este proceso in vivo. Esto tiene aplicabilidad clínica para la reparación de cartílago.

Ejemplo 2 Condrogénesis in vitro utilizando dexametasona y TGF-\beta1

Se obtuvieron células mesenquimatosas derivadas de médula humana y de conejo y se sedimentaron tal como se describió en el ejemplo 1. Los medios de cultivo se modificaron tal como sigue.

Se cultivaron las células mesenquimatosas derivadas de médula de conejo tal como se describió en el ejemplo 1 con, o bien (i) la adición de TGF-\beta1 (10 ng/ml) o bien (ii) la adición de TGF-\beta1 (10 ng/ml) y la supresión de la dexametasona. Las células mesenquimatosas derivadas de médula humana se cultivaron tal como se describió en el ejemplo 1 con, o bien (i) la adición de TGF-\beta1 (10 ng/ml) o bien (ii) la adición de TGF-\beta1 (10 ng/ml) y la supresión de la dexametasona.

En los cultivos de células de conejo, se observó la diferenciación de las MSC en condrocitos, en presencia de TGF-\beta1, tanto con como sin dexametasona. En los cultivos de células humanas, se observó la diferenciación de las MSC en condrocitos en presencia de TGF-\beta1 con dexametasona, pero no en su ausencia.

Ejemplo 3 Condrogénesis in vitro utilizando dexametasona y BMP-2

Se obtuvieron células mesenquimatosas derivadas de médula de rata y se sedimentaron tal como se describió en el ejemplo 1. Los medios de cultivo se modificaron tal como sigue. Se cultivaron las células mesenquimatosas derivadas de médula de rata tal como se describió en el ejemplo 1, con la adición de BMP-2 a 10 ng/ml y 100 ng/ml en presencia o ausencia de dexametasona (10^{-7} M). Se observó la diferenciación de las MSC en condrocitos en presencia de TGF-\beta1 con dexametasona, pero no en su ausencia.

Claims (20)

1. \global\parskip0.970000\baselineskip

   1. Composición para la condrogénesis in vitro de células precursoras mesenquimatosas humanas y la formación in vitro de condrocitos humanos a partir de ellas, composición que comprende células madre mesenquimatosas humanas y aisladas, condensadas en una gran proximidad como células empaquetadas y al menos un agente de inducción de la condrogénesis en contacto con las mismas, en la que el agente de inducción de la condrogénesis es una combinación de dexametasona y TGF-\beta1.
2. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que las células madre mesenquimatosas son células madre mesenquimatosas humanas, expandidas en cultivo y aisladas.
3. 3. Composición según la reivindicación 1, en la que las células madre mesenquimatosas están en un entorno sin suero definido químicamente.
4. 4. Composición según la reivindicación 1, en la que las células empaquetadas son un sedimento de células centrifugadas.
5. 5. Procedimiento para producir condrocitos a partir de células madre mesenquimatosas, poniendo en contacto las células madre mesenquimatosas con un agente de inducción de la condrogénesis in vitro, en el que las células madre se condensan en una gran proximidad como células empaquetadas, en el que el agente de inducción de la condrogénesis es una combinación de dexametasona y TGF-\beta1.
6. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células madre mesenquimatosas son células madre mesenquimatosas humanas, expandidas en cultivo y aisladas.
7. 7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que las células madre mesenquimatosas están en un entorno sin suero definido químicamente.
8. 8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células empaquetadas son un sedimento de células centrifugadas.
9. 9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la etapa de puesta en contacto comprende cultivar un sedimento de células madre mesenquimatosas humanas en un medio sin suero, definido químicamente.
10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el medio sin suero, definido químicamente comprende (1) un medio esencial mínimo, definido químicamente; (2) ascorbato o un análogo del mismo; (3) una fuente de hierro; (4) insulina o un factor de crecimiento similar a la insulina.
11. 11. Método según la reivindicación 5, en el que las células se cultivan con la composición de agente de inducción de la condrogénesis y posteriormente se sitúan en un recipiente poroso y rígido.
12. 12. Método según la reivindicación 11, en el que el recipiente poroso y rígido es un cubo de cerámica.
13. 13. Procedimiento para inducir la condrogénesis en células madre mesenquimatosas poniendo en contacto las células madre mesenquimatosas con un agente de inducción de la condrogénesis in vitro, en el que las células madre se condensan en una gran proximidad como células empaquetadas, en el que el agente de inducción de la condrogénesis es una combinación de dexametasona y TGF-\beta1.
14. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células madre mesenquimatosas son células madre mesenquimatosas humanas, expandidas en cultivo y aisladas.
15. 15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que las células madre mesenquimatosas están en un entorno sin suero definido químicamente.
16. 16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células empaquetadas son un sedimento de células centrifugadas.
17. 17. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la etapa de puesta en contacto comprende cultivar un sedimento de células madre mesenquimatosas humanas en un medio sin suero, definido químicamente.
18. 18. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el medio sin suero, definido químicamente comprende (1) un medio esencial mínimo, definido químicamente; (2) ascorbato o un análogo del mismo; (3) una fuente de hierro; (4) insulina o un factor de crecimiento similar a la insulina.
19. 19. Método según la reivindicación 13, en el que las células se cultivan con la composición de agente de inducción de la condrogénesis y posteriormente se sitúan en un recipiente poroso y rígido.
20. 20. Método según la reivindicación 19, en el que el recipiente poroso y rígido es un cubo de cerámica.