ES2253866T3 - Conjugado de cortisol reducido. - Google Patents

Conjugado de cortisol reducido.

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ES2253866T3 ES99307762T ES99307762T ES2253866T3 ES 2253866 T3 ES2253866 T3 ES 2253866T3 ES 99307762 T ES99307762 T ES 99307762T ES 99307762 T ES99307762 T ES 99307762T ES 2253866 T3 ES2253866 T3 ES 2253866T3
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Brian A. Snyder
Lisa D. Sprague
Shirley Y. Lynn
Paul B. Contestable
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden nuevos conjugados de cortisol reducidos, procedimientos para su preparación y empleo en inmunoensayos para cortisol. En otro aspecto, la invención se refiere a conjugados de cortisoles reducidos como inmunogenes para poner de manifiesto anticortisol o anticuerpos anticortisol reducidos.

Description

Conjugado de cortisol reducido.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a haptenos y marcas conjugadas que tienen especificidad mejorada para anticuerpos anti-cortisol, procedimientos para su preparación y uso en inmunoensayos para la detección de corticol. Más particularmente, la presente invención se refiere conjugados que comprenden peroxidasa de rábano picante y cortisol reducido.
Antecedentes de la invención
El cortisol es el principal glucocorticoide en seres humanos. Se sintetiza y se secreta por la zona fasciculata y la zona reticularis del córtex adrenal. Está implicado en la regulación del metabolismo de carbohidratos, proteínas, y de lípidos. Los niveles de cortisol pueden alcanzar diez veces después de cirugía u otro trauma mayor, a medida que el esteroide actúa para prevenir el colapso vascular, reduce la inflamación, y suprime el sistema inmune.
Existen tres trastornos médicos principales asociados a hiperadrenalismo: síndrome de Cushing, hiperadrenalismo, e hiperplasia adrenal congénita. El síndrome de Cushing es el término usado para describir cualquier afección que se produce por una concentración creciente de glucocorticoide circulante, usualmente cortisol (Clinical Chemistry: Theory, Analysis, and Correlation; Lawrence A. Kaplan, Amadeo J. Pesce, CV Mosby Company, 1989, p 673-4).
La detección y cuantificación de cortisol en suero humano, plasma u orina se requiere para la diagnosis apropiada, tratamiento y seguimiento de afecciones relacionadas con cortisol.
Los inmunoensayos de unión competitiva para cortisol comprenden anticuerpos anti-cortisol, usualmente unidos a un sustrato inmovilizado o inmovilizable y cortisol marcado, o análogos marcados (derivados) de cortisol. Se entenderá que siempre que se haga referencia a cortisol marcado, salvo que se indique otra cosa, el término pretende comprender análogos marcados (derivados) de cortisol. El cortisol marcado compite con cortisol por un número limitado de sitios de unión de anticuerpos anti-cortisol. La señal derivada de cotisol marcado libre o unido se determina como medida de la cantidad de cortisol.
La sensibilidad y especificidad de un inmunoensayo por cortisol dependen del cortisol marcado. Es importante que el cortisol marcado compite efectivamente por el número limitado de sitios de unión de anti-cortisol con esteroides similares estructuralmente a cortisol que pueden estar presentes en una muestra. Por otra parte, no se obtendrá una determinación clínicamente aceptable de la cantidad de cortisol en la muestra.
Los individuos que tienen una deficiencia de al enzima 11\beta-hidrolasa, o que reciben metirapona tendrán niveles aumentados en gran medida de 11-desoxicortisol, que es estructuralmente similar a cortisol (Fundamentals of Clinical Chemistry, Tietz, N. W., W. B. Saunders Co., 1987, p. 569) y potencialmente puede competir con cortisol marcado para la unión a anticuerpo anti-cortisol. Otros esteroides de tipo cortisol que pueden estar presentes en una muestra, que potencialmente pueden competir con cortisol marcado para el anticuerpo anti-cortisol, incluyen prednisolona, cortisona, y
corticosterona. Tal competición con cortisol marcado para el anticuerpo anti-cortisol se denomina reactividad cruzada.
Los ensayos de cortisol comerciales pueden exhibir reactividad cruzada con todos los esteroides identificados anteriormente. Por ejemplo se ha observado una reactividad cruzada con 11-desoxicortisol de más del 10 por ciento; que comprometa gravemente la exactitud del ensayo para cortisol.
Aqua culture 117, p. 351-63 (1993) describe conjugados de cortisol unidos a 3-carboxi metil-oxima para uso en la inducción de anticuerpos y en inmunoensayos.
Sumario de la invención
Los problemas asociados con ensayos de la técnica anterior para cortisol se han evitado usando las marcas conjugadas descritas en esta memoria descriptiva más adelante.
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden conjugados novedosos de cortisol reducido, procedimientos para su preparación y uso en inmunoensayos para cortisol.
En otro aspecto, se refiere a conjugados de cortisol reducido como inmunógenos o haptenos para generar anticuerpos anti-cortisol o anti-cortisol reducido.
Inesperadamente se encontró que conjugados de cortisol reducido de la presente invención compite eficazmente con esteroides similares a cortisol para unirse a anticuerpos anti-cortisol, por lo tanto mostrando significativamente menos reactividad cruzada comparada con los conjugados de cortisol marcados de la técnica anterior. Los inmunoensayos para cortisol que comprenden conjugados de cortisol reducido marcado de la presente invención muestran tanto especificidad mejorada como sensibilidad para la determinación de cortisol.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un conjugado de cortisol reducido de fórmulas IA, IB e ID, que se pueden producir mediante compuestos de fórmula IC.
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en las que X es O, S, sulfonilo, o fosfono; X_{1} es un polímero natural o sintético, marcado o no marcado o una marca; Y_{1} es un grupo de unión o un enlace; X_{2} es un polímero natural o sintético, marcado o no marcado o una marca; Y_{2} es un grupo de unión o un enlace; A_{1} y A_{2} son cada uno hidrógeno o A_{1} y A_{2} juntos forman un enlace simple; B_{1} y B_{2} son cada uno hidrógeno o B_{1} y B_{2} junto forman un enlace sencillo; E_{1} y E_{2} son cada uno hidrógeno o E_{1} y E_{2} juntos forman un enlace sencillo con tal que al menos uno de A_{1} y A_{2}, o B_{1} y B_{2}, o E_{1} y E_{2} sean cada uno hidrógeno.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos de preparación para la preparación de conjugados de cortisol reducido. De acuerdo con lo anterior, los inventores proporcionan un procedimiento para preparar un complejo de cortisol reducido de fórmulas
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en las que X, X_{1}, Y_{1}, X_{2}, Y_{2}, A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, E_{1} y E_{2} son como se han definido anteriormente, comprendiendo:
hacer reaccionar un compuesto de fórmula
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con un agente reductor.
Se proporciona un procedimiento alternativo para preparar un conjugado de cortisol reducido de fórmula:
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en las que X, X_{1}, Y_{1}, X_{2}, Y_{2}, A_{1}, A_{2}, B_{1}, B_{2}, E_{1} y E_{2} son como se han definido anteriormente, que comprende las etapas de:
(i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula
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con un agente reductor, formando por lo tanto el compuesto IA o IC; y
(ii) opcionalmente, hacer reaccionar el compuesto IA o IC con un primer agente de acoplamiento, formando por lo tanto un compuesto de fórmula
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en la que G_{1} es un grupo de acoplamiento;
(iii) opcionalmente, hacer reaccionar X_{2} con un segundo agente de acoplamiento, formando por lo tanto X_{2}-G_{2}, en la que G_{2} es un agente de acoplamiento capaz de formar un enlace covalente con el grupo G_{1} de acoplamiento, y en la que G_{1} y G_{2} pueden ser iguales;
(iv) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IA o IC con X_{2}-G_{2} en la que G_{2} es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de X1, formando por lo tanto el conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(v) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IIIA o IIIC con X_{2} en la que G_{1} es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de X_{2}, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(vi) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IIIA o IIIC con X_{2}-G_{2}, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID.
Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a procedimientos para la determinación cualitativa o cuantitativa de cortisol que utilizan los conjugados novedosos de cortisol reducido marcado.
De acuerdo con lo anterior, los inventores proporcionan un procedimiento para realizar un ensayo competitivo para cortisol que comprende las etapas de:
A)
poner en contacto una muestra sospechosa de contener cortisol con
(i)
un receptor inmovilizado o inmovilizable que se une a cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable,
(ii)
un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID como se ha definido anteriormente, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
B)
detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
En una realización alternativa, el procedimiento de ensayo descrito anteriormente se puede combinar con una etapa en la que el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido se separa del conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
También se proporciona un procedimiento alternativo para realizar un ensayo competitivo para cortisol usando un elemento analítico seco, el elemento analítico seco que comprende
a) una zona de dispersión,
b) una o más zonas de reactivos,
c) un soporte, y
junto o de manera separada en una o más de las zonas, un receptor inmovilizado que se une al cortisol y opcionalmente, un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID definido anteriormente, en el que el procedimiento comprende las etapas de:
A)
poner en contacto la zona de dispersión del elemento analítico seco con
i)
una muestra sospechosa de contener cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado,
ii)
conjugado de cortisol reducido marcado si no está presente en el elemento analítico seco, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado,
B)
opcionalmente, separar el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido del conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado; y
C)
detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
En otra realización, la presente invención se refiere a haptenos o inmunógenos de fórmula IA, IB, IC o ID como se ha definido anteriormente y las composiciones que comprenden los inmunógenos. También se refiere a procedimientos de producción de anticuerpos anti-cortisol que usan inmunógenos de la presente invención, inmunizando un animal huésped, retirando sangre del huésped, y separando anticuerpos que se unen a cortisol del suero o plasma de la sangre del animal huésped. En otro procedimiento relacionado, el bazo, timo u otro órgano que se puebla con las células productoras de anticuerpo se retira del animal huésped inmunizado, los hibridomas que secretan anticuerpos se preparan usando células productoras de anticuerpos del bazo, timo u otro órgano así retirado, y anticuerpos que se unen a cortisol se seleccionan a partir de ellos.
Todavía en otro sentido, la presente invención se refiere a procedimientos de reducción de reactividad cruzada en inmunoensayos para cortisol usando conjugados de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID.
Los conjugados de cortisol reducido marcado de la presente invención, como se ha establecido, efectivamente compiten con los esteroides de tipo cortisol para unión a anticuerpos anti-cortisol, por lo tanto mostrando significativamente menos reactividad cruzada comparada con los conjugados de cortisol marcado de la técnica anterior.
Descripción detallada
La invención se describe en detalle con respecto a un conjugado de cortisol reducido específico que comprende albúmina sérica bovina y peroxidasa de rábano picante. Esto se ha hecho para ilustrar la presente invención y no se pretende que limite la invención de ninguna forma a este ejemplo específico. También se contemplan oros conjugados de cortisol reducido, sus síntesis y uso como inmunógenos, o como marcas de cortisol reducido en inmunoensayo competitivo y no competitivo y en otros aspectos que son evidentes de las enseñanzas presentadas en esta memoria descriptiva o serían conocidos por los expertos en la técnica.
Un "polímero natural" para el propósito de la presente invención se define en esta memoria descriptiva como el que se origina de una fuente biológica incluyendo pero sin limitación a:
microorganismos, hongos, virus, ser humano, vaca, cerdo, ratón, gato, perro, rata, o insecto. Tales polímeros naturales incluyen proteínas, péptidos, glicoproteínas, lipoproteínas y especies recombinantes y químicamente modificadas de los mismos, polisacáridos, celulosas, colágenos, y látex. Los ejemplos algo más específicos incluyen, dextranos, porcino, ser humano, ratón, rata y albúmina sérica bovina o globulinas, estreptavidina, anticuerpos, enzimas tales como peroxidasa, \beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina.
Un "polímero sintético" se define en esta memoria descriptiva como un polímero que no se origina necesariamente directamente de una fuente biológica. Es una que se prepara mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, por medio de una condensación de monómeros usando polimerización en emulsión, polimerización de cadena iónica, polimerización de carbonilo, polimerización de cadena radical y similares. Incluye, homopolímeros tales como poliacrilamidas, polimetacrilatos, poliestirenos, poliacrilamidas sustituidas, polimetacrilatos, y poliestirenos, y copolímeros que comprenden dos o más unidades monoméricas diferentes, tales como archilamida o archilamida sustituida, estireno y estireno sustituido, y similares, como conocerán los expertos en la técnica. Incluye copolímeros de bloque, copolímeros de injerto, polímeros acuosos solubles y acuosos insolubles y las combinaciones covalentes y no covalentes con polímeros naturales.
El término "marca" como se define en esta memoria descriptiva incluye: elementos químicos, compuestos, y enzimas que son capaces de detectarse directamente o indirectamente usando, por ejemplo, espectrometría de absorción, fluorescencia, o de reflectancia, o procedimientos de detección por radiación. Una marca puede ser un polímero natural o sintético. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante es tanto una marca como un polímero natural. Pero una marca no es necesariamente un polímero natural o sintético.
Una marca capaz de detección directa es una que es intrínsecamente capaz de producir una señal detectable. Tales marcas incluyen sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de fluorescencia, o fosforescencia, tal como pero no limitados a fluoresceína, y derivados de los mismos, y N-(3-fluorantil)maleimida, radionucleídos, tal como carbono 14, tritio y fósforo 32, y similares. Se incluyen sustancias que tienen absorción espectral tal como pero sin limitación a, tintes de azo-oxo, azo-tetrazo, azina, oxazina, tiamina, quinolina, indamina, pirona y pirazolona.
Una marca que es capaz de detección indirecta requiere la presencia de una o más sustancias adicionales para la producción de la señal detectable. Tales marcas incluyen típicamente pero no se limitan a enzimas que requieren la presencia de un(os) sustrato(s), cofactor(es), metal(es) y similares. Las peroxidasas, más particularmente, peroxidasa de rábano picante, una marca común, requiere un dador de electrones y un agente oxidante, tal como luminol, leucotintes de di- o triarilimidazol y peróxido de hidrógeno para producir un producto quimioluminiscente o tinte, respectivamente. También se contemplan otras enzimas, tales como \beta-galactosidasa, glucosa oxidasa y fosfatasa alcalina, y similares.
En general, las marcas incluyen etiquetas radiactivas, enzimas, cromóforos, fluoróforos radicales libres estables, y cofactores de coenzimas, inhibidores y efectores alostéricos.
Un "agente reductor", para el propósito de la presente invención, es cualquier compuesto o mezcla de reactivo que es capaz de hidrogenar un doble enlace, tal como dobles enlaces carbono-carbono, carbono-nitrógeno, carbono-oxígeno y carbono-azufre.
Los agentes reductores útiles incluyen pero no se limitan a: hidruro de aluminio, hidruro de aluminio y litio, boorohidruro y las sales de los mismos. También se pueden usar hidrogenación catalítica sobre paladio, platino o níquel u otros procedimientos de hidrogenación. El borohidruro de sodio es un agente reductor preferido.
Un "grupo de unión" se define en esta memoria descriptiva, como un grupo químico que comprende uno o más átomos. Un grupo de unión conecta una molécula a otra, tal como un polímero natural a un polímero natural, un polímero sintético a un polímero sintético, un polímero natural a un polímero sintético, una marca a un polímero natural o sintético, una marca a cortisol reducido, una marca a cortisol, y así sucesivamente, a través de la formación de un enlace covalente con cada una de las moléculas se une.
El grupo de unión puede comprender un heteroalquilo sustituido o no sustituido de cadena lineal o ramificada, tal como oxalilo, tioalquilo, aminoalquilo, alquenilo sustituido o no sustituido, uno o más anillos heterocíclicos hidrocarburos sustituidos o no sustituidos, uno o más anillos arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos tales como pero no limitados a, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, quinolinilo, y quinazolinilo.
Las macromoléculas de unión o acoplamiento, tales como polímeros naturales o sintéticos a otras moléculas, o pequeñas moléculas de unión, tal como cortisol o análogos de cortisol, a macromoléculas se conoce bien en la técnica. Específicamente con respecto a cortisol, carbono 3 (C3) es reactivo con nucleófilos que incluyen, aminas, oximas, y tioximas y otros conocidos en la técnica. Las especies nucleófilas pueden ser un agente de acoplamiento (unión), una marca, un polímero natural o sintético. Si es un agente de acoplamiento u otra especie que tiene un grupo funcional reactivo (una marca, etc.), tras enlace covalentemente al C3 de cortisol se puede hacer reaccionar con otro agente de acoplamiento u otras especies que tienen un grupo funcional reactivo de manera apropiada. El cortisol así derivatizado se puede usar como el punto de partido para preparar los compuestos de cortisol reducido de al presente invención. Los detalles de química de acoplamiento y grupos de unión se pueden encontrar en numerosas publicaciones, que incluyen, las patentes de Estados Unidos números, 3.654.090; 3.791.932; 3.875.011; 4.016.043; 4.040.907; 4.092.479; 4.213.894; 4.243.749; 4.376.165; 4.410.643; 4.752.658; 4.828.978; 4.879.249; 4.997.772; 5.053.497; 5.106.732; 5.147.777;
5.155.166; 5.162.219; 5.177.023; 5.284.948; 5.298.403; 5.308.749; 5.374.516; 5.391.483; 5.397.695; 5.401.633;
5.527.709; 5.543.311; 5.578.457; 5.652.346; 5.763.588; 5.770.390 y las referencias identificadas en esos documentos; Yoshitake y col., Eur. J. Biocehm., 101, 395, (1979) y Tjssen, en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, p. 221-278 (1985) y las referencias en esos documentos.
En resumen, un grupo de unión y molécula al que se une de manera covalente se puede conectar a través de enlaces amida, éster, éter, tioéster, y disulfuro. Por ejemplo, la química de acoplamiento o de unión que incluye hacer reaccionar las moléculas a acoplar con agentes de condensación tales como carbodiimidas, maleimidas, etilcloroformiato, y glutaraldehído se conocen bien en la técnica.
El término "muestra" se refiere a cualquier sustancia que pueden contener el analito de interés. Una muestra puede ser un fluido biológico, tal como fluido cerebro espinal, semen, secreciones vaginales, esputo, fluido de ascitos, fluido lacrimal, sudor, suero, plasma, orina, sangre entera o componentes de sangre entera incluyendo glóbulos rojos y blancos, plaquetas, y otros fluidos o tejidos del cuerpo que puede contener el analito de interés. Opcionalmente, las muestras se pueden obtener de agua, suelo y plantas.
Los inmunoensayos, que pueden tener ventaja de reacciones inmunológicas naturales, han encontrado uso amplio como técnicas analíticas en la química clínica. Debido a la especificidad de las reacciones, son particularmente ventajosos en la cuantificación de los analitos biológicos, que están presentes en muy baja concentración en fluidos biológicos. Tales analitos incluyen, por ejemplo, anticuerpos, fármacos terapéuticos, narcóticos, enzimas, hormonas, proteínas, etc.
En inmunoensayos de unión competitiva, un analítico marcado (el término incluye análogos inmunocompetentes del analito) se coloca en competición con analito no marcado para reacción con una cantidad fija de un receptor apropiado, que a menudo se inmoviliza sobre un sustrato sólido, o es capaz de inmovilización de los mismos. El analito marcado que se une al receptor se separar del analito marcado libre. Las concentraciones no conocidas del analito se pueden determinar a partir de la señal medida de o bien el analito marcado o libre. La reacción procede como sigue:
Analito + analito marcado + receptor \leftrightarrow analito-receptor + analito-receptor marcado.
Los inmunoensayos se pueden llevar a cabo en solución, en dispositivos de de ensayo en los que se pueden separar los componentes solubles e insolubles, o en elementos analíticos secos. Los inmunoensayos pueden ser heterogéneos u homogéneos como se conocen estos términos en al técnica. En los ensayos heterogéneos los inmunorreactivos marcados unidos o libres (analito marcado o receptor marcado para un analito) se separan antes de la medición de la señal; mientras que, en la separación de los ensayos homogéneos no se requiere la separación de inmunorreactivo marcado libre del unido. Los conjugados de cortisol reducidos de la presente invención se pueden usar tanto en ensayos homogéneos como heterogéneos.
Numerosas publicaciones con relación a inmunoensayos y procedimientos de inmunoensayos, que incluyen muchas de las publicaciones relacionadas a grupos de unión y química de acoplamiento, están disponibles para el medico. Las publicaciones adicionales incluyen: las patentes de Estados Unidos números 4.382.745; 4.670.381; 4.483.921; 4.517.288; 4.822.747; 4.824.778; 4.829.012; 4.839.299; 4.847.194; 4.847.195; 4.853.335; 4.855.226; 4.857.453;
4.857.454; 4.859.610; 4.863.876; 4.868.106; 4.868.130; 4.879.219; 5.663.054; 5.776.933 y todas las referencias citadas en esos documentos; e Immunoassays in The Clinical Laboratory, Nakamura y col., eds., Alan R. Liss, Inc., (1979); Quantitative Enzyme Immunoassay, Engvall y col., eds. Blackwell Scientific Publications, (1978; Clinical Chemistry, Sommer y col., v. 32, p. 1770-1774, (1986); Clinical Chemistry, Sommeret y col., p 201-2206 (1990); A Primer for Multilayer Immunoassay, Berke, American Chemical Society Conference Proceeding, p. 303-312, PLenum Press, (1988); y todas las referencias citadas en esos documentos.
En los inmunoensayos competitivos el analito marcado y la muestra que contiene el analito libre se pueden añadir de manera simultánea o separada a una mezcla que comprende receptor inmovilizado o inmovilizable que se une al analito.
En el caso de elementos analíticos secos, el analito marcado y receptor inmovilizado cuando están presentes juntos en el elemento antes de ponerse en contacto con la muestra, están preferiblemente presentes en zonas separadas.
Los materiales y medios convencionales para ensamblar los elementos analíticos de película seca se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 3.867.258; 3.992.158; 4.042.435; 4.050.898; 4.066.403; 4.153.668; 4.258.001; 4.292.272 y 4.430.436.
Se conocen bien los procedimientos para obtener anticuerpos que se unen a una molécula específica mediante inmunización de animales huésped adecuados. Tales procedimientos están bien documentados y se describen, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Methods in Immunology, Garvey, J. S., Cremer, N. E. y Sussdorf, D. H., W. A. Benjamin, Inc., tercera edición (1977) y Handbook of Experimental Immunology, editado por Weir, D. M., Blackwell Scientific Publications, tercera edición., (1978).
Los procedimientos de producción de las líneas celulares de hibridoma para secreción de anticuerpos también se conocen bien, y se proporcionan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 4.950.592; 5.338.671; y 5.650.324.
Preparación de cortisol-3-CMO-BSA reducido marcado con HRP
Se proporciona un procedimiento más adelante que ilustra la preparación de un conjugado de cortisol reducido marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP). En este procedimiento la reducción d conjugado de oxima de cortisol de albúmina sérica bovina (cortisol-3-CMO-BSA) con borohidruro de sodio se llevó a cabo antes de al conjugación con HRP; sin embargo, la reducción de cortisol se puede llevar a cabo después de acoplarse a HRP.
Existen tres sitios para la reducción de cortisol-3-CMO-BSA que se marcan mediante un asterisco en la estructura mostrada más adelante.
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Cualquiera o todos estos sitios se pueden reducir mediante tratamiento con un agente reductor o mezcla reductora que es capaz de hidrogenar un doble enlace, produciendo productos que tienen un solo sitio reducido como en las estructuras mostradas más adelante.
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así como, los compuestos que tienen dos de los sitios reducidos, produciendo tres especies reducidas diferentes, y los tres sitios reducidos, como es fácilmente evidente para los expertos en la técnica. Otros conjugados que comprenden cortisol, que tras reducción producen los compuestos genéricamente definidos en las estructuras 1A, 1B, 1C y 1D, de manera análoga formarán especies de cortisol reducido diferentes como se ha ejemplificado anteriormente con cortisol-3-CMO-BSA. Los compuestos que tienen un enlace covalente a C3 de cortisol que no es capaz de hidrogenarse se reducirán solamente en en el doble enlace carbono-carbono del anillo y/o y el doble enlace carbono-oxígeno (grupo carbonilo) de cortisol. Todas las formas reducidas individualmente o en cualquier combinación se contemplan en al presente invención.
Ejemplo 1 Preparación de conjugado de oxima de 3-cortisolcarboximetil a albúmina sérica bovina (3-CMO-BSA) Oxima de hidrocortisona-3-(O-carboximetilo)
Albúmina sérica bovina (cortisol-3-CMO-BSA) se preparó como se describe más adelante. Como alternativa, se puede comprar de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
Una solución madre de N-hidroxisuccinimida (NHS) se preparó disolviendo 20 mg de NHS en 3,0 ml de dioxano. Una solución madre de diciclohexilcarbodiimida (DCC) también se preparó disolviendo 30 mg de DCC en 2,50 ml de dioxano. A un vial de vidrio que contenía 40 mg de oxima de cortisol-3-carboximetilo (cortisol-3-CMO) se añadieron 1,744 ml de la solución madre de NHS y 1,744 ml de la solución madre de DCC. La mezcla se agitó y se incubó durante tres horas a la temperatura ambiente de la habitación. A 1,00 gramos de albúmina sérica bovina (BSA) se añadieron 12 ml de solución de carbonato ácido de sodio 0,1 M. La solución se mezcló hasta transparencia y al final de las tres horas de incubación, se añadieron 3,0 ml del cortisol-3-CMO activado a la solución de BSA. La mezcla se agitó y se incubó a temperatura ambiente durante dos horas. Después de las dos horas de incubación, se añadieron 15 ml tampón de fosfato sódico 0,1 M, cloruro sódico 0,3 M (pH 6,0). La mezcla se filtró a través de Sartorius Minisarts de 5,0 \mum y 0,45 \mum y después de cromatografió sobre una columna de 5 x 70 cm Superdex 200 PG a un caudal de 8,0 ml/min. El primer tubo correspondiente al pico principal y las diez fracciones siguientes (un minuto) s recogieron y se combinaron. Combinación de las fracciones. Las fracciones combinadas se dializaron contra agua durante aproximadamente quince minutos. Se repitió la diálisis. El dializado se filtró través de un Sartorius Minsart de 0,2 \mum y se liofilizó en pequeñas alícuotas y se mantuvieron congeladas hasta necesidad.
Ejemplo 2 Reducción y activación de cortisol-3-CMO-BSA
Cortisol-3-CMO-BSA (24 mg) se disolvió en 4 ml de una solución de carbonato de sodio 50 mM y cloruro sódico 100 mM a pH 9,5. Una alícuota, 0,60 ml, de una solución acuosa de borohidruro de sodio (4 mg por ml) se añadió a la solución de Cortisol-3-CMO-BSA, que después se mezcló de manera continua durante treinta minutos a 20ºC. Después el pH se ajustó, usando aproximadamente 200 \mul de una solución de fosfato sódico 0,5 M, hasta un valor en un intervalo entre pH 7,2 y 7,5 para descomponer cualquier exceso de borohidruro. La solución se mezcló cuidadosamente hasta que cesó la efervescencia y se dejó en reposo durante aproximadamente quince minutos. Después al mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de 0,45 \mu y se cromatografía sobre una columna de Sephadex D25 1,6 x 14,5 cl preequilibrada con fosfato 0,02 M, pG 7,0, a un caudal de aproximadamente 40 ml/hora. El tamaño de fracción recogida era aproximadamente 0,67 ml (1 minuto). Se combinaron quince de las fracciones más concentradas, es decir, las fracciones que tienen una gran absorción a 280 nm.
4-(N-Maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succidinimilo (SMCC) se disolvió en N,N-diemtilformamida (DMF) a una concentración final de 9,6 mg/ml. A 10 ml del cortisol-3-CMO-BSA reducido recogido de la cromatografía de la etapa anterior, se añadieron 186 \mul de al solución de SMCC. La solución se mezcló cuidadosamente después se incubó durante una hora a 20ºC. la reacción se inactivó con 800 \mul de una solución acuosa de glicina (10 por ciento, peso 7 volumen). La mezcla de reacción inactivada se cromatografió después sobre una columna de 3,22 x 10 cm cargada con Sephadex G25 perequilibrada con una solución de fosfato 0,1 M y ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), pH 6,0, a un caudal de aproximadamente 161 ml/h. Se recogieron las fracciones de 1 mililitro. Ochos de las fracciones más concentradas (que tienen una absorción mayor a 280 nm) se combinaron y se usaron para conjugación a HRP activada.
Ejemplo 3 Activación de HRP
Se disolvió peroxidasa de rábano picante en fosfato o,1 M, pH 7,5, a una concentración final de HRP de 10 mg/ml. Cinco mililitros de la solución de HRP se transfirieron a un vial de reacción de 20 ml, Una alícuota de 0,5 ml de ácido S-acetiltioacético, N-hidroxisuccidinimil éster (SATA) en DMF (25 mg/ml) se añadió al vial de reacción que contenía la solución de HRP. La solución se mezcló cuidadosamente después se incubó a 20ºC durante sesenta minutos. Una alícuota (500 \mul) de una solución que contenía EDTA 0,05 M e hidroxilamina 2,5 M a pH 7,0 se añadió ala mezcla de reacción, se mezcló cuidadosamente, y se incubó después a 20ºC durante 15 minutos. Después al mezcla se cromatografió sobre una columna de 2,0 x 10 cm de Sephadex G25 preequilibrada con una solución de fosfato 0,1 M y EDTA 5 mM a pH 6,0, usando un caudal de aproximadamente 63 ml por hora. Se recogieron las fracciones de un minuto. Se combinaron once de las fracciones más concentradas (que tenían una gran absorción a 403 nm).
Ejemplo 4 Acoplamiento de HRP activada y cortisol-3-CMO-BSA activado
21,47 ml del cortisol-3-CMO-BSA reducido, activado se combinaron con 11,55 ml de HRP activado. La solución se mezcló cuidadosamente, y se incubó a 20ºC durante 20 horas. Una alícuota (224 \mul) de una solución que contenía mercaptoetanol en agua (1 por ciento de tiol por volumen) se añadió a al mezcla de reacción y al solución se mezcló cuidadosamente y se dejó en reposo durante aproximadamente 15 minutos. Una alícuota de 476 \mul de una solución que contenía 10 mg/ml de N-metilmaleimida en DMF, se añadió después a la mezcla de reacción, y se incubó veinte minutos adicionales después de la mezcla. La mezcla de reacción de cromatografía después sobre una columna de 4,4 x 50 cm que contenía Superdex 200 preequilibrado con una solución de fosfato 0,1 M y NaCl 0,3 M a pH 6,0 usando una caudal de aproximadamente 344 ml por hora. Se recogieron las fracciones de un minuto. Se combinaron veintiséis de las fracciones más concentradas alrededor de los primeros eluatos que tienen una absorción máxima de 280 nm.
La absorción de la combinación conjugada (cj) y al solución de HRP (en el ejemplo 2 anterior, antes de la activación y diluida suficientemente en tampón fosfato para obtener una medición de la absorción exacta) se determinaron a 280 nm y 403 nm, A_{403}cj, A_{280}cj y A_{403} HRP, A_{280} HRP respectivamente. La concentración del conjugado de cortisol-3-CMO-BSA-HRP reducido basándose en al concentración de BSA se determinó a partir de estas mediciones usando la fórmula siguiente:
BSA (mg/ml) = A_{280}cj - (A_{403}cj / [A_{403} HRP/A_{280} HRP]) / 0,76
Ejemplo 4 Evaluación del conjugado
La evaluación del cortisol-3-CMO-BSA reducido marcado con HRP (de aquí en adelante denominado conjugado HRP-RC) se evaluó usando una metodología de ensayo basado en quimioluminiscencia de Ortho-Clinical Diagnostic VITROS Eci.
Se prepararon los siguientes reactivos para uso con el sistema VITROS Eci.
Solución de la marca
-
100 ng/ml de cortisol-3-CMO-BSA-HRP reducido (o 20 ng/ml de una marca de conjugado HRP-cortisol comparativo, que no es una marca conjugada de al presente invención, pero que se llevó a cabo a través del mismo procedimiento como la marca de la invención excepto para la etapa de reducción)
-
2,86 g/l de fosfato sódico dibásico, anhidro
-
7,3 g/l de fosfato sódico monobásico, anhidro
-
0,01 g/l de ferricianuro potásico
-
2,5 g/l de ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico
-
20 g/l de albúmina sérica bovina
-
0,03 g/l de apo-peroxidasa de rábano picante
-
alfa globulina bovina al 0,2% (Cohn fracción IV-I)
-
1 g/l de gamma globulina bovina
-
5 g/l de suero de oveja normal
-
100 g/l de plasma humano depurado con carbón
-
20 g/l de Kathon (un conservante que comprende 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona y 2-metil-4-isotiazolin-3-ona)
-
pH 6,4
Anti-cortisol policlonal de oveja biotinilado Solución
-
1,5 \mug/ml de anti-cortisol gamma globulina de oveja biotinilada
-
21 g/l de fosfato sódico dibásico, anhidro
-
1,8 g/l de cloruro sódico
-
1,1 g/l de ácido cítrico
-
20 g/l de albúmina sérica bovina
-
20 g/l de catón
-
pH 5,4
Reactivo de lavado
-
0,39 g/l de ácido bórico
-
0,35 g/l de tetraborato de disodio
-
0,58 g/l de cloruro sódico
-
0,50 g/l de TRITON X -100 (octilfenoxipolietoxi etanol)
-
0,5 p/p de BRONIDOX (un conservante que comprende 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano)
-
pH 8,4
Reactivo de señal
Parte A
-
3,88 g/l de ácido bórico
-
14,2 g/l de tetraborato de sodio
-
1,06 g/l de citrato de sodio
-
0,08 g/l de benzoato de sodio
-
0,10 g/l de azida sódica
-
0,008 g/l de ácido dietilentriaminopentaacético
-
0,58 g/l de glicina
-
0,40 g/l de luminol
\newpage
Parte B
-
0,90 g/l de ácido cítrico
-
1,68 g/l de citrato de sodio
-
0,08 g/l de benzoato de sodio
-
0,62 g/l de perborato de sodio
-
0,06 g/l de 3-cloro-4-hidroxiacetanilida
-
5,84 g/l de cloruro sódico
Una alícuota (75 \mul) de anticuerpo de oveja biotinilado anti-cortisol, 30 \mul de muestra, suero que comprende cortisol o un esteroide estructuralmente similar a cortisol ((más adelante), y 75 \mul de conjugado HRP-RC se añadieron a un recipiente de muestra VITROS ECi al que se había preañadido estreptavidina. La solución se incubó a 37ºC durante 30 minutos, después se lavó usando el reactivo de lavado indicado anteriormente.
Una alícuota de 200 \mull de la solución de reactivo de señal indicada anteriormente (100 \mull de la parte A y 100 \mull de la parte B combinadas justo antes de uso) se añadió después al recipiente de muestra. La solución se incubó durante 5 minutos a 37ºC, después se determinó la intensidad de quimioluminiscencia.
Ejemplo 5 Reactividad cruzada
El procedimiento anterior se usó para determinar al concentración de reactivo cruzado potencial (esteroide que es estructuralmente similar al cortisol: 11-desoxicortisol, prednisolona, corticosterona y cortisona) que desplazaba cincuenta por ciento de una cantidad fija de un conjugado de cortisol marcado con HRP comparativo (cortisol no reducido, HRP-NRC) o conjugado HRP-RC unido a una cantidad fija de anticuerpo anti-cortisol.
Se añadieron niveles variados del reactivo cruzado potencial a los recipientes de muestra o bien el conjugado de cortisol marcado comparativo (cortisol no reducido, HRP-NRC) o conjugado HRP-RC de la presente invención, como se ha descrito anteriormente.
La concentración de reactivo cruzado que da como resultado un medición de señal luminosa que corresponde a 50% del máximo alcanzable (todo el conjugado desplazado) se determinó y se usó para calcular el porcentaje de reactividad cruzada como se describe más adelante y cuyos resultados se enumeran en la tabla 1.
El porcentaje de reactividad cruzada se define como la concentración de cortisol que desplazaba el 50% del conjugado comparativo de HRP-NRC (o el conjugado HRP-RC) dividido por la concentración de reactivo-cruzado que desplazaba el 50% del conjugado comparativo HRP-NRC (o el conjugado HRP-RC) multiplicado por 100 como se determina por el procedimiento de ensayo descrito en esta memoria descriptiva anteriormente.
TABLA 1 Porcentaje de reactividad cruzada
Compuesto Marca comparativa de Marca de la invención
HRP-NRC de HRP-RC
cortisol 100 100
prednisolona 34,8 24,6
11-desoxicortisolo 28,4 2,2
cortisona 5,5 1,8
corticosterona 4,4 3,3
Estos datos muestran claramente que el conjugado HRP-RC representativo de la presente invención proporciona significativamente menos reactividad cruzada en un inmunoensayo para cortisol. De acuerdo con lo anterior, los ensayos de cortisol que utilizan cortisol reducido marcado como se describe en la presente invención mostrará una precisión mejorada; dando como resultado diagnosis mejorada, tratamiento y seguimiento.
La presente invención se ha descrito en detalle con referencia particular a ciertas realizaciones de la misma.

Claims (13)

1. Un conjugado de cortisol reducido de fórmula
12
13
14
en las que X es O, S, sulfonilo, o fosfono;
X_{1} es un polímero natural o sintético, marcado o no marcado o una marca;
Y_{1} es un grupo de unión o un enlace;
X_{2} es un polímero natural o sintético, marcado o no marcado o una marca;
Y_{2} es un grupo de unión o un enlace;
A_{1} y A_{2} son cada uno hidrógeno o A_{1} y A_{2} juntos forman un enlace simple;
B_{1} y B_{2} son cada uno hidrógeno o B_{1} y B_{2} junto forman un enlace sencillo; y
E_{1} y E_{2} son cada uno hidrógeno o E_{1} y E_{2} juntos forman un enlace sencillo;
con tal que al menos uno de A_{1} y A_{2}, o B_{1} y B_{2}, o E_{1} y E_{2} sean cada uno hidrógeno.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que X es O y X_{1} es albúmina sérica bovina.
3. El conjugado de la reivindicación 2, en el que Y_{1} es metilencarboniloxi.
4. El conjugado de la reivindicación 3, en el que X_{2} es una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante.
5. El conjugado de las reivindicaciones 1 a 4, en una composición acuosa.
6. Un procedimiento para preparar un conjugado de cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende:
hacer reaccionar un compuesto de fórmula
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17 
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con un agente reductor.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente reductor es borohidruro.
8. Un procedimiento para preparar un conjugado de cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4:
que comprende:
(i)
hacer reaccionar un compuesto de fórmula IIA como se ha definido en la reivindicación 6, con un agente reductor, formando por lo tanto un compuesto de la fórmula IA; y
(ii)
opcionalmente, hacer reaccionar un compuesto de la fórmula IA o IC, en la que IC es un compuesto que tiene la fórmula
18
en la que X_{1}, Y_{1}, B_{1}, B_{2}, y E_{2} son como se han definido en la reivindicación 1;
con un primer agente de acoplamiento, formando por lo tanto un compuesto de fórmula
19
o
20
en la que G_{1} es un grupo de acoplamiento;
(iii) opcionalmente, hacer reaccionar X_{2} con un segundo agente de acoplamiento, formando por lo tanto X_{2}-G_{2}, en la que G_{2} es un agente de acoplamiento capaz de formar un enlace covalente con el grupo G_{1} de acoplamiento, y en la que G_{1} y G_{2} pueden ser iguales;
(iv) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IA o IC con X_{2}-G_{2} en la que G_{2} es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de X_{1}, formando por lo tanto el conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(v) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IIIA o IIIC con X_{2} en la que G_{1} es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional de X_{2}, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID;
(vi) opcionalmente hacer reaccionar el compuesto IIIA o IIIC con X_{2}-G_{2}, formando por lo tanto conjugado de cortisol reducido IB o ID.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el primer agente de acoplamiento es N-hidroxisuccinimida éster del ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico y el segundo agente de acoplamiento es N-hidroxisuccinimidil éster del ácido S-acetiltioacético.
10. Un procedimiento para realizar un ensayo competitivo para cortisol que comprende las etapas de:
A)
poner en contacto una muestra sospechosa de contener cortisol con i) un receptor inmovilizado o inmovilizable que se une a cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable, ii) un conjugado de cortisol reducido marcado de fórmula IA, IB, IC o ID como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que al menos una de X_{1} y X_{2} es un polímero natural o sintético marcado o una marca, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
B)
detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
11. Un procedimiento para realizar un ensayo de unión competitiva para cortisol usando un elemento analítico seco que comprende: a) una zona de dispersión; b) una o más zonas de reactivos; c) un soporte y d) juntos o separadamente en una o más de las zonas, un receptor inmovilizado que se une a cortisol, y, opcionalmente, un conjugado de cortisol reducido marcado como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en las que al menos X_{1} y X_{2} es un polímero natural o sintético marcado o una marca, en las que el procedimiento comprende las etapas de:
A)
poner en contacto la zona de dispersión del elemento analítico con
i)
una muestra sospechosa de contener cortisol, formando por lo tanto cortisol que está unido y cortisol que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable,
ii)
el conjugado de cortisol reducido marcado si no está presenten el elemento analítico seco, formando por lo tanto un conjugado de cortisol reducido marcado que está unido y un conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable;
B)
detectar o bien el conjugado de cortisol reducido marcado que está unido o el cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable como una medida de la cantidad de cortisol en la muestra.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 o reivindicación 11 que comprende además la separación del conjugado de cortisol reducido marcado que está unido del conjugado de cortisol reducido marcado que no está unido al receptor inmovilizado o inmovilizable.
13. Un procedimiento para producir anticuerpos anti-cortisol que comprende las etapas de:
A)
inmunizar un animal hospedador con un conjugado de cortisol reducido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, por lo tanto produciendo anticuerpos que se unen a cortisol;
B)
aislar los anticuerpos que se unen a cortisol a partir del suero o plasma sanguíneo del animal hospedador; o
C)
retirar el bazo, tejido linfático u otros tejidos u órganos poblados con células productoras de anticuerpos.
D)
retirar las células productoras de anticuerpos;
E)
preparar hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos;
F)
seleccionar los hibridomas que producen anticuerpos que se unen a cortisol; y
G)
aislar los anticuerpos que se unen a cortisol.
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