ES2255154T3 - Procedimiento para producir proteinas foraneas. - Google Patents

Abstract

Un método de producción de HSA (albúmina sérica humana), que comprende cultivar una levadura preparada mediante manipulación genética, en un medio que contiene un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo a una concentración de no más de 0, 5 g/l, y recoger la HSA del cultivo.

Description

Procedimiento para producir proteínas foráneas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una mejora en el método para la producción de HSA (albúmina sérica humana) que comprende cultivar una levadura transformada mediante manipulación genética.

Antecedentes de la técnica

Aunque se producen un amplio intervalo de proteínas útiles como productos farmacéuticos tales como albúmina sérica humana (designada en adelante como HSA), que es un componente proteico mayoritario del plasma, y similares, mediante fraccionamiento de fluido corporal, este método se enfrenta a dificultades para asegurar el material de partida, y las preparaciones producidas tienen una gran posibilidad de contaminación con virus y similares. La aparición de la tecnología de ADN recombinante en los últimos años ha posibilitado la producción de dichas proteínas mediante microorganismos y células, lo que estimula el estudio y el desarrollo de la producción a gran escala de proteína heteróloga mediante ingeniería genética. Sin embargo, el rendimiento es aún bajo y no ha sido obtenible una producción a gran escala.

El método para aumentar la producción de proteína heteróloga incluye un método que comprende añadir un ácido graso o una sal del mismo a un medio para aumentar la producción de HSA recombinante (en adelante designada como rHSA) (documento JP-A-4-293495), un método que comprende añadir una alta concentración de tensioactivo que tiene un grupo polialquilenglicol (Solicitud de Patente Japonesa según PCT en trámite y según kohyo nº 3-500969= WO 90/02808).

El documento EP-A-0470575 da a conocer un proceso mejorado para producir esterasa que comprende cultivar un microorganismo productor de esterasa en un medio. El documento WO 90 03430 A da a conocer medios mejorados para el cultivo de células animales y la producción de productos naturales y recombinantes derivados de las mismas. El documento US-A-5024947 da a conocer medios que soportan el crecimiento de células de insecto, y la producción así de proteínas recombinantes.

A la vista de dichos antecedentes técnicos, la presente invención se dirige a aumentar la cantidad de producción de HSA mejorando particularmente las condiciones de cultivo.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han realizado estudios intensivos en un intento de resolver los problemas anteriormente citados, y han encontrado que la cantidad de producción de una HSA puede aumentarse cultivando una levadura preparada mediante manipulación genética en un medio que contenga un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo, que dio como resultado la conclusión de la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona lo siguiente:

(1)

Un método de producción de HSA (albúmina sérica humana) que comprende cultivar una levadura preparada mediante manipulación genética en un medio que contiene un ácido graso o sal del mismo y un tensioactivo a una concentración no mayor de 0,5 g/l, y recoger la HSA del cultivo.

(2)

El método de producción (1) anterior, en el que el ácido graso tiene 10 a 26 átomos de carbono.

(3)

El método de producción (1) anterior, en el que el medio contiene un ácido graso o una sal del mismo a una concentración de 0,01-10% p/v.

(4)

El método de producción (1) anterior, en el que el tensioactivo es un tensioactivo no iónico que tiene un peso molecular de 100-100.000.

En la presente invención, el hospedador es una levadura, que puede ser del género Saccharomyces o del género Pichia. Pueden utilizarse también la cepa auxotrófica y la cepa sensible a antibióticos de estos hospedadores. Preferiblemente, puede utilizarse la cepa AH22 de Saccharomyces cerevisiae que es una cepa sensible a G418 (a, his 4, leu 2, can 1) y la cepa GTS115 de Pichia pastoris (his 4, nº depósito NRRL Y-15851).

Por ejemplo, puede prepararse un hospedador productor de HSA (o una cepa productora de HSA) mediante un método que utiliza un gen de HSA conocido (documentos JP-A-58-56684, JP-A-58-90515, JP-A-58-150517), un método que utiliza un nuevo gen de HSA (documentos JP-A-62-29985, JP-A-1-98486), un método que utiliza una secuencial señal sintética (documento JP-A-1-240191), un método que utiliza una secuencia señal de albúmina sérica (documento JP-A-2-167095), un método que comprende la integración de un plásmido recombinante en un cromosoma (documento JP-A-3-72889), un método que comprende la fusión de hospedadores (documento JP-A-3-53877), un método que comprende la mutación en un medio que contiene metanol, un método que utiliza un promotor AOX2 mutante (documentos JP-A-6-90768, JP-A-4-299984), la expresión de HSA por Bacillus subtilis (documento JP-A-62-25133), la expresión de HSA por levadura (documentos JP-A-60-41487, JP-A-63-39576, JP-A-63-74493), la expresión de HSA por levadura Pichia (documento JP-A-2-104290).

De estos, el método que causa la mutación en un medio que contiene metanol se realiza del siguiente modo. Se introduce un plásmido que tiene una unidad de transcripción para expresar HSA bajo el control del promotor AOX1 en la región del gen AOX1 de un hospedador adecuado, preferiblemente levadura Pichia, específicamente cepa GTS115 de Pichia pastoris, mediante un método convencional, proporcionando un transformante (véase el documento JP-A-2-104290). Este transformante tiene una débil capacidad de proliferación en un medio que contiene metanol. Por tanto, según el método descrito en el documento JP-A-4-299984, este transformante se cultiva en un medio que contiene metanol para causar la mutación, y sólo se recupera la cepa capaz de crecimiento. En este caso, la concentración de metanol es aproximadamente de 0,0001%-5%. El medio puede ser sintético o natural. Las condiciones de cultivo son 15°C-40°C, 1 hora-1.000 horas.

A condición de que el medio a utilizar para cultivar un hospedador transformado contenga un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo, no está sujeto a limitaciones particulares con respecto a otros componentes, y se utiliza habitualmente un medio conocido en este campo. El cultivo de un hospedador transformado en un medio que contiene un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo posibilita el aumento de la cantidad de producción de una proteína heteróloga. Además, se espera que la enzima que secreta el hospedador mismo suprima la descomposición de la proteína heteróloga.

Los ejemplos de ácido graso incluyen preferiblemente aquellos que tienen 10 a 26 átomos de carbono.

Los ejemplos de los ácidos grasos anteriormente citados incluyen ácidos grasos saturados e insaturados tales como ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido terc-vaccénico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido araquidónico. Las sales de estos ácidos grasos son, por ejemplo, sal de metal alcalino tal como sal de sodio, sal de potasio y sal de calcio, sales de metales alcalinotérreos y sales de amina orgánica, dando preferencia a un medio que contenga ácido oleico o una sal del mismo.

El contenido de ácido graso en el medio es de 0,01-10% p/v, preferiblemente 0,2-5% p/v.

El tensioactivo a utilizar en la presente invención es un tensioactivo no iónico que tiene preferiblemente un alto peso molecular de 100 a 100.000.

Los ejemplos del tensioactivo no iónico anteriormente citado incluyen polialquilenglicol (por ejemplo, polipropilenglicol que tiene un peso molecular medio de 1.000-10.000, preferiblemente 2.000-6.000), copolímero de polioxialquileno (por ejemplo, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno que tiene un peso molecular medio de 100-100.000, preferiblemente 1.000-30.000), derivado polioxialquileno de aceite de ricino hidrogenado [por ejemplo, polioxietilen(20)éter de aceite de ricino hidrogenado, polioxietilen(40)éter de aceite de ricino hidrogenado, polioxietilen(100)éter de aceite de ricino hidrogenado], derivado polioxialquileno de aceite de ricino [por ejemplo, polioxietilen(20)éter de aceite de ricino, polioxietilen(40)éter de aceite de ricino, polioxietilen(100)éter de aceite de ricino], éster de ácido graso de polioxietilensorbitán (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán, monopalmitato de polioxietilensorbitán, monolaurato de polioxietilensorbitán), éster de ácido graso de sorbitán, alquilfenolpolioxietilenéter, éster de ácido graso de polioxietilensorbita, derivado polioxiletileno de aceite de ricino hidrogenado y éster de ácido graso de poliglicerina. En particular, es preferible que el medio contenga polialquilenglicol, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (marca comercial Pluronic) o éster de ácido graso de polioxietilensorbitán (marca comercial Tween).

El contenido del tensioactico en un medio es preferiblemente no mayor de 0,5 g/l.

El medio puede ser un medio sintético o un medio natural, dando preferencia a un medio sintético. Puede ser un medio sólido o un medio líquido, preferiblemente un medio líquido. Por ejemplo, un medio sintético contiene generalmente diversos sacáridos como fuente de carbono, urea, sal de amonio y nitrato como fuente de nitrógeno, diversas vitaminas y nucleótidos como nutrientes traza y sales inorgánicas (por ejemplo, Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Cu y similares). Los ejemplos de medio incluyen un medio líquido YNB [0,7% de base nitrogenada de levadura (fabricada por Difco), 2% de glucosa]. Los ejemplos de medio natural incluyen un medio líquido YPD [1% de extracto de levadura (fabricado por Difco), 2% de bactopeptona (fabricado por Difco), 2% de glucosa]. Cuando se utiliza un hospedador que utiliza metanol, puede utilizarse un medio que contiene metanol. En este caso, la concentración de metanol es preferiblemente de aproximadamente 0,01-5%.

El medio utilizado en la presente invención puede prepararse fácilmente añadiendo un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo a un medio conocido convencionalmente.

Otras condiciones de cultivo son similares a las utilizadas para un método convencional.

La temperatura de cultivo es, por ejemplo, de 15°C-40°C, generalmente de 20°C-37°C. Cuando el hospedador es una levadura, es preferiblemente de 20°C-30°C, y cuando el hospedador es bacteria, es preferiblemente de 30-37°C. El tiempo de cultivo es generalmente de 1 hora-1.000 horas.

Se realiza el cultivo mediante cultivo discontinuo o cultivo semicontinuo o cultivo continuo con reposo o agitación, agitación mecánica o aireación, preferiblemente semicontinuo utilizando un fermentador. Por ejemplo, se añade glucosa de alta concentración en porciones al cultivo semicontinuo, evitando la inhibición por alta concentración de sustrato respecto a las células productoras, con lo que se obtienen células y productos con alta concentración (documento JP-A-3-83595).

Es preferible realizar un precultivo antes de este cultivo. El medio para precultivo puede ser, por ejemplo, medio líquido YNB o medio líquido YPD. Las condiciones de precultivo son preferiblemente tiempo de cultivo de 10 horas-100 horas, temperatura de aproximadamente 30°C para levaduras y aproximadamente 37°C para bacterias.

Después de la terminación del cultivo, se recoge una HSA mediante un método conocido de separación y purificación a partir del cultivo. Como se utiliza en la presente memoria, el cultivo cubre cualquier sustancia capaz de contener HSA, tal como un medio de cultivo y una levadura que es específicamente un sobrenadante de cultivo, un filtrado del mismo, una célula bacteriana y una célula.

La presente invención se explica con detalle a continuación mediante el ejemplo y el ejemplo experimental, a los que la presente invención no está limitada.

Ejemplo 1 (1) Preparación de la cepa bacteriana utilizada

Utilizando un promotor AOX2 mutante [promotor AOX2 natural (Yeast 5, 167-177 (1988) o Mol. Cell Biol., 9, 1316-1323 (1989)) en el que el nucleótido 255 cadena arriba del codón de iniciación se cambió de T a C], se construyó un plásmido pMM042 para la expresión de HSA y se introdujo en la cepa GTS115 de Pichia pastoris, proporcionando una cepa UHG42-3 transformante (documento JP-A-4-29984).

(2) Composición del medio

Para el precultivo, se utilizó medio YPD (2% de bactopeptona, 1% de extracto de levadura, 2% de glucosa). Se muestra la composición del medio semicontinuo utilizado para el cultivo principal en la Tabla 1, y se muestra la composición del medio de alimentación en la Tabla 2. La composición de la solución de *2 en la Tabla 1 y la Tabla 2 se muestra en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 1 y la Tabla 2, el contenido de ácido oleico del medio semicontinuo y el medio de alimentación utilizados en este Ejemplo se fijó en 0,5% p/v.

TABLA 1

Composición de medio discontinuo
Componente	Cantidad (1/l)
Glicerol	50,0 g
H_{3}PO_{4} (al 85%)	14,0 ml
CaSO_{4}\cdot2H_{2}O	0,6 g
K_{2}SO_{4}	9,5 g
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	7,8 g
KOH	2,6 g
Solución de biotina (*1)	1,6 ml
Solución de YTM (*2)	4,4 ml
Ácido oleico	5,0 g
*1: biotina 0,2 g/l
*2: véase la Tabla 3.

TABLA 2

Composición del medio de alimentación
Componente	Cantidad (1/l)
Solución de YTM (*2)	2,0 ml
Ácido oleico	5,0 g
Metanol	1.000,0 ml
*2: véase la Tabla 3.

TABLA 3

Composición de la solución YTM
Componente	Cantidad (1/l)
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	65,0 g
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O	6,0 g
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O	20,0 g
MnSO_{4}\cdot4-5 H_{2}O	3,0 g
H_{2}SO_{4}	5,0 ml

(3) Método de cultivo utilizando fermentador 1) Precultivo

Se inoculó una suspensión celular bacteriana (1 ml, aproximadamente DO_{540}\approx aproximadamente 10) al medio YPD (50 ml) y se sometió a cultivo agitado a 30°C durante 24 horas.

2) Cultivo principal

Se inoculó el precultivo (14 ml) en el medio discontinuo (700 ml) y se sometió a cultivo de agitación mecánica con aireación en un minifermentador. La temperatura del cultivo fue 25°C, el pH fue 5,8. Se añadió Adekanol LG-109 (fabricado por Asahi Denka Kogyo), que es un tensioactivo de polioxilalquileno, al medio a una concentración de 0,4 g/l.

En cultivo discontinuo, cuando la levadura proliferó a una densidad suficientemente alta y se consumió el glicerol en el medio, se añadió medio de alimentación y se cultivó durante 360 horas, permitiendo la producción de HSA.

Después de terminar el cultivo, se muestreó el cultivo y se midió la cantidad de producción de HSA mediante el método descrito en los siguientes ejemplos. Como resultado, la cantidad fue de 114% cuando la producción sin adición de ácido oleico fue de 100%.

Ejemplo 2

Se realizó el cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto porque la concentración de ácido oleico en el medio de alimentación se fijó a 1% p/v. La cantidad de producción de HSA fue de 125%.

Ejemplo 3

Se realizó el cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto porque la concentración de ácido oleico del medio de alimentación se fijó a 5% p/v. La cantidad de producción de HSA fue de 127%.

Ejemplo 4

Se realizó el cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto porque el tensioactivo en el medio de alimentación fue Pluronic L-61 (peso molecular medio: 2.000, óxido de etileno:óxido de propileno = 10:90, fabricado por Asahi Denka Kogyo), que es un copolímero de polioxietileno-polioxipropileno.

Ejemplo de referencia

Determinación cuantitativa de la concentración de HSA

Se centrifugó una parte del cultivo recuperado y se filtró el sobrenadante después de volverse transparente, lo que fue seguido por la determinación cuantitativa mediante análisis de filtración en gel por HPLC.

Según la presente invención, puede aumentarse la cantidad de HSA producida por una levadura, y puede inhibirse la descomposición de HSA por una enzima secretada por la levadura misma, con lo que puede aumentarse la cantidad de HSA recogida. La presente invención comprende cultivar una levadura de HSA en un medio que contiene un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo, y es un método fácil y sencillo.

Claims (4)

1. Un método de producción de HSA (albúmina sérica humana), que comprende cultivar una levadura preparada mediante manipulación genética, en un medio que contiene un ácido graso o una sal del mismo y un tensioactivo a una concentración de no más de 0,5 g/l, y recoger la HSA del cultivo.

2. El método de producción de la reivindicación 1, en el que el ácido graso tiene 10 a 26 átomos de carbono.

3. El método de producción de la reivindicación 1, en el que el medio contiene un ácido graso o una sal del mismo a una concentración de 0,01-10% p/v.

4. El método de producción de la reivindicación 1, en el que el tensioactivo es un tensioactivo no iónico que tiene un peso molecular de 100-100.000.