ES2253318T3 - Cribado in vitro de ligandos del receptor de estrogeno. - Google Patents
Cribado in vitro de ligandos del receptor de estrogeno.Info
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Abstract
Un método para el cribado in vitro de ligandos del receptor de estrógeno (ER) con actividad neurotrópica específica por medio del uso secuencial de al menos dos sistemas de ensayo que comprende i. usar un sistema de ensayo celular o de tejidos que contiene ER y un gen informador accionado por ER para detectar la activación de la transcripción que se mide detectando la concentración eficaz del ligando de ER, requerida para la inducción transcripcional semimáxima del gen informador dependiente de ER (EC50), y seleccionar el ligando que induce la transcripción, y ii. usar un sistema de ensayo libre de células o enzimático para medir la interacción fisicoquímica del coactivador 1 del receptor de esteroide (SRC-1), o sus fragmentos NID-1, NID-2 o NID-3 con la proteína de ER con la unión de un ligando seleccionado en el primer sistema de ensayo, que se mide detectando la dosis de ligando de ER requerida para la aparición de las primeras señales significativas (más de 2 veces la desviación estándar a partir de la línea base) de la interacción fisicoquímica entre el ER activado y una cantidad definida de SRC-1 o un fragmento del mismo, en el que el reclutamiento de SRC-1 o de sus fragmentos se refiere al incremento en la interacción proteína-proteína entre ER y SRC-1 o sus fragmentos por encima de la tasa de interacción basal medida en ausencia de cualquier ligando activador de ER, en el que los agonistas de ER con propiedades neurotrópicas selectivas son aquellos que muestran valores menores o iguales a 10 nmoles/l en el sistema de ensayo (i), y valores mayores o iguales a 100 nmoles/l en el sistema de ensayo (ii).
Description
Cribado in vitro de ligandos del receptor
de estrógeno.
La invención se refiere a un método in
vitro para detectar ligandos y al cribado in vitro de
ligandos del receptor de estrógeno que tienen propiedades sistémicas
mínimas y neurotrópicas semejantes a estrógenos. La invención se
refiere además a un uso in vitro de un coactivador 1 del
receptor de esteroides (SRC-1) para detectar
ligandos del receptor de estrógeno que tienen propiedades
definidas.
La Solicitud Internacional WO 99/42108, de
PATCHEV et al., describe esteroides como medicamento para
suplementar selectivamente la carencia de estrógenos en el sistema
nervioso central, sin influir en otros órganos o sistemas. Tales
compuestos (ligandos) tienen propiedades neurotrópicas selectivas;
no afectan a otros órganos sensibles a estrógenos. El efecto
neurotrópico selectivo sobre el sistema nervioso se estudió en
modelos de animales.
El perfil deseado de fármacos para el tratamiento
de síntomas de carencia de estrógenos en el sistema nervioso
central requiere que estos fármacos actúen sobre genes diana en el
cerebro, dependientes de estrógenos, a la vez que tengan sólo
efectos menores o no tengan ningún efecto en órganos del sistema
reproductivo sensibles a estrógenos (por ejemplo, endometrio, mama,
pituitaria).
Los estrógenos tienen un gran número de efectos
sobre el sistema nervioso central (SNC). Los efectos mentales de los
estrógenos dan como resultado un "cableado duro" irreversible
de los circuitos neuronales, lo que determina varios aspectos de la
función cerebral [V.K. Patchev y O.F.X. Almeida, Steroid
hormone-dependent organization of neuroendocrine
functions, R.G. Landes Company, Austin, 1999].
En el cerebro maduro, los niveles fisiológicos de
estrógenos, derivados de las gónadas, influyen en el control de las
funciones reproductoras así como las actividades cerebrales que no
están relacionadas con la reproducción ni con el comportamiento
sexual, tales como el aprendizaje, la memorización, la orientación
espacial, la emotividad y el procesamiento de información cognitiva
[S.E. Alves y B.S. McEwen, Estrogen and brain function: Implications
for aging and dementia; en M. Oettel y E. Schillinger, eds.,
Estrogens and Antiestrogens, Handbook of Experimental Pharmacology,
vol. 135/I, Springer, Berlin, Heidelberg, 1999, p.
315-328]. La mayoría de los efectos neurotrópicos
de los estrógenos están relacionados con la regulación
transcripcional de genes diana; esta regulación se induce activando
receptores de estrógeno en distintas áreas neuronales.
El receptor de estrógeno (ER) existe en dos
isoformas, ER\alpha y ER\beta, cuya distribución y unión a
ligandos se han descrito [V. GIGUERE et al. (1998) Estrogen
receptor \beta: re-evaluation of estrogen and
anti-estrogen signaling; Steroids Vol. 63, p.
335-339 y G.G. KUIPER et al. (1997) The novel
estrogen receptor subtype: potential role in the cell- and
promoter- specific actions of estrogens and
anti-estrogens, FEBS Lett, Vol. 410: p.
87-90]. El receptor de estrógeno activado por
ligandos se une a secuencias de ADN específicas, denominadas
elementos sensibles a estrógenos (ERE), en los promotores de genes
sensibles a estrógenos, influyendo de este modo en su transcripción
como un factor de transcripción activado por ligandos. Ambas
isoformas de ER están presentes en el cerebro, y tienen una
distribución distinta, que no siempre se solapa, en regiones del
cerebro discretas y funcionalmente diferentes [P.J. Shughrue et
al., Comparative distribution of estrogen
receptor-a y -b mRNA in the rat central nervous
system, J. Comp. Neurol., Vol. 388, p. 507-525,
1997]. Con la unión de un ligando natural o sintético, y antes del
acoplamiento en los ERE a fin de influir en la transcripción de los
genes diana, el ER puede reclutar coactivadores intrínsecos y
proteínas adaptadoras que sirven como moduladores (amplificadores o
atenuadores) de la transcripción del gen diana mediada por el
ER.
El coactivador 1 del receptor de esteroides
(SRC-1) es un miembro de una familia de proteínas
celulares y actúan como "amplificadores" de la transcripción
mediada por receptores nucleares que son activados mediante la unión
a ligandos [S.A. Onate et al., Sequence and characterization
of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily,
Science, vol. 270, p. 1354-1357, 1995]. La
coactivación mediada por SRC-1 de la transcripción
controlada por el receptor de estrógeno (ER) requiere la presencia
de ER en conformación agonista, e implica el reclutamiento de
mediadores adicionales (por ejemplo, CBP/p300). Sin embargo, también
se han identificado dominios de activación autónomos [D. Robyr
et al., Nuclear hormone receptor coregulators in action:
Diversity for shared tasks, Mol. Endocrinol., vol. 14, p.
329-347, 2000].
El SRC-1 se expresa ampliamente
en órganos diana estrogénicos y en tumores sensibles a estrógenos
[BERNS et al. (1998) Predictive value of
SRC-1 for tamoxifen response of recurrent breast
cancer, Breast Cancer Res. Treat. Vol. 48, 97-92,
adicionalmente NEWMANN et al. (2000) Cofactor competition
between the ligand-bound estrogen receptor and an
intron 1 enhancer leads to estrogen repression of ERBB2 expression
in breast cancer, Oncogene, Vol. 19, 490-497, y
LABRIE et al., (1999) a third generation SERM acting as pure
anti-estrogen in the mammary gland and endometrium,
J. Steroid Biochem. Mol. Biol. Vol. 69, 51-84]. Si
el SRC-1 se inactiva mediante selección de dianas
génicas, se puede detectar resistencia parcial a estrógenos en
varios tejidos, tales como útero, próstata, testículos y glándula
mamaria [XU et al. [1998] Partial hormone resistance in mice
with disruption of the steroid receptor
coactivator-1 (SRC-1) gene, Science,
Vol. 279, 1922-1925]. Sin embargo, los mutantes
completos de SRC-1 homocigotos fracasaron a la hora
de demostrar alteraciones en las funciones cerebrales en
comparación con el fenotipo natural. Estos resultados enseñan que el
SRC-1 puede no desempeñar un papel en la modulación
de la señalización química en el SNC mediada por el ER. La
publicación de O.C. MEIJER, P.J. STEENBERGEN y E.R. DE KLOET (2000)
Differential expression and regional distribution of steroid
receptor coactivators SRC-1 and
SRC-2 in brain and pituitary, Endocrinology, Vol.
141, p. 2192-2199, describe dos isoformas de
SRC-1, a saber, SRC-1a y
SRC-1e, en el cerebro de rata adulta, distribuidas
en regiones distintas. El SRC-1 se expresa en
muchas áreas cerebrales, incluyendo el hipocampo, el núcleo
amigdalino, el hipotálamo, los núcleos basales y la isocorteza, que
sirven a distintas funciones con respecto al procesamiento o
regulación cognitiva de funciones relacionadas con la reproducción,
y son bien conocidas por su sensibilidad a estrógenos.
La publicación de Lascombe et al.,
Estrogenic activity assessment of environmental chemicals using
in vitro assays: Identification of two new estrogenic
compounds, Environmental Health Perspectives, vol. 108, p.
621-629, 2000, describe que los xenoestrógenos que
son capaces de unirse y de activar la transcripción informadora, vía
el ERalfa, fracasan a la hora de inducir una interacción
significativa entre el ER y el SRC-1. Estos
hallazgos sólo confirman el punto de vista de que el grado de
reclutamiento de SRC-1 por el ER unido a ligando
depende enormemente de cambios conformacionales del ER que están
especificados por la molécula del ligando. Sin embargo, estos
autores no presuponen la utilidad de la disociación entre la
afinidad del ligando por el ER y la modificación resultante del
receptor responsable del reclutamiento o recuperación del SRC para
la identificación de ligandos de ER con actividad neurotrópica
selectiva.
En Hanstein et al., Functional analysis of
a novel estrogen
receptor-beta-isoform, Molecular
Endocrinology, vol. 13, p. 129-137, 1999, se sugiere
que la isoforma beta2 del ER fracasa a la hora de interactuar con el
SRC-1. La publicación de Needham et al.,
Differential interaction of steroid hormone receptors with LXXLL
motifs of SRC-1a depends on residues flanking the
motif, vol. 72, p. 35-46, 2000, muestra que el
ERbeta2 unido a ligando es tan capaz de interaccionar con el
SRC-1 como lo son otras isoformas conocidas del ER.
Sin embargo, estos autores revelaron que esta interacción está
apoyada por uno de los cuatro motivos distintos en
SRC-1, lo que permite interacciones de esta
proteína con diversos receptores nucleares. A la vista de estos
hallazgos, se debe concluir que los datos dados a conocer en esta
publicación resultaron del uso de un sistema experimental en el que
el motivo crítico de SRC-1 que interactúa con el ER
no es accesible por igual.
Es el problema de la invención proporcionar un
cribado in vitro para detectar ligandos del receptor de
estrógeno que tengan efectos semejantes a estrógenos en áreas del
SNC que tienen funciones cerebrales no relacionadas con la
reproducción. Al mismo tiempo, los ligandos no deben ser eficaces en
órganos diana estrogénicos distintos del cerebro. Tales ligandos
del receptor de estrógeno, que son selectivos para el SNC, se pueden
usar para la prevención y terapia de trastornos del SNC provocados
por carencia de estrógeno. Tales ligandos evitarán los efectos
secundarios que tiene la administración de estrógenos en el
endometrio y en la mama, y en el control neuroendocrino de la
secreción de gonadotropina.
El problema de la invención se logra mediante un
método de un cribado in vitro de ligandos del receptor de
estrógeno (ER) con actividad neurotrópica específica, e implica
seleccionar y detectar por medio del uso secuencial de al menos dos
sistemas de ensayo que comprenden las siguientes etapas:
- (i)
- usar un primer sistema de ensayo celular o de tejidos que contiene ER y un gen informador accionado por ER para detectar la activación de la transcripción que se mide detectando la concentración eficaz del ligando de ER, requerida para la inducción transcripcional semimáxima del gen informador dependiente de ER (EC_{50}), y seleccionar el ligando inductor de la transcripción, y
- (ii)
- usar un segundo sistema de ensayo libre de células o enzimático para medir la interacción fisicoquímica del coactivador 1 del receptor de esteroide (SRC-1) o sus fragmentos NID-1, NID-2 o NID-3 con la proteína de ER con la unión de un ligando seleccionado en el primer sistema de ensayo, que se mide detectando la dosis del ligando de ER requerida para la aparición de los primeros signos significativos (más de 2 veces la desviación estándar desde la línea base) de la interacción fisicoquímica entre el ER activado y una cantidad definida de SRC-1 o un fragmento del mismo, en el que el reclutamiento de SRC-1 o sus fragmentos se refiere al incremento en la interacción proteína-proteína entre ER y SRC-1 o sus fragmentos por encima de la tasa de interacción basal medida en ausencia de cualquier ligando activador de ER,
en el que los agonistas de ER con
propiedades neurotrópicas selectivas son aquellos que muestran
valores menores o iguales a 10 nmoles/l en el sistema de ensayo (i)
y valores mayores o iguales a 100 nmoles/l en el sistema de ensayo
(ii).
La expresión "fragmentos" sólo representa
NID 1, 2 ó 3 (dominios inactivadores nucleares, Caja I de NR de
SRC1a 632-QTSHKLVQLLTTTAEQQ-648;
Caja II de NR de SRC1a
689-ERHKILHRLLQEGSPSD-705; Caja III
de NR de SRC1a
750-KDHQLLRYLLDKDEKDL-766, que
también se definen en: Xiu Fen Ding, Carol M. Anderson, Han Ma, Heng
Hong, Rosalie M. Uht, Peter J. Kushner y Michael R. Stallcup (1998)
en Molecular Endocrinology 12 (2):302-313 Copyright©
1998 por The Endocrine Society; Nuclear
Receptor-Binding Sites of Coactivators
Glucocorticoid Receptor Interacting Protein 1 (GRIP1) and Steroid
Receptor Coactivator 1 (SRC-1): Multiple Motifs with
Different Binding Specificities.
La secuencia de los sistemas de ensayo en (i) y
(ii) se puede cambiar. El sistema de ensayo es tal sistema de
ensayo que se usa preferiblemente primero como un sistema de ensayo
que conduce al menor número de selecciones positivas o al menor
trabajo. En todos los casos en los que se conoce la actividad
estrógena de un ligando, sólo se ha de llevar a cabo el segundo
sistema de ensayo que implica la combinación de ER y del coactivador
SRC-1.
El uso secuencial de los sistemas de ensayo
descritos en (i) y (ii) permitirá la selección de ligandos
preferidos, es decir, compuestos que inducen muy poca o pocas
interacciones de SRC-1 cuando se miden en un sistema
de ensayo (ii) a una concentración definida, en comparación con la
dosis requerida para producir la actividad transcripcional
semimáxima en el sistema de ensayo (i).
Además, el objetivo se logra mediante un método
de cribado in vitro de ligando de ER con actividad
neurotrópica específica que implica seleccionar y detectar por medio
del uso secuencial de al menos dos sistemas de ensayo como se
establece anteriormente en los que el ligando es capaz de inducir la
transcripción de un gen informador dependiente de ER a una dosis
igual o menor que 10 nM en el primer sistema de ensayo, y en los que
la concentración molar del ligando que se requiere para la
aparición de una interacción proteína-proteína
significativa (más de 2 veces la desviación estándar desde la línea
base) entre el ER coexpresado y el SRC-1, o uno de
sus fragmentos NID-1, NID-2 o
NID-3, en un sistema de ensayo, es igual o mayor que
100 nM.
In vivo: "técnicas in vivo"
significa métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal
mediante cirugía o métodos de terapia y de diagnóstico practicados
sobre el cuerpo humano o animal.
In vitro: la expresión "in
vitro" excluye todas las técnicas y métodos in vivo
mencionados anteriormente. La expresión in vitro en esta
Solicitud significa además cultivos, tales como cultivos celulares,
cultivos de tejidos, partes de órganos, órganos, sistemas de
órganos y secciones de partes del cuerpo animal, especialmente el
cuerpo humano. Todas estas muestras se retiran del organismo animal
o humano. La muestra no se reintroducirá en el organismo animal
(incluyendo el ser humano). Se da preferencia a la expresión
"in vitro" que representa a experimentos científicos
y/o comerciales caracterizados por un sistema artificial que usa
células, fracciones de las mismas, componentes purificados u
homogenatos, fuera de un organismo vivo.
Ligandos: la expresión "ligando"
comprenderá todos los tipos de sustancias químicas de origen natural
o producidas sintéticamente que son capaces de unirse a ER,
mientras que no recluten SRC-1 con la unión a ER,
y/o que tienen un efecto de transcripción neurotrópico, selectivo,
semejante a estrógenos, en el tejido del sistema nervioso central,
y que no tienen efectos biológicos sobre los tejidos del sistema
reproductor. En este texto, el ligando es la sustancia de
ensayo.
Detección: el producto génico del elemento
de respuesta a estrógeno se puede identificar mediante diferentes
sistemas, como ELISA, RIA, o sistemas de ensayos enzimáticos, en los
que se mide la función del producto del ERE. Tales métodos se
describen en los manuales.
Ensayo celular o de tejido: esta
expresión, en esta Solicitud, significa además ensayos que usan
cultivos, tales como cultivos celulares, cultivos de tejidos, partes
de órganos, órganos, sistemas de órganos y secciones de partes del
cuerpo animal, especialmente el cuerpo humano.
Actividad transcripcional y detección de la
misma: la actividad transcripcional representa el grado mediante
el cual la cantidad de un ARNm que codifica una proteína definida
cambia como resultado de una influencia externa (fármaco) sobre la
región promotora del gen correspondiente.
El segundo sistema de ensayo se basa en el
mecanismo del reclutamiento del coactivador, y sólo indirectamente
en la transcripción. El reclutamiento del coactivador estimula en
este caso la transcripción, que sólo se puede activar en ausencia de
un coactivador en menor grado. En esta invención, el núcleo de la
invención es la descripción del sistema de ensayo libre de células o
enzimático, en el que el reclutamiento del coactivador se mide sin
generar resultados de la propia transcripción. La persona experta en
la técnica está familiarizada con el hecho de que el sistema de
ensayo en presencia del coactivador SRC-1 conduce
evidentemente por sí mismo a un incremento en la transcripción.
Tal correlación entre la activación de la
transcripción modulada por ER y el reclutamiento del coactivador se
describe, por ejemplo, en el documento WO 99/18124 de Cummings et
al publicado del 15 de abril de 1999. En KAMEI et al.
(1996) Cell Vol. 85, páginas 403-414 se describen
métodos más antiguos. Tales métodos implican, entre otras cosas, la
construcción de proteínas de fusión, la preparación de proteínas
marcadas con ^{32}P, la construcción de vectores de expresión
especializados, es decir para el ensayo de dos híbridos de levadura
y los ensayos de activación transcripcional, la utilización de
muchos geles, y la producción de anticuerpos. Los métodos se
aprovechan de la unión, dependiente del ligando, de receptores y
coactivadores nucleares. En ausencia del ligando, la unión entre el
receptor nuclear y el coactivador del receptor nuclear no se
produce. Si el ligando está presente, sin embargo, se produce tal
unión, y se puede detectar mediante transferencia de energía de
resonancia mediante fluorescencia (FRET) entre un receptor nuclear
marcado fluorescentemente y un receptor nuclear marcado
fluorescentemente y el coactivador marcado fluorescentemente. Otros
ligandos se pueden identificar en virtud de su habilidad para
evitar o interrumpir -en diferente grado (o con una potencia
diferente) la interacción, inducida por el agente, de los
coactivadores del receptor nuclear. El receptor nuclear o su dominio
de unión a ligando se marca con un reactivo fluorescente para uso en
los métodos descritos anteriormente para detectar ligandos de
receptores nucleares.
Potencia: potencia es el valor de la
concentración del ligando según se determina mediante la EC_{50}
(la dosis requerida para el efecto semimáximo sobre un parámetro
diana que está influido específicamente por un receptor unido a
este ligando). La potencia depende principalmente de la afinidad de
la unión entre ligandos individuales y el receptor, así como de los
cambios conformacionales, inducidos por el ligando, en la proteína
receptora, los cuales pueden alterar la fuerza de la transmisión de
la señal química.
Control de ER: el control de ER se
describe ampliamente en el apartado que describe el estado de la
técnica.
Gen informador: genes o fragmentos génicos
que están enlazados o acoplados a otros genes o secuencias
reguladoras a fin de detectar la actividad de tales secuencias. Los
genes informadores tienen que producir productos génicos que sean
fácilmente detectables. Además, los productos génicos no deben ser
tóxicos para los organismos que expresen estos productos. Los genes
informadores se describen en Methods in Enzimol. Vol. 152, páginas
709-713 (1987). Otros métodos se describen en el
documento WO 00/37681 de HARRIS et al. (publicado el 29 de
junio de 2000), y en el documento WO 99/11760 de KUSHNER et
al. (publicado el 11 de marzo de 1999).
Transcripción: síntesis de ARN con la
ayuda de ARN polimerasa en la dirección 5' \rightarrow 3' usando
ADN como molde. La transcripción es el proceso de transferencia de
la secuencia de ADN de una de las dos hebras de ADN en una secuencia
de ARN monocatenaria.
Activación de la transcripción: esta
expresión se refiere al aumento en la actividad del gen informador
regulada/dependiente del ER por encima de la tasa de transcripción
basal que se observa en ausencia de un ligando.
Regulación: molécula que tiene un efecto
sobre la tasa de transcripción del ER. La activación comprenderá
cualquier tasa de transcripción más elevada. La disminución
representa una reducción de la tasa de transcripción. La tasa de
transcripción basal es el valor en condiciones de ausencia de
ligando, condiciones las cuales son compatibles en los diferentes
sistemas de ensayo (comprendiendo al menos un sistema de ensayo el
ER, y comprendiendo el otro sistema de ensayo ER junto con
SRC-1).
Sistema libre de células: para obtener un
sistema libre de células, se destruyen las membranas celulares o
las paredes celulares, y los fragmentos de membranas celulares y
fragmentos de paredes celulares se retiran parcial o completamente,
por ejemplo, mediante centrifugación, de la parte interna de las
células (citosol). Los componentes orgánicos contenidos en tales
compartimientos celulares pueden mantener su capacidad para entrar
en interacciones bioquímicas que son características de la célula
intacta.
Ensayo enzimático: en los ensayos
enzimáticos, se usan enzimas específicas y, si es necesario,
cofactores, para catalizar sustratos específicos. Se miden los
cambios en las concentraciones de los sustratos y de los productos.
Los ensayos enzimáticos comprenden normalmente una cascada de
enzimas especiales y sustratos.
Reclutamiento del coactivador: el
reclutamiento de SRC-1 se refiere a un incremento en
la interacción proteína-proteína entre ER y
SRC-1 por encima de la tasa de interacción basal
medida en ausencia de cualquier ligando activador de ER.
Reclutamiento: el reclutamiento de
SRC-1 se refiere a la comparación de los grados de
asociación mediante interacción proteína-proteína
entre ER copresente y SRC-1 en ausencia o en
presencia de un agonista de ER. Numéricamente, el reclutamiento se
define mediante la concentración molar de agonista de ER que se
requiere para la aparición de una interacción
proteína-proteína significativa (más de 2 veces la
desviación estándar a partir de la línea base) entre ER coexpresado
y SRC-1 en un sistema de ensayo. La línea base se
define mediante la interacción medida en un sistema de ensayo
idéntico al que no se ha añadido antagonista de ER.
El método de cribado in vitro basado en la
invención puede seleccionar compuestos naturales o sintéticos que
tienen actividad neurotrópica específica basada en su capacidad para
ejercer una fuerte activación transcripcional a través del ER sin el
fuerte reclutamiento simultáneo de SRC-1. El método
de cribado basado en la invención excluye la experimentación animal.
Las tecnologías in vitro del estado de la técnica para la
identificación de tales ligandos usan parámetros sustitutos (tales
como el alargamiento de los procesos neuronales, la supervivencia
con impacto neurotóxico) que no pueden predecir las disociaciones
entre la eficacia sistémica (por ejemplo, uterotrópica) y la
eficacia neurotrópica de los ligandos. En el estado de la técnica
falta un criterio definido para determinar la eficacia neurotrópica
selectiva de ligandos relacionados con estrógenos. La selección del
ligando depende de comparaciones entre efectos sistémicos y
neurotrópicos, lo que hace obligatorio el uso de animales.
La ventaja obvia de la invención es que ya no son
necesarios los ensayos con animales para encontrar ligandos que no
feminicen al animal o a la persona que tome los ligandos.
En el estado de la técnica fue necesario al menos
un sistema de ensayo que usa animales.
La etapa inventiva está apoyada por la
comparación de los resultados del estado de la técnica y los del
ensayo de la invención que muestran sorprendentemente una expresión
diferencial de SRC-1 tanto en diferentes partes del
cerebro como a diferentes edades del desarrollo del individuo.
Se encontró lo siguiente en la corteza cerebral:
cuanto más viejo es el animal, menor es la presencia de
SRC-1 en esta región del cerebro. De este modo, hay
muy poca probabilidad de que la neuroprotección y reparación
mediadas por el receptor de estrógeno impliquen el reclutamiento de
SRC-1 y la amplificación de la señalización de ER en
esta región del cerebro.
Se encontró lo siguiente en el núcleo
ventromedial: la creciente presencia de SRC-1 en
fases críticas de la maduración sexual y en la etapa adulta sugiere
que este coactivador apoya la señalización de ER en esta región del
cerebro en asociación con el control de la función sexual.
Esta expresión diferencial a lo largo de la vida
no se ha mencionado en el estado de la técnica. Por lo tanto, el
método de cribado da una herramienta técnica sensible para encontrar
ligandos que se pueden usar para el tratamiento y la prevención de
la neurodegeneración en la corteza cerebral, y de este modo es un
método útil para el tratamiento y la prevención de trastornos
cognitivos, trastornos afectivos, enfermedades de Alzheimer e
isquemia/apoplejía cerebral relacionados con la edad.
Los ligandos encontrados mediante los métodos de
cribado de la invención se pueden usar para mantener las funciones
normales celulares del sistema nervioso, y para prevenir y tratar el
deterioro patológico de estas funciones.
Los mutantes completos de SRC-1
homocigóticos no tienen alteraciones obvias en la función cerebral
[XU et al. (1998) Partial hormone resistance in mice with
disruption of the steroid receptor coactivator-1
(SRC-1) gene, Science, Vol. 279,
1922-1925]. Estos resultados no sugieren que el
SRC-1 desempeña un papel en la modulación de la
señalización química mediada por ER en el SNC.
C. MEIJER, P. J. STEENBERGEN y E.R. DE KLOET
(2000), Vol. 141, p. 2192-2199, describen la
distribución de SRC-1 en células de diferentes áreas
del cerebro. Para estos experimentos, sólo se usaron ratas de la
misma edad. La función de la expresión de SRC-1 en
el cerebro no fue caracterizada por los autores. Los resultados del
ensayo describen sólo la presencia o ausencia de expresión de
SRC-1 en el cerebro. La tasa de expresión no se
midió cuantitativamente. A partir de esta descripción, no se puede
deducir que el SRC-1 puede modular cualquier
transmisión de señal mediante receptores de estrógeno en el sistema
nervioso en un contexto específico de una región. La publicación de
MEIJER et al. es descriptiva, y no implica la cuantificación
de la expresión de SRC-1 en regiones discretas del
cerebro, ni discute los resultados en el contexto de la señalización
mediada por ER.
Se obtuvieron ratas Wistar macho y hembra a
partir de madres preñadas (Max Planck Institute of Psychiatry,
Munich, Alemania). Dentro de las primeras 24 horas tras el
suministro, las camadas se escogieron hasta 6 cachorros. Los
animales se enjaularon en condiciones controladas de iluminación
(luz/oscuridad 12/12 horas, luz entre 7:00 am y 7:00 pm), de
temperatura (22-24ºC) y de humedad (60 por ciento),
y tuvieron acceso libre a una dieta estándar de laboratorio y a
agua del grifo. Con el destete a la edad de 22 días, las ratas se
separaron de sus madres, y se agruparon según el sexo en colonias
de 5. El período de pubertad en las hembras se monitorizó
comprobando la abertura vaginal y la aparición de cambios cíclicos
en el epitelio vaginal, según se determina mediante frotis diarios
del cuello uterino tomados entre las edades de 35 y 45 días.
Los animales se sacrificaron por decapitación a
las siguientes edades: día 1 (dentro de las 24 horas tras el
nacimiento), día 7, día 40 a 45 (en la pubertad, como se define en
las hembras) y en el día 90 (madurez sexual). Las hembras púberes y
sexualmente maduras se sacrificaron en la etapa del diestro. Los
cerebros se retiraron del cráneo (excepto para los de las ratas
neonatas) y se congelaron instantáneamente en isopentano
preenfriado. El tejido se almacenó a -80ºC hasta que se seccione.
Los procedimientos experimentales cumplieron las normas regionales y
nacionales sobre protección de animales.
Un fragmento de EcoRI de 622 bases, que
corresponde a los pb 1125-1743 del ADNc del
SRC-1A humano (U90661), se purificó y se clonó en
el vector pBS (Stratagene GmbH; Heidelberg, Alemania). Con la
amplificación, la confirmación de secuencias y la linealización con
nucleasas de restricción apropiadas, se sintetizaron ARNc mediante
transcripción in vitro usando T3 y T7 polimerasas para sondas
antisentido y sentido, respectivamente. El marcado radioactivo se
obtuvo con ^{35}S-UTP y -CTP (NEN Life Science
Products GmbH; Cologne, Alemania). El ARNc marcado se extrajo
mediante fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, y se purificó en
columnas Nuctrap (Stratagene). La actividad específica de las
sondas usadas superó 10^{6} cpm/\mul.
Se obtuvieron criosecciones coronarias de 15
\mum de grosor que contienen el núcleo preóptico medial (MPN) y
el núcleo ventromedial hipotalámico (VMN) a partir de cerebros de
rata adulta al nivel del bregma -0,51 y -2,45 mm, respectivamente
[L.W. Swanson, Brain maps: Structure of the rat brain; Elsevier,
Amsterdam, 1998]. En animales púberes, jóvenes y neonatos, se
seleccionaron muestras que contienen las dos regiones de interés a
partir de secciones en serie rostrocaudales. Las secciones del VMN
también contenían la parte superior de la formación del hipocampo y
el complejo nuclear amigdalino. Las secciones se montaron sobre
portaobjetos revestidos con gelatina. La fijación, la
permeabilización, la hibridación con sondas marcadas con ^{35}S y
el lavado de restricción se realizaron según un protocolo
estandarizado [H.J. Whitfield et al., Optimization of cRNA
probe in situ hybridization methodology for localization of
glucocorticoid receptor mRNA in rat brain: A detailed protocol.
Cell. Mol. Neurobiol., vol. 10, p. 145-157, 1990].
Las señales de hibridación no específicas se monitorizaron mediante
hibridación de secciones de control procedentes de cada grupo de
edad con la sonda sentido. Se generaron autorradiografías mediante
exposición a Hyperfilm \betamax (Amersham; Braunschweig, Alemania)
durante 14 días.
Las autorradiografías de película se evaluaron
mediante densimetría asistida por ordenador (NIH Image 5.1; National
Institute of Mental Health, Bethesda, USA). Se realizaron cuatro
medidas de la densidad óptica (nivel gris) del área de interés con
resta automática del fondo en dos secciones adyacentes de cada
individuo. En todos los grupos de edad, las densidades de la señal
se midieron en cuadrados (corteza cerebral, MPN y VMN) o tiras
(subcampo hipocámpico CA1) de tamaño idéntico, a fin de evitar la
tendencia que resulta de los cambios asociados con la edad en la
dimensión de estas estructuras. Los valores medios individuales de
la densidad óptica se usaron para la computación de la
radioactividad específica de la señal (\muCi/g de tejido) por
medio de una ecuación polinómica de tercer orden que resulta de las
medidas de los patrones de ^{14}C coexpuestos (ARC; St. Louis,
USA). Las medias de los grupos se compararon mediante ANOVA de una
sola vía; cuando fue apropiado, se realizaron comparaciones en
parejas mediante el test de
Student-Neuman-Keuls. El nivel de
significancia se preajustó a p < 0,05.
A los niveles anatómicos examinados, se
encontraron en el circunvolución dentada y en los subcampos de CA de
la formación hipocámpica distintas señales fuertes de hibridación
específicas; los núcleos preopticomedial, ventromedial y arqueado,
la corteza del cíngulo, parietal y temporal, y el complejo nuclear
amigdalino presentaron todos una intensidad moderada de señal. La
incubación con una sonda sentido marcada fracasó a la hora de
proporcionar una señal de hibridación específica en cualquier
estructura o grupo de edad.
Entre todas las estructuras investigadas, en
animales neonatos, la corteza cerebral mostró la densidad más
elevada de transcriptos que codifican SRC-1a. Dentro
de la primera semana postnatal, se midió una disminución
significativa en la intensidad de señal; la tendencia a declinar
continuó con el aumento de la edad, dando como resultado niveles en
adultos de aproximadamente 30 por ciento de los medidos en el
momento del nacimiento. A cualquier edad investigada, la expresión
de SRC-1a en la corteza cerebral fracasó a la hora
de presentar diferencias de género (véase la Tabla I).
| Edad (días) | Corteza cerebral de macho | Corteza cerebral de hembra | Etapa de la vida |
| 1 | 0,68 \pm 0,10 | 0,56 \pm 0,03 | nacimiento |
| 7 | 0,32 \pm 0,07 | 0,38 \pm 0,01 | juventud |
| 40 | 0,27 \pm 0,01 | 0,27 \pm 0,01 | pubertad |
| 90 | 0,23 \pm 0,01 | 0,24 \pm 0,01 | madurez sexual |
Estos resultados sugieren que la amplificación de
la señalización mediada por ER mediante SRC-1
copresente en la corteza cerebral, una estructura que es crucial
para el rendimiento cognitivo, disminuye bruscamente y,
probablemente, pierde importancia funcional al aumentar la edad.
Además, estos datos sugieren que, una vez se logra el desarrollo
temprano del cerebro (que engloba la neurogénesis, el crecimiento
neuronal y la conectividad sináptica), el reclutamiento de
SRC-1 por ER activado juega un papel insignificante
en la mediación de efectos estrogénicos en la corteza cerebral. Con
respecto a la especificidad funcional de este área del cerebro
(procesamiento cognitivo), parece improbable que el reclutamiento de
SRC-1 pueda tener importancia significativa para la
manifestación de efectos estrogénicos en esta función del
cerebro.
Se observó una dinámica de desarrollo opuesta de
la expresión de SRC-1 en el núcleo ventromedial
hipotalámico (VMN), un área del cerebro que está muy dotada con ER
y tiene una importancia fundamental en el control de las funciones
reproductoras y del comportamiento sexual por estrógenos. En el
nacimiento, las señales de hibridación de SRC-1a en
el VMN fueron modestas en ambos sexos. Dentro de la primera
semana postnatal, se documentaron aumentos significativos en las
densidades de transcriptos, y, en ambos sexos, las intensidades pico
de la señal en esta estructura se midieron alrededor de la pubertad
(véase la Tabla II).
| Edad (días) | Núcleo ventromedial macho | Núcleo ventromedial de hembra | Etapa de la vida |
| 1 | 0,27 \pm 0,03 | 0,25 \pm 0,01 | nacimiento |
| 7 | 0,33 \pm 0,01 | 0,31 \pm 0,01 | juventud |
| 40 | 0,43 \pm 0,01 | 0,37 \pm 0,01 | pubertad |
| 90 | 0,38 \pm 0,02 | 0,30 \pm 0,02 | madurez sexual |
Estos resultados indican que la presencia y,
probablemente, el reclutamiento de SRC-1 representan
una precondición necesaria para la transmisión de señales químicas a
través de la activación del ER en una región del cerebro que regula
la actividad endocrina y el comportamiento relacionados con la
reproducción. Esta conclusión viene corroborada por el hecho de que
la expresión de SRC-1 en el VMN aumenta bruscamente
en fases de la vida en las que hay transiciones dramáticas en el
sistema reproductivo, es decir, la pubertad (véase los datos en el
día 40 en la Tabla II) y durante el ciclo del estrus (Tabla
III).
| Fase de ciclo ovárico | Nivel de expresión en el VMN | Nivel de expresión en la corteza cerebral |
| Diestrus | 0,43 \pm 0,02 | 0,32 \pm 0,03 |
| Proestrus | 0,60 \pm 0,04 | 0,38 \pm 0,02 |
El ensayo empleado en este Ejemplo usó solamente
compuestos que se caracterizan por actividad estrógena. Los ensayos
para encontrar los compuestos estrogénicos ya se han desarrollado y
publicado. Estos ensayos son ensayos estándares bien conocidos por
la persona experta en la técnica.
El ensayo usado en el presente Ejemplo para
investigar el reclutamiento de ER y del coactivador
SRC-1 se realiza según la publicación de Gauchao
ZHOH et al. (1998) Nuclear receptors have distinct affinities
for co-activators: Characterization by fluorescence
resonance energy transfer, Mol Endo, Vol. 12, p.
1594-1604, especialmente en la página 1602. Además,
el sistema de ensayo se describe en el documento WO/18124 de
Cummings et al. En los ensayos, se usó quelato de europio -
100 ng de anticuerpo anti-GST marcado con europio
por pocillo -, en lugar del criptato de europio mencionado en la
Solicitud Internacional. El anticuerpo marcado se obtuvo de Wallac,
ahora Perkin Elmer Lifesciences (anticuerpo anti-GST
marcado con Eu-W1024 para Lance Assays, Partícula
Number AD 0065).
El SRC-1 se usó a una
concentración de 175 ng de SRC-1 etiquetado con his,
por pocillo. El SRC-1 está presente en cada pocillo
de este sistema de ensayo.
Usando el sistema de ensayo, se pueden determinar
los siguientes resultados:
el control que contiene el estrógeno natural
17\beta-estradiol [i] muestra una interacción
significativa entre ER y SRC-1 a 10^{-9} M.
Los estrógenos sintéticos
(ent-1,3,5(10)-estratrien-3,17\beta-diol)
[ii],
(3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol)
[iii],
(15\beta-alil-estra-1,3,5,(10)-trien-3,17\beta-diol)
[iv] y
(15\beta-propil-estra-1,3,5,(10)-trien-3,17\beta-diol)
[v]
se sometieron a ensayo comparativo en el sistema
descrito anteriormente. Los resultados de la comparación se
presentan en la siguiente Tabla IV.
Los resultados demuestran que los compuestos
sintéticos que presentan actividad agonista similar en la regulación
transcripcional mediada por ER muestran diferencias sustanciales con
respecto a su capacidad para reclutar SRC-1
copresente, con la unión al ER. Las relaciones calculadas entre los
valores obtenidos en los dos sistemas de ensayo permiten identificar
ligandos de ER con diferente capacidad para implicar a
SRC-1 en la regulación transcripcional. Los
agonistas de ER con propiedades neurotrópicas selectivas son
aquellos que muestran relaciones más elevadas entre los valores
determinados en el sistema de ensayo II (reclutamiento de ER y del
coactivador SRC-1) y en el sistema de ensayo I
(ER).
| Ligando | Sistema de ensayo I: activación | Sistema de ensayo II: primeros | Relación entre valores |
| transcripcional de un gen informador | signos de interacción | medidos en los sistemas | |
| dependiente de ER (EC_{50} en M) | significativa entre ER y proteína | de ensayo II y I | |
| de SRC-1 (dosis en M) | |||
| [i] | 6,10^{-11} | 10^{-9} | 16,6 |
| [ii] | 4,10^{-9} | 10^{-8} | 2,5 |
| [iii] | 1,10^{-9} | 10^{-7} | 100,0 |
| [iv] | 4,10^{-9} | 10^{-7} | 25,0 |
| [v] | 1,10^{-8} | 10^{-7} | 10,0 |
Usando el ensayo descrito en el Ejemplo 2, se
seleccionó el compuesto
3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol
(iii) para un examen posterior de sus efectos neurotrópico y
estrogénico sistémico. Se demostró que el compuesto se une a
ER\alpha y a ER\beta con una afinidad relativa de
25-30 por ciento de la del ligando natural de ER
17\beta-estradiol [i]. Además, el compuesto
demostró una activación medible de la transcripción de un gen
informador inducible por ER in vitro, con una EC50 de
10^{-9} M (el 17\beta-estradiol presentó una
EC50 de 10^{-10} M).
Se administraron subcutáneamente dosis diferentes
del compuesto de interés y de 17\beta-estradiol
de referencia en ratas hembra ovariectomizadas, durante siete días
consecutivos. El efecto de los compuestos en el rendimiento
cognitivo de los animales experimentales se evaluó monitorizando la
adquisición, la consolidación y la recuperación del comportamiento
de evitación activo. Con el sacrificio, se realizaron evaluaciones
morfométricas de los órganos sensibles a estrógeno (útero, timo,
glándulas suprarrenales). Los efectos neuroquímicos se evaluaron
mediante cuantificación de la transcripción de genes específicos de
SNC inducidos por ER, en diferentes áreas del cerebro, dotadas con
diferentes cantidades de SRC-1.
En resumen, los resultados indican que
- -
- la capacidad de 3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol) [iii] para inducir efectos semejantes a estrógenos en órganos diana de estrógenos periféricos (útero, timo, glándulas suprarrenales) es varias veces menor que la del estrógeno natural 17\beta-estradiol, que también recluta fuertemente SRC-1 con la unión a ER;
- -
- el compuesto 3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol) [iii] estimula la transcripción del gen antiapoptótico bcl-2 regulado por estrógeno en la corteza cerebral (un área del cerebro con una pobre expresión de SRC-1) en un grado mayor que lo que lo hace el 17\beta-estradiol administrado a una dosis igual;
- -
- el compuesto 3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol) [iii] induce la expresión dependiente de estrógeno de receptores de oxitocina en el núcleo ventromedial (VMN) rico en SRC-1 y pertinente para la reproducción, en un grado significativamente menor que el 17\beta-estradiol;
- -
- el efecto de comportamiento (cognitivo) del compuesto 3',15\beta-dihidrocicloprop[14,15]-estra-1,3,5(10),8-tetraen-3,17\alpha-diol), según se mide mediante retención de un comportamiento de evitación activo recientemente adquirido es distinguible del de 17\beta-estradiol [i]; sin embargo, esta eficacia de comportamiento no estaba asociada con cambios dependientes de estrógenos en órganos periféricos sensibles a estrógenos.
Los resultados resumidos anteriormente sugieren
que un compuesto, el cual
- -
- presenta afinidad medible por el ER,
- -
- actúa como un agonista del ER con relación a la regulación transcripcional de genes dependientes de estrógeno, y
- -
- fracasa a la hora de reclutar SRC-1 con la unión al ER in vitro
actúa como un estrógeno
neurotrópico selectivo in vivo, a la vez que afecta de forma
insignificante a los órganos diana de estrógenos
periféricos.
Claims (2)
1. Un método para el cribado in vitro de
ligandos del receptor de estrógeno (ER) con actividad neurotrópica
específica por medio del uso secuencial de al menos dos sistemas de
ensayo que comprende
- i.
- usar un sistema de ensayo celular o de tejidos que contiene ER y un gen informador accionado por ER para detectar la activación de la transcripción que se mide detectando la concentración eficaz del ligando de ER, requerida para la inducción transcripcional semimáxima del gen informador dependiente de ER (EC50), y seleccionar el ligando que induce la transcripción, y
- ii.
- usar un sistema de ensayo libre de células o enzimático para medir la interacción fisicoquímica del coactivador 1 del receptor de esteroide (SRC-1), o sus fragmentos NID-1, NID-2 o NID-3 con la proteína de ER con la unión de un ligando seleccionado en el primer sistema de ensayo, que se mide detectando la dosis de ligando de ER requerida para la aparición de las primeras señales significativas (más de 2 veces la desviación estándar a partir de la línea base) de la interacción fisicoquímica entre el ER activado y una cantidad definida de SRC-1 o un fragmento del mismo, en el que el reclutamiento de SRC-1 o de sus fragmentos se refiere al incremento en la interacción proteína-proteína entre ER y SRC-1 o sus fragmentos por encima de la tasa de interacción basal medida en ausencia de cualquier ligando activador de ER,
en el que los agonistas de ER con
propiedades neurotrópicas selectivas son aquellos que muestran
valores menores o iguales a 10 nmoles/l en el sistema de ensayo (i),
y valores mayores o iguales a 100 nmoles/l en el sistema de ensayo
(ii).
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que
- a.
- el ligando es capaz de inducir la transcripción de un gen informador dependiente de ER a una dosis igual o menor que 10 nM en el primer sistema de ensayo, y en el que
- b.
- la concentración molar de ligando que se requiere para la aparición de una interacción proteína-proteína significativa (más de 2 veces la desviación estándar a partir de la línea base) entre el ER coexpresado y SRC-1 o uno de sus fragmentos NID-1, NID-2 o NID-3, en un sistema de ensayo, es igual o mayor que 100 nM.
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