ES2326616T3 - Plasmina acidificada reversiblemente inactivada. - Google Patents

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Shan Jiang
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Abstract

Composición fibrinolítica que comprende una plasmina acidificada, reversiblemente inactiva para su uso como medicamento sin cambiar el pH a un pH fisiológico antes de ponerse en contacto con fluidos corporales, en la que dicha plasmina acidificada, reversiblemente inactiva está sustancialmente libre de un activador de plasminógeno; que comprende además: un tampón de baja capacidad de tamponamiento a una concentración a la que el pH de la composición se eleva hasta un pH neutro mediante la adición de no más de un volumen igual de suero a dicha composición; y opcionalmente, un estabilizador.

Description

Plasmina acidificada reversiblemente inactivada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones útiles en el tratamiento trombolítico. Más particularmente, la presente invención se refiere a composiciones novedosas que comprenden composiciones de serina proteasa acidificada reversiblemente inactivada útiles en el tratamiento de disolución de coágulos, siempre que sea factible la administración dirigida a un trombo.
Antecedentes
El proceso de coagulación sanguínea, como mecanismo de hemostasia o en la generación de un estado patológico que implica trombos, requiere dos rutas de cooperación: 1) tras la activación, desencadenada por la enzima trombina, las plaquetas circulantes se adhieren entre sí acompañadas por la liberación de factores de tipo tromboxano A2 y la posterior formación de un tapón creado a partir de las plaquetas agregadas, y 2) la activación de una cascada de enzimas proteolíticas y cofactores, la mayoría de los cuales son glicoproteínas plasmáticas sintetizadas en el hígado, para producir un trombo. Los trombos están compuestos principalmente por una red de fibrina insoluble, que atrapa las células sanguíneas, las plaquetas y las proteínas plasmáticas circulantes para formar un trombo.
La enfermedad tromboembólica, es decir, el bloqueo patológico de un vaso sanguíneo por un coágulo sanguíneo, es una causa significativa de morbimortalidad. La mayoría de las obstrucciones vasculares que se desarrollan espontáneamente se deben a la formación de coágulos sanguíneos intravasculares o trombos. Los fragmentos pequeños de un coágulo también pueden desprenderse del cuerpo de un coágulo y viajar a través del sistema circulatorio para alojarse en órganos distantes e iniciar la formación de coágulos adicional. El infarto de miocardio, el accidente cerebrovascular oclusivo, la trombosis venosa profunda (TVP) y la enfermedad arterial periférica son consecuencias bien conocidas de los fenómenos tromboembólicos.
Los activadores de plasminógeno son actualmente los agentes preferidos empleados en el tratamiento trombolítico, convirtiendo todos ellos el plasminógeno en plasmina y potenciando la fibrinólisis mediante la ruptura de la matriz de fibrina (Creager M.A. & Dzau V.J., Vascular Diseases of the Extremities, págs. 1398-1406 en Harrison's Principles of Internal Medicine, 14ª ed., Fauci et al, editors, McGraw-Hill Co., Nueva York, 1998;
Los activadores de plasminógeno más ampliamente usados incluyen una forma recombinante de activador de plasminógeno de tipo tisular (APt), urocinasa (UC) y estreptocinasa (EC), así como una nueva generación de activadores de plasminógeno seleccionados para que tengan propiedades de unión a fibrina y farmacocinéticas mejoradas. Sin embargo, todos estos activadores de plasminógeno actúan indirectamente para efectuar la lisis y requieren un suministro adecuado de su sustrato común, el plasminógeno, en el sitio del trombo.
La UC y el APt convierten el plasminógeno en plasmina mediante la escisión del enlace peptídico Arg^{561}-Val^{562}. Las dos cadenas polipeptídicas resultantes de la plasmina permanecen unidas mediante dos puentes disulfuro intercatenarios. La cadena ligera de 25 kDa lleva el centro catalítico y es homóloga a la tripsina y a otras serina proteasas. La cadena pesada (60 kDa) consiste en cinco estructuras kringle de triple bucle con secuencias de aminoácidos sumamente similares. Algunos de estas kringles contienen los denominados sitios de unión a lisina que son responsables de la interacción del plasminógeno y de la plasmina con fibrina, \alpha_{2}-antiplasmina u otras proteínas. Las formas variantes de la plasmina truncada, incluyendo las variantes que carecen de parte de o de todas las regiones kringle de la cadena pesada de la plasmina, se dan a conocer por Wu et al. en la patente estadounidense número 4.774.087. La EC y la estafilocinasa activan el plasminógeno indirectamente mediante la formación de un complejo con el plasminógeno, que posteriormente se comporta como activador de plasminógeno para activar otras moléculas de plasminógeno mediante la escisión del enlace arginil-valina.
La plasmina es una clase mecanística diferente de agente trombolítico que no activa el plasminógeno. La plasmina escinde directamente la fibrina en un trombo, dando como resultado la lisis. Esto evita el requisito de que estén presentes el plasminógeno o los activadores de plasminógeno en un trombo. Muchos coágulos que tienen déficit de plasminógeno se deben a la contracción del trombo desencadenada por las plaquetas y por el factor VIII.
Aunque APt, EC y UC se han empleado clínicamente de manera satisfactoria para reducir una oclusión trombótica, sigue habiendo graves limitaciones con su uso en el tratamiento trombolítico actual. Por ejemplo, dado que la administración sistémica del APt no se dirige específicamente al trombo, puede dar como resultado una hemorragia sistémica significativa. Otras limitaciones asociadas con los activadores de plasminógeno afectan a su utilidad global. En el mejor de los casos, el uso del tratamiento trombolítico actual da como resultado un flujo sanguíneo vascular reestablecido en el plazo de 90 minutos sólo en aproximadamente el 50% de los pacientes, mientras que se produce la reoclusión coronaria aguda en aproximadamente el 10% de los pacientes. La recanulación coronaria requiere como promedio 45 minutos o más y se produce hemorragia intracerebral en del 0,3% al 0,7% de los pacientes. La mortalidad residual todavía es de aproximadamente el 50% del nivel de mortalidad en ausencia de tratamiento contra la trombólisis.
\newpage
Un enfoque diferente que evita muchos de los problemas asociados con la administración sistémica de un activador de plasminógeno es generar plasmina en el sitio del trombo o administrar directamente la plasmina o bien dentro de o bien proximalmente al trombo. Reich et al. en la patente estadounidense número 5.288.489 dan a conocer un tratamiento fibrinolítico que incluye la administración parenteral de plasmina en el organismo de un paciente. La concentración y el tiempo del tratamiento fueron suficientes para permitir que la plasmina activa lograra una concentración en el sitio de un trombo intravascular que es suficiente para lisar el trombo o para reducir los niveles circulantes de fibrinógeno. Reich et al. requieren la generación de la plasmina a partir de plasminógeno inmediatamente antes de su introducción en el organismo.
En contraposición, Jenson en la patente estadounidense número 3.950.513 da a conocer una preparación de plasmina porcina que se afirma que se estabiliza a pH bajo. Sin embargo, una disolución de plasmina de este tipo debe neutralizarse antes de la administración sistémica a seres humanos para el tratamiento trombolítico.
Yago et al. en la patente estadounidense número 5.879.923 dan a conocer composiciones de plasmina empleadas como reactivo de diagnóstico. Las composiciones de Yago et al. consisten en bajas concentraciones de plasmina a un pH neutro y un componente adicional que puede ser 1) un oligopéptido que consiste en al menos dos aminoácidos o 2) al menos dos aminoácidos o 3) un único aminoácido y un alcohol polihidroxilado, y los aminoácidos se identifican específicamente.
Numerosos problemas técnicos, tales como la dificultad de preparar plasmina libre de activadores de plasminógeno contaminantes, han evitado el uso clínico de la plasmina. Las preparaciones de plasmina se contaminaban normalmente de manera amplia por los activadores de plasminógeno estreptocinasa y urocinasa, dando como resultado la atribución de la actividad trombolítica a los activadores de plasminógeno contaminantes más que a la propia plasmina. Los activadores de plasminógeno contaminantes también pueden desencadenar hemorragia sistémica en sitios distintos al de la trombosis seleccionada como objetivo. Un factor que limita el uso clínico de la plasmina es que la plasmina, como serina proteasa con amplia especificidad, es sumamente propensa a la autodegradación y la pérdida de actividad a pH fisiológico cuando se prepara como una disolución altamente purificada y altamente concentrada. Esto origina grandes retos para la producción de plasmina de alta calidad, para la formulación estable de esta proteasa activa durante periodos prolongados de almacenamiento antes de su uso, y para la administración segura y localizada de plasmina a pacientes humanos que padecen la formación de trombos oclusivos.
Así, existe una necesidad de una composición terapéutica que comprenda una serina proteasa estabilizada que pueda escindir fibrina y un vehículo farmacéuticamente aceptable con un intervalo de pH suficientemente bajo para inactivar reversiblemente la serina proteasa, aunque suficientemente alto para limitar la hidrólisis ácida de los enlaces peptídicos dentro de la serina proteasa. Además, existe una necesidad de una composición terapéutica de este tipo que tenga una baja capacidad tampón para mantener un pH bajo durante el almacenamiento, permitiendo todavía que la plasmina vuelva rápidamente a su forma activa al pH en el entorno local del coágulo.
También existe una necesidad de una composición terapéutica que comprenda una serina proteasa acidificada reversiblemente inactivada estabilizada mediante al menos un agente estabilizante farmacéuticamente aceptable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Estos y otros objetivos y ventajas de la invención se volverán completamente evidentes a partir de la descripción y las reivindicaciones que siguen o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención.
Sumario de la invención
Esta invención supera las desventajas de la técnica anterior proporcionando una composición fibrinolítica que comprende una plasmina acidificada, reversiblemente inactiva para su uso como medicamento sin cambiar el pH a un pH fisiológico antes de ponerse en contacto con fluidos corporales que pueden administrarse de manera terapéutica directamente a o proximal a un sitio de una oclusión trombótica. Además, la composición fibrinolítica de la presente invención tiene un término de caducidad sustancialmente a largo plazo con respecto a la técnica anterior.
En un aspecto, la presente solicitud da a conocer una composición fibrinolítica que comprende una serina proteasa acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de un activador de plasminógeno, un tampón de baja capacidad de tamponamiento, y opcionalmente, un agente estabilizante. Tales serina proteasas incluyen tripsina, quimiotripsina, elastasa pancreática II, catepsina G, antígeno específico de la próstata, elastasa leucocitaria, quimasa, triptasa, acrosina, calicreína tisular humana y plasmina. La plasmina incluye Glu-plasmina o Lys-plasmina, derivados y variantes modificadas o truncadas de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, midi-plasmina, mini-plasmina o micro-plasmina.
En otro aspecto de la invención, la composición fibrinolítica de la presente invención comprende una plasmina acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de un activador de plasminógeno, un tampón de baja capacidad de tamponamiento, y opcionalmente, un agente estabilizante. La plasmina incluye Glu-plasmina o Lys-plasmina, derivados y variantes modificadas o truncadas de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, midi-plasmina, mini-plasmina o micro-plasmina.
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Los tampones empleados en la presente invención incluyen tampones de baja capacidad de tamponamiento tales que están presentes en la composición a una concentración a la que el pH de la composición se eleva rápidamente hasta un pH neutro mediante la adición de no más de aproximadamente un volumen igual de suero a la composición. En un aspecto de la invención, el tampón comprende al menos un ácido farmacéuticamente aceptable, tal como un aminoácido, un derivado del al menos un aminoácido, un dipéptido, un oligopéptido que incluye el al menos un aminoácido y combinaciones de los mismos. Los aminoácidos que pueden emplearse como tampón incluyen serina, treonina, metionina, glutamina; glicina, isoleucina, valina, aspartato y alanina. Pueden emplearse otros ácidos de baja capacidad de tamponamiento e incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido benzoico, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos. Los aminoácidos y los otros ácidos de baja capacidad de tamponamiento también pueden combinarse en cualquier combinación deseada.
Los agentes estabilizantes que pueden emplearse en la presente invención incluyen hidratos de carbono, sales, glucosamina, tiamina, niacinamida, citrulina farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.
Así, ahora se proporciona una única composición fibrinolítica que trata satisfactoriamente las deficiencias de las composiciones existentes y proporciona distintas ventajas con respecto a tales composiciones. Objetos, características y ventajas adicionales de la invención se harán más evidentes con la revisión de la descripción detallada expuesta a continuación cuando se toma conjuntamente con las figuras de los dibujos adjuntos, que se describen brevemente tal como sigue.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra la dependencia del pH de la actividad de la plasmina tal como se mide con el sustrato cromogénico S2251.
La figura 2 ilustra la estabilidad de la plasmina en solución salina acidificada (pH 3,7) tal como se mide mediante un ensayo caseinolítico.
La figura 3 ilustra que la estabilidad del pH de la plasmina no depende del agente de tamponamiento ni de la concentración del agente de tamponamiento.
La figura 4 ilustra la eficacia de la plasmina o del APt más plasminógeno en la trombólisis.
La figura 5 ilustra la estabilidad a 37ºC de una plasmina acidificada reversiblemente inactivada a pH de 3,7, con estabilizadores de hidrato de carbono.
La figura 6 ilustra la estabilidad a 37ºC de una plasmina acidificada reversiblemente inactivada a un pH de 3,7 con glucosamina, niacinamida, tiamina o citrulina como un agente estabilizante.
La figura 7 ilustra la degradación progresiva de una composición de plasmina a un pH de 2,2, 3,5 ó 3,7.
La figura 8 ilustra los sitios de escisión generados en la plasmina a pH 2,2 y 3,8.
La figura 9 ilustra la titulación, con suero humano, de disoluciones de plasmina que tienen diversos tampones de baja capacidad de tamponamiento.
La figura 10 compara la potencia trombolítica de la plasmina en solución salina a pH 3,7 con la de la plasmina neutralizada antes de la inyección en el coágulo.
Descripción detallada
Una descripción completa y favorable de la presente invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención se expone más particularmente en el resto de la memoria descriptiva, incluyendo la referencia a los ejemplos. Esta descripción se realiza para el fin de ilustrar los principios generales de la invención y no debe tomarse en el sentido limitativo.
La presente invención trata la necesidad de una composición fibrinolítica que es estable en almacenamiento y puede administrarse terapéuticamente a un paciente que tiene una oclusión trombótica. Por tanto, en un aspecto, la presente invención describe una composición fibrinolítica que comprende una serina proteasa acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de un activador de plasminógeno, un tampón de baja capacidad de tamponamiento, y opcionalmente, un agente estabilizante. Tales serina proteasas incluyen tripsina, quimiotripsina, elastasa pancreática II, catepsina G, antígeno específico de la próstata, elastasa leucocitaria, quimasa, triptasa, acrosina, calicreína tisular humana y plasmina. La plasmina incluye Glu-plasmina o Lys-plasmina, derivados y variantes modificadas o truncadas de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, midi-plasmina, mini-plasmina o micro-plasmina.
La presente invención describe además una composición fibrinolítica que comprende una serina proteasa acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de activador de plasminógeno y un vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable, que comprende además un agente estabilizante farmacéuticamente aceptable.
La composición fibrinolítica de la presente invención comprende una plasmina acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de un activador de plasminógeno, un tampón de baja capacidad de tamponamiento, y opcionalmente, un agente estabilizante. De nuevo, la plasmina incluye Glu-plasmina o Lys-plasmina, derivados y variantes modificadas o truncadas de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, midi-plasmina, mini-plasmina o micro-plasmina.
Los tampones empleados en la presente invención incluyen tampones de baja capacidad de tamponamiento tales que están presentes en la composición a una concentración que permitiría que el pH de la composición cambiara a un pH fisiológico mediante la puesta en contacto con fluidos corporales. En un aspecto de la invención, el tampón comprende al menos un ácido farmacéuticamente aceptable, tal como un aminoácido, un derivado del al menos un aminoácido, un dipéptido, un oligopéptido que incluye el al menos un aminoácido y combinaciones de los mismos. Los aminoácidos que pueden emplearse como tampón incluyen serina, treonina, metionina, glutamina, alanina, glicina, isoleucina, valina, aspartato, alanina y combinaciones de los mismos. Pueden emplearse otros ácidos de baja capacidad de tamponamiento e incluyen ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido benzoico, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos. Los aminoácidos y los otros ácidos de baja capacidad de tamponamiento también pueden combinarse en cualquier combinación deseada.
Los agentes estabilizantes que pueden emplearse en la presente invención incluyen hidratos de carbono, sales, glucosamina, tiamina, niacinamida, citrulina farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos. Los agentes estabilizantes adicionales incluyen, pero sin limitarse a, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, alcoholes polihidroxilados o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, tales agentes estabilizantes incluyen azúcares o alcoholes de azúcar, tales como glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa, trehalosa o combinaciones de los mismos. En la presente invención pueden emplearse sales, tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, o combinaciones de los mismos, como agentes estabilizantes.
Con el uso creciente de catéteres arteriales y venosos en la práctica clínica, la administración local de una plasmina activa en proximidad estrecha a, o realmente dentro de, un trombo ofrece una oportunidad terapéutica atractiva en el tratamiento trombolítico. Siendo una serina proteasa activa, la plasmina es un agente directo de disolución de trombos, a diferencia de los activadores de plasminógeno que requieren la presencia del zimógeno plasminógeno en las cercanías del trombo. El tratamiento trombolítico local dirigido por catéter con plasmina activa puede regularse para lograr una trombólisis total, y la plasmina tiene el potencial de ser un agente trombolítico más seguro porque la dosificación inferior requerida para la administración local puede reducir significativamente las complicaciones de hemorragia asociadas frecuentemente con el tratamiento trombolítico a dosis alta inducidas por activadores de plasminógeno. Además, cualquier posible derrame de plasmina desde las cercanías inmediatas del sitio del trombo se neutralizará rápidamente mediante la \alpha_{2}-antiplasmina circulante.
En el pasado, ha habido varios desafíos técnicos asociados con la purificación de la plasmina, y el almacenamineto, así como con su administración y uso terapéutico. La plasmina es una serina proteasa activa y se somete a autodigestion e inactivación a un pH fisiológico. Desafortunadamente, la degradación de la plasmina es además lo más evidente en el intervalo de pH requerido para la trombólisis in vivo.
La composición fibrinolítica, tal como se incorpora en la presente invención, incluye el mantenimiento de la plasmina en un tampón ácido durante la purificación, así como su formulación en un vehículo acidificado que tiene un tampón de baja capacidad de tamponamiento farmacéuticamente aceptable, proporcionando de ese modo una composición fibrinolítica que contiene plasmina acidificada reversiblemente inactivada sustancialmente libre de activador de plasminógeno. Se contempla que, para que esté dentro del alcance de la presente invención, la composición fibrinolítica sea una composición liofilizada que puede reconstituirse mediante la adición de vehículos farmacéuticamente aceptables tales como, pero sin limitarse a, agua, solución salina fisiológica o cualquier otro disolvente que permita la administración de la composición a un ser humano o animal. Su eficacia en la restauración de la permeabilidad vascular se demostró en ensayos in vitro y en un modelo de trombólisis de la vena yugular de conejo in vivo.
La expresión "reversiblemente inactivada" tal como se usa en el presente documento se refiere a una actividad enzimática que está sustancialmente libre de actividad en un conjunto específico de condiciones pero que revertirá a una forma activa cuando se transfiera a otro conjunto de condiciones.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier vehículo que se tolere fisiológicamente por un receptor humano o animal, incluyendo, pero sin limitarse a, agua, disoluciones salinas, solución salina fisiológica, o cualquier otro líquido o gel en el que puede disolverse o suspenderse un agente fibrinolítico tal como plasmina. El "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede incluir cualquier compuesto farmacéuticamente aceptable que dará una disolución de plasmina que tiene un pH inferior a aproximadamente 4,0 y que tiene una capacidad de tamponamiento baja o cero.
La expresión "pH fisiológico" tal como se usa en el presente documento se refiere a un pH de entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente 7,5, más normalmente entre aproximadamente pH 7,1 y aproximadamente 7,5.
La expresión "fluido corporal" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier fluido corporal incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, suero, plasma, semen y orina.
La expresión "tampón de baja capacidad de tamponamiento del pH" o "tampón de baja capacidad de tamponamiento" tal como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de ácido o base que un tampón puede neutralizar antes de que el pH comience a cambiar en un grado apreciable. Tal como se usa en el presente documento, un tampón de baja capacidad de tamponamiento tendrá un pH significativamente ajustado mediante la adición de un pequeño volumen de un ácido o una base en relación con el volumen de la disolución tampón de baja capacidad de tamponamiento. Por ejemplo, en la presente invención, el tampón está presente en la composición a una concentración que permitiría que el pH de la composición cambiase mediante la puesta en contacto con un fluido corporal. Esta expresión pretende incluir disoluciones acidificadas mediante ácidos fuertes incluyendo, pero sin limitarse a, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido sulfúrico, y que no tienen capacidad de tamponamiento.
El término "trombo" tal como se usa en el presente documento se refiere a un trombo en un vaso sanguíneo o dispositivo en contacto con sangre (por ejemplo endoprótesis o dispositivos de catéter). Un trombo puede comprender fibrina y puede comprender además, pero sin limitarse a, plaquetas, eritrocitos, linfocitos, lípido o cualquier combinación de los mismos. Un "trombo" puede ser, pero sin limitarse a, un trombo anular, trombo esférico, trombo hialino, trombo mural, trombo estratificado o trombo blanco.
La expresión "oclusión trombótica" tal como se usa en el presente documento se refiere a un bloqueo total o parcial de un vaso debido a la formación de un coágulo trombótico, en el que el trombo comprende al menos fibrina. El vaso vascular ocluido puede ser, pero sin limitarse a, una vena, una arteria, una vénula, una arteriola, un capilar, un lecho vascular o el corazón y puede estar dentro de cualquier tejido u órgano vascularizado del cuerpo humano o animal. La oclusión trombótica también puede ser de un catéter u otro implante incluyendo, pero sin limitarse a, vasos protésicos e injertos de origen animal, humano o sintético y bloqueados eficazmente mediante una oclusión que comprende fibrina.
La expresión "dispositivo de catéter" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier catéter o dispositivo de tipo tubo que puede introducirse en el organismo, e incluye, pero sin limitarse a, un catéter arterial, catéter cardiaco, catéter central, catéter venoso central, catéter intravenoso, catéter central insertado de manera periférica, catéter arterial pulmonar o catéter venoso central tunelizado y endoprótesis arteriovenosas.
La expresión "vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable que se ha acidificado hasta un pH inferior a aproximadamente 4,0. El "vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable" puede comprender un tampón de capacidad de tamponamiento baja o cero tal como un ácido carboxílico tal como, pero sin limitarse a, ácido fórmico, ácidos acético, propiónico, butírico, cítrico, succínico, láctico o málico acidificados hasta un pH inferior a aproximadamente 4,0 mediante la adición de un ácido inorgánico; o al menos un aminoácido tal como, pero sin limitarse a, glicina, alanina, valina, isoleucina, treonina o glutamina, metionina, serina, ácido aspártico o al menos un ácido inorgánico tal como, pero sin limitarse a, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico o ácido fosfórico o cualquier combinación de los mismos. Se contempla que, para que esté dentro del alcance de la presente invención, el resto ácido del vehículo farmacéutico sea al menos un tampón, oligopéptico, ion orgánico o inorgánico fisiológicamente tolerados o cualquier combinación de los mismos que mantenga un pH en el vehículo farmacéuticamente aceptable inferior a un valor de aproximadamente 4,0.
La expresión "hidrato de carbono" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sacárido o disacárido farmacéuticamente aceptable tal como, pero sin limitarse a, glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, manosa, alcoholes de azúcar incluyendo, pero sin limitarse a, sorbitol y manitol, y polisacáridos tales como, pero sin limitarse a, dextrinas, dextranos, glucógeno, almidones y celulosas, o cualquier combinación o derivado de los mismos que sean farmacéuticamente aceptables para un ser humano o animal.
La expresión "agente estabilizante" tal como se usa en el presente documento se refiere a al menos un compuesto tal como, pero sin limitarse a, alcoholes polihidroxilados, glicerol, ascorbato, citrulina, niacinamida, glucosamina, tiamina o una sal inorgánica tal como, pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio o cloruro de manganeso o cualquier combinación de los mismos que aumente la estabilidad de una preparación de plasmina.
La expresión "plasmina acidificada reversiblemente inactivada" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier forma catalíticamente activa de la plasmina que puede escindir proteolíticamente la fibrina cuando se encuentra en condiciones fisiológicas, pero se inactiva reversiblemente cuando se coloca a un pH de entre aproximadamente pH 2,5 y aproximadamente 4,0. El término "inactivado" tal como se usa en el presente documento se refiere a una reducción total o sustancial de la actividad enzimática en comparación con la actividad a pH fisiológico. La expresión "plasmina activa" tal como se usa en el presente documento se refiere a una plasmina en condiciones en las que la plasmina puede escindir proteolíticamente la fibrina. El término "plasmina" incluye, pero sin limitarse a, Glu-plasmina, Lys-plasmina, derivados, variantes modificadas o truncadas de las mismas. La expresión "variantes truncadas" incluye, pero sin limitarse a, midi-plasmina, mini-plasmina o la micro-plasmina tal como se da a conocer en la patente estadounidense número 4.774.087.
El término "anticoagulante" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuesto que puede inhibir la formación de un trombo incluyendo, pero sin limitarse a, hirudina, heparina, inhibidores de trombina, inhibidores de plaquetas y cualquier derivado o combinación de los mismos.
La expresión "serina proteasa" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier serina proteasa que puede escindir proteolíticamente la fibrina incluyendo, pero sin limitarse a, plasmina, tripsina, quimotripsina, elastasa pancreática II, catepsina G, antígeno específico de la próstata, elastasa leucocitaria, quimasa, triptasa, acrosina y calicreína tisular humana.
Una limitación del tratamiento trombolítico actual con activadores de plasminógeno es la disponibilidad de plasminógeno alrededor o dentro de un trombo. La administración local de un agente fibrinolítico a un trombo permite ahora que la propia plasmina sea un potente agente terapéutico administrado directamente a un trombo. A diferencia de diversos activadores de plasminógeno que se usan actualmente como trombolíticos, el tratamiento trombolítico localizado directo con plasmina puede intensificarse hasta cualquier nivel que se requiera para lograr la lisis del coágulo. Esto se debe a que la plasmina actúa directamente sobre el polímero de fibrina. Además, la plasmina, cuando se administra directamente en o adyacente a un trombo, permite que se administre una dosis eficaz inferior con una reducción concomitante en la hemorragia sistémica asociada normalmente con el tratamiento trombolítico convencional. El exceso de plasmina también puede inactivarse rápidamente mediante la \alpha2-antiplasmina circulante.
La presente invención contempla que la plasmina puede producirse a partir de plasminógeno usando cualquier método que produzca una plasmina activa purificada sustancialmente libre de activador de plasminógeno. Está dentro del alcance de la presente invención que el plasminógeno sea cualquier plasminógeno recombinante o un plasminógeno truncado tal como, pero sin limitarse a, el mini-plasminógeno y micro-plasminógeno, tal como se da a conocer por Wu et al. en la patente estadounidense número 4.774.087. Por ejemplo, los ejemplos 1 y 2 más adelante dan a conocer un método mediante el cual se preparó plasmina activa a partir de plasminógeno purificado de la fracción de Cohn II + III. La pureza de la plasmina obtenida usando este método fue superior al 95% y la actividad específica estaba en el intervalo de 18-23 CU/mg. Las preparaciones de plasmina estaban sustancialmente libres de urocinasa, o cualquier otro activador de plasminógeno usado para la conversión de plasminógeno en plasmina.
La plasmina de la presente invención se purificó mediante la unión a una columna de afinidad de benzamidina y se recogió y almacenó la plasmina eluida posteriormente en un vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable. Los resultados mostraron que un pH bajo en el intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0 estabilizó enormemente la composición de plasmina, incluso cuando se mantuvo a temperatura ambiente o superior. Sin desear restringirse a ninguna teoría, se cree que a este pH bajo la plasmina tiene actividad serina proteasa mínima que de lo contrario conduciría a la autodegradación, tal como se observa cuando se almacena la plasmina a pH fisiológico de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5.
Cuando la plasmina se administra directamente en un trombo, o próxima al mismo, la plasmina se encuentra con el pH fisiológico del coágulo de aproximadamente 7,4. El vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable alcanza el valor de pH del trombo, con lo cual la plasmina recupera su actividad serina proteasa y comienza a digerir la fibrina. Además, la alta concentración de fibrina dentro del trombo proporciona un sustrato alternativo para que la plasmina minimice la autodegradación y maximice la trombólisis.
El tratamiento fibrinolítico que emplea una preparación de plasmina que hace que la plasmina sea proteolíticamente inactiva hasta que se administre en, o se encuentre inmediatamente adyacente a, un trombo y que está también sustancialmente libre de cualquier activador de plasminógeno reduce la probabilidad de hemorragia sistémica no deseable. La plasmina administrada en exceso se inactiva rápidamente mediante inhibidores séricos circulantes tales como \alpha_{2}-antiplasmina, y están sustancialmente ausentes los activadores de plasminógeno que de lo contrario circularían para inducir la fibrinolisis distal.
La plasmina acidificada reversiblemente inactivada de la presente invención puede almacenarse fácilmente, incluso a 37ºC, en vehículos farmacéuticamente aceptables de baja capacidad de tamponamiento tales como, pero sin limitarse a, acetato de sodio 2 mM. Puede usarse cualquier resto farmacéuticamente aceptable, de manera singular o en combinación que mantiene la composición a un pH en el intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0, especialmente a un pH de aproximadamente 3,1 a aproximadamente pH 3,5. Los compuestos ácidos útiles en la presente invención, o bien individualmente o bien cualquier combinación de los mismos, incluyen pero sin limitarse a ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, un ácido carboxílico tal como, pero sin limitarse a, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido benzoico, serina, treonina, metionina, glutamina, glicina, isoleucina, valina, alanina, ácido aspártico, derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos que mantengan el pH en el vehículo farmacéuticamente aceptable entre aproximadamente pH 2,5 y aproximadamente pH 4,0.
La composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada de la presente invención puede comprender además al menos un agente estabilizante tal como un hidrato de carbono farmacéuticamente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos y alcoholes polihidroxilados. Por ejemplo, los estabilizadores de hidratos de carbono farmacéuticamente aceptables que se contemplan que están dentro del alcance de la presente invención incluyen azúcares tales como, pero sin limitarse a, sacarosa, glucosa, fructosa, lactosa, trehalosa, maltosa y manosa, y alcoholes de azúcar incluyendo, pero sin limitarse a, sorbitol y manitol. Se contemplan dentro del alcance de la presente invención polisacáridos tales como, pero sin limitarse a, dextrinas, dextranos, glucógeno, almidones y celulosas, o cualquier combinación de los mismos farmacéuticamente aceptables para un paciente humano o animal.
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Los agentes estabilizantes contemplados dentro del alcance de la presente invención y útiles para estabilizar la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, glicerol, niacinamida, glucosamina, tiamina, citrulina y sales inorgánicas tales como, pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio o cualquier combinación de los mismos. Otros agentes estabilizantes contemplados dentro del alcance de la presente invención pueden incluir, pero sin limitarse a, compuestos farmacéuticamente aceptables tales como alcohol bencílico o ácido benzoico, para retardar la contaminación microbiana.
Una composición de plasmina según la presente invención puede administrarse mediante cualquier método que administre la plasmina como un bolo o como una infusión prolongada directamente en un trombo, o a un sitio a corta distancia próximo al trombo, con lo cual la composición de plasmina puede encontrar rápidamente el trombo. Minimizando la distancia desde el catéter hasta el trombo, se reduce la exposición de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada a inhibidores séricos. La administración con catéter a un trombo permite precisión para colocar la composición de plasmina, especialmente dentro del trombo.
Así, la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada de la presente invención puede almacenarse sin una pérdida significativa de la actividad de la plasmina reestablecida ajustando el pH de la composición a pH fisiológico y usarse de manera segura como agente trombolítico durante la administración asistida por catéter a un paciente que tiene una oclusión trombótica. La presente invención es una composición de plasmina sustancialmente libre de activadores de plasminógeno que muestra actividad fibrinolítica al menos comparable con el APt y el perfil de seguridad parece al menos similar en este modelo animal de administración trombolítica local. Se contempla que está dentro del alcance de la presente invención que la enzima fibrinolítica acidificada reversiblemente inactivada puede ser, pero sin limitarse a, plasmina, derivados de plasmina tales como formas truncadas de la misma incluyendo, pero sin limitarse a, mini-plasmina y micro-plasmina tal como se da a conocer por Wu et al. en la patente estadounidense número 4.774.087.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no deben interpretarse como limitativos. Aún cuando la invención se ha descrito con un cierto grado de particularidad, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.
Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, en vista de la presente descripción, deberán apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas dadas a conocer y obtener todavía resultados parecidos o similares.
Ejemplos Ejemplo 1 Fuentes de proteínas investigadas
Se purificó plasminógeno a partir de pasta de fracción de Cohn II + III mediante cromatografía de afinidad sobre Lys-Sepharose tal como se describe por Deutsch & Mertz (1970). Así, se resuspendieron 200 g de la pasta en 2 litros de tampón citrato de sodio 0,15 M, pH 7,8. Se incubó la suspensión durante la noche a 37ºC, se centrifugó a 14.000 rpm, se filtró a través de fibra de vidrio y se mezcló con 500 ml de Lys-Sepharose 4B (Pharmacia). Tuvo lugar la unión de plasminógeno a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirió entonces la Lys-Sepharose sobre un filtro de vidrio de 2 litros y se lavó varias veces con citrato de sodio 0,15 M que contenía NaCl 0,3 M hasta que la absorbancia a 280 nm descendió por debajo de 0,05. Se eluyó el plasminógeno unido con tres porciones de 200 ml de ácido \varepsilon-aminocaproico 0,2 M. Se precipitó el plasminógeno eluido con 0,4 g de sulfato de amonio sólido/ml de disolución de plasminógeno. Se almacenó el precipitado de plasminógeno bruto (puro al 80-85%) a 4ºC.
Se purificó adicionalmente urocinasa de bajo peso molecular (LMW-urocinasa) (Abbokinase-Abbott Laboratories, Chicago III.) mediante cromatografía de afinidad sobre benzamidina-Sepharose. Se acopló entonces la urocinasa a Sepharose 4B activada con CNBr mezclando 1,3 mg de LMW-urocinasa en tampón acetato 50 mM, pH 4,5, y diluyendo con 5 ml del tampón de acoplamiento, bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0.
Esta disolución se combinó inmediatamente con 5 ml de Sepharose activada por CNBr previamente hinchada y lavada en HCl 0,1 M. Se produjo el acoplamiento durante 4 horas sobre hielo con agitación. Se bloqueó el exceso del grupo activo CNBr con Tris 0,1 M, pH 8,0. Se usó cada lote de urocinasa-Sepharose 5 veces y se almacenó en glicerol al 50% en agua a 4ºC entre los ciclos. El activador de plasminógeno tisular (activasa) era de Genentech. El fibrinógeno libre de plasminógeno y la \alpha-trombina (3793 U/ml) eran de Enzyme Research, Inc. Se obtuvo la \alpha_{2}-antiplasmina de Athens Research Technologies. La plasmina comercialmente disponible era de Haemotologic Technologies, Inc. El sustrato de plasmina cromogénico S2251 era de Chromogenix. El fibrinógeno humano marcado con ^{125}I (150-250 \muCi/mg) era de Amersham Pharmacia Biotech. Se realizó la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en el aparato Phast System de Pharmacia usando geles en gradiente del 8-25% preparados previamente y tiras de SDS-tampón. La fuente de plasminógeno no está limitada a la purificación a partir de una fuente de plasma. Se contempla que el plasminógeno también puede obtenerse a partir de una fuente transgénica o recombinante.
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Ejemplo 2 Purificación de la plasmina activa (i) Activación de plasminógeno en plasmina usando urocinasa-Sepharose
Se escindió plasminógeno en plasmina produciendo plasmina sin contaminación de la preparación final usando un activador de plasminógeno inmovilizado. La urocinasa escinde el plasminógeno directamente. La activación de plasminógeno mediante la urocinasa no depende de la presencia de fibrina como en el caso del APt, y la urocinasa es una proteína humana. Estos factores y su coste bajo relativo, hacen que la urocinasa sea el activador preferido, aunque esto no impide el uso del APt, estreptocinasa o cualquier otro medio de escisión que produzca una plasmina activa que puede degradar la fibrina. Se centrifugó el precipitado en sulfato de amonio de plasminógeno bruto a 14.000 rpm y se resuspendió en un volumen mínimo usando Tris 40 mM, que contenía lisina 10 mM, NaCl 80 mM a pH 9,0 para lograr la concentración de proteína final de 10-15 mg/ml. Se dializó la disolución de plasminógeno durante la noche frente al mismo tampón para eliminar el sulfato de amonio. Se diluyó la disolución de plasminógeno dializada (10-20 ml) con un volumen igual de glicerol al 100% y se combinó con 5 ml de urocinasa-Sepharose. El uso de glicerol al 50% reduce la autodegradación de la plasmina durante la activación. La plasmina es estable en glicerol al 50% y puede almacenarse en esta disolución a -20ºC durante un periodo prolongado.
Se produjo la activación de plasminógeno a temperatura ambiente durante entre 2 horas y 24 horas dependiendo de la frescura de la urocinasa-Sepharose. Con un lote reciente de urocinasa-Sepharose, la activación pudo completarse en 2 horas. Sin embargo, se deteriora y se vuelve menos eficaz tras varios ciclos, necesitándose el uso de SDS-PAGE en condiciones reductoras para monitorizar el progreso de la activación de plasminógeno. Tras la finalización de la activación, se filtró la disolución de plasmina a partir de la urocinasa-Sepharose con un filtro de vidrio, y se aplicó inmediatamente a benzamidina-Sepharose.
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(ii) Captura de la plasmina sobre benzamidina-Sepharose
Dado que la plasmina es una serina proteasa con especificidad similar a la tripsina, la benzamidina-Sepharose es un absorbente de afinidad que permitió la captura de la plasmina activa. Se aplicó una disolución de plasminógeno en glicerol al 50% a la columna de benzamidina-Sepharose de 50 ml equilibrada con Tris 0,05 M, pH 8,0, que contenía NaCl 0,5 M con una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se ejecutó la columna a 3 ml/min. a 3-7ºC. La parte frontal del pico no unido contenía impurezas de alto peso molecular. El resto del pico no unido está representado por plasminógeno no activado residual y por productos de autodegradación inactivos de la plasmina.
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(iii) Elución de la plasmina unida con tampón de pH bajo
Para proteger a la plasmina de la inactivación en condiciones de pH neutro, se seleccionaron condiciones de elución ácidas. Se eluyó la plasmina unida a benzamidina-Sepharose con tampón glicina 0,2 M, pH 3,0 que contenía NaCl 0,5 M. El pico unido se dividía normalmente en tres grupos, dos picos frontales, B1 y B2, y la masa del material eluido como B3.
El análisis en gel no reductor mostró que los tres grupos contenían plasmina sumamente pura (>95%). Sin embargo, el análisis del gel, además de las cadenas pesadas y ligeras de la plasmina, reveló algunas bandas de bajo peso molecular en un intervalo de 10-15 kDa como resultado de la degradación por escisión interna parcial de la plasmina.
La parte frontal del pico B1 contenía normalmente la mayoría de las impurezas de bajo peso molecular. Los grupos B2 y B3 estaban menos degradados. La parte frontal del pico unido tenía muy poca de la actividad de la plasmina y habitualmente se desechó. La pérdida de actividad en este material puede deberse a la autodegradación durante la cromatografía, porque no está presente glicerol en el material eluido, y el pH de la parte frontal es intermedio entre el pH de los tampones de elución y equilibrado, normalmente en un intervalo de pH de 6-6,5. Se recogió la plasmina eluida, sustancialmente libre de activadores de plasminógeno, en tubos que contenían tampón glicina 2 M, pH 3,0 (el 10% del volumen recogido).
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(iv) Formulación de material eluido en agua acidificada (pH 3,7)
Se dializó la plasmina eluida con agua y se acidificó hasta aproximadamente pH 3,7 con ácido acético glacial. Puede usarse cualquier ácido que proporcione un vehículo acidificado farmacéuticamente aceptable que tenga un tampón de baja capacidad de tamponamiento y que tenga un pH de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 4,0. Por ejemplo, también se contempla dentro del alcance de esta invención el uso de otros ácidos y aminoácidos tales como, pero sin limitarse a, ácidos inorgánicos, ácidos carboxílicos, ácidos alifáticos y aminoácidos incluyendo, pero sin limitarse a, ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido benzoico, serina, treonina, valina, glicina, glutamina, isoleucina, \beta-alanina y derivados de los mismos, o bien individualmente o bien cualquier combinación de los mismos, que mantendrán el pH en el vehículo farmacéuticamente aceptable de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0.
Se midió la actividad específica de plasmina usando un ensayo caseinolítico adaptado tal como se describe por Robbins & Summaria (1970). Se añadió un ml de disolución de caseína al 4% en agua acidificada y un volumen apropiado de tampón fosfato de sodio 67 mM, pH 7,4 a un tubo de ensayo de policarbonato. Se agitaron con vórtex las disoluciones y se incubaron a 37ºC durante 10 minutos. Se añadieron muestras de plasmina o tampón (blanco) a cada tubo a intervalos de 15 segundos, se mezclaron bien y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se detuvo la reacción con la adición de 3 ml de ácido tricloroacético al 15% y se dejó que se formara el precipitado durante 15 minutos. Se centrifugaron los tubos a 3200 rpm durante 20 minutos. Se transfirieron los sobrenadantes a cubetas y se determinó la A_{280} de cada muestra. Se determinó la actividad caseinolítica específica de cada muestra mediante la siguiente fórmula:
1
Se determinó la concentración de plasmina espectrofotométricamente usando el coeficiente de extinción de 1,7 para la disolución al 0,1%.
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Ejemplo 3 Estabilidad de plasmina dependiente del pH
La plasmina muestra una dependencia del pH en forma de campana de su actividad catalítica. Tal como se muestra en la figura 1, la plasmina tiene actividad enzimática máxima a pH 7,5-8,0, y su actividad disminuye rápidamente a pH o bien más alcalinos o bien más ácidos. La plasmina es inactiva en su mayor parte, y de manera reversible, por debajo de pH 4,0, debido a la protonación de la histidina en el centro catalítico, tal como se muestra Robbins & Summaria, (1976) y Castellino & Powell (1981).
La plasmina es muy inestable a un pH fisiológico. Tanto la cadena pesada como las cadenas ligeras de la plasmina se degradaron drásticamente en el plazo de horas a temperatura ambiente y 4ºC. Se formuló la plasmina a 1 mg/ml en fosfato de sodio 0,04 M, pH 7,4, y se incubó a 22ºC o 4ºC durante 6 horas. Durante la incubación, se analizó la integridad de la plasmina cada dos horas mediante análisis de SDS-PAGE reductora. Tanto la cadena pesada como la cadena ligera se degradaron rápidamente en el plazo de horas a 22ºC y 4ºC tal como se muestra en la tabla 1.
TABLA 1 La rápida degradación de la plasmina en disolución de pH neutro a 22ºC y 4ºC
2
Se incubó la plasmina a 1 mg/ml a 37ºC durante 14 días en diferentes condiciones ácidas. Se analizaron los cambios en la cadena pesada y la cadena ligera de la plasmina ejecutando SDS-PAGE reductora. Se formuló la plasmina a 1 mg/ml en fosfato de sodio 0,04 M, pH 7,4 y también se incubó a 4ºC durante seis horas. Durante la incubación, se midió la actividad de la muestra de plasmina cada dos horas mediante ensayo de potencia cromogénica. Se midió cuantitativamente la potencia de plasmina usando el analizador MLA 1600C (Pleasantville, NY). La plasmina hidrolizó el sustrato cromogénico S-2403 (D-piroglutamil-L-fenilalanil-L-lisina-p-nitroanilina clorhidrato o abreviado como piro-Glu-Phe-Lys-pNA) para formar un péptido y el grupo cromofórico p-nitroanilina (pNA). Se midió cinéticamente la tasa de formación de color a 405 nm. La cantidad de sustrato hidrolizado era proporcional a la actividad de plasmina en la muestra. Se generó una curva patrón a partir de la regresión lineal de la tasa de formación de color (DO/min.) frente a la potencia de un patrón de plasmina. Se usó la ecuación lineal junto con la tasa observada para una muestra desconocida para calcular la potencia de desconocidos. Se notificó la potencia de plasmina en unidades de mg/ml.
La integridad de la plasmina se redujo significativamente mediante incubación a un pH fisiológico, tal como se muestra en la tabla 2.
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TABLA 2 La rápida disminución de la actividad de plasmina en una disolución de pH neutro a 4ºC
3
En esta disolución de pH neutro, la actividad de plasmina disminuyó más del 70% tras 6 horas a 4ºC.
La plasmina formulada en agua acidificada a pH 3,7 es estable. Puede mantenerse en esta forma durante meses a temperaturas reducidas sin ninguna perdida de actividad o la aparición de productos de degradación de naturaleza proteolítica o ácida. La figura 2 y los datos de la tabla 3 muestran la estabilidad de plasmina a 4ºC y a temperatura ambiente.
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TABLA 3 Estabilidad de plasmina 1 mg/ml en las siguientes condiciones ácidas a 37ºC
4
A 4ºC, la plasmina es estable durante al menos nueve meses. A temperatura ambiente, la plasmina acidificada reversiblemente inactivada es estable durante al menos dos meses. Para determinar el pH óptimo de diferentes agentes de tamponamiento y el efecto de la concentración de tampón sobre la estabilidad de la plasmina, se prepararon composiciones de 1 mg/ml de plasmina en glicina o acetato de sodio 10 mM, 20 mM o 40 mM a diversos valores de pH. Se almacenaron las muestras a 37ºC durante 7 días, y se determinó la cantidad relativa de cadena pesada de la plasmina intacta restante mediante densitometría de geles de SDS teñidos con Coomassie. En la figura 3 se muestra una gráfica del pH frente al porcentaje de cadena pesada en relación con la proteína total en cada carril de los geles de SDS. Los resultados demuestran una estabilidad de pH óptima de aproximadamente 3,1-3,5, independientemente del tipo de tampón o de la concentración de tampón.
La estabilidad a largo plazo a temperatura ambiente es importante porque haría que esta formulación fuera compatible con regímenes largos de administración de agentes trombolíticos. Por ejemplo, una administración de 36 horas de agentes trombolíticos tales como urocinasa o activador de plasminógeno tisular es común en el tratamiento de oclusiones arteriales periféricas.
La capacidad de plasmina acidificada reversiblemente inactivada para volverse completamente activa tras la transferencia a pH fisiológico se demuestra por su actividad en el ensayo caseinolítico y también en los ensayos de trombólisis de fibrina marcada con ^{125}I. Estos dos ensayos se realizan a pH 7,4, y hubo una recuperación completa de la actividad de plasmina durante el cambio de pH y pasando a través del punto isoeléctrico (pH 5-5,5). La plasmina se formula en un disolvente de baja capacidad de tamponamiento y, cuando se añade a una disolución tamponada tal como plasma, adopta rápidamente el pH neutro o fisiológico de manera instantánea y no se produce la precipitación que habitualmente acompaña al paso lento a través del punto isoeléctrico.
Ejemplo 4 La plasmina tiene la misma potencia fibrinolítica intrínseca que una mezcla de plasminógeno/activador de plasminógeno
La plasmina tiene la misma potencia fibrinolítica intrínseca que una mezcla de plasminógeno/activador de plasminógeno. Se comparó la potencia fibrinolítica de plasmina con la de una mezcla de Lys-plasminógeno y APt. Se realizaron estos experimentos en un sistema definido que consistía en un trombo de fibrina radiomarcado con ^{125}I sumergido en PBS. La figura 4 muestra que, en un entorno tamponado, la trombólisis lograda con la plasmina es casi idéntica a la mezcla de Lys-plasminógeno más APt (curvas a y b, respectivamente). Al mismo tiempo, no se observó trombólisis con APt solo (curva c) o en ausencia de cualquier proteína (curva d). Los datos obtenidos con APt solo muestran que su actividad depende de su sustrato, plasminógeno, para ser un agente trombolítico eficaz.
Estos datos indican que, en ausencia de inhibidores y otros factores proteicos presentes en el plasma, no hay diferencia en la capacidad para lisar trombos de fibrina entre plasmina purificada y la combinación de APt y Lys-plasminógeno. Para evaluar la potencia trombolítica de plasmina activa, se realizó el ensayo de trombólisis de fibrina marcada con ^{125}I con trombos de plasma en un entorno de plasma.
Ejemplo 5 Estabilización de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada con un azúcar o alcohol de azúcar
Se formularon composiciones de plasmina acidificada según la presente invención, tal como se describe en los ejemplos 1 y 2, en 5 mM de ácido acético a pH 3,7 con 0,1 M de maltosa, manitol, sacarosa o sorbitol añadido como estabilizador. Se incluyó como control una composición de plasmina formulada sin ningún excipiente. Se incubaron todas las muestras a 37ºC durante 7 días y se analizó el cambio en la integridad de plasmina usando SDS-PAGE en condiciones reductoras, tal como se describió en el ejemplo 2 anteriormente. La figura 5 demuestra que el porcentaje de degradación de plasmina en las composiciones de pH bajo formuladas con un azúcar o alcohol de azúcar se reduce significativamente, en comparación con el control sin un azúcar o alcohol de azúcar.
Ejemplo 6 Estabilización de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada con agentes estabilizantes distintos de hidrato de carbono
Se formularon composiciones acidificadas reversiblemente inactivadas a 1 mg/ml en ácido acético 5 mM, pH 3,7, según la presente invención, con 0,1 M de glucosamina, niacinamida, citrulina o tiamina añadida como estabilizador distinto de hidrato de carbono. Se incluyó como control una formulación de plasmina acidificada reversiblemente inactivada sin ningún agente estabilizante de excipientes. Se incubaron todas las muestras a 37ºC durante 7 días y se analizó el cambio en la integridad de la plasmina usando SDS-PAGE en condiciones no reductoras. En referencia ahora a la figura 6, todos los agentes estabilizantes distintos de azúcar sometidos a prueba mejoraron la estabilidad de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada a 37ºC a lo largo del periodo de prueba de 7 días.
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También se formuló una composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada a 1 mg/ml en ácido acético 2 mM, pH 3,4, según la presente invención, con cloruro de sodio 150 mM como agente estabilizante. También se preparó la misma formulación, pero sin cloruro de sodio, y se incluyó como control. Se incubaron muestras a 4ºC durante 28 días. Se analizó el cambio en la integridad de la plasmina usando SDS-PAGE en condiciones no reductoras, tal como se describió en el ejemplo 3 anteriormente. Se evaluó también la actividad tal como se describió en el ejemplo 3. Se normalizaron los valores en relación con controles del día 0 a los que se asignó un valor del 100%. Los resultados, tal como se muestran en la tabla 5, demostraron que la plasmina almacenada a 4ºC era más estable en la formulación de pH bajo que contenía cloruro de sodio.
TABLA 5 Estabilidad de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada (acetato de sodio 2 mM, pH 3,4) con o sin cloruro de sodio 150 mM, almacenado a 4ºC
6
Ejemplo 7 Patrón de degradación de la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada caracterizado mediante secuenciación N-terminal
Se caracterizaron los péptidos de degradación de muestras de plasmina mediante secuenciación N-terminal tal como sigue. Se formularon composiciones de plasmina a valores de pH bajos: un pH inferior a 2,5 y un pH de 3,5 y 3,8 que contiene ácido acético 2 mM. Se analizaron las muestras de plasmina usando SDS-PAGE con geles de Bis-Tris NuPage al 4-12%, tal como se muestra en la figura 7. Se transfirieron las bandas de proteína a una membrana de PVDF, teñida con azul de Coomassie R-250 (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA) y se cortaron las bandas usando un escalpelo.
Se realizó un análisis de secuencias N-terminales directamente a partir de la membrana usando un secuenciador de proteínas Hewlett Packard 241 (Hewlett Packard, Inc., Glen Allen, VA). Se ejecutaron diez ciclos para cada banda de modo que pudo identificarse el correspondiente fragmento de plasmina. Se determinaron los pesos moleculares para cada banda con análisis de densitometría usando el marcador Mark 12 disponible de Invitrogen, Inc. (San Diego, CA).
Tres polipéptidos generados mediante incubación de plasmina a pH 3,8 empezaban en las posiciones (numerando en relación con Lys-plasmina) treonina (T105), glicina (G190) y ácido glutámico (E623). A partir de la secuencia de aminoácidos conocida de la plasmina, se determinó que los primeros dos polipéptidos eran de la cadena pesada y el tercero de la cadena ligera. Tal como se muestra en la figura 8, el aminoácido que precede al aminoácido N-terminal era o bien arginina o bien lisina (K104, R189 y K622). Comúnmente se sabe que la plasmina escinde proteínas en el lado carboxilo de lisina y arginina. Estos resultados demostraron que las composiciones de plasmina a pH 3,8 eran sensibles a la autodegradación.
Tres polipéptidos generados mediante incubación de plasmina a pH 2,2 empezaban con prolina en los extremos N-terminales. A partir de la secuencia de aminoácidos conocida de la plasmina, se determinó que estos polipéptidos eran de la cadena pesada, comenzando en las posiciones P63, P155 y P347, tal como se muestra en la figura 8. El aminoácido que precede a cada prolina era un ácido aspártico (D62, D154 y D346). Comúnmente se sabe que los enlaces peptídicos aspartil-prolil (D-P) son lábiles a ácidos. Estos resultados demuestran que las composiciones de plasmina a pH 2,2 eran sensibles a la hidrólisis ácida de enlaces peptídicos.
Ejemplo 8 Baja capacidad tampón de composiciones
Se formuló plasmina (1 mg/ml) en ácido acético, benzoico, láctico, málico o tartárico 2 mM a pH 3,5. Se midió el efecto del mezclado de volúmenes crecientes de suero sanguíneo humano con respecto al pH de 1 ml de la disolución de plasmina (figura 9). En todos los casos, se requirió sólo una pequeña cantidad de suero, normalmente del 10 al 30% del volumen de plasmina, para lograr un pH de aproximadamente 7. En un experimento separado, las composiciones de plasmina contenían ácido acético o bien 5 o bien 10 mM. Los volúmenes de suero requeridos para neutralizar la disolución de plasmina eran del 30% y el 70% del volumen inicial. Estos resultados demostraron que las composiciones de baja capacidad de tamponamiento, normalmente de aproximadamente 2 mM, pero más de 100 mM, se reestablecen fácilmente a un pH de aproximadamente 7. Estos resultados también sugieren que la plasmina se neutralizaría fácilmente de manera local dentro de un trombo y que podían usarse volúmenes grandes (en relación con la fracción líquida del coágulo) de plasmina para afectar a la lisis.
Ejemplo 9 Lisis de trombos mediante plasmina acidificada reversiblemente inactivada en un modelo de trombo in vitro
Para comparar la eficacia de la plasmina y el APt frente a la lisis de coágulos retraídos prolongados, se ha desarrollado un modelo in vitro que imitaría los parámetros de los coágulos formados en pacientes con PAO.
Modelo de PAO in vitro. Se extrajo sangre completa humana reciente en tubos de vidrio de 30 x 0,95 cm y se dejó que coagulara espontáneamente sin aditivos. Se incubaron los tubos durante 20 horas a 37ºC para permitir la retracción completa. Se separaron los coágulos retraídos del suero usando tamices D16 de prueba según la norma de EE.UU. con 14 de malla y se determinaron sus pesos. Se transfirieron los coágulos sanguíneos a tubos de vidrio de menor diámetro que se parecían a los coágulos de tamaño promedio en arterias de las piernas (0,6 x 12 cm). Se insertó un catéter de inyección pulsada con orificios laterales múltiples (tamaño francés 5 con la punta de inyección de 11 cm, Cook, Inc.) en el coágulo y se administró una composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada trombolítica según la presente invención, o APt) a 1 mg/ml en incrementos de 1 ml separados por intervalos de tiempo de 1 hora. El número de inyecciones corresponde a la dosis de agente trombolítico. Se midió el grado de lisis del coágulo mediante el peso de un coágulo residual y se expresó como porcentaje de la reducción de peso del coágulo. Aunque este modelo se denomina un modelo de PAO, e imita las dimensiones de los coágulos encontrados en pacientes con PAO, se usó sangre venosa para la formación de coágulos. Se sometieron a prueba tanto el APt como la composición de plasmina acidificada reversiblemente inactivada según la presente invención en este modelo y se presentan los resultados más adelante.
La plasmina es tan eficaz como el APt para la lisis de coágulos recientes, a diferencia de cuando se usan APt y plasmina para la lisis de coágulos retraídos envejecidos durante 20 horas para permitir la reticulación completa mediante el factor XIII. El APt no puede lisar tales coágulos. La reducción del peso del coágulo obtenida con los coágulos tratados con APt es similar al control, incluso cuando se eleva la dosis hasta 5 mg por coágulo.
Por otra parte, la plasmina es eficaz frente a coágulos tanto reticulados como retraídos completamente. Existe una dependencia de la dosis del efecto lítico de la plasmina y tras cinco inyecciones (o 5 mg de plasmina en total) los coágulos están casi completamente lisados. En una serie de experimentos en seres humanos similar, se observó la misma incapacidad para disolver coágulos reticulados y retraídos con urocinasa. Por tanto, la plasmina administrada localmente es un agente trombolítico más eficaz que el APt y otros activadores de plasminógeno.
Estos datos in vitro muestran que el APt requiere la presencia de su sustrato, plasminógeno, en el coágulo para iniciar y mantener la lisis de coágulos. Por tanto, mientras que la plasmina es tan eficaz como el APt para lisar coágulos recientes o ricos en plasminógeno, la plasmina es más eficaz que el APt, y otros activadores de plasminógeno, para lisar coágulos pobres en plasminógeno retraídos prolongados. Además, los datos presentados en este ejemplo demuestran que la plasmina es eficaz en su forma acidificada reversiblemente inactivada cuando se inyecta directamente dentro del coágulo.
Se usó el modelo de PAO tal como se describió anteriormente para comparar la eficacia de la plasmina (1 mg/ml) formulada en una formulación de pH bajo descrita en esta invención (solución salina, pH 3,7) con una formulación de estabilizador más pH neutro. Los resultados se muestran en la figura 10 y demuestran que la formulación de pH bajo es tan eficaz como la formulación de estabilizador más pH neutro.
Ejemplo 10 La tripsina estabilizada a pH bajo puede reactivarse mediante transferencia a un entorno de pH más alto
Se disolvió tripsina (16,4 mg, Sigma Chemical Co. nº de catalogo T-1426) en 2,28 ml de Tris 50 mM/NaCl 0,5 M (pH 8,0). Se cargo la disolución de tripsina sobre una columna de 1 ml de benzamidina-Sepharose (Pharmacia nº de código 17-0568-01) que se había equilibrado previamente con Tris 50 mM/NaCl 0,5 M (pH 8,0). Se lavó esta columna con 4 ml de este último tampón, dando como resultado una disminución de la absorbancia del eluato (280 nm) hasta menos de 0,03. Se eluyó la tripsina de esta columna en un estado inactivado con volúmenes de 0,5 ml de glicina 200 mM/NaCl 0,5 M (pH 3,0); las fracciones tercera a quinta de 0,5 ml eluidas de esta columna contenían los valores pico de absorbancia (280 nm) y se combinaron. Se determinó que la absorbancia (280 nm) de este eluato de tripsina combinado era de 9,22; basándose en el coeficiente de extinción para la tripsina (E_{280} para una disolución al 1% = 17,09) y el peso molecular de la tripsina (24.000), se calculó que la concentración de proteína tripsina total en este eluato de columna combinado era de 225 \muM.
Se determinó la concentración de sitios activos de tripsina en este eluato de columna de tripsina combinado mediante el método descrito por Case & Shaw, Biochem. Biophys. Res. Commun. 29, 508 (1967) usando benzoato de p-nitrofenilguanidino como agente titulante de sitios activos. Se realizó este ensayo a pH 8,3, diluyendo un pequeño volumen (100 \mul) del eluato de columna de tripsina combinado en una mezcla de ensayo que contenía también 700 \mul de borato de sodio 50 mM (pH 8,3), 200 \mul de fosfato de sodio 10 mM/glicina al 1% (pH 7,0) más 10 \mul de benzoato de p-nitrofenilguanidino (disuelto en dimetilformamida); se determinó que el pH final de esta composición de mezcla era 8,3. Se monitorizó la cantidad dependiente de tripsina del p-nitrofenol formado en este ensayo a 410 nm. Basándose en el coeficiente de extinción para p-nitrofenol a 410 nm y a pH 8,3 (16,595 M^{-1}), 100 \mul de este eluato de columna de tripsina combinado presentes en el ensayo de 1,01 ml corresponden a una concentración de 22,95 \muM de sitios activos de tripsina presentes en la cubeta. Por tanto, la disolución madre original de eluato de columna de tripsina combinado contenía sitios activos de tripsina 231 \muM. Este último valor es idéntico, dentro del error experimental, a la concentración de proteína tripsina total presente (225 \muM). Estos resultados demuestran que la tripsina puede ajustarse hasta pH bajo y entonces transferirse a un entorno de pH más alto con la reactivación de su sitio activo.

Claims (18)

1. Composición fibrinolítica que comprende una plasmina acidificada, reversiblemente inactiva para su uso como medicamento sin cambiar el pH a un pH fisiológico antes de ponerse en contacto con fluidos corporales, en la que dicha plasmina acidificada, reversiblemente inactiva está sustancialmente libre de un activador de plasminógeno; que comprende además:
un tampón de baja capacidad de tamponamiento a una concentración a la que el pH de la composición se eleva hasta un pH neutro mediante la adición de no más de un volumen igual de suero a dicha composición; y
opcionalmente, un estabilizador.
2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además un vehículo acuoso.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que la composición fibrinolítica está liofilizada.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la plasmina es una variante truncada de la misma seleccionada de midi-plasmina, mini-plasmina o micro-plasmina.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la plasmina está en el intervalo de concentraciones de entre 0,01 mg/ml y 50 mg/ml.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un anticoagulante.
7.Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición fibrinolítica tiene un pH de entre 2,5 y 4.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el tampón de baja capacidad de tamponamiento comprende al menos un ácido.
9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el tampón comprende un ácido carboxílico, al menos un aminoácido, un derivado del al menos un aminoácido, un dipéptido, un oligopéptido que incluye el al menos un aminoácido o una combinación de los mismos.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el tampón se selecciona de ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido benzoico, serina, treonina, metionina, glutamina, alanina, glicina, isoleucina, valina, alanina, ácido aspártico, derivados de los mismos o combinaciones de los mismos.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que el ácido está en el intervalo de concentraciones de entre 1 mM y 100 mM.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el agente estabilizante se selecciona de un alcohol polihidroxilado, una sal, citrulina o combinaciones de los mismos.
13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el agente estabilizante es un hidrato de carbono, sal, glucosamina, tiamina, niacinamida, citrulina farmacéuticamente aceptables o combinaciones de los mismos.
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el agente estabilizante es un azúcar o alcohol de azúcar seleccionado de glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, lactosa, trehalosa o combinaciones de los mismos.
15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el agente estabilizante se selecciona de monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, alcoholes polihidroxilados o combinaciones de los mismos.
16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el hidrato de carbono tiene una concentración en el intervalo del 0,2% p/v al 20% p/v.
17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el agente estabilizante se selecciona de cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio o combinaciones de los mismos.
18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 ó 17, en la que el agente estabilizante se selecciona de una sal, glucosamina, tiamina, niacinamida o una combinación de las mismas y la concentración del agente estabilizante está en el intervalo de 0,01 M a 1 M.
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