ES2255180T3

ES2255180T3 - Celulas modificadas geneticamente que expresan proteinas morfogeneticas oseas.

Info

Publication number: ES2255180T3
Application number: ES98945924T
Authority: ES
Inventors: Ioannis Moutsatsos; Dan Gazit; Yoram Zilberman; Gadi Turgeman
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Genetics Institute LLC
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Genetics Institute LLC
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-09-04
Also published as: PT1007559E; JP2001514026A; AU9306298A; DE69832989T2; AU752556B2; EP1007559A1; ATE314390T1; US20020102728A1; CA2301882A1; EP1007559B1; DK1007559T3; US20110111505A1; WO1999011664A1; DE69832989D1; MXPA00002318A

Abstract

Método para la producción de células destinadas a la implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: (a) transformar una célula madre mesenquimática humana cultivada con un ADN que codifica la proteína 2 ósea morfogenética (BMP-2); y (b) cultivar la célula madre mesenquimática humana transformada en la etapa (a), mediante la cual las células producidas expresan a BMP-2 y son adecuadas para su implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano.

Description

Células modificadas genéticamente que expresan proteínas morfogenéticas óseas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de células modificadas genéticamente para producir citocinas. Más específicamente, la presente invención se refiere a los métodos de transformación de células con ADNc que codifican factores de crecimiento de transformación de la superfamilia TGF-\beta de proteínas, que son útiles para el tratamiento de enfermedades tales como la osteoporosis y la osteoartritis.

Antecedentes de la invención

Durante la reparación de la fractura, las células madre pluripotentes (progenitores osteógenos) se diferencian en osteoblastos y forman callo. Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son conocidas por iniciar la diferenciación de las células precursoras del cartílago y del hueso y por producir la formación ósea. Hasta la fecha, no existe una terapia eficaz para las fracturas que cicatrizan con dificultad (fracturas no consolidadas). Se ha intentado la terapia génica con varias células tratadas con genes. Sin embargo, no existe actualmente ningún método conocido mediante el cual las células que son potencialmente sensibles a los BMP puedan utilizarse para la administración del factor de crecimiento a receptores de señalización de las células trasplantadas (efecto autocrino) y las células madre precursoras del anfitrión (efecto paracrino) para el trasplante, la diferenciación y la estimulación de nuevo crecimiento óseo.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos que comprenden la transformación de las células con factores de crecimiento que codifican el ADNc que son útiles para el tratamiento de enfermedades tales como osteoporosis y la osteoartritis, así como para el tratamiento de fracturas, particularmente fracturas difíciles de cicatrizar, tales como las fracturas no consolidadas. En formas de realización concretas, los métodos comprenden la transformación de las células con ADNc que codifica uno o más factores a partir de la superfamilia de proteínas del factor beta transformante del crecimiento (TGF-\beta). La superfamilia TGF-\beta incluye las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), los factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y otras proteínas relacionadas estructuralmente que se describen con más detalle en la presente memoria. En otras formas de realización, la presente invención comprende células que han sido transformadas con ADNc que codifica los factores de crecimiento, tales como las proteínas de la superfamilia TGF-\beta y métodos de tratamiento de pacientes mediante implante de dichas células. Las células útiles en la presente invención pueden ser células madre humanas, así como líneas celulares cultivadas y células madre de la médula ósea. En las formas de realización preferidas, las células han sido transformadas con ADNc que codifica una o más BMP o GDF. En algunas formas de realización preferidas, las células que sirven de huésped en la invención contienen receptores endógenos unidos a la membrana que son capaces de unirse a las BMP o a las GDF. Muchas líneas celulares son conocidas y están disponibles públicamente. Éstas incluyen, por ejemplo, osteosarcoma U 2-OS. Otras líneas celulares que son conocidas por expresar receptores de BMP pueden también utilizarse. En otras formas de realización preferidas, las células contienen receptores endógenos unidos a la membrana que se unen a proteínas que han estado implicadas en la formación de tejido óseo, de cartílago y de otros tejidos conectivos. Éstos incluyen receptores para la hormona del paratiroides, el péptido relacionado con la hormona del paratiroides, cadherinas, activina, inhibina, genes de hedgehog, IGF, factor de crecimiento de fibroblastos y OGP.

En otras formas de realización preferidas, las células que sirven como huésped pueden transformarse con ADN que codifica tanto a un factor de crecimiento, tal como una BMP o una GDF, como una proteína del receptor unido a la membrana, tal como una proteína del receptor BMP, otra proteína del receptor TGF-\beta, receptor de la hormona del paratiroides, proteína del receptor cadherina u otra proteína receptora relacionada. En una forma de realización concreta, las células pueden transformarse con una secuencia de ADN que codifica una versión truncada del factor de crecimiento y/o la proteína receptora unida a la membrana. Este factor de crecimiento truncado debería conservar preferentemente su actividad biológica y la proteína receptora truncada conservaría preferentemente el dominio de unión al ligando. Las células huésped adecuadas para su utilización en la presente invención incluyen las líneas celulares y las células primarias, así como cualquier célula que pueda ser cultivada y manipulada in vitro y/o in vivo, particularmente por la introducción de varios genes en las células.

Una de las ventajas de la presente invención consiste en que se aprovechan ambos efectos paracrino y autocrino: p. ej., los efectos de los factores transformados en la diferenciación del medio celular circundante, así como los efectos del medio celular en el aumento de la expresión de los factores transformados.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 6 presentan resultados que demuestran el efecto dependiente de la dosis de rhBMP-2 administrada por vía general sobre la fuerza muscular, el volumen trabecular del hueso (TBV), la diferenciación de CFU-f y las características celulares. Se trataron ratones viejos con rhBMP-2 administrados por vía general [(i.p.) 0,5, 1,0 \mug/día, 20 d]. La Figura 1 presenta los resultados de una prueba de agarre de fuerza muscular. La Figura 2 presenta la producción ósea mediante el volumen óseo trabecular femoral (TBV). La Figura 3 presenta la diferenciación osteoblástica de CFU-f representada por la histoquímica de fosfatasa alcalina (ALP). La Figura 4 presenta la proliferación celular de CFU-f representada por BrdU. La Figura 5 presenta la apoptosis celular de CFU-f representada por la tinción con DAPI. La Figura 6 presenta la apoptosis celular de las células CFU-f representadas por tinción con Annexin V-FITC y PI. La Figura 7 presenta el efecto de BMP-2 por infección adenovírica: índice de eficacia de la infección [Figura 7A]; aumento de la proliferación [Figura 7B]; disminución de la apoptosis [Figura 7C] y aumento de la diferenciación osteoblástica [Figura 7D]. Las Figuras 8 a 10 presentan los análisis de densidad de fluorescencia por densitometría e histomorfométricos de las fisuras rellenas con esponja de colágeno impregnada con BMP-2, líneas celulares C3H, CHO y T5. La Figura 8 presenta la densitometría por rayos X en defectos segmentarios. La Figura 9 presenta la densidad de fluorescencia relativa. La Figura 10 presenta el área de tejido calcificado total.

Descripción detallada de la invención

Entre las moléculas de ADN útiles en la presente invención están las que comprenden las secuencias de codificación de una o más de las proteínas BMP BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, dadas a conocer por ejemplo en las patentes de Estados Unidos nº 5.108.922; nº 5.013.649; nº 5.116.738; nº 5.106.748; nº 5.187.076 y nº 5.141.905; BMP-8, dadas a conocer en la publicación PCT WO 91/18098; y BMP-9, dada a conocer en la publicación PCT WO 93/00432, BMP-10, dada a conocer en la solicitud PCT WO 94/26893; BMP-11, dada a conocer en la solicitud PCT WO 94/26892 o BMP-12 o BMP-13, dadas a conocer en la solicitud PCT WO 95/16035, o BMP-15, dada a conocer en la solicitud PCT WO 96/36710 o BMP-16, dada a conocer en la solicitud de patente pendiente de trámite número de serie 08/715/202, presentada el 18 de septiembre de 1996.

Otras moléculas de ADN que también pueden ser útiles incluyen las que codifican Vgr-2 y cualquiera de los factores de crecimiento y diferenciación [GDF], incluyendo los descritos en las solicitudes PCT WO 94/15965; WO 94/15949; WO 95/01801; WO 95/01802; WO 94/21681; WO 94/15966; y otras. También pueden ser útiles en la presente invención BIP, dada a conocer en el documento WO 94/01557; y MP52, dada a conocer en la solicitud PCT WO 93/16099.

Otras moléculas de ADN que pueden ser útiles, además del ADN que codifica una proteína BMP, incluyen las moléculas de ADN que codifican otros agentes terapéuticamente útiles incluyendo los factores de crecimiento tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento transformante (TGF-\alpha y TGF-\beta), las proteínas hedgehog tal como hedgehog sónica, india y del desierto, la hormona paratiroides y la hormona paratiroides relacionada con péptidos, cadherinas, activinas, inhibinas e IGF, FSH, proteínas frizzled, frzb o frazzled, PDGF y otros factores de crecimiento endoteliales, proteínas de fijación a BMP tales como chordina y fetuina, estrógeno y otros esteroides así como versiones truncadas de los mismos y factores de transcripción tales como las proteínas wnt, genes mad y cbfa.

Entre los receptores que pueden ser útiles para la cotransfección en la presente invención están los diversos receptores BMP y TGF-\beta conocidos, tal como ALK-1 hasta ALK-6, y sus especies de contrapartida, particularmente humanas, también como receptores para la hormona del paratiroides, la hormona del paratiroides relacionada con péptidos, cadherinas, activina, inhibina, genes de hedgehog, IGF, FGF, OGP, PDGF, factores de crecimiento endotelial, proteínas frizzled, estrógeno, hormona estimulante del folículo y otros receptores esteroides. Por lo tanto, la célula huésped puede transformarse con una o más secuencias de ADN que codifican dicha proteína receptora. En una forma de realización particular, la célula puede transformarse con una o más secuencias de ADN que codifican una forma truncada de las proteínas receptoras anteriores. Es preferible que la forma truncada conserve el dominio de unión al ligando, pero que excluya el dominio unido a la membrana, produciendo la expresión de una proteína receptora segregada.

En una forma de realización preferida, las células que se transforman son líneas celulares cultivadas, aunque también pueden utilizarse células primarias. Las líneas celulares pueden presentar particularmente ventajas porque sean fáciles de manipular in vitro, particularmente para la introducción de varios genes en las células. Las líneas celulares presentan también ventajas porque crecen relativamente con rapidez y es relativamente fácil conseguir un número elevado de células. En una forma de realización particular, las líneas celulares pueden revestirse con alginato u otros materiales adecuados, o si no pueden tener bloqueada su antigenicidad, a fin de reducir o impedir la reacción con los linfocitos T. Entre las líneas celulares humanas que contienen receptores de BMP, y que pueden preferirse para su utilización como células huésped en la presente invención están TIG-3-20 (fibroblasto pulmonar), SF-TY (fibroblasto de la piel), HUO-3N 1 (osteosarcoma), NB-1 (neuroblastoma), HepG2 (hepatocarcinoma), NC65 (adenocarcinoma de riñón), TMK-1 (adenocarcinoma de estómago), PC3 (adenocarcinoma de próstata), ABC-1 (adenocarcinoma pulmonar), COLO201 (adenocarcinoma de colon) [Iwasaki et al. J. Biol. Chem., 270:5476 (1995)]; U2-OS osteosarcoma (Lind et al., Bone 18:53 (1996)); NG108-15 (neuroblastoma) (Perides et al. J. Biol. Chem. 269:765 (1994)); HOBIT (osteoblástico) (Zheng et al., J. Cell Physiol. 159:76 (1994)); Saos-2 y HOS (osteosarcomas), HaCaT (queratinocito) (Nissinen et al., Exp. Cell. Res., 230:377 (1997)); AG1518 (fibroblasto del prepucio) y Tera-2 (teratocarcinoma) (ten Dijke et al., J. Biol. Chem. 269:16985 (1994)); TE85 (osteosarcoma) (Malpe et al., BBRC 201:1140 (1994)); y HepG2 (hepatocarcinoma) (Song et al., Endocrin. 136:4293 (1995)). Se ha demostrado que las células primarias humanas que presentan receptores de BMP y que pueden preferirse para su utilización como células huésped en la presente invención incluyen las células de la médula ósea (Cheng et al., Endocrin, 134:277 (1994)); osteoblastos (Lind et al., Bone 18:53 (1996)); células de ligamento (Kon et al., Calcif. Tissue Int., 60:291 (1997)); células embrionarias y queratinocitos (Nissinen et al., Exp. Cell Res., 230:377(1997)); monocitos, neutrófilos y fibroblastos (Postlethwalte et al., J. Cell Physiol. 161:562 (1994), Cunningham et al., PNAS 89:11740 (1992); y hepatocitos (Song et al., Endocrin. 136:4293 (1995)). Además, se conocen y pueden utilizarse en la presente invención muchas otras líneas celulares humanas y no humanas y células primarias. Con fines veterinarios, se prefieren las líneas celulares y las células primarias de las mismas especies.

En la presente invención, los vectores utilizados para la incorporación y expresión del ADN son preferentemente de origen vírico, particularmente adenovirus, así como retrovirus. Los adenovirus presentan ventajas porque no requieren células en estado de proliferación y tienen una gran eficacia de infección tanto in vitro como in vivo, mientras que los retrovirus son con más frecuencia adecuados para la infección in vitro. Los adenovirus ofrecen también niveles elevados de expresión transgénica y la capacidad de conseguir altos títulos. Estas ventajas hacen más adecuados a los adenovirus para células primarias, líneas celulares y transducción directa in vivo. Además, la expresión del transgén es temporal y el vector adenovírico no se integra en el genoma de la célula, haciendo más seguros los vectores para su utilización. Todas las generaciones de adenovirus recombinantes son adecuadas, incluyendo la presente generación (E1 eliminado) y las nuevas generaciones que han reducido la antigenicidad (virus E1, E3, E4 eliminados o E1, E4 eliminado y E3 sobreexpresado), Smith (1995); Dunbar (1996); Roemer (1992); Graham (1991); Kozarsky (1993) e Ilan (1997).

La expresión de los genes que se expresan en la presente invención puede se constitutiva o controlada. El control de la expresión puede conseguirse mediante control externo por medio de elementos reguladores, tal como con un activador induciblemente controlado, por ejemplo, un activador controlado por tetraciclina, como se describe con más detalle en la presente memoria o utilizando elementos reguladores procedentes de genes específicos del tejido o específicos temporalmente para dirigir la expresión únicamente a determinadas series de reacciones de diferenciación especificadas o a determinadas etapas en la diferenciación. Por ejemplo, el activador de osteocalcina puede utilizarse para la producción en las últimas etapas de formación de hueso y calcificación.

Los métodos de la presente invención pueden ser útiles para la regeneración del tejido de varios tipos, incluyendo el tejido óseo, cartílago, tendones, ligamentos, muscular, piel y otros tejidos conectivos, así como tejidos nervioso, cardíaco, hepático, pulmonar, renal, pancreático, cerebral y de otros órganos. Además, los métodos de la presente invención podrían utilizarse para producir la diferenciación y/o regeneración de otros tipos de tejido, incluyendo en el nivel embrionario en la producción de desarrollo epidérmico, endodérmico y mesodérmico.

En algunas formas de realización, las células de la presente invención pueden administrarse en combinación con una matriz apropiada, por ejemplo, para soportar la composición y proporcionar una superficie para el crecimiento del tejido óseo, cartílago, muscular, nervioso, epidérmico y otros tejidos conectivos. La matriz puede estar en forma de biomateriales de matriz tradicional. La matriz puede proporcionar la liberación lenta de la proteína expresada y las células diferenciadas y/o el medio apropiado para la presentación de las mismas. En algunas formas de realización, es de esperar que varias proteínas colágenas y no colágenas se regulen por aumento y se segreguen desde las células madre multipotentes. Este fenómeno acelera la regeneración del tejido aumentando la deposición de la matriz. Las proteínas de la matriz pueden también expresarse en las células modificadas genéticamente y aumentar el trasplante y fijación de las células trasplantadas en el área del trasplante. Por ejemplo, la expresión de proteínas de integrina o proteínas con filamento de actina pueden ayudar a dicho trasplante. Jones (1996).

La selección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de la interfase. La aplicación concreta de las composiciones celulares definirán la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y químicamente definidas por sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatito, ácido poliláctico y polianhídridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y bioquímicamente bien definidos, tal como el hueso o el colágeno dérmico. Matrices adicionales están compuestas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tal como hidroxiapatito sinterizado, bioglas, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones de algunos de los tipos de material mencionados anteriormente, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatito o colágeno y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden ser alteradas en composición, tal como en aluminato-fosfato de calcio y tratamiento para alterar el tamaño del poro, el tamaño de partícula, la forma de la partícula y la biodegradabilidad.

La invención, en algunas de sus formas de realización, se ilustra mediante los ejemplos siguientes. Los ejemplos no son limitativos. Como apreciarán los expertos en la materia, están disponibles muchas variaciones y combinaciones de los ejemplos siguientes. Estas combinaciones y variaciones constituyen una parte de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión in vivo de BMP-2 en células C.9 bajo activador inducible

Se generaron células C3HBAG\alpha infectando células C3H10T1/2 con retrovirus BAG\alpha que codifica \beta-galactosidasa.

Para determinar los efectos de la expresión regulada de BMP-2 bajo el control del activador inducible Tet, mediante tetraciclina, en células C.9 in vivo, las células C.9 se transformaron con un vector en el que el ADNc para BMP-2 se expresó bajo el control del activador inducible Tet y las células C.9 se transplantaron en el músculo abdominal, una zona no regenerativa. Las células se localizaron en el músculo por tinción histoquímica X-gal, después de 10, 21 y 31 días (secciones congeladas). Se utilizó doxiciclina (Dox) como análogo de tetraciclina y se administró P.O. No se administraron ciclosporina ni ningún otro fármaco inmunosupresor.

Resultados

Se desarrollaron trasplantes de C.9 en el músculo en el interior del hueso y del cartílago ectópicos recién formados, en animales (-Dox) (sin tratamiento con Dox generalizado). Se observaron el cuello del hueso y el cartílago en el trasplante (día 10), distante del músculo del anfitrión. El día 21, se observaron el hueso trabecular prominente, el cartílago y la médula ósea distantes y adyacentes al músculo del anfitrión. El día 31, se observó el hueso trabecular prominente (sin cartílago) en el centro del trasplante. En los animales (+Dox) (tratados de forma general con Dox), solamente se formó tejido mesenquimático (conectivo) en los trasplantes (no se observó hueso ni cartílago). El tamaño del trasplante y la radiopacidad fue mayor en los animales (-Dox) en comparación con los animales (+Dox).

Se observaron células positivas a \beta-gal en las células trasplantadas, formación de hueso y cartílago (origen del donante), en ratones (-Dox). El día 11, se observó mayor número de células positivas a \beta-gal, localizadas en el hueso (osteoblastos) recién formado del trasplante, cartílago (condrocitos) y tejido mesenquimático circundante. El día 21, las células positivas a \beta-gal se localizaron en las trabéculas (osteoblastos) de hueso recién formado y en el cartílago hipertrófico (condrocitos). Después de 31 días, no se observaron células positivas en animales (+Dox), las células positivas a \beta-gal no se detectaron en los animales (+Dox).

Conclusiones

Un "sistema de diferenciación recíproco" es muy eficaz no solamente en una zona de regeneración (defecto segmentario), sino en una zona no regenerativa también, por ejemplo, trasplantes i.m. (intramusculares) de células madre multipotentes que sobreexpresan BMP-2 (expresión inducible). La combinación de células madre multipotentes y la expresión de BMP-2 (sistema de diferenciación recíproco compuesto por los efectos autocrino y paracrino de BMP) aumenta un proceso de diferenciación significativamente en las células madre multipotentes trasplantadas. Utilizando este sistema, las células trasplantadas se diferencian en el hueso y cartílago (como se muestra con la expresión de \beta-gal). El sistema descrito presenta la ventaja de que la proteína BMP-2 está siendo producida in vivo, libera el gen de interés (con fines de terapia génica) y permite a las células madre multipotentes diferenciarse en la dirección requerida (en zonas de regeneración y de no regeneración). Dicho sistema de diferenciación recíproco, que presenta un aumento del potencial de diferenciación de las células madre multipotentes, es un sistema eficaz y factible que permite la identificación de nuevas actividades biológicas de las citocinas tanto nuevas como conocidas.

Ejemplo 2 Expresión in vitro e in vivo de BMP-2 en células C.9

Para determinar la expresión regulada de BMP-2 bajo el control del activador inducible Tet, mediante tetraciclina, y su efecto sobre las células C.9 tanto in vitro como in vivo, se generaron células C.9 por transfección de células C3HBAG\alpha con el montaje rhBMP-2 que contiene un activador Tet regulado. La expresión de \beta-gal in vitro se determinó por coloración histoquímica con X-gal e inmunofluorescencia. La expresión de BMP-2 in vitro fue determinada por inmunohistoquímica.

Se trasplantaron células C.9 en un defecto segmentario de 3 mm. Las células se localizaron en la gab mediante coloración histoquímica de X-gal, tras una semana. Las células C.9 se trasplantaron también al músculo abdominal (zona no regenerativa). Las células se localizaron en el músculo mediante coloración histoquímica de X-gal, después de 10 días (secciones congeladas). Se utilizó doxiciclina (Dox) como análogo de tetraciclina para la administración in vitro e in vivo (inyecciones i.p. y administración oral).

Resultados

Se demostró que la expresión in vitro de \beta-gal no estaba afectada por el tratamiento con Dox, in vitro. Aproximadamente el 50% de las células expresan a \beta-gal. La expresión de BMP-2 in vitro, se demostró que estaba regulada por el tratamiento con Dox. Se demostró que las células C.9 sobreviven mejor en espacio con defecto segmentario sin la presencia de Dox. Los trasplantes de C.9 en el músculo eran capaces de desarrollarse en hueso ectópico recién formado, sin el tratamiento de Dox. Solamente con el tratamiento de Dox, se formó tejido conectivo blando sin señal alguno de formación ósea. Se observaron células positivas a \beta-gal en el área del trasplante (incluyendo partículas óseas) solamente en ausencia de Dox. No se detectaron células positivas en el trasplante en presencia de Dox.

Conclusiones

La doxiciclina puede regular la expresión in vitro de BMP-2 y afectar a la supervivencia de las células C.9 y la producción ósea in vitro.

Ejemplo 3 Trasplantes in vivo de linfocitos T5

Para probar la hipótesis de que los linfocitos T5 pueden sobrevivir, producen BMP-2 y se diferencian en osteoblastos in vivo, dando como resultado el aumento de cicatrización de los defectos segmentarios del hueso, se montaron linfocitos T5 en esponjas de colágenos y se trasplantaron a defectos segmentarios (2,5 mm, 3 mm y 3,5 mm) en el radio de ratones C3H. (C3H10T1/2 BAG\alpha y C3H10T1/2 WT, colágeno solamente y el defecto segmentario sirvieron únicamente como referencias negativas. La proteína BMP-2 (3-10 \mug) humana producida de forma recombinante sirvió como referencia positiva). Se localizaron in vivo linfocitos T5 (y C3h BAG\alpha) mediante tinción histoquímica de X-gal para \beta-gal (secciones congeladas). La expresión de \beta-gal y BMP-2 se localizaron conjuntamente mediante la primera tinción histoquímica de \beta-gal realizada y la segunda tinción inmunohistoquímica de BMP-2 realizada o por doble inmunofluorescencia (secciones congeladas). La cicatrización de la fractura se evaluó por histología, fotografías de rayos X, densitometría de rayos X informatizada y densitometría de fluorescencia informati-
zada.

Resultados

Los trasplantes de linfocitos T5 han demostrado un aumento de radiopacidad en los rayos X desde dos semanas en adelante e incluso llenando del defecto a las 6 semanas. Se han localizado linfocitos T5 en el área de la fisura a diferentes tiempos, en la esponja trasplantada y en el hueso último recién formado y en las células osteoprecursoras. Se ha demostrado que los linfocitos T5 producen BMP-2 in vivo. Los grupos de referencia negativos presentan pérdida de cicatrización (colágeno solamente y defecto segmentario solamente o cicatrización reducida en C3H BAG\alpha y WT en comparación con los linfocitos T5).

Los implantes de BMP-2 (proteína/esponja) formaron hueso ya a las dos semanas después del implante. El hueso nuevo estaba compuesto por trabéculas óseas y médula ósea grasa. Los rayos X y la densitometría de fluorescencia informatizada demuestran cuantitativamente los resultados mencionados en los apartados anteriores.

Conclusiones

La capacidad de los linfocitos T5 tanto para producir BMP-2 como para diferenciarse (in vitro) y localizar un hueso recién formado (in vivo), se correlaciona con aumento de capacidad del trasplante de T5 para remediar los defectos segmentarios.

Ejemplo 4 Infección adenovírica y retrovírica del cultivo primario

Para determinar la eficacia de la administración del gen en las células osteoprogenitoras de la médula se realizaron experimentos preliminares con adeno/retrovirus con el montaje LacZ. Las células osteoprogenitoras de médula se cultivaron, ex vivo (en cultivo cfu-f). Los cultivos se infectaron (in vitro) con BAG\alpha de retrovirus recombinante que codifica el gen LacZ (\beta-gal) y E1-LacZ adenovírico. Se detectaron células infectadas con tinción histoquímica de X-gal para \beta-gal.

Resultados

Se consiguieron grandes cantidades de infecciones en infecciones tanto adenovíricas como retrovíricas. Sesenta y cinco a noventa por ciento [65 a 90%] de las células han expresado \beta-gal.

Conclusiones

Los experimentos anteriores demostraron que las células osteoprogenitoras de la médula pueden modificarse genéticamente para expresar los genes y pueden utilizarse en terapia génica en los huesos. Pueden expresarse varios genes, entre ellos las citocinas y los factores de crecimiento tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y otros miembros de la superfamilia de proteínas factor de crecimiento de transformación beta (TGF-\beta). Dichos genes pueden administrarse mediante retrovirus ex vivo o mediante adenovirus para transformación ex vivo o in vivo.

Ejemplo 5 Actividad autocrina en el sistema de diferenciación recíproco

Se transformaron linfocitos 10T con ADN que codifica BMP-2 y receptor de la hormona del paratiroides (PTHR). Se completaron varios implantes que indican que 10T que sobreexpresan a BMP-2 construyen cartílago y hueso. Sin embargo, las células que sobreexpresan tanto a BMP-2 como a PTHR evidenciaron solamente la formación del cartílago sin ninguna formación de hueso observada. Esta formación de cartílago se cree que es debida a los efectos de BMP-2 al influir en la unión de la hormona del paratiroides a su receptor, por lo tanto un efecto autocrino. Las células pueden asimismo ser manipuladas para expresar receptores de BMP-2 inducibles. En dicho sistema, la actividad autocrina de dichas células puede alterarse drásticamente y/o controlarse para ejercer un efecto biológico deseado.

Ejemplo 6 Efectos generales de BMP-2 en ratones osteoporósicos adultos

Para probar el efecto in vivo de BMP-2 en células osteoprogenitoras de médula ósea (CFU-f), compartimento óseo trabecular y capacidad física en ratones osteoporósicos, ratones BALB/c macho de 24 meses recibieron administración general de rhBMP-2 a razón de 0,5 \mug/ratón/día i.p. durante 20 días. Se inyectaron 200 \mul de BSA/PBS al 0,1% a un grupo de referencia. Se marcaron los ratones con Calcehína verde (2,5 mg/kg) siete días y dos días antes del sacrificio para morfometría ósea fluorescente. La histomorfometría ósea de la tibia y de los fémures se realiza utilizando secciones histológicas de plástico y de parafina. La histología de los órganos internos, incluyendo el hígado, el bazo, el riñón y los testículos, se realiza mediante secciones de parafina (tinción H&E). Se realizan ensayos de psicobiología para la determinación de la capacidad física, comportamiento y actividad utilizando sistemas informatizados con control por vídeo para controlar una prueba de agarre. Prueba de campo abierto y de laberinto en agua.

Resultados

En las Figuras 1 a 6, se presentan los resultados que demuestran el efecto dependiente de la dosis de rhBMP-2 administrado de forma generalizada sobre la fuerza muscular, el volumen trabecular del hueso, la diferenciación de CFU-f y las características celulares. Los órganos internos no se afectaron. Sin embargo, se notó aumento de la espermatogénesis testicular.

La prueba "de agarre" puso de manifiesto una disminución significativa del tiempo (aproximadamente tres veces) en los ratones tratados con BMP-2 (véase el gráfico). Las pruebas de "campo abierto" y de "laberinto en agua" no pusieron de manifiesto diferencias significativas en el comportamiento de los ratones. Los resultados de la prueba de agarre demuestran claramente que los ratones osteoporósicos más viejos inyectados de forma generaliza con rhBMP-2 presentan aumento de la potencia física. Esta es la primera indicación de que BMP-2 presenta efecto generalizado en los músculos de los ratones viejos, un modelo para la osteoporosis. Estos experimentos excluyen cualquier efecto general negativo de BMP-2 en el SNC (ningún efecto desfavorable en el comportamiento, memoria, etc.).

Ejemplo 7 Infección adenovírica y retrovírica de cultivos primarios

Para probar los efectos in vitro de BMP-2 sobre cultivos primarios en la presente invención, células de estroma de médula ósea recubiertas procedentes de fémur y tibia (CFU-f) se colocaron en placas en MEM-\alpha enriquecido con FCS al 10% y 100 \mu/ml de Pen/Strep en placas de 35 mm a una densidad de 10^{6} células/placa y se infectaron con (1) retrovirus BAG\alpha que codifica el gen LacZ; (2) adenovirus que codifica LacZ; o (3) adenovirus que codifica a rhBMP-2. Las células CFU-f transfectadas se cultivaron in vitro durante un periodo de 12 días con cambio de medio y enriquecimiento para mineralización dos veces a la semana. Se ensayó en CFU-f la histoquímica con fosfatasa alcalina (ALP), la proliferación (BrdU) y la apoptosis (DAP1).

La infección retrovírica alcanzó una eficacia de infección de aproximadamente 65 a 70% y el adenovirus consiguió más del 90% de eficacia de infecciones. Además, la infección adenovírica con BMP-2 alteró la grasa de las células del estroma de la médula y las características celulares, aumentando la diferenciación osteoblástica (ALP), aumentando la proliferación y disminuyendo la apoptosis [Figuras 7A-D].

Estos experimentos demuestran que las células del estroma de la médula son anfitriones adecuados para la transfección in vitro con vectores adenovíricos y pueden servir como células huésped para su utilización en el sistema de diferenciación recíproca de la presente invención.

Ejemplo 8 Efectos del sistema autocrino/paracrino comparados con el efecto paracrino

Se transplantaron las líneas celulares siguientes en un defecto segmentario radial (2,5 mm) en ratones: linfocitos T5 (células C3H10T1/2 que coexpresan a \beta-gal y rhBMP-2); C3H BAG\alpha (células C3H10T1/2 que expresan solamente a \beta-gal); y células CHO que sobreexpresan a rhBMP-2. Además, se transplantaron los ratones con excipiente solamente (esponja de colágeno) como referencia negativa.

En este sistema los linfocitos T5 representan tanto el efecto paracrino como el autocrino: las células CHO, que no son osteógenas y no pueden diferenciarse en la serie de reacciones osteogénicas, representan únicamente el efecto paracrino. El efecto paracrino puede estimarse mediante la secreción de rhBMP-2 en el medio. Se observó in vitro que los linfocitos T5 segregan 5 ng de rhBMP-2 activo/día/10^{7} células y que las células CHO segregan 840 ng de rhBMP-2 activo/día/10^{7} células, lo que significa que las células CHO segregan 160 veces más BMP-2 que los linfocitos T5 y por consiguiente presentan efectos paracrinos mayores que los linfocitos T5.

Los resultados cuantitativos de la curación con separación representados en la densitometría por rayos X, fluorescencia y gráficos de morfometría, demostraron claramente que los linfocitos T5 presentaban puntuaciones mayores en todos los parámetros que las células CHO después de 6 a 8 semanas y de este modo presentaban un potencial terapéutico mayor que CHO [Figuras 8 a 10]. Los resultados superiores obtenidos por los linfocitos T5 no pueden atribuirse al efecto paracrino únicamente, ya que las células CHO presentan un efecto potencial paracrino significativamente mayor que los linfocitos T5. Por consiguiente se concluye que el efecto autocrino de la expresión de rhBMP-2 sobre los propios linfocitos T5 desempeño una función significativa en estos resultados. Los linfocitos T5 se presentan in vitro para diferenciar espontáneamente a osteoblastos: in vivo, se presentan para expresar rhBMP-2 y presentan la morfología de osteoblastos diferenciados (inmunofluorescencia doble).

La prueba adicional de la importancia del efecto autocrino se demuestra mediante trasplantes de células
(C3H10T1/2) de 2 líneas celulares que expresan a rhBMP-2 de la misma manera, sin embargo una de las líneas celulares está además transfectada para sobreexpresar el receptor PTH/PTHrP. La sobreexpresión del receptor PTH/PTHrP inhibió el efecto autocrino de las últimas etapas de diferenciación de las células y por lo tanto representa principalmente el efecto paracrino. En los trasplantes de músculo in vivo, el cartílago heterolópico en exceso y el hueso se forman en la célula que expresa únicamente a rhBMP-2. Sin embargo, en la célula que expresa el receptor tanto de rhBMP-2 como de PTH/PTHrP, solamente el tejido conectivo denso y los islotes pequeños de cartílago se formaron. Como el efecto paracrino de estas dos líneas celulares es de esperar que sea el mismo, es la diferencia en los efectos autocrino la que es principalmente responsable de los resultados alterados en la formación y diferenciación ósea.

La ventaja más importante de los efectos paracrino y autocrino combinados es la introducción de los elementos sensibles, es decir, las propias células, en el área en el que se está produciendo la proteína transgénica deseada. Todas las proteínas terapéuticas ejercen su efecto sobre las células diana que responden a ellas, e inician un efecto biológico. Las BMP y otros factores de crecimiento inductivos del hueso actúan, principalmente sobre las células precursoras del estroma presentes en el medio de la médula ósea. Para presentar un efecto paracrino eficaz con estas proteínas, se requiere la presencia de cantidades significativas de células osteoprogenitoras. Sin embargo, en defectos segmentarios grandes, la masa de hueso significativa es insuficiente, así como en la osteoporosis, en la que el hueso carece de células madre (Kahn 1995). En estas condiciones, se ha demostrado que la capacidad para responder a BMP y otros factores de crecimiento del hueso es reducida debido al número reducido de sensibilidad de las células madre a las proteínas osteoinductoras. Fleet et al., Endocrinology, 137:4605-4610 (1996). Por consiguiente, las ventajas del sistema de diferenciación recíproco descritas en la presente memoria se basan en los efectos paracrino y autocrino combinados que permiten a las células modificadas genéticamente participar activamente en los procesos de cicatrización y regeneración.

Ejemplo 9 Efectos in vitro e in vivo In vivo A. Líneas celulares

(1) Se generaron células C3H BAG\alpha inyectando células C3H10T1/2 con retrovirus BAG\alpha que codifica a \beta-galactosidasa.

(2) Se generaron linfocitos T5 (T5-B2C-BAP) mediante células transfectadas de C3H10T1/2 con el montaje rhBMP-2, que codifican el ADNc de BMP-2 humano bajo el control del activador SV40 e infección adicional con retrovirus BAG\alpha que codifica a \beta-galactosidasa.

(3) Se generaron células CHO-rhBMP-2 transfectando las células CHO (DUKX) con el montaje rhBMP-2 solamente. Las células se cultivaron en DMEM enriquecido con suero de ternero fetal al 10%, L-glutamato 2 mM y 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina.

B. Ensayos de diferenciación

(1) Fosfatasa alcalina para fenotipo osteoblástico, aceite rojo O y alcian azul para grasa y fenotipos de cartílago.

(2) Se determinó la expresión de BMP-2 por transferencia northern. Inmunohistoquímica y bioanálisis utilizando células W-20-17.

(3) Se demostró la localización conjunta de BMP-2 y \beta-gal por inmunofluorescencia doble.

Efectos in vivo

A. Se montaron células 10º de cada línea celular en esponja de colágeno y se trasplantaron a defectos segmentarios (2,5 mm) en ratones C3H/HeN. 16 en cada grupo. Otro grupo de ratones se trasplantó con excipiente de esponja de colágeno solamente. Se implantaron tres ratones con 10 \mug de rhBMP-2 como referencia histológica.

B. Se localizaron linfocitos T5 (y C3H BAG\alpha) in vivo por coloración histoquímica con X-gal para \beta-gal (secciones congeladas).

C. Se localizaron conjuntamente la expresión de \beta-gal y BMP-2 por inmunofluorescencia doble (secciones congeladas).

D. Se evaluó la cicatrización de la fractura cuantitativamente por densitometría informatizada de rayos X, densitometría de fluorescencia informatizada e histomorfometría.

E. Se evaluó la histología por coloración con Masson Trichrom.

Resultados In vitro

A. Se demostró la expresión de rhBMP-2 en linfocitos T5 por transferencia northern e inmunohistoquímica. La cantidad estimada de secreción de rhBMP-2 (por bioanálisis de células W20) se obtuvo que era 5 \pm 2,3 ng/24 horas/10^{7} células en linfocitos T5 y 841,3 \pm 88 ng/24 horas/10^{7} células en células CHO rhBMP-2.

B. Se demostró que las células T5 coexpresan a BMP-2 y \beta-gal en cultivos.

C. Los linfocitos T5 se diferenciaron espontáneamente en osteoblastos incluso sin ningún tratamiento, a diferencia de las células C3H BAG\alpha que se diferencian únicamente en presencia de ascorbato y BMP-2. No se encontraron fenotipos de grasa ni de cartílago.

D. Se obtuvo la expresión de BMP-2 que estaba correlacionada con la diferenciación. T5 diferencia y expresa a BMP-2 in vitro, C3H BAG\alpha sirven de referencia, no expresan a BMP-2 y no se diferencian.

E. Se obtuvo la expresión de \beta-gal al diferenciar los linfocitos T5 que expresan ALP.

In vivo

A. La densitometría por rayos X (densidad media de la cavidad en comparación con la densidad media de Ulna) como parámetro de cicatrización, demostró valores mayores con grupos T5 y CHO-rhBMP-2 en comparación con C3H BAG\alpha y colágeno solamente. Los valores del grupo T5 fueron significativamente mayores que los del grupo CHO-rhBMP-2 a las seis y ocho semanas después del trasplante. Los grupos C3H10T1/2 WT y colágeno solamente no se diferencian entre sí y cada punto de tiempo. El aumento significativo en la relación de densitometría se observó ya tras dos semanas en todos los grupos (excepto el grupo colágeno solamente), que aumentó con el tiempo hasta los valores mayores a las seis semanas (C3H BAG\alpha y colágeno) y a las ocho semanas (T5 y CHO-rhBMP-2).

B. La densidad por fluorescencia (en comparación con el área constante de la corteza de Ulna) puso de manifiesto la cantidad mayor con el grupo T5, estadísticamente significativa cuando se compara a todos los grupos a las cuatro semanas y a las ocho semanas. CHO-rhBMP-2 presentó valores significativamente mayores en el colágeno y C3H BAG\alpha a las cuatro semanas y en colágenos solamente a las ocho semanas. Aunque parece que hubo una disminución en la relación de fluorescencia desde las cuatro semanas hasta las ocho semanas en T5 y CHO-rhBMP-2 y lo contrario en C3H BAG\alpha, no fue estadísticamente significativa.

C. Los grupos T5 y CHO-rhBMP-2 presentaron la cantidad mayor de hueso calcificado recién formado en la cavidad en comparación con los grupos C3H BAG\alpha y colágeno a las cuatro semanas y a las ocho semanas. T5 se diferenció de CHO-rhBMP-2 solamente a las ocho semanas: el colágeno y C3H BAG\alpha no se diferenciaron significativamente. Solamente los grupos de colágeno y T5 fueron significativamente mayores en ocho semanas en comparación con los de cuatro semanas.

D. Histológicamente, en los grupos T5 se puede observar hueso nuevo de nuevo en el área del trasplante. Además, la cicatrización evoluciona mediante la formación ósea del encondroma organizada que rodea los bordes de la cavidad. Todos los demás grupos carecen de algunas señales de formación ósea de nuevo en el área del trasplante y la respuesta del cartílago alrededor del borde de la cavidad está desorganizada y menos calcificada. En el grupo CHO-rhBMP-2, se forma hueso ectópico en exceso (en los músculos circundantes) que es reabsorbido a continuación.

E. Las células T5 y CH3 BAG\alpha se injertan y localizan alrededor de los bordes de la cavidad después del trasplante; tras cuatro semanas, los linfocitos T5 presentan morfología de osteoblastos y expresan a \beta-gal y BMP-2. Una dosis elevada de BMP-2 (10 \mug) fue capaz de guiar el defecto después de ocho semanas, con excesivo hueso trabecular y médula ósea grasa. Sin embargo, el nuevo hueso formado no presentó continuación con los bordes del hueso original que permanecieron intactos.

Ejemplo 10 Ensayo W-20 A. Descripción de las células W-20

La utilización de células W-20 de estroma de médula ósea como indicador de la línea celular se basa en la conversión de estas células en células similares a osteoblastos después del tratamiento con una proteína BMP [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5: 305 (1990); y Thies et al., Endocrinology, 130:1318 (1992)]. Específicamente, las células W-20 son una línea celular de estroma de médula ósea clonal procedente de ratones adultos por autores en el laboratorio del Dr. D. Nathan. Children's Hospital, Boston, MA. El tratamiento de las células W-20 con determinadas proteínas BMP produce (1) aumento de la producción de fosfatasa alcalina, (2) producción de AMPc estimulado por PTH, y (3) producción de síntesis de osteocalcina por las células. Mientras que (1) y (2) representan características asociadas al fenotipo del osteoblasto, la capacidad de sintetizar osteocalcina es una propiedad fenotípica solamente presentada por los osteoblastos maduros. Además, hasta la fecha se ha observado la conversión de células W-20 de estroma en células similares a osteoblastos solamente en el tratamiento con las BMP. De esta manera, las actividades in vitro presentadas por las células W-20 tratadas con BMP se correlacionan con la actividad de formación de hueso in vivo conocida para la BMP. A continuación se describen dos ensayos in vitro útiles en comparación de las actividades de BMP de nuevas moléculas osteoinductoras.

B. Protocolo del ensayo de W-20 con fosfatasa alcalina

Se colocan en placas de cultivo tisular de 96 pocillos células W-20 a una densidad de 10.000 células por pocillo en 200 \mul de medio DME con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10%, glutamina 2 mM y 100 unidades/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células se dejan adherirse toda la noche en una incubadora con 95% de aire y 5% de CO_{2} a 37ºC. Se eliminan los 200 \mul de medio de cada pocillo con una pipeta multicanal y se sustituyen por un volumen igual de muestra de ensayo suministrada en DME con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10%, glutamina 2 mM y 1% de penicilina-estreptomicina. Las sustancias de ensayo se analizan por triplicado. Las muestras de ensayo y los patrones se dejan en periodo de incubación de 24 horas con las células indicadoras W-20. Después de 24 horas, se sacan las placas del incubador a 37ºC y se extrae el medio de ensayo de las células. Las capas de células W-20 se lavan 3 veces con 200 \mul por pocillo de solución salina tamponada con fosfato exenta de calcio y magnesio y se descartan estos lavados. Se añaden 50 \mul de agua destilada a cada pocillo y las placas de ensayo se colocan a continuación en un baño de nieve carbónica/etanol para congelación rápida. Una vez congeladas, las placas de ensayo se sacan del baño de nieve carbónica/etanol y se descongelan a 37ºC. Esta etapa se repite dos veces más hasta un total de 3 procedimientos de congelación-descongelación. Una vez completa, la fosfatasa alcalina unida a la membrana está disponible para la medición. Se añaden a cada pocillo de ensayo 50 \mul de mezcla de ensayo (glicina 50 mM, Triton X-100 0,05%, MgCl_{2} 4 mM, fosfato de p-nitrofenol 5 mM, pH = 10,3) y las placas de ensayo se incuban a continuación durante 30 minutos a 37ºC en un baño de agua en agitación a 60 oscilaciones por minuto. Al final de la incubación de 30 minutos, la reacción se interrumpe añadiendo 100 \mul de NaOH 0,2 N a cada pocillo y colocando las placas de ensayo en hielo. Se lee la absorbancia espectrofotométrica de cada pocillo a una longitud de onda de 405 nanómetros. Estos valores se comparan a continuación con patrones conocidos para dar una estimación de la actividad de la fosfatasa alcalina en cada muestra. Por ejemplo, utilizando cantidades conocidas de fosfato de p-nitrofenol, se generan valores de absorbancia. Esto se muestra en la Tabla I.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA I

Valores de absorbancia para patrones conocidos de fosfato de p-nitrofenol
\mumoles de fosfato de p-nitrofenol	Absorbancia media (405 nm)
0,000	0
0,006	0,261 \pm 0,024
0,012	0,521 \pm 0,031
0,018	0,797 \pm 0,063
0,024	1,074 \pm 0,061
0,030	1,305 \pm 0,083

\newpage

Los valores de absorbancia para cantidades conocidas de las BMP pueden determinarse y convertirse en \mumoles de fosfato de p-nitrofenol hidrolizado por unidad de tiempo como se muestra en la Tabla II.

TABLA II

Valores de fosfatasa alcalina para células W-20 tratadas con BMP-2
Concentración de BMP-2, ng/ml	Lectura de absorbancia a 405 nmetros	\mumoles de sustrato por hora
0	0,645	0,024
1,56	0,696	0,026
3,12	0,765	0,029
6,25	0,923	0,036
12,50	1,121	0,044
25,0	1,457	0,058
50,0	1,662	0,067
100,0	1,977	0,080

Estos valores se utilizan a continuación para comparar las actividades de cantidades conocidas de BMP-16 a BMP-2.

C. Protocolo de osteocalcina por RIA

Se colocan en placas de cultivo tisular multipocillo de 24 pocillos células W-20 a razón de 10^{6} células por pocillo en 2 ml de suero de ternero fetal al 10% inactivado térmicamente que contiene DME y glutamina 2 mM. Se dejan adherir las células toda la noche en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO_{2} a 37ºC. Al día siguiente el medio se cambia a suero de ternero fetal al 10% que contiene DME y glutamina 2 mM y la sustancia de ensayo en un volumen total de 2 ml. Cada sustancia de ensayo se administra a los pocillos por triplicado. Las sustancias de ensayo se incuban con células W-20 durante un total de 96 horas con sustitución a las 48 horas por los mismos medios de ensayo. Al final de las 96 horas, se extraen 50 \mul del medio de ensayo de cada pocillo y se analiza la producción de osteocalcina utilizando un radioinmunoanálisis para osteocalcina de ratón. Los detalles del análisis se describen en el kit fabricado por Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072. Los reactivos para el análisis se encuentran como números de producto BT-431 (patrón de osteocalcina de ratón), BT-432 (osteocalcina anti-ratón de cabra), BT-431R (osteocalcina de ratón yodada), BT-415 (suero normal de cabra) y BT-414 (IgG anti-cabra de asno). El RIA para la osteocalcina sintetizado por células W-20 en respuesta al tratamiento con BMP se realiza como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante.

Los valores obtenidos para las muestras de ensayo se comparan con los valores de patrones conocidos de osteocalcina de ratón y con la cantidad de osteocalcina producida por las células W-20 en respuesta a la prueba con cantidades conocidas de BMP-2. Los valores para la síntesis de osteocalcina producida por BMP-2 por células W-20 se presentan en la Tabla III.

TABLA III

Síntesis de osteocalcina por células W-20
Concentración de BMP-2, ng/ml	Síntesis de osteocalcina, ng/pocillo
0	0,8
2	0,9
4	0,8
8	2,2
16	2,7
31	3,2
62	5,1
125	6,5
250	8,2
500	9,4
1000	10,0

Ejemplo 11 Células precursoras pluripotentes modificadas genéticamente se integran y diferencian en el hueso en regeneración: una nueva terapia génica mediada por células en la zona

Entre las aproximadamente 6,5 millones de fracturas sufridas en los Estados Unidos cada año, aproximadamente el 20% son difíciles de cicatrizar. Hasta ahora, para la mayoría de estos casos difíciles no existe una terapia eficaz. Los autores han desarrollado un defecto segmentario radial de ratón como sistema modelo experimental para ensayar la capacidad de células precursoras pluripotentes modificadas genéticamente (clon C3H10T1/2 que expresa rhBMP-2) para la administración génica, trasplante y producción de crecimiento óseo en regeneración del hueso. Las células precursoras transfectadas que expresan a rhBMP-2 se infectaron más con un vector que lleva el gen LacZ, que codifica la \beta-galactosidasa (\beta-gal). Se confirmaron por inmunohistoquímica y bioensayo niveles de expresión in vitro de rhBMP-2 y su función. In vitro, las células precursoras se diferenciaron espontáneamente en células osteógenas que expresan la fosfatasa alcalina. Las células precursoras se trasplantaron in vivo a un defecto segmentario radial (zona de regeneración). Las células precursoras trasplantadas se localizaron cuantitativamente in vivo por expresión de \beta-gal y los ensayos inmunohistoquímicos pusieron de manifiesto que las células trasplantadas que se habían diferenciado en los osteoblastos y coexpresado a \beta-gal y rhBMP-2. Los principales grupos de referencia incluían clones LacZ de células WT-C3H10T1/2-LacZ y CHO-rhBMP-2. La formación de hueso nuevo se midió cuantitativamente mediante marcado fluorescente, que puso de manifiesto que a las 4 a 8 semanas después del trasplante, GEPMSC aumentó significativamente (P<0,01) la reparación del defecto del segmento. El estudio presente demuestra que la terapia génica mediada por la célula es útil para la administración a receptores de señalización de células trasplantadas (efecto autocrino) y células huésped precursoras (efecto paracrino), lo que sugiere la capacidad de las células precursoras para injertar, diferenciar y estimular el crecimiento óseo. Por lo tanto, las terapias génicas pueden ser útiles para las fracturas no consolidadas que de otro modo no cicatrizan en pacientes humanos.

Introducción

Es sabido que las fracturas radiales no consolidadas pueden cicatrizarse aumentando la concentración local de una molécula con señal (como BMP-2) para la osteogénesis y formación del hueso. En los presentes experimentos, los autores demuestran que una proteína puede ser administrada por células precursoras modificadas genéticamente para expresar el transgén para esta molécula con señal. BMP-2 recombinante humana (rhBMP-2) ha demostrado ser una proteína muy osteoinductora que produce la diferenciación osteogénica in vitro en varios tipos de células precursoras y puede producir la formación del hueso in vivo en zonas ectópicas así como en fracturas no consolidadas. Se creó un sistema modelo utilizando fracturas radiales no consolidadas en ratones como modelo para las fracturas óseas que no cicatrizan en condiciones normales, para permitir la medición de nuevos cartílagos y la formación de tejido óseo en estos defectos grandes de hueso producidos por la presencia de células precursoras (C3H10T1/2) modificadas genéticamente para expresar rhBMP-2 (rhBMP-2). Se trasplantaron las células sobre esponjas de colágeno (véase el apartado Métodos) que se colocaron quirúrgicamente en la fractura ósea radial (defecto segmentario de 2,5 mm) creada en ratones (C3H/HeN hembra. Se utilizaron cuatro grupos de referencia. En todos los casos se utilizó un único tipo de ratón (C3H/HeN). En el experimento se trató un grupo mediante implante de una esponja de colágeno que lleva uno de los siguientes: I) una alícuota de 10^{6} células C3H-BMP2; II) una alícuota de 10^{6} células no precursoras modificadas genéticamente (CHO-BMP2); III) una alícuota de 10^{6} células precursoras que no habían sido modificadas genéticamente (C3H-WT); IV) ninguna célula; V) ninguna célula pero en la que se colocaron 3 \mug de rhBMP-2. Este último grupo de referencia era una referencia positiva, como la proteína que se ha descrito previamente en la bibliografía.

Existen muchas técnicas ortopédicas bien conocidas para el tratamiento de fracturas óseas. Entre éstas, la terapia proteica es bien conocida pero no se utiliza todavía normalmente. La diferencia importante entre el presente sistema que se está describiendo en la presente memoria y la terapia de proteínas más habitual es que la proteína se administra al locus por las células que llevan el gen para la proteína deseada como transgén. Dado que las células se han trasplantado en el tejido del anfitrión enfermo, la expresión del transgén crea un aporte de proteína terapéutica en la proximidad de la lesión que debe cicatrizarse. Las células para esta finalidad se seleccionan principalmente por su capacidad para proporcionar expresión estable a largo plazo del transgén en cuestión. Por esta razón, las células que deben trasplantarse deben caracterizarse por la supervivencia a largo plazo y por la capacidad para integrarse de forma estable en el tejido del anfitrión.

En el SNC, tras el trasplante in vivo a los tejidos del anfitrión, las células precursoras pluripotentes no diferenciadas se integran y diferencian con éxito. Por esta razón, en el SNC, las células precursoras pluripotentes no diferenciadas son candidatos adecuados para su utilización en la terapia génica mediada por células. La supervivencia a largo plazo y la integración con éxito de las células precursoras en tejido del huésped las hace particularmente apropiadas para el caso de la reparación del tejido. Utilizando células precursoras pluripotentes no diferenciadas, se considera que la expresión eficaz del transgén en el tejido dañado (mecanismo paracrino) aumenta, mientras que se mantiene el efecto del transgén en las propias células precursoras (mecanismo autocrino). Además, las células precursoras pueden comunicarse con el tejido del anfitrión a través de sus propias moléculas con señal, así como las moléculas con señal de las células del anfitrión que pueden afectar las células del trasplante. Las células precursoras neuronales se han utilizado anteriormente para reparar la disfunción del sistema nervioso central: se ha demostrado que se integran eficazmente en la citoarquitectura del sistema nervioso central (SNC) del anfitrión y permiten la expresión estable de los transgenes. Además, como se ha demostrado en el SNC, las propias células precursoras presentan el potencial para participar activamente en el proceso de cicatrización. Estos resultados sugieren que las células precursoras pueden servir no solamente como vehículo para la expresión del transgén, sino que ellas mismas pueden participar en el proceso de reparación y llegar a ser una parte íntegra del tejido del anfitrión. Además, se considera que las propias células precursoras pueden estar afectadas por la expresión de los transgenes que están llevando (mecanismo autocrino). Se considera también que existe un aumento de trasplante, diferenciación y potencial terapéutico de dichas células precursoras y que otras células no precursoras, como los fibroblastos, carecen del mecanismo autocrino y por eso supuestamente tendrán menos efectos terapéuticos, en comparación con las células precursoras. Por lo tanto, las células precursoras pueden presentar una ventaja específica sobre otros tipos de células en la terapia génica mediada por células para la reparación de tejidos.

Resultados Generación y caracterización de células precursoras modificadas genéticamente

Se generaron células precursoras modificadas genéticamente a partir de la línea celular precursora pluripotente C3H10T1/2 capaz de diferenciar líneas celulares biogénicas, osteogénicas, condrogénicas o adipogénicas. Las células C3H10T1/2 fueron transfectadas por el plásmido pED4 que codifica un transcrito bicistrónico que presenta la configuración de neoR con la secuencia principal rhBMP-2ADNc-EMC bajo el control del activador principal tardío del adenovirus y del potenciador SV40. Se seleccionó un clon para el trabajo posterior que se denominó CH3-BMP-2. Para facilitar la localización de las células trasplantadas, se infectaron más C3H-BMP2 con el retrovirus BAGa que lleva el gen lacZ que codifica a \beta-galactosidasa (\beta-gal); de este modo la línea celular modificada genéticamente coexpresó lacZ como gen marcador y el gen para la proteína terapéutica rhBMP-2. Se confirmó por inmunofluorescencia doble que ambas proteínas estaban siendo sintetizadas por C3H-BMP-2. Solamente \beta-gal, y no rhBMP-2, se observó en las células C3H10T1/2 naturales (C3H-WT) infectadas con BAG\alpha. La línea celular CHO no precursora (CHO-WT) se modificó genéticamente transfectándola con un montaje rhBMP-2 que codifica un transcrito bicistrónico de BMP-2 y DHFR humanos bajo el control del activador tardío principal del adenovirus.

Se midió la secreción de rhBMP-2 en el medio acondicionado en el que se habían cultivado las células. Como se determinó por un bioanálisis in vitro de medio acondicionado, las células C3H-BMP2 segregaron proteína BMP-2 en la relación de 5\pm2,3 ng/24 h/10^{7} células y CHO-BMP2 segregaron la proteína BMP-2 en la cantidad significativamente mayor de 841\pm88 ng/24 h/10^{7} células. El bioanálisis y los análisis inmunohistoquímicos pusieron de manifiesto que C3H-WT no segregó proteína rhBMP-2. Como era de esperar, tal como se midió por la expresión de fosfatasa alcalina, después de 12 días en cultivo. Las células C3H-BMP2 se diferenciaron espontáneamente en una estirpe osteoblástica. En cambio, las células C3H-WT se diferenciaron solamente cuando se añadieron 50 \mug/ml de ácido ascórbico y 100 ng/ml de rhBMP-2 al medio de cultivo. Ni CHO-WT ni CHO-BMP2 se diferenciaron en ninguna circunstan-
cia.

Aumento de la reparación ósea por células precursoras modificadas genéticamente

Para comparar el potencial terapéutico in vivo de las células C3H-BMP2 con el de otros clones, se montaron células 10º de cada uno de los tres clones en esponjas individuales de colágeno que se trasplantaron a continuación individualmente en defectos segmentarios de 2,5 mm en el radio de ratones clónicos (C3H/HeN). Como referencia, un grupo de ratones recibió esponjas de colágeno sin ninguna alícuota celular. Para una referencia adicional, un quinto grupo de ratones recibió una esponja de colágeno que no llevaba células pero que llevaba 3 \mug de rhBMP-2. Se inmunosuprimieron los ratones mediante inyecciones de 50 mg/kg/día de Ciclosporina A, durante 14 días. El proceso de cicatrización se controló mediante fotografías periódicas por rayos X (cada dos semanas) durante un periodo de 8 semanas. El análisis por rayos X puso de manifiesto un proceso de cicatrización en los radios de ratones que recibieron células modificadas genéticamente, con la cantidad mayor (p<0,05) de formación de callo óseo en los radios trasplantados con C3H-BMP-2. En ambas semanas 6 y 8 tras el trasplante, la cantidad de formación del callo en el grupo C3H-BMP2 sobrepasó la del grupo CHO-BMP2, aún cuando CHO-BMP-2 expresa 168 veces más la proteína BMP-2. A las dos semanas después del trasplante, el aumento en las puntuaciones de la cicatrización para los ratones trasplantados con C3H-BMP2 o con CHO-BMP2 fue 3 a 4 veces mayor que para los trasplantados con células C3H-WT o esponjas de colágeno sin ninguna célula; esta diferencia fue 1,8 a 2,4 veces a las 8 semanas después del trasplante. Comparadas con el grupo CHO-BMP2, las puntuaciones para el grupo C3H-BMP2 aumentaron el 32% y el 20%, a las 6 y 8 semanas después del trasplante, respectivamente (P<0,05). La formación de callo en los ratones que habían recibido células C3H-WT no se diferencia estadísticamente de la de los ratones en las que habían recibido esponjas de colágeno que no llevan células en absoluto. Se observaron tendencias similares y aún más pronunciadas cuando se comparó la capacidad de varios trasplantes de línea celular para producir la formación del hueso, como se analizó por la deposición mineral y el tamaño del área del tejido calcificado.

A las cuatro semanas después del trasplante, el aumento en las puntuaciones de deposición mineral de las células C3H-BMP2 medido por densidad relativa de fluorescencia fue 9 veces mayor que el de C3H-WT y 11 veces mayor que el de los ratones en los que se habían trasplantado esponjas de colágeno que no llevan ninguna célula o proteína; a las ocho semanas después del trasplante estas diferencias fueron cuatro y ocho veces, respectivamente. Cuando se comparan con las células CHO-BMP2 no precursoras modificadas genéticamente, el aumento en las puntuaciones de deposición mineral de los trasplantes de células C3H-BMP2 fueron 140% y 165% a las cuatro y ocho semanas después del trasplante, respectivamente.

También a las cuatro semanas después del trasplante, el análisis histomorfométrico de las áreas trasplantadas puso de manifiesto que el tamaño del área nueva de tejido calcificado formada por los trasplantes de células C3H-BMP2 fue 2,0 a 2,8 veces mayor que el de los trasplantes de células C3H-WT o de los trasplantes de esponjas de colágeno que no llevan células ni proteína: a las ocho semanas después del trasplante esta diferencia fue de 3 veces. A las ocho semanas después del trasplante el tamaño del área de tejido calcificado en la que las células C3H-BMP2 se habían injertado fue 163% mayor que aquellos en los que se habían trasplantado células CHO-BMP2.

La formación de hueso es una de las consideraciones de la reparación ósea. Con sólo una ligera variación, la evaluación de los parámetros de formación ósea puso de manifiesto claramente que ambas líneas celulares que expresan a rhBMP-2 tenía una capacidad marcada para aumentar la regeneración del hueso. La capacidad para aumentar la regeneración del hueso de las células precursoras modificadas genéticamente, C3H-BMP2, fue mayor que la de las células no precursoras modificadas genéticamente, CHO-BMP2. Obsérvese que el nivel de secreción in vitro de rhBMP-2 detectado para las células C3H-BMP2 fue 168 veces menor que el de las células CHO-BMP2.

Modelos de regeneración presentados por las células precursoras modificadas genéticamente

Durante el proceso de cicatrización el análisis histológico del área de la fractura puso de manifiesto las estructuras morfológicas heterogéneas en los diversos grupos de trasplante. Cuatro semanas después del trasplante, en los puntos del radio no consolidados en los que se trasplantaron células C3H-BMP2, se observó un único proceso de regeneración que incluía nuevo crecimiento del hueso y cartílago bien organizado dentro de los límites de los bordes de la fractura. Además, se formó un cuello de diferenciación y calcificación de condriocitos alrededor del borde original del defecto óseo. Otra importante característica de las áreas en las que se trasplantaron C3H-BMP2 fue la formación de hueso de nuevo no unido a los bordes del defecto óseo. Ocho semanas después del trasplante, no hubo señales de actividad de reabsorción ósea en ninguna de las diversas partes de las zonas de trasplante. En todos los demás grupos experimentales, incluyendo el grupo que recibió esponjas de colágeno que llevan la proteína rhBMP-2, se formó algún hueso o cartílago observado de manera desorganizada.

Los trasplantes de CHO-BMP2 presentaron nueva formación de cartílago y hueso desorganizados y nueva formación de hueso ectópico relativamente extensa alrededor de los bordes del defecto óseo sin señales de estructura organizada alguna. Dicha formación de hueso ectópico no se observó en ninguno de los músculos que rodean el área del trasplante excepto en los trasplantes de CHO-BMP2 en contraste con los trasplantes de C3H-BMP2, ocho semanas después del trasplante de CHO-BMP2 se observó la reabsorción del hueso ectópico.

Los trasplantes de células C3H-WT y de esponjas de colágeno que no llevan células o proteínas presentaron respuestas muy moderadas que se expresaron como formación mínima de hueso de nuevo en los bordes del defecto óseo, formación de cartílago desorganizado alrededor de los bordes del defecto y un número relativamente bajo de condriocitos hipertróficos y calcificantes.

La comparación entre los trasplantes de esponjas de colágeno que llevan C3H-BMP2 o 3 \mug de rhBMP-2 puso de manifiesto que la introducción de la proteína pura aumentaba la formación de hueso y cartílago trabecular de nuevo. Sin embargo, en el caso de hueso y cartílago de nuevo no se formó en alineación con las cortezas del borde del defecto original, que se distinguen fácilmente del nuevo hueso trabecular.

En resumen, los efectos de las células C3H-BMP2 trasplantadas se diferencian de los demás grupos (incluyendo la proteína rhBMP-2) no sólo en eficacia, sino también en la naturaleza del proceso de cicatrización. Después del trasplante de C3H-BMP2, el hueso y el cartílago formados alrededor del borde de la fractura parecían organizados y orientados según el modelo original de hueso de radio, reconstruyendo mejor de este modo su estructura original. Los trasplantes de células C3H-BMP2 también produjeron formación de hueso de nuevo no relacionada con el borde del defecto. En todos los grupos la formación de cartílago y hueso nuevo apareció en una cierta medida concentrado en los bordes del defecto. Las células CHO-BMP2 y rhBMP-2 produjeron formación del cartílago y del hueso que parece ser que carece de alguna organización y orientación y no sigue la configuración normal del proceso de cicatrización.

Trasplante y destino celular de las células precursoras modificadas genéticamente

Las células infectadas con el retrovirus BAG\alpha llevan lacZ para permitir la fácil identificación de las células in vivo. Dos semanas después del trasplante, se observaron los clones C3H-BMP2 y C3H-WT trasplantados localizados a lo largo de la zona del trasplante, creando capas de células en los bordes del defecto óseo. Estas capas de células rodeaban los bordes del defecto de manera organizada. Morfológicamente, la mayoría de las células trasplantadas parecían fibroblastos y algunas parecían condriocitos.

Cuatro semanas después del trasplante, las células C3H-BMP2 se observaron como células de revestimiento en los trabéculos óseos recién formados, presentando morfología osteoblástica. Los ensayos dobles de inmunofluorescencia pusieron de manifiesto la coexpresión de \beta-gal y rhBMP-2 en estas células. A diferencia de las células C3H-BMP2, las células C3H-WT presentaron principalmente una morfología fibroblástica y se incorporaron en el tejido conectivo formado en el área del trasplante y en los bordes del defecto óseo. Se localizaron relativamente pocas células C3H-WT en el tejido óseo recién formado, como se observó con las células C3H-BMP2. El mismo modelo de trasplante de C3H-BMP2 y C3H-WT trasplantadas se identificó a las 6 y 8 semanas después del trasplante, aunque las células positivas a \beta-gal se redujeron en el número presentado. Estas observaciones demostraron que las células precursoras pueden trasplantarse con éxito y sobrevivir por lo menos hasta 8 semanas en una zona de hueso en regeneración. Además, pueden localizarse con éxito en las áreas específicas en el hueso regenerado, diferenciarse e incorporarse a los tejidos del anfitrión. Los datos de los autores indicaron que C3H-BMP2 presenta una tendencia hacia la diferenciación e integración osteogénica en el tejido osteogénico, mientras que las células C3H-WT presentan una tendencia hacia la diferenciación e integración en el tejido conectivo.

Las células no precursoras eran células CHO que no se diferencian en la serie de reacciones osteogénicas y que se había demostrado anteriormente que sobreviven en el tejido precursor (área subcutánea) durante cuatro semanas. Actualmente los autores han demostrado que las células C3H-BMP2 precursoras modificadas genéticamente sobrevivieron al trasplante, se trasplantaron y se diferenciaron para formar zonas de hueso regeneradas. Además, las células precursoras eran significativamente más ventajosas en su potencial terapéutico que lo fueron las células CHO-BMP2 modificadas genéticamente no precursoras tratadas de manera similar.

En el modelo de terapia génica mediado por las células los autores observaron tanto el mecanismo autocrino como el mecanismo paracrino. Tanto la línea celular C3H-BMP2 precursora modificada genéticamente como la línea celular CHO-BMP2 no precursora modificada genéticamente tanto in vitro como in vivo expresaron y segregaron rhBMP-2. Por consiguiente ambas líneas presentan el mecanismo paracrino. Sin embargo, además, las células C3H-BMP2 presentan el mecanismo autocrino y también probablemente responden a las moléculas con señal expresadas por las células huésped locales y las proteínas de la matriz. En contraste con estas dos líneas celulares modificadas genéticamente, las células C3H-WT no pueden ser controladas por un mecanismo paracrino o autocrino, pero probablemente responden en la misma medida a las moléculas con señal segregadas por las células huésped adyacentes en el área del trasplante. Esto es similar a los efectos descritos en el SNC. La prueba de la actividad autocrina se demostró in vitro por la capacidad de las células C3H-BMP2 para diferenciarse espontáneamente en las células osteogénicas, mientras que las células C3H-WT se diferenciaron solamente después de la aplicación de rhBMP-2 exógena. In vivo, tras el trasplante, injerto y diferenciación, las células C3H-BMP2 presentaban el aspecto morfológico de osteoblastos y se observó que se integran principalmente en nuevos tejidos óseos y de cartílago. Las células C3H-WT, por otra parte, tenían el aspecto morfológico de fibroblastos y se observó que se integraban principalmente en el tejido conectivo que rodea la zona del trasplante. Estos resultados indican que las células C3H-WT son menos capaces de diferenciarse en las células osteogénicas y el tejido óseo, debido a que carecen de expresión del transgén rhBMP-2. Se llegó a la conclusión de que por sí mismas, las células precursoras pueden injertarse, pero que las células precursoras modificadas genéticamente pueden tanto injertarse como diferenciarse a lo largo de la serie de reacciones osteogénicas. Se ha llegado a la conclusión de que la expresión de rhBMP-2 en las células C3H-BMP2 puede producir la diferenciación osteogénica in vitro así como in vivo, dirigiendo de este modo el modelo de diferenciación de las células trasplantadas desde la serie de reacciones fibroblásticas hasta las osteogénicas. La capacidad de las células precursoras para localizarse específicamente a las dos semanas tras el trasplante y además para rodear los bordes del defecto, indica que las células precursoras son probablemente sensibles a las señales locales procedentes de las células vecinas, que pueden afectar su localización y trasplantes. En el caso de las células precursoras modificadas genéticamente, existe además su reacción con el mecanismo autocrino en el que responden a sus propias moléculas con señal.

Mediante examen histológico se observó que el cartílago y el hueso se formaban alrededor de los bordes del defecto solamente en los trasplantes de C3H-BMP2. Se considera que es la localización específica y la orientación de las células C3H-BMP2 trasplantadas en los bordes del defecto la que es responsable de la formación ordenada. Aunque se ha descrito que las dosis elevadas de rhBMP-2 cicatrizan defectos grandes de los huesos, el nuevo hueso formado no parecía tener estructura normal ni parecía ser una continuación del hueso original. Esto está en contraste con la formación del hueso producida por rhBMP-2 aportado a través de la expresión del transgén en células trasplantadas modificadas genéticamente. Por este motivo, parece que la utilización de la terapia génica mediada por células precursoras para la reparación del tejido presentaría más ventajas que la utilización de otras terapias.

El análisis de los parámetros de formación del hueso en las zonas óseas en regeneración puso de manifiesto que los trasplantes de células C3H-BMP2 eran superiores a los de otros grupos experimentales (incluyendo los trasplantes de células CHO-BMP2) para favorecer la formación de hueso nuevo. Se sugiere que los mecanismos paracrino y autocrino combinados logrados por las células C3H-BMP2, y no solo el mecanismo paracrino de rhBMP-2 segregado, son responsables del pronunciado potencial terapéutico de estas células. En apoyo de estas observaciones está el hecho de que aunque las células C3H-BMP2 segregan 168 veces menos rhBMP-2 que las células CHO-BMP2 (in vitro y suponiendo que esta diferencia se mantenga in vivo), los trasplantes de células C3H-BMP2 formaron hueso que sobrepasa a los trasplantes de CHO-BMP2. Dado que in vivo el efecto de la aplicación local de rhBMP-2 depende de la dosis, se concluyó que además del mecanismo paracrino, el efecto terapéutico de la presencia de las células C3H-BMP2 fue dirigido por el mecanismo autocrino y también quizás por los efectos de señalización de las células huésped vecinas.

Las células precursoras están siendo utilizadas actualmente para la reparación de lesiones en el sistema nervioso central (SNC). En dichos sistemas, se ha descubierto que las células precursoras se diferencian y llegan a injertarse en el tejido del anfitrión. En un principio, era de esperar que las células precursoras neuronales podrían ser modificadas genéticamente para ejercer un efecto terapéutico por su capacidad para responder a los factores locales (incluyendo el transgén), diferenciarse y llegar a ser un componente íntegro del tejido del anfitrión, así como tener la capacidad del transgén para producir el propio mecanismo paracrino. Sin embargo, en este contexto, no se ha demostrado todavía que las células precursoras neuronales modificadas genéticamente en el SNC sean superiores a los tipos de células no precursoras modificadas genéticamente. Esto contrasta con los resultados presentes que demuestran que las células precursoras modificadas genéticamente (C3H-BMP2) son de hecho superiores a las células no precursoras modificadas genéticamente (CHO-BMP2).

La utilización de las BMP para la terapia génica de fracturas óseas no consolidadas fue descrita previamente en dos métodos diferentes. El primer método utilizaba administración génica directa de BMP-4 (por el plásmido sobre la matriz) al defecto del segmento femoral en ratas. Los autores supusieron que la cicatrización observada por la administración directa del plásmido es debida a la absorción del plásmido y a la expresión de BMP-4 por células fibroblásticas que migran a la zona de la lesión. Según este método, la BMP-4 expresada presenta mecanismo/efectos paracrinos sobre las células osteógenas, pero no es probable que presente los mecanismos tanto paracrino como autocrino. Además, es más probable conseguir altos niveles de expresión del transgén que utilizan administración de gen ex vivo en comparación con la administración génica directa (debido al bajo índice de transducción utilizando la administración directa del plásmido). El segundo método, utiliza como este informe la terapia génica mediada por células para la administración de rhBMP-2 en los defectos del segmento femoral en ratas. Con este objeto los autores utilizaron células W-20-17, línea celular murina del estroma, que se modificaron genéticamente para expresar a rhBMP-2 y se demostró que producen la cicatrización del hueso en el trasplante local en el punto de fractura. Aunque las células W-20-17 se diferencian en la serie de reacciones estereogénica en respuesta a rhBMP-2, los autores atribuyeron el efecto de cicatrización principalmente a la administración de rhBMP-2 (mecanismo paracrino) por estas células. No se sabe si las células W-20-17 modificadas genéticamente se diferencian in vitro, además este destino in vivo no está determinado todavía. Los resultados, sin embargo, demuestran que los precursores modificados genéticamente que expresan a rhBMP-2 presentan efectos tanto paracrinos como autocrinos, cuando se combinan para producir un aumento del efecto de cicatrización que sobrepasa el de las células modificadas genéticamente que presentan un efecto paracrino solamente.

rhBMP-2 presenta muchos efectos en diferentes tipos de células y tejidos y por consiguiente es adecuada para la terapia génica para otros órganos, además del hueso. Recientemente, se descubrió que rhBMP-2 presenta un efecto inhibidor en la proliferación in vitro e in vivo del músculo liso. En este estudio, la infección directa de la arteria carótida lesionada en ratas con adenovirus recombinante que codifica a BMP-2 humana, inhibió la proliferación de las células del músculo liso y evitó el espesamiento de la capa íntima de la arteria lesionada.

En el sistema modelo de los autores para la terapia génica basado en las células precursoras modificadas genéticamente los autores han conseguido varios objetivos: i) la formación de hueso de nuevo es continua con el hueso existente en fracturas no consolidadas; ii) la eficacia biológica de este sistema es lo bastante alta para que trabaje aún cuando la concentración del producto transgénico sea baja; iii) es conocido que la vida media de rhBMP-2 es muy corta; al crear un sistema en el que rhBMP-2 se expresa continuamente, se sometieron las células a la presión continua de la proteína rhBMP-2; iv) el sistema es sencillo, sencillo de utilizar y apropiado para su utilización en seres humanos. A este respecto, los autores están realizado experimentos actualmente para probar la posibilidad de que puedan utilizarse las células precursoras humanas en nuestro sistema modelo. Este modelo es también apropiado para la intervención terapéutica para lesiones de cicatrización en tejidos u órganos distintos del hueso.

Entre las muchas terapias posibles para la lesión del tejido están la terapia proteica y varios estilos de terapia génica. Aunque parece que el modelo para la terapia génica mediada por células modificadas genéticamente es probablemente más eficaz que la terapia proteica, los autores no han comparado todavía este sistema con los sistemas en los que se utilizan adenovirus o plásmidos como vehículo para la administración del gen rhBMP-2 en defectos óseos. Los autores estudiarán estas cuestiones experimentalmente en un próximo futuro.

Métodos Construcción de líneas celulares modificadas genéticamente

Se generaron células C3H-BMP2 a partir de la línea celular C3H10T1/2 pluripotente como se describió anteriormente. En presencia de 8 mg/ml de polibreno, el gen seleccionado (T5/C3H-BMP2) se infectó con el retrovirus BAG\alpha que lleva el gen lacZ que codifica la \beta-gal. Las células C3H10T1/2 naturales se infectaron también con el retrovirus BAG-\alpha, para generar una línea celular de C3H-WT que expresa \beta-gal. Se seleccionaron ambas líneas celulares con 0,5 mg/ml de antibiótico G418. Se generaron CHO-BMP2 como se describió anteriormente.

Caracterización in vitro de líneas celulares modificadas genéticamente

La secreción de rhBMP-2 por las líneas celulares C3H-BMP2 y CHO-BMP2 modificadas genéticamente se determinó mediante bioanálisis tal como se describió anteriormente. Se cultivaron células W-20-17 con medio acondicionado obtenido de cada una de las líneas celulares durante 24 horas. Los cultivos en paralelo de las células W-20-17 se cultivaron con concentraciones crecientes de proteína rhBMP-2. Veinticuatro horas después de la adición de la proteína rhBMP-2 y medio acondicionado, se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina en el lisado de células W-20-17 mediante incubación con glicina 50 mM, Triton X-100 al 0,05%, MgCl_{2} 4 mM y fosfato de p-nitrofenol 5 mM, pH 10,3 a 37ºC durante 30 minutos y midiendo la absorbancia espectrofotométrica a 405 nm. Se evaluó la secreción de rhBMP-2 en medio acondicionado de cada línea celular experimental comparando la actividad de la fosfatasa alcalina en los lisados de células W-20-17 (incubadas con el medio acondicionado) con una curva patrón generada a partir de la actividad en fosfatasa alcalina de las células W-20-17 incubadas con concentraciones crecientes de rhBMP-2 como se describió anteriormente.

La expresión conjunta de \beta-galactosidasa y BMP-2 se demostró por inmunofluorescencia doble. Se determinaron los fenotipos de diferenciación in vitro cultivando las líneas celulares precursoras C3H-BMP2 y C3H-WT en densidades en placas variables durante 12 a 19 días y utilizando los siguientes procedimientos de tinción histoquímica: tinción histoquímica de fosfatasa alcalina (kit Sigma 86-R) como marcador primario para la diferenciación osteoblástica, azul alcian para definir los condroblastos y tinción con aceite rojo O para definir los adipositos.

Inmunofluorescencia doble

Se utilizó inmunofluorescencia doble en secciones congeladas para demostrar la expresión conjunta in vivo de \beta-gal y BMP-2 en células C3H-BMP2. Se fijaron las células con metanol:acetona (1:1 en volumen). Se preparó la mezcla de anticuerpos de la forma siguiente: anticuerpos primarios de anti-\beta-gal de IgG2b de ratón monoclonal a una concentración de 20 \mug/ml y anti-rhBMP-2-R230 o -W8 de conejo policlonal (dilución 1:100) dirigida contra la zona madura de la BMP-2 humana. Las células fijadas y las mezclas de anticuerpos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. La incubación con la mezcla de anticuerpos primarios fue seguida de incubación con IgG2b Ab, anti-ratón de cabra biotinilada, seguido de estreptavidina Cy3 y por último mediante anticuerpo-FITC anti-conejo de cabra conjugado (dilución 1:80) Jackson 111-015-003) cada incubación durante 30 min. a temperatura ambien-
te.

Trasplante in vivo

Antes de ser trasplantadas in vivo, se trataron las células con tripsina y se hizo el recuento con un contador Coulter®-21. Se montaron alícuotas de 10^{6} células en esponjas individuales de colágeno de tipo I (Collastat®, 2 mm \times 2 mm \times 4 mm. Vitaphore Corp.) y se trasplantaron en ratones C3H/HeN, en una cavidad normal de 2,5 mm creada en el radio derecho. En todas, existían cinco grupos experimentales: una esponja de colágeno que lleva: I) una alícuota de 10^{6} células C3H-BMP2; II) una alícuota de 10^{6} células no precursoras modificadas genéticamente (CHO-BMP2); III) una alícuota de 10^{6} células precursoras que no había sido modificada genéticamente (C3H-WT); IV) ninguna célula en absoluto; V) ninguna célula pero en las que se colocaron 3 \mug de rhBMP-2 pura. Como animales anfitriones experimentales, se utilizaron ratones C3H/HeN hembra de 3 a 4 meses. Estos ratones se inmunosuprimieron con inyecciones de 1 mg/ratón/día de Ciclosporina A (Sandoz) a partir del día 0 durante un periodo de 2 semanas. El procedimiento del trasplante tuvo lugar inmediatamente después de este periodo de 2 semanas. Los trasplantes también comienzan el día 0.

Análisis por rayos X

En los días 0, 2, 4, 6 y 8 semanas después del trasplante de las esponjas de colágeno se tomaron fotografías por rayos X de cada ratón. Las fotografías por rayos X se escanearon en un ordenador y se realizaron las mediciones utilizando el programa 1.66 de imagen de NIH. Para cada punto de tiempo, se determinó la cicatrización del defecto calculando la relación de densidad óptica que es igual al valor de la densidad óptica media de la cavidad (tamaño original, medido por rayos X para cada ratón el día 0) dividido por la densidad óptica media del cúbito.

Análisis de deposición mineral

Para evaluar la cantidad de deposición mineral en las áreas del trasplante, se marcaron los ratones con el marcador de mineralización fluorescente calceína verde. Se inyectó a los ratones i.p. 2,5 mg/kg de colorante 7 y 2 días antes del sacrificio. Se sacrificaron los ratones a las cuatro y ocho semanas después del trasplante. Se fijaron en etanol (70% y posteriormente 80% y 100%) muestras de las extremidades operadas y se impregnaron en bloques de plástico (Immuno Bed Polysciences). Se observaron marcas por fluorescencia en secciones de 7 \mum de espesor, utilizando un microscopio fluorescente suministrado con un filtro FITC. Se calculó la densidad de fluorescencia relativa como la densidad de fluorescencia total medida en el área de la cavidad (tamaño original de la cavidad para cada ratón el día 0), dividido por la densidad de fluorescencia total de un área constante de la corteza cubital. Las mediciones se realizaron utilizando el programa 1.66 de imagen por NIH.

Histomorfometría e histología

Se tiñeron secciones plásticas de 7 \mum para histología e histomorfometría con tintes Masson Trichrom y H&E. Se midió el área total del tejido calcificado en la fisura (tamaño original de cada ratón el día 0), utilizando análisis de morfometría de imagen automático (Galai:CUE-3 Electro Optical Inspection and Diagnostic Laboratories Ltd. MigdalHaemek, Israel).

Detección in vivo de células precursoras modificadas genéticamente

La detección de células C3H-BMP2 y C3H-WT injertadas in vivo requirió el sacrificio de los ratones a las 2, 4, 6 y 8 semanas después del trasplante. Las extremidades operadas se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 1 hora después de la perfusión transcardial con 10 ml de PFA al 4%, crioprotegida con sacarosa al 5% durante la noche, impregnada y congelada. Se prepararon secciones de 15 \mum en un criostato (Bright, modelo OTF). Las células injertadas y su descendencia se detectaron por coloración histoquímica con X-gal. En primer lugar se fijaron en una solución de glutaraldehído al 0,25%, fosfato Na 0,1 M (pH 8,3), EDTA 5 mM y MgCl_{2} 2 mM durante 30 min. A continuación se lavaron las células tres veces en una solución de fosfato Na 0,1 M, MgCl_{2} 2 mM, desoxicolato al 0,1%, Nonident P.40 al 0,2%. Por último, se tiñeron las células incubándolas en una solución de 1 mg/ml de X-gal, K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6}·3 H_{2}O 5 mM, fosfato Na 0,1 M, MgCl_{2} 2 mM, desoxicolato al 0,1%, Nonident P.40 al 0,2%, a temperatura ambiente (en la oscuridad) durante la noche. La expresión conjunta de los genes para \beta-gal y BMP-2 en células C3H-BMP2 se puso de manifiesto por inmunofluorescencia doble (como se describió anterior-
mente).

Ejemplo 12 Efectos extraesqueléticos generales de rhBMP-2

rhBMP-2 administrada por vía general (20 días) afecta a varios órganos extraesqueléticos en ratones osteopénicos viejos.

Métodos Mediciones de fuerza muscular

Se midió la fuerza muscular mediante la prueba de agarre que determina la capacidad del ratón para agarrarse a un alambre fijado horizontalmente y la velocidad a la que lo hace, medida en segundos.

Histomorfometría, histología y tinción histoquímica para la actividad de ALP

Se disecaron órganos internos de ratones (hígado, riñón, testículos y bazo), se fijaron en formalina tamponada al 4% y se impregnaron en parafina. Se disecaron los fémures y se fijaron en formalina tamponada al 4%, se descalcificaron, se impregnaron en parafina. Se tiñeron secciones de 5 mm para H&E. Se realizó la coloración histoquímica de las células para la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) utilizando un kit Sigma (nº 86R). Se midieron las áreas de las colonias positivas a ALP en cada placa de 35 mm utilizando un análisis formométrico de imagen automático
(Glai).

Proliferación de las MSC detectada por BrdU

Se cultivaron células madre del estroma de la médula (MSC) en portaobjetos de cámara. Se eliminó el medio de cultivo celular y se sustituyó por la solución diluida de marcado con BrdU. Después de 2 horas de incubación a 37ºC, las células se tiñeron inmunohistoquímicamente utilizando el kit de tinción BrdU de Zymed según las directrices del fabricante (Zymed Laboratories Inc., sur de San Francisco, USA). En resumen, se fijaron las células con alcohol 70% a 80% durante 30 min a 4ºC, se bloqueó la actividad a la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 10 min, se trataron con solución desnaturalizante durante 30 min para desnaturalización del ADN. Siguiendo el tratamiento con PBS, que contiene suero de cabra no inmune al 10% durante 10 min a temperatura ambiente (para minimizar el enlace no específico de los reactivos en las etapas posteriores), se incubaron las células con anticuerpo anti-BrdU de ratón tratado con biotina durante 60 min a temperatura ambiente y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante durante 10 min a temperatura ambiente. Cada etapa se terminó mediante tres lavados con PBS. Se observaron los anticuerpos unidos específicamente utilizando mezcla de 3,3'-diaminobenzina (DAB). Todos los portaobjetos se tiñeron por contraste con solución de hematoxilina. Los resultados se expresaron en porcentaje de células positivas (núcleos marrones) de células totales.

Apoptosis de las MSC

Las células apoptósicas se detectaron mediante un kit TUNEL según el protocolo del fabricante (Oncor). Para el análisis cuantitativo de las células apoptósicas, se observaron 4 a 7 campos aleatorios de cada pocillo en los portaobjetos y las células apoptósicas y totales se contaron en el microscopio a través de lentes del objetivo 20\times o 40\times en modo fluorescente. Se calculó el porcentaje de núcleos apoptósicos para cada campo y los datos se expresaron como media para cada portaobjetos.

Aislamiento del ARN y RT-PCR

El aislamiento del ARN se realizó utilizando ARNazol B (Biotecx Lab. Inc., Texas. USA) según el protocolo del fabricante. En resumen, se homogeneizaron los cerebros en el reactivo utilizando un homogeneizador de vidrio-Teflon. Se recogieron las MSC mediante tripsina y los sedimentos celulares se homogeneizaron por ARNazol B. Se mezcló el homogeneizado con cloroformo y se centrifugó, lo cual proporcionó la fase acuosa superior, la interfase y la fase orgánica del fondo. Se precipitó el ARN en la fase acuosa mediante la adición de isopropanol, se lavó y se disolvió en agua. Se realizó la RT-PCR con modificaciones de procedimiento como se describió anteriormente (4), utilizando 2 \mug de ARN total.

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Resultados y exposición

Apartado 1

Efectos extraesqueléticos de la administración generalizada de rhBMP-2 en ratones macho osteoporósicos BALB/c viejos El tratamiento con BMP-2 aumenta la fuerza muscular en ratones viejos

BMP-2 tuvo un efecto significativo sobre la fuerza muscular similar en ambas dosis de 0,5 y 1,0 \mug/día. Los ratones viejos tratados fueron capaces de agarrarse al alambre y colocarse sobre él, con las patas y erguidos en el tiempo más breve, en comparación con las referencias no tratadas. Los ratones de referencia no tratados no pudieron agarrarse al alambre en horizontal, a causa de la disminución de la fuerza muscular.

Efectos generalizados de BMP-2 sobre la estructura y función testicular

rhBMP-2 (0,5; 1 y 5 \mug/día durante 20 días) estimuló la espermatogénesis. Hubo un aumento en el número de células germinativas en los animales tratados. El análisis cuantitativo de la espermatogénesis puso de manifiesto el aumento significativo en el número de células germinativas en los túbulos espermatogénicos en los ratones tratados, con el mayor efecto de la dosis de 1 y 5 \mug. Un número en aumento de células germinativas en los túbulos seminíferos siguió al tratamiento generalizado con BMP-2 y se correlacionó bien con una disminución significativa en el número de células germinativas apoptósicas (TUNEL) hallado en ratones tratados, en comparación con las referencias no tratadas (P<0,05). Estos resultados indicaron que la administración generalizada de rhBMP-2 a ratones viejos aumentó la fuerza muscular y estimuló la proliferación y diferenciación de la célula germinativa testicular. Este descubrimiento es coherente con los datos obtenidos por Zhao et al., quien describió a BMP-8 como crítico para la función y desarrollo testicular. En general, la función de BMP-2 en la espermatogénesis todavía es poco comprendida. Serán necesarios estudios futuros para aclarar los mecanismos biológicos involucrados en el aumento de la espermatogénesis y de la fuerza muscular producida por la administración generalizada de rhBMP-2.

Los efectos in vitro de rhBMP-2 sobre MSC, obtenidos a partir de rhBMP-2 en ratones BALB/c viejos aumentan la actividad de ALP in vitro de MSC obtenidas en ratones viejos

Se trataron colonias de MSC (obtenidas a partir de ratones viejos) in vitro con rhBMP-2 con dosis de 0,1, 0,5, 1,0 y 5,0 \mug/ml, durante 8 días. El tamaño de las colonias de MSC positivas a fosfatasa alcalina (ALP) aumentó significativamente a todas las dosis, excepto a 0,1 \mug/ml. Estos resultados indican el efecto directo de rhBMP-2 sobre MSC obtenido a partir de ratones viejos osteoporósicos y apoya el resultado de que la administración generalizada tiene efectos beneficiosos sobre la osteoporosis en los ratones mediante la estimulación de las MSC.

Receptores de BMP en cerebros obtenidos de ratones osteoporósicos viejos

La administración general de rhBMP-2 a ratones osteoporósicos viejos, aumentó de manera significativa la expresión de los receptores IA y II de BMP en sus cerebros. El diseño experimental incluyó 4 grupos: referencia joven, referencia vieja, viejos tratados con 0,5 \mug/día/ratón de rhBMP-2 durante 20 días, viejos tratados con 1,0 \mug/día/ratón de rhBMP-2, durante 20 días. El aislamiento del ARN de los cerebros se realizó utilizando ARNazol B (Biotecx Lab. Inc., Texas, USA) según el protocolo del fabricante. Se realizó la RT-PCR con modificaciones, utilizando 2 \mug de ARN total. Los cebadores del receptor BMP fueron una gentileza del Dr. J. Lauber y G. Gross (GBF, Alemania), diseñados según sus secuencias de ADNc. Los resultados cuantitativos de RT-PCR se expresaron normalizando las unidades densitométricas de los receptores de BMP a RPL19 (referencia interna). El tratamiento general de rhBMP-2 reguló por incremento la expresión de BMPR-II (en los cerebros de ratones tratados por vía general con 0,5 y 1,0 \mug de rhBMP-2) y BMPR-IA (1,0 \mug de rhBMP-2). Los cerebros extraídos de los ratones viejos expresan niveles de BMPR-IA y de BMPR-II ARNm significativamente menores, en comparación con los de los ratones jóvenes. Se demostró anteriormente (datos no publicados) que los ratones viejos no tenían tan buena memoria como los ratones jóvenes (determinada en la prueba del laberinto con agua) y según la presente invención BMP-2 podría presentar efectos beneficiosos sobre la memoria en ratones viejos.

rhBMP-2 administrada por vía general invierte la pérdida ósea en la osteoporosis postmenopáusica (tipo I) en ratones ovarioectomizados

BMP-2 humana recombinante produjo cartílago local y formación de hueso in vivo. Además, BMP-2 estimuló la expresión osteoblástica del fenotipo en líneas celulares osteogénicas. Los resultados preliminares indicaron que E2 administrada in vitro, regulaba por incremento la expresión génica de BMP-2 en las MSC obtenidas a partir de ratones operados tanto en falso como por OVX. Estos resultados indicaron que BMP-2 fue uno de los genes diana de E2 y puede ser responsable del efecto anabólico de E2 en ratones OVX. Basándose en estos datos, se supuso que la administración general de rhBMP-2 a ratones OVX, puede invertir su pérdida de hueso (efecto anabólico). Los ratones OVX se dividieron al azar en tres grupos y se trataron todos por vía general durante 20 días (inyecciones i.p.); ratones de referencia (200 \mul de PBS/BSA inyectados diariamente, n = 8); ratones tratados por vía general con 1 \mug/día/ratón (n = 8); y ratones tratados por vía general con 5 \mug/día/ratón (n = 8). El peso corporal no había cambiado de manera significativa durante los 20 días de inyección. Se disecaron los órganos internos, bazo, hígado y riñón en todos los ratones, se fijaron en formalina tamponada al 4% y se impregnaron en parafina. Se tiñeron secciones de 5 \mum por H&E. No existen señales de toxicidad y/o fibrosis en los ratones inyectados por vía general con 1 y 5 \mug de rhBMP-2. Los fémures de las referencias y de los ratones tratados con OVX se disecaron, se fijaron en formalina tamponada al 4%, se descalcificaron, se impregnaron en parafina y las secciones de 5 \mum se tiñeron para H&E. La administración general de rhBMP-2 (1 y 5 \mug/día) estimuló la formación de hueso trabecular en huesos femorales.

Estos resultados apoyan la hipótesis inicial de que rhBMP-2 administrada por vía general es capaz de invertir la osteopenia en los huesos femorales de ratones osteoporósicos ovariectomizados. Después de 20 días de tratamiento general con rhBMP-2, se cultivó médula ósea de ratones y se aislaron células del estroma (MSC) en portaobjetos de cámara de 4 pocillos, durante 12 días. El tratamiento general con rhBMP-2 disminuyó de forma significativa la apoptosis de MSC y aumentó la proliferación de MSC, indicando que el efecto anabólico general de rhBMP-2 en los ratones OVX, ocurrió por estimulación de las MSC extraídas de ratones OVX. Este mecanismo es similar al mecanismo que se describió en el caso de ratones osteoporósicos seniles tratados por vía general con rhBMP-2.

Ejemplo 13 Encapsulación de células mesenquimáticas pluripotentes modificadas genéticamente condicionalmente (reguladas por tet) que expresan a rhBMP-2

Se exploró aquí la posibilidad de utilizar la expresión de rhBMP-2 regulada por tet en células C3H10T1/2 como un vehículo de administración para rhBMP-2 (solamente mecanismo paracrino) sin trasplante de las células en el tejido del anfitrión (efectos autocrino y paracrino). La encapsulación celular, como se ha descrito anteriormente (Hortelano, 1996), separa físicamente el medio del anfitrión y el sistema inmunitario de las células trasplantadas, pero permite la difusión de rhBMP-2 en el medio del anfitrión.

Métodos

Encapsulación y trasplante de cápsulas: Se realizó la encapsulación celular tal como se describió anteriormente (Chang, 1994; Hortelano, 1996). En resumen, se mezcló una suspensión de células con alginato de potasio al 2,5% en una jeringuilla y se extruyó con una bomba de jeringuilla a través de una aguja 27G a un caudal de 39,3 ml/h. Un chorro de aire concéntrico a la aguja creó gotitas finas de la mezcla células/alginato que se recogieron en una solución de CaCl_{2}. En el contacto, se helaron las gotitas. La capa externa de alginato se reticuló químicamente con poli-L-lisinhidrobromuro durante 6 minutos y a continuación con otra capa de alginato. Finalmente, el núcleo exento de alginato restante se disolvió con citrato de sodio durante 6 minutos para proporcionar microcápsulas con una membrana de alginato-PLL-alginato que contienen las células. Las células se mantuvieron in vitro antes del trasplante in vitro con DMEM enriquecido con L-glutamina 2 mM, suero de ternero fetal al 10% y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina.

Utilizando una jeringuilla de 10 ml y una aguja 19G, se inyectaron aproximadamente 5 ml de cápsulas empaquetadas herméticamente en PBS dentro de un área subcutánea en el lomo de ratones BALB/c viejos y jóvenes. Se administró a los ratones agua potable con o sin adición de 0,5 mg/ml de DOX. En el momento del sacrificio, se volvieron a recuperar algunas cápsulas in vitro y se evaluó la histología en el resto del área del trasplante utilizando secciones de parafina y tinción H&E.

Resultados Encapsulación de células precursoras modificadas genéticamente para un sistema controlado de administración de proteína rhBMP-2

Se encapsularon células C9 en cápsulas de alginato redondeadas como se describió anteriormente (Chang 1994; Hortelano 1996). Se trasplantaron por vía subcutánea aproximadamente 5 ml de cápsulas en los lomos de dos ratones BALB/c viejos y dos jóvenes (en cada grupo se trató un ratón con DOX y el otro ratón no). Después de 27 días se sacrificaron y se analizaron los ratones. En los ratones tratados con DOX no se observaron señales de formación de tejido óseo o cartílago, en los ratones jóvenes o en los viejos. En los ratones que no fueron tratados con DOX, pudo observarse la formación de hueso y cartílago rodeando el área de trasplante de las cápsulas en las secciones macroscópicas así como en las histológicas. En los receptores jóvenes, el hueso formado alrededor de las cápsulas fue significativamente más destacado que el hueso formado en los receptores viejos. Este mismo modelo se observó en el interior de las cápsulas, en las que se produjo diferenciación condrógena; sin embargo, el modelo se observó a escala menor en los receptores viejos. Estos resultados sugieren que la diferenciación de las células en el interior de las cápsulas podría estar afectada por algunos factores desconocidos del medio del "anfitrión" (mecanismo recíproco).

Conclusiones

Los resultados de los autores indican que los precursores modificados genéticamente, como sistema de administración controlada de rhBMP-2, con encapsulación celular, podría ser una solución elegante. La encapsulación celular permite la separación completa de las células encapsuladas desde el medio del anfitrión y las protege del sistema inmune (Chang 1994; Hortelano 1996). En el trasplante de las cápsulas en el área subcutánea, la formación ósea estuvo bajo control de DOX. El tratamiento de los ratones con DOX inhibió la formación de hueso y cartílago que se observó en los ratones no tratados. Dicho sistema de administración controlada puede utilizarse para administrar gen rhBMP-2 y otros genes por vía local o general, como en las enfermedades similares a la osteoporosis y osteoartritis.

En el modelo de encapsulación también se permite la compartimentación de diferentes componentes del modelo de diferenciación recíproca. El mecanismo paracrino observado fuera de las cápsulas, el mecanismo autocrino dentro de las cápsulas, y el mecanismo recíproco es observado por los efectos diferentes del medio del anfitrión (ratones jóvenes o ratones viejos) en la diferenciación de las células en el interior de las cápsulas. Los datos no publicados de los autores demuestran que, las células mesenquimáticas modificadas genéticamente que expresan condicionalmente a rhBMP-2 pueden transplantarse y diferenciarse in vivo, aumentar la formación ósea en zonas ectópicas y reparar el hueso en fracturas no consolidadas. En la presente memoria los resultados también demuestran que estas células pueden encapsularse y pueden servir como sistema de administración de proteínas para rhBMP-2 u otros productos génicos, por vía general o local, sin trasplante de las células trasplantadas al tejido del anfitrión.

Ejemplo 14 Terapia génica de la zona para hueso que utiliza Ad-BMP-2 (adenovirus que lleva ADNc con BMP-2)

La proteína 2 morfogenética ósea humana recombinante (rhBMP-2), miembro de la superfamilia TGF-\beta, es un agente muy osteinductor que puede producir la formación de hueso en zonas ectópicas como hueso en regeneración. Se ha demostrado que rhBMP-2 produce in vitro diferenciación osteógena de líneas celulares mesenquimáticas y de células de estroma procedentes de la médula. Además, la sobreexpresión de rhBMP-2 produce la diferenciación in vitro de la línea celular C3H10T1/2 mesenquimática.

Las células de estroma de médula (MSC) son células mesenquimáticas pluripotentes que sirven también como precursores para las células osteoprecursoras, que son los mediadores celulares principales para la formación del hueso. In vitro y en presencia de numerosos complementos tales como \beta-glicerofosfato, ácido ascórbico y dexametasona, las MSC pueden diferenciarse en osteoblastos. Además, varias citocinas que incluyen BMP-2 pueden producir la diferenciación osteoblástica de las MSC. Cuando se trasplantan en zonas ectópicas, se ha demostrado que las MSC producen la formación del hueso in vivo.

Las MSC en general, y en particular las MSC humanas, se han considerado seriamente como vehículos para la terapia celular y para la terapia génica. Como vehículos de terapia celular las MSC han sido consideradas principalmente para su utilización en la cicatrización de los defectos de cartílago y hueso o en trastornos como la osteogénesis imperfecta. Como vehículos de terapia génica, las MSC han sido transducidas in vitro para expresar genes (factor IX y hormona del crecimiento) a fin de administrar estos transgenes por vía general, expresando el gen en el medio de la médula ósea. Se ha sugerido que las MSC podrían ser modificadas genéticamente para el tratamiento del hueso, enfermedades relacionadas como la osteogénesis imperfecta y la osteoporosis.

Se ha demostrado asimismo que las MSC se transducen de manera eficaz con vectores adenovíricos y vectores retrovíricos. En este estudio los autores exploraron la posibilidad de aumentar el potencial osteógeno de las MSC in vitro e in vivo mediante transferencia génica de rhBMP-2, utilizando vector adenovírico. Además, se planeó controlar los efectos de la expresión de rhBMP-2 en la diferenciación, proliferación y apoptosis in vivo y en la formación ectópica del hueso in vivo. Finalmente se exploró la posibilidad de introducir adeno-BMP-2 directamente in vivo para crear la terapia génica "directa" destinada a la regeneración del hueso.

Materiales y métodos

Animales: Se utilizaron ratones macho BALB/c de 6 a 7 semanas para recoger las MSC y para trasplantes in vivo. Cultivo celular: Se recogieron células del estroma de la médula ósea (MSC) tal como se describió anteriormente (Gazit et al., 1998). En resumen, se aislaron MSC de los fémures y tibias de ratones BALB/c jóvenes (de 6 a 7 semanas). Se extrajeron las epífisis de los huesos disecados y se expulsó el contenido de la cavidad de la médula ósea a presión hidrostática utilizando medio de cultivo tisular administrado en el espacio de la médula mediante una jeringuilla con una aguja 22G. Las células de médula ósea obtenidas de este modo se volvieron a poner en suspensión en medio de cultivo tisular seguido de pasadas a través de agujas 19G, 21G y 23G; se hizo el recuento de células y se cultivaron durante 12 días en MEM-a enriquecido con FCS al 10%, 100 U/ml de Pen-Strep, glutamina 2 mM y enriquecido con 50 mg/ml de ácido ascórbico, glicerofosfato 10 mM y dexametasona 10-8 M. Se colocaron células de médula en placas de 35 mm (Nunc) y cámara portaobjetos con cuatro pocillos (Nunc), a una densidad de 1,25 \times 105 células/cm^{2}. El día 6, estos cultivos se infectaron con adeno-BMP2 y adeno-lacZ (10 pfu/células en placa = m.o.i.=100 (multiplicidad de infección = pfu/célula) a 37ºC durante dos horas. Se realizo el análisis para diferenciación, proliferación y apoptosis los días dos, seis y 14 tras la infección. Se cultivaron células C3H10T1/2 en DMEM enriquecido con L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina y FCS al 10%. Se infectaron las células a 20 m.o.i. a una confluencia del 70%. La expresión de BMP-2 en células infectadas se demostró por inmunohistoquímica 48 horas después de la infección. Preparación de adenovirus e infecciones: Se preparó virus adeno-BMP-2 recombinante (Ad.5 sub360, zonas E1 y E3 parcial eliminadas; Logan y Shenk, 1984) insertando el fragmento Eco R1 del ADNc de BMP-2 humano en la secuencia Eco RV en el enlazador Ad5, en orientación inversa. Se cortó el plásmido resultante con NotI y se volvió a ligar en la orientación opuesta produciendo la orientación correcta para BMP-2. La expresión de BMP-2 humana fue dirigida por el activador de CMV. Se generó adenovirus recombinante infectando células 293 con el montaje descrito y analizando los clones seleccionados por análisis de transferencia Southern.

Adeno-lacZ recombinante (zonas E_{1} y E_{3} parcial eliminadas) fue una donación del Genetics Institute, Cambridge, MA. La expresión de \beta-galactosidasa (\beta-gal) se condujo desde el activador CMV. Aislamiento de ARN y RT-PCR: Se aisló el ARN total utilizando ARNazol B (Biotecx Lab. Inc., Texas. USA) según el protocolo del fabricante. En resumen, se recogieron las MSC mediante tripsina, los sedimentos celulares se homogeneizaron por ARNazol B. El homogeneizado se mezcló con cloroformo y se centrifugó, lo que proporcionó la fase acuosa superior, la interfase y la fase orgánica del fondo. El ARN se precipitó en la fase acuosa mediante la adición de isopropanol, se lavó y se disolvió en agua. El ARN fue extraído también mediante el Mini Kit RNeasy (QIAGEN Inc., CA. USA).

Se realizó la RT-PCR como se describió anteriormente (Orly et al., 1994) pero con 2 mg de ARNm total. Se diseñaron cebadores de BMP-2 basados en la secuencia murina humana de ADNc de BMP-2 (Wozney et al., 1988). Para la BMP-2 bandas de 492 bp, se utilizaron cebadores de la forma siguiente: el cebador transcrito: 5'-CATCC
CAGCCCTCTGAC-3' el cebador complementario: 5'-CTTTCCCACCTGCTTGCA-3'. Se diseñó RPL19 de referencia interna como se describió anteriormente (Orly et al., 1994). Bioanálisis de W20 para la detección de BMP-2: Para evaluar la secreción de rhBMP-2 activa, se cultivaron las MSC como se describió anteriormente y se incubaron con medio DMEM completo enriquecido con 100 mg/ml de heparina (Sigma H3393) (medio acondicionado). El medio se recogió después de 24 horas, cuatro días después de la infección con los montajes adenovíricos. El bioanálisis de W20 se realizó como se describió anteriormente (Thies, 1992). En resumen, las células W-20-17 se cultivaron con medio acondicionado extraído de cada una de las líneas celulares durante 24 horas. Cultivos paralelos de células W-20-17 se cultivaron con concentraciones crecientes de proteína rhBMP-2. Veinticuatro horas después de la adición de la proteína rhBMP-2 y del medio acondicionado, se determinó la actividad de la fosfatasa alcalina en el lisado de las células W-20-17 por incubación con glicina 50 mM, Triton X-100 0,05%, MgCl_{2} 4 mM y fosfato de p-nitrofenol 5 mM, pH 10,3, a 37ºC durante 30 min. y medición de absorbancia espectrofotométrica a 405 nm. Se evaluó la secreción de rhBMP-2 en medio acondicionado en cada línea celular experimental comparando la actividad de la fosfatasa alcalina en los lisados celulares de W-20-17 (incubados con el medio acondicionado) hasta una curva patrón generada a partir de la actividad de la fosfatasa alcalina de las células W-20-17 incubadas con concentraciones crecientes de rhBMP-2 como se describió anteriormente. Inmunohistoquímica para la detección de BMP-2: Se fijaron las células con metanol acetona y se realizó la inmunohistoquímica utilizando un kit patrón (kit 95-9943 de Zymed). Los autores utilizaron anticuerpos policlonales primarios. 1: dilución 100 de anti-rhBMP-2 de conejo, W8, R230 (Israel et al., 1992) o 20 mg/ml de anticuerpo monoclonal 17.8.1: se incubaron estas mezclas a temperatura ambiente durante una hora. La referencia negativa de los autores para anticuerpos policlonales fue suero de conejo normal; la referencia para anticuerpos monoclonales fue IgG de ratón (referencia negativa universal monoclonal-inmunostaina). Detección de \beta-galactosidasa por tinción histoquímica: Después de dos horas de incubación en paraformaldehido al 4%, se realizó la tinción histoquímica para X-gal fijando las células o la muestra de tejido completa durante 30 min. en una solución de glutaraldehido al 0,25%, fosfato Na 0,1 M (pH 8,3), EGTA 5 mM y MgCl_{2} 2 mM. A continuación se lavaron 3 veces las células con una solución de fosfato Na 0,1 M, MgCl_{2} 2 mM, desoxicolato al 0,1%, Nonident P.40 al 0,2%). Por último, las células se tiñeron por incubación en una solución de 1 mg/ml de X-gal, K_{3}Fe(CN)_{6} 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6}·3H_{2}O 5 mM, fosfato Na 0,1 M, MgCl_{2} 2 mM, desoxicolato al 0,1% y Nonident P.40 al 0,2%, en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Análisis para medición, diferenciación, proliferación y apoptosis. Expresión de fosfatasa alcalina: Para la experimentación de los cultivos de diferenciación se analizó la expresión de la fosfatasa alcalina (ALP). Se realizó la tinción histoquímica de las colonias de MSC para la actividad de ALP utilizando un kit de Sigma (nº 86R). Se hizo el recuento del número de colonias por placas utilizando un microscopio y se midieron las áreas de porcentaje de colonias positivas a ALP en cada placa de 35 mm utilizando análisis morfométrico de imagen automático (Computerized Morphometric System, Galai,
Israel).

Tinción de BrdU: Se cultivaron las MSC en portaobjetos (Nunk); se eliminó el medio de cultivo celular y se sustituyó por la solución diluida de marcado de BrdU. Después de dos horas de incubación a 37ºC, las células se tiñeron inmunohistoquímicamente utilizando el kit de tinción de BrdU de Zymed según las directrices del fabricante (Zymed Laboratories Inc., sur de San Francisco, USA). Los resultados se expresaron en porcentaje del número total de células que presentaba los núcleos marrones (células positivas). Apoptosis: El medio de cultivo se sustituyó por PBS y las células se tiñeron con 10 mg/ml de yoduro de propidio (PI) (Pandey y Wang 1995). Las células que contenían cromatina nuclear muy densa con inclusiones irregulares se definieron como apoptósicas. En las células que no eran apoptósicas el ADN se tiñó moderadamente y homogéneamente en todo el núcleo completo (Keren-Tal et al., 1995). Para referencia positiva se utilizaron las MSC que se trataron con 100 mg/ml de etopósido (Smeyne et al., 1993) durante 6 h.

Para el análisis cuantitativo se seleccionaron al azar cuatro a siete campos microscópicos de cada pocillo, utilizando unas lentes de objetivo de 20\times o 40\times en modo fluorescente. Se hizo el recuento del número de células totales y entre ellas el número de células apoptósicas. Se calculó el porcentaje de núcleos apoptósico para cada campo y los datos se expresaron como media para cada portaobjetos (Karen-Tal et al., 1995). Trasplante in vivo y análisis histológico: Para trasplantes in vivo, se cultivaron las MSC en las condiciones descritas anteriormente. Después de dos semanas en el cultivo, las células se trataron con tripsina y se colocaron en placas a una concentración de 1,6 \times 105 células/pocillo en geles de colágeno vitrogen en placas de 24 pocillos (según las instrucciones del fabricante Vitrogen 100R, Collagen Corporation, USA). Veinticuatro horas después de la colocación en placas en vitrogen, se infectaron las MSC con montajes de adeno-BMP-2 o adeno-lacZ (10-pfu/células en placa). Veinticuatro horas después de la infección, se extrajeron de la placa los geles de colágeno que contenían las células y se trasplantaron en una zona subcutánea de ratones BALB/c macho jóvenes (6 a 8 semanas); esto se denomina trasplante clónico. Se sacrificaron los ratones a los 10 o a los 20 días después del trasplante. En otro análisis, las MSC se infectaron dos veces con adeno-BMP-2 y adeno-lacZ (cada una a m.o.i. = 100) y se trasplantaron en ratas Sprague-Dawley por vía subcutánea en el abdomen y se sacrificaron después de 7 ó 20 días.

Para la administración directa de adeno-BMP-2 in vivo, se montaron una suspensión vírica de 3 \times 109 pfu de adeno-BMP-2 recombinante y 3 \times 109 pfu de adeno-lacZ en esponjas de colágeno (CholestatR, Vitaphore Corporation, 2 mm \times 2 mm \times 4 mm de tamaño) y se administraron directamente en el tejido abdominal subcutáneo de ratones BALB/c. Se sacrificaron los ratones los días 10 y/o 20 después del trasplante. Se evaluaron las muestras impregnándolas en parafina y tiñendo las secciones de 7 \mum con H&E. Los trasplantes de adeno-lacZ se procesaron por tinción histoquímica X-gal de montaje completo, seguido de evaluación histológica.

Resultados Caracterización in vitro

Como se determinó mediante el porcentaje de células positivas a \beta-galactosidasa (\beta-gal) de las células totales infectadas, se observó que la infección de MSC por adeno-lacZ era muy eficaz (más del 90%). Cuatro días después de la infección, se determinó la secreción de rhBMP-2 por bioanálisis (véase Métodos) y se observó que era tres veces más elevada en los cultivos infectados con adeno-BMP-2 que en los cultivos de referencia. Los niveles de secreción fueron 22\pm2,57 ng/24 horas/10^{6} células en los cultivos infectados con adeno-BMP-2 en comparación con 8\pm0,74 ng/24 horas/10^{6} células en cultivos de referencia. La expresión que se detectó en cultivos no infectados era debida a la expresión endógena de los genes de BMP murinos. Se observó la expresión de BMP-2 utilizando inmunohistoquímica dos días después de la infección por adeno-BMP-2 y RT-PCR cuatro días después de la infección con adeno-BMP-2. Además de esto, se detectó la expresión de BMP-2 también en la línea celular C3H10T1/2 infectada con Ad-BMP-2, 48 horas después de la infección. Se observaron descubrimientos interesantes con respecto a la diferenciación, proliferación y apoptosis de las MSC infectadas con adeno-BMP-2. Se observó que la diferenciación (determinada por la expresión de ALP) aumenta significativamente en función del tiempo después de la infección y los valores absolutos fueron mayores en los cultivos infectados con adeno-BMP-2 que en las referencias a los dos, seis y 14 días después de la infección. Se midió la proliferación mediante coloración con BrdU: el porcentaje de células positivas a BrdU fue significativamente mayor en las células infectadas con adeno-BMP-2 que en las referencias a los dos, seis y 14 días después de la infección. Se midió la apoptosis mediante tinción con PI: en el caso de la apoptosis los resultados estaban en oposición a los que se obtuvieron para diferenciación y proliferación. La fracción de células que eran apoptósicas en los cultivos infectados con adeno-BMP-2 fue menor que en los cultivos de referencia. En ambos cultivos experimental y de referencia el porcentaje de células apoptósicas disminuyó con el tiempo, indicando que BMP-2 mejora la diferenciación y proliferación e inhibe la apoptosis en MSC infectada con
adeno-BMP-2.

Formación ectópica del hueso in vivo

Las MSC cultivadas en vitrogén e infectadas con adeno-BMP-2 o con adeno-lacZ como referencia, se trasplantaron a un área subcutánea en el área del abdomen de ratones BALB/c macho. Diez días después del trasplante se pudo observar el comienzo del tejido mineralizado del hueso en MSC infectadas con trasplante de adeno-BMP-2 y se observó un número creciente de vasos sanguíneos en el área del trasplante (comparada con la referencia). En cambio, el tejido mineralizado no se observó en los ratones trasplantados con las MSC infectadas con adeno-lacZ. Veinte días después del trasplante de las MSC infectadas con adeno-BMP-2, se observó la formación de hueso y de vasos sanguíneos en la zona del trasplante.

Las MSC murinas (BALB/c) infectadas al doble con adeno-BMP-2 y adeno-lacZ se trasplantaron a ratas Sprague-Dawley. Siete días después del trasplante, se detectaron células positivas a \beta-gal en el tejido de rata sin señales de células inflamatorias. Veinte días después del trasplante, se observó tejido mineralizado en la zona del trasplante. Estos resultados indican que las MSC de una especie diferente a la del animal anfitrión (trasplante heterogeneico) pueden sobrevivir y producir la formación del hueso en el tejido del anfitrión. Hueso ectópico formado por administración directa de adeno-BMP-2: Se observó la formación de hueso producida veinte días después de administrar directamente una alícuota de 3 \times 10^{9} pfu de adeno-BMP-2 al tejido subcutáneo en una matriz de esponja de colágeno. No se observaron señales de formación de hueso después de la administración directa de adeno-lacZ (3 \times 10^{9} pfu) al tejido subcutáneo, 10 días después del trasplante. Sin embargo se observaron células musculares positivas a \beta-gal alrededor del área del trasplante, indicando la eficacia de los vectores adenovíricos para transducir las células en tejido subcutáneo in vivo.

Exposición

BMP-2 recombinante humana es conocida por producir la formación del hueso in vivo (Wozney et al., 1988; Wang et al., 1990; Volek-Smith y Urist, 1996) y por favorecer la diferenciación osteógena de las líneas celulares mesenquimática y del estroma de la médula in vitro (Katagiri et al., 1990; Chen, et al., 1991; Thies et al., 1992; Rosen et al., 1994; Chudhari et al., 1997; Yamaguchi et al., 1995; Yamaguchi et al., 1996; Hughes et al., 1995) así como de cultivos primarios (Rickard et al., 1994; Puleo et al., 1997; Hanada et al., 1997; Balk et al., 1997). Además se ha demostrado que la sobreexpresión de rhBMP-2 en la línea celular mesenquimática C3H10T1/2 producía diferenciación osteógena de estas células (Ahrens et al., 1993; Wang et al., 1993; Gazit et al., 1997). Los resultados de los autores indican que la proteína rhBMP-2 aumenta la diferenciación osteoblástica en las MSC tanto in vitro como in vivo, acelerando la diferenciación de las células comprometidas o comprometiendo células no comprometidas para diferenciar en la serie de reacciones osteoblásticas (datos no publicados).

Los descubrimientos de los autores también indican que la presencia de la proteína rhBMP-2 altera los parámetros celulares in vitro de las MSC, incluyendo la diferenciación, proliferación y apoptosis (datos no publicados). Basándose en estos descubrimientos, se supone que las MSC que se infectan de manera eficaz con adeno-BMP-2 pueden producir un efecto similar al descrito para la proteína BMP-2. Se descubrió que en las MSC infectadas con Ad-BMP-2 la diferenciación y proliferación celular aumentó pero la apoptosis se redujo. Es interesante indicar que en dichas MSC infectadas con adeno-BMP-2, la tasa de diferenciación aumentó y la tasa de apoptosis disminuyó en los cultivos que se mantuvieron más tiempo. Puesto que se supone que la apoptosis se produce principalmente en las células que no se han diferenciado, es posible que la reducción en la apoptosis sea un resultado indirecto del aumento de la diferenciación. Dado que la proliferación tiene lugar en la etapa inicial de la diferenciación (Shukunami et al., 1998), un mecanismo similar puede explicar el aumento de la tasa de proliferación de MSC. En los cultivos de referencia se observó también un aumento de la diferenciación y una reducción de la apoptosis, probablemente debidos a la expresión del gen endógenos de BMP murina (detectado en el bioanálisis). Sin embargo, la infección de estos cultivos de referencia con un vector adenovírico que codifica la BMP-2 humana produjo un aumento de tres veces en la expresión de rhBMP-2, detectada por bioanálisis. Dado que se descubrió que las MSC pueden transducirse con eficacia con un vector adenovírico, estas células modificadas genéticamente serán capaces de producir formación de hueso in vivo. Por lo tanto pueden utilizarse como productoras en terapia génica para cicatrizar lesiones óseas. La producción in vivo de la formación ósea por las MSC transducidas es de esperar que se produzca no solamente mediante el mecanismo paracrino de la rhBMP-2 expresada en las células huésped, sino también por el mecanismo autocrino del transgén en las propias MSC. Mediante este mecanismo autocrino, ellas se producen para diferenciarse y puede de este modo formarse el hueso (sistema de diferenciación recíproco, Gazit et al., 1997). De hecho, los resultados in vivo demuestran que las MSC infectadas con adeno-BMP-2 pueden producir formación del hueso en zonas subcutáneas ectópicas. Además, las MSC de ratón infectadas con adeno-BMP-2 puedieron sobrevivir y formar hueso en ratas sin ninguna prueba de reacción inmunitaria aún cuando las ratas no habían sido inmunosuprimidas. Estos resultados indican que las MSC modificadas genéticamente tienen un potencial osteógeno significativo incluso en diferente especies sin producir respuesta inmunitaria a las células del vector vírico. Se descubrió también que la administración directa de adeno-hBMP-2 presenta efecto osteógeno in vivo, lo que indica que el montaje adeno-BMP2 puede penetrar en el tejido del anfitrión eficazmente y expresar rhBMP-2 allí. Estos descubrimientos abren una nueva vía en la terapia génica del hueso. La transducción eficaz de las MSC fue descrita anteriormente con vectores retrovíricos (Li et al., 1995) y adenovíricos (Foley, 1997; Balk, 1997). Aunque se han descrito grandes eficacias de infección por retrovirus (Li et al., 1995; Chuah et al., 1998), generalmente dichas tasas de eficacia son bajas, significativamente menores que las tasas de infección con vector adenovírico. A diferencia de los retrovirus, la expresión de los vectores adenovíricos es de vida corta ya que no se integra en el genoma de las células infectadas. Por este motivo, los adenovirus se consideran más seguros para utilización terapéutica que los retrovirus (Roemer y Friedmann, 1992; Kozarsky y Willson, 1993). Esto presentaría ventajas cuando la actividad biológica temporal y controlada de las células infectadas sea deseable. Como se describe en la bibliografía, la utilización de las MSC transducidas para la terapia génica se ha centrado principalmente en la administración paracrina de proteínas para efectos generales, como se describe para los modelos hemofílicos (Lozier et al., 1994; Gordon et al., 1997; Hurwitz et al., 1997; Chuah et al., 1998) o para la producción de citocinas que afecta al medio hemopoyético (Allay et al., 1997; Foley et al., 1997). La sugerencia de que las MSC transducidas pueden utilizarse para tratar enfermedades óseas (Balk et al., 1997; Prockop. 1997) se confirma por los datos de los autores que demuestran que la transducción génica de adeno-hBMP-2 de las MSC aumenta su diferenciación osteógena in vitro y la formación del hueso in vivo. Se llega a la conclusión de que las MSC pueden transducirse eficazmente con una BMP-2 humana que codifica al vector adenovírico. El potencial osteógeno tanto in vitro como in vivo de dichas células transducidas aumenta. Estos resultados apoyan la utilización futura de dicho sistema para la terapia génica ex vivo para las enfermedades de cicatrización ósea. Los descubrimientos de los autores indican que los vectores adenovíricos que llevan ADNc de rhBMP-2 pueden infectar eficazmente células huésped in vivo, y de este modo aumentar la expresión local de
rhBMP-2.

Ejemplo 15 Trasplantes de células C3H10T1/2 modificadas genéticamente (i.m. 10/20 días), con excipiente de esponjas de colágeno en ratones C3H Objetivo

La diferenciación condroblástica y osteoblástica in vitro y la formación del hueso oncondral in vivo están dirigidas y dependen de las cascadas de señalización activadas por las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y sus receptores. Las BMP son miembros de la superfamilia del factor \beta transformante del crecimiento. Las BMP son conocidas por estimular la diferenciación de las células madre precursoras pluripotentes en el cartílago y el hueso. C3H10T1/2 es una línea celular precursora pluripotente que puede iniciar la serie de reacciones osteógenas y/o condrógenas en el momento de la adición exógena o la expresión recombinante de varias BMP. Se han identificado la BMP-2, para la que se caracterizaron dos receptores de tipo I [BMPR-IA (Alk3) y BMPR-IB (Alk6)] y un receptor de tipo II (BMPR-II). No está claro si tanto BMPR-IA como BMPR-IB son necesarios para mediar el comienzo y evolución de la diferenciación celular en la dirección de la formación de cartílago y/o hueso o si uno de ellos es sufi-
ciente.

Los datos preliminares de los autores demostraron que las células C3H10T1/2 que expresan a BMP-2 recombinante se diferencian en los condroblastos y osteoblastos in vivo. Aquí se caracterizará la diferenciación in vivo de las células C3H10T1/2 que expresan diferentes tipos de receptores, utilizando los trasplantes de células ectópicas en ratones
C3H.

Definiendo dichos mecanismos de señalización pudo prepararse el terreno para el diseño de nuevas modalidades terapéuticas en el trasplante de células C3H10T1/2 modificadas genéticamente para la terapia génica destinada a la formación de hueso endocondrial o a la formación del cartílago en fracturas, osteoporosis y osteoartritis.

Líneas celulares

1.: C3H10T1/2-BMP2: (línea celular C3H10T1/2 que sobreexpresa a hBMP2);

2.: C3H-PTHR: (línea celular C3H10T1/2 que sobreexpresa al receptor de PTH);

3.: C3H-BMP2-PTHR: (línea celular C3H10T1/2 que sobreexpresa a los receptores tanto de hBMP2 como de PTH);

4.: C3H-dominante negativa (dn) Alk 3 (receptor de tipo I A)-BMP2 (montaje C3H10T1/2-LacZ que sobreexpresa a rhBMP2 y receptor de tipo I A dominante negativo;

5.: C3H-dominante negativa (dn) Alk 6 (receptor de tipo I B)-BMP2 (montaje C3H10T1/2-LacZ que sobreexpresa a rhBMP2 y receptor de tipo I B dominante negativo.

Exposición razonada

El objetivo de este estudio es determinar los efectos in vivo de las alteraciones genéticas anteriores realizadas en receptores de la superficie de C3H y definir el mecanismo que determina la formación de cartílago y/o de hueso. Suponiendo que las diferentes líneas celulares estén comprometidas en diferentes series de reacciones de diferenciación, lo que debería reflejar su modelo de diferenciación in vivo y debería conducir a nuevas modalidades en la terapia génica mediada por células.

Métodos Líneas celulares y condiciones de cultivo

Se aislaron los clones de BMP-2, PTHR y BMP2-PTHR que expresan a rhBM-2, PTHR y los genes tanto de rhBMP-2 como de PTHR, respectivamente y se seleccionaron de entre las células C3H10T1/2 que habían sido transfectadas por plásmidos que codifican a hBMP-2 y PTHR de rata (BMP2-PTHR se transfectó dos veces). En ambos casos, la transcripción génica es dirigida desde la secuencia LPR del virus de sarcoma mieloproliferante (MPSV). Células C3H10T1/2 de referencia o transfectadas con BMP se seleccionaron por cotransfección con un plásmido que media la resistencia contra la puromicina (5 \mug/ml). Las células C3H10T1/2 transfectadas con PTHR de rata se seleccionaron por cotransfección con el plásmido que media la resistencia contra G418 (750 \mug/ml).

Las células se cultivaron en DMEM enriquecido con L-glutamina (2 mM), penicilina y estreptomicina (100 unidades/ml) y FCS al 10%.

Procedimiento de trasplante

Para el trasplante in vivo se cultivaron líneas celulares en cultivos a confluencia durante una a dos semanas (en las mismas condiciones mencionadas anteriormente). Después de dos semanas se trataron las células con tripsina, se recogieron, se hizo el recuento y se montaron aproximadamente 2,5-3,0 \times 10^{6} células en esponjas de colágeno esterilizadas cortadas previamente "Collastat®" (tamaño: 3 mm \times 3 mm \times 2 mm), que se utilizaron para administrar las células en la zona intramuscular de trasplante (músculo rectal abdominal) de ratones hembra C3H/HeN, de 6 a 8 semanas.

Los animales se anestesiaron (xilazina al 2% y cetamina al 8,5%, se inyectaron i.p.) y las células se montaron en la esponja de colágeno colocada en la cavidad intramuscular formada durante un periodo de 10 o 20 días.

Análisis histológico e histoquímico

Se sacrificaron los ratones los días 10 y 20 después de los trasplantes. El trasplante y los tejidos asociados se revistieron, se fijaron en formaldehído al 4%, se descalcificaron con solución De-cal (National Diagnostic, Atlanta, GA) durante la noche a temperatura ambiente y se impregnaron en parafina, utilizando la técnica habitual. Se cortaron secciones de 7 a 10 \mum y se montaron en portaobjetos y se tiñeron con H&E.

Para la histoquímica de X-gal se fijaron muestras de tejido en paraformaldehído al 4% y se procesaron según el protocolo habitual de histoquímica de X-gal, se impregnaron en parafina y se cortaron secciones de 20 a 30 \mum y se montaron en portaobjetos. Las secciones se tiñeron por contraste con rojo nuclear rápido (NFR) para detectar las células azules positivas a \beta-gal.

Resultados

Se realizó la evaluación morfológica de los tejidos implantados analizando la formación de cartílago y/o hueso en las zonas proximal y distal a la esponja de colágeno.

C3H10T1/2-BMP2
Día 20:	\begin{minipage}[t]{65mm} Huesecillo con cartílago hipertrófico (HC), hueso (B) y médula ósea (BM)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{65mm} Esponja rellena con cartílago proliferante\end{minipage}
PTHR
Días 10 y 20:	Ninguna célula ni formación de tejido.	Tejido conectivo (CT) únicamente.
BMP2-PTHR
Día 10:	Ninguna célula ni formación de tejido.	Tejido conectivo y cartílago (C)
Día 20:	Ninguna célula ni formación de tejido.	\begin{minipage}[t]{65mm}Tejido conectivo y cartílago que rellena la esponja de colágeno.\end{minipage}
dn Alk 3 (LA dominante negativo = Alk3)-BMP2 (LacZ)
Día 10:	Ninguna célula ni formación de tejido.	Tejido conectivo únicamente.
Día 20:	Ninguna célula ni formación de tejido.	Tejido conectivo y cartílago.
dnAlk 6 (IB dominante negativo = Alk 6)-BMP-2 (lacZ)
Día 10:	\begin{minipage}[t]{65mm} Cartílago (C), partículas óseas mineralizadas (BP) y nota: células positivas a \beta\text{-}gal (+) que revisten la BP.\end{minipage}	Tejido conectivo (CT) únicamente.
Día 20:	\begin{minipage}[t]{65mm} Cartílago hipertrófico (HC), partículas mineralizadas de hueso del cartílago.\end{minipage}	Partículas óseas mineralizadas (BP).

Conclusiones

Los resultados de los autores indican claramente que la alteración de los receptores de la superficie de las células en las células precursoras pluripotentes, como C3H10T1/2, ejercen un efecto mayor en la serie de reacciones de diferenciación de estos clones in vivo. La expresión de los receptores de Alk6 (IB) dominantes negativos dirigió la diferenciación in vivo hacia la formación de hueso y cartílago. En cambio, la expresión de Alk3 dominante negativo dio como resultado la formación de cartílago. La sobreexpresión de los receptores de PTH produjo también la formación de cartílago (in vivo). Los resultados demuestran que los receptores de BMP2 de tipo IB e IA transmiten diferentes señales mediante los precursores genéticamente modificados y desempeñan una función crítica en la diferenciación osteógena y por lo tanto pueden utilizarse para la terapia génica modificada por células destinada a las enfermedades óseas y/o de cartílagos como la osteoartritis y la osteoporosis.

Las descripciones anteriores detallan actualmente las formas de realización preferidas de la presente invención. En consideración a estas descripciones es de esperar que se produzcan numerosas modificaciones y variaciones forman la práctica de éstas por los expertos en la materia. Estas modificaciones y variaciones son parte de la presente invención y se considera que están comprendidas en las reivindicaciones adjuntas a esta memoria.

Claims

1. Método para la producción de células destinadas a la implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a): transformar una célula madre mesenquimática humana cultivada con un ADN que codifica la proteína 2 ósea morfogenética (BMP-2); y

(b): cultivar la célula madre mesenquimática humana transformada en la etapa (a), mediante la cual las células producidas expresan a BMP-2 y son adecuadas para su implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada es una línea de células madre mesenquimática.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada es una célula primaria.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada expresa un receptor endógeno de BMP.

5. Método para la producción de células destinadas a la implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a): transformar una célula madre mesenquimática humana cultivada con un ADN que codifica la proteína 2 ósea morfogenética (BMP-2); y un ADN que codifica un receptor de BMP; y

(b): cultivar la célula madre mesenquimática humana tranformada en la etapa (a), mediante la cual las células producidas expresan a BMP-2 dicho receptor de BMP y son adecuadas para su implantación en el sitio de una enfermedad ósea en un ser humano.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada es una línea de células madre mesenquimática.

7. Método según la reivindicación 5, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada es una célula primaria.

8. Método según la reivindicación 5, en el que dicha célula madre mesenquimática humana cultivada expresa un receptor endógeno de BMP.