ES2255179T3

ES2255179T3 - Generacion de celulas hematopoyeticas a partir de celulas madre neurales multipotentes.

Info

Publication number: ES2255179T3
Application number: ES98944943T
Authority: ES
Inventors: Christopher R. Bjornson; Rod L. Rietze; Brent A. Reynolds; Angelo L. Vescovi
Original assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Current assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-09-28
Also published as: NO324708B1; DK1019493T3; US6093531A; CA2304007A1; DE69832402T2; JP2001518289A; WO1999016863A1; NO20001509D0; NO20001509L; US20030148515A1; US7204979B2; ATE310077T1; EP1019493B1; US6897060B1; EP1019493A1; AU9249598A; DE69832402D1

Abstract

Utilización de progenie de células madre neurales multipotentes de mamífero para la preparación de una composición farmacéutica para la generación de células hematopoyéticas, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se destina a la administración al sistema circulatorio de un mamífero.

Description

Generación de células hematopoyéticas a partir de células madre neurales multipotentes.

Solicitudes prioritarias

Se reivindica prioridad a la solicitud US No. 09/100.679 presentada el 19 de junio de 1998 y a la solicitud provisional de patente US No. 60/060.289, presentada el 29 de septiembre de 1997.

Campo de la invención

El campo de la invención se refiere a la utilización de composiciones derivadas de células madre neurales para la reparación, reconstitución o incremento del sistema hematopoyético de un mamífero.

Antecedentes de la invención

Se han utilizado células madre hematopoyéticas y su progenie a través de trasplantes de médula ósea para reconstituir el sistema hematopoyético en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos relacionados con la sangre, tales como la anemia aplásica, las deficiencias inmunológicas y algunas formas de cáncer, entre ellas los linfomas y las leucemias (ver la revisión de Lu et al ., Critical Rev. Oncol./Hematol. 22:61-78, 1996). El trasplante de médula ósea con más frecuencia se utiliza en un intento de restaurar la función hematopoyética tras la exposición a agentes mieloablativos, por ejemplo tras terapia de radiación o quimioterapia en el tratamiento de una diversidad de cánceres. Estas terapias, además de destruir el cáncer, también pueden resultar en la mielosupresión o la mieloablación que, a su vez, puede conducir a infección, a trastornos hemorrágicos y a otras complicaciones. Las últimas estimaciones sugieren que la necesidad de trasplante de células madre hematopoyéticas derivadas de médula ósea crece a un ritmo del 20% al año y que el mercado para el producto supone aproximadamente 500 millones de dólares al año (Strickland, D., Bioworld Today 8(14):1).

Por desgracia para los pacientes, la utilización del trasplante de médula ósea como terapia se encuentra muy restringida. Existen varias desventajas que son inherentes a la utilización de las células hematopoyéticas como fuente de células en el tratamiento de los trastornos y enfermedades relacionados con la sangre. El éxito de un trasplante alogénico habitualmente depende de si se encuentra un donante que sea histocompatible con el receptor y esté dispuesto a someterse al doloroso y largo proceso de donación de la médula ósea. La incompatibilidad genética puede conducir a dos complicaciones frecuentes y potencialmente letales. En primer lugar, para reducir la probabilidad de la reacción de huésped contra injerto, se compromete el sistema inmunológico del paciente mediante la utilización de fármacos inmunosupresores, dejando al paciente en un estado altamente susceptible a la infección. En segundo lugar, tras establecerse las células medulares trasplantadas, en ocasiones atacan al paciente en una reacción de injerto contra huésped. En combinación, estos dos factores constituyen las causas principales de mortalidad y morbilidad de los pacientes de trasplante no autólogo de médula ósea.

Como alternativa al trasplante alogénico, en ocasiones puede recolectarse médula ósea del propio paciente y almacenarse para su posterior utilización, suponiendo que el paciente esté lo suficientemente sano para resistir el procedimiento, y que la médula resulte útil. Aunque la utilización de este sistema autólogo generalmente evita el riesgo de una falta de correspondencia genética, siguen existiendo riesgos graves derivados de una posible contaminación no detectada con células malignas. Todavía no se ha conseguido detectar y eliminar de manera fiable las células medulares transformadas. Una desventaja adicional de este enfoque es que únicamente puede recolectarse de un individuo una cantidad limitada de células de médula ósea capaces de reconstituir por completo el sistema hematopoyético.

Se han hecho muchos esfuerzos para establecer sistemas de cultivo ex vivo de células madre hematopoyéticas progenitoras con el fin de generar un número suficiente de células con fines de trasplante. Sin embargo, la obtención de cantidades suficientes de células madre hematopoyéticas, sea a través de biopsia de médula ósea o de otras fuentes, constituye una limitación a la utilización de este tejido para terapias relacionadas con el sistema hematopoyético. Los sistemas actuales requieren complejas condiciones de cultivo y tediosas etapas de separación de las células y únicamente resultan en una expansión limitada del número de células madre hematopoyéticas. Ver, por ejemplo, la patente US nº 5.646.043 de Emerson et al. La mayor desventaja es la incapacidad para cultivar secuencialmente las células madre in vitro bajo condiciones definidas de cultivo durante un periodo prolongado de tiempo, con el fin de expandir el número de células funcionales disponibles para el trasplante (Amos y Gordon, supra; Lu et al., supra). En consecuencia, existe una necesidad continuada de recolectar repetidamente células madre autólogas o de reclutar donantes compatibles para terapias que impliquen la reconstitución del sistema hematopoyético.

Debido a las complicaciones indicadas anteriormente, se han buscado otras fuentes de células madre para la reconstitución hematopoyética. Se ha informado de estudios sobre la utilización de células de hígado fetal, células de bazo neonatal o células del timo (Amos y Gordon, supra; Lu et al., supra). Sin embargo, los problemas éticos relacionados con la utilización de estos tipos celulares hace que su utilización comercial resulte menos atractiva. La posibilidad de recolectar y criopreservar sangre del cordón se está estudiando en la actualidad, y podría proporcionar un medio más aceptable de obtener células para su futura utilización (Broxmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3828, 1989). Sin embargo, hasta la fecha las células derivadas de la sangre del cordón sólo han demostrado ser capaces de repoblar con éxito el sistema hematopoyético infantil (Amos y Gordon, supra). La reciente identificación de células progenitoras de sangre periférica (PBPC) con la capacidad para repoblar la médula ha abierto líneas de investigación acerca de la utilización de las PBPC en trasplantes (para una revisión ver Lu et al., supra). La recolección de estas células sustituiría potencialmente la necesidad de trasplantes de médula ósea. Sin embargo, varias desventajas resultan evidentes en este sistema: 1) la sangre recolectada puede encontrarse contaminada, 2) la incidencia de enfermedad de injerto contra huésped todavía es muy elevada, 3) se requieren muchas leucaféresis para recoger suficientes células madre circulantes para una reconstitución hematopoyética completa, y 4) las células madre recolectadas no pueden mantenerse en un estado no diferenciado durante periodos prolongados de tiempo.

Resulta evidente a partir de lo anteriormente expuesto que se requieren alternativas a los procedimientos actuales para la reconstitución del sistema hematopoyético de un paciente.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la invención proporcionar composiciones que contengan células precursoras que puedan obtenerse y utilizarse fácilmente para la generación de células hematopoyéticas para la utilización en trasplantes xenogénicos, alogénicos o autólogos. También es un objetivo de la invención proporcionar composiciones que puedan prepararse utilizando células autólogas que puedan trasplantarse en un paciente durante o después de la terapia mieloablativa para el tratamiento de trastornos relacionados con la sangre, tales como los linfomas y las leucemias, la anemia de células falciformes, la osteopetrosis y otras, evitando de esta manera el riesgo de trasplantar células enfermas o cancerosas y resolviendo los problemas de la técnica anterior de rechazos de trasplante.

La presente invención alcanza estos objetivos proporcionando composiciones que contienen progenie de células madre neurales multipotentes que pueden utilizarse para generar células hematopoyéticas. De esta manera, la invención proporciona una nueva utilización médica de la progenie de células madre neurales multipotentes para la preparación de composiciones para incrementar, tratar o alterar el sistema hematopoyético de un paciente. Un procedimiento para generar células hematopoyéticas a partir de progenie de células madre neurales multipotentes de mamífero comprende introducir la progenie de células madre neurales multipotentes en un ambiente, tal como en el sistema circulatorio de un paciente, que induzca la progenie de células madre neurales multipotente a producir células hematopoyéticas. El procedimiento puede utilizarse para tratar un paciente que se está sometiendo o que ha sido sometido a terapia mieloablativa, tal como terapia de radiación, quimioterapia o una combinación de ambas, y en el que de esta manera se han suprimido o se han reducido las células madre hematopoyéticas endógenas. El procedimiento también puede utilizarse para tratar un paciente que posee un defecto genético que afecta a las células hematopoyéticas, mediante el trasplante de progenie de células madre neurales multipotentes obtenidas de un donante que posee células hematopoyéticas normales o mediante la administración de células genéticamente modificadas que pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas para el paciente. Además, el procedimiento puede utilizarse para tratar pacientes normales con el fin de proporcionarles un sistema hematopoyético superior al normal o para proporcionarles un sistema hematopoyético con características o funcionalidades adicionales en comparación con el estado normal.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: visualización directa mediante microscopía de fluorescencia de progenie de células madre neurales (NSC) multipotentes injertadas. Se prepararon extensiones sobre cubreobjetos con citocentrífuga de suspensiones de células de bazo procedentes de ratones de control, de ratones ROSA26 no irradiados y de ratones Balb/c (filas 1 a 3), así como de ratones receptores irradiados (filas 4 a 6). Las células se marcaron doblemente para H-2K_{b} (rojo) y para uno de los marcadores fenotípicos hematopoyéticos (verde). Las células doblemente marcadas presentaban un color amarillo y se observan en la figura 1 como células de color gris oscuro o negro. Las células doblemente marcadas se encontraban ausentes en los bazos de ratones Balb/c no irradiados (fila 1) y en los bazos de animales de control inyectados con EBSS (fila 2). Se encontraron abundantes células doblemente marcadas en los animales de control ROSA26 no irradiados (fila 3), así como en los animales inyectados con médula ósea de ratones ROSA (fila 4) o con NSC embrionarias (fila 5) o con NSC adultas (fila 6). Estos resultados demuestran que la progenie de células madre neurales multipotentes presenta la capacidad de repoblar el sistema hematopoyético comprometido (magnificación: 630X).

Figuras 2A a 2F: los ensayos clonogénicos in vitro de médula ósea derivada de animales que recibieron células madre neurales embrionarias o adultas identificaron la injertación de células madre neurales en la médula. Se utilizó histoquímica X-Gal para identificar los clones originados en células madre neurales. Un gran número de clones formados a partir de células embrionarias (A=mag. de 50X; B=mag. de 200X) o adultas (C=mag. de 50X; D=mag. de 200X) adquirieron un color azul al exponerlas a X-Gal durante 8 horas y se observan como clones de color gris oscuro o negro en las figuras 2A-2F. En la médula de ratones tanto embrionarios (E) como adultos (F) se observan varios clones que no adquirieron un color azul al exponerlas a X-Gal, indicando un nivel bajo de tipos celulares hematopoyéticos endógenos tempranos. En las figuras 2E y 2F, los clones más pequeños marcados con flechas no adquirieron el color azul al exponerlas a X-Gal. Las barras de escala indican 100 \mum (A, C, E y F) y 40 \mum (B y D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento significativo de que las células madre neurales multipotentes (MNSCs) que pueden expandirse in vitro, tal como se describe en la patente WO No. 93/01275 y en la patente US No. 5.750.376, son capaces de generar progenie hematopoyética.

Cuando una MNSC se divide, da lugar a una MNSC hija, y de esta manera presenta la capacidad de automantenimiento. También puede dar lugar a una célula progenitora, que es una célula no diferenciada destinada a dar lugar a una ruta de diferenciación particular. Por ejemplo, una célula progenitora neuronal puede dividirse un número limitado de veces; diferenciándose seguidamente la progenie resultante en neuronas. Las células progenitoras habitualmente son capaces de únicamente un número finito de divisiones celulares previamente a la diferenciación y, de esta manera, al contrario que las células madre, no presentan la capacidad de automantenimiento. La progenie no diferenciada de MNSCs, denominada en la presente memoria "células precursoras", incluye MNSCs hijas y células progenitoras predestinadas. El término "célula madre neural multipotente" ("MNSC") se refiere a una célula que es capaz de autorenovación extensiva, es decir, es capaz de sustituirse a sí misma durante la división celular a lo largo de un periodo prolongado de tiempo, y es capaz de generar todos los tipos celulares principales del tejido en el que se encuentra situado (es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos). Mediante la utilización de los procedimientos de cultivo descritos en la patente US No. 5.750.376, pueden inducirse la proliferación in vivo de las MNSCs en un medio de cultivo definido que contiene factor de crecimiento. La progenie de cada MNSC puede diferenciarse para generar astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Los MNSCs pueden expandirse continuamente en cultivo, generando grandes números de progenie sin la necesidad de transformar las células con oncogenes o de obtener las células a partir de tejido tumorigénico. Ello hace que las células sean particularmente deseables para las aplicaciones terapéuticas. La progenie de MNSC puede almacenarse hasta que se requiera utilizando técnicas criogénicas u otros procedimientos conocidos de la técnica.

El término "célula hematopoyética" se refiere a cualquier tipo de célula del sistema hematopoyético, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, las células no diferenciadas, tales como las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras, y células diferenciadas, tales como megacariocitos, eritrocitos, leucocitos, granulocitos, monocitos, linfocitos y células asesinas naturales.

Cuando se introducen en los ambientes apropiados, tales como los descritos en la presente memoria, puede inducirse que las MNSCs proliferen y generen progenie que se diferencia formando células del sistema hematopoyético. Al hacer referencia en la presente memoria al ambiente en el que se introduce la progenie de MNSC, se utiliza el significado habitual del término "ambiente". De esta manera, el término se refiere a la combinación de condiciones físicas externas o extrínsecas que afectan e influyen sobre el crecimiento y desarrollo de células madre neurales multipotentes y/o su progenie. El ambiente puede ser ex vivo o in vivo. La progenie de MNSC no diferenciada, al trasplantarse en el sistema circulatorio de un mamífero mieloablacionado utilizando las mismas técnicas de trasplante conocidas en la técnica para el trasplante de médula ósea y de células madre hematopoyéticas, regenera un complemento completo de las diversas células sanguíneas y restaura el sistema hematopoyético del mamífero. De esta manera, un sistema circulatorio de mamífero es un ejemplo de un ambiente in vivo que induce a las MNSCs a generar células del sistema hematopoyético.

El trasplante de progenie de MNSC no diferenciada presenta varias ventajas sobre el trasplante de médula ósea o el cultivo de células madre hematopoyéticas. Una ventaja es que, cuando se trasplantan células precursoras neurales no diferenciadas, se reduce sustancialmente el riesgo de enfermedad de injerto contra huésped debido a que no se transplantan las células linfoides. Además, se cree que las MNSCs presentan niveles reducidos o la ausencia completa de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) sobre su superficie. Las moléculas de MHC se ha descubierto que se encuentran ausentes de la superficie de las MNSC de ratón, y también pueden encontrarse ausentes de la superficie de las MNSCs de otras especies (ver Motluk, A., New Scientist, página 40, 1998). En el caso del trasplante autólogo, otra ventaja de utilizar la progenie de MNSC para repoblar el sistema hematopoyético de un paciente es que, durante o después de la quimioterapia o de la terapia de radiación para el tratamiento de leucemias y de otros trastornos relacionados con la sangre, se elimina el riesgo de reintroducir células malignas o hematopoyéticas enfermas.

Otra ventaja de la utilización de progenie de MNSC es que pueden utilizarse condiciones de cultivo definidas, que ya se han descrito en la literatura, para inducir la proliferación de MNSCs para generar fácilmente un gran número de progenie de MNSC a partir de una cantidad pequeña de tejido inicial.

Puede utilizarse cualquier tejido que contenga MNSCs. En la actualidad se prefiere la utilización de tejido neural procedente de cualquier tejido neural que contenga MNSCs, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el córtex cerebral, el lóbulo frontal, el cuerno medular, el hipotálamo, el cerebelo, el cerebro medio, el bulbo raquídeo, la médula espinal, el líquido cerebroespinal, y el tejido que rodea a los ventrículos del sistema nervioso central (SNC). Para los fines de trasplante autólogo, estos tejidos pueden obtenerse mediante biopsia.

Las MNSCs pueden expandirse continuamente in vitro y cultivarse para generar un gran número de células con fines de trasplante utilizando procedimientos ya conocidos de la técnica. En comparación, los procedimientos anteriores para la generación in vitro de células madre hematopoyéticas con frecuencia requieren complejas condiciones de cultivo y tediosas etapas de separación celular, y resultan únicamente en una expansión limitada del número de células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, tanto la patente US No. 5.646.043 como la patente US No. 5.612.211 proporcionan procedimientos para un grado limitado de renovación in vitro de las células madre hematopoyéticas.

Se dan a conocer en la patente US No. 5.750.376 procedimientos adecuados para obtener y expandir MNSCs en cultivo con el fin de obtener poblaciones enriquecidas de células madre neurales multipotentes, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "población enriquecida de células madre neurales multipotentes" se refiere a una población de células que contiene un porcentaje más elevado de MNSCs que el presente en el tejido del que se originaron las MNSCs. Típicamente menos de aproximadamente 0,1% de las células obtenidas del tejido neural de mamífero son MNSCs. Por lo tanto, una población enriquecida de MNSCs que contiene aproximadamente 1% de MNSCs típicamente contiene por lo menos 10 veces más MNSCs que las presentes en el tejido neural del que se derivan las MNSCs. Los cultivos secundarios y posteriores de MNSC preparados de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en la patente US No. 5.750.376 generalmente proporcionan poblaciones adecuadamente enriquecidas de MNSCs. Para la utilización en la repoblación del sistema hematopoyético de un paciente, la población enriquecida de MNSCs preferentemente comprende por lo menos 1% de MNSCs. Más preferentemente, por lo menos aproximadamente 5% de las células será MNSC. Todavía más preferente es la utilización de una población enriquecida de MNSCs que comprenda por lo menos 10% de MNSCs. Resulta posible obtener poblaciones enriquecidas de MNSCs que comprende por lo menos aproximadamente 20% de MNSCs. La utilización de poblaciones altamente enriquecidas en MNSCs que contienen por lo menos 15%, o en algunos casos 20%, de MNSCs puede resultar deseable en el aspecto de que puede reducir el número total de células necesario para el trasplante.

El porcentaje de MNSCs presente en un cultivo puede estimarse cultivando un número conocido de células desde el cultivo hasta un medio de cultivo fresco que contenga uno o más factores de crecimiento que induzcan la proliferación de las células madre neurales multipotentes, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento fibroblástico (FGF). El porcentaje de células que forma neuroesferas indica el porcentaje aproximado de células madre presentes en el cultivo. El término "neuroesfera" se refiere a una agrupación de células precursoras que se forma cuando se induce la proliferación de una MNSC in vitro. Una neuroesfera comprende la progenie de una sola MNSC, incluyendo MNSCs hijas y células progenitoras no diferenciadas. La patente US No. 5.750.376 describe las neuroesferas en detalle y proporciona fotografías de las mismas. Las técnicas de separación de células pueden utilizarse para enriquecer en MNSCs los cultivos, mediante la separación de las células progenitoras predestinadas de las MNSCs.

La progenie de MNSC no diferencia puede introducirse en un "ambiente inductor de células hematopoyéticas", que induzca la diferenciación en células hematopoyéticas. El término "ambiente inductor de células hematopoyéticas" incluye cualquier condición o tratamiento de cultivo ex vivo, o cualquier sitio in vivo de un huésped o paciente, que induzca que las MNSCS generen células hematopoyéticas. Para el cultivo ex vivo, dependiendo del fenotipo deseado, puede inducirse la diferenciación de la progenie de células madre neurales en un linaje particular mediante la modificación del ambiente de cultivo añadiendo uno o más factores de crecimiento o citoquinas o combinaciones de los mismos, y/o el cocultivo de las células con células seleccionadas de entre líneas celulares o células nodriza que proporcionen un sustrato y/o factores extrínsecos de liberación en el medio de cultivo que influyan sobre la ruta de diferenciación de la progenie de MNSC. Además, la manipulación del sustrato en el que se cultivan las células puede influir sobre el resultado fenotípico de una población de células, sea antes del trasplante o después de éste. Pueden utilizarse técnicas de cultivo conocidas de la técnica para influir sobre la diferenciación de la progenie de MNSC, tales como las que se conoce que influyen sobre el destino de diferenciación de la progenie de las células madre tempranas de la blástula embrionaria (ver Keller, G.M., Curr. Opin. Cell. Biol. 7:862-869, 1995). De esta manera, pueden utilizarse técnicas ex vivo para proporcionar una población de progenie de MNSC enriquecida con la presencia de progenie recién generada no diferenciada o selectivamente diferenciada de células madre neurales. Las células pretratadas pueden trasplantarse en el estado no diferenciado, o alternativamente, encontrarse ya diferenciadas o dentro del proceso de diferenciación en tipos celulares específicos antes de ser trasplantadas. Pueden utilizarse otras condiciones de cultivo conocidas de la técnica para cultivar células hematopoyéticas, tales como las descritas en las patentes US No. 5.612.211 y No. 5.646.043.

Entre los ejemplos de ambientes in vivo inductores de células hematopoyéticas se incluye el sistema circulatorio, el bazo, el timo, etc. de un mamífero. Por ejemplo, la progenie no diferenciada de MNSC preparada utilizando los procedimientos descritos en la patente US No. 5.750.376 puede administrarse sistémicamente a un paciente sin manipulación ex vivo adicional. El propio sistema circulatorio del paciente proporciona el ambiente que induce que la progenie de MNSC a que genere células del sistema hematopoyético. Las células madre neurales automáticamente repoblan los tipos celulares perdidos o de funcionamiento defectivo en respuesta a las señales ambientales. La progenie de MNSC también puede administrarse en el sistema circulatorio de un mamífero sano, y de esta manera utilizarse con el fin de fortalecer un sistema hematopoyético de funcionamiento normal. De esta manera, la progenie de MNSC sirve como suministro de reserva de células que permanecen sin diferenciar hasta el momento en que resulten
necesarias.

Otro ejemplo de un ambiente in vivo inductor de células hematopoyéticas es el sistema circulatorio de un animal huésped. Puede prepararse una población enriquecida en MNSCs humanas utilizando condiciones de cultivo conocidas en la técnica, y administrarse sistémicamente a un mamífero huésped, donde el ambiente inductor de células hematopoyéticas del sistema circulatorio del animal huésped induce las MNSCs a que generen células del sistema hematopoyético humano. Las MNSCs humanas opcionalmente pueden modificarse genéticamente, tal como se discute en más detalle posteriormente, antes de la administración en el mamífero huésped. Además, puede haberse reducido el sistema hematopoyético endógeno del mamífero huésped previamente a la administración de las MNSCs humanas, por ejemplo, mediante radiación o mediante cualquier otro tratamiento adecuado. Tras generar en el animal huésped una cantidad suficiente de células hematopoyéticas humanas, se extraen y se trasplantan en el paciente humano. Cuando el animal huésped y el paciente son especies diferentes, este procedimiento se denomina "xenoincubación".

Previamente al trasplante, la progenie de MNSC también puede modificarse genéticamente para aliviar los síntomas de un trastorno específico, o para dotar de nuevas funciones a la diferente progenie cuando se implanta en individuos sin ningún trastorno. Por ejemplo, las células podrían contener un gen deseado, tal como un gen capaz de expresar una proteína ausente, una proteína resistente a una enfermedad u otra proteína beneficiosa. En contraste con los otros sistemas de células madre, tales como el sistema de células madre hematopoyéticas, las MNSCs pueden inducirse a que se dividan continuamente bajo condiciones de cultivo in vitro apropiadas, convirtiéndolas en excelentes dianas para la modificación genética. El término "modificación genética" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la alteración estable o transitoria del genotipo de una célula precursora mediante la introducción deliberada de ADN exógeno. El término también abarca el enmascaramiento o deleción de un gen perjudicial o no deseado. El ADN puede ser de síntesis o de origen natural, y puede contener genes, partes de genes, u otras secuencias útiles de ADN. Son bien conocidos en la técnica procedimientos para la modificación genética de las células, y los procedimientos para la modificación genética de la progenie de MNSC se dan a conocer en la patente US nº 5.750.376. Puede resultar deseable modificar genéticamente la progenie de MNSC si se destina su utilización al trasplante en un paciente para aliviar los síntomas de una enfermedad específica con una base genética. Las células pueden modificarse genéticamente antes de su trasplante utilizando una técnica apropiada, tal como la recombinación homóloga. Por ejemplo, utilizando técnicas conocidas de la técnica, las células madre neurales pueden transformarse para expresar el alelo del gen del receptor de quimoquina, CCR5, que proporciona inmunidad frente a VIH. A continuación, las células se administran a un paciente con SIDA (que generalmente presenta un sistema hematopoyético comprometido) y dan lugar a células T resistentes a la infección por VIH (Paxton et al., Nature Medicine 2(4):412-417, 1996; Liu Rong et al., Cell 86:367-377, 1996, y Samson et al., Nature 382:722-725, 1996).

Se han utilizado los trasplantes de médula ósea para tratar una diversidad de enfermedades, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, la anemia aplásica, las deficiencias del sistema inmunológico, las enfermedades autoinmunológicas, los cánceres que afectan al sistema hematopoyético, tales como linfomas y leucemias, la anemia de células falciformes, la osteopetrosis y otras (ver O'Reilly, R.J., Blood 62:941-964, 1983; Thomas, E.D., Blood Cells 17:259-267, 1991; y Marmont, A.M., Bone Marrow Transplant 11:3-10, 1993). Puede trasplantarse progenie de MNSC en lugar de médula ósea para el tratamiento de estas enfermedades. Además, la administración intravenosa de progenie de MNSC en pacientes con trastornos autoinmunológicos podría aliviar los síntomas del trastorno (ver Kenyon, N.S., IBC on Hematopoietic Stem Cells, 1997). La progenie de MNSC también puede alterarse mediante medios extrínsecos o epigenéticos e implantarse en individuos normales o no enfermos para dotarles de un sistema hematopoyético con funciones superiores a las normales.

Tras la obtención de un número adecuado de progenie de MNSC para un fin particular, se trasplantan en un paciente utilizando regímenes de tratamiento conocidos por los expertos en la materia para el trasplante de células madre hematopoyéticas. Para el tratamiento en el ser humano, se dispone de mucha información en la técnica sobre técnicas para el trasplante de células madre hematopoyéticas para el tratamiento de diversos trastornos (Bensinger et al., J. of Clin. Oncology 13(10):2547-2555, 1995; y Tricott et al., Blood 85(2):588-596). Estas referencias describen ensayos clínicos para el trasplante de células madre autólogas de sangre periférica para la reconstitución del sistema hematopoyético de un paciente. Estos estudios han demostrado que la infusión de aproximadamente entre 2 x 10^{6} y 5,0 x 10^{6} células CD34^{+} por kilogramo de paciente, resulta en una injertación más rápida que cuando se administran menos células CD34^{+}. Menos de aproximadamente el 1% de las células no fraccionadas obtenidas a partir de sangre periférica son CD34^{+} (Lut et al., supra). Se estima que aproximadamente entre 1% y 5% de estas células CD34^{+} son células madre hematopoyéticas. En comparación, se estima que aproximadamente entre 10% y 20% de las células precursoras cultivadas secuencialmente y propagadas utilizando los procedimientos descritos en la patente US nº 5.750.376 son MNSCs. De esta manera, la reconstitución del sistema hematopoyético de un paciente utilizando progenie de MNSC debería resultar posible utilizando menos células que las utilizadas en los presentes procedimientos. Ello resulta ventajoso debido a que la administración de menos células introduce menos crioconservante en el paciente (suponiendo que las células trasplantadas se hubiesen congelado previamente). Otra ventaja es que se administra un menor volumen en el paciente, y puede administrarse como una dosis en bolo, en comparación con la infusión prolongada requerida para la administración de células madre de sangre periférica (por ejemplo Bensinger et al., supra, y Tricott et al., supra).

Aproximadamente 10^{2} a 10^{7}, y más típicamente, aproximadamente 10^{3} a 10^{6} células precursoras neurales/kg de peso corporal, deberían resultar suficientes para la reconstitución del sistema hematopoyético de un paciente humano que ha sido sometido a terapia mieloablativa. El número óptimo de células puede determinarse mediante ensayos clínicos rutinarios. El número de células necesario puede ser diferente para un paciente que presente un sistema hematopoyético destruido sólo en parte. Pueden utilizarse ensayos clínicos similares a los descritos por Tricott et al., supra, y Bensinger et al., supra, para determinar los regímenes de tratamiento apropiados para las diferentes poblaciones de pacientes.

Las células precursoras se introducen en el sistema circulatorio receptor mediante un procedimiento adecuado, tal como inyección o infusión intravenosa, subcutánea o intraperitoneal.. En la actualidad la inyección o infusión intravenosa son los procedimientos preferentes. Generalmente se prepara una composición que comprende las células precursoras y una solución fisiológica, tal como solución salina, que resulte adecuada para la utilización como vehículo para la administración de las células precursoras en el sistema circulatorio. Las células pueden enjuagarse en primer lugar en la solución con el fin de eliminar medio de cultivo residual o, si las células se han descongelado recientemente, para eliminar medio residual de crioconservación. Si la progenie de MNSC ha sido congelada, resulta preferible descongelarlas, cultivarlas in vitro en un medio de crecimiento (es decir, un medio que cultivo que contenga factores de crecimiento que induzcan la proliferación de las MNSC) y cultivarlas por lo menos una vez previamente al trasplante. Ello garantiza la viabilidad de las células y elimina el exceso de crioconservador. La concentración final de células precursoras no resulta crítica, con la condición de que se administre un número suficiente de células precursoras. Para facilitar la administración y por la comodidad del paciente, habitualmente se prefiere minimizar el volumen total administrado de suspensión celular, con la condición de que las células puedan inyectarse o infusionarse fácilmente en el paciente sin aglutinación. La concentración generalmente se encontrará en el intervalo comprendido entre 10^{7} y 10^{9} células precursoras/ml. La composición de solución fisiológica/células precursoras adicionalmente puede comprender factores de crecimiento hematopoyético, tales como factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF) o factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para acelerar el periodo durante el que se generan determinados tipos celulares. Alternativamente, pueden administrarse factores de crecimiento al paciente antes o después de la administración de las células precursoras. Previamente al trasplante, se prepara una forma de dosificación que comprende un dispositivo que contiene la composición de células precursoras/solución fisiológica. El dispositivo puede ser cualquier dispositivo que resulte adecuado para la administración de las células precursoras en un paciente. Entre estos dispositivos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, jeringas, bolsas de infusión o recipientes similares para la administración intravenosa de la composición de células precursoras en un paciente.

Tal como se detalla en el Ejemplo 4 posteriormente de un modelo de ratón, el trasplante de progenie de MNSC en receptores sometidos a irradiación corporal total para eliminar las células madre hematopoyéticas funcionales, resultó en la reconstitución del sistema hematopoyético. Se cree que el procedimiento resulta en la restauración permanente del sistema hematopoyético en la mayoría de casos. Sin embargo, en algunos trastornos puede resultar necesario realizar varios trasplantes.

Resulta evidente a partir de la discusión en la presente memoria y de los Ejemplos posteriores que la progenie de MNSC proporciona una alternativa ideal a la presente utilización de células madre hematopoyéticas para la reconstitución del sistema hematopoyético, o adicionalmente al sistema hematopoyético, de un animal o de un ser humano.

Todas las referencias, patentes y solicitudes de patente mencionadas se incorporan en su totalidad como referencia en la presente memoria. Los ejemplos y dibujos siguientes se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no deben interpretarse en ningún caso como limitativos del alcance de la invención.

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Ejemplo 1 Obtención de MNSCs a partir de tejido neural A. Tejido embrionario

Se extrajo tejido estriatal de cerebros de embriones de ratón CD1 y TGR-ROSA de 14 días de edad (Charles River) utilizando un procedimiento estéril. El tejido se disoció mecánicamente con una pipeta Pasteur pulida al fuego en medio libre de suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y nutriente F12 (Gibco). Las células disociadas se centrifugaron a 800 r.p.m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante, y las células se resuspendieron en medio DMEM/F-12 para el recuento.

B. Tejido adulto

Se extrajo tejido estriatal de cerebros de ratón TGR-ROSA (estos animales se marcaron genéticamente con \beta-Gal, permitiendo su detección en los animales huésped), de ratones RAG-1 (cepa de ratones "knockout", incapaces de producir células sanguíneas B y T funcionales maduras, esferas de control negativo) y ratones C57BL/6J (stock de fondo para los ratones RAG-1 knockout). Las células madre procedentes de los animales TGR-ROSA y C57BL/6J, pero no de los ratones RAG-1, deben poder reconstituir los compartimientos de células sanguíneas B y T de los animales huésped. Estos tejidos se extrajeron y se diseccionaron en secciones de 500 \mum e inmediatamente se introdujeron en líquido cerebroespinal artificial oxigenado bajo en calcio (aCSF bajo en Ca^{2+}) que contenía 1,33 mg/ml de tripsina, 0,67 mg/ml de hialuronidasa y 0,2 mg/ml de ácido quinurénico. El tejido se agitó en esta solución durante 90 minutos a una temperatura comprendida entre 32ºC y 35ºC. El aCSF se decantó y se sustituyó por aCSF oxigenado fresco durante 5 minutos. El tejido se transfirió a una solución DMEM/F-12/solución al 10% de hormona que contenía 0,7 mg/ml de ovomucoide y se trituró con una pipeta Pasteur pulida al fuego. Las células se centrifugaron a 400 r.p.m. durante 5 minu-
tos, el sobrenadante se aspiró y las células en el pellet se resuspendieron en mezcla DMEM/F-12/hormona al 10%.

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Ejemplo 2 Preparación de poblaciones enriquecidas en MNSCs

Las células adultas obtenidas en el Ejemplo 1 se sembraron (1.000 células viables por placa) en placas de cultivo de 35 mm no recubiertas (Costar) que contenían Medio Completo, 10 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de EGF [purificado a partir de glándula submaxilar de ratón (Collaborative Research) o de origen humano recombinante (Gibco/BRL)]. Las células embrionarias, obtenidas utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, se cultivaron en el mismo medio de cultivo, con la excepción de que no se añadió bFGF. El Medio completo es un medio libre de suero compuesto de DMEM/F-12 (1:1) que incluye glucosa (0,6%), glutamina (2 \muM), bicarbonato sódico (3 mM) y tampón HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperacinoetanosulfónico) (5 mM) (todos de Sigma excepto la glutamina [Gibco]). El Medio Completo se suplementó con una mezcla definida de hormonas y mezcla salina (Sigma), que incluía insulina
(25 \mug/ml), transferrina (100 \mug/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 \muM) y cloruro de selenio (30 nM). Las MNSCs murinas presentes en los cultivos poliferaron, dando lugar a neuroesferas.

Tras 6 a 7 días in vitro, se dejó que las neuroesferas sedimentasen en el fondo del matraz. A continuación las neuroesferas se transfirieron a tubos de centrifugación de 50 ml y se centrifugaron a 300 r.p.m. durante 5 minutos. El medio se extrajo por aspiración y las neuroesferas se resuspendieron en 1 ml del medio de proliferación en el que se habían cultivado. Las neuroesferas se disociaron con una pipeta Pasteur estrechada al fuego y se trituraron para formar una suspensión de células individuales. Las células se contaron y se sembraron en placas a 50.000 células/ml en Medio Completo. Se formaron nuevas neuroesferas tras unos cuantos días. Este procedimiento de proliferación/pasaje se llevó a cabo cuatro veces.

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Ejemplo 3 Preparación de progenie de MNSC derivada por clonación

Las células de las neuroesferas, obtenidas a partir de tejido estriatal de ratones ROSA adultos utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2, se diluyeron hasta aproximadamente 1 célula por pocillo en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos (200 \mul de medio de cultivo/pocillo) para generar progenie de MNSC derivada por clonación. La presencia de una sola célula en un pocillo se confirmó mediante microscopía de contraste de fases. Se desarrollaron neuroesferas individuales en aproximadamente 20% de los pocillos, indicando que cada uno de estos pocillos contenía una sola MNSC que había proliferado para formar la neuroesfera. Las neuroesferas se cultivaron tal como se describe en el Ejemplo 2. Tras varios cultivos, las neuroesferas se recogieron para el trasplante aproximadamente cuatro días después de su formación.

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Ejemplo 4 Regeneración del sistema hematopoyético utilizando MNSCs

Se sometieron números iguales de ratones Balb/c adultos macho y hembra de 2,5 a 3 meses de edad (25 a 30 g, Charles River) a irradiación corporal total (850 rads) con el fin de reducir severamente el número de células madre hematopoyéticas funcionales. Los procedimientos de irradiación esencialmente fueron los descritos por Tarbel et al., Development 121:4077-4083 (1987) y Down et al., Blood 3:661-669 (1991). Debido a la incidencia de toxicidad gastrointestinal y pulmonar tras dosis únicas de 850 rads informada en la literatura, se administró una dosis fraccionada de 450 rads seguida de 400 rads 4 horas después, resultando en la dosis absorbida acumulada por el tejido blando de aproximadamente 850 rads. Durante la irradiación, se realizó un seguimiento continuo del movimiento de los animales mediante cámaras de vídeo. Se registraron varias medidas para garantizar que todas las regiones del cuerpo habían recibido iguales cantidades de irradiación: 1) los ratones se introdujeron en una jaula Lucite con dimensiones que evitaban que los animales trepasen unos encima de otros (lo que podría varias la dosis recibida), 2) cada fracción de la dosis total se aplicó con la fuente de cobalto en primer lugar en posición dorsal y seguidamente en posición ventral, y 3) se unieron dispositivos de detección de calibración con cinta, a la parte superior, al fondo y a las paredes del recipiente, así como en el aspecto dorsal de un animal y en el aspecto ventral de un segundo animal en cada grupo con el fin de medir con exactitud la dosis precisa recibida por cada grupo de animales. En cada caso, los dispositivos de calibración utilizados determinaron que la dosis real recibida por los diferentes grupos de animales había sido de
850 rads \pm 2%.

Se resuspendieron en EBSS (solución salina equilibrada de Earle) varios lotes de poblaciones enriquecidas en MNSC, preparadas tal como en los Ejemplos 2 y 3, a temperatura ambiente. A continuación las células se mantuvieron a 4ºC hasta justo antes del trasplante, momento en el que se calentaron hasta la temperatura corporal para evitar el choque térmico del animal receptor.

Se inyectó una parte de los ratones irradiados ("ratones receptores") con una población enriquecida en MNSCs preparada tal como en el Ejemplo 2 ó 3 anterior, aproximadamente 16 horas tras completar la segunda irradiación. Los investigadores responsables del seguimiento y ensayo de los ratones irradiados no fueron informados del contenido de cada vial de células, ni de la asignación de los animales a grupo receptor o grupo de control. Se administraron 0,2 ml de una población enriquecida en MNSCs en EBSS caliente (a temperatura corporal) a los ratones receptores (mediante inyección en una vena de la cola). Los ratones de control recibieron EBSS caliente solo o fibroblastos murinos (aproximadamente 10^{6} células 3T3). Como control positivo, algunos de los ratones receptores recibieron una inyección de células de médula ósea de ratón ROSA obtenidas recientemente (aproximadamente
27.000.000 células).

Previamente al trasplante, se expusieron a citoquinas algunos lotes de MNSCs. El pretratamiento con citoquina consistía en: factor de crecimiento de células madre (10 ng/ml), interleuquina (IL)-1alfa (2 ng/ml), IL-2 (10 ng/ml), IL-3 (5 ng/ml) e IL-6 (10 ng/ml). Este pretratamiento se administró a las células 24 horas después de inyectar las células en el animal receptor.

Debido a que la susceptibilidad frente a los agentes infecciosos representa un problema tras la exposición a irradiación corporal total letal, se adoptaron varias medidas para tratar esta cuestión. Los animales empezaron recibiendo antibióticos (sulfato de neomicina: 1 mg/ml, añadido a agua) 48 horas antes de la irradiación y su agua de beber se acidificó (pH 3,5 a 4,0) para reducir la flora bacteriana en el sistema digestivo). Los ratones se alojaron en jaulas con filtros, en cuartos diseñados para alojar con seguridad animales inmunodeficientes, y con suministro de alimento y agua esterilizados. Finalmente el personal de laboratorio vestía bata, guantes, gorro y máscara durante el trabajo con los animales.

Los ratones irradiados se observaron diariamente, registrando cada dos días peso corporal, estado del pelaje, apariencia de los ojos, movilidad y postural general, en un intento de seguir las condiciones fisiológicas. Los animales que mostraban pérdida de apetito, movilidad reducida, diarrea o pérdida severa de peso se sacrificaron mediante dislocación cervical, sometiendo a ensayo su sangre y órganos para la identificación de tipos celulares hematopoyéticos e injertación (en su caso) mediante análisis inmunohistoquímico y separación celular actividad por fluorescencia (FACS), tal como se describe posteriormente. Se realizó autopsia de todos los animales que murieron prematuramente con el fin de determinar la causa de su muerte.

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Resultados

La Tabla I muestra los resultados de número de animales que sobrevivieron a cada tratamiento.

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TABLA I

Tratamiento	Animales en cada condición	Animales supervivientes
		(6 meses después del trasplante)
No inyección	4	0/4
EBSS	30	8/30
Fibroblastos murinos, 1.000.000 células	5	1/5
\begin{minipage}[t]{60mm}Médula ósea de ratones ROSA adultos 27.000.000 células\end{minipage}	10	10/10
\begin{minipage}[t]{60mm}Progenie de MNSC de ratones ROSA adultos con pretratamiento con citoquina 350.000 células\end{minipage}	5	5/5
\begin{minipage}[t]{60mm}Progenie de MNSC de ratones ROSA adultos sin citoquina, 500.000 células\end{minipage}	5	5/5
\begin{minipage}[t]{60mm}Progenie de MNSC de embriones de ratón CD1 sin citoquina, 2.000.000\end{minipage}	2	2/2
\begin{minipage}[t]{60mm}Progenie de MNSC de embriones de ratones CD1 con pretratamiento de citoquina, 750.000 células\end{minipage}	2	1/2

La mayor parte de la progenie de MNSC y de los animales receptores de médula ósea sobrevivieron al tratamiento (más de 6 meses), mientras que la mayoría de los animales de control negativo (aquellos que recibieron fibroblastos, solución salina o no fueron inyectados tras la irradiación) no sobrevivieron durante periodos superiores a 30 días. Las autopsias realizadas en animales de control negativo revelaron habitualmente glándulas de bazo y/o timo reducidas y/o en ocasiones ausentes, indicativas de un sistema hematopoyético severamente comprometido. Consistentemente con esta condición se observaron hígados de tamaño reducido y de color gris en los ratones de control con los periodos de supervivencia más largos, sugiriendo una pérdida significativa de glóbulos rojos. En claro contraste, los ratones supervivientes receptores de MNSC presentaban una apariencia sana y activa durante un periodo prolongado de observación (hasta 15 meses).

Con el fin de someter a ensayo la injertación de las células donantes, se recogió sangre periférica de los supervivientes 7 a 11 meses después del trasplante y se sometieron a citometría de flujo, análisis de FACS y amplificación por PCR del gen LacZ. Se detectó \beta-galactosidasa en algunos tipos celulares hematopoyéticos, sugiriendo que se había producido la reconstitución completa de todos los linajes hematolinfáticos principales.

Análisis de citometría de flujo

Tras 7 a 11 meses de completar el procedimiento de inyección en una vena de la cola (todavía llevando a cabo el estudio en el formato de "doble ciego"), se recogió sangre periférica de ratones representativos de cada condición y se sometió a ensayo para la presencia de actividad de \beta-Gal y expresión de antígeno de superficie hematopoyético (Berger et al., J. Cytometry 17:216-223, 1994). Con el fin de facilitar la detección de los tipos celulares hematopoyéticos \beta-Gal^{+}, se utilizó el kit de citometría de flujo FluoroReporter lac-Z (Molecular Probes nº F-1931). Básicamente se cargaron mediante choque hipotónico células hematopoyéticas viables con el sustrato fluorogénico de beta-galactosidasa: fluoresceína di-beta-D-galactopiranosidasa (FDG). La FDG no fluorescente se hidrolizó secuencialmente con \beta-galactosidasa con el fin de producir fluoresceína altamente fluorescente, que resulta fácilmente detectable mediante análisis de citometría de flujo. Debido a la carga hipotónica de FDG, los antígenos de la superficie celular siguen intactos y todavía resulta posible utilizar la exclusión con yoduro de propidio para el ensayo de viabilidad. Este procedimiento indicó la presencia de células positivas para \beta-Gal en la sangre periférica de los ratones receptores. El backgating de las células positivas para \beta-Gal en ratones que habían sido repoblados con médula ósea o con progenie de MNSC de ratones ROSA
reveló un patrón de distribución similar, sugiriendo que ambos tipos de ratón producían tipos celulares similares.

Además del gen lacZ, las células de ratones ROSA26 expresan una molécula MHC de tipo 1 (denominada de tipo H-2 en el ratón) diferente de la de los huéspedes Balb/c (H-2K^{b} y H-2K^{d}, respectivamente). Por lo tanto, resultó posible realizar un seguimiento de la presencia y fenotipo resultante de la progenie de MNSC en animales trasplantados utilizando inmunocitoquímica. Para detectar la injertación, se procesaron diversos tejidos hematopoyéticos (incluyendo sangre) procedente de animales trasplantados y de control para citometría de flujo utilizando anticuerpos H-2K^{d} y H-2K^{b} para detectar los diferentes isotipos de H-2. Los anticuerpos utilizados eran CD4 (nº 09005A),
CDIIb (0175B;), CD19 (O9655B) y H-2K^{b} (06105A), todos como conjugados con ficoeritrina (PE), H-2K^{b} (06102D) y H-2K^{d} (06092D) biotinilados e IgG_{1a'k} de ratón (isotipo de control), todos de Pharmingen (San Diego, CA). Todos los anticuerpos primarios se utilizaron a una proporción de 1:50. El conjugado FITC con estreptavidina (Jackson Laboratories; Mississauga, ON) se utilizó a una dilución de 1:100. Todos los animales utilizados para generar los datos habían sobrevivido un mínimo de 6 meses tras la irradiación.

Las suspensiones celulares de bazo y timo se prepararon en EBSS cortando el órgano en trozos pequeños y después moliéndolos entre dos portaobjetos de Corning esmerilados. Se lavó la médula ósea de los fémures con EBSS. Los eritrocitos se lisaron en NH_{4}Cl 144 mM, Tris-Cl 17 mM, pH 7,2, durante 4 minutos a temperatura ambiente. Las células se enjuagaron con tampón FACS (EBSS + suero de feto bovino al 1,0%), se centrifugaron a 1.100 r.p.m. durante 7 minutos y se resuspendieron en tampón FACS previamente a la realización de los contajes. Para la tinción de anticuerpos, se mezclaron 50 \mul de solución de anticuerpo con 50 \mul de suspensión celular (1,0 x 10^{6} células) y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. Las células se enjuagaron en tampón FACS, se centrifugaron a 1.100 r.p.m. durante 5 minutos, se resuspendieron en 50 \mul de tampón FACS y se incubaron con 50 \mul de anticuerpo secundario (en caso apropiado) a 4ºC durante 30 minutos. Finalmente, las células se enjuagaron en tampón FACS, se centrifugaron y se resuspendieron en 500 \mul de EBSS para el análisis de citometría de flujo. Se utilizaron controles de isotipo para fijar las ventanas de análisis en los casos en que se utilizaron anticuerpos biotinilados. En el caso de anticuerpos directamente marcados, se fijaron las ventanas utilizando células únicamente. Inmediatamente antes del análisis de citometría de flujo, se añadió yoduro de propidio a las suspensiones de control con el fin de garantizar una viabilidad de >95%. El análisis de citometría de flujo se llevó a cabo en un FACScan (Becton-Dickinson), seleccionando todos los sucesos en la dispersión frontal/en ángulo recto, con el fin de cuantificar el número de células H-2K^{b+} respecto al número total de sucesos seleccionados (n=6, \pm S.E.M.; p<0,05). Los resultados se muestran en la Tabla II siguiente.

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TABLA II

	Sangre periférica	Bazo	Médula ósea
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles Balb/C no irradiados, No trasplantados\end{minipage}	2,35 \pm 0,40	0,92 \pm 0,15	2,26 \pm 0,55
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles ROSA26 no irradiados, No trasplantados\end{minipage}	94,2 \pm 1,13	97,3 \pm 1,03	42,3 \pm 4,09
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles Balb/C irradiados, sólo inyección de EBSS\end{minipage}	1,68 \pm 0,43	1,68 \pm 0,44	42,3 \pm 4,09
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/C irradiados, trasplante de médula ósea procedente de ratones ROSA26\end{minipage}	56,7 \pm 12,6	95,3 \pm 2,45	38,8 \pm 2,48
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/C irradiados, trasplante de progenie de MNSC procedente de ratones ROSA26 adultos\end{minipage}	43,1 \pm 6,87	65,4 \pm 23,5	35,8 \pm 10,0
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/C irradiados, trasplante de progenie de MNSC procedente de embriones de ratones ROSA26\end{minipage}	43,9 \pm 6,98	96,5	22,0

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Se prepararon gráficos de puntos de las células positivas para H-2K^{b} frente a las positivas para H-2K^{d} en sangre periférica y de los tipos celulares hematopoyéticos positivos CD4 (células T), CD19 (células B) o CD11b (granulocitos) marcados con H-2K^{b} en suspensiones de células de bazo procedentes de controles no irradiados (ratones ROSA26 y Balb/c) y de animales receptores irradiados. Las células positivas para H-2K^{b} se detectaron en el bazo y en la sangre periférica de animales que habían recibido médula ósea de ratones ROSA o progenie de MNSC. No se encontraron células positivas para H-2K^{b} en los animales inyectados con EBSS únicamente. En los ratones receptores de células madre hematopoyéticas y neurales también se encontraron células positivas para H-2K^{b} en otros tejidos hematopoyéticos, incluyendo la médula ósea y el timo. Se encontraron poblaciones de cada uno de los fenotipos diferenciados (que representan todos los tipos celulares hematopoyéticos diferenciados terminalmente con la excepción de los eritrocitos) doblemente marcados con el antígeno H-2K^{b} en el bazo de los ratones receptores de células hematopoyéticas y
de MNSC.

Los análisis inmunocitoquímicos adicionales de las células positivas para H-2K^{b} en los receptores de progenie de MNSC revelaron la presencia de células del linaje de células T (H-2K^{b+}/CD8^{1}; H-2K^{b+}/Cd3e^{+}), células del linaje de células B (H-2K^{b+}/B220^{+}; H-2K^{b+}/IgM^{+}; H-2K^{b}/IgD), células del linaje granulocítico (H-2K^{b+}/CD 89^{+}) y células del linaje mieloide (H-2K^{b+}/Mac-3^{+}), proporcionando evidencia de que la progenie de MNSC generó todos los linajes celulares hematopoyéticos principales.

La Tabla III muestra el porcentaje de células de ratones ROSA26 (H-2K^{b+}) en los bazos de animales trasplantados y de control que se marcaron doblemente para los antígenos hematopoyético-específicos CD3e (células T), CD11b (granulocitos) y CD19 (células B) según ensayos de citometría de flujo, 7 a 11 meses después de los trasplantes. Se descubrió un número significativo de células marcadas doblemente en animales inyectados con médula ósea de ratones ROSA26, células madre neurales (NSCs) embrionarias y NSCs adultas derivadas por clonación. Todos los porcentajes se calcularon respecto al número total de sucesos seleccionados (n=6, \pm S.E.M.; p<0,05).

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TABLA III

	CD3e/H-2K^{b}	CD11b/H-2K^{b}	CD19/H-2K^{b}
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles Balb/c no irradiados, No trasplantados\end{minipage}	0,52 \pm 0,08	0,47 \pm 0,09	0,57 \pm 0,08
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles ROSA26 no irradiados, No trasplantados\end{minipage}	33,0 \pm 5,16	30,0 \pm 2,24	51,0 \pm 1,90
\begin{minipage}[t]{78mm}Controles Balb/c irradiados, sólo inyección de EBSS\end{minipage}	0,77 \pm 0,05	0,43 \pm 0,02	0,59 \pm 0,07
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/c irradiados, trasplante de médula ósea procedente de ratones ROSA26\end{minipage}	31,9 \pm 2,62	14,5 \pm 3,85	56,2 \pm 2,50
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/c irradiados, trasplante de progenie de MNSC procedente de ratones ROSA26 adultos\end{minipage}	28,1 \pm 14,2	14,9 \pm 10,9	26,8 \pm 11,7
\begin{minipage}[t]{78mm}Balb/c irradiados, trasplante de progenie de MNSC procedente de embriones de ratones ROSA26\end{minipage}	40,6	8,71	31,0

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Con el fin de confirmar adicionalmente los resultados de la citometría de flujo, se prepararon extensiones sobre cubreobjetos con citocentrífuga de las mismas muestras y se visualizaron utilizando microscopía de fluorescencia. Para ello, las células que se habían preparado en primer lugar para el análisis de citometría de flujo (ver anteriormente) se fijaron utilizando paraformaldehído al 4%/glutaraldehído al 0,1% en una proporción de 1:1 durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se prepararon extensiones de las células sobre cubreobjetos recubiertos previamente con albúmina de rata al 10% (Gibco BRL) con citocentrífuga a 700 r.p.m. durante 8 minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron con Fluorosave (Calbiochem, La Jolla, CA) y se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioscop.

Se muestran los resultados en la figura 1. Se observó la presencia de todos los linajes hematopoyéticos diferenciados en los animales irradiados que habían recibido EBSS, aunque ninguna de las células expresaba el antígeno H-2K^{b}. En los animales que habían recibido médula ósea derivada de ratones ROSA26, se observaron todos los fenotipos diferenciados, expresando una parte sustancial de estas células el antígeno H-2K^{b}. Se observó un resultado similar en los animales que habían recibido progenie de MNSC, demostrando que el trasplante de MNSC puede sustituir al trasplante de médula ósea. Las células doblemente marcadas con H-2K^{b} y CD4, CD11b o CD19 se visualizaron en animales que habían recibido progenie de MNSC preparada según los Ejemplos 2 y 3.

Con el fin de identificar cualitativamente la injertación de células madre neurales en linajes hematopoyéticos más tempranos, se aisló la médula ósea de animales que habían sido trasplantados con MNSC y con médula ósea para su utilización en ensayos clonogénicos in vitro. Se diluyeron células aisladas de las médulas óseas hasta una densidad de 500 células/ml en IMDM suplementado con HIFBS al 2% (Gibco BRL). Las células se añadieron a MethoCult (Stem Cell Technologies Inc.) siguiendo las especificaciones del fabricante, suplementado con las citoquinas apropiadas, en una proporción 1/10 v/v y se dispensaron 1,1 ml en placas de 35 mm y se dejaron 10 a 14 días a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}. Las citoquinas utilizadas eran: interleuquina-3 (10 ng/ml), interleuquina-7 (10 ng/ml), factor de crecimiento de células madre (50 ng/ml), eritropoyetina (3 U/ml) (R&D Systems) e interleuquina-6 (10 ng/ml; Novartis). Se utilizó histoquímica de X-Gal para detectar la actividad de \beta-galactosidasa en los clones originados en células madre neurales. Se añadió una solución de trabajo de X-Gal, constituida por K_{3}F_{3}(CN)_{6} 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6}\cdot
3H_{2}O 5 mM, MgCl_{2} 2 mM (Sigma) y X-Gal (en dimetil sulfóxido; Molecular Probes) hasta una concentración final de 1 mg/ml en PBS (pH 7,4) a cultivos en metilcelulosa 10 a 14 días después del sembrado en placa. Los cultivos se expusieron a 400 \mul de solución de trabajo de X-Gal durante 8 horas a 37ºC. Se tomaron fotografías utilizando película de diapositiva 400 ektachrome de Kodak utilizando una cámara Canon Epoh montada en un microscopio invertido Zeiss Axiophot. Bajo las condiciones de control, ninguna de las colonias derivadas de la médula ósea de ratones Balb/c adquirió un color azul, mientras que sí lo hizo la mayoría de los clones procedentes de ratones ROSA26. La médula ósea aislada de animales que habían recibido células madre embrionarias o adultas dieron lugar a colonias de células que adquirieron un color azul al exponerlas a X-Gal (figuras 2A-2D), sugiriendo que las células madre neurales pueden dar lugar a células hematopoyéticas tanto tempranas como tardías. Varios clones aislados de animales que habían recibido células madre neurales adultas o embrionarias no adquirieron un color azul al exponerlas a X-Gal (figuras 2E y 2F). Probablemente ello se deba a la presencia de células endógenas de médula ósea que no resultaron eliminadas
por la irradiación. Las identidades de estos clones aparentemente abarcaba un amplio espectro de células tempranas.

La detección de FDG \beta-Gal llevada a cabo en combinación con técnicas inmunocitoquímicas demostró la presencia de células del linaje de células T (CD4^{+} \beta-Gal^{+}; CD8a^{+} \beta-Gal^{+}; CD3e^{+} \beta-Gal^{+}), células del linaje de células B (B220^{+} \beta-Gal^{+}; IgM^{+} \beta-Gal^{+}; IgD^{+} \beta-Gal^{+}), células del linaje granulocítico (CD89^{+} \beta-Gal^{+}) y células del linaje mieloide (Mac-1^{+} \beta-Gal^{+}), demostrando que las MNSCs generaban todos los linajes hematolinfáticos principales.

Con el fin de identificar la posible injertación por las células madre neurales, se realizó un ensayo de PCR de presencia-ausencia de lacZ en ADN aislado de bazos de animales que habían sido trasplantado 7 a 12 meses antes. Se utilizó el procedimiento de eliminación del cebador descrito anteriormente (H. Wong, W.D. Anderson, T. Cheng, K.T. Riabowol, Anal. Biochem. 223:251, 1994) para amplificar ADN genómico utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. En resumen, se digirieron 10 \mug de ADN genómico durante la noche utilizando EcoRI y se utilizaron
0,5 \mug como molde de PCR. Se aplicaron 40 ciclos de 94ºC (1 minuto), 60ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto) para amplificar lacZ utilizando el par cebador siguiente: 5'-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA y 3'-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC. Tras 20 ciclos, se añadieron como control interno los cebadores específicos para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, 5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT y 3'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC).

No se detectó lacZ en los animales que habían recibido vehículo EBSS. En comparación, los animales que habían recibido médula ósea de ratones ROSA26 produjeron una señal muy fuerte. También se detecto lacZ en animales trasplantados con progenie de MNSC procedente de ratones ROSA26. Ello aparentemente era independiente del origen celular, debido a que los animales inyectados con progenie de células madre neurales embrionarias o adultas (incluyendo las adultas derivadas por clonación) produjeron una señal fuerte. Con el fin de descartar la posibilidad de un resultado falso negativo, se coamplificó el gen que codificaba GAPDH con lacZ en el mismo tubo de reacción. La presencia de una señal débilmente amplificada de GAPDH bajo todas las condiciones indicó que la amplificación de lacZ era genuina.

Entre los análisis adicionales realizados se incluyen el análisis de transferencia southern, la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (PCR-RT) y la PCR genómica de tejidos recolectados para identificar células
\beta-Gal+ en la sangre periférica.

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Ejemplo 5 Capacidad de las MNSCs de mantener el sistema hematopoyético

La capacidad de las MNSCs de generar nuevas células madre hematopoyéticas se determina mediante la extracción de médula ósea de animales irradiados supervivientes del Ejemplo 4 que habían recibido células marcadas de origen neural, e inyectando las células de médula ósea preparadas en animales receptores irradiados en los que las células madre hematopoyéticas endógenas han sido severamente reducidas o destruidas. La recuperación de los animales irradiados y la presencia de células marcadas en la médula ósea de los animales receptores indicó que el trasplante de médula ósea contenía células madre hematopoyéticas viables derivadas originalmente de tejido neural.

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Ejemplo 6 Tratamiento de la deficiencia inmunológica

Los ratones que portan una mutación de línea germinal en un gen activador de recombinación (RAG-1) presentan una incapacidad total para producir linfocitos B o T maduros (Mombaerts et al., Cell 68:869-877, 1992). El sistema inmunológico de estos ratones mutantes puede describirse como de ratones SCID (inmunodeficiencia combinada severa) no parciales. Las cepas reproductoras RAG-1 (cepa C57BL/6J-Rag1^{bn1Mom}) pueden obtenerse de Jackson Laboratories (nº JR2216).

La progenie de MNSC se preparó tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2 utilizando tejido neural obtenido de ratones RAG-1 y de ratones de la cepa de fondo C57BL/6J (Jackson nº 664) que no presentan la mutación RAG-1. Mediante la utilización de los procedimientos en el Ejemplo 4, se inyectaron intravenosamente aproximadamente 1.000.000 de células precursoras C57BL/6J en una vena de la cola precalentada de los ratones infantes RAG-1 antes de las 3 semanas de edad. A partir de las 4-6 semanas posteriores a la inyección, se recolectó sangre de los animales receptores y se sometió a ensayo para la detección de CD3e sérica (receptor de las células T); Mombaerts et al., supra. La presencia de CD3e indica la presencia de linfocitos T maduros, que son células que no se encuentran normalmente en los ratones RAG-1. Además, también puede someterse a ensayo la presencia de IgM y de IgD, que indica la presencia de linfocitos B maduros, que también son células que normalmente no se encuentran en los ratones RAG-1; Mombaerts et al., supra. Se sacrificó una subpoblación de aquellos animales que dieron positivo para estos tipos celulares maduros en diferentes momentos tras la inyección y se examinaron para evidencia de
hematopoyesis.

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Resultados

Al someter a ensayo mediante análisis FACS la sangre de los animales experimentales RAG-1, que habían recibido MNSCs de C57BL/6J, se obtuvieron resultados positivos para CD3e, un marcador del receptor de las células T que se encuentra en las células T funcionales. Por el contrario, la sangre de los ratones que habían recibido RAG-1 o EBSS presentaron resultados negativos para el marcador CD3e. Ello demuestra que el trasplante de MNSC puede utilizarse para tratar los defectos genéticos del sistema hematopoyético.

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Ejemplo 7 Trasplante alogénico para tratar defectos genéticos

Se preparó progenie sana de MNSC a partir de tejido neural normal obtenido a partir de una biopsia de un donante humano y se expandió in vitro utilizando procedimientos conocidos en la técnica con el fin de obtener una población enriquecida en células madre neurales multipotentes humanas. La progenie de MNSC se trasplantó en un paciente que había dado su consentimiento y que presentaba una enfermedad genética del sistema hematopoyético tal como, aunque sin limitación, la anemia de células falciformes. Se administraron MNSCs al paciente tras recibir quimioterapia o terapia de radiación para reducir la población de células madre hematopoyéticas del paciente. Las células se administraron intravenosamente a lo largo de un periodo de 24 a 48 horas, a una dosis comprendida entre 1 x 10^{2} y 5 x 10^{6} células/kg. Es posible que el curso temporal óptimo de administración y el número de células a administrar deban modificarse a un número superior a dicho número en algunos casos. Las MNSCs se administraron 36 a 48 horas después de la última dosis de quimioterapia o de terapia de radiación. Pueden administrarse factores de crecimiento y/o citoquinas seleccionados conocidos para promover la hematopoyesis (GF-CSF o G-CSF a una dosis de 250 \mug/m^{2}/día) tras la infusión hasta el establecimiento de una injertación exitosa. Se considera que se ha alcanzado una injertación exitosa cuando el contaje de neutrófilos del paciente es superior a 0,5 x 10^{9} células/ml en dos días consecutivos y cuando el contaje de plaquetas del paciente es superior a 20 x 10^{9}/litro durante 7 días consecutivos. Se administraron antibióticos profilácticos si el contaje absoluto de neutrófilos era inferior a 0,5 x 10^{9} células/l (ciprofloxaína oral (500 mg dos veces al día) o penicilina VK oral (250 mg cada 6 horas) o aciclovir intravenoso (5 mg/kg cada
8 horas).

Dependiendo del nivel de correspondencia entre el tejido del huésped y del donante, pueden administrarse fármacos inmunosupresores para evitar reacciones de rechazo.

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Ejemplo 8 Trasplante autólogo para tratar defectos genéticos

Se preparó la progenie de MNSC a partir de tejido neural obtenido de una biopsia de un paciente que sufría un trastorno genético que afecta a los glóbulos rojos. Los MNSCs del paciente se expandieron in vitro utilizando procedimientos descritos en la patente US No. 5.750.376, con el fin de obtener una población enriquecida en células madre neurales multipotentes. La progenie de MNSC se modificó genéticamente utilizando procedimientos conocidos para corregir el defecto genético. Por ejemplo, la patente US No. 5.760.012 describe procedimientos para modificar genéticamente las células madre hematopoyéticas en pacientes que sufren hemoglobinopatías, tales como la anemia de células falciformes, beta-talasemia o enfermedad de Gaucher. Los procedimientos para tratar la anemia de células falciformes se dan a conocer en Cole-Strauss, A. et al. (Science 273:1386-1389, 1996). Pueden utilizarse los mismos procedimientos para modificar genéticamente las MNSCs de un paciente.

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La progenie de MNSC genéticamente modificada se trasplanta en el paciente. En algunos casos puede resultar deseable tratar en primer lugar al paciente con quimioterapia o terapia de radiación para reducir la población de células madre hematopoyéticas enfermas del paciente. Las MNSCs genéticamente modificadas se administran intravenosamente utilizando los procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 8.

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Ejemplo 9 Trasplante alogénico para proporcionar resistencia a VIH

Se preparó la progenie de MNSC a partir de tejido neural obtenido de una biopsia de un donante humano que presentaba el alelo CCR5, que se ha demostrado que proporciona resistencia a la infección por VIH (Samson et al., supra) y se expandió in vitro utilizando procedimientos conocidos de la técnica con el fin de obtener una población enriquecida en células madre neurales multipotentes humanas. Utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 7, la progenie de MNSC se trasplantó en un paciente infectado por VIH con el fin de prevenir o reducir la progresión del SIDA. Alternativamente, la progenie de MNSC puede trasplantarse en un paciente no infectado para proporcionar inmunidad o resistencia frente a la infección por VIH.

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Ejemplo 10 Trasplante autólogo para proporcionar resistencia frente a VIH

Se obtuvo tenido neural de un paciente infectado por VIH. Utilizando los procedimientos descritos en la patente US No. 5.750.376, se expandieron in vitro las MNSCs presentes en el tejido neural. La progenie de MNSC se modificó genéticamente utilizando las técnicas conocidas de la técnica con el fin de sustituir el gen CCR5 endógeno con un alelo CCR5 que se ha demostrado que proporciona resistencia a la infección por VIH (Samson et al., supra). Se trasplantó la progenie de MNSC genéticamente modificada en el paciente utilizando los procedimientos descritos en el
Ejemplo 7.

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Ejemplo 11 Trasplante autólogo para pacientes de quimioterapia

Previamente a la quimioterapia de dosis elevada, se llevó a cabo una biopsia del tejido neural del paciente y se expandieron in vitro las MNSCs y se almacenaron mediante procedimientos descritos en la patente US No. 5.750.376. Las células se infusionaron en el paciente tras el tratamiento de quimioterapia utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 7. No deberían resultar necesarios los fármacos inmunosupresores.

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Ejemplo 12 Xenoincubación de MNSCs para producir células hematopoyéticas para la reinfusión en la especie donante

Las MNSCs embrionarias humanas, obtenidas a partir de diencéfalo de un feto o de un adulto se expandieron in vitro utilizando procedimientos descritos en la patente US No. 5.750.375. Tras varios cultivos, se obtuvieron células procedentes de neuroesferas de 1 semana de edad. Se inyectaron aproximadamente 1 x 10^{6} células en las venas de la cola de ratones RAG-1 irradiados, tal como se indica en el Ejemplo 4.

Se permitió que los animales sobreviviesen y se recolectó sangre a intervalos regulares con el fin de demostrar que las MNSC humanas pueden repoblar el sistema hematopoyético del ratón. La capacidad de las células madre neurales de reconstituir el sistema hematopoyético del ratón indica que las MNSCs pueden inyectarse en otras especies de mamífero, en particular en animales más grandes, tales como cerdos y caballos, en los que las MNSCs dirigen la producción de nuevas células sanguíneas humanas que pueden recolectarse para su utilización en pacientes
humanos.

Claims

1. Utilización de progenie de células madre neurales multipotentes de mamífero para la preparación de una composición farmacéutica para la generación de células hematopoyéticas, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se destina a la administración al sistema circulatorio de un mamífero.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la composición farmacéutica es para la reconstrucción del sistema hematopoyético de un animal o de un ser humano, o para la adición al mismo.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la composición farmacéutica es para la utilización en el tratamiento de la anemia aplásica, de las deficiencias del sistema inmunológico, de las enfermedades autoinmunológicas, de los cánceres que afectan al sistema hematopoyético, de la anemia de células falciformes y/o de la osteopetrosis.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha generación de células hematopoyéticas adicionalmente comprende introducir dicha progenie de células madre neurales multipotentes en un ambiente que induzca la producción por parte de dicha progenie de células madre neurales multipotentes de dichas células hematopoyéticas, en la que dicho ambiente es un ambiente ex vivo.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha progenie de células madre multipotentes se deriva de tejido neural humano.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se deriva de tejido adulto, juvenil o fetal.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se deriva de tejido neural seleccionado de entre el grupo que consiste en córtex cerebral, lóbulo frontal, cono medular, hipotálamo, cerebelo, cerebro medio, bulbo raquídeo, médula espinal, líquido cerebroespinal y tejidos que rodean a los ventrículos del SNC.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se deriva de dicho mamífero.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que previamente a la administración en dicho sistema circulatorio de un mamífero, dicha progenie de células madre neurales multipotentes se modifica genéticamente.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicho mamífero presenta un defecto genético que afecta a uno o más tipos celulares hematopoyéticos y dicha progenie de células madre neurales multipotentes se modifica genéticamente para tratar dicho defecto genético.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes se deriva de un donante alogénico o de un donante xenogénico.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha progenie de células madre neurales multipotentes comprende una población enriquecida en células madre neurales multipotentes, en la que dicha población enriquecida en células madre neurales multipotentes comprende por lo menos 1% de células madre neurales multipotentes.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que dicha población enriquecida en células madre neurales multipotentes comprende por lo menos 10% de células madre neurales multipotentes.

14. Composición para generar nuevas células hematopoyéticas en un paciente, comprendiendo dicha composición una cantidad de una población enriquecida en células madre neurales multipotentes, excluyendo las células madre embrionarias, siendo dicha cantidad una cantidad efectiva para generar células hematopoyéticas en un mamífero que recibe dicha cantidad, factores de crecimiento hematopoyético y una solución fisiológica.

15. Composición según la reivindicación 14, que comprende aproximadamente 10^{2} a 10^{7} células precursoras por kilogramo de peso corporal de dicho paciente.

16. Forma de dosificación para generar nuevas células hematopoyéticas en un paciente, que comprende un dispositivo que contiene la composición según la reivindicación 14, en la que dicho dispositivo resulta adecuado para administrar dicha composición al sistema circulatorio de un paciente.

17. Forma de dosificación según la reivindicación 16, en la que dicho dispositivo comprende una jeringa o una bolsa para la inyección intravenosa.