ES2255162T3

ES2255162T3 - Composiciones adecuadas para liberacion controlada de la hormona gnrh y sus analogos.

Info

Publication number: ES2255162T3
Application number: ES98923763T
Authority: ES
Inventors: Patrick J. Burns; John W. Gibson; Arthur J. Tipton
Original assignee: Durect Corp
Current assignee: Durect Corp
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: CA2291087C; EP1017411A1; US6051558A; AU743086B2; NZ501219A; DE69832631T2; BR9809189A; CA2291087A1; DE69832631D1; AU7598098A; EP1017411A4; AU743086C; ATE311196T1; WO1998053837A1; EP1017411B1

Abstract

Una composición para la liberación controlada de GnRH o análogos del mismo en yeguas para inducir la ovulación, que comprende: a) un material transportador líquido no soluble en agua, no polimérico que tiene una viscosidad de al menos 5000 cP a 37ºC que no cristaliza no diluido en condiciones ambientales o fisiológicas; b) GnRH o análogos, o combinaciones de los mismos.

Description

Composiciones adecuadas para liberación controlada de la hormona GnRH y sus análogos.

Antecedentes de la invención

En la industria de los caballos el desarrollo de un método exacto y económico para el control preciso de la ovulación en la yegua beneficiaría grandemente el manejo reproductivo de yeguas y potros. El periodo de estro extendido de las yeguas, con ovulación en cualquier momento entre 1 a 10 días después del comienzo del estro, ha hecho que el manejo reproductivo de las yeguas consuma tiempo, sea costoso y, más importante aun, ineficiente. En la yegua, el GnRH o sus análogos están comenzando a ser utilizados como sustitutos alternativos no anti-génicos sustitutos para reemplazar hCG para disparar la ovulación en yeguas preovulatorias. Esto se debe a que el uso repetido del hCG ha sido asociado con la respuesta disminuida [Sullivan, J., J Am. Vet. Med. Assoc. 63:895 (1973)] y la formación del anticuerpo anti-hCG [Roser, J., J. Reprod. Fert. Suppl. 173-179(1974)]. Los datos actuales sugieren que la inducción de la ovulación con análogos de GnRH potentes requiere inyecciones múltiples de dosis muy bajas [Harrison, L., et al., J. Eq. Vet Sci. 11:163-166(1991)] o una dosis muy alta dada mediante un implante de liberación lenta [Jochle, W. et al., J. Eq. Vet. Sci. 44:632(1994)].

La selección de un sistema apropiado de liberación de fármaco debería estar basado en las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del fármaco. La importancia de las propiedades farmacodinámicas de un fármaco es especialmente relevante en el caso de hormonas que apuntan a receptores de alta afinidad específicos para producir su efecto. En el caso del GnRH esta relación depende de múltiples elementos incluyendo especie, estatus reproductivo y efectos de concentración/presentación complejos de la respuesta del péptido y la pituitaria a él.

Los solicitantes han descubierto que ciertas composiciones son adecuadas para la liberación controlada de GnRH particularmente con el propósito de avanzar la ovulación en las yeguas. La composición incluye un sistema basado en acetato isobutirato de sacarosa (SAIB), una molécula de sacarosa completamente esterificada. El SAIB es un material de bajo peso molecular que tiene muchas de las propiedades asociadas a los materiales poliméricos. Puesto que el SAIB no es un polímero, se requiere dilución con sólo pequeñas cantidades de solventes para dar una solución fácilmente inyectable.

Breve descripción de la invención

Los solicitantes han descubierto una adaptación particular de la tecnología del sistema de liberación de fármacos SAIB adecuado para inducir la ovulación en yeguas, con una composición que es tanto inyectable como
esterilizable.

Abreviaturas y definiciones

GnRH Hormona de liberación de Gonadotropina, también conocida como LH-RH o LHRH

HVLCM Material líquido transportador de alta viscosidad.

LH Hormona luteinizante

LH-RH hormona liberadora de hormona luteinizante

LVLCM Material transportador líquido de baja viscosidad

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las concentraciones de LH en yeguas después del tratamiento con formulaciones experimentales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con una composición para la liberación controlada de GnRH o análogos de los mismos para inducir ovulación, la cual comprende:

(a) un material transportador líquido no soluble en agua, no polimérico que tiene una viscosidad de al menos 5000 cP a 37ºC que no cristaliza solo bajo condiciones ambiente o fisiológicas;

(b) GnRH o análogos, o combinaciones de los mismos.

En una modalidad de la composición de la presente invención, el material transportador líquido no soluble en agua es acetato isobutirato de sacarosa.

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En otra modalidad de la composición de la presente invención, le material transportador líquido no soluble en agua está presente en una cantidad de desde aproximadamente 99.5 por ciento hasta aproximadamente 10 por ciento en peso, con respecto al peso total de la composición.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el material transportador líquido no soluble en agua está presente en una cantidad de desde aproximadamente 95 por ciento hasta aproximadamente 25 por ciento en peso, con respecto al peso total de la composición.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, la composición comprende además un solvente en el cual es soluble el transportador líquido no soluble en agua.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el solvente es seleccionado del grupo consistente de etanol, dimetilsulfóxido, etil lactato, acetato de etilo, alcohol bencílico, triacetina, N-metilpirrolidona, carbonato de propileno y glicofurol.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el solvente es etanol.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el solvente está presiente en una cantidad de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 por ciento en peso, con respecto al peso de la composición.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el análogo es deslorelina.

En otra modalidad de la composición de la presente invención, el análogo es seleccionado entre deslorelina, avorelina, leuprolida y LHRH natural.

La presente invención también se relaciona con una composición líquida para la liberación controlada de GnRH o análogos de los mismos en yeguar para inducir la ovulación, comprendiendo acetato isobutirato de sacarosa y etanol en una relación en peso de entre aproximadamente 75:25 y aproximadamente 60:40, y GnRH o análogos del mismo o combinación de los mismos en una concentración de entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5 mg/ml de composición líquida, para liberar una dosis de entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 10 mg de GnRH o análogos o del mismo o combinaciones de los mismos.

En una modalidad de las composiciones líquidas de la presente invención, la composición es esterilizada antes de la administración a yeguas.

En otra modalidad de las composiciones líquidas de la presente invención, la composición es esterilizada por filtración antes de la administración a yeguas.

La presente invención también se relaciona con una composición líquida esterilizada por filtración para la liberación controlada de Deslorelina en yeguas para inducir ovulación, comprendiendo acetato isobutirato de sacarosa y etanol en una relación peso a peso de aproximadamente 75:25, y Deslorelina en una concentración de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5.0 mg/ml de composición líquida, para liberar una dosis de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg de deslorelina, siendo dicha composición administrable por inyección.

La presente invención también se relaciona con una composición líquida para la liberación controlada de Deslorelina en yeguas para inducir ovulación, comprendiendo Acetato isobutirato de sacarosa y etanol en una relación en peso de aproximadamente 75:25, y Deslorelina en una concentración de entre aproximadamente 1.0 y aproximadamente 2.5 mg/,l de composición líquida, para liberar una dosis de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg de deslorelina, siendo administrable dicha composición por inyección.

I. Material Transportador Líquido de Alta Viscosidad (HVLCM)

Un material transportados líquido de alta viscosidad debe seleccionarse de manera tal que no sea polimérico, y que tenga una viscosidad de al menos 50000 cP (y opcionalmente al menos 10000, 15000, 20000, 25000 ó aun 50000 cP) a 37ºC, y que no cristalice por sí mismo bajo condiciones ambiente o fisiológicas.

En una modalidad preferida, el HVLCM disminuye significativamente en velocidad cuando se mezcla con un solvente para formar un LVLCM que pueda ser mezclado con un sustrato para liberación controlada. La composición LVLCM/sustrato es típicamente más fácil de colocar en el cuerpo que una composición HVLCM/sustrato, porque fluye más fácilmente dentro y fuera de las jeringas u otros medios de implantación, y puede ser fácilmente formulada como una emulsión. La LVLCM puede tener cualquier viscosidad deseada. Se ha encontrado que un rango de viscosidad para la LVLCM de menos de aproximadamente 1000 cP, y más particularmente menos de 200 cP, es típicamente útil para aplicaciones in vivo.

En una modalidad preferida, el acetatoisobutirato de sacarosa ("SAIB"), una molécula de sacarosa esterificada con dos grupos de ácido acético y seis grupos de ácido isobutírico, se usa como HVLCM. La estructura del SAIB se define más abajo.

1

El SAIB es oralmente no tóxico y se usa corrientemente para estabilizar emulsiones en la industria alimentaria. Es un líquido muy viscoso y tiene la inusual propiedad de que sufre dramáticos cambios en viscosidad con pequeñas adiciones de calor o con la adición de solventes. Es soluble en un gran número de solventes biocompatibles. Cuando está en solución o en una emulsión, el SAIB puede ser aplicado a través de inyección.

En otras modalidades, la HVLCM pueden ser éteres estearato tales como los de propilenglicol, glicerilo, dietilaminoetilo, y glicol, amidas de estearato y otras aminas ácidas de grasas de cadena larga, tales como cetilalcohol y estearil alcohol, ésteres de cadena larga tales como miristato de miristilo, behenierucato y fosfatos de glicerilo. En una modalidad particular, el HVLCM es diestearato de sacarosa diacetilado (Crodesta A-10).

El HVLCM está presente en la composición en cualquier cantidad que alcance el efecto deseado. El HVLCM está típicamente presente en composiciones de liberación controlada para GnRH o sus análogos en una cantidad en el rango de desde aproximadamente 99.5 por ciento hasta aproximadamente 10 por ciento en peso, más típicamente, entre aproximadamente 90 y aproximadamente 25 por ciento, y lo más típicamente entre aproximadamente 85 y aproximadamente 65 por ciento en peso, con respecto al peso total de la composición.

II. Sustancia para ser liberada

Una variedad de análogos de la hormona liberadora de gonodotroflina son adecuados para la liberación controlada en las composiciones de la presente invención. Análogos adecuados incluyen, pero no están limitados a los listados en la siguiente Tabla I.

Estructura del agonista	Nombre
	Fuente comercial
D-Trp6Pro9N Et LHRH	Deslorelina
[Des-Gly10,D-2-Methyl-Trp6,Pro9-NHEt]-LHRH	Avorelina (Metrelina)
[D-Leu6, des-Gly-NH210] - LHRH (1-9) NHEt	Leuprolida (Abbott)
LHRH natural
D-trp6-LHRH	triptorelina (Debioplarm) (Decapeptina)
[D-Ser (But6des-GLy-NH210]-LHRK (1-9) NHEt	buserelina (Hoechst)
Des-Gly10-NH2-LH-RH-	etilamida fertirelina (Takeda)
[D-Trp6, MeLeu7, des-Gly-NH210] – LHRH(1-9) NHEt	Lutrelina (Wyeth)
[D-Ser(But)6, Azgly10]- -LHRH	Zoladex (Registered Trademark) ICI
[D- -Ser(but)6,]-LHRH(1-9)NHEt

(Continuación)

Estructura del agonista	Nombre
	Fuente comercial
[D- -Lys(Boc)6,des- -Gly- -NH210]- - LHRH (1-9)NHEt
[D- -Glu(OBut)6,des- -Gly- NH210]- - LHRH(1-9) NHEt
[D- -Asp(OBut)6,des- -Gly- -NH210]-LHRH(1-9)NHEt
[D—Leu6Ser(But),des- -Gly- -NH210]-LHRN(1-9)NHEt
[D- -Ser(But)6,Cys(But)7des- -Gly- -NH210]-LHRH(1-9)NHEt
[D- -Ser(Bu5)6 des- -Gly- -NH210]- -LHRH(1-9)NHEt
[D- -Phe6, Azgly10]- -LHRH
[D- -Tyr(Me)6,Azgly10]- -LHRH
[D-Ser(But)6,Azgly10]- -LHRH
[D—Tmo6]—LHRH
[D- -Nal(2)6]=LHRH
[D-His(Benzyl)6, des-glyNH210]-LHRH(1-9) NHEt	historelina

Análogos preferidos de GnRH incluyen deslorelina, avorelina, leuprolida, y LHRH natural. Otra serie de análogos preferidos de GnRH incluyen triptorelina, nafarelin, goserelina, buserelina, y fertirelina. La más preferida es la deslorelina.

Los análogos de GnRH son sintetizados mediante cualquiera de una variedad de técnicas convencionales. Véase en general Merrifield, B., Science 232:342 (1986), Norman, A.W. et al., Hormones Academic Press New York 1987. La deslorelina es sintetizada por el método de Ajayaghosh, A. et al., J. Org. Chem. 55:2826(1990); Nestor, J.J. et al., Proc. Am. Pept. Symp. 7,109 (1981); la avorelina por el método de WO 91/18016; la leuprolida por los métodos de La patente alemana 2,446,005, La patente estadounidense 4,005,063; el LHRH natural por el método de La patente alemana 2,213,737 y Coy et al. Methods Enzymol. 37,416 (1975); la triptorelina por los métodos de La patente alemana 2,625,843, La patente estadounidense 4,010,125; la goserelina por el método de La patente alemana 2,720,245, La patente estadounidense 4,100,274; la buserelina por el método de La patente alemana 2,438,352, La patente estadounidense 4,024,248; la fertirelina por el método de

\hbox{La patente alemana 
2,321,174; La patente estadounidense 3,853,837.}

III. Solvente

Cuando la composición se usa como un LVLCM, debe contener un solvente en el cual el HVLCM sea soluble. Preferiblemente, la sustancia que va a ser liberada también es soluble en el solvente. El solvente debe ser no tóxico, soluble en agua o miscible con agua, y de otra forma biocompatible. Los solventes que son tóxicos no deben ser usados para propósitos farmacéuticos o agrícolas. Los solventes usados para inyectar la composición en animales no deberían producir irritación de tejidos significativa o necrosis en el sitio de la El solvente debe ser al menos soluble en agua, de modo que se difunda rápidamente en los fluidos corporales o en otros ambientes acuosos, haciendo que la composición se coagule o solidifique. Ejemplos de solventes adecuados incluyen etanol, etil lactato, propilen carbonato, glicofurol, N-metilpirrolidona, 2 pirrolidona, propilen glicol, acetona, metil acetato, etil acetato, metil etil cetona, bencil alcohol, triacetina, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, tetrahidrofurano, caprolactama, decilmetilsulfóxido, ácido oléico, y 1-dodecilazacicloheptan-2-ona. Un solvente preferido es etanol.

Cuando se usa el SAIB como HVLCM, los solventes preferidos son etanol, dimetilsulfóxido, etil lactato, etil acetato, bencil alcohol, triacetina, N-metilpirrolidona, propilen carbonato, y glicofurol. SAIB no es miscible con glicerol, aceite de maíz, aceite de cacahuete, 1,2-propanodiol, polietilen glicol (PEG200), aceite de sésamo super refinado, y aceite de cacahuete super refinado. De acuerdo a ello, el último grupo de solventes no se prefiere para uso con SAIB.

El solvente es típicamente añadido a las composiciones en una cantidad en el rango de desde aproximadamente 5 por ciento hasta aproximadamente 55 por ciento en peso, con respecto al peso total de la composición. Preferiblemente, el solvente está presente en la composición en una cantidad en el rango de desde aproximadamente 10 por ciento hasta aproximadamente 50 por ciento en peso.

IV. Usos veterinarios de composiciones LVLCM y Veterinary HVLCM

La composición descrita aquí puede ser administrada al huésped a través de una variedad de métodos que pueden variar dependiendo del resultado que se va a obtener. Cuando el huésped es una animal, la composición puede ser administrada, por ejemplo, tópicamente, sistémicamente (por ejemplo, por vía mucosa (oralmente, rectalmente, vaginalmente o nasalmente), o por vía parenteral (intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal) en un transportador apropiado, si se desea.

Preferiblemente, para poropositosis veterinarios, las presentes composiciones son administradas como soluciones o suspensiones vía inyección. Cuando se administran vía inyección como un LVLCM, la pequeña cantidad de solvente usada en la composición migra hacia el fluido acuoso del huésped, formando un depósito altamente viscoso para la liberación controlada de sustancias. Véase, por ejemplo, Ansel, H.C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Del. Systems, sixth ed., 1995.

Ejemplo 1 A. Preparación de la Formulación 1 de SAIB

Se preparó una solución de deslorelina en DMSO (1.0% en peso). también se preparó una solución concentrada de relación en peso 95:5 SAIB:DMSO. Se añadió una cantidad predeterminada (2.1870 g) de acetate de deslorelina (DA)/DMSO a 7.9230 g de la solución 95:5 de SAIB:DMSO. La formulación final contenía 2.4 mg/ml de deslorelina y tenía una relación SAIB:DMSO de 75:25.

B. Preparación de la Formulación 2 de SAIB

Se prepare una solución de deslorelina en etanol (2.1% en peso). también se prepare una solución concentrada de relación 95:5 en peso SAIB:etanol. Se añadió una cantidad predeterminada (1.0376 g) de deslorelina acetato/etanol ala solución 95:5 SAIB:etanol. La formulación final contenía 2.3 mg/ml de deslorelina y tenía una relación SAIB:etanol de 85:15.

C. Preparación de la Formulación 3 de SAIB

Se prepare una solución de deslorelina en etanol (1.9% en peso). también se prepare una solución de relación en peso 95:5 de SAIB:etanol. La formulación final contenía 2.2 mg/ml de deslorelina y tenía una relación SAIB:etanol de 75:25.

D. Preparación de las Formulaciones de SAIB 4-8 con 75:25 SAIB:etanol para el Estudio de Titulación de Dosis

Un estudio de titulación de dosis fue llevado a cabo usando esta formulación 75:25 SAIB:etanol que evaluó las concentraciones de deslorelina de 0.5, 1.0, 1.5, y 2.0 mg/ml. Se prepare una solución concentrada de SAIB en etanol (83.6% en peso) y se esterilizó por filtración usando un filtro hidrófobo de 0.2 \mum. Etanol puro y una solución de deslorelina en etanol (21.0 mg/g) fueron esterilizados por filtración usando filtros de jeringa estériles de 0.22 \mum.

Cantidades apropiadas de soluciones estériles de [SAIB/EtOH y EtOH/Deslorelina fueron combinadas con una cantidad predeterminada de etanol estéril para producir las mezclas finales con las concentraciones deseadas. Las cantidades de cada componente usado y las composiciones de las formulaciones preparadas se muestran en la Tabla A. La concentración más baja de cada formulación produjo una solución, mientras que las formulaciones restantes fueron suspensiones que se incrementaron en turbidez con la concentración creciente de delorelina.

TABLA A

Composiciones de formulaciones 75:25 SAIB:Etanol para estudio in vivo
		Cantidad de componente añadida
Número de lote	Fórmula para #	Relación SAIB/EtOH	DA mg/ml	EtOH	EtOH/D es	SAIB/E tOH
X96560	4	75:25	0.5	2.49	0.74	27.91
X96561	5	75:25	1.0	1.79	1.49	28.39
X96562	6	75:25	1.5	1.03	2.19	27.61
X96563	7	75:25	2.0	0.31	2.91	27.64
X96568	8	75:25	0	8.74	-	77.79

E. Preparación de Formulaciones SAIB 9-12 con SAIB:Etanol 65:35 para Estudio de Titulación de Dosis

También se efectuó un estudio de titulación de dosis usando una formulación SAIB:Etanol 65:35 que evaluó las concentraciones de deslorelina de 0.5, 1.0, 1.5, y 2.0 mg/ml. Se preparo una solución concentrada de SAIB en etanol (83.6% en peso) y se esterilizó por filtración usando un filtro hidrófobo de 0.2 \mum. Etanol puro y una solución de deslorelina en etanol (21.0 mg/g) fueron esterilizados por filtración usando filtros de jeringa estériles de 0.22 \mum.

Cantidades apropiadas de soluciones estériles de de SAIB/EtOH y EtOH/Deslorelina fueron combinadas con una cantidad predeterminada de alcohol estéril para producir las mezclas finales con las concentraciones deseadas. Las cantidades de cada componente usado y las composiciones de las formulaciones se prepararon como se indica en la Tabla B. La concentración más baja de cada formulación produjo una solución, mientras que las formulaciones restantes fueron suspensiones que incrementaron en turbidez con la concentración creciente de deslorelina.

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TABLA B

Composiciones de formulaciones 65:35 SAIB:Etanol para estudio in vivo
		Cantidad de componente añadida
Número de lote	Fórmula para #	Relación SAIB/EtOH	DAg/ml	EtOH	EtOH/D s	SAIB/E tOH
X96564	9	65:35	0.5	5.56	0.74	23.23
X96565	10	65:35	1.0	4.98	1.43	22.29
X96566	11	65:35	1.5	447	2.22	23.18
X96567	12	65:35	2.0	3.64	2.17	22.60

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Ejemplo 2

LSU Agricultural Center Horse Farm y todas eran del tipo de caballo liviano, principalmente Quarter Horses, Thoroughbreds y Árabes. Todas las yeguas estaban en buena condición corporal y fueron mantenidas sobre pastura de pastos de verano nativos (predominantemente hierba bermuda). La mayoría de las yeguas en la manada no fueron criadas en la estación anterior, mientras que seis habían parido al cabo de 30 días y estaban lactando. Las yeguas fueron colocadas en un régimen diario de detección de estro comenzando el 1 de junio, y a todas se les practicó un examen general de salud y reproductivo profundo, durante junio. Sólo yeguas con buena salud, conformaciones vulvares y vaginales satisfactorias y conformaciones aparentemente normales uterinas y ováricas, fueron colocadas en un conjunto de candidatas potenciales para el tratamiento. La mayoría de las yeguas tenían entre 11 y 14 años de edad (rango: 8 a 22 años) y pesaban de 400 a 650 kg.

En este estudio, se prepararon tres formulaciones experimentales pesando y mezclando SAIB (SABER, SBS Inc., Birmingham, AL), e añadieron solvente de dilución y Deslorelina para dar una concentración final de 2.1 mg/ml. Las composiciones SAIB:solvente diluyente fueron SAIB:DMSO 75:25 p/p en la Formulación 1 (véase Ejemplo 1A); 85:15 p/p SAIB:Etanol en la Formulación 2 (véase Ejemplo 1B); y 75:25 p/p SAIB:Etanol en la Formulación 3 (véase Ejemplo 1C); las Formulaciones experimentales resultantes fueron hidrófobas de baja viscosidad después de la inyección i.m. cuando el solvente se difundió, dejando tras de sí una matriz SAIB-DA que liberaba la DA por difusión a través del SAIB de alta viscosidad, acompañada por degradación del SAIB a sacarosa y sus correspondientes ácidos alifáticos a partir de los cuales había sido preparado el éster de sacarosa. Además, se preparó un control negativo (1 mL de .9% NaCl USP, inyectado vía i.m.). A medida que las yeguas entraban a estro después del 1 de julio, sus ovarios fueron evaluados diariamente por ultrasonografía transrectal para establecer los tamaños foliculares y apariencia uterina. Una vez que una yegua satisface los dos criterios siguientes, se le asignó al tratamiento con base en una distribución aleatoria predeterminada: 1) tenía que estar en estro, y 2) tenía que tener un folículo de al menos 30 mm de diámetro, pero no más de 40 mm de diámetro. Las evaluaciones con ultrasonido fueron efectuadas cada mañana, y las yeguas fueron tratadas normalmente antes del medio día. Para evitar cualquier posible desviación en los datos, el personal que administraba los tratamientos era diferente del que establecía las características foliculares y del estro y los sitios de inyección. Además, las tres formulaciones SABER fueron codificadas por color y su contenido real era desconocido para todo el personal de la granja.

Una vez que una yegua hubo sido tratada, sus ovarios fueron vigilados por ultrasonografía cada 12 horas hasta que ovuló. Se registraron los tamaños de los folículos medibles, y la ovulación se determinó mediante diversos cambios en tamaño, suavidad y la apariencia del folículo dominante según lo describe en detalle por Ginther (Ginther, O.J. Ultrasonic Imaging and Reproductive Events in the Mare Equiservices Cross Plains, WI 1986). Además, se recolectaron muestras de sangre a 24 h antes del tratamiento (-24 h); inmediatamente antes del tratamiento (tiempo 0); a 1, 3, 6, 12, 24, 36, y 48 h después del tratamiento, y luego cada 24 h hasta 24 h después de la ovulación para medición de las concentraciones de la progesterona y(o) hormona luteinizante (LH). Estas muestras de sangre fueron extraídas a través de venipunción yugular en tubos heparinizados al vacío, y los tubos fueron colocados a 5ºC hasta que se recolectó el plasma por centrifugación. La progesterona fue medida por radioinmunoensayo con reactivos comercialmente disponibles (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.,Webster, TX) y la LH fue medida por radioinmunoensayo según lo describe Thompson et al. 1983. J. Anim. Sci. 56:678-686.

Cada día despues del tratamiento de 7 días, el sitio de inyección de cada yegua fue supervisado en cuanto a tres características:

1) hinchamiento, el cual fue calificado como 0= ninguno, 1= ligero (1 cm de diámetro o menos), 2= ligero (1 a 2.5 cm de diámetro), y 3= significativo (mayor de 3 cm de diámetro); 2) sensibilidad al toque, la cual fue calificada como sí o no; y 3) elevación de la Temp. de la piel, la cual también fue calificada como sí o no. Las concentraciones de deslorelina fueron determinadas en las muestras de sangre recolectadas a -24, 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 h con respecto al tratamiento. Inmediatamente después de que la muestra fue retirada de la vena yugular, se removió una alícuota de 1 ml y se añadió a 4 ml de acetona en un tubo de vidrio desechable de 12 x 75. La mezcla fue invertida varias veces y tapada para su almacenamiento a -15ºC. En fecha posterior, los extractos fueron centrifugados y decantados en un segundo tubo. La acetona fue secada entonces bajo una corriente de aire, y la solución acuosa residual fue rediluida hasta 1.0 ml con regulador de prueba. La deslorelina fue medida en los extractos por radioinmunoensayo, usando un antisuero anti.GnRH (Rabb et al., 1990. J. Anim. Sci. 68:3322-3329) y Deslorelina radioyodada. La Deslorelina fue radioyodada por el método de la cloramina-T y aislada por cromatografía sobre QAE-Sephadex como lo describe para el GnRH Nett et al., Endocrinology 101:1135 (1977). Puesto que el GnRH endógeno no está presente en cantidades suficientes en la sangre yugular para ser detectado, se asumió que cualquier inmunorreactividad en las muestras se debía a la Deslorelina y no a la GnRH.

Durante el curso del experimento, una yegua exhibió un periodo inusualmente largo y no ovuló hasta 216 h después del tratamiento. Puesto que su respuesta fue tan diferente de las de las demás yeguas, su tiempo de ovulación fue comparado con el de las demás yeguas que recibían deslorelina y se encontró que estaba separado 3.82 desviaciones estándar de cualquier promedio (P<.Ol). Así, los datos de esta yegua fueron removidos de todos los análisis y una yegua adicional fue tratada con la formulación de liberación lenta /véase ejemplo 1A) para tomar su
lugar.

Los datos para puntos de tiempo sencillos fueron analizados por análisis de varianza de una sola vía usando el procedimiento de Modelos Lineales Generales de SAS. 1988. SAS/STAT® User's Guide (Release 6.03). SAS Inst. Inc., Cary, NC. Para cada variable, la comparación entre las yeguas tratadas con solución salina y todas las yeguas que recibieron deslorelina fue incluida en el análisis, así como comparaciones individuales entre cada grupo que recibía deslorelina y el grupo de la solución salina; estas comparaciones estuvieron basadas en el valor LSD calculado a partir de la variancia del error de conjunto. Para el porcentaje de yeguas que ovalaban dentro de las primeras 48 horas, las yeguas fueron calificadas bien con 1 (sí) ó 0 (no) y se llevó a cabo un análisis de variancia de una sola vía sobre dichos datos en vez de usar el método de cuadrados de Chi. Los datos de muestreos repetidos (por ejemplo, concentraciones de LH) fueron analizados por análisis de punto dividido de la variancia en el cual el efecto del tratamiento fue probado con el caballo (tratamiento), y el tratamiento por interacción de tiempo fue probado con la variancia de error residual. Las áreas netas bajo las curvas de respuesta también fueron calculadas para concentraciones de Deslorelina de 0 a 24 horas después del tratamiento, y para concentraciones de LH de 0 a 48 horas después del tratamiento, estas áreas fueron analizadas por análisis de una vía de la variancia según se describió más
arriba.

La ovulación fue confirmada por ultrasonido (US) y niveles elevados de progesterona (P4). Los puntos finales estudiados incluían horas para ovulación, porcentaje (%) de yeguas en ovulación en las 48 h y niveles de LH, P4 y DA medidos por RIA. Además, las calificaciones de hinchamiento en los sitios de inyección (0 a 3; 0= ninguno, 1 = ligero, 2 = moderado, 3 = significativo), sensibilidad en el sitio de inyección (Sí/No) y elevación de la temperatura en el sitio de la inyección /Sí/No) también fueron estudiados.

Los resultados mostraron que las concentraciones en plasma de DA (Deslorelina acetato) se incrementaron significativamente después del tratamiento en todas las tres formulaciones de SAIB con niveles pico de de 1902 a 1699 pg/ml. El área bajo la curva de repuesta (AUC) para las primeras 24 horas después de la inyección también confirmó un significativo incremento en las yeguas tratadas con SAIB en comparación con los controles tratados con solución salina (Véase Tabla II).

En la Tabla II, se detectó u significativo aumento en el % de yeguas que ovulaban dentro de las 48 h (cuando se comparaban con las de solución salina), en yeguas que recibieron las formulaciones 2 y 3.

TABLA II

Eficacia de las yeguas \amp{1} Datos Hormonales
	Horas para la
	ovulación	Ovulación	DA AUC
	(US)	(P_{4})	por 48 h	las 24 h
Controles salinos	102	99	0%	148.68
Formulación 1	81	72	50%	4983.20^{1}
(ejemplo 1a)
Formulación 2 (1B)	69	51^{2}	75^{2}%	6026.19^{1}
Formulación 3 (1C)	48^{3}	48^{1}	100^{1}%	6037.52^{1}

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Seguridad - Datos de sitios de inyección (IS)
	Calificación de hinchamiento	Sensibilidad	Elevación de
	0-3 en días	en 1S	Temp. en
	1	3	5	7	(%)	IS (%)
Controles salinos	0	0	0	0	0%	0%
Formulación	.25	0	0	0	0%	0%
(ejemplo 1A)
Formulación 2 (1B)	.5	.25	.25	0	0%	0%
Formulación 3(1C)	.5	0	0	0	0%	0%
			(P<.01)^{1}: (P<.05)^{2}:
			(P<.07)^{3}

No hubo efecto del tratamiento (P0467) ni interacción alguna con el tiempo (P=817) para calificaciones de hinchamiento en el sitio de inyección, ni hubo ninguna sensibilidad o elevación de la temperatura de la piel en el sitio de la inyección proteasa cualquiera de los tratamientos.

AUC para LH en las primeras 48 h, indicaron que las yeguas que recibieron la Formulación 3 (P=.01) y la Formulación 2 (P=.1) se incrementaron en comparación con las yeguas tratadas con solución salina. Además, la concentración de LH en el plasma se incrementaron inmediatamente (P<.0003) en todos los tratamientos excepto con la solución salina, con pico a las 6 horas después de la inyección y permaneció elevada a lo largo de las 36 a 48 horas después del tratamiento como se muestra en la Figura 1.

Los resultados demuestran que las Formulaciones 2 y 3 liberaron efectivamente Deslorelina que estimulaban niveles ovulatorios de LH y dispararon la ovulación en yeguas con 7 de 8 yeguas en 48 horas después del tratamiento. Además, los datos indican que 3 formulaciones SAIB exhibían excelente biocompatibilidad a juzgar que por las mínimas reacciones en el sito de inyección fueron similares a las de los controles.

Ejemplo 3

Se usaron noventa yeguas cíclicas de diversas razas de caballos ligeros, de 3 a 16 años de edad y con pesos entre 400 a 650 kg. Las yeguas fueron asignadas aleatoriamente a uno de 9 grupos de color ciegos (n=10/grupo) para evitar desviaciones en la interpretación. Los tratamientos fueron 2 grupos de formulación experimentales que contenían: 0.5, 1.0, 1.5 ó 2.0 mg de Deslorelina acetato (DA) diseñados para liberar DA a diferentes ratas por aproximadamente 12 a 36 horas (h) después de una inyección intramuscular (i.m.) de 1 ml usando una aguja calibre 21; y un control negativo consistente de SAIB que no contenía fármaco también fue administrado en forma de una inyección i.m. de 1 ml.

Se prepararon formulaciones experimentales pesando y mezclando SAIB (SABER, SBS Inc., Birmingham, AL), solvente de dilución y DA añadidos para dar la concentración final apropiada de las composiciones 0.5, 1.0, 1.5 ó 2.0 mg/ml. SAIB: solvente de dilución fueron: 75:25 p/p SAIB:Etanol en la Formulaciones 4-8 (Véase ejemplo 1D) y 65:35 p/p en SAIB:Etanol en las Formulaciones 9-12 (véase ejemplo 1E).

Los ovarios de yeguas en estro fueron examinados diariamente por ultrasonido (US) y tratadas una vez se detectó un folículo entre 30 mm y 40 mm. Después de ello, los ovarios de las yeguas fueron examinados cada 24 horas hasta la ovulación la cual fue confirmada por US.

Las dos principales variables de eficacia en el estudio fueron (a) intervalo en horas desde el tratamiento hasta la ovulación, y (b) el porcentaje de yeguas que ovulan dentro de las 48 horas siguientes al tratamiento. El primero fue analizado estadísticamente usando del modelo de regresión SAS® de Cox (riesgos proporcionales). El último fue analizado estadísticamente usando regresión logística investigando los efectos de la formulación y la dosis. Las principales variables de seguridad en el estudio fueron (a) signos visibles de calificaciones de hinchamiento (b) sensibilidad al toque, y (c)elevación de la temperatura de la piel en el sitio de la inyección. Estas variable fueron analizadas estadísticamente por análisis de mediciones repetidas para datos de categorías usando SAS PROC CATMOD, sin embargo, no habiendo detectado hinchamiento, sensibilidad o elevación de temperatura, no se ejecutó el análisis.

Los datos de ovulación se presentan en la Tabla III. Usando el modelo de Cox (lineal) en dosis para ambos grupos de formulaciones, el coeficiente para la formulación 75:25 SAIB/Etanol fue altamente significativo (p<0.01 usando una prueba de dos lados), pero el coeficiente para las formulaciones 65:35 SAIB/Etanol no fueron significativas indicando la superioridad de las formulaciones 75:25 SAIB/Etanol (véase ejemplo 1C).

Usando el modelo logístico (lineal) en dosis para ambas formulaciones, el efecto de las formulaciones 75:25 SAIB/etanol fue también altamente significativo (p,0.01 usando una prueba de dos lados). Además, la pendiente de las formulaciones 75:25 fue significativamente mayor que la de las formulaciones 65:35 (\beta) (p=0.026) indicando la superioridad de las formulaciones 75:25.

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TABLA III

Datos de ovulación en yeguas
Formulación de control SAIB
Tratamientos	Horas para ovulación	Yeguas ovulando 48 horas (%)
Control negativo (0 mg)	112.8	20% (34%;37%)
Formulación 75:25 SAIB/Etanol
Tratamientos	Horas para Ovulación	Yeguas en ovulación en 48 h (%)
Ejemplo 1D
Formulación 4 (0.5 mg)	88.8	30% (54%; 52%)
Formulación 5 (1.0 mg)	50.4	90% (74%; 70%)
Formulación 6 (1.5 mg)	55.2	80% (90%; 84%)
Formulación 7 (2.0 mg)	50	4 90% (98%; 92%)
Formulación 65:35 SAIB/Etanol
Tratamientos	Horas para ovulación	Yeguas en ovulación 48 h (%)
Ejemplo 1E
Formulación 9 (0.5 mg)	60	70%* (38%; 41%)
Formulación 10 (1.0 mg)	74.4	50%* (40%; 48%)
Formulación 11 (1.5 mg)	110.4	50%* (42%; 56%)
Formulación 12 (2.0 mg)	79.2	60%* (54; 44%)
* \begin{minipage}[t]{155mm} % Real (El modelo lineal de riesgos proporcionales de Cox predice el %; % predicho por modelo logístico) a (p<0.01) \end{minipage}

Los términos cuadráticos no fueron significativos para el análisis indicando que los modelos lineales usados proveían una representación suficiente para todos los nueve grupos. El porcentaje predicho de yeguas que ovalaban dentro de las 48 horas usando ambos tipos de análisis se presentan en la Tabla III en paréntesis junto a los datos reales observados.

Las principales variables de seguridad en el estudio fueron signos visibles de hinchamiento, sensibilidad al toque y elevación de la temperatura de la piel en el sitio de inyección, todos los cuales fueron indetectables en las 90 yeguas estudiadas. La ausencia de cualquier hinchamiento, sensibilidad o elevación de la temperatura de la piel observados en el sitio de la inyección en cualquiera de los tratamientos sugiere fuertemente una excelente biocompatibilidad de la presente formulación de SAIB cuando se produce usando esterilización por filtración y se administra usando agujas menores de calibre 21 (Véase Tabla IV).

Este estudio claramente demostró la superioridad de la formulación 75:25 SAIB/etanol en comparación con la formulación 65:35 SAIB/etanol para la ovulación en avance. Además, el riesgo proporcional de Cox y el modelado logístico predijo una rata de respuesta positiva para estimular la ovulación en 48 horas de más del 70% para la dosis de 1 mh, 80% para la dosis de 1.5 mg y más de 90% para la dosis de 2 mg de DA, indicando que tales tratamientos efectivamente estimulan los niveles ovulatorios de LH y disparan la ovulación en la yegua. Finalmente, los datos de seguridad indican que todas las nueve formulaciones de SAIB exhibían excelente biocompatibilidad a juzgar por las reacciones no detectables en el sitio de inyección.

Claims

1. Una composición para la liberación controlada de GnRH o análogos del mismo en yeguas para inducir la ovulación, que comprende:

a) un material transportador líquido no soluble en agua, no polimérico que tiene una viscosidad de al menos 5000 cP a 37ºC que no cristaliza no diluido en condiciones ambientales o fisiológicas;

b) GnRH o análogos, o combinaciones de los mismos.

2. La composición de la reivindicación 1, donde el material transportador líquido no soluble en agua está presente en una cantidad desde 99.5 por ciento hasta 10 por ciento en peso, o preferiblemente 95 por ciento a 25 por ciento en peso, con respecto al peso total de la composición.

3. La composición de las reivindicaciones 1 y 2, donde el material transportador líquido no soluble en agua es acetate isobutirato de sacarosa.

4. La composición de las reivindicaciones 1 a 3 donde el análogo es seleccionado de entre deslorelina, avorelina, leuprolida y LHRH natural.

5. La composición de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente un solvente en el cual el transportador líquido no soluble en agua es soluble.

6. La composición de la reivindicación 5, donde el solvente es seleccionado del grupo consistente de etanol, dimetilsulfóxido, etil lactato, etilacetato, bencil alcohol, triacetina, N-metilpirrolidona, propilen carbonato y glicofurol.

7. La composición de la reivindicación 5 ó 6, donde el solvente está presente en una cantidad desde 10 por ciento a 50 por ciento en peso, con respecto al peso de la composición.

8. Una composición líquida para la liberación controlada de GnRH o análogos del mismo en yeguas para inducir la ovulación, como se definió en las reivindicaciones 1-7, que comprende acetato isobutirato de sacarosa y etanol en una relación en peso de entre 75:25 y 60:40, y GnRH o análogos de los mismos o combinación de los mismos en una concentración de entre 0.1 a 5.0 mg/ml de composición líquida, preferiblemente 1.0 a 2.5 mg/ml de composición líquida, para proveer una dosis de entre 0.3 mg y aproximadamente 10 mg del GnRH o análogo del mismo o combinación de los mismos.

9. La composición líquida según se reivindica en la reivindicación 8 donde el análogo de GnRH es deslorelina.

10. Una composición líquida esterilizada por filtración para la liberación controlada de deslorelina en yeguas para inducir ovulación, según se definió en las reivindicaciones 1-7, que comprende acetato isobutirato de sacarosa y etanol en una relación en peso de 75:25 y deslorelina en una concentración de entre 0.1 y aproximadamente 5.0 mg/ml de composición líquida, pref. de 1.0 y 2.5 mg/ml de composición líquida para liberar una dosis de entre aproximadamente 1 mh y 2 mg de deslorelina, siendo administrable dicha composición por inyección.

11. Una emulsión que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

12. Una solución que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.