ES2256269T3 - Reactivo multiespecifico para la estimulacion selectiva de receptores de la superficie celular. - Google Patents

Abstract

Fragmento anticuerpo biespecífico exento de Fc con un enlace monovalente para un receptor letal y como mínimo, con un enlace para un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral.

Description

Reactivo multiespecífico para la estimulación selectiva de receptores de la superficie celular.

El presente invento se ocupa de la activación selectiva de receptores sobre la superficie de la célula. El invento se refiere especialmente a fragmentos de anticuerpos biespecíficos, exentos de Fc con un enlace monovalente para un receptor letal y como mínimo, un enlace para un antígeno superficial celular específico de célula tumoral.

Es conocido en general, que señales extracelulares pueden transmitirse a través de la membrana de plasma mediante proteínas receptoras, que se hallan en situación de transformar los enlaces extracelulares de los ligandos en un episodio bioquímico intercelular. De este modo, los receptores superficiales celulares activan vías de señales intracelulares que conducen a distintos puntos de la célula y allí desencadenan un determinado episodio.

Todos los receptores superficiales celulares son proteínas transmembrana o complejos proteínicos que establecen una unión entre el interior y el exterior de la célula. Muchos receptores, experimentan una determinada alteración en la conformación proteínica, cuando su correspondiente Ligando queda unido. En algunos tipos de receptor esta alteración de la conformación provoca la abertura de un canal de iones, mientras que en otros receptores la alteración de la conformación conduce a que el ámbito citoplástico del receptor quede influido de tal modo que éste pueda asociarse con proteínas y enzimas señalizadoras intracelulares y luego, activarlas.

Un efecto decisivo de la unión de ligandos con los receptores, consiste frecuentemente en multimerizar o reticular el receptor y con ello, poner en marcha la cascada señalizadora intercelular. Tal reticulación transversal de los receptores superficiales, puede bien tener lugar por ligandos fisiológicos de los receptores, como también in vitro p. e. por los correspondientes anticuerpos reticulantes transversales.

En cuanto a los linfocitos, por ejemplo podría decirse, que una estimulación de los receptores específicos antigénicos por la formación de fragmentos F(ab'), que sólo disponen de un único radical, no es posible, mientras que mediante fragmentos anticuerpo (FaB')_{2}, que también disponen de dos enlaces, da lugar a los receptores Cluster y las células son activadas. En cualquier caso se consigue una fuerte reacción, cuando los linfocitos son estimulados por anticuerpos intactos, que se hallan unidos a las células que portan los receptores para la fracción Fc de las globulinas inmunes. En otras palabras, una activación tiene lugar, cuando los receptores son reticulados de este modo transversalmente de forma efectiva de modo que éstos se unen a múltiples moléculas de anticuerpos idénticas, que son preparadas por otras células, que disponen de receptores-Fc para las regiones constantes de anticuerpos intactos. Con los anticuerpos inmovilizados de este modo, los receptores son reticulados transversalmente de forma eficaz.

Este tipo de reticulación transversal, puede conseguirse por un lado in vitro, de forma que los ámbitos constantes de los anticuerpos unidos a los receptores mediante proteína A sean reticulandos transversalmente o bien mediante otros anticuerpos, que se unen específicamente en los ámbitos constantes de los anticuerpos unidos a los receptores.

Para los miembros de la familia del TNF (Factor de Necrosis Tumoral), es conocido, p.e. que actúan como trimeros y que la trimerización inducida por los ligandos es para sus receptores, el episodio crítico en la inicialización de la transmisión de la señal.

Dhein et al. "Inducción de la apoptosis por anticuerpos monoclonales anti-APO-1 variantes de cambio de clase en función del reticulado transversal de los antígenos de superficie celular APO-1", del Journal of Immunology, tomo 149, 1992, páginas 3166-3173, en donde se describe como una efectiva reticulación transversal de los antígenos superficiales celulares APO-1 conducen a la inducción de la apoptosis. Aquí nos demuestran que con SKW6. 4 se indujo la apoptosis celular, si en el receptor APO-1 se unen fragmentos anti-APO-1 F (Ab')_{2}, que son reticulados transversalmente por medio de un anticuerpo ratón-antioveja, que en este caso sin embargo, no basta únicamente con la unión de fragmentos de F (ab')_{2}. De estos resultados, se saca la conclusión de que la bivalencia del anticuerpo, que también presenta dos enlaces para los antígenos superficiales celulares APO-1 que no es suficiente para inducir la apoptosis, sino que para ello es necesario una reticulación transversal efectiva de los antígenos superficiales celulares APO-1.

La secuencia de los antígenos APO-1 así como un anticuerpo monoclonal contra los antígenos APO-1 se describen en el documento US 5,891,434. Esta descripción de patente menciona, que los anticuerpos anti APO-1 pueden utilizarse para el tratamiento de tumores, que portan antígenos APO-1, con lo cual los anticuerpos por otra parte, puedan también utilizarse para inducir apoptosis en diversos tipos de células.

Sin embargo, es sabido, que muchas células del cuerpo son portadoras de antígenos superficiales celulares APO-1, de modo que la administración de un anticuerpo anti-APO-1 en el caso de pacientes con tumores, no sólo conduce a un ataque contra las células tumorales, sino también contra otras, que se hallan sanas y posiblemente sea necesario mantenerlas vivas, y que a su vez son portadoras de antígenos superficiales celulares APO-1.

Ogasawara et al. Pudieron presentar en un importante trabajo en (Nature 364, 806-809 (1993)), que tras la inyección de un anticuerpo monoclonal anti-APO-1, ratones tipo salvaje morían dentro de 2 a 6 horas. Los ratones presentaban además severos daños en el hígado. La causa de ello se debió a la provocación de apoptosis en los hepatocitos por la formación de anticuerpos anti-APO-1 en el receptor APO-1, presente sobre la superficie de las células del hígado en gran densidad, así como a la inducción de una respuesta celular citotóxica, que de nuevo se ha visto favorecida por la fracción Fc de las moléculas anticuerpo.

Ante estos antecedentes, el empleo de los conocidos anticuerpos anti-APO-1 para la destrucción selectiva de células tumorales, y con ello, para el tratamiento de pacientes con tumores, el caso no resulta plenamente apropiado sino que con algunas condiciones.

Coney et al. (Int. J. Cancer 58, 562-567 (1994)) describen la elaboración y caracterización de un quimérico anticuerpo anti-APO-1 (murino/humano) incluyendo la fracción Fc que inducen apoptosis en células malignas y con ello favorecen la regresión de tumores.

En WO 94/20625 se reveló el anticuerpo biespecífico integral, que unen los tipos 1 receptor TNF (TNF-R1) y el antígeno-Fas (sinónimo del APO-1) y de ahí el que puedan emplearse para la lisis o para el bloqueo del crecimiento de células malignas. En WO 99/48527 se revelaron los anticuerpos biespecíficos intactos, dirigidos contra el APO-2 y HER2 y que conducen a una apoptosis severa.

Otro receptor letal, que puede activarse mediante la reticulación transversal, son los receptores TRAIL (Ligandos inductores de apoptosis vinculados a TNF)-R1 y R2; véase Griffith et al., "Análisis funcional de los receptores TRAIL empleando anticuerpos monoclonales", The Journal of Immunology, tomo 162, 1999, páginas 2597-2605. Los autores relatan que todos los anti-TRAIL-R2 y dos de los anticuerpos anti-TRAIL-R1 no pueden inducir ninguna lysis o si lo consiguen, lo hacen mínimamente en las células melanomas sensibles a TRAIL, si estas células se agregan en solución, pero que sin embargo, muestraron una elevada capacidad lytica al ser inmovilizadas en la placa de cultivo, de modo que éstas pudieron hacer posible la reticulación transversal de los receptores mortales TRAIL-R1 y -R2.

También los anticuerpos actúan de forma no específica contra los receptores letales TRAIL-R1 y -R2 sobre células sensibles a TRAIL, de modo que éstas tan sólo presentan una mínima utilización terapéutica.

A partir de aquí se sabe, que los denominados anticuerpos biespecíficos con una especificidad para un antígeno asociado a un tumor y otra especificidad para un antígeno superficial de células de defensa del sistema inmunológico, como por ejemplo las macrófagas, los linfocitos T o las células naturales asesinas, que son activadas a través de este vínculo por lo que pueden utilizarse para la terapia inmunológica del cáncer, a fin de dirigir la actividad de las células de defensa sobre cada una de las células diana.

Los anticuerpos biespecíficos son en general anticuerpos, que pueden formar dos distintos epítopes, siendo monovalentes para cada epítope. Estos se elaboran bien sea mediante oxidación de los fragmentos monovalentes F(ab') transformándose en un fragmento F(ab')_{2}, o mediante fusión de dos líneas celulares híbridas, transformándose en un hibridoma-híbrido o bien células Quadroma o incluso un recombinado.

Jung et al., en el documento "Activación de célula T inducida por célula objetivo con fragmentos de anticuerpo y triespecíficos", Eur. J. Immunol., tomo 21, 1991, páginas 2431-2435 describiendo la elaboración de fragmentos híbridos F (ab) biespecíficos, que para cada antígeno son monovalentes.

Los autores señalan que mediante anticuerpos o fragmentos biespecíficos puede realizarse una activación inducida de células T mediante células diana, para lo cual los anticuerpos, por un lado, se unen a los antígenos objetivo sobre las células diana y por otro, se unen a los receptores CD3 y/o CD28 sobre las células T.

También Segal et al., en el documento "Anticuerpos biespecíficos en la terapia del cáncer", de Current Opinión in Immunology, tomo 11,1999, páginas 558-562 describen así mismo la aplicación de anticuerpos biespecíficos, mediante los cuales una célula efectora es conducida a una célula diana, que de no ser así no hubiese podido ser reconocida. Por este motivo los anticuerpos biespecíficos se unen a una molécula superficial sobre la célula objetivo tal como a un receptor superficial, sobre la célula efectora.

Roosnek et al., en el documento "Activación de la célula T mediante un anticuerpo de clase I anti-CD3/anti-complejo de histocompatibilidad alta", de Eur. J. Immunol., tomo 20, 1990, páginas 1393-1396 pudieron demostrar, que un anticuerpo biespecífico con una especificidad tanto para MHC como también para CD3 - ambos exprimidos sobre células T - pudieron inducir una proliferación efectiva de células T, mientras que una mezcla de los dos anticuerpos originales, no pudieron conseguirlo. Los autores plantean la hipótesis de que este efecto sinergético debe imputarse a una interferencia del anclaje del complejo CD3/receptor celular-t en la membrana. Ellos se basaron en que el receptor celular T no puede distinguir si él está anclado en una célula que presenta un antigeno (APC) o bien en una molécula superficial dentro de la propia membrana.

De ahí que especulasen sobre que el complejo CD3/receptor celular T, que en vivo es provocado por un antígeno sobre otra célula, reacciona acusando alteraciones en su movilidad dentro de la membrana.

Sin embargo, todavía no se ha aclarado el mecanismo de esta activación del receptor celular T, que se limita a determinadas subpobulaciones de células T. Del nivel actual de la técnica, se dedujo que se trata de un efecto específico receptor célula T, que probablemente estriba en que junto al receptor celular T se estimula un correceptor como el CD4 o el CD8, que así mismo genera una señal por estimulación, véase Emmrich et al., Eur. J. Immuno, 18,645 (1988).

El presente invento se basa en consecuencia en la misión de ofrecer un nuevo tipo de fragmentos anticuerpo para la destrucción selectiva de células tumorales sin influencia negativa, simultánea para las células sanas. El problema se soluciona mediante los fragmentos anticuerpo exentos de Fc biespecíficos según las reivindicaciones con enlace monovalente para un receptor letal y como mínimo otro enlace para un antígeno superficial celular específico de célula tumoral. Con la ausencia de una fracción Fc se impedirá, que los fragmentos anticuerpo se unan a las células portantes de receptor Fc y así de forma no selectiva desencadenen la destrucción celular.

Los receptores superficiales celulares que precisan de una estimulación multimédica no deben obligatoriamente ser reticulados transversalmente mediante inmovilizados o p.e. mediante proteína A o bien otro anticuerpo unido a un anticuerpo. Fragmentos anticuerpos biespecíficos sin Fc que pueden ser reconocidos en el contexto del presente invento, también inducen una estimulación restringida a los antígenos objetivo de los receptores superficiales
celulares.

Con la ayuda de los fragmentos anticuerpos a los que se refiere el invento, existe la posibilidad de seleccionar un tipo determinado de célula mediante los antígenos diana y sobre este tipo de célula activar el correspondiente receptor superficial celular para lo cual el receptor superficial celular, será un receptor letal y el antígeno diana será un antígeno superficial celular específico de célula tumoral.

De los dos enlaces del fragmento anticuerpo, uno de ellos corresponde a la función, o sea el receptor superficial celular, y el otro para la especificidad, esto es responsable de la restricción del antígeno objetivo. Partiendo de los conocimientos del descubridor, tiene lugar una reticulación transversal efectiva de los receptores superficiales celulares incluso y justamente cuando ambos antígenos se exprimen sobre la misma célula. Este resultado es cuando menos sorprendente, por cuanto para estado actual de la técnica, no quedaba claro en qué forma los anticuerpos biespecíficos podían ser agentes de una reticulación transversal entre un receptor funcional y un receptor objetivo que bastase para incitar al receptor funcional, incluso cuando ambos receptores son exprimidos sobre la misma célula.

El inventor de la presente declaración ha deducido, partiendo de distintos experimentos propios, que de este modo biespecífico, p.e. el receptor letal APO-1 o las células que presentan antígenos (APCs) pueden ser estimuladas mediante la estimulación de CD4O (otro miembro de la familia del receptor TNF) empleando distintos antígenos diana, que también pueden tener una función de señalización, si bien no deberían, con lo cual la estimulación de las APCs no constituyen parte del descubrimiento.

Basándonos en el trabajo de Roosnek et al. a.a.O. así como Emmrich et al a.a.O. esto no era de esperar, sino que precisaba de una amplia verificación experimental.

Con la utilización de los fragmentos anticuerpo a los que se refiere el invento, ahora existe la posibilidad, p.e. de estimular receptores letales sobre determinadas células ob, para de este modo destruir selectivamente células cancerígenas o bien el marco de una supresión inmunológica y exprimir los receptores letales a las células T activadas, para provocar en ellas la muerte celular apoptótica, con lo cual la última aplicación no constituye parte componente del presente invento.

Los fragmentos anticuerpo a los que se refiere el invento, pueden emplearse también en una formulación farmacéutica con un excipiente farmacéutico compatible, que especialmente con los anticuerpos contra los receptores letales se evite una especificidad dañina según el invento, mediante la restricción sobre los antígenos objetivo.

Así por ejemplo, en la introducción del mencionado documento US 5,891,434 se describen por qué procedimientos pueden elegirse los excipientes farmacéuticos compatibles, las formulaciones etc.

Las condiciones básicas que deben satisfacer los fragmentos anticuerpo según la reivindicación 1, consiste en que se debe disponer de dos enlaces, esto es uno para un receptor letal y otro para un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral, ambos siendo exprimidos sobre la misma célula.

La técnica-DNA recombinante, facilita la síntesis de distintos anticuerpos biespecíficos, esto es, de los anticuerpos tandem y de los Diabodis. En los anticuerpos tandem, los genofragmentos para dos scFv (proteínas que enlazan antígenos con cadena sencilla) se unen en una secuencia de eslabones y se sintetizan como un péptido. En los diabodis, se exprimen en una célula dos scFv, que a menudo tienden a un tipo de dimerización, en la que la región variable de la cadena ligera no se haya alojado en la región variable de "su" cadena pesada, sino que lo hace en la segunda molécula-scFv, sin que se unan por enlace covalente. De este modo, se pueden generar Diabodis biespecíficos, en los que las secuencias-DNA de la región variable de las cadenas ligeras de ambas moléculas-scFv a combinar, pueden intercambiarse entre si con vectores de expresión. Después de su síntesis, las regiones variables almacenan los antígenos específicos de las cadenas ligeras y pesadas, unas con otras y forman una molécula anticuerpo recombinada con dos especificidades diferenciadas.

La fusión de distintos dominios de unión en los scFv facilita un amplio espectro de posibilidades de combinación de dos clases de scFv con anticuerpos biespecíficos.

En cualquier caso se preferirá que el antígeno diana, esto es, el antígeno superficial celular específico de célula tumoral sea también un receptor superficial celular, que requiera para su estimulación una unión multímera de ligandos.

En cuanto a esta medida, es una ventaja que los propios antígenos diana sean un receptor superficial celular activable, de modo que ambos receptores superficiales celulares, es decir los antígenos superficiales celulares específicos de células tumorales y receptor letal, sean simultáneamente activados y restringidos. De este modo, en la célula seleccionada de esta manera, pueden conseguirse, p.e. un efecto sinergético mediante la estimulación simultánea de dos receptores de superficie celular. El receptor letal es, por ejemplo APO-1, TRAIL-R1 o TRAIL-R2.

Esta enumeración de los receptores letales se facilita solamente a modo de ejemplo, el invento se refiere también a otros receptores letales que provocan en las células diana, funciones selectivas mediante una estimulación multi-
mérica.

El antígeno objetivo es un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral.

En este sentido, se ofrecen especialmente las marcas-CD, mediante las distintas subpoblaciones p.e. de leucocitos cuyos distintos estadios de diferenciación o de desarrollo son característicos. La lista permanentemente creciente de los antígenos-CD, comprende no obstante, también moléculas que pueden encontrarse en otros tipos de células, p.e. en las células del endotelio, las células nerviosas o en los fibroplastos; consúltese en este sentido el Léxico de la Biología, de Spektrum Akademischer Verlag GMBH, Heidelberg, 1999, tomo III, páginas 323-329.

De este modo, el fragmento anticuerpo biespecífico al que hace referencia el descubrimiento, es aplicable universalmente, mientras que mediante los antígenos objetivo se origina una restricción del receptor letal, mediante la función estimulante del primer enlace.

Mediante la aplicación de los fragmentos anticuerpo a los que hace referencia el invento, puede inducirse en una célula una apoptose restringida a un antígeno objetivo.

De este modo los fragmentos anticuerpo a los que hace referencia el invento, pueden, p.e. emplearse en la terapia inmunológica del cáncer.

Dado que los antígenos objetivo se exprimen específicamente sobre células tumorales, las células tumorales son las únicas que son destruidas selectivamente, mientras que otras células del organismo, que contienen así mismo el receptor de superficie celular activable, no son dañadas, dado que éstas carecen del antígeno objetivo.

Cuando el antígeno diana, por el contrario, se exprime específicamente sobre células T, lo que no forma parte constituyente del presente invento, exprimiendo receptores letales, las células T pueden ser destruidas selectivamente. En el ámbito de una supresión inmune, esto p.e. puede ser una ventaja para el trasplante de órganos.

Cuando el antígeno diana se exprime específicamente sobre células que presentan antígenos, lo cual no constituye ninguna parte componente del presente invento, estos APCs pueden ser estimulados selectivamente, cuando el reactivo multiespecífico aparte del enlace para los antígenos objetivo, presenta como mínimo un enlace para CD40.

Resumiendo, cabe establecer que merced al invento ha sido posible por primera vez, la activación de determinados receptores letales, restringiéndose con ello a determinadas células diana que aplican un fragmento anticuerpo exento de Fc biespecífico, que como mínimo presenta dos enlaces, uno para el receptor letal estimulable y como mínimo otro para una célula de superficie celular específica tumoral, que es especificada mediante la célula objetivo.

Otras ventajas resultan de la descripción y del dibujo adjunto:

Se comprende, que las características anteriormente mencionadas y las que siguen a continuación, no solo son aplicables en las eventuales combinaciones indicadas, sino también en otras combinaciones en solitario, sin que excedan del marco del presente invento.

Algunos ejemplos de realización del invento, se representan en el dibujo y se aclaran en la siguiente descripción. En donde:

Fig. 1 la unión fundamental de anticuerpos biespecíficos a dos antígenos, sobre la misma célula, de forma A) bicelular o B) monocelular;

Fig. 2 destrucción selectiva de las células-SKW6.4 tras una incubación de 16 horas con un fragmento anticuerpo biespecífico según el invento con una especificidad para CD20 y APO-1, mientras que las células-Jurkat no fueron destruidas, y

Fig. 3 destrucción selectiva de SKW6.4- y las células-Jurkat mediante anticuerpos biespecíficos a los que se refiere el invento con una especificidad para APO-1 y antígenos diana diversificados.

Ejemplo 1 Unión de anticuerpos biespecíficos a células diana

En la Fig. 1 se representan las células diana 10 sobre cuya superficie celular 11 se han exprimido, respectivamente un receptor letal 12 y un antígeno de superficie celular especifico de célula tumoral, 14.

En la célula diana 10 se une un anticuerpo biespecífico intacto 15 a efectos de lo cual el anticuerpo intacto incluida la fracción-Fc, no es parte componente de la presente invención, cuyo fragmento-Fab 16, dispone de un enlace para el antígeno de superficie celular específico de célula tumoral 14 y cuyo fragmento-Fab 17 es un enlace para el receptor letal. El fragmento-Fc no participa de la unión, así como tampoco de una reticulación de ahí que, en los abajo descritos experimentos, según el invento, pueden utilizarse fragmentos anticuerpo sin fracción Fc como se define en la reivindicación 1. El anticuerpo biespecífico 15 que reconoce ambos antígenos 12 y 14 se une a ambos antígenos sobre la misma célula.

Una estimulación de los receptores letales 12 sobre las células diana 10, se produce únicamente cuando el fragmento-Fab 16 puede unirse simultáneamente a un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral.

Por otra parte, no debe excluirse, que el anticuerpo biespecífico 15 en la modalidad de actuación bicelular, una a dos células diana 10 entre sí, tal como se muestra en la Fig. 1A. Esto significa, que dentro de un tipo de célula en cada una de las células 10, se presentan ambos antígenos 12 y 14, que pueden unirse al anticuerpo biespecífico 15 ya sea en modalidad unicelular como en la Fig. 1B o en modalidad bicelular como en la Fig. 1A, en cualquier caso, sin embargo, conduciendo a una estimulación restringida de antígenos diana del receptor letal 12, que se halla disponible en la misma célula como el antígeno de superficie celular específico de célula tumoral 14.

Como receptor letal 12, pueden utilizarse distintos receptores letales como por ejemplo el APO-1, el TRAIL-R1 o el TRAIL-R2, en donde como antígenos de superficie celular específicos de célula tumoral 14 pueden emplearse discrecionalmente antígenos de superficie celular específicos de células tumorales, con los que se conseguirá una estimulación restrictiva del receptor letal 12.

En otras palabras, el receptor letal 12 sólo es estimulado sobre determinadas células diana 10 que, o bien portan un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral 14 o bien mediante enlace bicelular, se hallan junto a una de aquellas células diana 10.

Este principio general, se describirá ahora a continuación, haciendo referencia a la estimulación restringida de los antígenos objetivo del receptor letal APO-1.

Ejemplo 2 Líneas celulares utilizadas

Como líneas celulares se utilizan las células SDKW6.4- como también las células-Jurkat.

Las células SKW6.4- (ATCC: TIB 215) provienen de los linfocitos-B y asimismo exprimen CD95 (APO-1), siendo apoptosis-sensitivas.

Las células-Jurkat (ATCC: TIB 152) provienen de los linfocitos-T exprimiendo así mismo CD95 y son apoptosis-sensitivas.

Ambas líneas celulares son incubadas en el medio RPMI 1640, completándose con 10 mM de glutamato, 100 U/ml penicilina, 100 \mum/ml estreptomicina y 10% de suero vacuno fetal activado térmicamente (Sigma, Deisenhofen, Alemania).

Como receptor superficial celular se escogió el receptor APO-1 (cd95) exprimido sobre ambas líneas celulares y como antígeno diana el CD-marker CD2, CD5, CD19, CD20, CD28 y CD40.

Los anticuerpos-CD95 pueden adquirirse en Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California. Los anticuerpos monoclonales contra los 6 antígenos objetivo utilizados que, son por ejemplo, suministrados por Biotreend Chemikalien GMBH, Eupener StraBe 157, Colonia.

Para verificar la expresión de APO-1 y los 6 antígenos diana, tras la incubación de las células-Jurkat y del SKW6.4- se incubaron con los correspondientes anticuerpos (10 \mug/ml) y anticuerpos marcados-FITC contra ratón IgG (Dako, Hamburgo, Alemania). El análisis-FACS se realizó con un Calibur FACS y el Sofware-CelQuest (Becton Dickinson, San José, California).

Así se demostró que ambas líneas celulares exprimieron APO-1, el CD20 y el CD40 y algo más débil el CD19 sobre SKW6.4 y que CD28 así como los más débiles CD2 y CD5 se exprimieron sobre células-Jurkat.

Ejemplo 3 La elaboración de fragmentos anticuerpo bioespecíficos

Los fragmentos anticuerpo biespecíficos según el presente invento, se prepararon mediante reducción selectiva y reoxidación de puentes de disulfito en la zona de articulación; véase a modo de ejemplo Jung et al. a.a.O. Las condiciones de la reacción aplicadas se seleccionaron de forma que se evitase la formación de homodímeros y fuese posible una casi total hibridización de los fragmentos-Fab originariamente modificados.

Para los siguientes análisis, se hibridizaron con anticuerpos la variante-IgG2a del anticuerpo-APO-1, que estaban orientados contra los antígenos CD19, CD20 y CD40 sobre células-SKW6.4 así como los antígenos CD2, CD5 y CD28 sobre células-Jurkat.

En las figuras están caracterizados los así elaborados fragmentos anticuerpo biespecíficos con sus dos especificidades, separados entre sí mediante una X.

Ejemplo 4 Determinación de la inducción apoptósica restringida de los antígenos objetivo

En los ensayos realizados, se comprobó si los fragmentos anticuerpo biespecíficos, según en presente invento, sólo podían estimular sobre tales células diana, al receptor-APO-1 que así mismo los correspondientes antígenos de superficie celular específica de célula tumoral habían sido exprimidos para los cuales el fragmento anticuerpo biespecífico dispone también de un enlace.

Este efecto se determinó partiendo de la velocidad de destrucción de las células diana, para lo cual la células diana (SKW6.4 y Jurkat) fueron incubadas por triplicado en placas del nº 96 (1 x 105/cavidad) con 1 \mug/ml del correspondiente constructor de anticuerpos.

Tras 16 horas de incubación, se determinó la capacidad vital de las células supervivientes empleando la sal de tetrazolio WST-1 (Boehringer, Mannhein, Alemania) que de enzimas mitocondriales se transformaron en un formazán de color rojo oscuro.

La densidad óptica se determinó mediante un láser-ELISA (SpektraMax 340, dispositivos moleculares de Sunnyville, California) y el porcentaje de células destruidas con una intensidad óptica ODx se calculó aplicando la siguiente fórmula:

(1.ODx/ODmax) x 100,

en donde ODmax corresponde a la densidad óptica obtenida de células tumorales en ausencia de anticuerpos.

En algunos experimentos pudo determinarse el porcentaje mediante ensayo de homologación del cromo. Con este motivo, se incubaron células diana con cromato de sodio marcado _{51}Cr (80 \muCi/ml, una hora) procediéndose a continuación a un lavado intenso y triple saturación en placas del nº 96. Tras una incubación con los anticuerpos durante 16 horas se cuantificó la actividad resultante y el porcentaje de células destruidas, del modo si-
guiente:

cpm/cpm_{máx} x 100,

cpm_{máx} es la radioactividad emitida por las células diana tratadas con un detergente.

Los porcentajes determinados con ambos procedimientos distintos con respecto a las células diana destruidas, coincidieron ampliamente.

Ejemplo 5 Resultados

La Fig. 2 muestra los fragmentos anticuerpo biespecíficos a los que se refiere el invento, con una especificidad para APO-1 y CD20 (APO-1-2ª x CD20) efectiva CD20-positiva células-SKW6.4, pero que no pudieron destruir las células Jurkat negativas CD 20. El que ambas líneas celulares sean sensibles con respecto a una muerte celular por mediación de APO-1, proviene del hecho de que ambas fueron destruidas por el anticuerpo 7C11, que es un anticuerpo argonístico IgM (Immunotech, Marseille, Francia), inductor de apoptosis.

Las mezclas de ambos anticuerpos originales, que fueron empleados como anticuerpos intactos o bien como fragmentos-Fab, no pudieron tampoco inducir en las células-SKW6.4 ninguna apoptosis.

A partir de aquí, una coincubación del fragmento anticuerpo biespecífico al que se refiere el presente invento, APO-1-2ª x CD20 junto con el anticuerpo-APO-1-2ª, condujo a un bloqueo de la lysis causada por el fragmento anticuerpo biespecífico.

En la Fig. 3, en donde las cifras-FACS facilitan información directa sobre la expresión de cada uno de los antígenos diana, esto es de los antígenos superficiales celulares específicos de células tumorales sobre las células, puede reconocerse, que esencialmente la cantidad de antígenos diana exprimidos sobre las células diana, son los responsables de la dimensión de la destrucción de las células diana.

Una significativa lysis de las células-Jurkat se consiguió solamente por parte del constructor APO-1-2ª x CD28.

APO-1-2ª x CD2 desencadenó en las células-Jurkat sólo una destrucción marginal, en donde APO-1-2ª x CD 5 en este caso resultó incluso completamente ineficaz. Por el contrario, se manifestaron muy eficaces el APO-1-2ª x CD20 y APO-1-2ª x CD40, que prácticamente fueron los causantes del 100% de destrucción de las células-SKW6.4.

Menor efectividad mostraron el APO-1-2ª x CD19 sobre las células-SKW6.4 y el APO-1-2ª x CD28 sobre las células-Jurkat.

Del resultado, podemos deducir que la apoptosis sólo fue inducida en las células, que aparte del receptor-APO-1 todavía se exprimió el correspondiente antígeno superficial celular específico de células tumorales.

Claims (4)

1. Fragmento anticuerpo biespecífico exento de Fc con un enlace monovalente para un receptor letal y como mínimo, con un enlace para un antígeno de superficie celular específico de célula tumoral.

2. Fragmento anticuerpo según la reivindicación 1, en donde el receptor letal es APO-1.

3. Formulación farmacéutica que contiene un fragmento anticuerpo biespecífico exento de Fc según la reivindicación 1 ó 2.

4. Aplicación de un fragmento anticuerpo biespecífico exento de Fc según la reivindicación 1 ó 2 para la elaboración de un medicamento destinado a la destrucción de células tumorales.