JPS6020149A - 免疫化学的測定方法及びその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ハプテンの新しいタイプの免疫化学的測定方
法及びその方法に利用するのに適した新しいタイプの測
定試朶に関する。 とくに、本発明は例えば血液、［せその他の体液や体液
成分などの如き被検体中の微量なハブテンを免疫化学的
に測定する沖］定方法及びその試桑に関し、侃れプξな
ｉ′（′実性、信６１度、精度、敏感ＥＬ及び高い特異
性をもって、偽反応生起のトラブルを伴うことなしに、
再現性良く安定且つ容易な操作で、短時間に被検体中の
ＩＲ−ｒ：、なハプテンを免ずＣ日ヒ学的に測冗できる
新しいタイプの辿１定方法及びその方法に利用するに適
した新しいタイプの測定試ゼ；憔に関する。 更に詳しくは、本発明は、− Ｌ４）　ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系
高分子化合物、若しくは該結合物が約０．０１〜約２ミ
クロンの粒径の高分子ラテックス担体に化学的に結合し
て成るハゾデン担（・１担体 及び ＣＢ）　上記ハプテンに対する単一種のモノクロナル抗
体担持担体 を用い、被検体中のノ・ブテンによる上記（Ａ）及び（
１３）両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴
とする上記イ、皮検体中のノ・ブテンの免疫化学的測定
方法に関する。本発明はまた、（Ａ）　ハプテン又はそ
の化学的変１４１ミ物を、化学的に結合せしめたカルボ
キシル、Ｊ、（；含有水溶性モノオレフィン系高分子化
合物、へしくけ該結合物が約０．０１〜約２ミクロンの
粒径の高分子ラテックスＪ’ＴＩ体に化学的に結合して
成るハプテン担持担体 及び （１３）　上記ハシテンに対する単−計重のモノクロナ
ル抗体Ｊｌ［］　Ｊ寺担体 から成ることを特徴とするノ・ブテンの免疫化学的測定
試薬にも関する。 従来、例えば血液、尿その他の体液や体液成分などの如
き検体中に存在する生物学的活性を有する微用物グ・Ｔ
を、免疫化学的手段で測定する方法は古くから知られて
いる。かかる免抑化学的測定法として、例えば赤血球を
担体として用い、これを抗原又は抗体で感作し、これオ
被恢戒中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫化学
的凝集又は凝集阻止反応を生起させて、該機上）４物質
を測定する方法も既に知られている。また、担体として
寿血球の代り（・（、非生物学的粒子として例えば合成
樹脂ラテックス、ベントナイト、Ｊロジオン、コレステ
ロール結晶、水晶等を免疫化学反応における固体ｊＬＪ
体として用いることも知られている（以上例えば％開明
５０−８２２３０　号公開公！４　）。 このような抗原抗体反応を利用した免疫化学的手法によ
って伎検体中の抗原の存在（定性）もしくはその；Ｈ：
゛＞　Ｋ　（定置）を測定検出するのに従来もつとも普
通に利用されてきた抗体感作担体は、ハ？リクロナル抗
体感作担体であった。 １９７５年Ｃ、ｋｆｉｌｓｔｅｉｎらがマウスのミエロ
ーマ＃ｉｌｌ　ｌ１ｉｑと牌絃中の抗体産生細胞とをＩ
？ｌｉｌ　Ｉ！ｉ・ＩＦｌ？Ｉｔ合し、該、Ｉ’ｌｌ＋
胞からモノクロナル抗体の産生に成功して以来、細胞θ
１１（合技術分野における著るしい技術の進歩に伴って
、モノクロナル抗体産生＃ｌＩＩ　Ｉｉｉ、１株の形成
、それを利用したモノクロナル抗体の産生が容易となシ
、このようなモノクロナル抗体を利用した抗原の免疫化
学的測定方法に関する提案がなされるようになった。 このような提案として、特開昭５７−８６０５１号の提
案が知られている。この提案に於ては、２個又はそれ以
上の異ｆ＝ｎ　Ｆのモノクロナル抗体が同一の抗原に対
応［７て用いられることを特ＦＩ（とじ、少くとも２個
の抗体分子に抗原をｈ″ｉ合させる免疫化学的反応を利
用した抗原穴１：１−法が提３Ｓされている。そして、
この提案には、従来の抗体すなわちポリクロナル抗体が
対応抗原と反応して沈殿物を生ずる公知現象とは全く異
なって、モノクロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物
を生成することがなく、モノクロナル抗体で被キ］ｑさ
れた例えば赤血球、ラテックス球、全屈粒子などの如き
担体粒子が対応抗原の存在下で凝集しないことが記載さ
れている。 この提案に於ては、従来公知の知見とは異って、モノク
ロナル抗体は対応抗原と結合して沈殿物を生成し々いと
いう事実があるにも拘わらず、複数種の異種モノクロナ
ル抗体を使用すると抗原と結合して沈殿物を生成できる
という新しい知見が得られたことを記載し、それゆえに
、この提案においては、上述のとおり、少なくとも二種
のｂｌ　Ｉｊｌｔモノクロナル抗体の使用を必須とする
抗原定量法に特定されている。 更に、この提案には、このような複数種の異種モノクロ
ナル抗体のイＵ：用に上ってもなセ、（１・Ｉ［−ｉの
感度と！１ヶ異性に閂［７て必ずしも好結果が得られる
わけではなく、全く効果的ではないことさえあり得るた
め、可能な限りの結合の仕方を試１トた上で（發削謂塾
１尺しなけれ（ｒ−１：ならないことを記ｊ７１ｉ　Ｌ
、ている。 このようなｒ′、を数種の！Ａ種モノクロナル抗体の使
用を必キｆ■とする州似の提案として、！１−〒開昭５
７−１１８１５９号の提案も知られている。 そして、これらモノクロナル抗体を利用する抗原の免疫
化学的測定方法に門する従来提案に於ては、従来のポリ
クロナル抗体の±−）合とは異なって、単−利ｉのモノ
クロナル抗体は対応抗体抗原と結合して沈殿物を生成せ
ず、ネ１す、’（＜　ｉｌの異Ｆ、−ｒモノクロナル抗
体の使用によっては、しめて沈殿物を生成できるという
事実から当然のことながら、祝数秤の５！秤モノクロナ
ル抗体の使用が必須であるという点で共通している。 しかし力から、前者の提案に記載嘔れているように、キ
ノクロナル抗体と対応抗原との凝集を生じさせるために
複数種の異種モノクロナル抗体を担体に感作［７、その
感作押体を使用し７てもなお、測定の感度と特異性に関
して必ず［７も好結果が達成できるとはかぎらない欠陥
があり、更には、利用し得るよう外凝集さえ生ぜず、全
く効果的でないことさえあるという重大な技術的欠点が
あった。 そして、満足すべき凝集性を与えるだめに、例えばより
多種の異種モノクロナル抗体を使用すればするほど、当
然のことながら、モノクロナル抗体の利用による高い特
異性の利点はより多く失われていく不都合を伴うことが
Ｆη避できないという両立し難い技術的課題が生じてい
た。 すなわち、モノクロナル抗体は抗原分子中の一つの！特
定部位を特異的に認識する能力を有する抗体であるが、
二種以上よシ多がのモノクロナル抗体を利用すればする
ほど、二種以上より多種の特定部位を同時にＮ５　ｎ６
する結果となり、モノクロナル抗体の利用による高い７
行異性の利点がより多く失われていくという両立し解い
技術的課題をｆ′ｔ′う。 更に又、抗原分子の多数の部位を１ｚ−元弁できる従来
のポリクロナル抗体利用の場合と（牝γなって、−上述
したように、モノクロナル抗イ・トハ一つの！１テ定部
位１７か認説しないので　、Ｈｑリクロナル抗汁利用の
場合に比して、凝集反応におけるＩ’４４ｊｔ　４ｉ１
、ｉｌ、〒、；るしく弱いことが予７！、＋Ｊされ、事
実、上述したよりに、モノクロナル抗体利用の従３１′
、、、ｔξΣ案においては甲一種のモノクロナル抗体の
利用では対１１−抗原と結合して沈殿物をイ］二成し０
いので朽シ吋市の！？、　Ｊｉｌｉモノクロナル抗体の
利用が必須てを・ることを教え、更に、前述した前者の
提案においては、７Ｕ′４種の異■゛１１モノクロナル
抗体を利用しでもなお、凝集を生じない場合があるとい
う技’０：’Ｉ的欠陥のあることを開示している。 本発明者等は、モノクロナル抗体を免疫化学的な抗原測
定法に利用する際の上述の如き両立し煎。 い技術的課題ないし技術的欠陥を解決できる方法を開発
すべく研究を行ってきた。 その結果、モノクロナル抗体利用における前記従来知見
とは全く異なって、ノ・ブテンを担体にｔｕ持させたハ
プテン担持担体の場合には、該ノ・ブテンに対する単一
種のモノクロナル抗体を担体に担持させた単一種のモノ
クロナル抗体感作担体との間に、１１而足すべき凝集反
応が生起し、斯くて、モノクロナル抗体利用における従
来知見に必須であった複数種の異種モノクロナル抗体を
利用する必要が全くないという予想外の新しい知見を得
た。 このモノクロナル抗体利用における全く新しい知見に基
いて更に研究を進めた結果、 （Ａ）　ハプテン又はその化学的変性物を、化学的に結
合せしめたカルボキシ）し基含有水溶性モノオレフィン
系高分子化合物、若しくは該結合物が約００１〜約２ミ
クロンσ）粒径の高分子ラテックス押体に化学的に鈷合
しＣ成るノ・ブテン担持担体 及び （Ｂ）　上Ｂｅ　ノ・ブテンに対するＪ４’＋、種のモ
ノクロナル抗体ＪＥＪ持ＪＵ体 の組み合わせから成る新［７いタイプの試ソ、１９を用
い、：ｔ！！ｘ　検体中の）・ブテンによる−に記（Ａ
）及び（１３）両試Ｊ、１≦成分のｍ１反応に対する凝
集阻止反応を測定するという新しいタイプ０の免ｑｒｙ
化学的な上記イウ検体中のノ・ブテンの測定方法が提］
Ｊ１．でき、顕著に優れた確実性、信頼度、Ｊ’＋１度
、感度及び顕著に高い抗原！１“ソ異性をもって、偽反
応牛起のトラフ゛ルを伴うことなしに、優れだＰ５現性
、安定性月つ容易な操作で、短時間に被検体中の微量な
ノ・ブテンを免疫化学的に測定できることを見い出しだ
。 更に又、上記の顕著に優れた作用効果は、対象とするハ
プテンに対するモノクロナル抗体の種類に実質的な彩管
を受けない利点を有し、斯くて広汎な任意のノ・ブテン
の免疫化学的測定方法に適用可能であることがわかった
。 従って、本発明の目的はモノクロナル抗体を利用したノ
・ブテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法及びその
方法に利用するのに適した新しいタイプの測定試す；１
ミを提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記ｉ・（から一層明らかとなるであろう。 本発明に於いて）・ブテン（不完全抗原）とは、生体内
に於てそれ自体で抗体敷産生能を有する抗原すなわち全
光抗原を除外する意味であって、低分子化合物で、それ
自体は抗原性を有しないが、抗ｙｙ、性を有する物り′
１、例えｔ　［、”；白′ｊ”ｊ、多わ１゛１類の如き
抗原性を有する高分子化合物と結合

【７ヤ抗原性を示し
、このような抗原性物質で１・ＩＩ物を免疫して生成し
た抗体と反応性を有するものをいり。かかるハプテンと
して、’ｌ”Ｊに、生体内に存在する成分（生理活性成
分およびその代、１１１産物を含む）および生体に投与
された系物訃よびその化１ｑ１産物が本発明の対象とす
るノ・ブテンとして升要である。 同−山ル（（人の出願に係わるＩ庁開昭５５−５２９４
５及び特開昭５５−５２９４６号には、（σ）ハプテン
又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカルボキ
シル基イ３有水ｉ’１’ｉ性モノオレフィン系高分子化
合物が、約（１，Ｑｌ〜約２ミクロンの粒径の１、−ち
分子ラテックスに化！！７４的に結合していることを１
１）包とする辛ｉ　ノ：ｉ、な（テ已疫化学的測定試祭
、及び該（α）ノ・フ０テンＪ’Ｑ　！−’＋ラテック
スと、 （／Ｊ）　・・ブテン抗体を約００１〜約２ミクロンの
粒径の高分子ラテックスにＥ・；（作し又は化ｑ的に結
合しまた抗体：ｌｒ！、ｌ＝〒ラデツクス或はハプテン
抗体（抗血清） とから成ることを特徴とする・・ブテンの免疫化学的測
定方法（特開昭５５−５２９４５号）又は（Ｃ）ハシテ
ンまたはその化学的変性物を化学的に結合せ１７めだカ
ルボキシル基含有７Ｊ＜溶性モノオレフィン系高分子化
合Ｍ：Ｊと、 （の　ハプテン抗体を担体に化学的に結合させるか゛ま
たは感作させたハプテン相持」１体とから在るハシテン
の免疫化学的測定状Ｊｊ≦（特開昭５５−５２９４６号
）、更には、上記（ａ）及び（ｂ）、もしくは（Ｃ）及
び（カを用い、被検体中の）・ブテンによる上記（ａ）
、（ｂ）あるいは（Ｃ）、（の両試票のδ″・召集阻止
反応を測定することを特徴とする）・ブテンの免疫化学
的測定方法が提案されている。この４２案に於ては、上
記（ｂ）及び（のにおける抗体としてモノクロナル抗体
を除外はしていないが、該モノクロナル抗体利用につい
ては、とくにはも及しておらず、亥だその具体例も示さ
れていない。 本発明においては、上記提、；ｊ＝における該（ｂ）及
び（のとして、該提案が具体的に開示しておらず且つま
た前述したモノクロナル抗体利用の従来提案とは異なっ
て、（Ｂ）上記ハシテンに対する単−柿のモノクロナル
抗体相持４ｕ体を厖択利用することによって、顕著に代
れた確実性、イ１ｊ頼度、棺鹿、感度及び顕著に高い抗
原１１♀具性をもって、偽反応生起のトラズルを伴うこ
となしに、優れだＰ］現性、安定性且つ容易な掃作で、
短時間に７１・ν塗体中の微量なハプテンを免疫化学的
に測定できる。 本発明で用いる（、（）ハプテン又はその化学的変性物
を、化学的に結合ぜしめたカルボキシルノ１与含有水溶
性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結合物が
約０．Ｏ１〜約２ミクロンの粒径の高分子ラテックス担
体に化学的に結合して成るハプテン担持」１休に利用す
るハプテン又はその化学的変性物ならびに変性手法、該
ハプテン又はその化学的変性物を化学的に結合させるカ
ルボキシル基含有水溶性モノオレフィン系高分子化合物
（便宜上、ＣＷｐと呼ぶことがちる）、該ＣＩ？”　ｐ
への該ハシテン又はその化学的変性物の化学的結合方法
及び結合物、更に、該結合物と高分子ラテックス担体と
の化学的結合手段ならびに斯くて形成されたハプテン４
１１持担体などについては、同−出紙（人の出願に係わ
る上記特開昭５５−５２９４５号に詳にｌｆｌに記載さ
れており、本うａ明において利用できる。 利用するハプテンの例としては、以下の如きものが例示
できる。 （１）　ステロイド系ハプテンニー （ｉ）　例エバエストロン、エストラジオール、エスト
リオール、エステトロール、エクイリン、エクイレニン
等の卵胞ホルモン、 （ｉｉ）　例えば、プログ９ステロン；ゾレグナンジオ
ール；プレグナントリオール；１９−ツルーエチステロ
ンおよび酢６タクロルマジノン等の合成黄体ホルモンへ
９の黄体ホルモン、（ｉｉｉ）　例えば、テストステロ
ン、デヒドロエピアンドロステロン、ソヒドロテストス
テロン、アンドロスゾロン、エチオコラノロンイγの男
性ホルモン、 （１ｖ）例えば、コルチゾール、コルチゾン、デオキシ
コルテコステロン、アルドステロン、テトラヒドロアル
ドステロン、テトラヒドロコルチゾール等の副腎皮質ホ
ルモン、 （ｖ）　ビタミンＪ）類；コレステロール；例えｉ・′
：Ｉ：コール酸、デスオキシコール酸、ケノコール酸等
の胆汁ｒ；：？：強心性ステロイド；サポニン；ザポケ
゛ニンウ、テのその他のステロイド類。 （ｎ）　生理活性アミン類ニー （ｉ）　エピネフリン、ノルエピネフリン、ド・ぐミン
、エフェドリン等のカテコールアミンおよびそれらの代
謝産物； （ｉｉ）　モルフイン、コディン、ヘロイン、モルフイ
ングルクロナイド、コカイン、メスカリン、ノぐノぐペ
リン、ナルコチン、ヨヒンビン、レセルピン、エルゴタ
ミン、ストリキニーネ等ノ生理活性アルカロイド類； （ｉｉｉ）　Ｌ　Ｓ　Ｉ）　、アンフェタミン、メゾロ
ノ々メート、メタアンフェタミン等。 （ｍ）　その他のノ・ブテン類ニー Ｔ　Ｉ？ｉｌ　、　Ｌｌｌ　−Ｒ１１の如き抗原性を有
しない低分子ペグチド辺；ソヨードサイロニン、トリヨ
ードサイロニン、サイロキシン等の甲状片？ホルモン；
プロスタグランソンＥ２、プロスタグランジンＥ３、ブ
ロスタグランソンｐ′ｌα〜覇）プロスクダジンソ７　
ｐ；ｆｉ、　；ビタミンＡ１　ビタミンＢグ５１１（）
ワ１ｊえ（・じビタミン７３．。 Ｂ２　、Ｂｏ　、ＩＪ、２等）、ビタミンＥ１　ビタミ
ンに等のビタミン用；ペニシリン、アクチノマイシン、
クロロマイセチン、テトラサイクリン等の抗性物質。 利用するハプテンの例と［７ては、」１謁例示の如き生
体内に存在する成分、生体内に投Ｌｊされたト２、物お
よびそのイい■産物などＣ角（、（多くのハプテン類を
あげることン％できるが、’４Ｖ　’ｊ’ｉ’ｉ　ｌ叫
でいうハゲテンｉｔ、＋ｉは上記例示のハノテンツ（１
１にト：・髭定されるものではない。 本発明においては、上記例示の如きハプテン＆」″、そ
のままで或はそれを化学的に変性した化学的ψ：性物と
してＣＦＰと化学的に結合せしめる。このようなハプテ
ンの化学的変性法として従来種々の方法が知られており
、本発明で利用できる。ノ・ブテンがＣＷｐの有する官
能基たとえばカルボキシル基や水酸基と化学的に結合し
得るように該ノ・ブテンを化学的に変性する如何なる変
性法を採用してもよい。かかるハゲテンの変性法として
は、特にハプテンにカルボキシル基、第１級又は第２級
アミノ基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第１級ア
ミン基を導入する化学的変性法が好適である。かかる方
法として例えば以下の如き変性法があげられる。 カルボニル基を有するハプテンに関しては、カルボキシ
ルメチルオキシムに変換することによってカルがキシル
基を導入することができ（例：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ
。 ２３４．１０９０−１０９４頁（１９５９、）　）、或
は、例えばブロム化したのちチオグ、リコール酸と反応
せしめて、カルボキシル基を持たせる（例：５ｔｅｒｏ
ｉｄｓ、　Ｌ　９巻３５７−３７５頁（１９７２））こ
ともできる。 カルボニル化合物のオキシムを５７元すると一級アミノ
化合物になることは周知であるが、これもハシテンとし
て利用できる。 まだ水［Ｖ夕基を有する）・ブテンは、例えｔ」：モノ
クロル酢酸と反応させて、カルホキ・／メチルエーテル
化する方法（例：　５ｃｉｅｎｃｅ、１６８巻。 １３４７−１３４８頁（１９７０））、或は無水コハク
酸と反応させてヘミザクシネートとする方法（例；Ｊｏ
ｎブｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｊｌｎ、ｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ。 ３３巻、７７５−７８２頁（１９７１））肴がある。 フェノール性水酸基を有するノ・プアンではその水酸基
のオルト又はパラ位に例えば・ξラカルボキシベンゼン
ソアゾニウム塩をジアゾカツプリングさせて、カルづζ
キシル基を導入する（例：　５ｔｅ−ｒｏｉｄｓ、　ｌ
　８巻、５５５−５６３頁（１９７１））ことも可能で
ある。 さらにまだステロイド類の代謝物であるグルクロナイド
は、そのカルボキシル基を利用することができるしく例
：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　５ｔｅｒｏｉｄ、　Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、３巻、２７５−２８８頁（１
９７２））、そのカルボキシル基を直接利用できなけれ
ば、適当なソアミン誘導体と反応させて、アミン化合物
に変換することもできる。 二級アミノ基をもつノ・ブテンに於ては、例えばそのア
ミン基をＮ−保護アミノアルキルノ・ログン化合物でア
ルキル化したのち保護基を説キＩＦすれば一級アミン誘
尋体に変えることができ（例：ＦＥ１３　Ｓ　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ、３６巻、３３９−３４２頁（１９，７３））、
或いは例えＵブロム酢酸エステルと反応させたのち加水
分解することによυ、カルｇ　キ’／　ル基をもプコ伊
る（例：　Ｃｈｅｍｉｃｒｔｌ　ａ、ｎ、ｄｐｊｒ、ａ
、ｒｍａｃｅｖ、ｔｉｃａｔ　）Ｊｔｒ、１ｌａｌゝｉ
ｎ、、　２　５　巻　＋　３　３　８　−８４０頁（１
９７７））こともできる。 適当な官１′１μ基を持たないハプテンは寸ず例えば倣
生物による水酸化反応のよう庁手段をｊ＋１’）じ、つ
いで」二連の方法によって請求むる官能基に久４・′１
することもできる。 更に、上記例示の如きハプテンン又はその化学的変性物
を化学的に結合ぜしめるのに利用するカルボキシル基含
有水溶性モノオレフィン系高分子化合物（ＣＪＶｐ）と
しては、カルボキシル基を含（ｊする水浴性モノオレフ
ィン系高分子化合物の如何なるものでもよい。ここで「
ス１、品＋’ｌｌとは該病勺子化合物の少くともｌ爪量
部を１０００重口２部の蒸留水に添加した１局舎にｉ、
Ｌ９１］な！ｆ′〜１りを形成することをいう。該高分
子化−８物の清＋ｆＴ度がＪ、’：ｐｌｉ：下限庖ン１
ｊ〜足する限り、その俗解Ｐｙはいくら大てあってもよ
い。また該高分子化合物の平均Ｍ量分子量に３、約１０
８〜１０７又はそれ以上であってもよく、通常数万乃至
数百万のものが好適に使用できる。またかかる高分子化
合物は、官能基としてカルボキシル基の他に水酸基（−
０１＃）を有していてもよく、之等の官能基は、ノ・ブ
テン又はその化学的変性物の官能基および後述する高分
子ラテックス担体の有する官能基との化学的結合に関与
すると共に、法高分子化合物に水溶性をも付−りする。 本兆明で使用するかかる高分子化合物は、生理的には不
活性物質と見られるものであって、一般に抗原性をイ〕
しないものである。 壕だ、かかる高分子化合物としては、例えば、アクリル
酸又はメタアクリル酸のホモ−又はコーポリマー；マレ
イン酸と酢酸ビニルとの共重合体又はぞのケン化物、マ
レイン酸と例えばビニルアルコール、低級アルキルビニ
ルエーテル、アクリル酸又はその低級アルキルエステル
、メタアクリル酸又はその低級アルキルエステルとの共
重合体又は所望によりそれらの加水分フ宜物があげられ
る。 之等の高分子化合物は１だ、例えばアクリル酸又はメタ
アクリルｒ、ｔと、例えばアクリル前のβ−ヒドロキシ
エチルエステル又ｔよアクリルアミドとの共重合物、或
は前記のモノマーを構成単位として含有する三元重合体
であってもよい。 本発明に於て、前記例示の如きノ・ブテン又はその化学
的変性物と、上記例示の如き高分子化合物との化学的結
合は、アミド結合又はエステル結合によって行うことが
できる。アミド結合反応を利用するのが好ましい。この
ようなアミド結合反応もしくはエステル結合反応は、そ
れ自体公知の手法を利用して行うことができる。 例えげ、ハプテン又はその化学的変性物をノ・ブテンで
代表して説明すると、ノ・ブテンが例えばアミノ基を有
しそしてＣＵ７　ｐがカルボキシル基を有する場合、又
はその反対の場合、ハゲテンとＣＷｐとを下記の如き方
法によりアミド結合にょシ化学的に結合することができ
る。 アミド結合でハプテンとｃ　ｎｙ　ｐとを結合する方法
ニー（１）　カルボジイミド法 アミン基とカルボキシル基との間で脱水縮合によりアミ
ド結合を形成させる方法で、両成分の溶液中に等モルも
しくは僅かに過剰のカルボジイミド化合物を加えて室温
又は水冷下に反応させることによシ目的を達することが
できる。カルボソイミド自身は尿素誘導体に変換する。 −Ｎｉ１２＋−ＣＯＯＩＩ　＋　Ｒ−Ｎ　＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ
−＋　、−ＮＪＩ−ＣＯ−十Ｒ−ＮＩＩＣＯＮ１１−Ｒ
反応溶媒としてはそれ自身が反応にあづかる官能基を有
しない限り特に限定されることはなく、例えば酢酸エチ
ル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ツメチルホルム
アミド、クロロポルム等が使用できる。珠だ任意の割合
で水を含有する系であってもよく、水溶液中で反応させ
ることもできる。用いるカルボジイミド化合物としては
、有イ六溶１！Ｉ；　中の反応にはジシクロへキシルカ
ルボソイミドが最もよく用いられ、含水不溶がＩ−中で
の反応には例え←じ１−エチル−３−（３−ツメチルア
ミンプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のような水溶性
カルボジイミドを用いることができる。 （２）　カルボニルソイミダゾーノ＋−ｖ６カルｙｆ　
Ｊイミド法と全く同様にアミン基とカルボキシル基との
間の脱水翁１１合を起させる方法で、両成分の溶液中に
必要号のカルボニルジイミダゾールを加えればよい。こ
の試・ｊ１４は水分に敏感で、水で直ちに分）５了する
ので、フ１、を含有しない溶１１１（を用いるのが好ま
しい。 （３）混合酸無水物法 カルボキシル基はクロル蟻酸エステルと、布石１−塩基
の存在下、いわゆる混合酸無水物を形成し、これはアミ
ノ基と容易に反応して、アミド結合を形成する。 −ＣＯＮＪＩ− クロル蟻酸エステルとしては例えはエチル、イソプロピ
ル、イソブチルのよう力低級アルキルエステル、！侍に
クロル蟻酸イソブチルがよく用いられ、有様塩基として
はトリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン等のような
第三級アミンが利用できる。 反応溶媒にはカルボジイミド法に述べたものをそのまま
用いることができるが、混合酸無水物は水に不安定であ
るので、混合酸無水物を形成する際には含水したものを
用いないよう注意するのがよい。反応温度としては、先
ず例えば−１０°〜−２０°（、位の低温で混合【；？
炒、水りを形成せしめ１ついでアミノ成分を加えてから
室ン１完にて反応をつづける温度条件で１−好ましく例
示できる。アミン成分を加えるときには水もり、　＜　
１１．を水を自んブｒ″、ｆｉＱ’ｌ：’を使用しても
か捷わない。 （４）活性エステル法 カルボキシル基）１；を′ｎ）、子吸引性の大きい化合
物のエステルにすると、そのカルボニル糸上の電子密度
が八り、ぞの結果アミノ基のような塩基性の大きい官能
基を攻撃してアミド結合を形成することになる。これが
活性エステル法の原理で、活性ニスデルとしては例えば
、パラニトロフェノール、２．４−ジニトロフェノール
、ペンタクロロフェノール、チオフェノール、ナフトー
ル、８−ノーイドロキシキノリン等のフェノール？＋’
３４体；例えば、Ｎ−ハイドロキシコハク「１！２イミ
ド、Ｎ−ノ・イ）′口キシピペリリン等のＮ−ハイドロ
キシ化合物；例えば、シアノメチルのようなアルキルエ
ステル等を用いることができる。溶媒としてはカルボソ
イミド法で述べたものが利用できる。 （５）アミド法 カルボキシル化合物をエステルに変え、ヒドラジンと反
応させると酸ヒドラジドになるが、これは亜硝酉・２０
作用により酸アミドになり、アミノ基と反応してアミド
結合を形成する。 ヒドラジド ヒドラジドを稀塩酸中皿硝酸ナトリウムと反応せしめて
生成した酸アジドを−だん単ＦＢシて、ついで適肖な有
機溶媒中アミン成分と反応させる古典的な方法も利用で
きるが、ヒドラジドを有機溶媒（含水したものでもよい
）中、塩化水ネ存在下亜硝酸アルキルエステル例えｈ＋
Ｈ亜硝酸ｔ−ブチル、亜硝酸ｉ−アミル等で処理して市
アジドとし、単ｔ’；ｉ！、することなくアミン成分と
反応せしめることによりアミド結合を形成することがで
きる。 （６）　酸クロリド法 カルがキシル化合物を酸クロリドに変え、アミノ化合物
と反応させてアミド結合を生成するＩｔも一般的な方法
も採用することができる。酸クロリドにするにはカルボ
キシル化合物を五塩化リン、塩化チオニル、オキシ塩化
リン等と反応させる直接法と、例えばシュウ酸クロリド
と反応させる交換反応法があげられる。アミン化合物と
の反応忙は水の中でアルカリを加えながら行なういわゆ
る「ショツテン−バウマン法」、必要に応じて例えばベ
ンゼンなどの不活性溶媒中で、例えばピリジン、トリエ
チルアミン等の有４３ｉ塩基存在下に反応する方法、女
どがあり、本発明で利用できる。 ＋７）　Ｄ　Ｉ）　Ｐ　Ａ法 カルボキシル化合物とアミン化合物との溶液中にソフェ
ニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ついで例えばトリ
エチルアミン、或はＮ−メチルモルホリン等の有機塩基
を加えてアミド結合を形成する方法も採用できる。この
際、溶媒としては例えばヅメチルホルムアミドが好辿に
用いられ、温度は水冷から室温でよい。 以上の例えば（１１〜（７）の如きアミド結合でハプテ
ンとｃ　ｔｖ　ｐとを結合する化学的結合法のいづれを
もってしても目的を達することができるが、本発明に応
用する際にはハゲテンが有する他の置換基などによって
は不安定なものもあり得るので、あまυ檄しい条件を必
要とするものは避けるべきである。最も好ましく利用で
きるのは０）カルボジイミド法、（７）　Ｄ　Ｐ　Ｐ　
Ａ法である。ＣＩＶ　ｐと、導入すべき適尚す１．のハ
プテンの溶液中にハプテンニ対シ等モル又はイ＾’ｉｙ
Ｉ＞Ｋ過剰のカルボソイミド、もしく１ｔＤＰＰＡを加
えＪ）　Ｐ　Ｐ　、４０〃ろ合には有仁塩基を加えて反
応せしめることができる。反応後は全反応液をセロファ
ンチューブ内にて水に対しｊ℃析すれば、未反応のハプ
テン、状態、副成物などは外液に逃げるので内液を／ｌ
管縮、或はン東結乾４７トすることにより目的のハゲテ
ン又はその変性物−Ｃｌｒ’ｐ結合物を得るととがてき
る。 更に、ハシテン又はその化学的変性物とＣＴｒＩ　ｐ高
分子化合物との化学的結合は、ハプテン又はその化学的
変性物が：＋じ１当な反応性水ｒ％Ｑ基を有しそし一’
（ＣＩＶｐがカルボキシル基を有する場合又はその反対
の場合、ハプテンとＣＩ７；’　Ｐとをエステル結合で
化学的に結合することにより行うこともできる。 エステル結合でハプテンとｃ　ｎ″ｐとを結合する方法
：一 エステル１，１７合法の場合、ハプテン又はその化学的
変性物が水６だ基を有し、ｃｒ：’ｐがカルボキシル基
を有する場合には、カルボキシル基を例えば塩化チオニ
ルを作用させて酸クロリドに変え、或はＣＩ？−ｐが例
えば無水マレイン酸を含む共重合体ならばそのｔ−ｔで
、ハゲテンと反応させて、エステル結合によるハプテン
−ｃ　ｎ〕”　ｐ結合物を得ることができる。その反対
即ちハフ０テン又はその化学的変性物がカルボキシル基
を有し、ＣＩＶＰが水酸基をもつ場合には、ハプテンの
性質によっては反応性Ｂ馴尋体例えば酸クロリドに変換
し得る程充分な安定性を有しない場合もあシ、この場合
エステル結合せしめるのは困難である。 かくして得られるハプテン−Ｃ１１７ｐ結合物としては
、数多くのハプテンとＣＷＰの組合せからなる結合物を
得ることができるが、之等の代表例を具体的に示せば、
例えば下記の如き結合物を例示できる。 １７−アミノ−］　、３．５（１０）−エストラトリエ
ン−３−オール結合ポリアクリル酸、１７−アミノ−！
、３．５（１０）−エストラトリエン−３−オール結合
ビニルメチルエーテル無水マレインｒｉ共重合体、 エストリオール−１６−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸、 エストリオール−１６−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、エストリオール−
１６，１７−ソヘミザクシネート結合ポリアクリル酸、 プレグナンジオール−３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酊、 プレグナンジオール−３−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレインｒ〉共重合体、プレグナント
リオールー３−グルクロナイド４″１１ｉ合ポリアクリ
ル酸、 プレグナントリオールー３−グルクロナイド結合ビニル
メチルエーテル無水マレイン酸共重合体、３α、１１β
、１７α、２１−テトラヒドロキシプレグナン−２０−
オン−３−グルクロナイド結合ポリアクリル酸、 ３α、１１β＋１７α、２１−テトラヒドロキシプレグ
ナン−２０−オン−３−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酸共重合体、 カルｄ？ギシメチルモルフィンに古’ｃｌ’Ｆ　；ｒｅ
　ＩＪアクリル酸、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共重合体、 エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート結合ポリアク
リル酸、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体、 ザイロキシン結合ポ・リアクリル「１夕、メタネフイリ
ン結合ポリアクリル酸、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共爪合体 等々をあげることができる。 本発明における（　Ａ　）ハプテン４工ｌ持担体ｔｊ１
、ｊ−述のようにして得ることのできるハプテン又ｔｉ
ｔその化学的変性物を化学的に結合せしめ／こＣＩ！’
　／ｌを反応性高分子ラテックス担体とさらに化！１′
的にシ′、“１合することによシ得ることができる。か
かる高分子ラテックスとしては、平均粒径が約００１〜
約２ミクロンのものでろ、つて、眩スペーザーと反応し
得る官能基を有するものが用いられる。平均私′ｉ径が
約０．０５〜約１．５ミクロンのものが！寺に！ＪＪ′
１．’ｆｉ’である。 また、かかる反応性高分子ラテックス担体としては、官
能基としてカルボキシル基、第１級アミン基又はカルボ
アミド基（−ＣＯＮＩＩ２　）　含有Ｌ、且つ基体が例
えばポリスチレン、スチレン−ブタツエン共重合体、ス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエ
ン、ビニルトルエン−ターシャリブチルスチレン等から
成る高分子ラテックス担体が例示ス、きる。このような
ラテックス担体は種々の商品名で市販されており、之等
の高分子ラテックス担体のいずれも使用することができ
る。高分子ラテックス担体の基体は勿論上記例示の如き
重合体又は共重合体に何部限定されない。 高分子ラテックス担体が官能基として第１級アミツガ；
を有している場合は、之等の高分子ラテックス担体をそ
のま咬前記ＣＨ７ｐの有するカルボキシル基と反応せし
めて、アミド結合によってｃｔｒｔｐと化学的に結合す
ることができる。かかるアミド結合の形成は、ハプテン
又はその変性物とｃｖｐとの反応について１４℃に説明
したと同様々反応手段を用いて行うことができる。 また高分子ラテックス」°１体とＣＦｐの双方が官能基
としてカルボキシル基ｊ：を有する場合には、該ラテッ
クスの有するカルボキシル基を下記の如き方法によって
化学的に要件して、第１級アミノ基を４１人した後、ｃ
ｎ：”ｐとアミド゛結合によって結合することもできる
。例えばカルボキシル基１（含有ラテックスを水溶性カ
ルボソイミド存在下へブタメチレンジアミンの株なンｊ
？リメチレンジアミンと反応せしめて第一級アミン基を
増大する方法（例：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａ１ｌ　
ｎｉｏｌｎｇｙ、　６４老、　７５〜８８頁（１，，９
７５）　）等がある。 本発明では、まだ、例えばＮ−ε−第３級ブトキシカル
ボニルノンメチルエステル又はＮ−フタロイル−Ｎ′−
メチルトリメチレンジアミンの如き片方のアミノ基をイ
？も′りしたアルキレンツアミン誘導体をカルボキシル
基を有する高分子ラテックス担体と反応させることがで
きる。この反応はノ・ブテンとＣＷＰとの結合に使用さ
れるアミド結合形成反応の中から選択することができる
が、例えば高分子ラテックスの粒径の如き物理的性質を
かえないで反応を行なう必要がある。そのだめには水を
含んだ系で行なうことが望ましく、殖に水浴性カルボジ
イミドを用いる水中でのカルＴｌ？ソイミド法が望まし
い。反応を行々つだ後アミン保護基を除去するとアミン
基を反応基として有する反応性高分子ラテックスが得ら
れる。この様にして得られた反応性高分子ラテックスを
カルボキシル基を有するハプテン又はその変性物とＣＷ
Ｐとの結合物と前述のアミド結合形成反応により反応さ
せると本発明の測定試薬を得ることができる。この変更
態様については、前記特開昭５５−５２９４５号に詳し
く説明されており、本発明において利用できる。 上述のようにして得ることのできるＣＡ）ノ・ブテン又
はその化学曲技１１物を、化学的に結合−亡しめんカル
ボキシル基含有水溶性モノオレフ・イン系高分子化合物
（Ｃ１ｌ’Ｐ）が、約０．０１〜約２ミクロンの粒径の
高分子ラテックス担体に化学的１ｃ　Ｆｉｒ合して成る
ノ１ゾテン担持担体の例として社、す、下の如きノ・ブ
テン担持担体を例示することができる。 エストリオール−１６−グルクロナイドリアクリル酸結
合ラテックス、 エストリオール−１６．１７−ジヘミサクシネート結合
ポリアクリルげ２結合ラテックス、１７−アミノ−１，
３．５（１０）−エストラトリエン−３−オール結合ポ
リアクリノｂ　ｎｌ結合ラテックス、 １７−アミノ−１，３．５（１０）−エストラトリエン
−３−オール結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共重合体結合ラテックス、エストリオール−１６−グル
クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共
重合体結合ラテックス、 エストリオール−ｔ６．ｉ７−ノへミサクシネート結合
ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテ
ックス、 プレグデンソオール−３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックス、 グレグナンソオールー３−グルクロナイド結合ビニルメ
チルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテックス、 ３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロキシプレグ
ナン−２０−オン−３−グルクロナイド結合ポリアクリ
ル酸結合ラテックス、 ３α、１１β、１７α＋２１−テトラヒドロキシプレグ
ナン−２０−オン−３−グルクロナイド結合ビニルメチ
ルエーテル無水マレイン酌共」（合体結合ラテックス、 カルボキシメチルモルツイン危゛ｉ合ポリアクリル酸結
合ラテックス、 カルボキシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテル
無水マレイン酸共亘合体結合うデックス、エチオコラノ
ロン−３−へミザクシネート４ｉ′ｉ合ポリアクリル鼠
結合ラテックス、 サイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックス、 サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸
共亜合体結合ラテックス、 メタネフィリン結合ポリアクリル１．ｔ’１２結合ラテ
ックス、 メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイン
酸共正合体結合ラテックス、 等々をあけることができる。 本発明に於ては、」二連の如き（Ａ）ハゲテン担持担体
におけるハプテンに’１′？異的に反応するモノクロナ
ル抗体を利用して、（Ｂ）上記ハゲテンに対する単一〇
１１のモノクロナル抗体感作担体を調製する。 本発明で利用する前述の如きハプテンに対するモノクロ
ナル抗体は、細胞ａ（合技術分野においてそれ自体公知
の手法を適宜に選択組み合わせてモノクロナル抗体産生
融合細胞株を形成し、該細１１ｉｉ株を利用して産生、
取得することができる。 その−態様によれば、ハプテン又はその化学的変性物を
、抗原性を有する物質と結合させ、このようにして抗原
性を賦与したハシテン結合物を用いて、これを適当な動
物たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウ
シなどの如き動物に、投与たとえばアジュバントと共に
皮下注射の如き手法で投与して、該動物を免Ｊ（トじた
のち、この免疫動物たとえば免疫マウスの該ハゲテンに
対する抗体産生細胞たとえば胛Ｘ’、ｌｉｌ胞、ル’！
ｌＩｌ’ｉ！　＋ｔ！ＩＩ胞、リンＡ節細胞および／ま
だは末梢血ｆｆｌ＋胞の如き細胞を採取し、該＃ｌｔｌ
　ｆＪ〜と自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に
有しない適当な株化イ（ｕ胞たとえばマウス骨髄肺株化
細胞とを、それ自体公知の手法によシ細ｌ１ｆ８Ｉ融合
処理する。 ハシテンに抗原性を賦与するのに利用する抗原性を有す
る物質の例としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、家
兎血清アルブミン（Ｒ５Δ）、卵白アルブミン、ヒト血
清アルブミン、牛γ−グロブリン、家兎ｒ−グロブリン
、ヒトγ−グロブリン、破傷ａ毒素、肺炎球菌多糖体等
の如き物質を例示できる。 更に、ハゲテン又はその化学的変性物と上記例示の如き
抗原性を有する物質との結合は、公知の方法により行う
ことができる（例えば、山村堆−１石板公成編隼、免疫
化学２９４〜３０２頁、利金書店発行）。 ハシテンに対するモノクロナル抗体をＫｒＪるだめの、
ミエローマＲ）１１胞と抗体産生細胞との組合せは、各
細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生ずることが可能で
あれシ」：、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限
定されず、任意の組合せでよい。 使用されるミエローマ細ｒ１１には特に限定は々く、多
くのマウス、ラツｌ−、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞
株を使用することができる。好ましい株化細胞は薬剤抵
抗性のものであシ、かつ未融合のミエローマ細胞が選択
培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなも
のが良い。最も普通に用いられるものは８−アザグアニ
ジン抵抗性の株化＃ｌ１ｌｌｔｅｌで、これはヒボキサ
ンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラー
ゼに欠ｔＡし、ヒボキサンチン・アミノグチリン・チミ
ジン（ＩＪＡＴ）培地に育生でき女い性質を有している
。さらに使用する株化ｔｒｉｌｌ胞は「非分泌型」のも
のであることが好１［７い。例えばマウスミエローマＢ
ｏｐＣ−２１４未由来のＰ３／　Ｘ　６３−　Ａ　（７
８ＵＨ（７’ｓＵ＋）、ｐ３／×６３−ＡＣｌＢ・６・
５・３、ｐ３／Ｎ５Ｉ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２１０−
Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ　３・Ａｇ
１・２・３などが好適に用いられる。 該イ（１１胞副１合処理しＬｌ例えば、通常イーグ／Ｌ
最少基本培地（Ｍ八“Ｍ　）、ＲＰＭＪ−１６４０など
の培地中で上記免疫マウスのＦ’　ｌｉ“１胞１〜５Ｘ
１０”個と上記マウス骨髄腫株化細１ｉｉｑ　ｌ〜５Ｘ
１０’個とを、混合して行なうことができる。ｌ’７１
１．合併；＋ｆｆ４剤としては、平均分子ｆ３．１．　
（１００〜６．０００のポリエチレングリコール（ｐｌ
ζＧ）が好４Ｌ、＜、他の融合促進剤、例え（・、六ポ
リビニルアルコール、ウィルスなどを使用することがで
きる。ＰＥＧの使用Ｌ［は約３０〜５０％で用いること
ができる。 上述のようにして得ることのできるｈｌ・１１合細胞１
含有系から１独合、１ｆｌｌ　ｌｌ１Ｊを、それ自体公
知の手法を利用【７て、選別処理、抗体活性スクリーニ
ング処理及びクローニング処理して、免し′コマウスの
形成に用いプこハプテンに対するモノクロナル抗体産生
能を・汀し且つ自己増殖能を持つ１．独合Ｉｖｍｌ抱株
を取得することができる。 上記ｆ：独合イ（１胞の選別処理は、例えば、２０％ウ
シ胎児血清含有ＲｐＪ（１−１６４０培地々どで細胞融
合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクログレー
トに１０’〜１０６／ウ工ル程度に分注し、各ウェルに
選択培地（たとえばＨＡ　Ｔ培地）を加え、以後選択培
地交換を行いながら、５タロＣ０２（培養器（３７℃）
で培養を続けることによシ行うことができる。ミエロー
マ１７ｉ１１　、ｌｌ１ｕとして８一アザグアニン抵抗
性株を用いれば、未融合のミニ０−　マｇｅｌ　ｌｌ「
・ＪはＨＡ　Ｔ培」ｔｌｃで死滅１７、寸だ抗体産生細
胞は正常細胞なので　ｉ　ｎ、　ｔｒ　ｉ、　ｔ　ｒ　
ｏ培炭では長期間生育でき女い。（７たがって培養後１
０〜１４０ぐらいから生育してくる４ｉ１１　月ｆ・Ｌ
ＩＩよ全てρ合細１１１・１である。 上述のように１〜で得ることのできるρ！１合８１１１
胞株の抗体活１」゛スクリーニング処理及びクローニン
グ処理は、常法によシ行つことができるが例えＶ１１以
下のようにして行うことができる。 融合Ａ′用胞の化１°工し２だウェルの培養土ｎｔの一
部を採取し１、一定置の標識）・ブテンとインキュベー
ションし　’　４７　Ｆ、、ｊｅノ・ブテンとの、ｔ、
ｌ；金倉１已をち州庁することによム　目的とする抗体
を１Ｉ）ＮＸｔ、ているウェルを検索することができる
。即ち、３ＨＸ１２＋！７．　＋３１　Ｉなどのラジオ
アイソトープあるいは醪素などで標識したハプテンと培
養上着“ｆを反応させた後、各反応液についてノ・ブテ
ン−抗（１、ｌ’、”、合′吻を分Ｆ＋′ｉ　ｔ、、（
↑識量を測定することによシ、目的とする抗体の存在お
よび結合能を検索することができる。 目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には２種以
上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希
釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニング
を行い、ハシテンに対するモノクロナル抗体産生融合細
胞株を得ることができる（このようなモノクロナル抗体
産生融合細胞株は微工研の寄託受託拒否対象である）。 上述のようにして得ることのできるモノクロナル抗体産
生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いたハプテ
ンに対するモノクロナル抗体を取得するには、該モノク
ロナル抗体産生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、
培地からモノクロナル抗体を採取する方法、ミエローマ
細胞由来動物と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中の
モノクロナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の
手法を利用して取得することができる。 上記前者の態様によれば、例えば、モノクロナル抗体産
生り１合６」ｔｌ　１ｌｉ１株を１０％ウシ胎児血清含
有ＲＰＭＩＩＧ４０培地役どの培善液で培πＧし、その
培養」−清液を硫安分画、抗原を結合させたセファロー
ス４Ｂなどのアフィニティークロマトグラフィーなどに
よって８Ｔｊ　製することにより目的とするハプテンに
対するモノクロナル抗体を採取することができる。 又、上記後者の左１シ様によれば、例えば、同系動物に
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を
腹腔内投与することによりｉｎυｉｖｏで融合細胞を大
量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高７１
“１度のモノクロナル抗体が含まれている。この腹水か
ら硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマ
トグラフィーなどによシ、目的とするハプテンに対する
モノクロナル抗体を取得することができる。 上述のようにして取イｌ）できるようなモノクロナル抗
体は市販品として人手することも可能であり、利用でき
る。 本発明に於ては、上述のようにして得ることのできるハ
プテンに対するモノクロナル抗体の単一種を担体に相持
させて、（Ｂ）ハプテンに対する単一種のモノクロナル
抗体担持担体を得ることができる。 このような感作担体の調製に利用する担体としては、従
来よシ免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において
一般的に用いられる微粒子の担体を使用することができ
、例えばヒト、羊、ウザギなどの赤血球、π■［菌の細
胞などの生物学的粒子、高分子ラテックス、ベントナイ
ト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリ
ンなどの非生物学的粒子などの如き担体を）γ゛げるこ
とかできる。 このよりな］１！体の中で、高分子ラテックス担体のｆ
ｉ’１１としては１．Ｊ？リスチレンラテックス、メチ
１／ンープタソエンコフＩ９リマーラテツクス、ポリビ
ニルトルエンラアックス、ビニルトルエン・ｔ−プチル
スチレンコホリマーラテックス、スチレン−メタアクリ
レ−トコポリマージデックスなどおよび官能基とＬ７て
カル７＋？キシル７！−！ｊ、Ｊ　Ｉ　Ｌ’ｌアミノ基
又はカルボアミド基（−ＣＯＮＪＩ２）を有し、■１つ
基体が前記ラテックスから成る反応１テ１ユ高分子ラテ
ックス寿どを挙げることができる。 」二記例示の如き高分子ジテックス用体の才′ｌ了サイ
ズは’９　’Ｆｆ：に遮択できるが、例えば、平均粒径
が約００１〜約２ミクロンのものが使用でき、躬゛に平
均粒径が約０．０５〜約１５ミクロンのものが好ましい
。又、他の非生物学的担体についても上こ己高分子ラテ
ックス相体と同様に平均粒径約０．０１〜約２ミクロン
のものが使用できる。 上記例示の如きＪ’ｔ１体に、ハゲテンに対するモノク
ロナル抗体を担持さぜる手法は従来公知の完全抗原に対
する抗体を相体に担持させる手法において、該抗体の代
シに、ハゲテンに対するモノクロナル抗体を用いるほか
は同様にして行うことができる。その手法は程々知られ
ておシ、本〉し明において適宜に選択利用できる。この
ような相持手法としては、担体にこれらを吸着させる手
ｒ′ン及び化学的に結合させる手法のいずれの手法も利
用することができ、本発明に於て、ノ・ブテンに対する
単一９．のモノクロナル抗体担掲担体と称するのは、こ
れらの任）えよの手法を適宜に辺択利用して担体にハゲ
テンに対する単一種のモノクロナル抗体を担持させたす
べての担持担体を意味する。 以下、その故態様について更に詳しく説明する。 ハプテンに対するモノクロナル抗体担持担体の調製態様
ニー ハプテンに対するモノクロナル抗体を吸着によυ担体に
て感作するには、モノクロナル抗体の溶液と担体の懸１
％液を混合することにより、容易にモノクロナル抗体相
持相体を得ることができる。 モノクロナル抗体は多くの場合カルボキシル基と第１級
アミン基の双方を有する。モノクロナル抗体を化学的に
担体にｆ’ｉ′ｉ合させるには、例え１−、＋：前記官
能基を有する反応性高分子ラテックスとモノクロナル抗
体をカルボジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、
混合酸無水物法、活性エステル法などの一つを適宜選択
して用い、結合することによりモノクロナル抗体担持担
体を得ることができる。 また赤血球を担体として用い、モノクロナル抗体を担持
するには、例えば赤皿球をホルマリン、グルタルアルデ
ヒド又はピルビンアルデヒド等の適切なもので固定化し
フヒ固定赤血球を用い、必要に応じタンニン酸あるいケ
Ｊ、ビスジアゾベンジジン（Ｂ　ｌ）　Ｂ　）やグルタ
ルアルデヒド等の縮合剤を用いて担持させ、モノクロナ
ル抗体担持血球を得ることができる。 上述のようにして調製できる（Ａ）ノ・ブテン又はその
化学的変性物を化学的に結合せしめたカルがキシル基含
有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、若しくは該結
合物をラテックス担体に結合したハシテン担持担体とＣ
Ｂ）上記ノ・ブテンに対する単一種のモノクロナル抗体
担持担体の組み合わせから成る本発明の免疫化学的ｌｌ
す定試セＩ≦としては、下記の如き測定試桑を例示する
ことができる。 １、　エツトロケ９ンの測定試Ｊにとしては、（イ）Ａ
：エストリオールー１６−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと ｎ：抗エストリオールー１６−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよりなる免Ｊ４２化学的測定試
荏、 （ロ）Ａ：エストリオールー１６．１７−ヅへシリ−ク
シネート結合ポリアクリルＩ’ｉ’？＃、ｌＢ合シラテ
ックス Ｂ：抗エストリオールー１６．３７−ソヘミーリークシ
ネートモノクロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化
学的１１１１定試薬、（ハ）Ａ：エストリオール−１６
−グＡ・クロナイド結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン【イ１ヨ重合体結合ラテックスと Ｂ：抗エストリオールモノクロナル抗体４１月１ラデツ
クスより疫る免疫化学的測定試県、に）Ａ：エストリオ
ールー１６．１７−ジヘミサクシネー　トｆｆ＋’ｒ　
合ｅ　＝ノしメチルニーデル；ｆｍ；　７Ｊ′−ｙレイ
ン酸共重合体と Ｂ：抗エストリオールモノクロナル抗体相持ラテックス
よりなる免疫化学的測定試薬。 （ホ）Ａ：エストリオールー１６−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテックスと １３　：　抗ｘストリオールー１６−グルクロナイドモ
ノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的ｂ’ｌｌｌ
定試ジζが、 （へ）Ａ：エストリオールー１６．１７一ソヘ汁ナクシ
ネート結合ポリアクリル酸と Ｂ：抗エストリオール−１６＋’　１７一ジヘ汁ナクシ
ネートモノクロナル抗体感作血球よりなる免疫化学的測
定試薬、 （ト）Ａ：１７−７ミ／−１，３，５（１０）−エスト
ラトリエン−３−オール結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと Ｂ：抗エストリオールー１６−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスよシなる免に化′Ｏ１と的ｉｉ
、’ｌ　′、ｌｌπ・い１′５等々。 ２　プレグナンソオール；則定ｉ・−（′１ｓとしてｔ
土、（イ）Ａ：プレグデンソオール−３−グルク１１ナ
イビシ吉合ポリアクリル１′ｇ２結合ラデツクスとＢ：
抗ゾレグナンヅオールー３−グツしクロナイドモノクロ
ナル抗体Ｊｕ４−′ｊラテックスよりなる免疫化学的測
定試ジーＳ１ （ロ）Δ：グレグナンソオールー３−グルクロナイド結
合ピニノしメチルエーテル”　無ノ’マレインｉＴ’ｉ
共重合体と Ｂ：抗グレグナンソオールー３−グルクロナイドモノク
ロナル抗体和Ｊ＜ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 （ハ）Ａ：プレグナシソオール−３−グルクロナイド結
合ポリアクリル戯と Ｂ：抗ゾレグナンノオールー３−グルクロナ・ｆドモノ
クロナル抗体相持ラテックスよりなる免疫化学的測定試
薬、 に）Ａ：プレグデンソオール−３−グルクロナイド結合
ン１？リアクリル酸結合ラテックスとＢ：抗プレグナン
ジオールー３−グルクロナイドモノクロナル抗体感作血
球よりなる免疫化学的測定試薬、 （ホ）Ａ：：７６レグナンジオール−３−ダルクロナイ
ド結合−ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体
と Ｂ：抗ン０レグナンソオールー３−グルクロナイドモノ
クロナル抗体感作血球よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 ３、　１’ｌ−０１１Ｃ５測定試築としては、（イ）Ａ
：３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロキシプレ
グナン−２０−オン−３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテックスと Ｂ：抗３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロキシ
ゾレグナンー２０−オン−３−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体」１１持ラテツクスよりなる免Ｊ′ε化学的ｉ
１：ｌ定試イ５、（ロ）Ａ：３α、１１β、１７α、２
１−テトラヒドロキシプレグナン−２０−オン−３−グ
ルクロナイド結合ビニルメチルエーテル外水マレイン酸
共重合体と Ｂ：抗３α、１１β、１７α、２１−デトラヒドロキシ
プレグナン−２０−オン−３−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体Ｊμ持うデツクスよりなる免疫化学的測定試４
’＋ｚ　Ｎ（ハ）ノｉ：３α、１１β、１７α、２１−
テトラヒドロキンプレグナン−２０−オン−３−グルク
ロナイド結合ポリアクリル酸結合ラテックスと Ｉ３：抗３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロギ
シプレグナン−２０＆−オン−３−グルクロナイドモノ
クロナル抗体相持血球よりなる免疫化学的測定拭払（≦
、 に）Ａ；３α、１１β、１７α、２１−テトジヒドロキ
シグレグナン−２０−オン−３−グルクロナイド結合ビ
ニルメチルエーテル無水マレイン酸共重合体結合ラテッ
クスと Ｂ：抗３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロギシ
プレグナン−２０−オン−３−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定試薬、 等々。 ４、　モルフインの測定試薬としては、（イ）Ａ：カル
ボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸結合ラテッ
クスと Ｂ：Ｊ几カルボキシメチルモルフインモノクロナル抗（
４、’ｊＨ！’ｊ寺ラテックス よりなる免疫化学的８（ｌ所ゴ・（桑、（Ｃ１）Ａ：カ
ルフ〕？キシメチルモルフイン結合ビニルメチルエーテ
ル無水マレイン酸、Ｉ（重合体とＢ：抗カルボキシメチ
ルモルフインモノクロナル抗体担持ラテックス よりなる免疫化学的測定状Ａ１１；、 等々。 ５、　１７−　Ｊ（５（７）ｌ、ｉｌ定試沓５、（イ）
Ａ：エチオコラノロン−３−へミーリクンネー１−結合
、　、ｊ５リアクリル酸結合ラテックスとＢ：抗エチオ
コラノロン−３−へミザクシネートモノクロナル抗体Ｊ
旧−ケラテックスよりなる免疫化学ｊ杓測定試帛、 （ロ）Ａ：エチオコラノロン−３−へＳザク７ネー）結
合ビニルメチルエーテル無水マレイン酸共届−合体ｒ１
１合ラケラテック ス：抗エアオコラノロンー３−ヘミサクシネートモノク
ロナル抗体ｍ’ｔｌ血球 よりなる免疫化学的測定試薬、 （ハ）Ａ：エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート結
合νｊ？リアクリルｒ（χと Ｂ：抗エチオコラノロン−３−へ汗ナクンネートーＥノ
クロナル抗体」Ｕ持血球 よシなる免疫化学的測定試薬、 等々。 ６　サイロキシン（Ｔ、）測定試薬としては、（イ）Ａ
：サイロキシン結合号？リアクリル酸結合ラテックスと Ｂ：抗サイロキシンモノクロナル抗体相持ラテックス よりなる免疫化学的測定状４：１、 （ロ）Ａ：サイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン６′２共重合体と ”　：　抗−！Ｊ−イロキシンモノクロナル抗体ＪＩＩ
Ｊ？ラテックス よりなる免疫化学的１４１１定試セ、１シ、（ハ）Ａ：
ザイロキシン結合ポリアクリル酸結合ラテックスと Ｂ：抗サイロキシンモノクロナル抗体担持血球よυ安る
免疫化学的ｉ！η１定試塾、 等々。 ７、　カテコールアミンの１ｆｊｌｊ定試桑としてｔ」
２．０）Ａ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸結合ラ
テックスと Ｂ：抗メタネフイリンモノクロナル抗体担ｊ“ｒラテッ
クス よりなる化５′：召ヒ学的１Ｔｊｌｌ定試ゼｉｔ≦、（
ロ）Ａ：メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無水
マレイン「Ｈ’５．共重合体と Ｂ：抗メタネフィリンモノクロナル抗体相持ラテックス よシなる免疫化学的測定試薬 等々をあげることができる。しかし、本発明の試薬は上
記に掲げる具体例の例示に限定されるものではない。 本発明によれば、上述の如き新しいタイプの測定試薬を
利用したハプテンの新しいタイプの免疫化学的測定方法
が提供できる。この測定方法によれば、前記（Ａ）ハゲ
テン又はその化学的変性物を化学的に結合せしめたカル
ボキシル基含有水浴性モノオレフィン系高分子化合物、
若しくは該化合物をラテックス担体に結合したハプテン
担持担体及び（Ｂ）上記ハゲテンに対する単一種のモノ
クロナル抗体担持担体の組み合わせを用い、被検体中の
該抗原による上記ＣＡ）及び（Ｂ）両試築成分の凝集を
阻止する凝集阻止反応を測定するととにより、上記・・
ブテンを免疫化学的にｉ！’！１１定することができる
。測定は、被検体中の７・ブテンの存在を測定検出する
定性的１　ｉ＋１１１定及び被検体中の抗原の名゛′”
１度をｊ［！ＩＩ定イ・（出する定量的な測定のいずれ
の態様によっても行なうことができる。″１１ｊＢ検体
の例としては、尿、血ｎ’ｆ　％　血漿、羊水などの如
き体液もしく　ｌ：Ｔ、体液成分を例示することができ
る。以下、本発明の免疫化学的測定方法について更に詳
しく説明する。 血液、尿その他の体液中に存在する微量物質は前記試薬
を用いて凝集阻止反応により定７．することができる。 具体的な測定法は実施例として示したが、一般的な測定
法は次に述べる通りである。 原〃！１的にはハプテン−ＣＩＶ　Ｐ結合物又は〕・ブ
テン担担持体と該ハシテンに対するモノクロナル抗体感
作担体の凝集反応系を用いた凝イ１′−阻止反応である
。すなわち、（１）例え−”、、Ｉｒｒ浄なスライド板
上に１滴の試験検体（適宜希釈）を置き、その上に１滴
の前記モノクロナル抗体感作ラテックスを滴下し、次い
でハゲテン担持ラテックス１１（、＜１を滴下した後、
三者を混合し、２分間揺動することにより、試験の結果
が観察され、凝集像を陰性、凝シ１ミ阻止像（非凝集像
）を陽性と判定する。 （２）清浄な丸底試験管に検体（適宜希釈）の一定量を
入れ、これにモノクロナル抗体感作血球懸濁液の一定量
を加えて振・パ・λ混和後、ノ・ブテン−ｃｒｒ＝’ｐ
結合物懸濁結合−懸濁液加えて振γ才混和し、ミラー付
スタンドに静置し、２時間後に管底像を観察する。この
場合、凝集阻止像（陽性像）は沈降リングを形成し、凝
集像（陰性仰）はマット状を呈する。 検体中のハプテン感）現は、検体を適宜希釈して試験を
行い、陽性像を呈する最高希釈倍数に測定感度を乗する
ことによ請求めることができる。 本発明の（、（）ハプテン又はその化学的変性物を化学
的に結合せしめたカル）】？キシル基つ有水１１ｒ性モ
ノオレフィン系高分子化合物、若しくしよ該化合物をラ
テックス、１１１体に結合したハプテン担持担体及び（
１））上記ハプテンに対する一ＩＱ−４ＪＨのモノクロ
ナル抗体担持担体のｆＪｌみ合わせから汝る該ハゲテン
の免疫化学的ηｉｌｌ定試己“５及びこれを用いた該ハ
プテンの免疫化学的１１ｊｉｌ定方法によれば、モノク
ロナル抗体利用の従来Ｊ々術においては、乍−＋・（の
モノクロナル抗体の利用によっては対応抗原と結合して
沈殿物を生成し、ないので二以上ＴｉｊＪＱ　Ｊ＋ｉｊ
の色釉モノクロナル抗体の１更用が必須でま）っだにも
拘わらず、全くλ丁、外なことに１．ｌ二Ｒｅ　（Ａ）
及び（１；　）両試ケｊコの同には／Ｎ１足すべき？４
具反応が生ずる。ｌｊｉ↑〈て、本う１１明によれｔ六
ハグデン分子中の−っの特定部位孕憤依的に認ｌ；哉す
る能ＪＪを有するモノクロナル抗体の４’　Ｎ・ｉ７と
ハプテンとのｔ′１み合わせによる凝集反応であるため
、顕著に高い特異性が達成できる特色がある。更に、上
記（Ａ）及び（Ｈ）両試薬の間の凝集反応で形成される
凝集像は、予想外なことにも、従来のポリクロナル抗体
を用いたものよりも強いル】し集性を示す鮮明な凝年像
と力る特色がある。又更に、モノクロナル抗体利用の従
来技術においては、二以上の異種モノクロナル抗体を使
用してもなお、全く効果的でないことさえあるというト
ラン゛ルがあったにも拘わらず、本発明によればそのよ
うなトラブルから解放され、広汎な任意のノ・アミンの
免疫学的測定方法に適用可能となる特色を有する。 本発明によれば、上述の如き特色を持ったモノクロナル
抗体利用の新しいクイズの免疫化学的測定試薬及び測定
方法が提供でき、顕著に侵れた確実性、信頼度、精度、
感度及び顕著に高い特異性をもって、偽反応生起のトラ
ブルを伴うことなしに、Ｖ−れた賞現性、安定性で月っ
容上口なｔ’：作で、煙時間に被検体中の０１シ川のハ
ゲテンを免ブ′ζ化学的に測定することができる。 以下、実施例により木ブ！；明の数実施態析について「
グに詳しく説明する。 実Ｍ１」例１ 尿中エストロケ゛ンの１ｊｉｌｊ定 （ａ）抗エストリオールー１６−グルクロナイドモノク
ロナル抗体４Ｉ！持ラテックスの１１″Ｉ造（（Ｚ−１
）エストリオール−１６−グルクロナイド（Ｅｓ１６Ｇ
）−ＢＳＡの製造 エストリオール−１６−グルクロナイド（／？、１６Ｇ
）４０ｍ９をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１．。 ｒｒｔｅＫ溶角了し、これに４℃す、下でトリーｎ−フ
゛デル７　ミン２０．６μｌを添加したのち、イソブチ
ルクロロカーボネート１１．２μｌを加え３０分間イτ
ｊｌ′ｌ’した。これに予めＢ、ＳＡ、（牛血清アルブ
ミン）１１７Ｉ’９を２．８　ｍ（！の水（（訂ツノ・
ｆしプＣものにＩＮ水酸化ナトリウム液１”　Ｑ　／ｌ
ｌを加えたのちジメチルホルムアミド２０πｌを加え、
８℃に保たれた液を混合した。次いでこれを８℃で撹拌
し、１時間後にＩＮ水酸化ナトリウム液１６，６μｌを
加え、さらに３５時間橙押したのち、セファデックスａ
−２５で未反応のエストリオール−１６−グルクロナイ
ド及びトリー？２、−ブチルアミン等の低分子試薬を分
Ｆ４Ｆした。さらにこれを’）”’Ｍ析（鞘製氷に対し
）したのち凍結乾燥すると、エストリオール−１６−グ
ルクロナイド−１）　Ｓ　Ａが得られた。この抗原の凍
乾末についてのコーベル反応により、Ｂ５７１モル当シ
エストリオールー１６−グルクロナイド２７〜３０モル
の結合が確認されていた。 （ａ−Ｚ）抗Ｅ３１６Ｇモノクロナル抗体の製造」−１
記（ａ）で製造したＥ　３１６　Ｇ−Ｂ　、５　Ａ　２
５　μりＣマウス（６〜８趙令）に３ｙＪ間おきに皮下
投−１ｊし、収穀に５０μ７をＭｊ’注した。 ｔ、’、Ｌ、　ｆｙ、免疫から３日後にマウスのＪｌ’
ｌ！　ｈＷ、ｉ４を払ｊ出して、肘Ａ、：＋＋胞を採取
し、デルベコのモディファイドｒ反少基本培地（以下／
）／ＭＥ、’＋１と称す）で３回わ１［、？’、ｆ＋　
Ｌだ彼、＃、ｔ＋ｌ　１］己７我を３７ンｉして、その
２Ｘ１０’イ同をマウスミ”ローマ４１１１１１Ｐ３−
　Ａ’Ｓ−１／　ｌ　−Ａ　ｇ　４−１（以−トＮ５−
１と栃＼ず）　Ｉ　Ｘ　１０７ｆ１７Ｊと混合してン玄
、心し；ｒｆｌｌｈ”Ｌを集めた。このペレソ［・に３
７°Ｃに温めておいたポリエチレングリコ−”　ｉ＋、
’；　ｉｉ’ｉ　（ＰＥＧ−１００：　４．２５％、Ｊ
〕Ａｔ　ＳＯ：１．５　ｊ６含有１ノ’Ｊ／　ＥＭ　）
　ｆ　１　ｍｌｌ加え、１分間遠心？１−１をゆっくり
回転させて細胞融合を行つ／こ。３７°Ｃのり　’Ａｆ
　Ｅ“Ｍを３０秒ごとに２ｍｒずつ１０回加えたのち”
ｈｓ’＋ｊ分ｔ’；ｉｎ　Ｌ、ペレットを２０九′ウシ
胎児血清含イ〕ＲＰｌｆｌ−１６４０培Ｋ１１−ＣＡ’
Ｓ　−ｔとＬ　テ５　Ｘ　ｌ　Ｏ’　１１２１ロブレー
トに０．２ゴずつ分注し、５％ＣＯ２培プこ器で培養し
た。２４時間後６ウェルの上清の半量をすて、ＨＡＴ培
地（ヒポキサンチン・アミツブゾリン・チミジン、１０
％′ウシ胎児血清含有ＲｐＭｌ−１６４０培地）を０．
１　＋ｎｌ加え、その後３〜４日ごとに半」−：をｌｉ
　Ａ　Ｔ培池交換を行いながら２週間培養しだのち　ｊ
ｉｊ７殖したウェル中の培ｙ二上ネｒｊの抗体活性を測
定した。 活性の認められたウェルの細胞を＃ＡＬＪ３／Ｃマウス
胸腺錫１ｉｉ：ｉ、を含む１０％ウシ胎児血消含有ＲＰ
Ｊｆｌ　−１６４０培地で希収【−１限界希釈法により
クローニングを行って１０株のモノクロナル抗体産生ｉ
ｉＮ’ｉ合細胞を得た。これを大最培徴し、その培養上
清からＥ３Ｇ−１？ＳＡを結合させたセファロース４Ｂ
を用いたアフイニテイークロマトダラフイーに伺［２、
モノクロナル抗体を得た。また２Ｘ１０’個以−Ｈの細
胞をプリスタン０．５　ｒｒｒｅを予め投与したＢ、Ａ
ＬＢ／Ｃマウスに腹腔内税Ｊグし、腹水肺癌を作ぜてハ
「Ｌ水を得たのち、この腹水をＥ３１６Ｇ−Ｒ５Ａを結
合させたセファロース４Ｂを用いたアフイニディークロ
マトグラフイーによりモノクロナル抗体を初だ。 （ａ−３）抗Ｅ、、１６Ｇモノクロナル抗体ＪＩＩ持ラ
テックスの製造 抗Ｅ　３１６　（ｙ　モ／　りｏナル抗体０．２　ｍｙ
を５＊ｒのグリシン緩イ４ｊ化食塩液（７＋Ｈ１３，２
）に溶Ｏ’ｒ　ｌｙ、これに１０％ポリスチレンラテッ
クス１　ｍｐを加えて混合し、５６℃で３０分間処理し
た。次いで遠心公印して得た沈殿をグリシン緩（□１７
１化食塩液にてＳ−；（心洗浄し、沈殿を００５９σに
Ｂ　Ｓ　Ａを含むグリシン緩衝化食塩液２０ｍ１：にて
懸洞さぜ、抗Ｅ３１６Ｇモノクロナル抗体感作ポリスチ
レンラテックスを製造［７た。 （ｂ）　エストリオール−１６−グルクロナイド＃ｌ’
ｉ　’ｆｊポリアクリル酸結合ラテックスの製造 （／１−１）リソン・ラテックス カルボキシルモディファイドポリスチレンラテックスの
１０９σｌＪｉ泊液５ｍｒにε−第三ブチルオキシカル
ボニルリノンメチルエステル２６０ｍｙｅツメチルホル
ムアミド（Ｊ）ＪＩｆＦ　）　３　ｍ／に溶かした液を
加え、０℃に冷却したのち攪拌しつつ水溶性カルボジイ
ミド、〔１−エチル−ａ−（３−ツメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩〕２４３ｍｙを加える。０℃
にて１時間、室温にて３時間撹拌をつづけたのち室ＭＡ
に一夜放置し、遠心分子・ｉｉする。上清を捨て、沈降
物を５０％ＤＭＦ水溶液、ついで水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸５ｍｌを加え、ときどきふり１ぜ
つつ０℃に１５分間放置したのち氷水で約倍量にうすめ
遠心する。沈降物を洗液が中性になるまで洗浄し、つい
でトリエチルアミンの１０％水溶液１０　ｎ・？、を加
えて室温で１５３）４：ｐ４拌ｒｓ、＝　；、：、を心
１２、洗’ｌ＋Ｌが中性に介る１で水洗をくり返す。）
’ｊ、、′□ξに１０タロ）旨濁液になるノ；うに１．
′！度を調整し所望のりシン・ラテックスを得る。４く
品ｔ、１、ニンヒドリン反応陽性である。 生成物の４νｊ債は 八１１／２ ■ （Ｃ’Ｈ２）４ にて表わされる。 （ｂ−２）エストリオール−１６−グルクロナイド＾′
７１１合、１９リアクリルｒ戊の一製造（イ）　エスト
リオール−１６−ゲルクロナイドーヘキザメチレンジア
ミン誘’？ｆ’　体エストリオール−１６−グルクロナ
イド９３ｒ９と、Ｎ−ノ・イドロキシコノ・り酸イミド
２５　＋１１Ｂ、ｌ　＜ｃＤＭ　Ｆ　１．５　ｍｅに溶
かし、水冷下撹拌しつつｎｃｃ４１ｍ９を加える。３０
分後モノベンジルオキシカルポニルへキサメチレンジア
ミン塩酸塩”　５　ｗり、トリエチルアミン０．０３　
ｖｅをＤＭＦ１ｒｐ／に溶かした溶液を加え、水冷下で
２時間、室温で１２時間攪拌ケつづける。全体を減圧乾
固し、残渣をブレ・ぐラテイブ薄層クロマトに付して目
的の村記化合物、 ８２ｍ９（対理論収率５５タロ）を得た。 本市はシリカゲルの薄層クロマトでＲｆ＝０．４２（ク
ロロホルム−メタノール５：１）を示した。 （ロ）上記（イ）で得たエストリオール−１６−グルク
ロナイド・ベキ１ノメチレンジアミン；、宣、・’；体
５０何ノをメタノール３πｔ゛に７亡かし、・ぐラジウ
ム黒１０ｒｓｇを加え、常’ｊｌｉＡ常圧で７Ｊ％：　
ＣＩ’；気ｒｒ１１．中テ化（打する。２時間で反応は
終了（７触ケ１、をむ−・別し、炉液を減圧可縮し、残
渣にエーテルを加えると、カルボベンジルオキシ基が脱
Ｎしたｌ］的物３，５ｍｇを粉末としてイ↓）だ。 この生成物１ｏＴＲノをポリアクリル酸ｔｏｏｍｙとと
もにＩ）　Ｍ　Ｆ２　ｐｒ（：に溶かし、１）ＣＣ４鮪
を加え、室１品に５０時間放置する。反応液を１ノー析
し、内液を濾過後凍結乾赴）へすると、エストリオール
−１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸９５　ｒｎ
９を白色粉末として得た。 （／＋−３）エストリオール−１６−グルクロナイド結
イ］′シｊ？リアクリル酸結合ラテックスの製造 前記（ｂ−１）で製造したリジンラテックス０．１２を
１　ｍｅの蒸留水にて懸濁さぜ、これに前記（ｂ−２）
で製造したエストリオール−１６−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸水溶液１　ｒｙｅ　（エストリオール−
１６−グルクロナイド０．３１１Ｖ相当量）を加えて混
合し、ついで１−エチル−３−（３−ツメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド−塩酸塩１０ｍ２を加え　ＰＨ
，押下−夜反応を行なう。 反応終了後遠心分Ｐ、ａ　ｌ、て得た沈殿をグリシン緩
衝化食塩液１０ｒｎｅで３回洗浄後、沈殿を０．０５９
０に１？　ＳＡ　（ウザギ血清アルブミン）を含むグリ
シン緩衝化食塩液３０　ｒｎｉにて懸濁させて、エスト
リオール−１６−グルクロナイド結合ポリアクリル酸結
合ラテックスを製造した。 （Ｃ）　尿中ニストロダンの測定 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿各３例について
、それぞれをグリシン緩衝化食塩液で２倍、３倍、５倍
、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍
、６０倍および８０倍に希釈し、各希釈液の１．盲（０
，０３＋ｒｒｅ　）を反応スライド板上にｒ＋ｇｊ下し
、これに前記（ａ）でｌｉｄ造しだ抗Ｅ、　１６　Ｇモ
ノクロナル抗体担持ラテックスを１２１冷ずつ、）、Ｎ
″ｊ下し、ついで前記（ｂ）で製造したエストリオール
−１６−グルクロナイド結合ポリアクリルｒ・ぐ枯イ干
ラテックスを１　ｉ＋ｉ’４ずつ滴下する。この三者を
均一に混合し、２分間揺動後肉眼でさ：（：、（ｉ’４
像、７’ｌ’ｊｌ：ガユ［ｆ−を止トイ；を１・見察し
だ。 なお、本実施例においてＯ゛よ測定／＋’、：’＆　ｆ
Ｉ）′ｌを２ｎｇ／ｌｎｌに調整しであるので各尿中エ
ストロケ゛ンイ１“ｌｌ′（は第１表に示すごとくであ
った。 実施例２ 尿中ゾレグナンソオールの測定 （（Ｚ）　抗プレグナンジオールー３−グルクロナイド
モノクロナル抗体担持ラデツクスの製造（（Ｚ−１）７
’レグナンソオール−３−グルクロナイド−ＢＳＡの製
造 プレグナシソオール−３−ダルクロナイドとＢ　ＳＡを
用いて実施例１（ａ−１）と同様の方法でグレダナンソ
オールー３−グルクロナイド−ＢＳＡを製造した。 （ａ：２　）　抗プレグナンジオールー３−グルクロナ
イド抗体の製造 上記（ａ−１）で製造したプレグナンジオール−３−グ
ルクロナイドＢＳＡを用い、実施例１（＋１−２）と同
様な方法で４株の抗プレグナンジオールー３−グルクロ
ナイド抗体産生融合細胞ｔ）ミを得た。モノクロナル抗
体は、２Ｘ１０’個の細胞を予めシリスタン（１５ｍＣ
腹肘−内Ｊ″トＬブた１３Δ７Ｌ　１１／Ｃマウスの腹
腔に移殖して腹／１（を１釆取し、その脱水の硫、安５
０タロ′飽和分画を抗プレグナンジオールー３−グルク
ロナイドモノクロナル抗体としてイ奮だ。 （α−３）抗グレグナンソオールー３−グルクロナイド
抗体」μ持うテックスの製造 上記（ａ−２）でぶｒ造した抗グレダナンジオールー３
−グルクロナイドモノクロナル抗体を用い、実施例１（
α−３）と同様な方法で、抗グレグナンジオールー３−
グルクロナイドモノクロナル抗体担４！Ｊ、Ｉ？リスチ
レンラデックスを製造した。 （ｂ）　グレダナンソオールー３−グルクロナイド結合
ビニルメチルエーテル無水マし・インｒ１夕共重合体（
ｐＶＭＡｆΔ）の製造 （ｂ−ｒ）グレグナンソオールー３−グルクロナイドリ
ジンＮ＃ｊ　ｅ：す、休 プレグナンジオール−３−グルクロナイド９９ｆｆＪ９
、ε−ベンジルオキシカルがニルリソンメチルエステル
・トルエンスルポン酸３４Ｉ　１４０ワヲ／□）／／Ｆ
　１２　ｍｅに溶か［２氷冷下］［１，拌しつつソフェ
ニルホスホリルアミド６５弥つぃでトリエチルアミン０
、０５６）〃ｌを加えたのち、実施例１（ｂ−２）と同
４３於（（シて下ｎ：ｊ　’１丁Ｇ造式で表わされる目
的のりジン誘尋体ｔｏｏｍｙ（対理論収率”８Ｘ）を得
た。 （ｂ−２）プレグナシソオール−３−グルクロナイド結
合ｐ　／７　ｊτ／、Ｍイの製造」二６己（ｂ−ｔ）で
イ）だフ０レグナンソオールー３−グルクロナイド−リ
ジン誘尋体３３　ｎＩｇを実施例ｘ（ｂ−２）と同様に
して接ｆ：’ｊＩ’ｊＪＬＬ元した生成物をｐＨＭＭＡ
　１００　ｍｇとともに））　Ｍ　Ｆ　６　ｍｅに力旧
゛昌ｎ了解したのち、室温に４日間放置した。反応液を
実施例ｚ（ｂ−２）と同様に１０理し、プレグナンシ。 オール含［Ｊ　Ｏ−４６＋Ｉ＋！／／　ｍｅ　（９ｉ（
１９発色にヨル定Ｆ］−）のプレグナンジオール−３−
グルクロナイド結合ｉ合ｐｖＭｒｈΔのｍ液３０グｌを
得た。 （Ｃ）尿中プレグナンジメールの測定 妊婦尿５例をダリシン緩杓化食塩液で５００倍、１００
０倍、２０００倍、４０００倍および８０００倍に希釈
し、各希釈液の１　イ’ｌＪｉ　（０，０３ｒ−／　）
を反応スライド板上に部下［７、これに（σ）で製造し
た抗グレダナンヅオールー３−ダルクロナイドモノクロ
ナル抗体相持ラテックスをｌ　７ｉ！’ｉ闇’つ、つい
で（ｂ）で製造したプレグナンジオ−／１．−３−グル
クロナイド結合Ｐ　Ｖ　Ｍ　Ａ−Ｉ　Ａのグリシン緩衝
化食塩液の清液を１ｆ：・□・：Ｊずつｉｒｌ’ｊ下し
１、この三者イじ均一に混合し２分間揺動後肉眠でイ疑
集体、凝集阻止像を観察した。 力お、この実施例においては、試５％％の感度を５ｎ　
１７　／　ｒｖｉに訓コ整しであるので各妊婦Ｄｉ芝の
ゾレグナンジオールｒ弓度は第２表に示す値であった。 実施例３ 尿中１７−Ｏｆ−ＪＣ５の測定 （σ）抗３α、１１β、１７α、２１−テトラヒドロキ
シプレグナン−２０−オン（ＴＪＩＦ）−３−グルクロ
ナイドモノクロナル抗体感作血球の製造 （ａ−１）ＴＩＩＦ−３−グルクロナイド−，１３Ｓ　
Ａの製造 Ｔｉ１Ｆ−３−グルクロナイドとＢ　、５　Ａを用い、
実施例１（ａ−１）と同様な方法でＴＩＩＦ−３−グル
クロナイド−ＢＳΔを製造した。 （ａ−２）抗ＴＨＦ−３−グルクロナイドモノクロナル
抗体の製造 上記（ｃ−ｔ）で製造したＴｌ１Ｆ−’３−グルりロナ
イド−ＢＳＡを用い、実施例１（α−２）と同様な方法
で６株の抗ＴＩＩＦ−３−グルクロナイド抗体江生融合
細胞株をイＪ）、実施例２（ａ−２）と同様な操作によ
り、抗ＴＪＩＦ−３−グルクロナイドモノクロナル抗体
を得だ。 （α−３）抗Ｔ１１Ｆ　−３−グルクロナイドモノクロ
ナル抗体感作血球の芽こ（造 ホルマリン固定羊血球の４９に懸濁液（リンｌＩ：でド
（ｔｊ化化成塩液ｐＨ６，４）に等４１の０．０１％タ
ンニン酸溶液を加えて５６°Ｇ　３０分反応させた後、
リン酸緩衝化食ハＸ液にて血球をｆｆｔ：　ｒＤ後、８
２６懸バ宵色とする。ついで上記（α−２）で製造しだ
抗１’１ｌＦ−３−グルクロナイドモノクロナル抗体の
０．０００５％俗液をｉ：Ｆ　石−加え５６°Ｇで２時
間反応させる。反応終了後、リンｒｆ？緩衝化食塩液に
て血殊を遠心洗７子し、０．２％にＮ　ＲＳ　（正′帛
写：児血清）５％に乳糖を含むリンｒ波緩画化食ゼ賃１
１：にて１５ン（１血球υ′１度に希釈１．、　０．１
　ｎｒｅずつアンプルに分注し、次いで凍ｈ’ｊ　乾ｊ
’！”ユして抗Ｔ−ＩＩ’　Ｆ−グルクロナイドモノク
ロナル抗体感作血球を製造した。 （／＋）　ＴＲＦ　−３−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸の製造 （ｂ−ｔ）７°ｌｆ　、１’　−３−グルクロナイド−
リジン誘導体 実倫例２　（／）　−２）に従い、ｉ’１ｌＦ−３−グ
ルクロナイド５’３＋＋ｙ、ε−ペンツルオキ７カルン
ヒニルリノンメチルエステル・トルエンスルホンＲＪ’
ｍ５９ｍｐ、ソフエニルポスホリルアジド３３１−７ｇ
、トリエチルアミン（１，０２７ｍ（とから所望のリジ
ンｉｉ；＃導体５７　ｒｙ　（対理論収率７１９６）を
得た。 （ｂ−２）ＴｆｆＦ−３−グルクロナイドＡ′占合、Ｉ
Ｅリアクリル酸の製造 り記（ｂ−１）で得たリジン誘導体４０ｍ９を実施例１
（−）と同様にして接触還元後ＤＣ０１４ｍｇおよびポ
リアクリル酸１００？５と反応せしめ、後処理し、ＴＨ
Ｆ−３−グルクロナイド結合ボリア　り’）　ル？ｌ＋
’ｌ溶液１５ｍ（！（Ｔ、ＩＩＦ含有Ｌ１°０．９６π
ｙ／ｍｅ）を得だ。 （Ｃ）尿中１Ｔ−０，１１０Ｓのｊｌｌｌｌ定正常男子
床及び正常女子尿各々３検体について、それぞれをリン
【：汀（衝化食堵液で１００倍、１５０倍、２００４１
′？、２５０倍、３００倍および４００倍に４釈し、各
希釈酸を丸底小試Ｈ−ｑ管に０．１　ｒｎＩずつ分注し
、ついで前記（ａ）で狙！；宣しだ抗ＴＪ／Ｆ−３−グ
ルクロナイドモノクロナル抗体感作血球１アングルをリ
ン酸緩ゼ・Ｉ化成ｊ（１を液０．３　ｍｒで懸濁させ／
こ全量を、それぞれに添加し混合ｔＶ、！、’押抜、上
記（１））で製造しだＴＩＩＦ−３−グルクロナイド結
合１１？リアクリル帥のリン酸鋒（どｉ化成塩液０．１
　ｍｃを加え、よく１７、ξ押抜、ミラー付スタンドに
２１′Ｉ′ｌ′間静置したのちン￥・Ｉニガ８争、７＋
＋ご：Ｓ　ｌＩｔ　、ＩＬ、イ象を（で見察しだ。与本
実施例においてはｉｌｌ、！ｌｌ高感度２０　ｎ　Ｑ　
／’ｒｎｅに調整Ｌ　テ４）　ル（７）　ｆ各床中１７
−０　、／／　ＣＳ　ｉ”、：ｎ”ｌＩｔ、Ｉ、第３表
に示すととくであつブこ。 実施例４ サイロキシン（Ｔ４）の測定 （ａ）抗すイロキシンモノクロナル抗体世持ラテックス
の製造 （Ｑ、　−１）サイロキシン−Ｂ　Ｓ　Ａの製造Ｂ　Ｓ
　、４５’　Ｑ　ｍｑを２５＊ｒの蒸留水に、宕角厘７
、この（ｒ；ｆｉｌ　Ｋ　！５　＋ｐｅ　（７）　ｌ）
　Ｎ　Ｆに俗１’Ｒ’　シ’；’Ｃサイロキシンを加え
、４謂′ｌミ下３０　ｍ９の１−シクロへキシル−３−
（２−モル・ポリニル−４−エチル）カルボソイミドメ
１ｐ−）ルエンスルフォネートを加え、室温にて一夜反
応を行なった。反応液をノに留水に幻して辺析後、用５
結乾燥を行なってサイロキシン・Ｂ　Ｓ　Ａを製造した
。 （ａ、　−２）抗ツイロキシンモノクロナル抗体の［Ｆ
］′Ｉ造 上記（ａ）で−１・４　ｈしたサイロキシン・Ｕ　、５
　Ａ　ｆ　Ｊｌｌ　イ、実施例１　（ａ、　−２）とト
旧゛りな方法で抗−リーイロギンンモノクロナル抗体産
生融合細胞株を得、実施例２（ａ−２）と同様にして抗
ザイロキシンモノクロナル抗体を得だ。 （ａ、　−３）抗すイロキシンモノクロナル抗体相」も
ラテックスの製造 Ｊｍ記（ａ−２）でＵ＋；！造した抗ザイロキシンモノ
クロナル抗体０，２ｈ・ノを５力、ｅの２へ留水に溶ｉ
’４７ｋ、これにカルボキシルモディファイドラテック
スの１０％懸潔液１ｒ戸を混合し、次いで、１０ｍ９の
１−エチル−３−（３−ツメチルアミノゾロビル）カル
ボソイミド塩酸塩を加えｔＴｈｔ拌下−夜反応を行なっ
た。反応終了後、遠心分ｉ’！して得た沈殿をグリシン
緩衝化食塩液で洗浄し、沈殿を００８％にヤギ血清アル
フゝミンを含むグリシン緩動化食塩ｙｋ１０　ｒ！Ｉｅ
にてｊｌ、＋、ｐ　渇させて、抗サイロキシンモノクロ
ナル抗体結合ラテックスを製造した。 （ｂ）ザイロキシン結合ビニルメチルエーテル無水マレ
イン酸共爪合体（Ｐ　ＶＪｉＡｆＡ　）結合ラテックス
の製造 （ｂ−１）サイロキシン結合Ｐ　Ｖ　７１ｆ　Ｍ　、４
の製造実施例２（ｂ）と全く同様にしてＰ　Ｌ’　、Ａ
ｆ　ｉ（／ｌとサイロキシンとから製造し、ンｆ析内ｌ
戊を坤紅ｉ乾１；７ｊ　Ｌ、て白色粉末として得た。 （ｂ　−２）サイロキシン結合Ｐ　Ｉ／　ＭＭΔｆ’ｉ
合ラテックスのル・」造 前記（ｂ−１）で５目造したサイロキシン結合ｐ　Ｖ　
ｆｉｆＡｉ　ｙｉと実施（３’ｌＪ　１　（ｂ　−１）
で釡′１造し／こリジンラテックスを用いて実施例１（
１）−３）と同様な方法でサイロキシン結合Ｐ　）”　
Ｍ　、＋／ΔＡ１″ｆ合ラテックス全ラテックス。 （’）　Ｔ４の測足 正常男子血清４例について、８−アニリノ−１−ナフク
レンースルフオン酸を添加後、生理食塩水で２倍、３倍
、４倍、５倍、８倍及び１０倍に希釈し、実施例１（ｃ
）と同様な操作にょシＴ４を測定した。本実施例におけ
る試薬の測定感度は１゜ｎ　ｇ　／　Ｔｎ（！　ＶＣ調
整しであるので、測定値は第４表に示す通りでを）つた
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（／ｆ）ノ・ブテン又はその化学的変性物を、化学
   的に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフ
   ィン系高分子化合物、若しくは該結合物が約０．０１〜
   約２ミクロンの粒径の高分子ラテックス担体に化学的に
   結合して成るノ・ブテン担持担体及び ＣＢ）上記ハプテンに対する単一種のモノクロナル抗体
   担持担体 を用い、被検体中のノ・ブテンによる上記（Ｊ）及び（
   Ｂ）両試薬成分の凝集阻止反応を測定することを特徴と
   する上記被検体中のノ・ブテンの免疫化学的ｚ１１）定
   力法。 Ｚ　（，４）ハプテン又はその化学的変性物を、化学的
   に結合せしめたカルボキシル基含有水溶性モノオレフィ
   ン系高分子化合物、若しくは該結合物が約０．０１〜約
   ２ミクロンの粒径の高分子ラテックス４ｕ体に化学的に
   結合して成るノ・ブテン担持４ｕ体及び （／？）上記ハシテンに対する早一種のモノクロナル抗
   体担持担体 から成ることを特徴とするハプテンの免ｑｉ＝化学的測
   定試桑。