ES2253736T3 - Tratamiento para prevenir la perdida y/o aumentar la masa osea en transtornos metabolicos del hueso. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN TRATAMIENTO PARA AUMENTAR LA MASA OSEA O PREVENIR LA PERDIDA DE HUESO DE UN INDIVIDUO AFECTADO CON UNA ENFERMEDAD OSEA QUE CONSISTE EN ADMINISTRAR AL INDIVIDUO UN MORFOGEN EN UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA QUE MANTENGA O ESTIMULE LA FORMACION DE LOS HUESOS.

Description

Tratamiento para prevenir la pérdida de y/o aumentar la masa ósea en trastornos metabólicos del hueso.

Esta invención se refiere a unos medios para aumentar la masa ósea y/o prevenir la pérdida de masa ósea en un mamífero.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la vida del adulto, el hueso está continuamente experimentando su remodelación a través de los ciclos interactivos de formación ósea y reabsorción (renovación del hueso). Generalmente la reabsorción ósea es rápida y esta mediada por osteoclastos (células reabsorbedoras del hueso), formadas por células precursoras fagocíticas, Biononucleares en sitios o puntos de remodelación ósea. Luego este proceso es seguido por la aparición de osteoblastos (células tomadoras del hueso), que forman hueso lentamente para sustituir el hueso perdido. Las actividades de los diversos tipos de células que participan en el proceso de remodelado o reconstrucción, se controlan mediante interacción sistémica (por ejemplo, hormonas, linfoquinas, factores de crecimiento, vitaminas) y factores locales (por ejemplo, citoquinas, moléculas de adhesión, linfoquinas y factores de crecimiento). El hecho de que la ejecución de este proceso normalmente conduce a la sustitución y renovación equilibradas de hueso, indica que las señales moleculares y eventos, que influyen en la remodelación o reconstrucción ósea, se controlan estrecha-
mente.

Se conoce una cantidad de trastornos del crecimiento óseo, que causan un desequilibrio en el ciclo de remodelado o reconstrucción ósea. Ocupan un lugar principal entre éstos las enfermedades ósea metabólicas, tales como osteoporosis, osteoplasia (osteomalacia), insuficiencia renal crónica e hiperparatiroidismo, que dan como resultado una pérdida anormal o excesiva de masa ósea (osteopenia). Otros trastornos óseos, tales como enfermedad de Paget, también causan una pérdida excesiva de masa ósea en puntos o ubicaciones localizadas.

La osteoporosis es un deterioro estructural del esqueleto causado por la pérdida de masa ósea resultante de un desequilibrio en la formación del hueso, reabsorción ósea, o ambas, de manera que la reabsorción domina la fase de formación del hueso, reduciendo, de este modo, la capacidad sustentadora de peso del hueso afectado. En el caso de un adulto sano, el régimen en el cual se forma y se re-absorbe hueso, está estrechamente coordinado a fin de mantener la renovación del hueso esquelético. Sin embargo, en el caso de individuos osteoporósicos se desarrolla un desequilibrio en estos ciclos de remodelación o reconstrucción ósea, lo cual da como resultado tanto una pérdida de masa ósea como la formación de defectos microarquitecarquitecturales en la continuidad del esqueleto. Estos defectos esqueléticos, creados por la perturbación en la secuencia de remodelación o reconstrucción, se acumulan y finalmente alcanzan un punto en el que la integridad estructural del esqueleto queda seriamente comprometida y la fractura ósea es probable. Aunque este desequilibrio ocurre gradualmente en la mayoría de los individuos a medida que van envejeciendo ("osteoporosis senil"), es mucho más serio y se presenta en un régimen rápido en el caso de mujeres posmenopáusicas. Además, la osteoporosis también podría resultar de desequilibrios nutricionales y endocrinos, trastornos hereditarios y una serie de transformaciones malignas.

Los pacientes que sufren insuficiencia renal crónica, casi universalmente padecen pérdida de masa ósea esquelética (osteodistrofia renal). Aunque se conoce el hecho de que la mal función o funcionamiento defectuoso del riñón causa un desequilibrio de calcio y fosfato en la sangre, hasta la fecha el aprovisionamiento de calcio y fosfato mediante diálisis no inhibe significativamente la osteodistrofia en pacientes que sufren insuficiencia renal crónica. En el caso de adultos, los síntomas osteodistróficos son frecuentemente una causa significativa de estado morboso. En el caso de niños, la insuficiencia renal muchas veces da lugar a una falta de crecimiento, debido a dejar de mantener y/o aumentar la masa ósea. La osteoplasia, también conocida como osteomalacia ("huesos blandos"), es un defecto en la Mineralización ósea (por ejemplo, mineralización incompleta), y clásicamente está relacionado con la deficiencia de la vitamina D (1, 25-dihidroxi vitamina D_{3}). El defecto puede causar fracturas de compresión en el hueso y una disminución en la masa ósea, así como zonas prolongadas de hipertrofia y cartílago proliferativo en lugar de tejido óseo. La deficiencia podría resultar de una deficiencia nutricional (por ejemplo, raquitismo en niños), absorción defectuosa de vitamina D o calcio, y/o metabolismo anormal de la vitamina.

El hiperparatiroidismo (producción en exceso de la hormona paratiroidea) es conocido por causar absorción deficiente de calcio, que conduce a la pérdida anormal de hueso. En los niños, el hiperparatiroidismo puede inhibir el crecimiento, en los adultos la integridad del esqueleto queda comprometida y la fractura de las costillas y vértebras es característica. El desequilibrio de la hormona paratiroidea podría resultar típicamente de adenomas tiroidea o de hiperplasia glandular, o pudiera proceder de uso farmacológico prolongado de un esteroide. El hiperparatiroidismo secundario también podría resultar de osteodistrofia renal. En las etapas precoces de la enfermedad se estimulan los osteoclastos para reabsorber hueso en respuesta a la hormona en exceso presente. A medida que progresa la enfermedad, el hueso trabecular se reabsorbe últimamente y la médula o tuétano se sustituye con fibrosis, macrófagos y zonas de hemorragia como una consecuencia de micro fracturas. Este estado se referencia clínicamente como osteotitis fibrosa.

La enfermedad de Paget (osteítis deformans) es un trastorno corrientemente considerado o conceptuado para tener una etiología vírica y se caracteriza por una reabsorción ósea excesiva en puntos localizados, que se inflaman y curan o cicatrizan, pero que, por ultimo, son crónicos y progresivos, y podrían conducir a transformación maligna. La enfermedad típicamente afecta a adultos con edad superior a los 25 años.

Hasta la fecha, los tratamientos de osteopenia se basan en la inhibición ulterior de la reabsorción ósea, por ejemplo, mediante 1) inhibición de la diferenciación de células mononucleares hemopoiéticas en osteoclastos maduros, 2) mediante la prevención directa de la reabsorción ósea mediada por osteoclastos, o 3) mediante la afectación del control hormonal de la reabsorción ósea.

Los regímenes de fármacos usados para el tratamiento de la osteoporosis incluyen suplementos de calcio, estrógeno, calcitonina y difosfonatos. También se están experimentando la vitamina D_{3} y sus metabolitos, conocidos por mejorar la absorción de calcio y de fosfato.

Ninguna de las terapias corrientes estimulan la regeneración del nuevo tejido óseo. Además, todos estos agentes únicamente tienen un efecto transitorio o momentáneo sobre el remodelado o reconstrucción del hueso. Así pues, aunque en algunos casos se podría parar o retardar la progresión de la enfermedad, los pacientes con deterioro óseo significativo permanecen activamente en riesgo. Esto es particularmente prevalente en trastornos, tales como osteoporosis, en los cuales resulta difícil el díagnóstico precoz y/o ya pudiera haber ocurrido un deterioro raro y estructural significante del hueso.

Es un objeto de la presente invención desarrollar métodos y composiciones para inhibir o prevenir la pérdida de masa ósea y/o para incrementar la formación de hueso en un individuo, que, por ejemplo, se ve aquejado con una enfermedad, la cual disminuye o reduce la masa ósea esquelética, particularmente en aquellos casos en los que la enfermedad causa un desequilibrio en la remodelación o reconstrucción ósea.

Otro objeto es mejorar el crecimiento óseo en niños, que sufren trastornos óseos, incluyendo enfermedades óseas metabólicas. Otro objeto más es prevenir o inhibir el deterioro del hueso en individuos con riesgo de pérdida de masa ósea, incluyendo mujeres posmenopáusicas, individuos ancianos y pacientes sometidos a diálisis. Otro objeto más es proveer métodos y composiciones para reparar defectos en la microestructura de hueso estructuralmente comprometido, incluyendo la reparación de fracturas óseas.

Así pues, la invención pretende estimular la formación de hueso y aumentar la masa ósea, opcionalmente a lo largo de periodos de tiempo prolongados, y particularmente reducir la aparición o presencia de nuevas facturas resultantes de un deterioro estructural del esqueleto. Estos y otros objetos y características de la invención se pondrán de manifiesto partiendo de la descripción, dibujos y reivindicaciones, que siguen.

Sumario de la invención

La presente invención provee métodos y composiciones para inhibir la pérdida de masa ósea, y/o para estimular la formación de hueso en mamíferos, particularmente humanos.

En un aspecto, la invención caracteriza un método de tratamiento terapéutico y composición para prevenir la pérdida de masa ósea y/o para aumentar la masa ósea en un mamífero, que incluye la administración al individuo de un morfógeno terapéuticamente efectivo en una cantidad y durante, un tiempo suficiente para inhibir la pérdida de masa ósea, y/o para aumentar la masa ósea en el individuo.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método de tratamiento terapéutico y una composición para prevenir la pérdida de masa ósea y/o para aumentar la masa ósea en un mamífero, que incluye la administración al mamífero de un compuesto, que estimula in vivo una concentración terapéuticamente efectiva de un morfógeno endógeno en el cuerpo del mamífero suficiente para prevenir la pérdida de y/o para aumentar la masa ósea en el individuo. Estos compuestos se referencia en este caso como agentes estimuladores de morfógeno, y se entienden incluir sustancias, que, cuando se administran a un mamífero, actúan sobre tejido(s) u órgano(s), que normalmente son responsables de, o capaces de, producir un morfógeno y/o secretar un morfógeno, y que causan la aleración del nivel endógeno del morfógeno. El agente podrá actuar, por ejemplo, estimulando la expresión y/o secreción de un morfógeno endógeno.

Los morfógenos descritos aquí se consideran desempeñar un papel significativo en el mantenimiento de masa ósea apropiada en un individuo. Así pues, un morfógeno podría ser administrado de acuerdo con la invención a cualquier individuo, que requiera asistencia en el mantenimiento de masa ósea apropiada y/o que sufre un desequilibrio en la remodelación o reconstrucción del hueso. Por ejemplo, el morfógeno o el agente estimulador de morfógenos se podrían administrar de acuerdo con la invención a un adulto, que sufre insuficiencia renal, para prevenir el deterioro del hueso, que se asocia con esta enfermedad, por ejemplo, para corregir la pérdida de hueso debido a insuficiencia renal en ultima fase. De forma similar, se supone o espera que la administración dé un morfógeno a un niño, que sufre insuficiencia renal, no solamente alivie la pérdida de masa ósea en el niño, sino también estimule la formación de hueso y, por consiguiente, el crecimiento. Además, se espera que la administración de un morfógeno o agente estimulador de morfógenos a un individuo, que sufre defectos en la microestructura esquelética dé como resultado la reparación de este defecto y mejore o acreciente la cacidad sustentante de peso del hueso tratado.

Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, los métodos de tratamiento y composiciones de la invención se podrían usar para tratar una fractura ósea o cualquier enfermedad, que causa o da como resultado fracturas óseas u otros defectos en la microestructura esquelética, incluyendo la pérdida de masa ósea, y que comprometen la capacidad sustentante del peso del hueso. Esta clase de enfermedades incluyen, por ejemplo, la insuficiencia renal crónica y otras enfermedades renales, particularmente las que requieren diálisis; osteomalacia; osteopenia inducida por la deficiencia de la vitamina D u osteoporosis; osteoporosis posmenopáusica o senil; hiperparatiroidismo y enfermedad de Paget.

En otro aspecto más, la invención provee métodos y composiciones para proteger un individuo en riesgo de la pérdida o deterioro de masa ósea esquelética mediante la administración profiláctica de un morfógeno o de un agente estimulador de morfógenos. Los individuos con riesgo incluyen hembras posmenopáusicas, individuos ancianos e individuos sometidos a diálisis, particularmente diálisis prolongada o crónica.

En el caso de una forma de realización preferente de la invención, el morfógeno o el agente estimulador de morfógenos se administra sistemáticamente al individuo, por ejemplo, oral o parenteralmente. En el caso de otra forma de realización de la invención, el morfógeno se podrá proveer directamente al hueso, por ejemplo, mediante inyección al periostio del hueso o al endostio. La inyección directa es particularmente útil para reparar defectos en la microestructura del hueso, incluyendo las fracturas óseas.

En el caso de un método de tratamiento de la invención, la "administración de morfógeno" se refiere a la administración del morfógeno, solo o en combinación con otras moléculas. Por ejemplo, la forma madura del morfógeno podría proveerse en asociación con su precursor "pro" dominio, que se conoce por aumentar la solubilidad de la Proteína. Otras moléculas útiles conocidas por acrecentar o mejorar la solubilidad de las proteínas incluyen caseína y otros componentes de la leche, así como diversas proteínas del suero. Moléculas útiles adicionales, que se podrían asociar con el morfógeno o con el agente estimulador de morfógenos, incluyen moléculas dirigidas al tejido, capaces de dirigir el morfógeno o el agente estimulante de morfógenos al hueso.

Las moléculas dirigidas al tejido, concebidas para ser útiles en protocolos de tratamiento de esta invención incluyen tetraciclina, difosfonatos y anticuerpos, u otras proteínas ligantes, que interactúan específicamente con las moléculas de superficie sobre las células del tejido óseo.

Otra molécula más útil que se dirige al tejido, es el precursor morfógeno "pro" dominio, particularmente el de OP-1, BMP2 o BMP4. Estas proteínas se encuentran naturalmente asociadas con tejido óseo, pero probablemente se sintetizan en otros tejidos y se dirigen al tejido óseo después de la secreción del tejido sintetizante. Por ejemplo, la fuente primaria de la síntesis de OP-1 parece ser el tejido del tracto urinario (por ejemplo, tejido renal), aunque la proteína ha manifestado ser activa en el tejido óseo (véase más abajo). Por otra parte, la proteína se ha identificado en el suero, saliva y diversas formas lácteas. Además, la forma secretada de la proteína comprende el dímero maduro en asociación con el pro dominio de la secuencia de morfógenos intactos. Por consiguiente, el morfógeno asociado pro dominios podría actuar para dirigir morfógenos específicos a diferentes tejidos in vivo.

Moléculas asociadas que se dirigen al tejido o mejoran la solubilidad, también se podrán ligar covalentemente al morfógeno utilizando medios químicos estándar, incluyendo uniones ácido-lábiles, que probablemente se fisurarán o hendirán preferencialmente en el medio ácido de puntos o sitios de remodelación o reconstrucción del hueso.

Los morfógenos o los agentes estimuladores de morfógenos también se podrán administrar junto con otros "co-factores" conocidos por tener un efecto benéfico sobre la remodelación o reconstrucción del hueso, incluyendo hormona paratiroidea, vitamina D_{3}, prostaglandinas, dexametasona. IGF (I, II) proteínas ligantes y otros agentes conocidos por mejorar la actividad de los osteoblastos. Otros cofactores útiles incluyen calcitonina y estrógeno y otros agentes, que inhiben la reabsorción del hueso.

Entre los morfógenos útiles en esta invención figuran proteínas originalmente identificadas como proteínas osteogénicas, tales como la OP-1, OP-2 y CBMP2 proteínas así como proteínas relacionadas con la secuencia aminoácido, tales como DPP (procedente de Drosophila), Vgl ( procedente de Xenopus), Vgr-1 (procedente de ratón, véase (1991) 011,691 referente a Oppermann et al.), GDF-1 (procedente de ratón, véase Lee (1991) PNAS 88: 4250-4254), la totalidad de las cuales se presentan en la tabla II y Seq.ID N^{os}. 5-14), y la recientemente identificada proteína 60A (procedente de Drosophila, Seq. ID Nº. 24, véase Wharton et al. (1991) PNAS 88: 9214-9218). Los miembros de esta familia, que incluye miembros de la súper familia de proteínas TGF-beta, comparten homología sustancial de secuencia de aminoácidos en sus regiones C-terminales. Las proteínas se trasladan como un precursor, que tiene una secuencia de péptidos con señal N-terminal, típicamente menos de unos 30 residuos, seguido por un "pro" dominio, que se escinde o divide para producir la secuencia madura. El péptido de señal se divide rápidamente después de la translación, en un punto de escisión, desdoblamiento o división, que se puede predecir en una secuencia dada, usando el método de Von Heijne ((1986) Nucleic acids research 14: 4683-4691). La tabla I, más abajo, describe los diversos morfógenos identificados hasta la fecha, incluyendo su nomenclatura como se emplea aquí, su Seq. ID referencias y fuentes de publicación para las secuencias aminoácido de las proteínas de longitud completa no incluidas en el listado de Seq. La divulgación de estas publicaciones se incorpora como referencia.

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TABLA I

"OP-1"

Se refiere generalmente al grupo de proteínas morfogénicamente activas expresadas de parte o de la totalidad de una secuencia ADN, que codifica proteína OP-1, incluyendo alélico y especies variantes de la misma, por ejemplo, OP-1 humana ("hOP-1", Seq. ID nº 5, secuencia aminoácido de proteínas maduras), o OP-1 de ratón ("mOP-1", Seq. ID Nº. 6, secuencia aminoácido de proteínas maduras). El esqueleto conservado de siete cisteinas se define por residuos 38 a 139 de Seq. ID N^{os} 5 y 6. Las secuencias de cDNA y los aminoácidos, que codifican las proteínas de longitud completa se proveen en Seq. ID N^{os} 16 y 17 (hOP1) y Seq. ID N^{os} 18 y 19 (mOP1). Las proteínas maduras se definen por residuos 293-431 (hOP1) y 292-430 (mOP1). Las "pro" regiones de las proteínas, escindidas o divididas para producir las proteínas maduras, morfogénicamente activas se definen esencialmente por residuos 30-292 (hOP1) y residuos 30-291 (mOP1).

"OP-2"

se refiere generalmente al grupo de proteínas activas expresadas de parte 6 de la totalidad de una secuencia ADN que codifica proteína OP-2, incluyendo alélico y especies variantes de la misma, por ejemplo, OP-2 humana ("hOP-2", Seq. ID Nº. 7, secuencia aminoácido de proteínas maduras) u OP-2 ratón ("mOP-2", Seq. ID Nº. 8, secuencia aminoácido de proteínas maduras). El esqueleto conservado de siete cisteinas se define por residuos 38 a 139 de Seq. ID N^{os} 7 y 8. Las secuencias de cADN y los aminoácidos, que codifican las proteínas de longitud completa, se proveen en Seq. ID N^{os}. 20 y 21 (hOP2) y Seq. ID N^{os}. 22 y 23 (mOP2). Las proteínas maduras se definen esencialmente por residuos 264- 402 (hOP2) y 261-399 (mOP2). Las "pro" regiones de las proteínas, divididas para producir las proteínas maduras, morfogénicamente activas se definen esencialmente por residuos 18-263 (hOP2) y residuos 18-260 (mOP2). (Otro punto de división también se presenta 21 residuos más allá en dirección 5' para ambas proteínas OP-2).

"CBMP2"

se refiere generalmente a las proteínas morfogénicamente activas expresadas de una secuencia de DNA, que codifica las proteínas CBMP2, incluyendo alélico y especies variantes de las mismas, por ejemplo, CBEP2A humana ("CBMP2A(fx)", Seq ID Nº. 9) o CBMP2B ADN humana ("CBMP2B(fx)", Seq. ID Nº. 10. La secuencia de aminoácidos para las proteínas de longitud completa, referencia en la bibliografía colectivamente como BMP2A y BMP2B, o BMP2 y BMP4, aparecen en Wozney, et al. (1988) Science 242:1528-1534. El pro dominio para BMP2 (BMP2A) incluye probablemente residuos 25-248 ó 25-282; la proteína madura, residuos 249-396 o 283-396. El pro dominio para BMP4 (BMP2B) incluye probablemente residuos 25-256 o 25-292; la proteína madura, residuos 257-408 o 293-408.

"DPP(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen DPP de la Drosophila y que definen el esqueleto conservado de siete cisteinas (Seq. ID Nº. 11). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Padgett, et al. (1987) Wature 325: 81-84. El pro dominio probablemente se extiende desde el punto o sitio de escisión o división de péptidos de señal a residuo 456; la proteína madura se define probablemente por residuos 457-588.

"Vgl(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen Vg1 del Yenopus y que definen el esqueleto conservado de sietes cisteinas (Seq. ID Nº 12). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Weeks (1987) Cell 51: 861-867. El pro dominio se extiende probablemente del punto o sitio de división de péptidos de señal a residuo 246; la proteína madura se define probablemente por residuos 247-360.

"Vgr-1 (fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen Vgr-1 murine y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Seq. ID No 13). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Lyons, et al., (1989) PNAS 86: 4554-4558. El pro dominio se extiende probablemente del sitio o punto de división de péptidos de señal a residuo 299; la proteína madura se define probablemente por residuos 300-438.

"GDF-1(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen GDF-1 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Seq. ID Nº 14). El cADN y la secuencia amino codificada para la proteína de longitud completa se provee en Seq. ID. No 32. El pro dominio se extiende probablemente de sitio o punto de escisión o división de péptidos de señal a residuo 214; la proteína madura se define probablemente por residuos 215-372.

"60A"

se refiere generalmente a las proteínas morfogénicamente activas expresadas de parte o de la totalidad de una secuencia de ADN (procedente del gen 60A de Drosophila), que codifica las proteínas 60A (véase Seq. ID No 24, en la cual se proveen el cADM y la secuencia de aminoácidos codificada para la proteína de longitud completa). "60A(fx)" se refiere a las secuencias de proteínas, que definen el esqueleto conservado de siete cisteinas (residuos 354 a 455 de Seq. ID Nº. 24). El pro dominio se extiende probablemente de sitio de división de péptidos de señal a residuo 324; La proteína madura se define probablemente por residuos 325-455.

TABLA I (continuación)

"BMP3(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen BMP3 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Seq. ID Nº. 26). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Wozney et al. (1988) Science 242* 1528-1534. El pro dominio se extiende probablemente del sitio o punto de división de péptidos de señal a residuo 290; la proteína madura se define probablemente por residuos 291-472.

"BMP5(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen BMP5 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Seq. ID Nº 27). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Celeste et al. (1991) PNAS 87: 9843-9847. El pro dominio se extiende probablemente del sitio de división de los péptidos de señal a residuo 316; la proteína madura se define probablemente por residuos 317-454.

"BMP6(fx)"

se refiere a secuencias de proteínas codificadas por el gen BMP6 humano y que definen el esqueleto conservado de siete cisteínas (Seq. ID Nº. 28). La secuencia de aminoácidos para la proteína de longitud completa aparece en Celeste et al. (1990) PNAS 87: 9843-5847. El pro dominio incluye probablemente o se extiende del sitio de división de los péptidos de señal a residuo 374; la secuencia madura incluye probablemente residuos 375-513.

Las proteínas OP-2 tienen un residuo de cisteínas adicionales en esta región (por ejemplo, véase residuo 41 de Seq. ID N^{os} 7 y 8), además del esqueleto conservado de cisteinas en común con las otras proteínas en esta familia. La proteína GDF-1 tiene un inserto de cuatro aminoácidos dentro del esqueleto conservado (residuos 44-47 de Seq. ID Nº. 14), pero este inserto probablemente no se interfiere con la relación de las cisteínas en la estructura plegada. Además, las proteínas CBMP2 han perdido un residuo aminoácido dentro del esqueleto de cisteínas.

Los morfógenos son inactivos cuando se reducen, pero son activos como homodímeros oxidados y cuando se oxidan en combinación con otros morfógenos de esta invención. Así pues, como quedan definido aquí, un morfógeno es una proteína dimérica, que comprende un par de cadenas de polipéptidos, en que cada cadena de polipéptidos comprende, al menos, el esqueleto de seis cisteínas C-terminal definido por residuos 43-139 de Seq. ID Nº. 5, que incluye disposiciones funcionalmente equivalentes de estas cisteinas (por ejemplo, inserciones o supresiones de aminoácidos, que alteran la disposición lineal de las cisteínas en la secuencia, pero no su relación en la estructura plegada), de manera que, cuando se pliegan las cadenas de polipéptidos, la especie de proteína dimérica, que comprende el par de cadenas de polipéptidos, tiene la estructura tridimensional apropiada, incluyendo los enlaces de disulfuros intra o intercadena apropiados, de modo que la proteína es capaz de actuar como morfógeno, como queda definido aquí. Específicamente, los morfógenos son capaces, por lo general, de la totalidad de las siguientes funciones biológicas en un medio morfogénicamente permisivo: estimulando la proliferación de células progenitoras; estimulando la diferenciación de células progenitoras; estimulando la proliferación de células diferenciadas; y apoyando el crecimiento y el mantenimiento de células diferenciadas, incluyendo la rediferenciación de células transformadas. Además, también se anticipa que estos morfógenos son capaces de inducir la rediferenciación de células comprometidas bajo condiciones ambientales apropiadas.

En el caso de un aspecto preferido, los morfógenos de esta invención comprenden una de dos especies de secuencias de aminoácidos genéricos: Secuencia Genérica 1 (Seq. ID Nº. 1) o Secuencia Genérica 2 (Seq. ID Nº. 2); donde cada Xaa indica uno de los 20 L-isómero, alfa-aminoácidos naturales o un derivado del mismo. La Secuencia Genérica 1 comprende el esqueleto conservado de seis cisteínas y la Secuencia Genérica 2 comprende el esqueleto conservado de seis cisteínas más las cisteínas adicionales identificadas en OP-2 (véase residuo 36, Seq. ID Nº. 2). En el caso de otro aspecto preferido, estas secuencias comprenden, además, la siguiente secuencia adicional en su N-terminus:

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa} (Seq. ID Nº. 15)

Las secuencias de aminoácidos preferidas dentro de las secuencias genéricas precedentes incluyen: Secuencia Genérica 3 (Seq. ID Nº. 3), Secuencia Genérica 4 (Seq. ID Nº. 4), Secuencia Genérica 5 (Seq. ID Nº. 30) y Secuencia Genérica 6 (Seq. ID Nº. 31), enumeradas más abajo. Estas Secuencias Genéricas acomodan las homologías compartidas entre los diversos miembros preferidos de esta familia de morfógenos identificada en la tabla II, así como la variación de la secuencia de aminoácidos entre ellos. Específicamente, las Secuencias Genéricas 3 y 4 son secuencias de aminoácidos compuestas de las siguientes proteínas presentadas en la tabla II e identificadas en Seq. ID N^{os}. 5-14: OP-1 (hOP-1, Seq. ID N^{os} 5 y 16-17) humana, OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID N^{os} 6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Seq. ID N^{os}. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID Nº. 9), CBMP2B (Seq. ID Nº. 10). DPP (procedente de Drosophila, Seq. IDF Nº. 11), Vgl (procedente de Xenopus, Seq. ID No 12), Vgr-1 (procedente de ratón, Seq. ID Nº. 13) y GDF-1 (procedente de ratón, Seq. ID Nº. 14). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácido compartida por las secuencias en la tabla II, así como residuos alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia. Advertid que estas secuencias genéricas admiten un cisteína adicional en posición 41 o 46 en Secuencias Genéricas 3 o 4, respectivamente, proveyendo un esqueleto de cisteinas apropiado donde se pueden formar enlaces de disulfuro Ínter o intra-moleculares, y contienen ciertos aminoácidos críticos, que ejercen su influencia sobre la estructura terciaria de las proteínas.

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en que cada Xaa se selecciona independientemente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados, definido como sigue:

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en que cada Xas independientemente se selecciona de un grupo de uno o más aminoácidos especificados, definido por lo siguiente:

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De forma similar, la Secuencia Genérica 5 (Seq. ID Nº. 30) y la Secuencia Genérica 6 (Seq. ID Nº. 31) acomodan las homologías compartidas entre todos los miembros de la familia de proteínas de morfógenos identificados en la tabla II. Específicamente, las Secuencias Genéricas 5 y 6 son secuencias de aminoácidos compuestas de OP-1 humano (hOP-1, Seq. ID N^{os} 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID N^{os}.6 y 18-19), OP-2 humana y de ratón (Seq. ID N^{os}. 7, 8 y 20-22), CBMP2A (Seq. ID Nº 9), CBMP2B (Seq. ID Nº 10), DPP (procedente de Drosophila, Seq. ID Nº 11), Vgl, (procedente de Xenopus, Seq. ID Nº. 12), Vgr-1 (procedente de ratón, Seq. ID Nº 13),y GDF-1 (procedente de ratón, Seq. ID Nº. 14 y 32), BMP3 humana (Seq ID Nº. 26), BMP5 humana (Seq. ID Nº. 27), BMP6 humana (Seq. ID No 28), y 60 A (procedente de Drosophila, Seq. ID Nº 24). Las secuencias genéricas incluyen tanto la identidad de aminoácido compartida por estas secuencias en el dominio C-terminal, definido por los esqueletos de seis y siete cisteínas (Secuencias Genéricas 5 y 6, respectivamente) así como residuos alternativos para las posiciones variables dentro de la secuencia. Como para las Secuencias Genéricas 3 y 4, las Secuencias Genéricas 5 y 6 admiten cisteína adicional en posición 41 (Secuencia Genérica 5) o posición 46 (Secuencia Genérica 6), proveyendo un esqueleto de cisteinas apropiado, en el que se pueden formar enlaces de disulfuros ínter- o intramoleculares, y conteniendo ciertos aminoácidos críticos, que ejercen su influencia sobre la estructura terciaria de las proteínas.

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en que cada Xaa independientemente se selecciona de un grupo de uno o más aminoácidos especificados, definido como sigue:

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en que cada Xaa independientemente se selecciona de un grupo de uno o más aminoácidos especificados, como definido por lo siguiente: "Res." significa "residuo" y Xaa enres. 2 = (Lys, Arg, Ala o Gin); Xaa en res. 3 = (Lys, Arg o Met); Xaa en

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Secuencias particularmente útiles para su empleo como morfógenos en esta invención incluyen los dominios C-terminal, por ejemplo, los residuos de aminoácidos C-terminal 96-102 de Vgl, Vgr-1, DPP, OP-1, OP-2, CBMP-2A, CBMP-2B, GDF-1 (véase tabla II, abajo, y Seq. ID N^{os}. 5-14), así como proteínas que comprenden los dominios C-terminal de 60A, BMP3, BMP5 y BMP6 (véase tabla II, abajo, y Seq. ID N^{os}. 24-28), cuya totalidad incluye, al menos, el esqueleto conservado de seis o siete cisteínas. Además, también son útiles construcciones biosintéticas diseñadas a partir de las secuencias genéricas, tales como COP-1, 3-5, 7, 16, dadas a conocer en U.S. Pat. Nº. 5,011,691. Otras secuencias incluyen las proteínas inhibina/activina (véase, por ejemplo, U.S. Pat. N^{os}. 4,968,590 y 5,011,691). Por consiguiente, otras secuencias útiles son las que comparte, al menos, el 70% de la homología o "similaridad" de la secuencia de aminoácidos, y preferentemente el 80% de homología o similaridad con cualquiera de las secuencias anteriores. Estas se anticipan por incluir alélico y especies variantes y mutantes, y muteínas biosintéticas, así como nuevos miembros de esta familia morfogénica de proteínas. Particularmente concebidas en la familia de proteínas relacionadas son aquellas proteínas que exhiben una actividad morfogénica y en las que los cambios de aminoácidos a partir de las secuencias preferidas, incluyen cambios conservativos, por ejemplo, aquellos definidos por Dayoff et al., Atlas of protein Sequence and Structure; vol. 5, Supl. 3, págs. 345-362, (M.O. Dayoff, ed., Nat'l BioMed. Kesearch Fdn., Washington, D.C. 1979). Como se usa en este contexto, las secuencias potencialmente útiles se alinean con una conocida secuencia de morfógenos utilizando el método de Needleman et al. ((1970) J.mol. Biol. 48: 443-453) e identidades calculadas por el Align program (ADNstar, Inc.). "Homología" o "similaridad" como se emplea aquí incluye cambios conservativos permitidos como quedan definidos por Dayoff et al.

Las secuencias de proteínas habitualmente más preferidas útiles como morfógenos en esta invención incluyen las que tienen más del 60% de identidad, preferentemente más del 65% de identidad, con la secuencia de aminoácidos, que define el esqueleto conservado de seis cisteinas de hOP1 (por ejemplo, residuos 43-139 de Seq. ID Nº. 5). Estas secuencias preferidas incluyen tanto alélico como especies variantes de las proteínas OP-1 y OP-2, incluyendo la proteína 60A de Drosophila. Por consiguiente, en el caso de otro aspecto preferido de la invención, morfógenos útiles incluyen proteínas activas, que comprenden especies de cadenas de polipéptidos, las cuales tienen la secuencia de aminoácidos genérica, referenciada en este contexto como "OPX", que acomoda las homologías entre las diversas especies identificadas de OP1 y OP2 (Seq. ID Nº. 29).

Los morfógenos útiles en los métodos, composición y dispositivos de esta invención incluyen proteínas, que comprenden cualquiera de las cadenas de poli-péptidos descritas más arriba, sea aislados de fuentes naturales o producidos mediante ADN recombinante u otras técnicas sintéticas, e incluye alélico y especies variantes de estas proteínas, imitantes de las mismas naturales o biosintéticos, así como diversas construcciones truncadas o de fusión. También, se conciben mutantes de supresión o de adición para ser activos, incluidos los que pudieran alterar el esqueleto conservado de cisteínas C-terminal, siempre que la alteración no rompa funcionalmente la relación de estas cisteínas en la estructura plegada. En consecuencia, esta clase de formas activas se consideran el equivalente de las construcciones específicamente descritas, dadas a conocer aquí. Las proteínas podrán incluir formas, que tienen patrones o modelos de glicosilación variables, N-termini variables, una familia de proteínas relacionadas, que tienen regiones de homología de secuencia de aminoácidos y formas activas truncadas o mutadas de proteínas nativas o biosintéticas, producidas mediante expresión de ADN recombinante en células huésped.

Las proteínas morfogénicas se pueden expresar de cADN intacto o truncado o de ADNs sintéticos en células huésped procarióticas o eucarióticas, y purificadas, divididas, replegadas y dimerizadas para formar composiciones morfogénicamente activas. Células huésped corrientemente preferidas incluyen E coli o células de mamíferos, tales como células CHO, COS o BSC. Una descripción detallada de los morfógenos útiles en los métodos y composiciones de esta invención se da a conocer en la solicitud de patente US copendiente, N^{os}. de serie 752,764, registrada el 30 de agosto, 1991, y 667,274, registrada el 11 de marzo de 1991, cuyas revelaciones se incorporan aquí como referencia.

Así pues, en vista de esta revelación, ingenieros genéticos expertos pueden aislar genes de cADN o de librerías genómicas de varias especies diferentes, que codifican secuencias de aminoácidos apropiadas, construyen ADNs partiendo de oligonucleótidos, y luego pueden expresarlos en diversos tipos de células huésped, incluyendo tanto procariotas y eucariotas, para producir grandes cantidades de proteína activas capaces de mejorar la formación de hueso y/o inhibir el deterioro anormal del hueso en una variedad de mamíferos, incluyendo humanos, para su uso en el mantenimiento de masa ósea apropiada y en el remodelado o reconstrucción de hueso en el tejido óseo en vías de desarrollo y adultos.

Breve descripción de los dibujos

Lo precedente y otros objetos y características de esta invención, así como la invención en sí, se podrán comprender más completamente partiendo de la siguiente descripción, cuando se lea junto con los dibujos acompañantes, en los cuales:

La Figura 1 compara el efecto mitogénico de hOP-1 y TGF-beta sobre osteoblastos de rata;

La Figura 2 ilustra el efecto de la proteína-1 (hOP-1) osteogénica humana sobre la síntesis del colágeno de osteoblastos;

La Figura 3 compara el efecto de inducción de fosfatasa alcalina de hOP-1 y TGF-beta sobre osteoblastos de rata;

La Figura 4 muestra el efecto a largo plazo de hOP-1 sobre la producción de fosfatasa alcalina por osteoblastos de rata;

La Figura 5 muestra el efecto de hOP-1 sobre la producción de CAMP mediada por hormona paratiroidea, usando osteoblastos de rata en cultivo;

Las Figuras 6A y B representan gráficamente el efecto de morfógeno sobre la síntesis de osteoclacina (A), y el efecto de morfógeno sobre el régimen o tasa de mineralización (B);

La Figura 7 muestra el análisis Western en referencia de calostro bovino, usando OP-1 y anticuerpos específicos de BMP2; Las Figuras 8A y B muestran resultados de ensayos de actividad in vivo e in vitro respectivamente, para OP-1 purificada de extracto mamario;

La Figura 9 es una fotomicrografía de una inmunorreferencia, que muestra la presencia de hOP-1 en suero; y

La Figura 10 (A y B) son fotomicrografías, que muestran nueva formación de hueso endostio seguido de inyección de morfógeno en la superficie endostial (A), y nueva formación de hueso periostio seguido de inyección de morfógeno en la superficie periostial (B);

La Figura 11 es una representación gráfica del efecto dosis-dependiente de morfógeno sobre la reabsorción de hueso; y

La Figura 12 (A y B) son representaciones esquemáticas de inhibición de morfógeno de multinuclearización de células fagocíticas mononucleares precoz in vivo.

Descripción detallada de la invención

Ahora se ha descubierto que las proteínas descritas aquí son agentes efectivos para prevenir la pérdida de masa ósea y/o para estimular la formación de hueso, cuando se proveen sistémicamante o se inyectan directamente en el tejido óseo en un mamífero. Como se describe aquí, estas proteínas ("morfógenos" se podrán usar en el tratamiento de enfermedades óseas metabólicas y otros trastornos que causan desequilibrio del ciclo de remodelación o reconstrucción del hueso, y/o que causan deterioración de la microestructura esquelética.

La invención se basa en el descubrimiento de una familia de proteínas morfogénicas capaces de inducir morfogénesis histológica en un mamífero. Más particularmente, la invención se basa en el descubrimiento de que estas proteínas desempeñan un importante papel, no solamente en embriogénesis, sino también en el crecimiento, mantenimiento y reparación de tejido óseo en mamíferos jóvenes y adultos.

Se ha evidenciado que la implantación de un morfógeno (incluidas proteínas OP-1, CBMP2, DPP y 60A, y diversas construcciones biosintéticas, tales como COP5 y COP7) junto con una matriz adecuada en puntos o ubicaciones subcutáneas en mamíferos induce una secuencia de eventos celulares, la cual conduce a la formación de nuevo hueso completamente funcional, como queda determinado por la actividad específica de fosfotasa alcalina, contenido de calcio e histología de implantes día 12 (véase, por ejemplo, U.S. Pat. N^{os}. 4,968,890 y 5,011,691, y USSN 667,274 y 752,857, cuyas revelaciones se incorporan aquí como referencia). Los implantes, que contienen morfógeno, recluían células troncales o madre mesenquimales y activan o inician su diferenciación en condrocitos dentro de 5-7 días. Después de la invasión capilar, los condrocitos se hipertrofian, se calcifican y subsiguientemente se sustituyen por hueso nuevamente formado dentro de 9-12 días. Luego el hueso mineralizado se remodela o reconstruye extensivamente y se ocupa por osíferos llenados con elementos funcionales de médula o tuétano óseo en 14-21 días.

Como queda descrito aquí, los morfógenos provistos en este caso estimulan la proliferación, crecimiento y diferenciación de osteoblastos in vitro (véanse ejemplos 2-7, más adelante), y pueden inducir la formación de hueso en tejido óseo osteoporósico in vivo cuando se administra sistémicamente a un mamífero o directamente a tejido óseo, sin un portador de matriz asociado (véanse ejemplos 8, 9, más adelante. Además, los morfógenos inhiben la multinucleación de células fagocíticas mononucleares, activadas precozmente (véase ejemplo 12, más adelante). Por otra parte, la inhibición de la actividad de morfógenos endógenos puede inhibir el desarrollo normal del esqueleto en un mamífero (véase ejemplo 13, más adelante).

Como queda descrito en el ejemplo 1 y de modo detallado en USSN copendiente 752,764 y 752,861, cuyas revelaciones se incorporan como referencia, los morfógenos naturales se distribuyen ampliamente en los diferentes tejidos del cuerpo. Por ejemplo, como determinado mediante hibridización de northern, OP-1 se expresa primariamente en el tejido del tracto urogenital (por ejemplo, tejidos renales y vesicales). En contraste, Vgr-1, BMP3, BMP4 y BMP5 parecen expresarse primariamente en el corazón y pulmón. BMP5 también parece expresarse significativamente en el tejido hepático. (Cfr., por ejemplo, Ozkaynak et al. (1992) JBC, en publicación). Por otra parte, el tejido de síntesis pudiera diferir del sitio natural de acción de morfógenos específicos. Por ejemplo, aunque OP-1 parece ser primariamente sintetizada en el tejido renal, la proteína es activa en el tejido óseo. Además, al menos un morfógeno, OP-1, está presente en una serie de fluidos corporales, incluidos saliva, leche (incluyendo el extracto de glándula mamaria, calostro y leche de 57 días) y suero (véase ejemplo 11, más adelante). Por consiguiente, sin limitarse a una teoría dada, los morfógenos descritos en este contexto podrían comportarse como factores endocrinos, por ejemplo, proteínas secretadas de un tejido productor del factor en respuesta a estímulos particulares, y capaces de ser transportadas a, y accionando sobre, un tejido distante. Además, estos hallazgos distinguen a los morfógenos de otros miembros de la super-familia TGF-beta de proteínas, con inclusión de TGF-beta, que actúan como factores locales o autocrinos producido por el tejido sobre el cual actúan.

El pro dominio podrá funcionar para aumentar o mejoras la estabilidad de las proteínas y/o para ayudar en la focalización histológica de morfógenos a tejidos particulares. Por ejemplo, la forma madura, activa, de OP-1 parece ser secretada de células en asociación con el pro dominio de la secuencia intacta. En consecuencia, aunque, como se explica aquí, los morfógenos útiles en esta invención tienen homologías de secuencias de aminoácidos significativas dentro de los dominios activos y son similares en su habilidad para inducir morfogénesis histológica, sin limitarse a ninguna teoría, se formula la hipótesis de que la variación de la secuencia dentro de los miembros de la familia de proteínas morfogénicas pudiera reflejar los diferentes papeles específicos que desempeña cada morfógeno en tejidos específicos bajo condiciones naturales. Por ejemplo, la variación de secuencias significativa dentro de los pro dominios podría significar que estas regiones de la secuencia de proteínas son importantes para focalizar o dirigir morfógenos específicos a diferentes tejidos para actividad morfogénica dentro de los mismos.

Por consiguiente, la presente invención comprende dos aspectos fundamentales. En un aspecto, los métodos y composiciones de esta invención comprenden un morfógeno, que, cuando se administra a un individuo, es capaz de inhibir la pérdida de masa ósea y/o estimular la formación de hueso en el individuo. En otro aspecto, los métodos y composiciones de la invención comprenden un agente estimulador de morfógenos, el cual cuando se administra a un individuo, es capaz de inducir la expresión y/o secreción de suficiente morfógeno endógeno dentro del individuo para proveer concentraciones terapéuticamente efectivas capaces de inhibir la pérdida de masa ósea y/o estimular la formación de hueso en el individuo.

El ejemplo 14 describe un ensayo para seleccionar compuestos a fin de identificar agentes candidatos estimuladores de morfógenos. Una descripción detallada de ensayos de seleccionado útiles para identificar agentes candidatos estimuladores de morfógenos también se provee en USSN 752,861, cuya revelación se incorpora como referencia. Luego los agentes candidatos se podrán testar para comprobar su eficacia in vivo, usando, por ejemplo, el modelo de osteoporosis descrito en los ejemplos 8 y 9 más adelante.

Más adelante se detallan descripciones de morfógenos idóneos útiles en los métodos y composiciones de esta invención, así como métodos para la administración y aplicación de estos morfógenos y/o de agentes estimuladores de morfógenos. También se proveen numerosos ejemplos no limitativos que: 1) ilustran la adecuación de los morfógenos y de los agentes estimuladores de morfógenos descritos aquí como agentes terapéuticos para inhibir la pérdida anormal de hueso y/o para aumentar o mejorar la formación de hueso en un humano, y 2) proveer ensayos con los cuales comprobar la eficacia de morfógenos candidatos y agentes estimuladores de morfógenos.

I. Morfógenos útiles

Como se define aquí, una proteína es morfogénica si es capaz de inducir la cascada progresiva de eventos celulares y moleculares que culminan en la formación de nuevo tejido órgano-específico y comprende, al menos, el esqueleto conservado de seis cisteínas C- terminal o su equivalente funcional (véase más arriba). De manera específica, los morfógenos generalmente son capaces de la totalidad de las siguientes funciones biológicas en un medio o ambiente morfogénicamente permisivo: estimulando la proliferación de células progenitoras; estimulando la diferenciación de células progenitoras; estimulando la proliferación de células diferenciadas; y apoyando el crecimiento y mantenimiento de células diferenciadas, con inclusión de la "rediferenciación" de células transformadas. Detalles de cómo los morfógenos útiles en el método de esta invención fueron identificados por primera vez así como una descripción sobre cómo hacerlos, usarlos testarlos para comprobar su actividad morfogénica se dan a conocer en USSN 667,274, registrada el 11 de marzo de 1991 y USSN 752,764, registrada el 30 de agosto de 1991, cuyas revelaciones se incorporan como referencia. Como dado a conocer aquí, los morfógenos podrían ser depurados de material de origen natural o producidos recombinantemente de células huésped procarióticas o eucarióticas, haciendo uso de las secuencias genéticas dadas a conocer aquí. Alternativamente, se podrán identificar nuevas secuencias morfogénicas siguiendo los procedimientos expuestos aquí.

Proteínas particularmente útiles incluyen aquellas que comprenden las secuencias naturalmente derivadas, presentadas en la tabla II. Otras secuencias útiles incluyen construcciones biosintéticas, tales como las reveladas en U,S. Pat. 5,011,691, cuya revelación se incorpora como referencia (por ejemplo, COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 y COP-16).

Por consiguiente, los morfógenos útiles en los métodos y composiciones de esta invención también se podrían describirse por proteínas morfogénicamente activas, que tienen secuencias de aminoácidos las cuales comparten un 70% o, de preferencia, un 80% de homología (similaridad) con cualquiera de las secuencias descritas más arriba, donde "homología" es como queda definido anteriormente.

Los morfógenos útiles en el método de esta invención también pueden ser descritos por cualquiera de las 6 secuencias genéricas descritas aquí (Secuencias Genéricas 1, 2, 3, 4, 5 y 6). Las secuencias genéricas 1 y 2 también pudieran incluir, en su N-terminus, la secuencia

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa} (Seq. ID Nº. 15)

La tabla II, expuesta más adelante, compara las secuencias de aminoácidos de las regiones activas de proteínas nativas, que se han identificado como morfógenos, incluidas OP-1 humana (hOP-1, Seq. ID N^{os}. 5 y 16-17), OP-1 de ratón (mOP-1, Seq. ID N^{os}. 6 y 18-19). OP-2 humana y de ratón (Seq. ID N^{os}. 7, 8 y 20-23), CBMP2A (Seq. ID Nº. 9), CBMP2B (Seq. ID Nº. 10), BMP3 (Seq. ID Nº. 26), DPP (procedente de Drosophila, Seq. ID Nº. 11), Vgl, (procedente de Xenopus, Seq. ID Nº. 12), Vgr-1 (procedente de ratón, Seq. ID Nº. 13), GDF-1 (procedente de ratón, Seq. ID N^{os}. 14, 32 y 33), 60A proteína (procedente de Drosophila, Seq. ID N^{os}. 24 y 25), BMP5 (Seq. ID Nº. 27) y BMP6 (Seq. ID Nº. 28). Las secuencias se alinean esencialmente siguiendo el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453, calculado mediante el empleo del Align Program (DNAstar, Inc.). En la tabla, tres puntos indican que el aminoácido en esta posición es el mismo que el aminoácido en hOP-1. Tres rayas indican que en esta posición no se presenta ningún aminoácido, y se incluyen para fines de ilustrar homologías. Por ejemplo, esta "ausente" el residuo aminoácido 60 de CBMP-2A y CBMP-2B. Por supuesto, estas dos secuencias de aminoácidos en esta zona o región comprenden ASn-Ser (residuos 58, 59), con CBMP-2A que comprende Lys e Ile, mientras que CBMP-2B comprende Ser e Ile.

TABLA II

8

9

10

11

12

13

Entre los residuos 56 y 57 de BMP3 está un residuo Val; entre los residuos 43 y 44 de GDF-1 se ubica la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Pro-Pro.

Como resulta evidente de las precedentes comparaciones de secuencias de aminoácidos se pueden hacer cambios significativos de aminoácidos dentro de las secuencias genéricas aunque reteniendo la actividad morfogénica. Por ejemplo, aunque la secuencia de proteínas GDF-1 representada en la tabla II comparte solamente alrededor del 50% de identidad de aminoácido con la secuencia de hOP-1 descrita aquí, la secuencia de GDF-1 comparte mas del 70% de homología (o "similaridad") de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de hOP-1, donde "homología"/o "Similaridad" incluye cambios de aminoácidos conservativos, permitidos dentro de la secuencia como queda definido por Dayoff et al.. Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3. págs. 345-362, (M.O. Dayoff. ed., Nat'l BioMed. Res. Fd'n, Washington D.C. 1979).

Las secuencias de proteínas habitualmente más preferidas útiles como morfógenos en esta invención incluyen aquellas que tienen más del 60% de identidad, con preferencia más del 65% de identidad, con la secuencia de aminoácidos que define el esqueleto conservado de seis cisteínas de hOP-1 (por ejemplo, residuos 43-139 de Seq. ID Nº. 5). Estas muy preferidas secuencias incluyen tanto alélico como especies variantes de las proteínas OP-1 y OP-2, con inclusión de la proteína 60A de Drosophila. Por consiguiente, en otro aspecto preferido, la invención incluye morfógenos, que comprenden especies de cadenas de polipéptidos, las cuales tienen la secuencia genérica de aminoácidos referenciada aquí como "OPX", que define el esqueleto de siete cisteínas y acomoda las identidades entre las diversas proteínas OP1 y OP2 de ratón y humanas identificadas. OPX se presenta en Seq. ID Nº. 29. Como queda descrito aquí, cada Xaa en una posición dada se selecciona, de manera independiente, de los residuos, que aparecen en la correspondiente posición en la secuencia C-terminal de OP1 u OP2 de ratón o humana (véase Seq. ID N^{os}. 5-8 y/o Seq. ID N^{os}. 16-23).

II. Formulaciones y métodos para administrar agentes terapéuticos

Los morfógenos se podrían proveer a un individuo mediante cualquier medio adecuado, preferentemente de forma directa, parenteral u oral. Donde el morfógeno se ha de suministrar directamente (por ejemplo, localmente, como mediante inyección, a un punto de tejido óseo) o parenteralmente, tal como mediante vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, bucal, rectal, vaginal, intranasal o mediante admistración de aerosoles, el morfógeno comprende preferentemente parte de una solución acuosa. La solución es fisiológicamente aceptable de modo que, además de suministrar al paciente el morfógeno deseado, la solución, por otra parte, no afecta adversamente al equilibrio de electrólitos y volumen del paciente. Así pues, el medio acuoso para el morfógeno podrá comprender salina fisiológica normal (9,85% NaCl, 0.15M), pH 7-7,4. La solución acuosa, que contiene el morfógeno, se puede hacer, por ejemplo, disolviendo la proteína en 50% de etanol, que contiene acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) o 0,1% de HC1, o disolventes equivalentes. Luego se añade un volumen de la solución resultante, por ejemplo, a diez volúmenes de salina tamponada con fosfato (PBS), que, además, podría incluir 0,1-0,2% de albúmina de suero humano (HSA). De preferencia, la solución resultante se somete a un movimiento de torbellino extenso. Si se desea, se podrá hacer más soluble un morfógeno dado mediante asociación con una molécula adecuada. Por ejemplo, asociación del dímero maduro con el pro dominio del morfógeno aumenta la solubilidad de la proteína significativamente, de hecho, la proteína endógena está concebida para ser transportada en esta forma. La caseína es otra molécula capaz de mejorar o acrecentar la solubilidad y particularmente útil para administraciones por vía oral. Por ejemplo, la adición de 0,2% de caseína aumenta la solubilidad de la forma activa, madura, de OP-1 en un 80%. Otros componentes encontrados en la leche y/o diversas proteínas del suero también pudieran ser útiles.

Soluciones útiles para administración oral o parenteral se podrían preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, descrita, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub. 1990. Las formulaciones pudieran incluir, por ejemplo, polialquileno glicoles tales como polietileno glicol, aceites de origen vegetal, naftalinas hidrogenadas y similares. Las formulaciones para la administración directa, en particular, podrán incluir glicerol u otras composiciones de alta viscosidad. Polímeros bio-compatibles, de preferencia biorreabsorbibles, incluyendo, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, polibutirato, lactidas y copolímeros de lactidas/glicólidas, pudieran ser excipientes útiles para controlar la liberación del morfógeno in vivo. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para estos morfógenos incluyen partículas de etileno-vinilo acetato copolímero, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para administración mediante inhalación contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa, o pudieran ser soluciones acuosas, que contienen, por ejemplo polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato y deoxicolato, o soluciones oleoginosas para administración en la forma de gotas nasales, o como un gel de aplicación intranasal. Las formulaciones para la administración parenteral también podrían incluir glicolato para la administración bucal, metoxisalicilato para la administración rectal o ácido cútrico para la administración vaginal.

Alternativamente, los morfógenos descritos aquí se podrán administrar por vía oral. La administración oral de proteínas como terapéutica generalmente no practica ya que la mayoría de las proteínas se degradan pronto o fácilmente por las enzimas digestivas y ácidos en el sistema digestivo de mamíferos antes de que se puedan absorber en la corriente sanguínea. Sin embargo, los morfógenos descritos aquí típicamente son estables a los ácidos y resistentes a la proteasa (véase, por ejemplo, U.S. .Pat. Nº. 4,968,590). Además, al menos un morfógeno, OP-1, ha sido identificado en extracto de glándula mamaria bovina, calostro y leche (véase ejemplo 10, más adelante) así como saliva. Por otra parte, la OP-1 depurada de extracto de glándula mamaria, ha demostrado ser morfogénicamente activa. Específicamente, esta proteína ha demostrado inducir formación de hueso endocondrial en mamíferos cuando se implantan subcutáneamente en asociación con un material matriz adecuado, usando un ensayo estándar óseo in vivo, tal como se da a conocer en U.S. Pat. Nº. 4,968,590. Además, morfógeno endógeno también se ha detectado en la corriente sanguínea (véase ejemplo 11). Estos hallazgos indican que la administración oral y parenteral es un medio viable para administrar morfógenos a un individuo. Además, aunque las formas maduras de ciertos morfógenos descritos aquí típicamente son rara vez o escasamente solubles, la forma de morfógeno hallado en la leche (y extracto de la glándula mamaria y calostro) es fácilmente soluble, probablemente por asociación de la forma madura, morfogénicamente activa con el pro dominio de la secuencia intacta y/o por asociación con uno o más componentes de la leche. En consecuencia, los compuestos provistos aquí también pudieran ser asociados con moléculas capaces de mejorar o agrandar su solubilidad in vitro o in vivo, incluyendo, por ejemplo, parte o la totalidad de un morfógeno pro dominio, y caseína, como queda descrito más arriba.

Los compuestos provistos aquí también se podrán asociar con moléculas capaces de dirigir el morfógeno o el agente estimulador de morfógenos a un tejido óseo. Por ejemplo, se conocen la tetraciclina y los difosfonatos por ligarse al mineral del hueso, particularmente en zonas de remodelación o reconstrucción del hueso, cuando se suministran sistemáticamente en un mamífero. Alternativamente, también se podrá usar un anticuerpo u otra proteína ligante, que interactúa específicamente con una molécula de superficie sobre las células del tejido óseo. Además, este tipo de moléculas objetivo se podrán asociar covalentemente al morfógeno o al agente estimulador de morfógenos con, por ejemplo, un enlace inestable a los ácidos, tal como una unión o ligazón Asp-Pro, usando medios químicos estándares bien conocidos en la técnica. Como el medio o ambiente local en los sitios de remodelación o re-construcción del hueso es ácido, se espera que las uniones inestables a los ácidos se escindan o dividan, de preferencia, en estos sitios o puntos, produciendo morfógeno activo o agente estimulador de morfógenos en el punto o ubicación deseado. Se podrían diseñar moléculas objetivo útiles, por ejemplo, usando la tecnología de sitio o punto de unión de cadena simple, dada a conocer, por ejemplo, en la U.S. Pat. Nº. 5,091,513.

Como queda descrito más arriba, los morfógenos provistos aquí participan de homología significativa en los dominios activos C-terminal. Por contraste, las secuencias divergen significativamente en las secuencias, que definen el pro dominio. Por consiguiente, el pro dominio pudiera ser morfógeno-específico. Como queda descrito más arriba, también es un hecho conocido que los diversos morfógenos identificados hasta la fecha se expresan diferencialmente en los diferentes tejidos. En consecuencia, sin limitarse a cualquier teoría dada, es probable que, bajo condiciones naturales en el cuerpo, morfógenos seleccionados actúan típicamente sobre un tejido dado. Por consiguiente, parte o la totalidad de pro dominios, que se han identificado, asociados con la forma activa del morfógeno en solución, podrán servir de moléculas objetivo para los morfógenos descritos en este contexto. Por ejemplo los pro dominios pudieran interactuar específicamente con una o más moléculas en el tejido objetivo para dirigir el morfógeno asociado con el pro dominio a este tejido. En consecuencia, otra molécula objetivo útil para dirigir morfógeno a tejido óseo es parte o la totalidad de un morfógeno pro dominio, particularmente parte o totalidad de los pro dominios de OP-1, BMP2 ó BMP4, todas las cuales proteínas se hallan naturalmente asociadas con tejido óseo.

Finalmente, los morfógenos o los agentes estimuladores de morfógenos provistos aquí se podrán administrar solos o en combinación con otras moléculas conocidas por tener un efecto beneficioso sobre el mantenimiento de los ciclos apropiados de remodelación o reconstrucción de hueso en un individuo con riesgo de pérdida excesiva de hueso. Ejemplos de cofactores útiles incluyen vitamina D_{3}, calcitonina, prostaglandinas, hormona paratiroidea, dexametasona, estrógeno e IGF.

Los compuestos provistos aquí se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante mezcla con excipientes atóxicos, farmaceuticamente aceptables y portadores o vectores. Como queda indicado más arriba, esta clase de composiciones se podrá preparar para administración parenteral, particularmente en la forma de soluciones liquidas o suspensiones; para administración oral, particularmente en la forma de comprimidos o cápsulas; o por vía intransal, particularmente en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Las composiciones se pueden formular para administración parenteral u oral a seres humanos u otros mamíferos en cantidades terapéuticamente efectivas, por ejemplo, cantidades que proporcionan concentraciones apropiadas de un morfógeno a un tejido óseo durante un tiempo suficiente para inhibir la pérdida de masa ósea y/o para estimular la formación de hueso en individuos, que padecen enfermedades óseas metabólicas y otros trastornos de remodelación o reconstrucción del hueso, como queda descrito concentraciones terapéuticas también son suficientes para reparar fracturas y otros defectos en la microestructura esquelética y para mejorar el mantenimiento de masa ósea apropiada en jóvenes en vías de desarrollo y adultos, incluyendo la protección de individuos con riesgo de deterioración de la masa ósea.

Como se apreciará por aquellas personas expertas en la técnica, la concentración de los compuestos descritos en una composición terapéutica variará en función de un numero de factores, incluidas la dosificación del fármaco que se va a administrar, las características químicas (por ejemplo, hidrofobicidad) de los compuestos empleados y la ruta o vía de administración. La dosificación preferida de la medicina que se va a administrar, también parece depender de estas variables como el tipo y alcance de la pérdida de hueso o defecto óseo, el estado general de salud del paciente particular, la relativa eficacia biológica del compuesto seleccionado, la formulación de los excipientes del compuesto y su ruta o vía de administración. En términos generales, los compuestos de esta invención se podrían proporcionar en una solución tampón, fisiológica y acuosa, que contiene aproximadamente de 0,1 a 10% p/v compuesto para administración parenteral. Rangos de dosis típicos son de unos 10 ng/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por día; un rango de dosis preferida oscila entre aproximadamente 0,1 ug/kg y 100 mg/kg de peso corporal por día. Óptimamente, la dosificación de morfógeno dada en todos los casos oscila entre 2-20 ug de proteína por kilogramo de peso del paciente por día. Los rangos de dosis habitualmente preferidos para inyección local de morfógeno soluble a tejido óseo son de 0,1-50 ug morfógeno/inyección. No se producen lesiones patológicas obvias inducidas por morfógenos cuando se administra morfógeno maduro (por ejemplo, OP-1, 20 ug) a ratas de crecimiento normal durante 21 días consecutivos. Por otra parte, inyecciones sistémicas de 10 ug de morfógeno (por ejemplo, OP-1) inyectado díariamente durante 10 días a ratones normales recién nacidos no producen grandes anormalidades.

III. Ejemplos Ejemplo 1 Identificación del tejido que expresa morfógenos

La determinación de la distribución histológica de morfógenos podría usarse para identificar diferentes morfógenos expresados en un tejido dado, así como para identificar nuevos morfógenos relacionados. La distribución de tejido también pudiera usarse para identificar tejido útil, que produce morfógenos, para su uso en la selección e identificación de agentes candidatos estimulantes de morfógenos. Los morfógenos (o sus transcriptos mRNA) se identifican fácil o prontamente en diferentes tejidos usando metodologías estándar y modificaciones menores de los mismos en tejidos en los que la expresión pudiera ser baja. Por ejemplo, la distribución de proteínas se podría determinar usando análisis estándares de transferencia Western o técnicas inmunofluorescentes, y anticuerpos específicos al morfógeno o morfógenos de interés. De modo similar, la distribución de transcriptos de morfógeno se podrá determinar usando protocolos de hibridación estándar Northern y pruebas específicas de transcriptos.

Se podrá usar cualquier prueba capaz de hibridar específicamente a un trascripto y distinguir el trascripto de interés de otros transcriptos relacionados o afines. Como los morfógenos descritos aquí comparten tan elevada homología de secuencias en sus dominios activos, C-terminal, la distribución del tejido de un trascripto de morfógeno específico pudiera determinarse mejor usando una prueba específica para la pro región de la proteína inmadura y/o la región N-terminal de la proteína madura. Otra secuencia útil es la región 3' no codificante, que flanquea y sigue inmediatamente al a los dos puntos (:) de parada. Estas porciones de la secuencia varían sustancialmente entre los morfógenos de esta invención, y, en consecuencia, son específicos para cada proteína. Por ejemplo, una secuencia de prueba Vgr-1-específica particularmente útil es el fragmento PvuII-SacI, un fragmento 265 bp que codifica tanto una porción de la pro región no trasladada y el N-terminus de la secuencia madura (véase Lyons et al. (1989) PNAS86:4554-4558 para una descripción de la secuencia cADN). De forma similar, secuencias de prueba mOP-1-específicas particularmente útiles son el fragmento BstX1-Bgll, una secuencia 0,68 Kb que cubre aproximadamente dos tercios de la pro-región mOP-1; un fragmento StuI-StuI, una secuencia 0,2 Kb inmedíatamente aguas arriba del dominio de 7 cisteínas; y el fragmento EarI-PstI, un fragmento 0,3 Kb, que contiene una porción de la secuencia 3' no trasladada véase Seq. ID No 18, donde la pro región se define esencialmente por residuos 30-291). Se pueden usar aproximaciones similares, por ejemplo, con hOP-1 (Seq. ID Nº 16) u OP-2 humana o de ratón (Seq. ID N^{os}. 20 y 22).

Mediante el empleo de estas pruebas morfógeno-específicas, que pudieran proyectarse sintéticamente u obtenerse de secuencias clonadas, se pueden identificar transcriptos de morfógenos en tejidos de mamíferos, usando metodologías estándar bien conocidas a los que tienen experiencia ordinaria en la técnica. En resumen, se prepara RNA total partiendo de diversos tejidos de murina adulto (por ejemplo, hígado, riñón, testículo, corazón, cerebro, timo y estómago) mediante una metodología estándar, tal como mediante el método de Chomczyaski et al. ((1987) Anal. Bioche 162:156-159) y descrito más adelante. Se prepara Poli (A)+ RNA usando cromatografía de oligo (dT)-celulosa (por ejemplo, tipo 7, procedente de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc). Poli (A)+ RNA (generalmente 15 \mug) de cada tejido se fracciona en un 1% de agarosa/formaldehido gel y se transfiere a una membrana Nytran (Schleicher & Schuell). A continuación de la transferencia se seca o cuece (hornea) la membrana a 80ºC y se degrada (entrecruza retícula) el RNA bajo luz de rayos ultravioleta (generalmente 30 segundos a 1 mW/cm^{2}). Antes de la hibridación, se desnaturaliza la prueba apropiada mediante calentamiento. La hibridación se efectúa en un cilindro de lucita, que gira en un aparato de botellas con rodillos con aproximadamente 1 rev./minuto durante aproximadamente 15 horas a 37ºC, usando una mezcla de 40% de formamida, 5 x Denhardts, 5 x SSPE y 0,1% de SDS. Después de la hibridación, se eliminan los conteos no específicos de los filtros en 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS a 50ºC.

Ejemplos que demuestran la distribución histológica de diversos morfógenos, con inclusión de Vgr-1, OP-1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, GDF-1 y OP-2 en tejido en vías de desarrollo y adulto, se dan a conocer en USSN 752,764 copendiente y en Ozkaynak et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commn. 179*116-123, y Ozkaynak et al. (1992) (JBC, en prensa), cuyas revelaciones se incorporan como referencia. Usando la metodología general de comprobación de muestras descrita aquí, hibridaciones de referencia northern, que utilizan pruebas o muestras específicas para estos morfógenos a fin de examinar tejido del cerebro, bazo, corazón, hígado y riñón, indican que el tejido relacionado con el riñón parece ser la fuente primaria de expresión para OP-1 con tejidos del cerebro, corazón y pulmón, que son fuentes secundarias. El tejido pulmonar parece ser la fuente primaria de expresión histológica para Vgr-1, BMP5, BMP4 y BMP3. Bajos niveles de Vgr-1 también se ven en tejido renal del corazón aunque el hígado parece ser una fuente secundaria de expresión para BMP5, y el bazo parece ser una fuente secundaria de expresión para BMP4. GDF-1 parece expresarse primariamente en el tejido del cerebro. Hasta la fecha, 0+-2 parece expresarse primariamente en tejido embriónico precoz. Específicamente, referencias northern de embriones de murina y animales postnatales de 6 días muestran abundante expresión de OP2 en embriones de 8 días y no se detecta en animales postnatales.

Ejemplo 2 Efecto mitogénico de morfógeno sobre osteoblastos de rata y humanos

La habilidad de un morfógeno de inducir proliferación de osteoblastos se podría determinar in vitro usando el siguiente ensayo. En este y en todos los ejemplos, que implican cultivos de osteoblastos, se emplean preferentemente cultivos primarios y enriquecidos con osteoblastos. Aunque estos cultivos son heterogéneos en que las células individuales están en diferentes etapas o estadios de diferenciación, se cree que el cultivo refleja más exactamente el metabolismo y la función de los osteoblastos in vivo que el cultivo de osteoblastos conseguido a partir de líneas establecidas de células. A no ser que se indique otra cosa, todos los productos químicos referenciados son reactivos estándar, comercialmente disponibles, fácilmente adquiribles de una serie de fuentes, incluyendo Sigma Chemical, Co., St. Louis; Calbiochem, Corp., San Diego, y Aldrich Chemical Co., Milwaukee.

Cultivos primarios enriquecidos con osteoblastos de rata se preparan mediante digestión secuencial de colagenasa de cráneo de rata recién nacida, libre de sutura (por ejemplo, de animales de 1-2 días de edad, cepa de Long-Evans, Charles River Laboratorios Wilmington, MA); siguiendo procedimientos estándar, tales como se describen, por ejemplo, en Wong et al., (1975) PNAS 72:3167-3171. Luego se colocaron suspensiones de células individuales de osteoblastos en una placa con muchas cavidades (por ejemplo, una placa de 48 cavidades o bateas) con una concentración de 50.000 osteoblastos por cavidad en alfa MEM (medio De Eagle's modificado, Gibco, Inc., Long Island), que contiene un 10% de FBS (suero bovino fetal), L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Las células se incubaron durante 24 horas a 37ºC, tiempo en el cual se substituyó el medio de crecimiento por alfa MEM, que contiene 1% de FBS y las células incubadas durante un período adicional de 24 horas, de tal manera que las células estuvieron dentro de un medio desprovisto de suero en el momento del experimento.

Luego se dividió el cultivo de células en tres grupos: (1) cavidades o bateas, que recibieron 0,1, 1,o, 10,0, 40 y 80,0 ng de norfógeno; (2) cavidades o bateas, que recibieron 0,1, 1,0, 10,0 y 40 ng de un factor de crecimiento, de acción local; y (3) el grupo de control, que recibió factores de no crecimiento. En este ejemplo, OP-1 fue el morfógeno testado y TGF-\beta fue el factor de crecimiento, de acción local. Luego se incubaron las células durante un período de tiempo adicional de 18 horas, después del cual se pulsaron las cavidades o bateas con 2 \muCi/batea de ^{3}H-timidina y se incubaron durante seis horas más. Luego de deslavó o eliminó el lábel excesivo con una solución fría de 0,15 M NaCl, se añadió después a cada cavidad o batea 250 \mul de 10% de ácido tricloroacético y se incubaron las bateas o cavidades a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se lavaron las células tres veces con agua destilada fría, y se sometieron a lysis mediante la adición de 250 \mul de 1% de dodecilsulfato sódico (SDS) durante un período de 30 minutos a 37ºC. Luego los lisados de células se recogieron usando medios estándar bien conocidos en la técnica, y la incorporación de ^{3}H-timidina a la SADN celular se determino mediante escintilación de líquido como una indicación de actividad mitogénica de las células. Los resultados, mostrados en la Fig. 1, demuestran que OP-1 (identificada en la figura por cuadros) estimula la incorporación de ^{3}H-timidina al ADN, y, por consiguiente, promueve la proliferación de células de los osteoblastos. La mitogénesis estimulada por 40 ng de OP-1 en medio libre de suero fue equivalente al efecto mitógénico del 10% de suero fresco o reciente solo. Por contraste, el efecto de TGB-\beta (indicado por díamantes en la fig. 1) es transitorio y bifásico. Con altas concentraciones, TGF-\beta no tiene ningún efecto significativo sobre la proliferación de células de osteoblastos. Este sistema se podrá usar para testar otros morfógenos en cuanto a su efecto sobre la proliferación de las células.

El efecto in vitro de un morfógeno sobre la proliferación de osteoblastos también se testó en osteoblastos primarios humanos (obtenidos de tejido óseo de un paciente adulto normal y preparados como queda descrito anteriormente) y en células derivadas de osteosarcoma, y en todos los casos produjeron proliferación de células. Además, experimentos similares, efectuados usando BMP4 (BMP2B) y BMP3 muestran que estos morfógenos también pueden estimular la proliferación y crecimiento de osteoblastos. (Cfr. Chen et al., (1991) JJ. Bone and Min. Res. 6: 1387-1393, y Vukicevic, (1989) PNAS 86: 8793-8797).

El efecto de un morfógeno dado sobre el crecimiento de células óseas y/o desarrollo también se pudiera testar usando una variedad de marcadores de células óseas: por ejemplo, síntesis del colágeno, actividad de la fosfatasa alcalina, producción de AMP (cAMP) cíclica mediada por la hormona paratiroidea, y mediante valoración de la tasa de mineralización en osteoblastos. De estos, la actividad de la fosfatasa alcalina, la producción de cAMP medida por la hormona paratiroidea, la síntesis de la osteocalcina y la promoción de la mineralización son marcadores específicos para el fenotipo de osteoblastos diferenciados. Sistemas experimentales para testar estos parámetros así como la síntesis del colágeno se describen más adelante en los ejemplos 3-7. En todos los casos el morfógeno solo estimuló la expresión de estos marcadores fenotipo-específicos. En los ejemplos 3-7 la OP-1 fue el morfógeno testado. Experimentos similares, realizados usando BMP4 (BMP2B) muestran que este morfógeno también produce la diferenciación de osteo-
blastos. (Cfr. Chen, et al. (1991) T. Bone and Min. Res. 6: 1387-1392, y Vukicevic, (1989) PNAS 86: 8793-8797).

Ejemplo 3 Efecto de morfógeno sobre síntesis de colágenos en osteoblatos de rata

El efecto de un morfógeno sobre la producción de colágeno en osteoblastos de rata in vitro se podría determinar como sigue.

Se prepararon y cultivaron osteoblastos de rata en una placa multi-batea como queda descrito para el ejemplo 2. En este ejemplo se usó una placa de 24 cavidades o bateas. Luego las células cultivadas se dividieron en tres grupos: (1) cavidades o bateas que recibieron 1, 10 ó 40 ng de morfógeno por ml de medio; (2) cavidades o cubetas que recibieron 1, 10 o 40 ng de un factor de crecimiento, de acción local, por ml de medio; y (3) un grupo de control, que no recibió factores de crecimiento. En este ejemplo, la OP-1 fue el morfógeno testado, y la TGF-\beta fue el factor de crecimiento, de acción local.

Se incubaron las muestras durante 68 horas a 37ºC con 5% de CO_{2} en un incubador humidificado. Se añadieron veinticinco (25) \muCi de ^{3}H-prolina a cada batea y se incubaron durante seis horas adicionales. Luego se congelaron a -20ºC hasta que se llevó a cabo el ensayo del colágeno. Luego se analizaron las células para comprobar la producción de colágeno mediante la detección de la incorporación de ^{3}H-prolina a la proteína colagenasa-digestible (CDP) total. Los resultados, mostrados en la Fig. 2, demuestran que la OP-1 estimula la síntesis de colágenos del tipo-1, como medido por la incorporación de ^{3}H-prolina a la CDP total. Así pues, OP-1 promueve la síntesis del colágeno in vitro por preosteoblastos y osteoblastos maduros.

Ejemplo 4 Inducción de la fosfatasa alcalina de osteoblastos por morfógeno 4.1 Inducción de la fosfatasa alcalina morfógeno-específica

Como la producción de fosfatasa alcalina es un indicador de la formación de hueso mediante osteoblastos funcionales, diferenciados, se puede evaluar un morfógeno en cuanto a sus efectos osteogénicos potenciales, usando este marcador de osteoblastos en el siguiente sistema de prueba in vitro.

Se prepararon y cultivaron osteoblastos de rata en una placa multi-bateas como queda descrito para el ejemplo 2. En este ejemplo se usó una placa de 24 cavidades o bateas. Luego las células cultivadas se dividieron en tres grupos: (1) cubetas, que recibieron concentraciones variables de morfógeno; (2) cubetas, que recibieron concentraciones variables de un factor de crecimiento, de acción local; y (3) un grupo de control, que no recibió ningún factor de crecimiento. En este ejemplo OP-1 fue el morfógeno testado con las siguientes concentraciones: 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 0 80,0 ng/ml de medio; y TGF-\beta fue el factor de crecimiento, de acción local, testado con 0,1, 1,0, 10,0, 40,0 o 80,0 ng/ml de medio. Después se incubaron las células durante 72 horas. Después del período de incubación se extractó la capa de células con 0,5 ml de 1% de Tritón x-100. Se centrífugo el extracto de las células resultante, se añadió 100 \mul del extracto a 90 \mul de mezcla de paranitrosofenilfosfato (PNPP)/glicerina y se incubó durante 30 minutos en un baño de agua a 37ºC y se detuvo la reacción con 100 \mul de NaOH. Luego se hicieron pasar las muestras a través de un lector de placas (por ejemplo, Dynatech MR700 lector de placas, y se midió la absorbencia a 400 nm, usando p-nitrofenol como un patrón) para determinar la presencia y cantidad de la actividad del fosfato alcalino. Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el método de Biorad. Se calculó la actividad de la fosfatasa alcalina en unidades/\mug proteína, donde 1 unidad = 1 nmol de p-nitrofenol liberado/30 minutos a 37ºC.

Los resultados, expuestos en la Fig. 3, ilustran que el morfógeno solo estimula la producción de fosfatasa alcalina en osteoblastos, y, por consiguiente, promueve el crecimiento y expresión del fenotipo diferenciado de osteoblastos. En la figura, cuadros representan concentraciones de OP-1, y los díamantes representan concentraciones de TGF-\beta.

4.2. Efecto a largo plazo de morfógeno sobre la producción de fosfatasa alcalina por osteoblastos de rata

A fin de determinar el efecto a largo plazo de un morfógeno sobre la producción de fosfatasa alcalina por osteoblastos de rata, se llevó a cabo el siguiente ensayo.

Se prepararon y cultivaron en placas multi-batea osteoblastos de rata, como queda descrito en el ejemplo 2. En este ejemplo se emplataron seis juegos de placas de 24 bateas o cavidades con 50.000 osteoblastos de rata por batea. Después las bateas o cavidades en cada placa, preparadas como queda descrito más arriba, se dividieron en tres grupos: (1) las que recibieron 1 ng de morfógeno por ml de medio; (2) los que recibieron 40 ng de morfógeno/ml de medio; y (3) los que recibieron 80 ng de morfógeno/ml de medio. Luego cada placa se incubó durante diferentes períodos de tiempo: 0 horas (tiempo de control), 24 horas, 48 horas, 96 horas,120 horas y 144 horas. Después de cada periodo de incubación, se extrajo la capa de células con 0,5 ml de 1% Tritón X-100. Se centrifugó el extracto de células resultante y se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina como para el ejemplo 4, usando paranitrosofenilfosfato (PNPP). Los resultados, presentados en la Fig. 4, ilustran que el morfógeno solo estimula la producción de fosfatasa alcalina en osteoblastos, que el aumento de las dosis de OP-1 aumenta el nivel de producción de fosfatasa alcalina, y que los niveles elevados, morfógeno-estimulados, de fosfatasa alcalina en los osteoblastos tratados durante un periodo prolongado de tiempo. En la figura, los círculos representan 1 ng de OP-1; los cuadrados, 40 ng de OP-1 y los díamantes, 80 ng de OP-1.

Ejemplo 5 Producción de cAMP mediada por la hormona paratiroida, morfógeno-inducida en osteoblastos de rata

El efecto de un morfógeno sobre la producción de cAMP mediada por la hormona paratiroidea en osteoblastos de rata in vitro se podrá determinar como sigue.

Osteoblatos de rata se prepararon y se cultivaron en una placa multi-batea, como queda descrito para el ejemplo 2 más arriba. En este ejemplo se usó una placa de 24 cavidades o bateas. Después las células cultivadas se dividieron en tres grupos: (1) cubetas, que recibieron concentraciones variables de morfógeno este ejemplo, OP-1, con 1,0 y 40,0 ng/ml de medio; (2) cubetas, que recibieron concentraciones variables de un factor de crecimiento, de acción local (en este ejemplo, TGF-\beta, con 0,1, 1,0 y 5,0 ng/ml de medio; y (3) un grupo de control, que no recibió factores de crecimiento. Luego se incubó la placa durante otras 72 horas. Al cabo de las 72 horas se trataron las células con medio, que contiene un 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mM de 3-isobutil-1-metil xantina durante 20 minutos seguido de la adición a la mitad de las cavidades o bateas de hormona paratiroidea recombinante humana (hPTH, Sigma, St. Louis) con una concentración de 200 ng/ml durante 10 minutos. Se extrajo la capa de células de cada cubeta con 0,5 ml de 1% de Tritón X-100. Después se determinaron los niveles de cAMP usando un kit para radioinmunoensayo (Amersham, Arlington Heights Illinois). Los resultados, expresados en la Fig. 5, demuestran que el morfógeno solo estimula un aumento en la respuesta de cAMP mediada por PTH, y, por consiguiente, promueve el crecimiento y la expresión del fenotipo diferenciado por osteoblastos.

Ejemplo 6 Efecto de morfógeno sobre la síntesis de osteocalcina y la tasa de mineralización por osteoblastos en cultivo

La osteocalcina es una proteína específica del hueso, sintetizada por osteoblastos, que desempeña un papel integral en la tasa de mineralización del hueso in vivo. Los niveles circulantes de osteocalcina en el suero se usan como un marcador para la actividad de osteoblastos y la formación de hueso in vivo. Para probar la eficacia del morfógeno in vitro se puede utilizar la inducción de síntesis de la osteocalcina en cultivos enriquecidos con osteoblastos.

Se preparan y cultivan osteoblastos de rata en una placa multi-batea, como para el ejemplo 2. En este ejemplo se cultivaron células en una placa de 24 cavidades o bateas. En este experimento el medio fue suplementado con 10% de FBS, y el día 2, las células se alimentaron con medio fresco o reciente suplementado con 10 mM de \beta-gliceroafosfato reciente o fresco (Sigma, Inc). Comenzando el día 5 y dos veces por semana tiempo después, las células se alimentaron con un medio de mineralización completa, que contiene la totalidad de los susodichos componentes más L (+) - ascorbato fresco o reciente, con una concentración final de 50 \mug/ml de medio. Después se añadió morfógeno a las bateas o cavidades directamente. En este ejemplo, se añadió OP-1 en 50% de acetonitrilo (o 50% de etanol), que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) a no mas de 5 \mul de medio morfógeno/ml. Las cubetas de control recibieron solamente vehículo disolvente. Luego se realimentaron las células y se diluyó 1:1 la muestra del medio acondicionado en un tampón para radioinmunoensayo estándar, que contiene inhibidores de proteasa estándar y se almacenaron a -20ºC hasta ser analizados para comprobar la presencia de osteocalcina. Después se midió la síntesis de la osteocalcina mediante ensayo radioinmunológico estándar usando un anticuerpo específico de la osteocalcina de rata, de venta en el comercio.

Se determinó la mineralización en cultivos a largo plazo (13 días), usando una técnica de teñido de von Kossa modifica en capas de células fijadas: las células se fijaron en 4% paraformaldehido fresco o reciente a 23ºC durante 10 min., seguido de aclarado o enjuagado con 0,9% NaCl frío. Luego las células fijadas se tiñeron para la fosfatasa alcalina endógena con pH 9,5 durante 10 minutos, empleando un kit comercialmente disponible (Sigma, Inc.). Después las células teñidas de púrpura se deshidratan con metanol y se secan al aire. Después de una incubación de 30 minutos en 3% AgNO_{3} a oscuras, se exponen las muestras aclaradas con H_{2}O durante 30 segundos a 254 nm de luz ultravioleta para desarrollar los nódulos de fosfato teñidos con placa negra. Se contaron los focos mineralizados individuales (al menos, 20 \mum en tamaño) con un microscopio de disección y se expresaron como nódulos/cultivo (véase figura 6B).

Como se puede ver en la figura 6A, OP-1 estimula las síntesis de osteocalcina en cultivos de osteoblastos. La síntesis de osteocalcina incrementada en respuesta a OP-1 es dependiente de la dosis y mostró un aumento de 5 veces sobre el nivel basal usando 25 ng de OP-1/10 ml medio después de 13 días de incubación. La síntesis de osteacalcina acrecentada también se puede confirmar mediante la detección del mensaje mBNA osteocalcina elevada (aumento de 20 veces) usando una prueba osteocalcina específica de rata. Además, el aumento en la síntesis de la osteocalcina se correlaciona con la mineralización incrementada en cultivos de osteoblastos de larga duración, como determinados por la aparición de nódulos minerales (compárense las figuras 6A y 6B). OP-1 aumenta la tasa de mineralización inicial unas 20 veces comparado con los cultivos no tratados. Experimentos similares realizados utilizando TGB-\beta indican que TGF-\beta no produce la síntesis de osteocalcina o promueve el proceso de mineralización. Así pues, el morfógeno solo promueve el crecimiento y la expresión del fenotipo diferenciado de osteoblastos.

Ejemplo 7 Efecto de morfógeno sobre la inducción del factor del crecimiento derivado del hueso in vitro

IGF-I e IGF-II son factores del crecimiento derivado del hueso, implicados en acoplar la formación de hueso con la reabsorción del hueso en el ciclo de remodelación o reconstrucción del hueso: El efecto de morfógeno sobre la producción de estos u otros factores del crecimiento óseo-derivados, incluida TGF-\beta, pudiera ser evaluado utilizando el siguiente procedimiento.

Osteoblastos de rata o humanos se prepararon y cultivaron en una placa multi-bateas, como para el ejemplo 2. Las cavidades o bateas de la placa se dividieron en grupos, en los cuales se añadieron diferentes concentraciones de morfógeno (por ejemplo, 0, 1, 10 y 100 ng). En este ejemplo, OP-1 fue el morfógeno empleado. Luego se incubó la placa durante un período prescrito de tiempo, por ejemplo, 72 horas, y se detectó el nivel de IGF, por ejemplo, mediante inmunolocalización, usando un anticuerpo específico para IGFs, disponible en el comercio. OP-1 indujo o produjo el nivel de IGF-I e IGF-II significativamente. Se produjeron más de seis veces de IGF-I y dos veces de IGF-11, seguido de la exposición a 100 ng de OP-1/ml. Además, OP-1 estimuló la producción del factor estimulante de IGF-I, BP3 (proteína 3, que liga IGF-I).

Ejemplo 8 Efecto de morfógeno sobre hueso trabacular en ratas ovariectomizadas (OVX)

Como queda indicado anteriormente, los niveles de fosfatas alcalina de suero y osteocalcina son indicadores de la formación de hueso dentro de un individuo. A fin de determinar el efecto de un morfógeno sobre la producción de hueso in vivo, se miden estos parámetros bajo unas condiciones, que promueven la osteoporosis, por ejemplo, en las que la osteoporosis se produce por la remoción de ovarios en ratas.

Cuarenta ratas de Long-Evans (Charles River Laboratories, Wilmington) con un peso de unos 200 g cada una se ovariectomizaron (OVX), utilizando procedimientos quirúrgicos estándar, y a continuación se operan en ficción. La ovariectomización de las ratas produce un estado osteoporósico dentro de las ratas como consecuencia de la producción de estrógeno menguada. Se proveen alimentos y agua ad libitum. Ocho días después de la ovariectomía, las ratas, preparadas como queda descrito más arriba, se dividieron en 5 grupos: (A), 10 ratas operadas en ficción; (B), 10 ratas ovariectomizadas, que reciben 1 ml de salina tamponada con fosfato (PBS) i.v. en la vena de la cola; (C) 10 ratas ovariectomizadas, que reciben alrededor de 1 mg de 17 \betaE_{2} (17\beta-estradiol E_{2}) mediante inyección intravenosa a través de la vena de la cola; (D) 9 ratas ovariectomizadas, que reciben díariamente inyecciones de aproximadamente 2 \mug de morfógeno por la vena de la cola durante 22 días; y (E) 9 ratas ovariectomizadas, que reciben díariamente inyecciones de aproximadamente 20 \mug de morfógeno por la vena de la cola durante 22 días. En este ejemplo, OP-1 fue el morfógeno testado.

El día 15 y 21 del estudio, cada rata se inyectó con 5 mg de tetraciclina, y el día 22 se sacrificaron las ratas. Después de determinar para cada rata los pesos corporales, pesos uterinos, los niveles de fosfatos alcalinos de suero, los niveles de calcio del suero y los niveles de osteocalcina de suero: Los resultados se muestran en las tablas III y IV.

TABLA III

Pesos corporales, pesos uterinos y fosfatasa alcalina
Grupo	Pesos corporales (g)	Pesos uterinos (g)	Fosfatasa (U/L)
A-FICCION	250.90\pm17.04	0.4192\pm0.10	43.25\pm6.11
B-OVX+PBS	273.40\pm16.81	0.1650\pm0.04	56.22\pm6.21
C-OVX+E2	241.66\pm21.54	0.3081\pm0.03	62.66\pm4.11
D-OVX+OP-1 (2 \mug)	266.67\pm10.43	0.1416\pm0.03	58.09+12.97
E-OVX+OP-1 (20 \mug)	272.40\pm20.48	0.1481 \pm0.05	66.24\pm15.74

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IV

Niveles de calcio del suero y de osteocalcina del suero
Grupo	Calcio del suero (ng/dl)	Osteocalcina del suero (ng/ml)
A-FICCION	8.82\pm1.65	64.6\pm14.77
B-OVX+PBS	8.95\pm1.25	69.01\pm10.20
C-OVX+E2	9.20\pm1.39	67.13\pm17.33
D-OVX+OP-1 (2 \mug)	8.77\pm0.95	148.50\pm84.11
E-OVX+OP-1 (20 \mug)	8.67\pm1.94	182.42\pm52.11

Los resultados presentados en la tabla III y IV muestran que la inyección intravenosa de morfógeno en ratas ovariectomizadas produce un aumento significativo en los niveles de fosfatasa alcalina del suero y de osteocalcína del suero y demuestra que la administración sistémica del morfógeno estimula la formación de hueso en hueso osteoporósico.

Ejemplo 9 Análisis histomorfométrico de morfógeno en la diáfisis de la tibia en ratas ovariectomizadas (OVX)

Se ovariectomizaron (OVX) quince ratas hembra de Long-Evans con un peso de unos 160 g para producir un estado osteoporósico y se pseudooperaron cinco ratas (Charles River Laboratorios Wilmington, MA) como queda descrito para el ejemplo 8. Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum. Veintidós días después de la ovariectomía, se dividieron las ratas en cuatro grupos: (A) pseudo operadas u operadas en ficción (1 ml de PBS mediante inyección intravenosa a través de la vena de la cola (5 ratas); (B) OVX, en las que no se inyectó nada (5 ratas); (C) OVX, que recibieron alrededor de 1 mg de 17\betaE_{2} por inyección intravenosa a través de la vena de la cola (5 ratas), y (D) OVX, que recibieron alrededor de 1 \mug de morfógeno mediante inyección intravenosa a través de la vena de la cola (5 ratas).En este ejemplo OP-1 fue el morfógeno testado.

Las ratas se inyectaron díariamente como queda descrito, durante siete días, excepción hecha que no se dieron inyecciones el día decimotercero. Luego se sacrificaron las ratas el día decimonoveno. Después se retiraron o extrajeron los huesos largos de las diáfisis de la tibia y se fijaron en etanol y se efectuó el análisis histomorfométrico utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica. Los resultados se presentan en la tabla V.

TABLA V

	(A)	(B)	(C)	(D)
Medición	Control	OVX	OVX+E_{2}	OVX+OP-1
Tasa de crecimiento longitudinal (\mum/día)	20.2\pm0.3	19.4\pm0.2	4.9\pm0.5	17.9\pm0.9
Volumen de hueso (BV/TV, hueso vol/vol total)	20.2\pm1.5	13.0\pm1.6	13.7\pm2.1	16.6\pm1.8
Perímetro de hueso esponjoso (mm)	16.2\pm1.8	9.6\pm0.9	11.5\pm1.1	12.2\pm0.7
Perímetro despomoso etiquetado o rotulado (%)	35.5\pm1.5	51.9\pm5.6	58.0\pm4.2	39.2\pm1.9
Tasa de aposición mineral (\mum/día)	1.76\pm0.14	2.25\pm0.16	1.87\pm0.08	1.86\pm0.20

Los resultados presentados en la tabla V confirman los resultados del ejemplo 8, que la inyección intravenosa de OP-1 a ratas ovariectomizadas estimula el crecimiento de hueso para hueso, que ha sido perdido debido a la caída en estrógeno dentro de la rata individual. Específicamente, la inhibición del volumen de hueso esponjoso o reticulado en ratas OVX se repara mediante el morfógeno sistémicamente proporcionado. Además, en ratas tratadas con morfógeno el perímetro esponjoso o reticulado etiquetado y la tasa de aposición de mineral vuelven ahora a niveles medido en las ratas de control pseudooperadas o en ficción. Por otra parte, el tratamiento de morfógeno no inhibe el crecimiento longitudinal de hueso, a diferencia con el tratamiento con estrógeno, que parece inhibir significativamente el crecimiento del hueso. Por consiguiente, la administración sistémica de un morfógeno en concentraciones terapéuticamente efectivas inhibe efectivamente la pérdida de la masa ósea en un mamífero sin inhibir la formación natural del hueso.

Ejemplo 10 Determinación de la presencia de morfógeno en fluidos corporales

OP-1 ha sido identificada en la saliva, el suero de sangre humano y en diversas formas de la leche, incluyendo el extracto de la glándula mamaria, calostro y leche bovina de 57 días. Por otra parte, como se describe más adelante, la proteína extraída del fluido corporal es morfogénicamente activa. El descubrimiento de que el morfógeno está presente, de forma natural, en la leche, junto con la conocida observación de que la OP-1 madura, activa es estable a los ácidos y resistente a la proteasa indican que la administración oral es una vía útil para la administración terapéutica de morfógeno a un mamífero. La administración oral típicamente es el modo preferido de suministro para terapias prolongadas o profilácticas. Además, la identificación de morfógeno en todas las formas lácteas, incluido el calostro, indica que la proteína desempeña un papel significante en el desarrollo histológico, incluido el desarrollo esquelético de jóvenes (véase ejemplo 13, más adelante).

10.1 Detección de morfógeno en la leche

OP-1 se purificó o depuró parcialmente de extracto de glándula mamaria de rata y del calostro bovino y leche de 57 días pasando estos fluidos a través de una serie de columnas de cromotografía: (por ejemplo, intercambio de cationes, fase de afinidad e inversa). En cada paso o etapa se recogió el eluyente en fracciones y éstas fueron testadas para comprobar la presencia de OP-1 mediante inmunotransferencia estándar. Luego se combinaron y se purificaron o depuraron las fracciones inmumorreactivas. Después se examinó el producto final, parcialmente parificado, en cuanto a la presencia de OP-1 mediante el análisis de transferencia Westhern, usando antisueros específicos a OP-1, y se testó en cuanto a la actividad in vivo e in vitro.

OP-1 depurado de las diferentes fuentes lácteas se caracterizó por Western transferencia, usando anticuerpos preparados contra OP-1 y BMP2. Se prepararon anticuerpos empleando protocolos de inmunología estándar bien conocidos en la técnica, y como se describe generalmente en el ejemplo 14, más adelante, usando como sustancias inmunógenas OP-1 y BMP2 producidos por E. coli, de longitud completa.

Como se representa en la figura 7, OP-1 purificada o depurada de calostro reacciona con el anticuerpo anti-OP-1, pero no con el anticuerpo anti-BMP2. En la figura 7 la columna 1 contiene OP-1 reducida, purificada, producida recombinantemente; la columna 2 contiene calostro bovino purificado, y la columna 3 contiene COP-16 reducida, una construcción biosintética que tiene actividad morfogénica y una secuencia de aminoácidos modelada en las proteínas descritas aquí, pero que tienen una homología muy elevada de la secuencia de aminoácidos con BMP2 (véase US Pat No 5,011,691 para la secuencia de aminoácidos COP-16). En la fig. 7A el gel se probó con anticuerpo de anti-OP-1; en la fig. 7B, el gel se probó con anticuerpo anti-BMP2. Como se puede ver en la figura, el anticuerpo anti-OP-1 solamente se híbrida con la proteína en las columnas 1 y 2, pero no 3; mientras que el anticuerpo anti-BMP2 se hibrida con la columna 3 únicamente.

El extracto de la glándula mamaria purificado en la columna y la leche de 57 días también reaccionan específicamente con anticuerpos anti-OP-1, incluyendo anticuerpo preparado contra la OP-1, de E. coli de longitud completa, OP-1 producida por mamíferos, de longitud completa, y los OP-1 Ser-17-cys peptido (por ejemplo, los OP-1 N-terminal 17 aminoácidos).

La actividad morfogénica de OP-1 depurada o purificada del extracto de la glándula mamaria se evaluó in vivo, como sigue. Se preparó una muestra de cada fracción inmunorreactiva de OP-1 del producto final de OP-1 derivado del extracto de glándula mamaria mediante la liofilización de una porción (33%) de la fracción y la resuspensión de la proteína en 220 \mul de 50% acetonitrilo/0,1% TFA. Después de la agitación vorticial, se añadieron 25 mg de matriz de colágeno. Durante la noche se liofilizaron las muestras y se implantaron en ratas de Long Evans (Charles River Laboratorios, Wilmingttbn.MA, de 28-35 días de edad). Cada fracción se implantó por duplicado. Para detalles del procedimiento de implantación de la matriz de colágeno, véase, por ejemplo, la U.S. Pat. Nº 4,968,590, incorporada como referencia. Después de 12 días, se retiraron los implantes y se evaluaron para comprobar la nueva formación de hueso mediante observación histológica.

Los resultados se presentan en la figura 8A, donde "% de actividad" se refiere al porcentaje de formación de hueso/área total cubierta por hueso en la muestra de histología. En la figura, unas barras sólidas o compactas representan implantes, que utilizan OP-1 derivada de extracto mamario, correspondiendo cada barra a una fracción inmunorreactiva del producto purificado o depurado, quedando indicado en el eje X el número de fracción. La barra rayada o sombreada representa un implante, que emplea OP-1 (600 ng) producida recombinantemente. Como se puede ver en la figura, todas las fracciones inmunorreactivas son osteogénicamente activas.

De modo similar, la actividad morfogénica de OP-1 purificada o depurada de extracto de glándula mamaria se evaluó in vitro mediante la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina in vitro con ayuda del siguiente ensayo. Se prepararon muestras de para pruebas o probetas como para el ensayo in vivo, usando 15-20% de fracciones inmunorreactivas individuales, reunidas o recogidas del producto final. Se testó la actividad de la fosfatasa alcalina, como queda descrito anteriormente en el ejemplo 4. Los resultados, presentados en la fig. 8B, indican que las fracciones inmunorreactivas pueden estimular la actividad de la fosfatasa alcalina in vitro. Por otra parte, la actividad se correlaciona bien con la producida por OP-1 altamente purificada, producida recombinantemente. En la fig. 8B, las barras sólidas o compactas representan ensayos realizados con OP-1 purificada o depurada de la glándula mamaria, correspondiendo cada barra a una fracción inmunorreactiva de OP-1 purificada en la columna, quedando indicados en el eje x los números de fracción; la barra sombreada o rayada representa el ensayo efectuado con OP-1 purificada, producida recombinantemente (100 ng ml); y la barra esgrafiada representa fondo.

10.2 Detección de morfógeno en el suero

Se podrá detectar morfógeno en el suero utilizando anticuerpos específicos de los morfógenos. El ensayo se podría realizar usando cualquier inmunoensayo estándar, tal como Western transferencia (inmunotransferencia) y similares. De manera preferente, el ensayo se efectúa usando una columna de afinidad, a la que se liga el anticuerpo específico de morfógenos y a través del cual después se vierte o cuela el suero de la muestra, para extraer selectivamente el morfógeno de interés. Luego se eluye el morfógeno. Se podrá determinar empíricamente un tampón de elución adecuado mediante la determinación de las condiciones apropiadas de ligazón y de elución primeramente con un control (por ejemplo, morfógeno purificado, producido recombinantemente). A continuación se testan las fracciones para comprobar la presencia del morfógeno mediante inmunotransferencia estándar, y los resultados se confirmaron mediante secuenciación N-terminal. De preferencia, se prepara la afinidad empleando anticuerpos monoclonales. Luego se podrán determinar las concentraciones de morfógenos en el suero u otras muestras de fluidos o líquidos, utilizando las técnicas de cuantificación de proteínas estándar, con inclusión la de absorbencia espectrofotométrica o la cuantitación de anticuerpo conjugado.

Más adelante se presenta un protocolo de muestras para identificar OP-1 en el suero. Siguiendo esta metodología general se podrían detectar otros morfógenos en líquidos o fluidos corporales, incluyendo el suero. Además, la identificación de morfógeno en el suero indica que la administración sistémica es un medio idóneo para proveer concentraciones terapéuticas de un morfógeno a un individuo, y que los morfógenos probablemente se comportan de manera sistemática como factores endocrinoideos. Finalmente, usando este protocolo, se pueden detectar fluctuaciones en los niveles de morfógeno endógeno, y estos niveles alterados o modificados se pudieran usar como un indicador de la disfunción del tejido óseo. Alternativamente, se podrán valorar las fluctuaciones en los niveles de morfógeno mediante la monitorización de los niveles de trascripción del morfógeno, sea mediante el análisis estándar de northern transferencia, como queda descrito en el ejemplo 1, o mediante la hibridación in situ, utilizando una prueba etiquetada capaz de hibridizarse específicamente a RNA morfógeno, y los protocolos de hibridación estándar de RNA, bien descritos en la técnica y descritos generalmente en el ejemplo 1.

Se detectó OP-1 en el suero humano, utilizando el siguiente ensayo. Un anticuerpo monoclonal preparado contra mamíferos, OP-1 producida recombinantemente, usando técnicas de inmunología estándar bien descritas en la técnica y descritas generalmente en el ejemplo 14, se inmovilizó mediante el paso del anticuerpo a través de un gel activado por agarosa (por ejemplo, Affi-GeI^{TM}, de Bio-Rad Laboratorios, Richmond, CA, preparado según las instrucciones del fabricante) y se empleó para purificar o depurar OP-1 del suero. Luego el suero humano se pasó a través de la columna y se eluyó con 3M K-tiocianato. Después se díalizaron fracciones de K-tiocianato en 6M urea, 20mM PO_{4}, pH 7.0, aplicado a C8 HPLC columna, y se eluyó con un gradiente de 20 minutos, 25-50% acetonitrilo/0.1% TFA. Homodimeros maduros, de OP-1 producida recombinantemente se eluyeron entre 20-22 minutos. Después se reunieron o recogieron fracciones y se testaron para comprobar la presencia de OP-1 mediante inmunotransferencia estándar, usando un anticuerpo OP-1-específico como, para el ejemplo 10. A. La fig. 9 es una inmunorreferencia que muestra OP-1 en los sueros humanos bajo condiciones reductoras y oxidadas. En la figura, las columnas 1 y 4 son estándares de OP-1, funcionan bajo condiciones oxidadas (columna 1) y reducidas (columna 4). La columna 5 muestra marcadores del peso molecular con 17, 27 y 39 kDa. Las columnas 2 y 3 son sueros humanos OP-1, funcionan bajo condiciones oxidadas (columna 2) y reducidas (columna 3).

Los morfógenos se podrán utilizar en aplicaciones díagnósticas mediante la comparación se la cantidad de morfógeno presente en una muestra de líquidos o fluidos corporales con un valor de referencia predeterminado con fluctuaciones en los niveles del morfógeno del fluido, que indican un cambio en el estado del tejido óseo. Alternativamente, mediante este método se podrían detectar fluctuaciones en el nivel de anticuerpos de morfógenos endógenos, muy probablemente en el suero, usando un anticuerpo u otra proteína ligante capaz de interactuar específicamente con el anticuerpo del morfógeno endógeno. Como indicadores de un cambio en el estado del tejido se podrán emplear fluctuaciones detectadas en los niveles del anticuerpo endógeno.

Ejemplo 11 Formación del hueso periostial y endostial inducida por morfógenos

La reabsorción del hueso inducida por osteoclatos se presenta primariamente en la superficie endostial del tejido óseo. En consecuencia, en el caso de trastornos en la remodelación o reconstrucción del hueso la cavidad de la médula o tuétano se hipertrofia anormalmente, debilitando la capacidad de sostenimiento o resistencia del peso del hueso remanente. El siguiente ejemplo proporciona unos medios para evaluar la habilidad de los morfógenos descritos aquí a fin de incrementar la masa ósea endostial y periostial en un mamífero. En este ejemplo, tanto la formación del hueso perostial como endostial se inducen o produce mediante la inyección directa de un morfógeno en una solución biocompatible directamente al tejido óseo. Como se demuestra más adelante, los morfógenos pueden inducir o producir nueva formación de hueso y aumentar la masa ósea en ambas superficies cuando se suministran al hueso mediante inyección directa. La inyección directa podría ser un modo preferido de administración para proveer concentraciones terapéuticamente efectivas a fin de reducir una cavidad de tuétano o médula hipertrofiada, y/o reparar fracturas y otro daño a la microestructura del tejido óseo.

Se suministró morfógeno al periostio (superficie exterior o periférica del hueso) y al endostio (superficie interior del hueso, por ejemplo, la superficie que reviste la cavidad del tuétano) de un fémur de rata mediante una simple inyección en cada caso. Específicamente, se proveyó morfógeno (por ejemplo, OP-1, 2-20 \mug) al tejido óseo como una suspensión coloidal en salina tamponada o amortiguada con fosfato. Se efectuó la inyección endostial a través de un orificio microscópico hecho con un taladro ortopédico de mano. Después de 7 días, se retiraron o extrajeron los huesos tratados y se prepararon para su evaluación histológica, como queda descrito en la U.S. Pat. nº. 4,968,590. Una cantidad tan pequeña como 2 \mug de morfógeno es suficiente para inducir o causar la nueva formación de hueso en el sitio de la inyección dentro de 4-7 días. Además, la inducción de hueso es dependiente de la dosis. En la fig. 10 se presentan fotomicrografías de la histología. En la fig. "ob" significa hueso viejo, "bm" significa tuétano o médula del hueso, "nb" significa nuevo hueso y "m" significa músculo. La fig. 10A muestra nuevo hueso formado después de la inyección de morfógeno a la superficie endostial. Como se puede ver en la figura, se ha formado nuevo hueso dentro de la cavidad del tuétano o médula del hueso, rellenando la periferia de la cavidad. La fig. 10B muestra nuevo hueso formado a continuación de la inyección de morfógeno a la superficie periostial, que sustituye al músculo normalmente presente.

Ejemplo 12 Efecto de morfógeno sobre la reabsorción del hueso

El efecto del morfógeno sobre la reabsorción del hueso pudiera ser evaluado usando osteoclastos de rata o rodajas o lonchas de hueso bovino, en presencia y ausencia de morfógeno, y determinarse el efecto del morfógeno sobre la formación de hoyos, fosos o fosas (índice de reabsorción). Bajo condiciones estándar los osteoclastos de rata comienzan a reabsorber el tejido óseo, causando formación de hoyos sobre la superficie de la lámina fina de hueso. En este experimento OP-1 fue el morfógeno testado, en concentraciones de 0, 5, 10, 20, 40, 50 y 100 ng/ml.

Los resultados se presentan en la figura 11, en la cual se calcula el índice de reabsorción como un porcentaje del control (por ejemplo, reabsorción del hueso en ausencia de morfógeno), calculado como el número de hoyos o fosas por un área superficial dada de placas finas. Por debajo de 40 ng se mejora la reabsorción del hueso; por encima de 40 ng, OP-1 no tiene efecto claro sobre la reabsorción del hueso. Los resultados ponen de relieve el papel integral que desempeña el morfógeno en la remodelación o reconstrucción del hueso. OP-1 se almacena en el tejido óseo in vivo. En el caso de un ciclo de remodelación o reconstrucción de hueso normal, la concentración local de OP-1 en la superficie es probablemente baja cuando los osteoclastos comienzan a reabsorber hueso, y la concentración baja pudiera mejorar y/o estimular la reabsorción del hueso. A medida que continúa la reabsorción, aumenta la concentración local de OP-1 en la superficie probablemente, hasta una concentración que ya no tiene efecto sobre los osteoclastos, pero continúa afectando el crecimiento y la actividad de los osteoblastos (véanse ejemplos 2-7), estimulando el crecimiento del hueso.

Además, los morfógenos pueden inhibir la multinucleación de las células fagocíticas mononucleares bajo unas condiciones, en las que estas células normalmente serían activadas. Por ejemplo, en ausencia de morfógeno, un material de substrato implantado (por ejemplo, implantado subcutáneamente) compuesto de, por ejemplo, hueso mineralizado, una cerámica tal como óxido de titanio o cualquier otro substrato, que provoca la formación de células gigante multinucleadas, se rodea rápidamente de células gigante multinucleadas, por ejemplo, fagocitos activados estimulados para responder y destruir el objeto extraño. En presencia de morfógeno, sin embargo, las células reclutadas permanecen en su forma de precursor mononuclear y el material matriz se mantiene inalterado. La figura 12 ilustra este efecto de los morfógenos, en una representación esquemática de los resultados histológicos de un substrato de óxido de titanio implantado subcutáneamente. En la figura, "mg" significa células gigante multinucleadas y "ob" significa osteoblastos. El substrato representado en la fig. 12B se implantó junto con el morfógeno (OP-1) y son evidentes osteoblastos recién o nuevamente formados, que rodean el substrato. Por contraste, el substrato representado en la fig. 12A se implantó sin morfógeno y es evidente una formación de células gigante multinucleada extensiva, que rodea el substrato. Por consiguiente, el efecto de los morfógenos en inhibir la pérdida excesiva de masa ósea en un mamífero también pudiera incluir la inhibición de la activación de esta célula.

Ejemplo 13 Efecto de la neutralización de morfógenos sobre el crecimiento del hueso

El efecto de los morfógenos descritos aquí sobre el crecimiento del hueso en mamíferos en vías de desarrollo también se podrá evaluar usando anticuerpos neutralizantes específicos para morfógenos particulares y valorando el efecto de estos anticuerpos sobre el desarrollo del hueso. Específicamente, se podrían preparar anticuerpos monoclonales y/o policlonales anti-morfógeno utilizando metodologías estándar, que incluyen, por ejemplo, el protocolo provisto en el ejemplo 14, más adelante.

Después se suministran regularmente a ratones recién nacidos anticuerpos purificados, por ejemplo, 10-100 \mug/
inyección/día durante 10-15 días. A los 10 o 21 días se sacrifican los ratones y se valora el efecto del morfógeno sobre el desarrollo del hueso mediante peso corporal, examen visual total e histología. En este ejemplo, se emplearon anticuerpos anti-OP-1. La neutralización de morfógenos impidió significativamente el crecimiento corporal, incluido el desarrollo del hueso, como queda indicado por el peso corporal reducido y la longitud del hueso reducida de los mamíferos tratados.

De manera similar, se puede evaluar la actividad de los morfógenos en el desarrollo fetal en el modelo de ratón, utilizando el siguiente ensayo. Se administran inyecciones de labio único, que comprenden 10-100 \mug/inyección de anticuerpo específico para los morfógenos, a ratones hembra embarazadas durante cada día del período de gestación y se evaluó el desarrollo del hueso en nuevos ratones tratados y de control mediante análisis histomorfométrico estándar en el nacimiento. Similarmente, también se podrían suministrar inyecciones de labio único a ratones jóvenes y adultos (por ejemplo, 10-100 \mug) durante un tiempo prolongado (por ejemplo, 10-15 días) para evaluar el efecto sobre el crecimiento y la integridad del hueso y para evaluar la iniciación de la osteoporosis. Se anticipan los anticuerpos para inhibir
la morfogénesis del tejido, incluidos el crecimiento y el desarrollo del hueso, en los embriones en vías de desarrollo.

Ejemplo 14 Ensayo de selección para compuestos candidatos, que alteran o modifican los niveles de los morfógenos endógenos

Compuesto(s) candidato(s), que pudieran ser administrados para afectar al nivel de un morfógeno dado, podrían ser encontrados usando el siguiente ensayo de selección, en el cual se determina el nivel de la producción de morfógenos mediante un tipo de célula que produce niveles medibles del morfógeno, con y sin incubación de la célula en cultivo con el compuesto, a fin de evaluar los efectos del compuesto sobre la célula. Esto se puede llevar a cabo mediante la detección del morfógeno o en la proteína o en el nivel RNA. En la USSN 752,861, incorporada más arriba como referencia también se podrá encontrar una descripción detallada.

14.1 Crecimiento de células en cultivo

Cultivos de células de riñón, cápsulas suprarrenales, vejiga urinaria, cerebro u otros órganos se podrían preparar como se describe ampliamente en la bibliografía. Por ejemplo, se podrán explantar o extraer riñones de roedores neonatales o recién nacidos o jóvenes o adultos (ratón o rata) y emplear en el cultivo de órganos como tejidos enteros o en láminas finas (1-4 mm). Los cultivos de tejidos primarios y las líneas de células establecidas, también derivadas de riñón, cápsulas suprarrenales, vejiga urinaria, cerebro, mama u otros tejidos se podrán colocar en placas multibatea (6 ó 24 bateas o cavidades) de acuerdo con las técnicas convencionales de cultivo de células, y se cultivan en ausencia o presencia de suero durante un período de tiempo (1-7 días). Las células se podrían cultivar, por ejemplo, en medio Dulbecco's Modified Eagle (Gibco, Long Island, NY), que contiene suero (por ejemplo, suero de ternero fetal a 1%-10%, Gibco) o en un medio desprovisto de suero, según se desee, o en un medio definido (por ejemplo, conteniendo insulina, transferrina, glucosa, albúmina u otros factores de crecimiento).

Muestras para testar el nivel de la producción de morfógenos incluyen sobrenadantes de cultivo o lisados de células, recogidos periódicamente y evaluados para la producción de morfógenos mediante análisis de inmunotransferencia (Sambrook et al., eds., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), o una porción del cultivo de células en sí, recogida periódicamente y usada para preparar poliA+ RNA para análisis del RNA, A fin de monitorizar de novo la síntesis de los morfógenos se etiquetan algunos cultivos de acuerdo con procedimientos convencionales con una mezcla de ^{35}S-metionina/^{35}S-cisteina durante 6-24 horas y después se evalúan para comprobar la síntesis de proteínas morfogénicas mediante métodos convencionales de inmunoprecipitación.

14.2 Determinación del nivel de proteína morfogénica

A fin de cuantificar la producción de una proteína morfogénica por un tipo de célula, se pudiera realizar un inmunoensayo para detectar el morfógeno, usando un anticuerpo policlonal o monoclonal específico para esta proteína. Por ejemplo, se podría detectar OP-1 usando un anticuerpo policlonal específico para OP-1 en una ELISA, como sigue.

Se añade a cada batea o cavidad de una placa de 96 bateas o cavidades 1 \mug/100 \mul de IgC de conejo policlonal purificada por afinidad, específica para OP-1 y se incuba a 37ºC durante una hora. Las bateas se lavan cuatro veces con tampón de 0.167 M borato sódico con 0.15 M MaC1 (BSB), pH 8.2, que contiene 0.1% Tween 20. Para minimizar la ligazón no específica, se bloquean las cubetas o cavidades llenándolas completamente con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en BSB e incubando durante 1 hora a 37ºC. Luego se lavan las bateas cuatro veces con BSB, que contiene 0.1% Tween 20. Se añade a cada batea o cavidad por triplicado una alícuota de 100 \mul de una dilución apropiada de cada una de las muestras de sobrenadante de cultivo de células y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación 100 \mul de suero anti-OP-1 de conejo biotinilado (la solución concentrada o madre es aproximadamente 1 mg/ml y diluida 1:400 en BSB, que contiene 1% BSA antes de su uso) se añade a cada cubeta o cavidad y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Después se lavan las cubetas cuatro veces con BSB, que contiene 0,1% Tween 20. Se añaden a cada cubeta 100 \mul de estrepavidina-alcalina (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, Alábanla, diluido 1:2000 en BSB, que contiene 0,1% Twenn 20 antes de su uso) y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Se lavan las placas cuatro veces con 0.5M Tris tamponada salina (TBS), pH 7.2. 50 \mul sustrato (ELISA Amplificación System Kit, Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) a cada cubeta incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se añade 50 \mul amplificador (procedente del mismo kit del sistema de amplificación) y se incuba durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Se para la reacción mediante la adición de 50 \mul de 0,3 M ácido sulfúrico. Se registra la OD a 490 nm de la solución en cada cavidad o batea. Para cuantificar OP-1 en medios de cultivo, se realiza una curva estándar de OP-1 en paralelo con las muestras de prueba.

Se podrá preparar anticuerpo policlonal, como sigue. A cada ratón se da una inmunización primaria de 100 ug/500 \mul monómero de OP-1 producido por E. coli (aminoácidos 328-431 en SEQ ID Nº: 5) en 0,1% SDS mezclada con 500 \mul de Adyuvante Completo de Freund. El antígeno se inyecta subcutáneamente en múltiples puntos en la espalda y flancos del animal. Se refuerza el conejo después de un mes de la misma manera usando Freund's Adjuvant incompleto. Se tomaron sangrías de prueba de la vena auricular siete días más tarde. Se efectúan dos reforzamientos adicionales y sangrías de prueba en intervalos mensuales hasta que se detecta en el suero anticuerpo contra OP-1, utilizando un ensayo ELISA. Después se refuerza el conejo mensualmente con 100 \mug de antígeno y se sangra (15 ml por sangría) los días siete y diez después del reforzamiento.

Se podrá preparar como sigue anticuerpo monoclonal específico para un morfógeno dado. A un ratón se dan dos inyecciones de monómero de OP-1 producido por E. coli. La primera inyección contiene 100 \mug de OP-1 en complete Freund's adyuvante y se da subcutáneamente. La segunda inyección contiene 50 \mug de OP-1 en adyuvante incompleto y se administra intraperitonealmente. A continuación, el ratón recibe un total de 230 \mug de OP-1 (aminoácidos 307-431 en SEQ. ID Nº: 5) en cuatro inyecciones intraperitoneales en varios momentos a lo largo de un periodo de ocho meses. Una semana antes de la fusión, se refuerzan ambos ratones intraperitonealmente con 100 \mug de OP-1 (307-431) y 30 \mug del péptido N-terminal (ser_{293}-Asn_{309}-Cys) conjugado a través de la cisteína añadida a albúmina de suero bovino con agente SMCC de entrecruzamiento. Este refuerzo se repitió cinco días (IP), cuatro días (IP), tres días (IP) y un día (IV) antes de la fusión. Luego las células del bazo del ratón se fusionan a células de mieloma comercialmente disponibles en una razón de 1:1, usando PEG 1500 (Boeringer Mannheim, Alemania), y se emplata y se selecciona la fusión de las células para anticuerpos específicos de OP-1, usando OP-1 (307-431) como antígeno. Luego la fusión de células la selección monoclonal son de acuerdo con procedimientos estándar bien descritos en los textos estándar ampliamente disponibles en la técnica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Thangavel Kuberasampath

\hskip4.1cm

Charles Cohen

\hskip4.1cm

Hermann Oppermann

\hskip4.1cm

Engin Ozkayanak

\hskip4.1cm

David C. Rueger

\hskip4.1cm

Roy H. L. Pang

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TRATAMIENTO PARA PREVENIR LA PÉRDIDA DE Y/O EL AUMENTO DE LA MASA ÓSEA EN ENFERMEDAD ÓSEA METABÓLICA

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Testa, Hurwitz & Thib eauuuuuult

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(B)

CALLE: 53 State Street

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(C)

CIUDAD: BOSTON

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(D)

ESTADO: Massachusetts

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(E)

NACIÓN: USA

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(F)

CIP: 02109

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(v)

FORMA LEGIBLE AL ORDENADOR.:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DEL MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM XT

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS 3.30

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 752,857

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 30-Agosto-1991

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 667,274

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 11-MARZO-1991

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia Genérica 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Cada Xaa indica uno de los 20 \alpha-aminoácidos L-isómeros naturales o un derivado del mismo.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia Genérica 2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en que cada Xaa se selecciona de forma independiente de un grupo de uno o mas aminoácidos especificados como quedan definidos en la especificación.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NOMBRE: Secuencia Genérica 3

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en que cada Xaa se selecciona de forma independiente de un grupo de uno o mas aminoácidos especificados como quedan definidos en la especificación.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Secuencia Genérica 4

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

OTRA INFORMACIÓN: en que cada Xaa se selecciona de forma independiente de un grupo de uno o mas aminoácidos especificados como quedan definidos en la especificación.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(3) DESCRIPCIÓN PARA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: hOP-1 (forma madura)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: mOP-1 (forma madura)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: hOP-2 (forma madura)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMÁCIÓÑ PARA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 139 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: mOP-2 (forma madura)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CBMP2A (fx)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: CBMP2A (fx)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: DPP(fx)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: vgl (fx)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: vgr-1(fx)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ser humano

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: CEREBRO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN; producto = "GDF-1 (fx)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTEEÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: peptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1822 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)TIPO:

AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ser humano

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hipocampo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN:49..1341

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/nombre estandar= hOP1''

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº16

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1822 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nombre estandar= hOP1''

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1873 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: muridos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: embrión

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

UBICACIÓN:49..1393

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= MOP1(CDNA)''

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTEEÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1873 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= MOP1(CDNA)''

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1723 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: hipocampo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN:490..1696

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "hOP2(CDNA)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 402 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "hOP2-PP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17226 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: muridos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: embrión

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN:93..1289

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "mOP2(cDNA)"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 399 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "mOP2-PP"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1368 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN:1..1368

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/NOMBRE ESTANDAR= "60"

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TITULO: GENE 60A de DROSOPHILA

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

RESIDUOS RELEVANTES.EM SEQ ID KO:/: DE 1 a 1368

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS:9214-9218

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: Octubre de 1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 455 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

UBICACIÓN:1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "BHP3"

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTEEÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

NOMBRE/CLAVE:proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

UBICACIÓN:1..104

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "BMP3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

UBICACIÓN:1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(J)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "BHP5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(K)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(L)

UBICACIÓN:1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(M)

OTRA INFORMACIÓN:/nota= "BMP6"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(N)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(O)

UBICACIÓN:1..102

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:: etiqueta o lábel = OPx/nota = EN QUE XAA EN CADA POSICIÓN SE SELECCIONA DE MANERA INDEPENDIENTE DE LOS RESIDUOS QUE SE PRESENTAN EN LA CORRESPONDIENTE POSICIÓN EN LA SECUENCIA C-TERMINAL DE OP1 u OP2 DE RATÓN O SER HUMANO "(VÉASE SEQ: ID N^{os} 5, 6, 7 y 8 6 16, 18, 20 y 22)".

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 29

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: secuencia genérica 5

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en que cada Xaa se selecciona de modo independiente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como queda definido en la especificación.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

63

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NOMBRE: secuencia genérica 6

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: en que cada Xaa se selecciona de modo independiente de un grupo de uno o más aminoácidos especificados como queda definido en la especificación.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

64

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1238 pares de base, 372 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico, aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL U ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ser humano

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: CEREBRO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(P)

NOMBRE/CLAVE:CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(Q)

UBICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "GDF-1"

\hskip6,5cm

/nota="GDF-1 CDNA"

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Lee, Se Jin

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TÍTULO: expresión de crecimiento/factor de diferenciación

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA:Proc. Nat'l Acad. Sci

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN:88

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

RESIDUOS RELEVANTES: 1-1238

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS:4250-4254

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: Mayo de 1991

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 32

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:372 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TRENSADO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: no

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

PROCEDENCIA O GUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ser humano

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: cerebro

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/función/producto= "GDF-1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 33

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (8)

1. Uso de un morfógeno en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedad ósea metabólica mediante administración oral en que dicho morfógeno:

(i) estimula la formación de hueso endocondrial un ensayo óseo in vivo; y

(ii) comprende una secuencia de ácidos aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: una secuencia OPX definida por SEQ ID Nº: 29, la OP-1 humana (SEQ ID N^{os}: 5, 16 y 17), la OP-1 de ratón (SEQ ID N^{os}: 6, 18 y 19, la OP-2 humana (SEQ ID N^{os}:7,20 y 21), la OP-2 de ratón (SEQ ID N^{os}:8, 22 y 23).60A (SEQ ID Nº8:24), GDF-1 (SEQ ID N^{os}:14, 32 y 33),BMP2A (SEQ ID Nº: 9), BMP2B (SEQ ID Nº: 10), DPP (SEQ ID Nº: 23). Vgl (SEQ ID Nº: 12), Vgr-1 (SEQ ID Nº: 13), BMP3 (SEQ ID Nº: 26, BMP5 (SEQ ID Nº: 27) y BMP6 (SEQ ID Nº: 28); y

(iii) es apropiado para una administración en una cantidad eficaz para aumentar el volumen de hueso esponjoso con respecto al volumen óseo total en dicho mamífero, no comprendiendo el medicamento vitamina D u otro inhibidor de la reabsorción ósea.

2. Uso de un morfógeno en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad ósea metabólica mediante administración parenteral, en que dicho morfógeno:

(i) estimula la formación de hueso endocondrial en un ensayo óseo in vivo; y

(ii) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por: una secuencia OPX definida por SEQ ID Nº: 29, la OP-1 humana (SEQ ID Nº: 5, 16 y 17), la OP-1 de ratón (SEQ ID Nº: 6, 18 y 19), la OP-2 humana (SEQ ID Nº: 7, 20 y 21), la OP-2 de ratón (SEQ ID Nº: 8, 22 y 23), 60A (SEQ ID Nº: 24), GDF-1 (SEQ ID N^{os}:14,32 y 33), BMP2A (SEQ ID Nº: 9), BMP2B (SEQ ID Nº: 10), DPP (SEQ ID Nº: 23), Vgl (SEQ ID Nº: 12), Vgr-1 (SEQ ID Nº: 13), BMP3 (SEQ ID Nº: 26), BMP5 (SEQ ID Nº: 27) y BMP6 (SEQ ID Nº: 28); y

(iii) es apropiado para una administración en una cantidad eficaz para aumentar el volumen de hueso esponjoso con relación o respecto al volumen óseo total en dicho mamífero, no comprendiendo el medicamento vitamina D u otro inhibidor de la reabsorción ósea.

3. El, uso según la reivindicación 1 ó 2, en que dicho morfógeno se presenta bajo una forma soluble.

4. El uso según la reivindicación 3, en que dicha forma soluble comprende un morfógeno en asociación con un pro-dominio de morfógeno.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicho trastorno del metabolismo óseo representa un trastorno escogido entre el grupo que comprende la osteoporosis, la osteomalacia y la osteodistrofia renal.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicho trastorno del metabolismo óseo está provocado por una deficiencia nutricional u hormonal.

7. El uso según la reivindicación 2, en que el morfógeno está formulado, para la inyección.

8. El uso según la reivindicación 7, en que el morfógeno está formulado para la inyección intravenosa.