ES2257771T3 - Agentes de contraste. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a una composición de materia representada por la fórmula (I): V-L-R en la que V es un grupo orgánico que tiene afinidad por el sitio receptor de la angiotensina II, L es un resto de unión o un enlace y R es un resto detectable en la visualización in vivo de un cuerpo humano o animal con las condiciones de que si V es una angiotensina o un derivado peptídico de la angiotensina o análogo entonces V-L-R es distinto de un péptido sustituido con un radionúclido no metálico (por ejemplo una angiotensina II sustituido con 125I) y L-V no es simplemente un péptido con un agente quelante amídico unido a una de sus cadenas laterales. Esta composición de materia puede utilizarse para visualización de enfermedades y trastornos cardiovasculares.
Description
Agentes de contraste.
Esta invención se refiere a técnicas de formación
de imágenes para diagnóstico en las que pueden formarse imágenes de
una patología usando un agente de contraste diana y a agentes de
contraste diana adecuados para usar en dichas técnicas. Más
particularmente la invención se refiere al uso de dichos agentes de
contraste en los que el vector director se une a receptores de
angiotensina II.
La angiotensina II (en lo sucesivo en este
documento AII) es un octapéptido
(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)
que es la especie activa primaria en el sistema
renina-angiotensina aldosterona (el sistema RAS) que
regula la presión sanguínea y el equilibrio de electrolitos y agua.
El sistema RAS se ilustra esquemáticamente en la Figura 1 de este
documento que se basa en la Figura 1 del artículo de Foote et
al. en Ann. Pharmacother. 27: 1495-1503
(1993).
AII ejerce sus efectos biológicos por la
interacción con receptores específicos presentes en muchos tejidos
del cuerpo humano o de un animal (por ejemplo, vasos sanguíneos,
corazón, cerebro, hígado, riñón, útero y ovarios). Aunque uno de
sus efectos principales es promover la vasoconstricción, AII tiene
otros efectos que conducen a un aumento de la presión sanguínea y
la retención de sodio. De esta manera, por ejemplo, en respuesta a
la estimulación de los receptores de AII en la corteza suprarrenal,
se libera aldosterona y esto estimula la retención de sodio y agua
y la excreción de potasio en los túbulos distales y en los conductos
colectores corticales del riñón. AII también tiene un efecto
directo sobre el riñón incluyendo hipertrofia glomerular y aumento
de la reabsorción de sodio en el túbulo proximal. Además, AII actúa
centralmente estimulando la sed y potenciando la liberación de
hormona antidiurética conduciendo de esta manera a un aumento del
volumen intravascular.
Por consiguiente, la supresión de los efectos de
AII se ha usado terapéuticamente, por ejemplo, en el tratamiento de
hipertensión y de insuficiencia cardiaca congestiva. Esto se ha
conseguido de varias formas: por medio del uso de inhibidores de
renina que bloquean la conversión de angiotensinógeno en
angiotensina I (el precursor de AII); por medio del uso de
inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) que
bloquean la conversión de angiotensina I en AII (y también bloquean
la bioconversión de bradiquinina y prostaglandinas); por medio del
uso de anticuerpos anti-AII; y por medio del uso de
antagonistas del receptor de AII.
Se ha descubierto que existen diferentes tipos de
receptores (sitios de unión) de AII dentro del cuerpo y que la
unión de AII tiene diferentes efectos en diferentes sitios de unión.
De esta manera, el receptor AT1 media la acción cardiovascular
principal del RAS y se inhibe por los antagonistas del receptor de
AII Losartán y DTT, mientras que la otra familia de receptores
principal, AT2, se inhibe por PD123177 y sus análogos estructurales.
Se conocen otros receptores para AII aparte de AT1 y AT2 y se
denominan en general AT_{atípico} (véase Kang et al.,
Am. Heart J. 127:1388-1401
(1994)).
La Patente de Estados Unidos Nº 5.444.069
describe el uso de ácidos
4,5,6,7-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]piridina-6-carboxílicos
y análogos de los mismos para antagonizar la unión de angiotensina
II a receptores AT_{2}, para tratar la pérdida de memoria.
Ahora se ha descubierto que es posible obtener
imágenes de sitios receptores de AII in vivo usando agentes
de contraste dirigidos en los que el vector de dirección tiene
afinidad por sitios receptores de AII. Los receptores de AII se
localizan generalmente dentro del sistema cardiovascular y son
accesibles a estos agentes de contraste cuando se administran en la
corriente sanguínea. Por consiguiente, usando estos agentes de
contraste dirigidos, es posible detectar enfermedades y trastornos
tales como insuficiencia cardiaca, aterosclerosis y restricción del
flujo sanguíneo, así como otras enfermedades y trastornos
vasculares, y también controlar la progresión del tratamiento de
estas enfermedades y trastornos. Por lo tanto, considerado desde un
aspecto, la invención proporciona una composición de materia de
fórmula I
(I)V - L –
R
en la que V es un grupo orgánico
que tiene afinidad de unión por un sitio receptor de angiotensina
II, L es un resto enlazador o un enlace, y R es un resto detectable
en la formación de imágenes in vivo del cuerpo de un ser
humano o de un animal, con la condición de que cuando V es
angiotensina o un derivado peptídico o análogo de angiotensina,
entonces V-L-R es distinto de un
péptido sustituido con un radionúclido no metálico (por ejemplo,
angiotensina II substituida con ^{125}I) y L-V es
distinto de simplemente un péptido con una amida de agente quelante
unida a una cadena lateral del
mismo.
Preferiblemente, cuando R es un radionúclido, es
un yodo unido directa o indirectamente a V o es un ión metálico
quelado por un grupo quelante en L y/o se puede separar de V por
biodegradación de un grupo L enlazador orgánico. (Debe tenerse en
cuenta que los radionúclidos de hidrógeno, aunque son detectables
in vitro, no cumplirán los requisitos de que R sea
detectable en la formación de imágenes in vivo).
Preferiblemente, cuando V es angiotensina, R no
es un ión metálico.
En muchos casos, la composición de materia de
fórmula I será un compuesto caracterizable. En otros, puede ser una
combinación de compuestos unidos o asociados de otra manera, por
ejemplo, conjugados entre sí. Por motivos de conveniencia, la
composición de materia se denominará en lo sucesivo agente.
Considerado desde otro aspecto, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad
eficaz (por ejemplo, una cantidad eficaz para mejorar el contraste
de las imágenes en la formación de imágenes in vivo) de un
agente de fórmula I junto con al menos un vehículo o excipiente
farmacéuticamente eficaz.
Considerado desde otro aspecto adicional, la
invención proporciona el uso de un agente de fórmula I para la
fabricación de un medio de contraste para uso en un método de
diagnóstico que implica la administración de dicho medio de
contraste a un sujeto animado y la generación de una imagen de al
menos parte de dicho sujeto.
Considerado desde otro aspecto adicional, la
invención proporciona un método para generar una imagen de un ser
humano o un animal no humano animado (preferiblemente un mamífero o
ave) que implica administrar un agente de contraste a dicho sujeto
y generar una imagen de al menos una parte de dicho sujeto en el que
se ha distribuido dicho agente de contraste, por ejemplo, por rayos
X, MR, ultrasonidos, escintigrafía, PET, SPECT, impedancia
eléctrica, luz o modalidades de formación de imágenes
magnetométricas, caracterizado porque como dicho agente de contraste
se usa un agente de fórmula I.
Considerado desde otro aspecto adicional, la
invención proporciona un método para controlar el efecto de
tratamiento de un ser humano o un animal no humano con un fármaco
para combatir o provocar efectos asociados con la angiotensina II,
implicando dicho método administrar a dicho sujeto un agente de
fórmula I y detectar la captación de dicho agente por receptores de
angiotensina II, realizándose dicha administración y detección de
forma opcional pero preferiblemente de manera repetida, por
ejemplo, antes, durante y después del tratamiento con dicho
fármaco.
Considerado desde otro aspecto adicional, la
invención proporciona un proceso para la preparación de un agente
de fórmula I, comprendiendo dicho proceso conjugar (i) un compuesto
orgánico que tiene afinidad de unión por un receptor AII con (ii)
un compuesto detectable en un procedimiento de formación de imágenes
de diagnóstico o un compuesto quelante y, si es necesario, metalar
los grupos quelantes en el conjugado resultante con un ión metálico
detectable en un procedimiento de formación de imágenes de
diagnóstico.
Los agentes de fórmula I tienen tres componentes
característicos: un vector (V); un enlazador (L) y un indicador
(R). El vector debe tener la capacidad de dirigir el compuesto a
receptores de AII, el indicador debe ser detectable en un
procedimiento de formación de imágenes de diagnóstico in
vivo; y el enlazador debe acoplar el vector al indicador, al
menos hasta que se haya completado el procedimiento de formación de
imágenes.
Como vector, se puede usar cualquier compuesto
que tenga afinidad por los receptores de AII. Éste puede ser un
péptido (tal como la propia AII o un análogo tal como saralasina
(Sar-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-\beta-Ala))
o un no péptido tal como losartán o PD-123177,
aunque se prefieren no péptidos. De forma similar, el vector puede
ser un compuesto (tal como losartán) que tiene una afinidad más
pronunciada por un tipo de receptor de AII que por otros tipos, o
un compuesto (tal como la propia AII) que tiene afinidad general por
todos los receptores de AII. Generalmente, se preferirán compuestos
que tienen una afinidad más pronunciada por tipos particulares de
receptores de AII (tales como AT1 o AT2).
Preferiblemente, el agente es un compuesto que no
induce una respuesta biológica inaceptable, particularmente
compuestos que actúan como antagonistas del receptor de AII y no
inducen las respuestas asociadas con la propia AII, especialmente
las respuestas de modificación de la presión sanguínea. Sin embargo,
si se desea, las respuestas biológicas pueden modificarse por medio
de la administración de un agente terapéutico, por ejemplo, antes,
al mismo tiempo o después de la administración del agente de fórmula
I.
Entre los vectores peptídicos, se encuentran
oligopéptidos que tienen el motivo
Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro
o un motivo análogo en el que uno cualquiera de los cinco restos
aminoacídicos puede variar individualmente o en relación con
isósteros estructurales o funcionales de tal forma que el motivo
estructural o funcional se conserve permitiendo de esta manera una
interacción eficaz con los sitios receptores de angiotensina II. A
modo de ejemplo, se prefieren los motivos
Arg-Val-Tyr*-XX-His-Pro
(donde Tyr* es una Tyr opcionalmente modificada, por ejemplo,
Me-Tyr y XX es un aminoácido, por ejemplo, Ile o
Val), por ejemplo AII y más particularmente saralasina y sarmesina.
Sin embargo, cuando como vector se usan AII o estos análogos de
angiotensina parecidos, puede ser deseable utilizar combinaciones
de enlazador-indicador distintas de quelantes
metalados (por ejemplo, que incluyen un radionúclido o ión metálico
paramagnético) unidos directamente a la estructura peptídica; de
esta manera, puede ser deseable usar un indicador de radionúclido
sin metal, o usar un indicador en forma de partículas.
Otros vectores oligopeptídicos adecuados pueden
determinarse fácilmente usando presentación en fagos, química
combinatoria (química combinatoria tanto peptídica como no
peptídica), HTS (síntesis de alto rendimiento) y técnicas CAM.D.
Entre los vectores no peptídicos se prefieren
losartán y PD 123177. Otros vectores no peptídicos adecuados
incluyen compuestos heterocíclicos (tales como imidazoles,
imidazoles condensados, xantinas y piridonas). En los documentos
WO-91/17148,
US-A-4355040,
WO-91/18888, WO-91/19715,
WO-91/15209,
EP-A-420237,
EP-A-459136 y
US-A-5338744 se proporcionan
ejemplos de vectores no peptídicos adecuados. El desarrollo de
antagonistas de receptores de AII no peptídicos apropiados se
describe, por ejemplo, por Timmermans et al., en TiPS
12: 55-62 (1991) y Pharm. Rev. 45:
205-251 (1993) y por van Meel et al. en
Arzneim-Forsch./Drug Res. 43:
242-246 (1993).
Los vectores no peptídicos adecuados generalmente
contendrán un anillo heterocíclico N_{1}, N_{2} o N_{3} de 5
ó 6 miembros, insaturado, que lleva opcionalmente un anillo
opcionalmente heterocíclico de 5 o 6 miembros insaturado condensado
y, opcionalmente, que lleva grupos colgantes que comprenden uno o
más (por ejemplo, 1, 2 ó 3) grupos arilo homo o heterocíclicos de 5
ó 6 miembros, por ejemplo,
aril-metil-bifenil tetrazoles. Los
ejemplos incluyen DuP 753, L-158809,
SR-47436, GR 117289, SKF 108566, BIBS 39, BIBS 222,
ExP 3892 y CGP 48933.
De esta manera, el compuesto del vector puede
ser, por ejemplo, un compuesto de fórmula II
en la que R_{1} y R_{2} son
grupos carboxi o grupos alquilo C_{1-6}
opcionalmente sustituidos con grupos oxa, oxo, fenilo, amino,
carboxilo o hidroxi o R_{1} puede representar adicionalmente un
grupo oxo,
y
R_{3} y R_{4} son grupos metil bifenil
carboxilo o metil bifenil tetrazol o grupos alquilo
C_{1-6} opcionalmente sustituidos con grupos oxa,
oxo, fenilo, amino, carboxilo o hidroxi, estando presente R_{4}
solo cuando R_{1} es oxo, preferiblemente con uno de R_{3} y
R_{4} representando un grupo que contiene bifenilo y
con uno de los grupos R_{1}, R_{2}, R_{3} y
R_{4} representando un grupo alquilo sustituido con grupos oxa,
oxo, fenilo, amino, carboxilo o hidroxi.
En dichos compuestos, las funciones amino,
hidroxi, carbonilo o carboxi pueden usarse también para conjugar el
vector al indicador.
Por tanto, los ejemplos de dichos vectores
triazol incluyen
en la que R_{30}
es
R_{31} es COOH,
tetrazol-5-ilo,
NH_{2}SO_{2}CF_{3}, SO_{2}NHCO-fenilo,
SO_{2}NHCO-ciclopropilo, y R_{10} y R_{20}
son
| R_{10} | R_{20} |
| n Bu | NH2CH2 |
| NH2CH2 | n Bu |
| n Bu | 3-hidroxipropilo |
| 3-hidroxipropilo | n Bu |
| n Bu | COOH |
| n Bu | CH3CO |
| n Bu | 2-carboxietilo |
| 2-carboxietilo | n Bu |
| 3-aminopropilo | n Bu |
| n Bu | 3-aminopropilo |
en la que R_{40}
es
\vskip1.000000\baselineskip
R_{31} es como se ha definido anteriormente y
R_{20} y R_{39} son
| R_{39} | R_{20} |
| fenil-CHOHCH2 | n Bu |
| carboximetilo | n Bu |
| 2-carboximetoxi-2-feniletilo | n Bu |
| 2(2,4-dimetoxifenil)-2-hidroxietilo | n Bu |
| 4-carboxibutilo | n Bu |
De manera similar el vector puede ser un
compuesto de fórmula III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que el doble enlace marcado
con un asterisco está opcionalmente sustituido con un enlace
sencillo; R_{100} es un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo
opcionalmente sustituido con al menos un grupo hidroxi o amino, o
un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido
con un grupo hidroxi o unido opcionalmente mediante un oxígeno,
azufre o nitrógeno; R_{400} es un grupo arilmetilo, por ejemplo un
grupo metilbifenilo (opcionalmente sustituido en un anillo de
fenilo con una función ácida, por ejemplo, un carboxilo, o un éster
del mismo, por ejemplo, un grupo (alcoxi
C_{1-6})-carbonilo) o
metilbifeniltetrazol unido mediante el grupo metilo, o un grupo
bencilo opcionalmente sustituido con alquilo
C_{1-6}, amino y/o hidroxi; R_{300} es un grupo
carboximetilo o un grupo alquilo C_{1-6}
opcionalmente sustituido con hidroxi, por ejemplo, un grupo
hidroxi-metilo, y R_{200} es cloro o R_{300} y
R_{200} junto con los carbonos que intervienen forman un anillo
aromático carbocíclico o heterocíclico de 6 miembros (que contiene
0, 1 o 2 nitrógenos en el anillo) opcionalmente sustituido en un
carbono del anillo con un grupo hidroxi, carboxilo, alquilo
C_{1-6} o aciloxi (donde el grupo acilo comprende
un grupo alquilo C_{1-6}, fenilo, o bencilo) o en
un nitrógeno del anillo con un grupo acilo (por ejemplo, un grupo
alquil C_{1-6} carbonilo opcionalmente sustituido
con grupos fenilo). Preferiblemente al menos uno de R_{100},
R_{200}, R_{300} y R_{400} contiene un grupo hidroxi, amino,
tiol, mercapto, aldehído, cetónico, o carboxílico, o un enlace
múltiple (por ejemplo, un enlace C=C) o cualquier otro grupo
funcional que pueda usarse para la unión del vector a la molécula
indicadora.
\newpage
Por tanto a modo de ejemplo, el compuesto de
fórmula III puede ser de fórmula
en la que R_{309} es
hidroximetilo o carboxi, o de
fórmula
en la que
R_{101}-fenil- es
3,4-dihidroxifenilo, 4-aminofenilo o
2-hidroxifenilo, o de
fórmula
en la que R_{30} es como se ha
definido anteriormente, por ejemplo, metil-bifenil
tetrazol o metilbifenilcarboxilo, y R_{202} y R_{302} son los
siguientes:
| R_{202} | R_{302} |
| OH | H |
| nPr | OH |
| OH | OH |
| OH | tBuCOO |
| FenilCOO | OH |
| tBuCOO | OH |
| bencilCOO | OH |
Como alternativa el vector de fórmula III puede
ser por ejemplo de fórmula
en la que R_{30} es como se ha
definido anteriormente, o de
fórmula
en la que R_{30} es como se ha
definido anteriormente y R_{102} es alquilo
C_{1-3} unido mediante O, S o NH, o de
fórmula
en la que R_{77} es hidroxi o
amino y el enlace de línea discontinua es un doble enlace o un
enlace sencillo, preferiblemente un doble enlace en el que R_{77}
es amino y un enlace sencillo en el que R_{77} es
hidroxi.
Además el vector puede ser un compuesto de
fórmula IV
en la que R_{501} es un grupo
alquilo C_{1-6} opcionalmente fluorado, R_{504}
es un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente
fluorado, R_{502} es un grupo carboxi,
hidroxi-alquilo C_{1-6} o CHO; o
el doble enlace marcado con un asterisco se sustituye con un enlace
sencillo y R_{504} es un grupo =O o =NR_{505} (donde R_{505}
es alquilo C_{1-6}), R_{502} es un grupo alquilo
C_{1-6} opcionalmente fluorado y R_{503} es un
grupo carboxifenilo; y R_{30} es como se ha definido anteriormente
(por ejemplo, donde R_{310} es
tetrazol-5-ilo, NH2SO2CF_{3},
SO2NHCO-ciclopropilo o
SO2NHCO-fenilo.
Por tanto, por ejemplo, el vector de fórmula IV
puede ser de fórmula
en la que R_{27} es metilo o
C_{2}F_{5},
R_{26} es COOH, CHO o CH2OH,
R_{25} es butilo o propilo,
R_{28} es =O o =NCH_{3}, y
R_{21} es
tetrazol-5-ilo, NH2SO2CF3,
SO2NHCO-ciclopropilo o
SO2NHCO-fenilo.
Otros compuestos adecuados para usar como
vectores incluyen compuestos tales como los descritos en los
documentos WO 92/18529,
US-A-5156977,
EP-A-435827,
EP-A-420237,
EP-A-426021, WO 92/09556, WO
91/19715, WO 91/18888, WO 91/17148,
EP-A-446062, WO 92/09563, WO
91/15479, WO 91/15209, EP-A-459136,
EP-A-445811,
EP-A-442473,
EP-A-430300,
US-A-4355040,
US-A-4340598 y
US-A-5338744.
Los vectores de fórmulas II a IV pueden
prepararse mediante las técnicas descritas en las publicaciones de
patente a las que se hace referencia en este documento.
También pueden usarse CAM-D y
otras técnicas de identificación y evaluación candidatas como se ha
mencionado anteriormente para encontrar o evaluar vectores no
peptídicos adicionales candidatos.
De esta manera, también es posible obtener
moléculas que se unen específicamente a receptores de angiotensina
II por medio de la selección directa de bibliotecas moleculares. Por
ejemplo, para esta selección podrían usarse bibliotecas de fagos
que presentan pequeños péptidos. La selección puede realizarse
mezclando simplemente los receptores y la biblioteca de
presentación en fagos y eluyendo los fagos que se unen a los
receptores. Si se desea, la selección puede realizarse en
"condiciones fisiológicas" (por ejemplo en sangre) para
eliminar péptidos que presenten una reacción cruzada con
componentes de la sangre. Los restos de unión identificados de esta
manera pueden acoplarse (por conjugación química o por síntesis de
péptidos, o a nivel del ADN para vectores recombinantes) a una
molécula enlazadora, que constituye una herramienta general para
unir cualquier molécula de vector al indicador.
Pueden generarse moléculas de vector a partir de
bibliotecas combinatorias sin que sea necesario conocer la diana
molecular exacta, por selección funcional (in vitro, ex
vivo o in vivo) de moléculas que se unen a la
región/estructura de la que se desea obtener la imagen.
| Vectores de bibliotecas combinatorias | ||
| Tipo de vector | Diana | Comentarios/áreas de uso |
| \begin{minipage}[t]{48mm} Anticuerpos con estructura determinada durante el proceso de generación \end{minipage} | \begin{minipage}[t]{45mm} Cualquiera de las dianas anteriores - o puede ser desconocida cuando se realiza una selección funcional de un vector que se une a receptores de AII \end{minipage} | \begin{minipage}[t]{45mm} Cualquier estructura enferma o normal de interés que tiene receptores de AII\end{minipage} |
| \begin{minipage}[t]{48mm} Péptidos con secuencia determinada durante el proceso de generación \end{minipage} | `` | `` |
| \begin{minipage}[t]{48mm} Oligonucleótidos con secuencia determinada durante el proceso de generación \end{minipage} | `` | `` |
| \begin{minipage}[t]{48mm} Modificaciones de oligos obtenidas como se ha indicado anteriormente \end{minipage} | `` | `` |
| \begin{minipage}[t]{48mm} Otros agentes químicos con estructura determinada durante el proceso de generación \end{minipage} | `` | `` |
| \begin{minipage}[t]{155mm} (véase, por ejemplo: Abelson (Ed), Meth. Enzymol. 267 Combinatorial Chemistry, Academic Press, San Diego, 1996; Cortese (Ed), Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential, Walter de Gruyter! Berlin, 1996; and Wu, Nat. Biotech. 14: 429-431 (1996)). \end{minipage} |
El resto de vector en los agentes de fórmula I
preferiblemente tendrá una constante de formación para la
conjugación de R-L-V:sitio receptor
de angiotensina II de al menos 100.
Como se ha mencionado anteriormente, los agentes
de fórmula I comprenden restos de vector, enlazador e indicador. Un
resto enlazador puede servir para unir un vector a otro indicador;
como alternativa, puede unir entre sí más de un vector y/o más de
un indicador. De forma similar, un indicador o un vector pueden
unirse a más de un enlazador. El uso de esta forma de una
pluralidad de indicadores (por ejemplo, varios restos de
enlazador-indicador unidos a un vector o varios
indicadores unidos a un enlazador que está unido a su vez a un
vector) puede permitir la detectabilidad del agente de contraste
que se desea aumentar (por ejemplo, aumentando su radioopacidad,
ecogenicidad o relaxibidad) o puede permitir que se detecte en más
de una modalidad de formación de imágenes. El uso de esta forma de
una pluralidad de vectores puede aumentar la eficacia de dirección
del agente de contraste o puede hacer que el agente de contraste
sea capaz de dirigirse a más de un sitio, por ejemplo, diferentes
receptores para un agente que tiene heterogeneidad de receptor. De
esta manera, por ejemplo, el agente de fórmula I puede incluir
restos de vector con sitios de afinidad distintos de los receptores
de angiotensina, por ejemplo, con afinidades por superficies
celulares en superficies de la pared de conductos corporales. Por
consiguiente, el agente puede incluir vectores tales como fragmentos
de anticuerpo y oligopéptidos, por ejemplo, que contienen RGD o
motivos peptídicos de unión a la superficie de células análogos (por
ejemplo, como se describe en los documentos
EP-A-422937 y
EP-A-422938 (Merck)) u otros
vectores como se describe en el documento GB 9700699.3. Estos
vectores extra también pueden seleccionarse entre cualquiera de las
moléculas que se concentran naturalmente en un órgano, tejido,
célula o grupo de células diana seleccionado, u otra localización
en el cuerpo de un mamífero, in vivo. Éstos pueden incluir
aminoácidos, oligopéptidos (por ejemplo, hexapéptidos), unidades de
reconocimiento molecular (MRU), anticuerpos monocatenarios (SCA),
proteínas, moléculas orgánicas no peptídicas, fragmentos Fab y
anticuerpos. Los ejemplos de moléculas de localización dirigida
incluyen polisacáridos (por ejemplo, CCK y hexapéptidos), proteínas
(tales como lecitinas, asialofetuína, IgG policlonal, proteínas de
coagulación sanguínea (por ejemplo, hirudina), lipoproteínas y
glicoproteínas, hormonas, factores de crecimiento, factores de
coagulación (tales como PF4), fragmentos de fibrina polimerizados
(por ejemplo, E_{1}), proteínas precursoras de amiloides en suero
(SAP), precursores de lipoproteínas de baja densidad (LDL),
albúmina de suero, proteínas superficiales de glóbulos rojos
intactos, moléculas de unión a receptores tales como estrógenos,
proteínas/polímeros específicos de hígado tales como
galactosil-neoglicoalbúmina (NGA) (véase Vera et
al. en Radiology 151; 191 (1984)), copolímeros de
N-(2-hidroxi-propil)metacrilamida
(HMPA) con números variables de galactosaminas unidas (véase Duncan
et al., Biochim. Biophys. Acta 880:62 (1986)) y alil
y 6-aminohexil glicósidos (véase Wong et al.,
Carbo. Res. 170:27 (1987)) y fribrinógeno. La proteína de
localización dirigida también pude ser un anticuerpo. La elección de
un anticuerpo, particularmente la especificidad de antígeno del
anticuerpo, dependerá del sitio diana deseado particular para el
agente. Se prefieren anticuerpos monoclonales a los anticuerpos
policlonales. Es bien conocida la preparación de anticuerpos que
reaccionan con un antígeno deseado. Las preparaciones de anticuerpo
están disponibles en el mercado en diversas fuentes. El fragmento
de fibrina E_{1} puede prepararse como se describe por Olexa et
al. en J. Biol. Chem. 254:4925 (1979). La preparación de
precursores de LBL y proteínas SAP se describe por de Beer et
al. en J. Immunol. Methods 50:17 (1982).
Se prefiere especialmente que estos vectores
extra se unan para ralentizar pero no impedir el movimiento del
agente en la corriente sanguínea y para anclarlo en su sitio cuando
se une a un sitio receptor de AII.
El componente enlazador del agente de contraste
es, en su forma más simple, un enlace entre el vector y restos
indicadores. Sin embargo, más generalmente, el enlazador
proporcionará un esqueleto mono- o multimolecular que une de forma
covalente o no covalente uno o más vectores con uno o más
indicadores, por ejemplo, un esqueleto molecular lineal, cíclico,
ramificado o reticulado, o un agregado molecular, con grupos
incorporados o colgantes que se unen covalentemente o no
covalentemente, por ejemplo, de forma coordinada, con los restos de
vector e indicador o que encapsula, atrapa o ancla estos
restos.
De esta manera, la unión de una unidad indicadora
a un vector deseado puede conseguirse por medios covalentes o no
covalentes, que implican normalmente la interacción con uno o más
grupos funcionales localizados en el indicador y/o vector. Los
ejemplos de grupos funcionales reactivos químicamente que pueden
emplearse para este fin incluyen grupos amino, hidroxilo,
sulfhidrilo, carboxilo y carbonilo, así como grupos carbohidrato,
dioles vecinales, tioéteres, 2-aminoalcoholes,
2-aminotioles, guanidinilo, imidazolilo y grupos
fenólicos.
El acoplamiento covalente del indicador y el
vector, por lo tanto, puede realizarse usando agentes enlazadores
que contienen restos reactivos capaces de reaccionar con estos
grupos funcionales. Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos sulfhidrilo incluyen compuestos
a-haloacetilo del tipo
X-CH_{2}-CO (donde X = Br, Cl o
I), que muestran reactividad particular para grupos sulfhidrilo pero
que también pueden usarse para modificar grupos imidazolilo,
tioéter, fenol y amino como se describe por Gurd, F.R.N. en Methods
Enzymol. (1967) 11, 532. Ciertos derivados de
N-maleimida también se consideran selectivos hacia
grupos sulfhidrilo, pero además pueden ser útiles en el
acoplamiento con grupos amino en ciertas condiciones. Los reactivos
tales como 2-iminotiolano, por ejemplo, como se
describe por Traut, R. et al., en Biochemistry (1973)
12, 3266, que introducen un grupo tiol por medio de
conversión de un grupo amino, pueden considerarse reactivos de
sulfhidrilo si se produce unión a través de la formación de enlaces
disulfuro. De esta manera, los reactivos que introducen enlaces
disulfuro reactivos en el indicador del vector pueden ser útiles, ya
que la unión puede llevarse a cabo por medio del intercambio de
disulfuro entre el vector y el indicador; los ejemplos de estos
reactivos incluyen reactivo de Ellman (DTNB),
4,4'-ditiodipiridina, disulfuro de
metil-3-nitro-2-piridilo
y disulfuro de metil-2-piridilo
(descrito por Kimura, T. et al., en Analyt. Biochem.
(1982), 122, 271).
Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos amino incluyen agentes alquilantes y
acilantes. Los agentes alquilantes representativos incluyen:
i) compuestos
\alpha-haloacetilo, que muestran especificidad
hacia grupos amino en ausencia de grupos tiol reactivos y son del
tipo X-CH_{2}CO- (donde X = Cl, Br o I), por
ejemplo, como se describe por Wong, Y-H. H. en
Biochemistry (1979) 24, 5337;
ii) derivados de N-maleimida, que
pueden reaccionar con grupos amino a través de una reacción de tipo
Michael o a través de acilación por la adición al grupo carbonílico
del anillo como se describe por Smyth, D.G. et al., en J. Am.
Chem. Soc. (1960) 82, 4600 y Biochem. J. (1964)
91, 589;
iii) haluros de arilo tales como compuestos
nitrohaloaromáticos reactivos;
iv) haluros de alquilo como se describe por
McKenzie, J.A. et al., en J. Protein Chem. (1988),
7, 581;
v) aldehídos y cetonas capaces de formar bases de
Shiff con grupos amino, estabilizándose los aductos formados
normalmente por medio de reducción para dar una amina estable;
vi) derivados de epóxido tales como
epiclorhidrina y bisoxiranos, que pueden reaccionar con grupos
amino, sulfhidrilo o hidroxilo fenólicos;
vii) derivados que contienen cloro de
s-triazinas, que son muy reactivos hacia nucleófilos
tales como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxi;
viii) aziridinas basadas en compuestos de
s-triazina descritos con detalle anteriormente, por
ejemplo, como se describe por Ross, W.C.J. en Adv. Cancer
Res. (1954) 2, 1, que reaccionan con nucleófilos tales
como grupos amino por apertura del anillo;
ix) ésteres dietílicos de ácidos escuárico como
se describe por Tietze, L.F. en Chem. Ver. (1991)
124, 1215; y
x) \alpha-haloalquil éteres,
que son agentes alquilantes más reactivos que los haluros de alquilo
normales debido a la activación producida por el átomo de oxígeno
del éter, por ejemplo, como se describe por Benneche, T. et
al., en Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.
Los agentes acilantes reactivos con amino
representativos incluyen:
i) isocianatos e isotiocianatos, particularmente
derivados aromáticos, que forman derivados de urea y tiourea
estables respectivamente y se han usado para la reticulación de
proteínas como se describe por Schick, A.F. et al., en J.
Biol. Chem. (1961) 236, 2477;
ii) cloruros de sulfonilo, que se han descrito
por Herzig, D.J. et al., en Biopolymers (1964)
2, 349 y que pueden ser útiles para la introducción de un
grupo indicador fluorescente en el enlazador;
iii) haluros de ácido;
iv) ésteres activos tales como nitrofenil ésteres
o N-hidroxisuccinimidil ésteres;
v) anhídridos de ácidos tales como anhídridos
mixtos, simétricos o N-carboxianhídridos;
vi) otros reactivos útiles para la formación de
enlaces amida como se describe por Bodansky, M. et al., en
"Principles of Peptide Synthesis" (1984)
Springer-Verlag;
(vii) acilazidas, por ejemplo, donde el grupo
azida se genera a partir de un derivado hidrazina preformado usando
nitrito sódico, por ejemplo, como se describe por Wetz, K. et
al., en Anal. Biochem. (1974) 58, 347;
viii) azlactonas unidas a polímeros tales como
bisacrilamida, por ejemplo, como se describe por Rasmussen, J. K. en
Reactive Polymers (1991) 16, 199; y
ix) Imidoésteres, que forman amidinas estables
tras la reacción con grupos amino, por ejemplo, como se describe por
Hunter, M.J. y Ludwig, M.L. en J. Am. Chem. Soc. (1962)
84, 3491.
Los grupos carbonilo tales como funciones
aldehído pueden hacerse reaccionar con bases proteicas débiles a un
pH tal que se protonan las funciones de cadena lateral de la
proteína nucleófila. Las bases débiles incluyen
1,2-aminotioles tales como los encontrados en restos
de cisteína N-terminales, que forman selectivamente
anillos de tiazolidina de cinco miembros estables con grupos
aldehído, por ejemplo, como se describe por Ratner, S. et
al., en J. Am. Chem. Soc. (1937), 59, 200. Pueden
usarse otras bases débiles tales como fenil hidrazonas, por
ejemplo, como se describe por Heitzman H. et al., en Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos (1974) 71, 3537.
Los aldehídos y cetonas también pueden hacerse
reaccionar con aminas para formar bases de Schiff, que
ventajosamente pueden estabilizarse por medio de aminación
reductora.
Los restos alcoxiamino reaccionan fácilmente con
cetonas y aldehídos para producir alcoxaminas estables, por ejemplo,
como se describe por Webb, R. et al., en Bioconjugate Chem.
(1990) 1, 96.
Los ejemplos de restos reactivos capaces de
reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos diazo tales
como ésteres de diazoacetato y diazoacetamidas, que reaccionan con
alta especificidad para generar grupos éster, por ejemplo, como se
describe por Herriot R. M. en Adv. Protein Chem. (1947)
3, 169. También pueden emplearse de forma útil reactivos
modificadores de ácido carboxílico tales como carbodiimidas, que
reaccionan por medio de la formación de O-acilurea
seguido de formación de enlaces amida; la unión se puede facilitar
por medio de la adición de una amina o puede dar como resultado un
acoplamiento directo vector-receptor. Las
carbodiimidas solubles en agua útiles incluyen
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida
(CMC) y
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC), por ejemplo como se describe por Zot, H.G. y Puett D. en
J. Biol. Chem. (1989) 264, 15552. Otros reactivos
modificadores de ácido carboxílico útiles incluyen derivados de
isoxazolio tales como reactivo de Woodwards K; cloroformiatos tales
como cloroformiato de p-nitrofenilo;
carbonildiimidazoles tales como
1,1'-carbonildiimidazol; y
N-carbalcoxidihidroquinolinas tales como
N-(etoxicarbonil)-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina.
Otros restos reactivos potencialmente útiles
incluyen dionas vecinales tales como
p-fenilendiglioxal, que puede usarse para
reaccionar con grupos guanidinilo, por ejemplo, como se describe por
Wagner et al., en Nucleic acid Res. (1978), 5,
4065; y sales de diazonio, que pueden someterse a reacciones de
sustitución electrófila, por ejemplo, como se describe por
Ishizaka, K. y Ishizaka T. en J. Immunol (1960) 85,
163. Los compuestos de bis-diazonio se preparan
fácilmente por tratamiento de aril diaminas, con nitrito sódico en
soluciones ácidas. Se apreciará que los grupos funcionales en el
indicador y/o vector, si se desea, pueden convertirse en otros
grupos funcionales antes de la reacción, por ejemplo, para conferir
reactividad o selectividad adicional. Los ejemplos de métodos
útiles para este fin incluyen conversión de aminas en ácidos
carboxílicos usando reactivos tales como anhídridos dicarboxílicos;
conversión de aminas en tioles usando reactivos tales como
N-acetilhomocisteína tiolactona, anhídrido
S-acetilmercaptosuccínico;
2-iminotiolano o derivados de succinimidilo que
contienen tiol; conversión de tioles en ácidos carboxílicos usando
reactivos tales como \alpha-haloacetatos,
conversión de tioles en aminas usando reactivos tales como
etilenimina o 2-bromoetilamina; conversión de ácidos
carboxílicos en aminas usando reactivos tales como carbodiimidas
seguido de diaminas; y conversión de alcoholes en tioles usando
reactivos tales como cloruro de tosilo seguido de
transesterificación con tioacetato e hidrólisis para dar el tiol con
acetato sódico.
También puede realizarse un acoplamiento de
vector-indicador usando enzimas como agentes de
entrecruzamiento de longitud cero; de esta manera, por ejemplo, se
han usado transglutaminasa, peroxidasa y xantina oxidasa para
producir productos entrecruzados. También puede usarse proteolisis
inversa para el entrecruzamiento a través de la formación de
enlaces amida.
Por ejemplo, el acoplamiento de
vector-indicador no covalente puede realizarse, por
ejemplo, por interacciones de carga electrostática, por ejemplo,
entre un indicador con funcionalidad polilisinilo y un vector con
funcionalidad poliglutamilo, por medio de quelación en forma de
complejos metálicos estables o por medio de interacción de unión de
alta afinidad tal como unión de avidina/biotina.
También puede ser útil un vector que comprende o
está acoplado a un péptido, lipo-oligosacárido o
enlazador lipopeptídico, que contiene un elemento capaz de mediar
la inserción en la membrana. Se describe un ejemplo por Leenhouts,
J. M. et al. en Febs Letters (1995)
370(3), 189-192.
El acoplamiento también puede realizarse usando
avidina o estreptavidina, que tienen cuatro sitios de unión de alta
afinidad para biotina. Por lo tanto, la avidina puede usarse para
conjugar un vector a un indicador si tanto el vector como el
indicador están biotinilados. Se describen ejemplos por Bayer, E.A.
y Wilchek, M. en Methods Biochem. Anal. (1980) 26,1.
Este método también puede extenderse para incluir la unión de un
indicador a otro indicador, un proceso que puede promover la
asociación del agente y por consiguiente aumentar potencialmente la
eficacia. Como alternativa, la avidina o estreptavidina puede unirse
directamente a la superficie de las partículas indicadoras.
El acoplamiento no covalente también puede
utilizar la naturaleza bifuncional de inmunoglobulinas
biespecíficas. Estas moléculas pueden unir específicamente dos
antígenos, enlazándolos de esta manera. Por ejemplo, puede usarse
una IgG biespecífica o fragmentos F(ab)'2 biespecíficos
obtenidos por ingeniería química como agentes enlazadores. También
se han presentado anticuerpos biespecíficos heterobifuncionales para
unir dos antígenos diferentes, por ejemplo, como se describe por
Bode, C. et al. en J. Biol. Chem. (1989) 264,
944 y por Staerz, U.D. et al. en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1986) 83,1453. De forma similar, cualquier indicador
y/o vector que contiene dos o más determinantes antigénicos (por
ejemplo, como se describe por Chen, Aa et al. en Am. J.
Pathol.(1988) 130, 216) puede formar entrecruzamientos
por moléculas de anticuerpo y conducir a la formación de conjuntos
con enlaces cruzados de agentes de fórmula I con una eficacia
potencialmente aumentada.
Si se desea, de acuerdo con la invención pueden
usarse los denominados agentes enlazadores de longitud cero, que
inducen la unión covalente directa de dos grupos químicos reactivos
sin introducir un material enlazador adicional (por ejemplo, como
en la formación de enlaces amida inducida usando carbodiimidas o
enzimáticamente), así como agentes tales como sistemas de
biotina/avidina que inducen la unión de
indicador-vector no covalente y agentes que inducen
interacciones electrostáticas.
Sin embargo, lo más común es que el agente
enlazador comprenda dos o más restos reactivos, por ejemplo, como
se ha descrito anteriormente, conectados por un elemento espaciador.
La presencia de este espaciador permite que los enlazadores
bifuncionales reaccionen con grupos funcionales específicos dentro
de una molécula o entre dos moléculas diferentes, dando como
resultado un enlace entre estos dos componentes e introduciendo un
material derivado del enlazador extrínseco en el conjugado de
indicador-vector.
Los restos reactivos en un agente enlazador
pueden ser iguales (agentes homobifuncionales) o diferentes (agentes
heterobifuncionales o, cuando están presentes varios restos
reactivos distintos, agentes heteromultifuncionales),
proporcionando una diversidad de reactivos potenciales que pueden
producir unión covalente entre cualquier especie química,
intramolecularmente o intermolecularmente.
La naturaleza del material extrínseco introducido
por el agente enlazador puede tener una carga crítica sobre la
capacidad de dirección y la estabilidad general del producto final.
De esta manera, puede ser deseable introducir enlaces lábiles, por
ejemplo, que contienen brazos espaciadores que son biodegradables o
químicamente sensibles o que incorporan sitios de escisión
enzimática. Como alternativa, el espaciador puede incluir
componentes poliméricos, por ejemplo, para actuar como
tensioactivos y mejorar la estabilidad del agente. El espaciador
también puede contener restos reactivos, por ejemplo, como se ha
descrito anteriormente, para mejorar la formación de enlaces
cruzados en la superficie.
Los elementos espaciadores típicamente constan de
cadenas alifáticas que separan eficazmente los restos reactivos del
enlazador por distancias comprendidas entre 5 y 30 \ring{A}.
También pueden comprender estructuras macromoleculares tales como
poli(etilenglicoles). Estas estructuras poliméricas,
denominadas en lo sucesivo PEG, son poliéteres sencillos neutros a
los que se ha prestado mucha atención en aplicaciones biotécnicas y
biomédicas (por ejemplo, véase Milton Harris, J. (ed)
"Poly(ethylene glycol) chemistry, biotechnical and
biomedical applications" Plenum Press, New York, 1992). Los
PEG son solubles en la mayoría de disolventes, incluyendo agua, y
están muy hidratados en medios acuosos, con dos o tres moléculas de
agua unidas a cada segmento de etilenglicol; esto tiene el efecto
de prevenir de adsorción de otros polímeros o de proteínas sobre las
superficies modificadas con PEG. Se sabe que los PEG son no tóxicos
y que no afectan a las proteínas activas o las células, aunque se
sabe que ciertos PEG unidos covalentemente son no inmunogénicos y
no antigénicos. Además, los PEG pueden modificarse fácilmente y
unirse a otras moléculas con tan sólo un pequeño efecto sobre su
química. Su solubilidad ventajosa y propiedades biológicas son
evidentes para los muchos usos posibles de PEG y sus copolímeros,
incluyendo copolímeros de bloque tales como
PEG-poliuretanos y
PEG-polipropilenos.
Los pesos moleculares apropiados para los
espaciadores de PEG usados de acuerdo con la invención pueden estar
comprendidos, por ejemplo, entre 120 Daltons y 20 kDaltons.
El mecanismo principal para la captación de
partículas por las células del sistema reticuloendotelial (RES) es
la opsonización por proteínas plasmáticas en la sangre; éstas marcan
a las proteínas extrañas que después se absorben por el RES. Las
propiedades biológicas de los elementos espaciadores de PEG usados
de acuerdo con la invención pueden servir para aumentar el tiempo
de circulación del agente de una manera similar a la observada para
liposomas PEGilados (véase, por ejemplo, Klibanov, A.L. et
al. en FEBS Letters (1990) 268,
235-237 y Blume, G. y Cevc, G. en Biochim.
Biophys. Acta (1990) 1029, 91-97).
También puede conseguirse una mayor eficacia de acoplamiento a
áreas de interés usando anticuerpos unidos al extremo de
espaciadores PEG (véase, por ejemplo, Maruyama, K. et al. en
Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234,
74-80 and Hansen, C.B. et al. in Biochim.
Biophys. Acta (1995) 1239, 133-144).
Otros elementos espaciadores representativos
incluyen polisacáridos de tipo estructural tales como ácido
poligaracturónico, glicosaminoglicanos, heparinoides, polisacáridos
de celulosa y polisacáridos marinos tales como alginatos,
quitosanos y carrageninas; polisacáridos de tipo de almacenamiento
tales como almidón, glucógeno, dextrano y aminodextranos;
poliaminoácidos y ésteres metílicos y etílicos de los mismos, como
en homo- y copolímeros de lisina, ácido glutámico y ácido
aspártico; y polipéptidos, oligosacáridos y oligonucleótidos, de los
que muchos pueden o pueden no contener sitios de escisión
enzimática.
En general, los elementos espaciadores pueden
contener grupos escindibles tales como glicol vecinal, azo,
sulfona, éster, tioéster o grupos disulfuro. También pueden ser
útiles espaciadores que contienen grupos diamida o diéster de
metileno biodegradables de fórmula
-(Z)_{m}.Y.X.C(R^{1}R^{2}).X.Y.(Z)_{n}-
[en la que X y Z se seleccionan
entre -O-, -S-, y -NR- (donde R es hidrógeno o un grupo orgánico);
cada Y es un carbonilo; tiocarbonilo, sulfonilo, fosfonilo o grupo
formador de ácido similar: cada uno de m y n es cero o 1; y cada
uno R^{1} y R^{2} es hidrógeno, un grupo orgánico o un grupo
-X.Y.(Z)_{m}-, o conjuntamente forman un grupo orgánico
divalente]; como se describe, por ejemplo, en el documento
WO-A-92127436 estos grupos se
biodegradan fácilmente en presencia de esterasas, por ejemplo in
vivo, pero son estables en ausencia de estas enzimas. Por lo
tanto, pueden unirse ventajosamente a agentes terapéuticos para
permitir su liberación
lenta:
Las
poli[N-(2-hidroxietil)metacrilamidas]
son materiales espaciadores potencialmente útiles gracias a su bajo
grado de interacción con células y tejidos (véase, por ejemplo,
volfovd, I., Ríhová, B y V.R. y Vetvicka, P. en J. Bioact. Comp.
Polymers (1992) 7, 175-190). Un trabajo
realizado sobre un polímero similar que constaba principalmente del
derivado 2-hidroxipropil muy relacionado demostró
que experimentaba endocitosis por el sistema de fagocitos
mononucleares sólo en una medida bastante baja (véase Goddard, P.,
Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L.E., Nicholls, J. y Petrak,
K. en J. Bioct. Compat. Poly. (1991) 6,
4-24).
\newpage
Otros materiales espaciadores poliméricos
potencialmente útiles incluyen:
i) copolímeros de metacrilato de metilo con ácido
metacrílico; estos pueden ser erosionables (véase Lee, P.I. en
Pharm. Res. (1993) 10, 980) y los sustituyentes
carboxilato pueden producir un mayor grado de hinchamiento que con
polímero neutros;
ii) copolímeros de bloque de polimetacrilatos con
poliésteres biodegradables (véase, por ejemplo, San Roman, J. y
Guillen-Garcia, P. en Biomaterials (1991)
12, 236-241);
iii) cianoacrilatos, es decir, polímeros de
ésteres de ácido 2-cianoacrílico - estos son
biodegradables y se han usado en forma de nanopartículas para la
liberación selectiva de fármacos (véase Forestier, F., Gerrier, P.,
Chaumard, C., Quero, A.M., Couvreur, P. y Labarre, C. en J.
Antimicrob. Chemoter. (1992) 30,
173-179);
iv) alcoholes polivinílicos, que son solubles en
agua y generalmente se consideran biocompatibles (véase por ejemplo
Langer, R. en J. Control. Release (1991) 16,
53-60);
v) copolímeros de vinil metil éter con anhídrido
maleico, que se ha afirmado que son bioerosionables (véase Finne,
U., Hannus, M. y Urtti, A. en Int. J. Pharm. (1992)
78, 237-241);
vi) polivinilpirrolidonas, por ejemplo, con un
peso molecular menor de aproximadamente 25.000, que se filtran
rápidamente por los riñones (véase Hespe, W., Meier, A.M. y
Blankwater, Y.M. en Arzeim-Forsch.Idrug Res.
(1977) 27, 1158-1162);
vii) polímeros y copolímeros de hidroxiácidos
alifáticos de cadena corta tales como ácido glicólico, láctico,
butírico, valérico y caproico (véase, por ejemplo Carli, F. en
Chim. Ind. (Milán) (1993) 75, 494-9),
incluyendo copolímeros que incorporan hidroxiácidos aromáticos para
aumentar su velocidad de degradación (véase Imasaki, K., Yoshida,
M., Fukuzaki, H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H.
y Nagai, T. en Int. J. Pharm. (1992) 81,
31-38);
viii) poliésteres que constan de unidades
alternas de etilenglicol y ácido tereftálico, por ejemplo,
Dacron^{R}, que son no degradables pero muy biocompatibles;
ix) copolímeros de bloque que comprenden segmento
biodegradables de polímeros de hidroxiácidos alifáticos (véase, por
ejemplo Younes, H., Nataf, P.R., Cohn, D., Appelbaum, Y.J., Pizov, G
y Uretzky, G. en Biomater. Artif. Cells Artif. Organs (1988)
16, 705-719), por ejemplo junto con
poliuretanos (véase Kobayashi, H., Hyon, S.H. e Ikada, Y. en
"Water-curable and biodegradable prepolymers" -
J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25,
1481-1494);
x) poliuretanos, que se sabe que se toleran bien
en implantes, y que pueden combinarse con segmentos blandos
flexibles, por ejemplo, que comprenden poli(tetra
metilenglicol), poli(propilenglicol) o
poli(etilenglicol) y segmentos duros aromáticos, por
ejemplo, que comprenden
4,4'-metilenbis(isocianato de fenileno)
(véase por ejemplo Ratner, B.D., Johnston, A.B. y Lenk, T.J. en
J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21,
59-90; Sa Da Costa, V. et al., en J.
Coll. Interface Sci. (1981) 80, 445-452 y
Affrossman, S. et al., en Clinical Materials (1991)
8, 25-31);
xi)
poli(1,4-dioxan-2-onas),
que pueden considerarse ésteres biodegradables gracias a sus enlaces
éster hidrolizables (véase por ejemplo, Song, C. X., Cui, X.M. y
Schindler, A. en Med. Biol. Eng. Comput. (1993) 31,
S147-150), y que pueden incluir unidades de
glicolida para mejorar su absorbabilidad (véase Bezwada, R.S.,
Shalaby, S.W. y Newman, H.D.J. en Agricultural and synthetic
polymers: Biodegradability and utilization (1990) (ed
Glass, J.E. y Swift, G.), 167-174 - ACS symposium
Series Nº 433, Washington D.C., Estados Unidos - American Chemical
Society);
xii) polianhídridos tales como copolímeros de
ácido sebácico (ácido octanodioico) con
bis(4-carboxi-fenoxi)propano;
que se ha demostrado en estudios de conejo (véase Brem, H., Kader,
A., Epstein, J.I., Tamargo, R.J., Domb, A., Langer, R. y Leong,
K.W. en Sel. Cancer Ther. (1989) 5,
55-65) y en estudios de rata (véase Tamargo, R.J.,
Epstein, J.I:, Reinhard, C.S. Chasin, M. y Brem, H. en J. Biomed.
Mater. Res (1989) 23, 253-266) que son
útiles para la liberación controlada de fármacos en el cerebro sin
efectos tóxicos evidentes;
xiii) polímeros biodegradables que contienen
grupos orto-éster que se han empleado para la liberación controlada
in vivo (véase Maa, Y.F. y Heller, J. en J. Control
Release (1990) 14, 21-28); y
(xiv) polifosfacenos, que son polímeros
inorgánicos que constan de átomos de fósforo y nitrógeno alternos
(véase Crommen, J.H., Vandorpe, J. y Schacht, E.H. en J.
Control. Release (1993) 24, 167-180).
Las siguientes tablas indican agentes enlazadores
que pueden ser útiles en agentes dirigibles de acuerdo con la
invención.
\newpage
| Agentes enlazadores heterobifuncionales | |||
| Agente enlazador | Reactividad 1 | Reactividad 2 | Comentarios |
| ABH | carbohidrato | foto-reactivo | |
| ANB-NOS | -NH_{2} | foto-reactivo | |
| APDP(1) | -SH | foto-reactivo | enlazador disulfuro yodable |
| APG | -NH_{2} | foto-reactivo | reacciona selectivamente |
| con Arg a pH 7-8 | |||
| ASIB(1) | -SH | foto-reactivo | yodable |
| ASBA (I) | -COOH | foto-reactivo | yodable |
| EDC | -NH_{2} | -COOH | enlazador de longitud cero |
| GMS | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-GMBS | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| HSAB | -NH_{2} | foto-reactivo | |
| sulfo-HSAB | -NH_{2} | foto-reactivo | soluble en agua |
| MBS | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-MBS- | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| M_{2}C_{2}H | carbohidrato | -SH | |
| MPBH | carbohidrato | -SH | |
| NHS-ASA(1) | -NH_{2} | foto-reactivo | yodable |
| Sulfo-NHS-ASA(1) | -NH_{2} | foto-reactivo | soluble en agua, yodable |
| sulfo-NHS-LC-ASA (1) | -NH_{2} | foto-reactivo | soluble en agua, yodable |
| PDPH | carbohidrato | -SH | enlazador disulfuro |
| PNP-DTP | -NH_{2} | foto-reactivo | |
| SADP | -NH_{2} | foto-reactivo | enlazador disulfuro |
| sulfo-SADP | -NH_{2} | foto-reactivo | enlazador disulfuro soluble |
| en agua | |||
| SAED | -NH_{2} | foto-reactivo | enlazador disulfuro |
| SAND | -NH_{2} | foto-reactivo | enlazador disulfuro soluble |
| en agua | |||
| SANPAH | -NH_{2} | foto-reactivo | |
| sulfo-SANPAH | -NH_{2} | foto-reactivo | soluble en agua |
| SASD (1) | -NH_{2} | foto-reactivo | enlazador disulfuro soluble |
| en agua | |||
| SIAB | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-SIAB | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
(Continuación)
| Agentes enlazadores heterobifuncionales | |||
| Agente enlazador | Reactividad 1 | Reactividad 2 | Comentarios |
| SMCC | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-SMCC | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| SMPB | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-SMPB | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| SMPT | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-LC-SMPT | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| SPDP | -NH_{2} | -SH | |
| sulfo-SPDP | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| sulfo-LC-SPDP | -NH_{2} | -SH | soluble en agua |
| sulfo-SAMCA(2) | -NH_{2} | foto-reactivo | |
| sulfo-SAPB | -NH_{2} | foto-reactivo | soluble en agua |
| Notas: | |||
| (1) = yodable | |||
| (2) = fluorescente |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Agentes enlazadores homobifuncionales | ||
| Agente enlazador | Reactividad | Comentarios |
| BS | -NH_{2} | |
| BMH | -SH | |
| BASED (1) | foto-reactivo | enlazador disulfuro yodable |
| BSCOES | -NH_{2} | |
| sulfo-BSCOES | -NH_{2} | soluble en agua |
| DFDNB | -NH_{2} | |
| DMA | -NH_{2} | |
| DMP | -NH_{2} | |
| DMS | -NH_{2} | |
| DPDPB | -SH | enlazador disulfuro |
| DSG | -NH_{2} | |
| DSP | -NH_{2} | enlazador disulfuro |
(Continuación)
| Agentes enlazadores homobifuncionales | ||
| Agente enlazador | Reactividad | Comentarios |
| DSS | -NH_{2} | |
| DST | -NH_{2} | |
| sulfo-DST | -NH_{2} | soluble en agua |
| DTBP | -NH_{2} | enlazador disulfuro |
| DTSSP | -NH_{2} | enlazador disulfuro |
| EGS | -NH_{2} | |
| sulfo-EGS | -NH_{2} | soluble en agua |
| SPBP | -NH_{2} |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Agentes de biotinilación | ||
| Agente | Reactividad | Comentarios |
| biotina-BMCC | -SH | |
| biotina-DPPE* | preparación de liposomas biotinilados | |
| biotina-LC-DPPE* | preparación de liposomas biotinilados | |
| biotina-HPDP | -SH | enlazadores disulfuro |
| biotina-hidrazida | carbohidrato | |
| biotina-LC-hidrazida | carbohidrato | |
| yodoacetil-LC-biotina | -NH_{2} | |
| NHS-iminobiotina | -NH_{2} | afinidad reducida por avidina |
| NHS-SS-biotina | -NH_{2} | enlazador disulfuro |
| biotina fotoactivable | ácidos nucleicos | |
| sulfo-NHS-biotina | -NH_{2} | soluble en agua |
| sulfo-NHS-LC-biotina | -NH_{2} | |
| Notas: DPPE = dipalmitoilfosfatidiletanolamina; LC = cadena larga. |
| Agentes para la modificación de proteínas | ||
| Agente | Reactividad | Función |
| Reactivo de Ellman | -SH | cuantifica/detecta/protege |
| DTT | -S.S- | reducción |
| 2-mercaptoetanol | -S.S- | reducción |
| 2-mercaptilaminal | -S.S- | reducción |
| Reactivo de Traut | -NH_{2} | introduce -SH |
| SATA | -NH_{2} | introduce -SH protegido |
| AMCA-NHS | -NH_{2} | marcaje fluorescente |
| AMCA-hidrazida | carbohidrato | marcaje fluorescente |
| AMCA-HPDP | -S.S- | marcaje fluorescente |
| SBF-cloro | -S.S- | detección fluorescente de -SH |
| N-etilmaleimida | -S.S- | bloquea -SH |
| NHS-acetato | -NH_{2} | bloquea y acetila -NH_{2} |
| anhídrido citracónico | -NH_{2} | \begin{minipage}[t]{48mm}bloque a reversiblemente e introduce cargas negativas \end{minipage} |
| DTPA | -NH_{2} | introduce quelante |
| BNPS-skatole | triptófano | escinde resto de triptófano |
| Bolton-Hunter | -NH_{2} | introduce grupo yodable |
Además de la cadena lineal ya contemplada y los
enlazadores de tipo PEG ramificados (por ejemplo polietilenglicoles
y otros que contienen de 2 a 100 unidades recurrentes de óxido de
etileno), los enlazadores en el sistema VLR pueden ser
independientemente un enlace químico o el resto de un grupo
enlazador. La frase "resto de un grupo enlazador" como se usa
en este documento se refiere a un resto que permanece, da como
resultado o procede de la reacción de un grupo reactivo de vector
con un sitio reactivo en un vector. La frase "grupo reactivo con
el vector" como se usa en este documento se refiere a cualquier
grupo que puede reaccionar con grupos funcionales que se encuentran
típicamente en vectores, cuya derivatización sólo afecta mínimamente
a la capacidad del vector para unirse a su receptor. Sin embargo,
se contempla específicamente que estos grupos reactivos con el
vector también pueden reaccionar con grupos funcionales típicamente
encontrados en moléculas de proteína relevantes. De esta manera, en
un aspecto, los enlazadores útiles en la práctica de esta invención
proceden de los grupos que pueden reaccionar con cualquier molécula
relevante que comprende un vector como se ha descrito anteriormente
que contiene un grupo reactivo, tanto si dicha molécula relevante es
una proteína como si no lo es, para formar un grupo enlazador.
Los grupos enlazadores preferidos proceden de
grupos reactivos con el vector seleccionado, pero sin limitación,
entre:
un grupo que reaccionará directamente con grupos
carboxi, aldehído, amina (NHR), alcoholes, sulfhidrilo, metilenos
activados y similares, en el vector, por ejemplo, grupos que
contiene halógeno activo incluyendo, por ejemplo, grupos
clorometilfenilo y grupos cloroacetilo [CICH_{2}C(=O)-], grupos
activados 2-etilsulfonilo (sustituidos con grupo
saliente) y etilcarbonilo tales como
2-cloroetilsulfonilo y
2-cloroetilcarbonilo; vinilsulfonilo;
vinilcarbonilo; epoxi; isocianato, isotiocianato, aldehído,
aziridina; succinimidoxicarbonilo; grupos acilo activados tales
como haluros de ácido carboxílico; anhídridos mixtos y
similares.
Un grupo que puede reaccionar fácilmente con
moléculas de vector modificadas que contienen un grupo reactivo con
el vector, es decir, vectores que contienen un grupo reactivo
modificado para contener grupos reactivos tales como los
mencionados en (1) anterior, por ejemplo, por oxidación del vector
para dar un aldehído o un ácido carboxílico, en cuyo caso el
"grupo enlazador" puede proceder de grupos reactivos
seleccionados entre amino, alquilamino, arilamino, hidrazino,
alquilhidrazino, arilhidrazino, carbazido, semicarbazido,
tiocarbazido, tiosemicarbazido, sulfhidrilo, sulfhidrilalquilo,
sulfhidrilarilo, hidroxi, carboxi, carboxialquilo y carboxiarilo.
Las porciones alquilo de dichos grupos enlazadores pueden contener
de 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono. Las porciones arilo de
dichos grupos enlazadores pueden contener de aproximadamente 6
aproximadamente 20 átomos de carbono; y
Un grupo que puede unirse al vector que contiene
un grupo reactivo, o al vector modificado como se ha indicado en
(1) y (2) anterior por medio del uso de un agente de
entrecruzamiento. Los restos de ciertos agentes de entrecruzamiento
útiles, tales como, por ejemplo, endurecedores de gelatina
homobifuncionales y heterobifuncionales, bisepóxidos y
bisiisocianatos pueden convertirse en una parte de un grupo
enlazador durante la reacción de entrecruzamiento. Sin embargo,
otros agentes de entrecruzamiento útiles pueden facilitar el
entrecruzamiento, por ejemplo, como catalizadores consumibles y no
están presentes en el conjugado final. Son ejemplos de dichos
agentes de entrecruzamiento agentes de entrecruzamiento de
carbodiimida y carbamoilonio como se describe en la Patente de
Estados Unidos Nº 4.421.847 y los éteres de la Patente de Estados
Unidos Nº 4.877.724. Con estos agentes de entrecruzamiento, uno de
los reactivos tales como el vector debe tener un grupo carboxilo y
el otro tal como un espaciador de cadena larga debe tener un grupo
reactivo amina, alcohol o sulfhídrilo. En la formación de enlaces
amida, el agente de entrecruzamiento primero reacciona
selectivamente con el grupo carboxilo, después se separa durante la
reacción del grupo carboxilo "activado" de esta manera con un
amina para formar un enlace amida uniendo de esta manera
covalentemente los dos restos. Una ventaja de esta estrategia es
que se evita el entrecruzamiento de moléculas similares, por
ejemplo, un vector a otro vector, mientras que la reacción de, por
ejemplo, agentes de entrecruzamiento homobifuncionales es no
selectiva y se obtienen moléculas entrecruzadas indeseadas.
Los grupos enlazadores útiles preferidos proceden
de diversos reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales tales
como los indicados en el Pierce Chemical Company Immunotechnology
Catalog - Protein Modification Section, (1995 y 1996). Los ejemplos
no limitantes útiles de estos reactivos incluyen:
Sulfo-SMCC
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo
Sulfo-SIAB
(4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo
Sulfo-SMPB
4-(p-maleimidofenil)butirato de
sulfosuccinimidilo
2-IT
2-Iminotiolano
SATA S-acetiltioacetato de
N-succinimidilo
Además de la descripción anterior, los grupos
enlazadores, en su totalidad o en parte, también pueden comprender
y derivar de secuencias complementarias de nucleótidos y restos de
nucleótidos, tanto naturales como modificados, preferiblemente
secuencias oligonucleotídicas sin autoasociación. En el mercado
están disponibles reactivos no limitantes particularmente útiles
para la incorporación de restos nucleotídicos modificados que
contienen grupos funcionales reactivos, tales como grupos amina y
sulfhidrilo, en una secuencia oligonucleotídica, por ejemplo, en
Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto California) e incluyen
Uni-Link AminoModifier (Nº de catálogo 5190),
Biotin-ON fosforamidita (Nº de catálogo 5191),
N-MNT-C6-AminoModifier
(Nº de catálogo 5202), AminoModifier II (Nº de catálogo 5203),
DMT-C6-3’Amina-ON
(Nº de catálogo 5222), C6-ThiolModifier (Nº de
catálogo 5211) y similares. En un aspecto, los grupos enlazadores
de esta invención proceden de la reacción de un grupo funcional
reactivo tal como un grupo amina o sulfhidrilo como está disponible
en los reactivos Clontech anteriores, de los que uno o más se ha
incorporado en una secuencia oligonucleotídica, por ejemplo, con uno
o más de los grupos reactivos con el vector descritos previamente
tal como un grupo heterobifuncional en el vector.
Por medio de la unión de dos secuencias
oligonucleotídicas complementarias, una al vector y otra al
indicador, el oligonucleótido hibridado bicatenario resultante
comprende el grupo enlazadores entre el vector y el indicador.
Otros sistemas poliméricos que sirven como
enlazadores incluyen:
Poli(L o D o
DL-aminoácidos) = proteínas y péptidos; naturales o
sintéticos
Pseudo poli(aminoácidos) = (aminoácidos
unidos por enlaces no amida)
Poli (L o D o DL-lactida) y los
copolímeros, por ejemplo, Poli
(L-lactida/DL-lactida)Poli
(glicolida)
Copolímeros de
L-lactida/glicolida
Poli-,-caprolactona y sus copolímeros
Polianhídridos
Poli (ortoésteres)
Polifosfacenos
Lípidos (y fosfolípidos) lineales o ramificados
de cadena larga. Azúcares y carbohidratos
Oligonucléotidos (véase anteriormente)
así como mezclas de los
anteriores.
Los agentes enlazadores usados de acuerdo con la
invención en general ocasionarán la unión del vector al indicador o
de un indicador a otro con algún grado de especificidad, y también
pueden usarse para unir uno o más agentes terapéuticamente
activos.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una herramienta para la liberación de un fármaco
terapéutico en combinación con la dirección mediada por un vector
del producto al sitio deseado. Por "terapéutico" o
"fármaco" se entiende un agente que tiene un efecto
beneficioso sobre una enfermedad específica en un ser humano o
animal no humano vivo.
Los compuestos terapéuticos usados de acuerdo con
la presente invención pueden encapsularse en el interior de un
enlazador agregado molecular o en forma de partículas o unirse a o
incorporarse en las paredes de encapsulación de un enlazador
vesicular. De esta manera, el compuesto terapéutico puede unirse a
una parte de la superficie, por ejemplo, por medio de enlaces
covalentes o iónicos, o puede mezclarse físicamente en un material
de encapsulación, particularmente si el fármaco tiene una polaridad
o solubilidad similar al material, para impedir que salga del
producto antes de que se desee que actúe en el cuerpo. La liberación
del fármaco puede iniciarse simplemente por contacto con la sangre
después de la administración o como consecuencia de otras
influencias internas o externas, por ejemplo, procesos de
disolución catalizados por enzimas o el uso cuando el
enlazador-indicador es una vesícula que contiene
gas.
La sustancia terapéutica puede unirse
covalentemente a la superficie de la membrana de encapsulación de un
enlazador vesicular usando un agente enlazador adecuado, por
ejemplo, como se describe en este documento. De esta manera, por
ejemplo, inicialmente se puede preparar un derivado de fosfolípido
al que se une el fármaco por medio un enlace o enlazador
biodegradable, y después se puede incorporar este derivado en el
material usado para preparar la membrana de la vesícula, como se ha
descrito anteriormente. Como alternativa, el agente puede
prepararse inicialmente sin el agente terapéutico, que después puede
acoplarse o aplicarse como un recubrimiento sobre agentes en forma
de partículas (por ejemplo vesiculares) antes de su uso. De esta
manera, por ejemplo, podría añadirse un agente terapéutico a una
suspensión de microburbujas en medio acuoso y agitarse para unir o
adherir el agente terapéutico a las microburbujas.
El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un
fármaco o profármaco conocido para uso en el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca congestiva u otra terapia cardiovascular.
Por medio de la dirección de un agente de acuerdo
con la invención que contiene una enzima de activación de
profármacos a áreas de patología, se pueden obtener imágenes de
dirección de la enzima, haciendo posible visualizar cuándo el
agente se dirige de manera apropiada y cuándo el agente ha
desaparecido de las áreas no diana. De esta forma, se puede
determinar el tiempo óptimo para la inyección de un profármaco en
pacientes individuales.
Otra alternativa es incorporar un profármaco, una
enzima de activación de profármaco y un vector en el mismo
enlazador-indicador particulado de tal forma que el
profármaco sólo se activará después de algunos estímulos externos.
Este estímulo puede ser, por ejemplo, un estallido de vesículas por
ultrasonidos externos, estimulación por luz de un indicador
cromofórico o calentamiento magnético de un indicador
superparamagnético después de que se haya conseguido la dirección
deseada.
En los agentes de acuerdo con la invención
también pueden usarse los denominados profármacos. De esta manera,
los fármacos pueden derivatizarse para alterar sus propiedades
físico-químicas y para adaptar el agente de la
invención; estos fármacos derivatizados pueden considerarse
profármacos y normalmente son inactivos hasta que la escisión del
grupo de derivatización regenere la forma activa del fármaco.
Los agentes terapéuticos pueden suministrarse
fácilmente de acuerdo con la invención en el corazón y en el
sistema vascular en general, y en el hígado, bazo y riñones y otras
regiones tales como el sistema linfático, cavidades corporales o
sistema gastrointestinal.
A modo de ejemplo, cuando el indicador es una
especie metálica quelada (por ejemplo, un ión metálico paramagnético
o un radionúclido metálico), el enlazador puede comprender una
cadena unida a un grupo quelante de metal, una cadena polimérica
con una pluralidad de grupos quelantes metálicos colgantes del
esqueleto molecular o incorporados en el esqueleto molecular, un
polímero ramificado con grupos quelantes metálicos en los extremos
ramificados (por ejemplo, un poliquelante dendrimérico), etc. Lo que
se requiere del enlazador es simplemente que se una a los restos de
vector e indicador conjuntamente durante un periodo adecuado. Por
periodo adecuado se entiende un periodo suficiente para que el
agente de contraste ejerza sus efectos deseados, por ejemplo,
aumentar el contraste in vivo durante un procedimiento de
formación de imágenes de diagnóstico.
De esta manera, en ciertas circunstancias, puede
ser deseable que el enlazador se biodegrade después de la
administración. Por medio de la selección de un enlazador
biodegradable de manera apropiada, es posible modificar los modelos
de biodistribución y bioeliminación para el vector y/o indicador.
Cuando el vector y/o indicador son biológicamente activos o pueden
ejercer efectos indeseados si quedan retenidos después del
procedimiento de formación de imágenes, puede ser deseable diseñar
biodegradabilidad en el enlazador que asegure una bioeliminación
apropiada o una degradación metabólica de los restos de vector y/o
indicador. De esta manera, un enlazador puede contener una función
biodegradable que tras la degradación produce productos de
degradación con patrones de biodistribución modificados que
resultan de la liberación del indicador del vector o de la
fragmentación de una estructura macromolecular. A modo de ejemplo,
en el caso de enlazadores que llevan indicadores de ión metálico
quelado es posible que el enlazador incorpore una función
biodegradable que tras la degradación libera un compuesto quelado
excretable que contiene el indicador. Por consiguiente, si se desea,
pueden incorporarse funciones biodegradables dentro de la
estructura del enlazador, preferiblemente en sitios que (a) son
sitios de ramificación, (b) en sitios de unión para vectores o
indicadores o cerca de estos sitios, o (c) de tal forma que la
biodegradación produce fragmentos fisiológicamente tolerables o
rápidamente excretables.
Los ejemplos de funciones biodegradables
adecuadas incluyen funciones éster, amida, doble éster, fosfoéster,
éter, tioéter, guanidilo, acetal y cetal.
Como se ha descrito anteriormente, el grupo
enlazador, si se desea, puede tener incorporado en su esqueleto
molecular grupos que afectan a la biodistribución del agente de
contraste o que aseguran una conformación espacial apropiada para
el agente de contraste, por ejemplo, para permitir el acceso del
agua a indicadores de ión metálico paramagnético quelado. A modo de
ejemplo, el esqueleto del enlazador puede constar, en parte o de
una forma esencialmente total, de una o más cadenas de óxido de
polialquileno.
De esta manera, el enlazador puede considerarse
un compuesto de grupos enlazadores al vector (V_{b}) y grupos
enlazadores al indicador (R_{b}) opcionalmente biodegradables
unidos a través de grupos de esqueleto de enlazador (L_{b}),
pudiendo llevar dichos grupos de esqueleto de enlazador grupos de
cadena lateral de enlazador (L_{sc}) para modificar la
biodistribución etc., y pueden incorporar por sí mismos funciones
biodegradables. Los grupos enlazadores R_{b} y V_{b} pueden ser
colgantes del esqueleto de enlazador o pueden estar en los extremos
del esqueleto del enlazador, por ejemplo, con un grupo R_{b} o
V_{b} en un extremo de L_{b}, con grupos R_{b} o V_{b} que
se unen entre sí a dos extremos L_{b} o con un extremo L_{b} que
lleva dos o más grupos R_{b} o V_{b}. Los grupos R_{b} y
L_{sc} convenientemente serán estructuras oligoméricas o
poliméricas (por ejemplo, poliésteres, poliamidas, poliéteres,
poliaminas, oligopéptidos, polipéptidos, oligo y polisacáridos,
oligonucleótidos, etc.), preferiblemente estructuras que tienen al
menos en parte una naturaleza hidrófila o lipófila, por ejemplo,
estructuras hidrófilas, anfífilas o lipófilas.
El enlazador puede tener un peso molecular bajo,
medio o elevado, por ejemplo, de hasta 2 MD. Generalmente, se
preferirán los enlazadores de mayor peso molecular si se van a
cargar con una multiplicidad de vectores o indicadores o si es
necesario separar el vector y el indicador, o si el enlazador por sí
mismo tiene un papel en la modificación de la biodistribución. Sin
embargo, en general, los enlazadores tendrán un peso molecular de
100 a 100.000 D, especialmente de 120 D a 20 kD.
La conjugación de enlazador a vector y de
enlazador a indicador puede realizarse por cualquier técnica de
conjugación química apropiada, por ejemplo, unión covalente (por
ejemplo, formación de éster o amida), quelación metálica u otra
unión coordinativa metálica o iónica, de nuevo como se ha descrito
anteriormente.
Los ejemplos de sistemas enlazadores adecuados
incluyen las estructuras poliquelantes amplificadoras de los
documentos US-A-5364613 y
WO90/12050, poliaminoácidos (por ejemplo polilisina), PEG
funcionalizado, polisacáridos, glicosaminoglicanos, polímeros
dendríticos tales como los descritos en el documento WO93/06868 y
por Tomalia et al. en Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:
138-175 (1990), polímeros de
PEG-quelante tales como los descritos en los
documentos WO4/08629, WO94/09056 y WO96/26754, etc.
Cuando el indiciador es un ión metálico quelado,
el grupo enlazador generalmente incorporará el resto quelante. Como
alternativa, el metal quelado puede llevarse sobre o en un indicador
en forma de partículas. En cualquier caso, pueden usarse grupos
quelantes metálicos convencionales tales como los que son bien
conocidos en los campos de agentes radiofarmacéuticos y medios de
contraste de MRI, por ejemplo, ácidos poliaminopolicarboxílicos
lineales, cíclicos y ramificados y equivalentes de oxiácido
fosforoso, y otros ligandos de azufre y/o nitrógeno conocidos en la
técnica, por ejemplo, DTPA, DTPA-BMA, EDTA, DO3A,
TMT (véase, por ejemplo, el documento
US-A-5367080), BAT y análogos
(véase por ejemplo Ohmono et al., J. Med. Chem. 35:
157-162 (1992) y Kung et al. J. Nucl. Med.
25: 326-332 (1984)), el quelante de
N_{2}S_{2} ECD de Neurolite, MAG (véase Jurisson et al.
Chem. Rev. 93: 1137-1156 (1993)), HIDA, DOXA
(ácido
1-oxa-4,7,10-triazaciclododecanotriacético),
NOTA (ácido 1,4,7-triazaciclononanotriacético),
TETA (ácido
1,4,8,11-tetraazaciclotetradecanotetraacético), THT
(4'-(3-amino-4-metoxi-fenil)-6,6''-bis(N',N'-dicarboximetil-N-metilhidrazino)-2,2':6',2''-terpiridina),
etc. A este respecto, se remite al lector a la bibliografía de
patentes de Sterling Winthrop, Nycomed (incluyendo Nycomed Imaging
and Nycomed Salutar), Schering, Mallinckrodt, Bracco y Squibb en
relación a los agentes quelantes para metales de diagnóstico, por
ejemplo, en agentes de MR, rayos X y radiodiagnóstico. Véanse, por
ejemplo, los documentos
US-A-4647447,
EP-A-71564,
US-A-4687659, WO89/00557,
US-A-4885363 y
EP-A-232751.
Los restos indicadores en los agentes de
contraste de la invención pueden ser cualquier resto que pueda
detectarse directa o indirectamente en un procedimiento de
formación de imágenes de diagnóstico in vivo, por ejemplo,
restos que emiten o que puede hacerse que emitan una radiación
detectable (por ejemplo, por desintegración radiactiva, excitación
de fluorescencia, excitación de resonancia de spin, etc.), restos
que afectan a los campos electromagnéticos locales (por ejemplo,
especies paramagnéticas, superparamagnéticas, ferrimagnéticas o
ferromagnéticas), restos que absorben o dispersan energía de
radiación (por ejemplo, cromóforos, partículas (incluyendo
vesículas que contienen gas o líquido), elementos pesados y
compuestos de los mismos, etc.) y restos que generan una sustancia
detectable (por ejemplo, generadores de microburbujas), etc.
En la técnica se conoce una serie muy amplia de
materiales detectables por la formación de imágenes de diagnóstico
y el indicador se seleccionará de acuerdo con la modalidad de
formación de imágenes que se vaya a usar. De esta manera, por
ejemplo, para la formación de imágenes por ultrasonidos, normalmente
se seleccionará un material ecogénico, o un material capaz de
generar un material ecogénico, para la formación de imágenes por
rayos X el indicador generalmente será o contendrá un átomo pesado
(por ejemplo, con un peso atómico de 38 o superior), para la
formación de imágenes por RM el indicador será un isótopo de spin
nuclear no cero (tal como ^{19}F) o un material con spins de
electrones no emparejados y por lo tanto propiedades paramgnéticas,
superparamagnéticas, ferrimagnéticas o ferromagnéticas, para la
formación de imágenes por medio de la luz el indicador será un
dispersador de luz (por ejemplo, una partícula coloreada o no
coloreada), un absorbente de luz o un emisor de luz, para la
formación de imágenes magnetométricas el indicador tendrá
propiedades magnéticas detectables, para la formación de imágenes
por impedancia eléctrica el indicador afectará a la impedancia
eléctrica y para escintigrafía, SPECT, PET, etc. el indicador será
un radionúclido.
En la bibliografía sobre la formación de imágenes
de diagnóstico se conocen ampliamente ejemplos de indicadores
adecuados, por ejemplo, partículas de óxido de hierro magnéticas,
vesículas que contienen gas, metales paramagnéticos quelados (tales
como Gd, Dy, Mn, Fe, etc.). Véanse, por ejemplo, los documentos
US-A-4647447, WO97/25073,
US-A-4863715,
US-A-4770183, WO96/09840,
WO85/02772, WO92/17212, WO97/29783,
EP-A-554213,
US-A-5228446, WO91/15243,
WO93/05818, WO96/23524, WO96/17628,
US-A-5387080, WO95/26205,
GB9624918.0, etc.
Son indicadores particularmente preferidos: iones
metálicos paramagnéticos quelados tales como Gd, Dy, Fe y Mn,
especialmente cuando están quelados por grupos quelantes
macrocíclicos (por ejemplo, quelantes de tetraazaciclododecano
tales como DOTA, DO3A, HP-D03A y análogos de los
mismos) o por grupos quelantes de enlazador tales como DTPA,
DTPA-BMA, EDTA, DPDP, etc.; radionúclidos metálicos
tales como ^{90}Y, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{47}Sc, ^{67}/Ga,
^{51}Cr, ^{177m}Sn, ^{67}Cu, ^{167}Tm, ^{97}Ru,
^{188}Re, ^{177}Lu, ^{199}Au, ^{203}pb y ^{141}Ce;
cristales de óxido de hierro superparamagnéticos; cromóforos y
fluoróforos que tienen máximos de absorción y/o emisión en el
intervalo de 300-1400 nm, especialmente de 600 nm a
1200 nm, en particular de 650 a 1000 nm; vesículas que contienen
gases fluorados (es decir, que contienen materiales en la fase
gaseosa a 37ºC que contiene flúor, por ejemplo, SF_{6} o
hidrocarburos C_{1-6} perfluorados u otros gases o
precursores de gas indicados en el documento WO97/29783); iones de
agrupamientos de metales pesados quelados (por ejemplo,
polioxoaniones de W o Mo o los análogos de azufre o de
oxígeno/azufre mixtos); átomos no metálicos unidos covalentemente
que tienen un alto número atómico (por ejemplo yodo) o son
radiactivos, por ejemplo ^{123}I, ^{131}I, etc., vesículas que
contienen compuestos yodados; etc.
Como se ha dicho generalmente, el indicador puede
ser (1) un metal quelable o ión que contiene metal poliatómico (es
decir, TcO, etc.), donde el metal es un metal de alto número atómico
(por ejemplo, un número atómico mayor de 37), una especie
paramagnética (por ejemplo, un metal de transición o lantánido), o
un isótopo radiactivo, (2) una especie no metálica unida
covalentemente que es un sitio de electrón no emparejado (por
ejemplo, un oxígeno o carbono en un radical libre persistente), un
no metal de alto número atómico, o un radioisótopo, (3) un
agrupamiento poliatómico o cristal que contiene átomos de alto
número atómico, que presenta un comportamiento magnético
cooperativo (por ejemplo, superparamagnetismo, ferrimagnetismo o
ferromagnetismo) o que contiene radionúclidos, (4) un gas o un
precursor de gas (es decir, un material o mezcla de materiales que
es gaseoso a 37ºC, (5) un cromóforo (término que incluye especies
que son fluorescentes o fosforescentes), por ejemplo, una
estructura inorgánica u orgánica, particularmente un ión metálico
complejado o un grupo orgánico que tiene un sistema de electrones
deslocalizados extensivo, o (6) una estructura o grupo que tiene
características de variación de impedancia eléctrica, por ejemplo,
gracias a un sistema de electrones deslocalizados extensivo.
Más adelante se describen con más detalle
ejemplos de grupos indicadores preferidos particulares.
Indicadores de metales quelados: radionúclidos
metálicos, iones metálicos paramagnéticos, iones metálicos
fluorescentes, iones metálicos pesados e iones agrupados.
Los radionúclidos metálicos preferidos incluyen
^{99}Y, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{47}Sc, ^{67}Ga, ^{51}Cr,
^{177m}Sn, ^{61}Cu, ^{167}Tm, ^{97}Ru, ^{188}Re,
^{177}Lu, ^{199}Au, ^{203}Pb y ^{141}Ce.
Los iones metálicos paramagnéticos preferidos
incluyen iones de metales de transición y lantánidos (por ejemplo,
metales que tienen números atómicos de 6 a 9, 21-29,
42, 44, 47 o 57-71), en particular iones de Cr, V,
Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er,
Tm, Yb y Lu, especialmente de Mn, Cr, Fe, Gd y Dy, más
especialmente Gd.
Los iones metálicos fluorescentes preferidos
incluyen lantánidos, en particular La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd,
Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu. Se prefiere especialmente Eu.
Los indicadores que contienen metales pesados
preferidos pueden incluir átomos de Mo, Bi, Si y W, y en particular
pueden ser iones de agrupamientos poliatómicos (por ejemplo,
compuestos de Bi y óxidos de W y Mo) como se describe en los
documentos WO91/14460, WO92/17215, WO96/40287 y WO96/22914.
Los iones metálicos deseablemente se quelan por
grupos quelantes en el resto enlazador o en o sobre una partícula
(por ejemplo, una vesícula o un sólido inorgánico u orgánico poroso
o no poroso), en particular quelantes lineales, macrocíclicos, de
terpiridina y N_{2}SO_{2}, tales como por ejemplo DTPA,
DTPA-BMA, EDTA, D03A, TMT. En los documentos
US-A-4647447, WO89/00557,
US-A-5367080,
US-A-5364613, etc., se describen
ejemplos adicionales de grupos quelantes adecuados.
El resto enlazador o la partícula puede contener
uno o más de estos grupos quelantes, si se desea metalados por más
de una especie metálica (por ejemplo, para proporcionar indicadores
detectables en diferentes modalidades de formación de imágenes).
Particularmente, cuando es no radiactivo, se
prefiere usar un enlazador poliquelante o indicador en forma de
partículas.
Un quelante o grupo quelante como se denomina en
este documento, puede comprender el resto de uno o más de una
amplia diversidad de agentes quelante que pueden formar complejos
con un ión metálico o un ión poliatómico (por ejemplo, TcO).
Como es bien conocido, un agente quelante es un
compuesto que contiene átomos donadores que pueden combinarse por
unión coordinada con un átomo metálico para formar una estructura
cíclica denominada complejo de quelación o quelato. Esta clase de
compuestos se describe en Kirk-Othmer Encyclopedia
of Chemical Technology, Vol. 5, 339-368.
El resto de un agente quelante adecuado puede
seleccionarse entre polifosfatos, tal como tripolifosfato sódico y
ácido hexametafosfórico; ácidos aminocarboxílicos, tales como ácido
etilendiaminatetraacético, ácido
N-(2-hidroxi-etilendiaminatriacético,
ácido nitrilotriacético,
N,N-di(2-hidroxietil)glicina,
ácido etilenbis(hidroxifenilglicina) y
dietilentriaminapentacético; 1,3-dicetonas, tales
como acetilacetona, trifluoroacetilacetona y tenoiltrifluoroacetona;
ácidos hidroxicarboxílicos, tales como ácido tartárico, ácido
cítrico, ácido glucónico y ácido 5-sulfosalicílico;
poliaminas, tales como etilendiamina, dietilentriamina,
trietilentetraamina y triaminotrietilamina; aminoalcoholes, tales
como trietanolamina y
N-(2-hidroxietil)etilendiamina; bases
heterocíclicas aromáticas, tales como
2,2'-diimidazol, picolina amina, dipicolina amina y
1,10-fenantrolina; fenoles, tales como
salicilaldehído, disulfopirocatecol y ácido cromotrófico;
aminofenoles, tales como 8-hidroxiquinolina y ácido
oximasulfónico; oximas, tales como dimetilglioxima y
salicilaldoxima; péptidos que contienen funcionalidad quelante
proximal tales como policisteína, polihistidina, ácido
poliaspártico, ácido poliglutámico o combinaciones de estos
aminoácidos; bases de Schiff, tales como disalicilaldehído
1,2-propilendiimina; tetrapirroles, tales como
tetrafenilporfina y ftalocianina; compuestos de azufre, tales como
toluenoditiol, ácido
meso-2,3-dimercaptosuccínico,
dimercaptopropanol, ácido tioglicólico, etilxantato potásico,
dietilditiocarbamato sódico, ditizona, ácido dietilditiofosfórico y
tiourea; compuestos macrocíclicos sintéticos, tales como
dibenzo[18]corona-6,
(CH_{3})_{6}-[14]-4,11]dieno-N_{4}
y (2.2.2-criptato); ácidos fosfónicos, tales como
ácido nitrilotrimetileno-fosfónico,
etilendiaminatetra(ácido metilenfosfónico) y ácido
hidroxietilidendifosfónico, o combinaciones de dos o más de los
agentes anteriores. El residuo de un agente quelante adecuado
preferiblemente comprende un grupo de ácido policarboxílico y los
ejemplos preferidos incluyen: ácido
etilendiamina-N,N,N',N'-tetraacético
(EDTA); ácido
N,N,N',N'',N''-dietilen-triaminapentaacético
(DTPA); ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA); ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N''-triacético
(DO3A); ácido
1-oxa-4,7,10-triazaciclododecano-N,N',N''-triacético
(OTTA); ácido
trans(1,2)-ciclohexanodietileno-triamina-pentaacético
(CDTPA).
Otros restos adecuados de agentes quelantes
comprenden proteínas modificadas para la quelación de metales tales
como tecnecio y renio como se describe en la Patente de Estados
Unidos Nº 5078985, cuya descripción se incorpora en este documento
como referencia.
También pueden obtenerse restos adecuados de
agentes quelantes a partir de compuestos que contienen N3S y N2S2,
por ejemplo, como los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº
4444690; 4670545; 4673562; 4897255; 4965392; 4980147; 4988496;
5021556 y 5075099.
En el documento WO92/08494 se describen otros
restos adecuados de quelantes.
Los grupos quelantes preferidos se seleccionan
entre el grupo compuesto por 2-amiometilpiridina,
ácido iminoacético, ácido iminodiacético, ácido
etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético
(DTPA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético
(DOTA), ácido carboniliminodiacético, ácido metieniminoacético,
ácido metileniminodiacético, ácido etilentioetileniminoacético,
ácido etilentioetileniminodiacético, TMT, un grupo terpiridilo, un
agente quelante que comprende un grupo terpiridilo y un grupo
carboximetilamino, o una sal de cualquiera de los ácidos
anteriores. Son grupos quelantes especialmente preferidos DTPA,
DTPA-BMA, DPDP, TMT, DOTA y HPDO3A.
También se describen grupos quelantes
representativos en los documentos US 5559214 A, WO 95/26754, WO
94/08624, WO 94/09056, WO 94/29333, WO 94/08624, WO 94/08629 A1, WO
94/13327 A1 y WO 94/12216 A1.
Dentro del nivel de experiencia en la técnica
están presentes métodos para metalizar cualquier agente quelante.
Los metales pueden incorporarse en un resto quelante por uno
cualquiera de tres métodos generales: incorporación directa,
síntesis de plantillas y/o transmetalación. Se prefiere la
incorporación directa.
De esta manera, es deseable que el ión metálico
se compleje fácilmente con el agente quelante, por ejemplo,
simplemente exponiendo o mezclando una solución acuosa del resto que
contiene el agente quelante con una sal metálica en una solución
acuosa, preferiblemente que tiene un pH en el intervalo de
aproximadamente 4 a aproximadamente 11. La sal puede ser cualquier
sal, pero preferiblemente la sal es una sal soluble en agua del
metal tal como una sal de halógeno, y más preferiblemente estas
sales se seleccionan de manera que no interfieran con la unión del
ión metálico con el agente quelante. El resto que contiene agente
quelante preferiblemente está en solución acuosa a un pH
comprendido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, más
preferiblemente entre pH de aproximadamente 6 y aproximadamente 8.
El resto que contiene el agente quelante puede mezclarse con sales
tamponantes tales como citrato, acetato, fosfato y borato para
producir el pH óptimo. Preferiblemente, las sales tampón se
seleccionan de manera que no interfieran con la unión posterior del
ión metálico al agente quelante.
En la formación de imágenes de diagnóstico, la
construcción de
vector-enlazador-indicador (VLR)
preferiblemente contiene una relación entre el radionúclido
metálico y el agente quelante que es eficaz en estas aplicaciones
de formación de imágenes de diagnóstico. En realizaciones
preferidas, la relación molar de ión metálico por agente quelante
es de aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 1:1.
En aplicaciones radioterapéuticas, el VLR
preferiblemente contiene una relación entre ión de radionúclido
metálico y agente quelante que es eficaz en estas aplicaciones
terapéuticas. En realizaciones preferidas, la relación molar de ión
metálico por agente quelante es de aproximadamente 1:100 a
aproximadamente 1:1. El radionúclido puede seleccionarse, por
ejemplo, entre radioisótopos de Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr,
Zn, Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta y Tl. Los
radionúclidos preferidos incluyen ^{44}Sc, ^{64}Cu, ^{67}Cu,
^{212}Pb, ^{68}Ga, ^{90}Y, ^{153}Sm, ^{212}Bi, ^{186}Re
y ^{188}Re. De éstos, se prefiere especialmente el ^{90}Y.
Estos radioisótopos pueden ser atómicos o preferiblemente
iónicos.
Los siguientes isótopos o pares de isótopos puede
usarse tanto para la formación de imágenes como para la terapia sin
tener que cambiar la metodología o el quelante de radiomarcaje:
^{47}Sc_{21}; ^{141}Ce_{58}; ^{188}Re_{75};
^{177}Lu_{71}; ^{199}Au_{79}; ^{47}Sc_{21};
^{131}I_{53}; ^{67}Cu_{29}; ^{131}I_{53} y
^{123}I_{53}; ^{188}Re_{75} y ^{99m}Tc_{43};
^{90}Y_{39} y ^{87}Y_{39}; ^{47}Sc_{21} y
^{44}Sc_{21}; ^{90}Y_{39} y ^{123}I_{53};
^{146}Sm_{62} y ^{153}Sm_{62}; y ^{90}Y_{39} y
^{111}ln_{49}.
Cuando el resto enlazador contiene un solo
quelante, ese quelante puede unirse directamente al resto del
vector, por ejemplo, a través de uno de los grupos de coordinación
de metales del quelante que puede formar un enlace éster, amida,
tioéster o tioamida con una amina, tiol o grupo hidroxilo en el
vector. Como alternativa, el vector y el quelante pueden unirse
directamente a través de una funcionalidad unida al esqueleto del
quelante, por ejemplo, un grupo
CH_{2}-fenil-NCS unido a un
carbono del anillo de DOTA como se propone por Meares et al.
en JACS 110: 6266-6267 (1988), o
indirectamente a través de un enlazador homo o hetrobifuncional, por
ejemplo, una bis amina, bis epóxido, diol, diácido, PEG
difuncionalizado, etc. En este caso, el enlazador bifuncional
convencionalmente proporcionará una cadena de 1 a 200,
preferiblemente de 3 a 30 átomos entre el vector y el resto de
quelante.
Cuando el resto de enlazador contiene una
pluralidad de grupos quelantes, el enlazador preferiblemente es o
contiene porciones de fórmula
en la que Ch es un resto quelante y
Li es un componente de esqueleto enlazador, es decir, el enlazador
preferiblemente tiene quelantes colgantes, quelantes incorporados
en el esqueleto o quelantes terminales o una combinación de los
mismos. Las estructuras poliméricas colgantes e incorporadas en el
esqueleto pueden estar ramificadas, pero más preferiblemente son
lineales y las unidades repetidas (LiCh) u otras unidades repetidas
en el polímero pueden tener grupos modificadores de la
biodistribución incorporados en el esqueleto o colgantes, por
ejemplo, grupos polialquileno como en los documentos WO94/08629,
WO94/09056 y WO96/20754. Las estructuras quelantes terminales Li
(Ch)_{n},
que pueden ser polímeros dendríticos como en el documento WO93/06868, pueden tener grupos modificadores de la biodistribución unidos a los extremos no ocupados por quelantes y pueden tener sitios potenciadores de la biodegradación dentro de la estructura del enlazador como en el documento WO95/28966.
que pueden ser polímeros dendríticos como en el documento WO93/06868, pueden tener grupos modificadores de la biodistribución unidos a los extremos no ocupados por quelantes y pueden tener sitios potenciadores de la biodegradación dentro de la estructura del enlazador como en el documento WO95/28966.
Los restos quelantes dentro del enlazador
poliquelante pueden unirse a través de funcionalización de esqueleto
del quelante o por medio de la utilización de uno o más de los
grupos de coordinación metálicos del quelante o por formación de
amida u otro enlace entre un quelante ácido y un esqueleto de
enlazador que lleva amina o hidroxilo, por ejemplo, como en
polilisina-poliDTPA,
polilisina-poliDOTA y en los denominados
poliquelantes amplificadores, del documento WO90/12050. Estos
enlazadores poliquelantes pueden conjugarse con uno o más grupos de
vectores directamente (por ejemplo, utilizando grupos amina, ácido o
hidroxilo en el enlazador poliquelante) o a través de un compuesto
enlazador bifuncional como se ha descrito anteriormente para
enlazadores monoquelantes.
Cuando la especie quelada se lleva por un
enlazador en forma de partículas (o agregado molecular, por ejemplo,
vesicular), el quelato puede ser, por ejemplo, un mono o
poliquelato no unido (tal como Gd DTPA-BMA o Gd
HP-DO3A) encerrado dentro de la partícula o puede
ser un mono o poliquelado conjugado con la partícula por unión
covalente o por interacción de un grupo de anclaje (por ejemplo, un
grupo lipófilo) sobre el mono/poliquelato con la membrana de una
vesícula (véase por ejemplo el documento WO96/11023).
Los indicadores atómicos no metálicos preferidos
incluyen radioisótopos tales como ^{123}I y ^{131}I así como
átomos de spin nuclear no cero tales como ^{18}F y átomos pesados
tales como I.
Estos indicadores, preferiblemente una pluralidad
de los mismos, por ejemplo de 2 a 200, pueden unirse covalentemente
a un esqueleto enlazador directamente usando técnicas de síntesis
química convencionales o a través de un grupo de soporte, por
ejemplo un grupo triyodofenilo.
En una realización de esta invención, se
contempla específicamente el uso de radioisótopos de yodo. Por
ejemplo, si el vector o enlazador comprende sustituyentes que
pueden sustituirse químicamente con yodo en una reacción de
formación de enlaces covalentes tal como, por ejemplo, sustituyentes
que contienen funcionalidad hidroxifenilo, estos sustituyentes
pueden marcarse por métodos bien conocidos en la técnica con un
radioisótopo de yodo. Las especies de yodo pueden usarse en
aplicaciones de formación de imágenes terapéuticas y de diagnóstico.
Aunque, al mismo tiempo, también puede usarse un metal en un agente
quelante en el mismo vector-enlazador en
aplicaciones de formación de imágenes terapéuticas o de
diagnóstico.
Como ocurre con los quelantes metálicos descritos
anteriormente, estos indicadores atómicos no metálicos pueden
unirse al enlazador o llevarse en o sobre un enlazador en forma de
partículas, por ejemplo, en una vesícula (véanse los documentos
WO95/26205 y GB9624918.0).
Los enlazadores del tipo descrito anteriormente
en relación con los indicadores metálicos pueden usarse para
indicadores atómicos no metálicos ocupando los indicadores atómicos
no metálicos o grupos que llevan estos indicadores el lugar de
alguno o todos los grupos quelantes.
Los indicadores cromóforos o fluoróforos
orgánicos preferidos incluyen grupos que tienen un sistema de
electrones deslocalizados extensivo, por ejemplo, cianinas,
merocianinas, ftalocianinas, naftalocianinas, trifenilmetinas,
porfirinas, colorantes de pirilio, colorantes de tiapirilio,
colorantes de escuarilio, colorantes de croconio, colorantes de
azuleno, indoanilinas, colorantes de benzofenoxazinio, colorantes de
benzotiofentiazinio, antraquinonas, naftoquinonas, indatrenos,
ftaloilacridonas, trisfenoquinonas, colorantes de azo, colorantes de
transferencia de carga intramoleculares e intermoleculares y
complejos de colorantes, troponas, tetrazinas, complejos de
bis(ditioleno), complejos de
bis(benceno-ditiolato), colorantes de
yodoanilina, complejos de bis(S,O-ditioleno),
etc. Pueden encontrarse ejemplos de cromóforos orgánicos metalados
u orgánicos adecuados en "Topics in Applied Chemistry: Infrared
absorbing dyes" Ed. M. Matsuoka, Plenum, NY 1990, "Topics in
Applied Chemistry: The Chemistry and Application of Dyes",
Waring et al. Plenum, NY, 1990, "Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemicals" Haugland, Molecular Probes Inc,
1996, documentos DE-A-4445065,
DE-A-4326466,
JP-A-3/228046, Narayanan et
al. J. Org. Chem. 60: 2391-2395 (1995),
Lipowska et al. Heterocyclic Comm. 1:
427-430 (1995), Fabian et al. Chem. Rev.
92: 1197 (1992), documento WO96/23525, Strekowska et
al. J. Org. Chem. 57: 4578-4580 (1992),
documento WO (Axis) y WO96/17628. Los ejemplos particulares de
cromóforos que pueden usarse incluyen xilenocianol, fluoresceína,
dansilo, NBD, verde de indocianina, DODCl, DTDCl, DOTCl y DDTCl.
Son particularmente preferidos grupos que tienen
máximos de absorción entre 600 y 1000 nm para evitar la
interferencia con la absorción de la hemoglobina (por ejemplo,
xileno cianol).
Los ejemplos adicionales incluyen:
colorantes de cianina: tales como colorantes de
heptametincianina, por ejemplo, los compuestos 4a a 4g de la Tabla
II en la página 26 de Matsuoka (supra)
| 4a | en la que Y = S, | X = I | R = Et |
| 4b | en la que Y = S, | X = ClO_{4}, | R = Et |
| 4c | en la que Y = CMe_{2} | X = I, | R = Me |
| 4d | en la que Y = CMe_{2} | X = ClO_{4}, | R = Me |
| 4e | en la que Y = CH=CH | X = I, | R = Et |
| 4f | en la que Y = CH=CH | X = Br, | R = Et |
| 4g | en la que Y = CH=CH | X = ClO_{4}, | R = Et |
y en la Tabla III en la pág
28 de Matsuoka (supra), es
decir
| en la que | Y = O, | X = I, | R = Me |
| en la que | Y = CMe_{2}, | X = I, | R = Me |
| en la que | Y = S, | X = Br, | R = Et; |
colorantes de
calcogenopirilometino, por ejemplo, los compuestos 12 en la página
31 de Matsuoka (supra), es
decir
en la que Y = Te, Se, O o
NR;
colorantes de monocalcogenopirilometino, por
ejemplo, los compuestos 13 en la página 31 de Matsuoka
(supra), es decir
en la que n = 1 o
2;
\newpage
colorantes de pirilio, por ejemplo, los
compuestos 14 (X = O) en la página 32 de Matsuoka (supra), es
decir
en la que X = O, S, o
Se;
colorantes de tiapirilio, por ejemplo, los
compuestos 15 en la página 32, y el compuesto I en la pág 167 de
Matsuoka (supra), es decir
en la que n = 1 o
2;
colorantes de escuarilio, por ejemplo, el
compuesto 10 y la Tabla IV en la página 30 de Matsuoka
(supra), es decir
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et,
X = S, Y = H, y R = Et, y
X = CMe_{2}, Y = H, y R = Me,
y el compuesto 6, página 26, de Matsuoka
(supra), es decir
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et;
\newpage
colorantes de croconio, por ejemplo, el compuesto
9 y la Tabla IV en la página 30 de Matsuoka (supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et,
X = S, Y = H, y R = Et,
X = CMe_{2}, Y = H, y R = Me,
y el compuesto 7, página 26, de Matsuoka
(supra), es decir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X = CH=CH, Y = H, y R =
Et;
colorantes de azulenio, por ejemplo, el compuesto
8 en la pág 27, de Matsuoka (supra), es decir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes de merocianina, por
ejemplo, el compuesto 16, R = Me, en la página 32 de Matsuoka
(supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes de indoanilina tales
como complejos de cobre y níquel de colorantes de indoanilina, por
ejemplo, el compuesto 6 en la página 63 de Matsuoka (supra),
es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R = Et, R' = Me, M =
Cu,
R = Et, R' = Me, M = Ni,
R = Me, R' = H, M = Cu, o
R = Me, R' = H, M = Ni,
colorantes de
benzo[a]fenoxazinio y colorantes de
benzo[a]fenotiazinio, por ejemplo, como se muestra en
la página 201 de Matsuoka (supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X = O o
S;
1,4-diaminoantraquinona(N-alquil)-3'-tioxo-2,3-dicarboxamidas,
por ejemplo, el compuesto 20, en la página 41 de Matsuoka
(supra)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
pigmentos de indantreno, por
ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
véase el compuesto 21 en la página
41 de Matsuoka
(supra);
\newpage
colorantes de
2-arilamino-3,4-ftalocianina,
por ejemplo, el compuesto 22 en la página 41 de Matsuoka
(supra)
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes de trisfenoquinona, por
ejemplo, el compuesto 23 en la página 41 de Matsuoka
(supra)
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes de azo, por ejemplo, el
colorante de monoazo, compuesto 2 en la pág 90 de Matsuoka
(supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X =
CH=C(CN)_{2}, R_{1} = R_{2} = Et, R_{3} =
R_{4} =
H,
X = C(CN)=C(CN)_{2},
R_{1} = R_{2} = Et, R_{3} = R_{4} = H, o
X = 34
e Y = C=O, R_{1} = R_{2} = Et, R_{3} =
R_{4} = H,
o Y = SO2, R_{1} = H, R_{2} =
CH(Me)nBu, R_{3} = OMe, y R_{4} = NHAc;
colorantes de azo, por ejemplo, el colorante de
poliazo, compuesto 5 en la página 91 de Matsuoka (supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
colorantes infrarrojos de
transferencia de carga intramolecular dador-aceptor,
por ejemplo, los compuestos 6 y 7 en la página 91 de Matsuoka
(supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes aromáticos de no
bencenoides, por ejemplo, el compuesto 8, una tropona, en la página
92, de Matsuoka (supra), es
decir
colorantes de radical tetrazina,
por ejemplo, el compuesto 9 en la página 92 de Matsuoka
(supra), es
decir
en la que, X =
p-fenileno
o
X = p-terfenileno así como el
compuesto 10 en la página 92 de Matsuoka (supra), es
decir
en la que X =
p-bifenilo;
\newpage
sales catiónicas de colorantes de radical
tetrazina, por ejemplo, el compuesto 11 en la página 92 de Matsuoka
(supra)
en la que X =
p-fenileno;
colorantes de transferencia de carga
intermolecular dador-aceptor, por ejemplo, complejos
CT de los compuestos 13b y 14a a 14c en la página 93 de Matsuoka
(supra), es decir
en la que X =
CH=N-N(Ph)_{2} en el donador
y
a) Y = CN, Z = NO_{2}
b) Y = CN, Z = H, o
c) Y = Cl, Z = NO_{2} en el aceptor;
colorantes de antraquinona, por ejemplo, los
compuestos 12 (X = S o Se) en la página 38 de Matsuoka
(supra), es decir
en la que X = S o Se e Y =
tetracloro, tetrabromo, ácido 2,3-dicarboxílico,
anhídrido 2,3-dicarboxílico, o
N-fenil imida del ácido
2,3-dicarboxílico;
colorantes de naftoquinona, por ejemplo, los
compuestos 2, 3 y 4 en la página 37, de Matsuoka (supra), es
decir
\vskip1.000000\baselineskip
colorantes de azo metalizados tales
como colorantes de azo que contienen níquel, cobalto, cobre, hierro,
y
manganeso;
colorantes de ftalocianina, por ejemplo, el
compuesto 1 en la Tabla II en la página 51 de Matsuoka
(supra), por ejemplo
colorantes de naftalocianina, por
ejemplo, el compuesto 3 en la Tabla II en la página 51 de Matsuoka
(supra), por
ejemplo
ftalocianinas metálicas tales como
ftalocianinas que contienen aluminio, silicio, níquel, zinc, plomo,
cadmio, magnesio, vanadio, cobalto, cobre, y hierro, por ejemplo,
el compuesto 1 en la Tabla III en la página 52 de Matsuoka
(supra), por
ejemplo
en la que, por ejemplo, M =
Mg;
naftalocianinas metálicas tales como
naftalocianinas que contienen aluminio, zinc, cobalto, magnesio,
cadmio, silicio, níquel, vanadio, plomo, cobre, y hierro, véase el
compuesto 3 en la Tabla III en la página 52 de Matsuoka
(supra), por ejemplo
en la que, por ejemplo, M =
Mg;
complejos metálicos bis(ditioleno) que
comprenden un ión metálico tal como níquel, cobalto, cobre, y hierro
coordinado con cuatro átomos de azufre en un complejo ligando
bis(S,S'-bidentado), por ejemplo, véase la
Tabla I en la página 59 de Matsuoka (supra)
en la
que
R_{1} = R_{2} = CF3, M = Ni,
R_{1} = R_{2} = fenilo, M = Pd,
R_{1} = R_{2} = fenilo, M = Pt,
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Ni,
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Pd,
R_{1} = alquilo C4 a C10, R_{2} = H, M =
Pt,
R_{1} = R_{2} = fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
p-CH_{3}-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
p-CH_{3}O-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
p-Cl-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
p-CF_{3}-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
3,4-diCl-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
o-Cl-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
o-Br-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
3,4-diCl-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} =
p-CH_{3}-fenilo, M = Ni,
R_{1} = R_{2} = 2-tienilo, M
= Ni,
R_{1} = p-(CH_{3})_{2}
N-fenilo, R_{2} = fenilo, M = Ni, y
R_{1} = p-(CH_{3})_{2}
N-fenilo, R_{2} =
p-H_{2}N-fenilo, M = Ni;
complejos metálicos bis(bencenoditiolato)
que comprenden un ión metálico tal como níquel, cobalto, cobre y
hierro coordinado con cuatro átomos de azufre en un complejo
ligando, por ejemplo, véase la Tabla III en la página 62 de Matsuoka
(supra), es decir,
en la
que
X = tetrametilo, M = Ni,
X = 4,5-dimetilo, M = Ni,
X = 4-metilo, M = Ni,
X = tetracloro, M = Ni,
X = H, M = Ni,
X = 4-metilo, M = Co,
X = 4-metilo, M = Cu, y
X = 4-metilo, M = Fe;
colorantes de indoanilina
N,O-bidentados que comprenden un ión metálico tal
como níquel, cobalto, cobre, y hierro coordinado con dos átomos de
nitrógeno y dos átomos de oxígeno de dos ligandos indoanilina
N,O-bidentados, por ejemplo, el compuesto 6 de la
Tabla IV en la página 63 de Matsuoka (supra), por
ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R = Et, R' = Me, M =
Cu,
R = Et, R' = Me, M = Ni,
R = Me, R' = H, M = Cu, y
R = Me, R' = H, M = Ni,
complejos metálicos
bis(S,O-ditioleno) que comprende un ión
metálico tal como níquel, cobalto, cobre, y hierro coordinado con
dos átomos de azufre y dos átomos de oxígeno en un complejo ligando
bis(S,O-bidentado), por ejemplo, véase la
Patente de Estados Unidos Nº 3.806.462, por ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
complejos
a-diimina-ditioleno que comprenden
un ión metálico tal como níquel, cobalto, cobre y hierro coordinado
con dos átomos de azufre y dos átomos de nitrógeno de imino en un
complejo diligando S,S- y N,N-bidentado mixto, por
ejemplo véase la Tabla II en la página 180, segunda desde el final,
de Matsuoka (supra) (véase también las patentes japonesas:
62/39.682, 63/126.889 y 63/139.303), por
ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
complejos tris(a-diimina)
que comprenden un ión metálico coordinado con seis átomos de
nitrógeno en un complejo triligando, por ejemplo, véase la Tabla II
en la página 180 de Matsuoka (supra), último compuesto,
(véase también las Patentes Japonesas 61/20.002 y 61/73.902), por
ejemplo,
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos representativos de colorantes
visibles incluyen derivados de fluoresceína, derivados de rodamina,
cumarinas, colorantes de azo, colorantes metalizables, colorantes de
antraquinona, colorantes de benzodifuranona, colorantes de
carbonilo aromático policíclico, colorantes de indigoides,
colorantes de polimetino, colorantes de azacarbocianina, colorantes
de hemicianina, barbituratos, colorantes de diazahemicianina,
colorantes de estirilo, colorantes de diaril carbonio, colorantes
de triaril carbonio, colorantes de ftalocianina, colorantes de
quinoftalona, colorantes de trifenodioxazina, colorantes de
formazán, colorantes de fenotiazina tales como azul de metileno,
azure A, azure B, y azure C, colorantes de oxazina, colorantes de
tiamina, colorantes de naftolactama, colorantes de
diazahemicianina, colorantes de azopiridona, colorantes de
azobenceno, colorantes mordientes, colorantes ácidos, colorantes
básicos, colorantes metalizados y premetalizados, colorantes
xanteno, colorantes directos, colorantes de leuco que pueden
oxidarse para producir colorantes con matices desplazados
batocrómicamente de aquellos del precursor de colorantes de leuco, y
otros colorantes tales como los mostrados en Warling, D. R. y
Hallas, G., en "The Chemistry and Application of Dyes", Topics
in Applied Chemistry, Plenum Press, Nueva York, N.Y., 1990.
Pueden encontrarse colorantes adicionales enumerados en Haugland, R.
P., "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals",
Sexta Edición, Molecular Probes, Inc., Eugene OR, 1996.
Dichos cromóforos y fluoróforos pueden unirse
covalentemente bien directamente al vector o a o en la estructura
del enlazador. De nuevo los enlazadores del tipo descrito
anteriormente en relación con los indicadores metálicos pueden
usarse para cromóforos o fluoróforos orgánicos ocupando los
cromóforos/fluoróforos el lugar de alguno o todos los grupos
quelantes.
Al igual que con los quelantes analizados
anteriormente los cromóforos/fluoróforos pueden incluirse en o sobre
un resto enlazador en forma de partículas, por ejemplo, en o sobre
una vesícula o unido covalentemente a partículas de matriz inertes
que también pueden funcionar como un indicador de dispersión de
luz.
Los indicadores y
enlazadores-indicadores en forma de partículas
generalmente se clasifican en dos categorías - aquellos en los que
la partícula comprende una matriz o envuelta que lleva o contiene el
indicador y aquellos en los que la matriz en forma de partículas es
por sí misma el indicador. Son ejemplos de la primera categoría:
vesículas (por ejemplo, micelas, liposomas, microbolas y
microburbujas) que contienen una fase líquida, gaseosa o sólida que
contiene el indicador eficaz de contraste, por ejemplo, un gas
ecogénico o un precursor del mismo (véase por ejemplo el documento
GB 9700699.3), un metal paramagnético quelado o radionúclido, o un
agente de contraste de rayos X yodado soluble en agua; partículas
porosas cargadas con el indicador, por ejemplo, partículas de
tamices moleculares cargadas con metales paramagnéticos; y
partículas sólidas, por ejemplo, de un polímero biotolerable
inerte, sobre las que el indicador se une o se aplica como un
recubrimiento, por ejemplo, partículas poliméricas cargadas
con
colorante.
colorante.
Son ejemplos de la segunda categoría: partículas
orgánicas o inorgánicas de dispersión de luz; partículas magnéticas
(es decir, superparamagnéticas, ferromagnéticas o ferrimagnéticas);
y partículas de colorante.
Los indicadores o
indicadores-enlazadores en forma de partículas
preferidos incluyen partículas superparamagnéticas (véanse los
documentos US-A-4770183, WO97/25073,
WO96/09840, etc.), vesículas ecogénicas (véanse los documentos
WO92/17212, WO97/29783, etc.), vesículas que contienen yodo (véanse
los documentos WO95/26205 y GB9624918.0) y partículas poliméricas
cargadas con colorante (Véase el documento WO96/23524).
Los indicadores en forma de partículas pueden
tener uno o más vectores unidos directa o indirectamente a sus
superficies. Generalmente, se preferirá unir una pluralidad (por
ejemplo de 2 a 50) de restos de vector por partícula. De una forma
particularmente conveniente, aparte del vector de dirección deseado,
también se unirán vectores de deceleración de flujo a las
partículas, es decir, vectores que tienen una afinidad por el lumen
del capilar u otra superficie de órgano que es suficiente como para
ralentizar el paso del agente de contraste a través de los
capilares o el órgano diana, pero que no es suficiente como para
inmovilizar el agente de contraste. Estos vectores de deceleración
del flujo (descritos por ejemplo en el documento BB9700699.3) además
pueden servir para anclar el agente de contraste una vez que se ha
unido a su sitio diana.
El medio por el cual se consigue la unión del
vector a la partícula dependerá de la naturaleza de la superficie
de la partícula. En el caso de partículas inorgánicas, la unión a la
partícula puede realizarse por ejemplo por medio de interacción
entre un grupo enlazador a un metal (por ejemplo, un grupo fosfato,
fosfonato u oligo o polifosfato) en el vector o en un enlazador
unido al vector. En el caso de partículas orgánicas (por ejemplo
poliméricas), la unión al vector puede realizarse por medio de unión
covalente directa entre grupos sobre la superficie de la partícula
y grupos reactivos en el vector, por ejemplo, unión de amida o
éster, o por unión covalente del vector y la partícula a un
enlazador. Pueden usarse enlazadores del tipo descrito anteriormente
en relación con los indicadores de metales quelados aunque, en
general, los enlazadores no se usarán para acoplar partículas entre
sí.
En el caso de partículas no sólidas, por ejemplo
gotas (por ejemplo, de líquidos yodados insolubles en agua como se
describe en los documentos
US-A-5318767,
US-A-5451393,
US-A-5352459 y
US-A-5569448) y vesículas, el
enlazador puede contener convenientemente grupos de "anclaje"
hidrófobos, por ejemplo cadenas C_{12-30}
saturadas o insaturadas, que penetrarán en la superficie de la
partícula y unirán el vector a la partícula. De esta manera, en el
caso de vesículas de fosfolípidos, el enlazador puede servir para
unir el vector covalentemente a un fosfolípido compatible con la
membrana de la vesícula. En los documentos GB9622368.0 y WO97/25073
se describen ejemplos de unión de enlazadores a vesículas y
partículas inorgánicas.
Aparte de los vectores, otros grupos pueden
unirse a la superficie de las partículas, por ejemplo
estabilizadores (para impedir la agregación) y modificadores de la
biodistribución tales como PEG. Estos grupos se describen, por
ejemplo, en los documentos WO97/25073, WO96/09840,
EP-A-284549 y
US-A-4904479.
Preferiblemente, los agentes
V-L-R de la invención tendrán
vectores no peptídicos (tales como losartán) acoplados directa o
indirectamente a un indicador, por ejemplo, con radioisótopos de
yodo unidos covalentemente, con quelatos metálicos unidos
directamente o a través de un grupo enlazador orgánico o acoplado a
un indicador o enlazador-indicador en forma de
partículas, por ejemplo, cristales superparamagnéticos
(opcionalmente recubiertos, por ejemplo, como en el documento
WO97/25073), o una vesícula, por ejemplo, micelas, liposoma o
microbola que contiene un gas o que contiene un agente de contraste
yodado.
Los agentes de la invención pueden administrarse
a los pacientes para formar imágenes en cantidades suficientes para
producir el contraste deseado con la técnica de formación de
imágenes particular. Cuando el indicador es un metal, generalmente
son eficaces dosificaciones de 0,001 a 5,0 mmoles de ión metálico de
formación de imágenes quelado por kilogramo de peso corporal del
paciente para conseguir aumentos de contraste adecuados. Para la
mayoría de las aplicaciones por IRM, las dosificaciones preferidas
de ión metálico de formación de imágenes estarán en el intervalo de
0,02 a 1,2 mmoles/kg de peso corporal, mientras que para
aplicaciones por rayos X, generalmente son eficaces dosificaciones
de 0,05 a 2,0 mmoles/kg para conseguir la atenuación de rayos X.
Para la mayoría de las aplicaciones por rayos X, las dosificaciones
preferidas son de 0,1 a 1,2 mmoles del lantánido o compuesto de
metal pesado/kg de peso corporal. Cuando el indicador es un
radionúclido, normalmente serán suficientes dosificaciones de 0,01
a 100 mCi, preferiblemente de 0,1 a 50 mCi por 70 kg de peso
corporal. Cuando el indicador es una partícula superparamagnética,
la dosificación normalmente será de 0,5 a 30 mg de Fe/kg de peso
corporal. Cuando el indicador es un gas o un generador de gas, por
ejemplo en una microbola, la dosificación normalmente será de 0,05
a 100 \mul de gas por 70 kg de peso corporal.
La dosificación de los compuestos de la invención
para uso terapéutico dependerá de la afección a tratar, pero en
general será del orden de 1 pmol/kg a 1 mmol/kg de peso
corporal.
Los compuestos de la presente invención pueden
formularse con ácidos farmacéuticos o veterinarios convencionales,
por ejemplo emulsionantes, ésteres de ácidos grasos, agentes
gelificantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes para ajustar
la osmolalidad, tampones, agentes para ajustar el pH, etc., y pueden
estar en una forma adecuada para administración parenteral o
entérica, por ejemplo, inyección, infusión o administración
directamente en una cavidad corporal que tiene un conducto de
salida externo, por ejemplo, el tracto gastrointestinal, la vejiga
o el útero. De esta manera, los compuestos de la presente invención
pueden estar en formas de administración farmacéutica
convencionales tales comprimidos, cápsulas, polvos, soluciones,
suspensiones, dispersiones, jarabes, supositorios,
etc.
etc.
Sin embargo, generalmente se preferirán
soluciones, suspensiones y dispersiones en medios de vehículo
fisiológicamente aceptable, por ejemplo, agua para inyecciones.
Por lo tanto, los compuestos de acuerdo con la
invención pueden formularse para la administración usando vehículos
o excipientes fisiológicamente aceptables de una manera totalmente
incluida en la experiencia de la técnica. Por ejemplo, los
compuestos, opcionalmente con la adición de excipientes
farmacéuticamente aceptables, pueden suspenderse o disolverse en un
medio acuoso, esterilizándose después la suspensión o solución
resultante.
Para formar imágenes de algunas partes del
cuerpo, el modo más preferido para administrar el agente de
contraste es la administración parenteral, por ejemplo intravenosa.
Las formas administrables por vía parenteral, por ejemplo,
soluciones intravenosas, deben ser estériles y carecer de agentes
fisiológicamente inaceptables, y deben tener baja osmolalidad para
minimizar la irritación u otros efectos adversos tras la
administración, y de esta manera el medio de contraste
preferiblemente debe ser isotónico o ligeramente hipertónico. Los
vehículos adecuados incluyen vehículos acuosos usados habitualmente
para administrar soluciones parenterales tales como inyección de
cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de dextrosa,
inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer lactada
y otras soluciones tales como las descritas en Remington’s
Pharmaceutical Sciences, 15ª ed., Easton: Mack Publishing Co.,
págs. 1405-1412 y 1461-1487 (1975) y
The National Formulary XIV, 14ª ed. Washington: American
Pharmaceutical Association (1975). Las soluciones pueden contener
conservantes, agentes antimicrobianos, tampones y antioxidantes
usados convencionalmente para soluciones parenterales, excipientes
y otros aditivos que son compatibles con los quelatos y que no
interferirán con la fabricación, almacenamiento o uso de
productos.
Los agentes de fórmula I pueden ser
terapéuticamente eficaces en el tratamiento de estados de enfermedad
así como detectables en la formación de imágenes in vivo. De
esta manera, por ejemplo, el vector en los restos indicadores puede
tener eficacia terapéutica, por ejemplo, gracias al efecto
radioterapéutico de un indicador radionúclido, la eficacia en
terapia fotodinámica de un indicador cromóforo (o fluoróforo) o el
efecto quimioterapéutico del resto del
vector.
vector.
El uso de los agentes de fórmula I en la
fabricación de composiciones terapéuticas y en los métodos del
tratamiento terapéutico o profiláctico del cuerpo humano o del
cuerpo de un animal no humano de esta manera se considera que
representan otros aspectos de la invención.
En una realización, el agente de contraste de la
invención convenientemente comprende un material que contiene gas o
que genera gas, preferiblemente en suspensión en un material de
vehículo acuoso y conjugado con uno o más vectores de los que al
menos uno es un vector V como se ha definido anteriormente, por
ejemplo, un antagonista del receptor de AII tal como CV11974 o
TCV-116. El gas puede tomar la forma de
microburbujas estabilizadas con una monocapa de un tensioactivo que
forma películas, o estabilizadas por un material de matriz distinto
de un tensioactivo. Los vectores pueden acoplarse, por ejemplo, a
dicho tensioactivo o matriz y pueden ser bioactivos o no
bioactivos. Los vectores pueden tener diferentes especificidades de
dirección y en una realización preferida son tales que interaccionan
con sus receptores pero no se unen de forma fija a las vesículas que
contienen gas.
La presente invención se ilustrará adicionalmente
por medio de los siguientes ejemplos no limitantes. A menos que se
indique otra cosa, todos los porcentajes proporcionados están en
peso.
Compuesto
1
Se disuelve
dietilentriamina-dianhídrido del ácido pancreático
(53,8 g, 137 mmol) en DMF seca
(N,N-dimetil-formamida) y se añade
ácido
4'-[3-(3-aminopropil)-5-butil-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico
(preparado de acuerdo con el documento WO 91/17148, 5 g, 13,7 mmol)
disuelto en DMF seca. La mezcla de reacción se agita a temperatura
elevada en atmósfera de nitrógeno. La reacción se sigue por TLC. El
disolvente se evapora rotatoriamente y la sustancia se purifica por
cromatografía.
A una solución del compuesto 1 (2 g, 2,7 mmol) en
agua se le añade óxido de gadolinio Gd_{2}O_{3} (0,5 g, 1,4
mmol) y la mezcla se calienta a 95ºC. Después de la filtración la
solución se evapora y se seca al vacío a 50ºC.
El Compuesto 1 del Ejemplo 1 (1 mg) se disuelve
en NaOH 0,1 N, SnCl_{2}2H_{2}O (100 \mug) disuelto en HCl
0,05 N y se añade una solución de 10-100 mCi de
Tc99m en la forma de pertecnetato sódico en solución salina. El pH
de la solución se ajusta a pH 7-8 por adición de
tampón fosfato 0,5 M (pH 5) después de menos de un minuto. La
reacción se sigue por TLC y la sustancia se purifica por
cromatografía.
Una solución acuosa de ^{131}I_{2} (2
equivalentes) y perclorato sódico (1 equivalente) se añade a una
solución acuosa de ácido
4'-[3,5-dibutil-1H-1,2,4-trizol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico
(preparado de acuerdo con el documento WO 91/17148, (1
equivalente). El disolvente se evapora rotatoriamente y la sustancia
se purifica por cromatografía.
Compuesto
2
Se disuelve anhídrido succínico (2,7 g, 27,4
mmol) en DMF seca y se añade ácido
4'-[3-(3-aminopropil)-5-butil-1H-1,2,4-trizol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico
(preparado de acuerdo con el documento WO 91/17148, 5 g, 13,7 mmol)
disuelto en DMF seca. La mezcla de reacción se agita a temperatura
elevada en atmósfera de nitrógeno. La reacción se sigue por TLC. El
disolvente se evapora rotatoriamente y la sustancia se purifica por
cromatografía.
Compuesto
3
Se añade DSPE (diestearoilfosfatidiletanolamina)
(0,5 g, 0,7 mmol) a una solución del Compuesto 2 (0,3 g, 0,7 mmol)
y DCC (N,N'-diciclohexilcarbodiimida) en DMF seca.
La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente y la reacción
se sigue por TLC. La dispersión se deja durante una noche a +4ºC. La
dispersión se filtra y el disolvente se evapora rotatoriamente
antes de que la sustancia se purifique por cromatografía.
A fosfatidilserina (5 mg) se le añade
propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se
calienta a no más de 90ºC durante 5 minutos y después se enfría a
temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un
vial (1 ml) y se añade el compuesto 3 (0,1-1,0 mb).
El vial se pone sobre una mesa de rodillos durante algunas horas.
El espacio de cabeza del vial se lava abundantemente con
perfluorobutano. El vial se agita en un mezclador con tapón durante
45 segundos, posteriormente la muestra se pone sobre una mesa de
rodillos. Después de la centrifugación el infranadante se cambia
por agua. El procedimiento de lavado se repite 2-3
veces.
Una solución de dicloroacetonitrilo (55,0 g, 0,50
mol) y acetona cianohidrina (46,8 g, 0,55 mol) en acetonitrilo (200
ml) y éter dietílico (50 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadió cianuro
potásico (10,65 g, 10,0 mmol), y la mezcla se agitó en atmósfera de
nitrógeno durante 19 horas a 0ºC. La solución se evaporó, el residuo
pardo se disolvió en éter dietílico (125 ml), se trató con carbono
activo, se filtró y se evaporó. El residuo se mezcló con éter
dietílico (30 ml) y hexanos (30 ml). El compuesto del título,
Compuesto 4, se aisló por filtración.
Rendimiento 21,2 g (cristales de color amarillo
claro)
El filtrado se evaporó, el residuo se lavó con
éter/hexanos (1:1, 20 ml). La mayor parte del compuesto del título
se aisló por filtración.
Rendimiento total: 34,5 g (50%) p.f.
56-58ºC.
RMN confirmó la estructura del compuesto del
título (\sim10% de material de partida cianohidrina como
impureza).
Una solución de
2-amino-3,3-dicloropropenonitrilo
(15,0 g, 0,11 mol) y 2-nitrobenzaldehído (15,1 g,
0,10 mmol) en tolueno (200 ml) se calentó a reflujo durante 23
horas. La mezcla se evaporó, se añadió metanol (100 ml) y la mezcla
se dejó reposar durante una noche. Después de la filtración, el
compuesto del título se aisló en forma de un sólido
pardo-amarillo.
Rendimiento 15,0 g, p.f.
171-174ºC
Rf = 0,9 (sílice, acetato de etilo:hexano =
1:2)
La evaporación del agua madre dio 13,7 g de un
residuo pardo. Se añadió metanol (25 ml) y la mezcla se dejó
reposar durante 2 días. La filtración dejó 6,6 g de material pardo
oscuro (compuesto del título - Compuesto 5).
Rendimiento total: 21,6 g (80%)
RMN confirmó la estructura del compuesto del
título.
Se burbujeó HCl gas a través de una solución de
2-(4-nitrobenciliden)amino-3,3-dicloro-propenonitrilo
(40,0 g, 0,148 mol) en dioxano (500 ml) a temperatura ambiente. La
mezcla se agitó durante 23 horas a 50ºC. Se burbujeó HCl gas a
través seguido de agitación durante 24 horas a 50ºC. La mezcla se
agitó durante 8 días más a 50ºC con adición de gas HCl cada 24
horas, seguido de agitación a 0ºC y se filtró. El residuo se mezcló
con etanol (96%, 200 ml) y el compuesto del título, Compuesto 6, se
aisló por filtración. Rendimiento: 23,1 g (62%). RMN confirmó la
estructura del compuesto del título.
Una mezcla de
4-cloro-5-formil-2-(4-nitrofenil)-imidazol
819,7 g, 78,3 mmol), bromuro de bencilo (14,5 g, 85,0 mmol) en DMF
(150 ml) se calentó a 110ºC durante 1,5 horas. La mezcla se evaporó
y el residuo se vertió en agua fría y se dejó reposar durante una
noche en la nevera. El residuo alquitranado se pulverizó y se
filtró. Rendimiento de compuesto del título bruto: 33,4 g. El
producto se recristalizó en etanol (96%, 350 m). Rendimiento: 14,0
g. RMN confirmó la estructura del compuesto del título, Compuesto
7.
Se añadió borohidruro sódico (1,1 g, 29 mmol) en
tres porciones a una mezcla agitada de
1-bencil-4-cloro-5-formil-2-(4-nitrofenil)imidazol
(54,2 g, 88 mmol) en metanol (250 ml) a temperatura ambiente.
Después de dos horas, se añadió más borohidruro sódico (0,51 g, 15
mmol), la mezcla se agitó durante 30 minutos y el metanol se
evaporó. El residuo se mezcló con agua (250 ml) y se extrajo con
cloruro de metileno (200 ml, 3x50 ml). Las soluciones orgánicas
combinadas se lavaron con agua (2x50 ml) y se secaron
(Na_{2}SO_{4}) durante una noche.
La mezcla se filtró y se evaporó dejando un
residuo de 20,9 g. El compuesto del título, Compuesto 8, se purificó
por cromatografía ultrarrápida (columna 150x65 mm de gel de sílice
60 eluida con acetato de etilo/hexanos (1:1)). Las fracciones que
contienen el compuesto del título se evaporaron.
Rendimiento: 12,75 (42%)
Rf = 0,4 (sílice, acetato de etilo/hexanos
(1:1)).
Se añadió gota a gota cloruro de tionilo (0,90
ml, 1,48 g, 12,4 mmol) a una suspensión agitada de
1-bencil-4-cloro-5-(hidroximetil)-2-(4-nitrofenil)imidazol
(18,5 g, 5,4 mmol) en cloroformo (15 ml) a temperatura ambiente. La
solución parda se agitó durante 2,5 horas después se evaporó hasta
sequedad. Se añadió tolueno (12 ml) al residuo y se evaporó hasta
sequedad. El residuo se disolvió en cloroformo (20 ml) y se usó en
la siguiente etapa para la introducción del grupo funcional
ciano.
Una solución de cianuro sódico (1,60 g, 32,7
mmol) y bromuro de tetrabutil amonio (0,2 g) en agua helada (10 ml)
se añadió gota a gota a una solución agitada vigorosamente de
1-bencil-4-cloro-5-(clorometil)-2-(4-nitrofenil)-imidazol
(5,4 mmol) en cloroformo a 0ºC. La mezcla se agitó a 0ºC durante 2
horas y después se dejó calentar a temperatura ambiente, se diluyó
con agua (10 ml), la capa orgánica se lavó con agua (10 ml). Las
capas acuosas combinadas se extrajeron con cloroformo (2x2 ml). Las
soluciones orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}), se
filtraron y se evaporaron produciendo 4,3 g. El producto se purificó
por cromatografía ultrarrápida (columna 170x25 mm, gel de sílice 60
eluido con acetato de etilo/hexanos 1:1). Rendimiento: 2,1 g.
Rf = 0,7 (sílice, acetato de etilo/hexanos
1:1).
RMN confirmó la estructura del compuesto del
título, Compuesto 10
Una mezcla agitada de
1-bencil-4-cloro-2-(4-nitrofenil)-5-imidazolil
acetonitrilo (2,0 g, 5,4 mmol) en HCl 6 M (20 ml) se calentó a
reflujo durante 4 horas. La mezcla se diluyó con agua (100 ml). Un
aceite amarillo precipitó, que solidificó tras enfriarse a
temperatura ambiente. La filtración dio 2,2 g de material sólido que
se recristalizó en etanol al 96% (15 ml) y agua (10 ml).
La filtración dio 2,24 g de residuo húmedo. RMN
confirmó la estructura del compuesto del título, Compuesto 11. El
producto se usó en la siguiente etapa.
Una mezcla de ácido
1-bencil-2-(4-nitrofenil)-5-imidazol-acético
(2,1 g, 5,0 mmol), paladio al 10% sobre carbono (0,10 g), HCl 12 M
(3,0 ml), etanol al 96% (50 ml) y agua (50 ml) se hidrogenó a 55 psi
(0,38 MPa) durante 1,5 horas en un aparato agitador de
hidrogenación Parr. La mezcla se filtró a través de un lecho de
celite y después a través de un papel de filtro estriado. La
evaporación dejó el compuesto del título, Compuesto 12, como 1,0 g
de un sólido
naranja.
naranja.
Rf = 0,1 (sílice, acetato de etilo/hexanos
1:1).
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto del título, Compuesto 13, se preparó
como se describe en el Esquema mostrado anteriormente de acuerdo con
la descripción en Nuclear Medicine Communications 16, (1995)
942-957.
El Compuesto 12 del Ejemplo 5 se marcó con
^{131}I usando el método de Cloramina T como se describe en
Radio-isotopes in Biology. A Practical Approach.
(1990), y en Nature 194, (1962) 495.
Rendimiento de marcado: 56%.
Una mezcla de
1-bencil-4-cloro-5-(hidroximetil)-2-(4-nitrofenil)imidazol
(1,0 g, 2,8 mmol, Compuesto 8 del Ejemplo 5), paladio al 10% sobre
carbono (0,10 g), HCl 12 M (1,0 ml), etanol al 96% (50 ml) y agua
(50 ml) se hidrogenó a 55 psi (0,38 MPa) durante 1,5 horas en un
aparato agitador de hidrogenación Parr. La mezcla se filtró a
través de un lecho de celite y después a través de un papel de
filtro estriado. La evaporación dejó 1,5 g de un aceite ámbar.
Rf = 0,2 (sílice, acetato de etilo/hexanos
1:1).
El compuesto del título, Compuesto 15, se preparó
como se describe en el Ejemplo 5 Compuesto 13. Rendimiento de
marcado: 89%.
Se disolvió Losartán (100 mg/2,22 mmol) en 3 ml
de acetonitrilo. Se añadió bromuro de bencilo (38 mg), y la mezcla
de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El
disolvente se evaporó al vacío, y el residuo se redisolvió en
cloroformo, se filtró y se purificó por cromatografía en columna. El
producto se identificó por espectrometría de masas MALDI y se usó
sin purificación adicional.
El compuesto se marcó usando una técnica de
marcado por intercambio como se describe en Radioisotopes in
Biology. A practical Approach. (1990) y en Nature 194, (1962)
495. Rendimiento de marcado: 98%.
Se disolvió Fmoc-Gli (300 mg/l
mmol) en 10 ml de THF. Se añadió DCC (110 mg/0,55 mmol) disuelto en
5 ml de THF y la mezcla de reacción se agitó durante una noche. Se
retiró DCC por filtración y el disolvente se retiró al vacío. TLC
mostró una mancha UV+, y la estructura se confirmó por
espectrometría de masas MALDI.
El producto bruto se disolvió en 10 ml de THF y
se añadieron 100 mg de Losartán. Se continuó agitando durante una
noche a temperatura ambiente. TLC mostró la conversión completa del
material de partida. El disolvente se retiró al vacío. El
producto bruto se disolvió en cloroformo y se purificó por
cromatografía en columna. TLC mostró una mancha UV+ y la estructura
se confirmó por espectrometría de masas MALDI.
Se disolvieron 100 mg de
FmocGlicil-Losartán (Compuesto 18) en 5 ml de
piperidina al 10%/DMF y se agitó durante 30 minutos. TLC mostró la
conversión completa del material de partida UV+ en una nueva mancha
UV+, Ninhidrina+. El disolvente se evaporó al vacío. La
estructura se confirmó por espectrometría de masas MALDI y el
producto bruto se usó sin purificación adicional.
El compuesto del título, Compuesto 20, se preparó
como se describe en el Ejemplo 5, Compuesto 13.
Rendimiento de marcado: 80%
Este ejemplo se refiere a la preparación de
microburbujas dirigidas a ultrasonidos en las que se usa
estreptavidina como enlazador entre el indicador o indicadores
biotinilados y el vector o vectores.
A una solución de clorhidrato de
colesterol-\beta-alanina (15 mg,
0,03 mmol) en 3 ml de cloroformo/metanol húmedo (2,6:1), se le
añadió trietilamina (42 ml, 0,30 mmol). La mezcla se agitó durante
10 minutos a temperatura ambiente y una solución de
biotin-PEG_{3400}-NHS (100 mg,
0,03 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) se añadió gota a
gota. Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas, la
mezcla se evaporó hasta sequedad y el residuo se purificó por
cromatografía ultrarrápida para dar cristales blancos, rendimiento,
102 mg (89%). La estructura se verificó por MALDI-MS
y RMN.
El péptido se sintetizó en un sintetizador
automático de péptidos ABI 433A empezando con
Fmoc-Trp(Boc)-resina Wang
(Novabiochem) en una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de
aminoácido de 1 mmol. Todos los aminoácidos se preactivaron usando
HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de
la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó
en TFA que contenía anisol al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas
dando un rendimiento de producto bruto de 75 mg. La purificación por
HPLC preparativa (columna Vydac 218TP1022) de una alícuota de 20 mg
de material bruto se realizó usando un gradiente del 30 al 80% de B
durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al
0,1%/acetonitrilo) y un caudal de 9 ml/min. Después de la
liofilización de las fracciones puras, se obtuvieron 2 mg de
material puro (HPLC Analítica; Gradiente, 30-80% de
B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,1%/agua: columna
- Vydac 218TP54: Detección - UV 214 nm - tiempo de retención del
producto = 12,6 minutos).
La caracterización adicional del producto se
realizó usando espectrometría de masas MALDI; esperado, M+H a 1077,
encontrado, 1077.
Este péptido se sintetizó y se purificó usando
protocolos similares a los descritos en la sección b) anterior. El
producto puro se caracterizó por HPLC y MALDI MS.
DSPS (Avanti, 4,5 mg) y
biotin-PEG_{3400}-\beta-Alanina
colesterol de la sección a) (0,5 mg) se pesaron en un vial y se
añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol
al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (los viales
se agitaron durante el calentamiento).
La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el
espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano.
El vial se agitó en un mezclador con tapón durante 45 segundos y las
microburbujas se hicieron rodar durante una noche. La suspensión de
microburbujas se lavó varias veces con agua desionizada y se analizó
mediante un contador Coulter y atenuación acústica.
A la preparación de microburburjas de d) se le
añadió estreptavidina conjugada con fluoresceína (0,2 mg) disuelta
en PBS (1 ml). Las burbujas se pusieron en una mesa de rodillos
durante 3 horas a temperatura ambiente. Después del lavado
extensivo con agua y el análisis por microscopía de fluorescencia,
las microburbujas se incubaron en 1 ml de PBS que contenía el
péptido biotinil-Endotelina-1 (0,5
mg) y péptido
biotinil-Fibrina-anti-polimerant
(0,5 mg) de la secciones b) y c) respectivamente durante 2 horas.
Se realizó el lavado extensivo de las microburbujas para retirar el
péptido no conjugado.
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador
automático de péptidos ABI 433A empezando con
Fmoc-Gly-resina Wang (Novabiochem)
en una escala de 0,01 mmol usando cartuchos de aminoácidos de 1
mmol. Todos los aminoácidos y ácido palmítico se preactivaron
usando HBTU antes del acoplamiento.
La retirada simultánea del péptido de la resina y
de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en fenol
al 5% que contenía TFA, EDT al 5%, anisol al 5% y H_{2}O al 5%
durante 2 horas dando un producto bruto de 150 mg. La purificación
por HPLC preparativa (columna Vydac 218TP1022) de una alícuota de 40
mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 70 al 100%
de B durante 30 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH, A = TFA
al 0,1%/agua: columna - Vydac 218TP54: Detección - UV 260 y
fluorescencia, Ex280, Em 350 - tiempo de retención del producto =
22 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó
usando espectrometría de masas MALDI; esperado, M+H a 1478,
encontrado, 1471.
DSPS (Avanti, 4,5 mg) y lipopéptido de a) (0,5
mg) se pesaron cada uno en 2 viales y se añadieron 0,8 ml de una
solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% a cada vial. La
mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (los viales se agitaron
durante el calentamiento). Las muestras se enfriaron a temperatura
ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas
perfluorobutano. Los viales se agitaron en un mezclador con tapa
durante 45 segundos y las microburbujas formadas se hicieron rodar
durante una noche. Las microburbujas se lavaron varias veces con
aguas desionizada y se analizaron mediante el contador Coulter y
atenuación acústi-
ca.
ca.
\newpage
Se usó el análisis espectral de masas MALDI para
confirmar la incorporación en microburbujas DSPS.
La preparación de microburbujas de b) anterior se
trató de una manera análoga a la descrita en el Ejemplo 10, sección
e).
Claims (7)
1. Una composición de materia de fórmula
I
(I)V - L -
R
en la
que
V es un grupo orgánico que tiene afinidad de
unión por un sitio receptor de angiotensina II y es
[Losartán], el resto de fórmula II,
en la que R_{1} y R_{2} son
grupos carboxi o grupos alquilo C_{1-6}
opcionalmente sustituidos con grupos oxa, oxo, fenilo, amino,
carboxilo o hidroxi o R_{1} puede representar adicionalmente un
grupo oxo,
y
R_{3} y R_{4} son grupos metil bifenil
carboxilo o metil bifenil tetrazol o grupos alquilo
C_{1-6} opcionalmente sustituidos con grupos oxa,
oxo, fenilo, amino, carboxilo o hidroxi, estando presente R_{4}
solo cuando R_{1} es oxo, preferiblemente con uno de R_{3} y
R_{4} representando un grupo que contiene bifenilo y con uno de
los grupos R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} representando un
grupo alquilo sustituido con grupos oxa, oxo, fenilo, amino,
carboxilo o hidroxi,
en la que el doble enlace marcado
con un asterisco está opcionalmente sustituido con un enlace
sencillo; R_{100} es un átomo de hidrógeno, un grupo fenilo
opcionalmente sustituido con al menos un grupo hidroxi o amino, o
un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido
con un grupo hidroxi o unido opcionalmente mediante un oxígeno,
azufre o nitrógeno; R_{400} es un grupo arilmetilo; R_{300} es
un grupo carboximetilo o un grupo alquilo C_{1-6}
opcionalmente sustituido con hidroxi, por ejemplo, un grupo
hidroxi-metilo, y R_{200} es cloro o R_{300} y
R_{200} junto con los carbonos que intervienen forman un anillo
aromático carbocíclico o heterocíclico de 6 miembros opcionalmente
sustituido en un carbono del anillo con un grupo hidroxi, carboxilo,
alquilo C_{1-6} o aciloxi o en un nitrógeno del
anillo con un grupo
acilo,
en la que R_{501} es un grupo
alquilo C_{1-6} opcionalmente fluorado, R_{504}
es un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente
fluorado, R_{502} es un grupo carboxi,
hidroxi-alquilo C_{1-6} o CHO; o
el doble enlace marcado con un asterisco se sustituye con un enlace
sencillo y R_{504} es un grupo =O o =NR_{505}, R_{502} es un
grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente fluorado y
R_{503} es un grupo carboxifenilo; y R_{30}
es
y R_{31} es COOH,
tetrazol-5-ilo,
NH_{2}SO_{2}CF_{3}, SO_{2}NHCO-fenilo,
SO_{2}NHCO-ciclopropilo,
L es un resto enlazador o un enlace, y
R es un esto detectable en la formación de
imágenes in vivo de un cuerpo humano o animal.
2. Una composición de materia de acuerdo
con la reivindicación 1 seleccionado entre:
i) un quelato con Tc de ácido
2-(4-N-(MAG-3)-aminofenil)-1-bencil-4-cloro-imidazol-5-acético;
ii) ácido
2-(4-aminofenil)-1-bencil-4-cloroimidazol-5-acético
marcado con ^{131}I;
iii) un quelato con Tc de
2-(4-N-(MAG-3)-aminofenil)-1-bencil-4-cloro-5-hidroximetilimidazol;
iv) ^{131}I
N-bencil-losartán;
v) un quelato con Tc de
N-(N-MAG-3-Glicil)-Losartán;
vi) un quelato Gd de un conjugado de DTPA y ácido
4'-[3-(3-aminopropil)-5-butil-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico;
vii) un quelato con Tc de un conjugado DTPA del
ácido
4'-[3-(3-aminopropil)-5-butil-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico;
viii) ácido
4'-[3,5-dibutil-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico
marcado con ^{131}I;
ix) una vesícula que lleva un conjugado de ácido
succínico del ácido
4'-[3-(3-aminopropil)-5-butil-1H-1,2,4-triazol-1-il)metil][1,1'-bifenil]-2-carboxílico.
3. Una composición de materia de acuerdo
con la reivindicación 1 caracterizada porque es
^{123}I-Losartán.
4. Una composición de materia de acuerdo
con la reivindicación 1 caracterizada porque es
^{131}I-Losartán.
5. Una composición farmacéutica que
comprende una composición de materia de fórmula I como se ha
definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con la
menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. El uso de una composición de materia
de fórmula I como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medio de contraste
para usar en un método de diagnóstico que implica la administración
de dicho medio de contraste a un sujeto animado y la generación de
una imagen de al menos parte de dicho sujeto.
7. Un proceso para la preparación de una
composición de materia de fórmula I de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho proceso conjugar (i)
un compuesto orgánico que tiene afinidad de unión por el receptor
de angiotensina II con (ii) un compuesto detectable en un
procedimiento de formación de imágenes para diagnóstico o un
compuesto quelante y si fuera necesario grupos quelantes de
metalación en el conjugado resultante con un ión metálico detectable
en un procedimiento de formación de imágenes para diagnóstico.
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