ES2626268T3

ES2626268T3 - Método de purificación de proteínas

Info

Publication number: ES2626268T3
Application number: ES10180577.8T
Authority: ES
Inventors: Kozo Takeda; Norimichi Ochi; Kimie Ishii; Manabu Matsuhashi; Akinori Imamura
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2017-07-24
Anticipated expiration: 2023-09-11
Also published as: ES2558303T3; US8809509B2; EP1561756A4; CA2497364A1; DK1561756T3; US20140323695A1; CN100522989C; HUE027134T2; CA2497364C; EP2261230B1; DK2261230T3; AU2003262087B2; JP2011006489A; HK1077836A1; WO2004024752A1; CN1681837A; AU2003262087A1; KR101119448B1; SI2261230T1; US20220185843A1

Abstract

Un método para eliminar virus en una muestra que contiene anticuerpos, que comprende las etapas de: 1) someter la muestra que contiene anticuerpo a una columna de cromatografía de afinidad de proteína A o G; 2) eluir la muestra con una solución acuosa ácida de conductividad baja de 0 a 50 mM; 3) ajustar la fracción eluida resultante con un tampón hasta un pH igual o menor que el punto isoeléctrico del anticuerpo, donde la molaridad de la fracción eluida ajustada es de 0 a 50 mM y 4) eliminar las partículas resultantes.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Metodo de purificacion de protemas Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere a un metodo para purificar protemas, mas espedficamente a un metodo para eliminar impurezas, tales como ADN contaminantes, de una muestra que contiene una protema fisiologicamente activa, tal como moleculas de anticuerpo.

Tecnica anterior

Los avances en la tecnologfa recombinante de genes han permitido un suministro estable de varias formulaciones proteicas. En particular, en los ultimos anos se han desarrollado e introducido en ensayos clmicos diversos farmacos de anticuerpos recombinantes, que son mas selectivos que los farmacos normales.

En estas formulaciones que contienen protemas fisiologicamente activas producidas de forma recombinante existe la necesidad de eliminar el ADN y las impurezas del huesped (por ejemplo, contaminantes de ADN) asociados con la contaminacion viral. Conforme a los criterios actuales de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), la cantidad de ADN en los farmacos biologicos no debe superar los 100 pg de ADN/dosis. Para cumplir este criterio, en general, un medio acuoso que contiene protemas fisiologicamente activas procedentes de la celula huesped, se trata mediante cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de hidroxiapatita o una combinacion de las mismas, con el fin de eliminar el ADN.

En particular, en un caso donde una protema fisiologicamente activa es un anticuerpo producido de forma recombinante en celulas huesped de mairnfero, el medio acuoso se trata mediante cromatograffa en columna de afinidad en la protema A o G antes de purificarlo mediante varios tipos de cromatograffa en base a la propiedad de union de la protema A o la protema G a la cadena Fc de la IgG.

Como ejemplo, en el documento JP KOHYO 5-504579, un medio acoso que contiene anticuerpos obtenido del cultivo de celulas de mamffero, se somete a cromatograffa en columna de protema A/G para adsorber las moleculas de anticuerpo sobre la columna, seguido de elucion con una solucion acida (acido cftrico aproximadamente 0,1M, pH 3,0-3,5) para liberar las moleculas de anticuerpo. La fraccion acida eluida resultante se somete secuencialmente a cromatograffa en columna de intercambio ionico y a cromatograffa en columna de exclusion por tamano para producir las moleculas de anticuerpo purificadas. En el documento WO 95/22389, los anticuerpos se purifican mediante cromatograffa en columna de la protema A, seguida de intercambio cationico y cromatograffa de interaccion hidrofobica.

No obstante, estos procesos cromatograficos individuales y las combinaciones de los mismos, requieren tiempo, son laboriosos y costosos, ademas de ser complicados. Ademas, no proporcionan resultados estables.

Por tanto, el objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo mas simple y menos caro para purificar protemas fisiologicamente activas, especialmente anticuerpos, que puede garantizar la eliminacion de impurezas, tales como ADN contaminantes, y que pueden minimizar una perdida de protemas fisiologicamente activas.

Divulgacion de la invencion

Como resultado de los intensos y extensos esfuerzos realizados para superar estos problemas, los inventores de la presente invencion han realizado el sorprendente hallazgo de que las impurezas, tales como los contaminantes de ADN y los virus, se pueden eliminar con eficiencia de una muestra que contiene protema fisiologicamente activa sin usar procesos cromatograficos complicados cuando la muestra se forma en una solucion acuosa de baja conductividad a un pH inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa y, despues, se filtra a traves de un filtro para eliminar las parffculas resultantes. Este hallazgo condujo a la realizacion de la presente invencion.

A saber, la presente invencion proporciona los puntos siguientes:

1. Un metodo para eliminar virus en una muestra que contiene anticuerpo, que comprende las etapas de:

1) someter la muestra que contiene anticuerpo a columna de cromatograffa de afinidad en la protema A o G;

2) eluir la muestra con una solucion acuosa acida de baja conductividad de 0 a 50 mM,

3) ajustar la fraccion eluida resultante con un tampon a un pH igual o inferior al punto isoelectrico del anticuerpo, donde la molaridad de la fraccion eluida ajustada es de 0 a 50 mM; y

4) eliminar las parffculas resultantes.

2. El metodo de acuerdo con el punto 1, donde la solucion acuosa acida de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 300 mM, expresado en molaridad.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3. El metodo de acuerdo con el punto 1 o 2, donde la solucion acuosa acida de baja conductividad tiene una fuerza ionica de 0 a 0,2.

4. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, donde la solucion acuosa acida de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m.

5. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, donde la solucion acuosa acida se selecciona de soluciones acuosas de acido clorlmdrico, acido dtrico y acido acetico.

6. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, donde el pH de la fraccion eluida resultante se ajusta a igual o inferior al punto isoelectrico del anticuerpo e igual o superior a pH 2,0.

7. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, donde la muestra que contiene anticuerpo tiene los virus a un tftulo de virus de 1,03 (Log10/ml) o menos despues del tratamiento de eliminacion de virus.

8. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 7, donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG.

9. El metodo de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.

10. El metodo de acuerdo con el punto 9, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado.

11. El metodo de acuerdo con el punto 9, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-antigeno HM1.24 humanizado.

12. El metodo de acuerdo con el punto 9, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-peptido relacionado con la hormona paratiroidea humanizado (anticuerpo anti-PTHrP).

13. El metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 12, donde las partmulas se eliminan mediante filtracion a traves de un filtro.

14. El metodo de acuerdo con el punto 1, donde el tampon es una solucion acuosa de Tris.

15. Un metodo para fabricar una formulacion de anticuerpo medica, que comprende una etapa de purificacion donde se usa el metodo de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14. Ademas, se divulga lo siguiente:

(1) Un metodo para eliminar impurezas en una muestra que contiene una protema fisiologicamente activa, que comprende las etapas de:

1) formar la muestra que contiene la protema fisiologicamente activa en una solucion acuosa de baja conductividad que tiene un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa; y

2) eliminar las partmulas resultantes.

(2) El metodo de acuerdo con (1) anterior, donde la solucion acuosa de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 100 mM, expresado en molaridad.

(3) El metodo de acuerdo con (1) o (2) anteriores, donde la solucion acuosa de baja conductividad tiene una fuerza ionica de 0 a 0,2.

(4) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3) anteriores, donde la solucion acuosa de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m.

(5) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (4) anteriores, donde la solucion se selecciona de soluciones acuosas de acido clorhfdrico, acido cftrico y acido acetico.

(6) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (5) anteriores, donde el pH de la solucion acuosa es igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa e igual o superior a pH 2,0.

(7) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (6) anteriores, donde las impurezas son contaminantes del ADN.

(8) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (6) anteriores, donde las impurezas son virus.

(9) El metodo de acuerdo con (7) anterior, donde la muestra que contiene protema fisiologicamente activa tiene los contaminantes del ADN a una concentracion de ADN de 22,5 pg/ml o menor despues del tratamiento de eliminacion de los contaminantes del ADN.

(10) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (9) anteriores, donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo.

(11) El metodo de acuerdo con (10) anterior, donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG.

(12) El metodo de acuerdo con (10) u (11) anteriores, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.

(13) El metodo de acuerdo con (12) anterior, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(14) El metodo de acuerdo con (12) anterior, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-anffgeno HM1.24 humanizado.

(15) El metodo de acuerdo con (12) anterior, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-peptido relacionado con la hormona paratiroidea humanizado (anticuerpo anti-PTHrP).

(16) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (9) anteriores, donde la protema fisiologicamente activa es un factor estimulante de colonias de granulocitos.

(17) El metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (16) anteriores, donde las parffculas se eliminan mediante filtracion a traves de un filtro.

(18) El metodo de acuerdo con (1) anterior, donde la etapa 1) se logra formando la muestra que contiene la protema fisiologicamente activa en una solucion acuosa acida o alcalina de baja conductividad y ajustando la muestra resultante con un tampon hasta un pH igual o menor que el punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa.

(19) El metodo de acuerdo con (1) anterior,

donde la protema fisiologicamente activa es un anticuerpo, y

donde la etapa 1) se logra sometiendo la muestra que contiene anticuerpo a cromatograffa de afinidad en la protema A o G, eluyendo la muestra con una solucion acuosa acida de baja conductividad y ajustando la fraccion eluida resultante con un tampon a un pH igual o menor que el punto isoelectrico del anticuerpo.

(20) El metodo de acuerdo con (18) o (19) anteriores, donde el tampon es una solucion acuosa de Tris.

(21) una protema fisiologicamente activa purificada obtenible mediante el metodo de acuerdo con una cualquiera de (1) a (20) anteriores.

(22) Un metodo para fabricar una formulacion proteica medica, que comprende una etapa de purificacion donde se usa el metodo de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (20) anteriores.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

Los ejemplos de protema fisiologicamente activa contenida en una muestra que se va a purificar mediante el metodo de la presente invencion, incluyen anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, y son mas preferidos los anticuerpos monoclonales. En una forma de realizacion de la presente invencion, para la purificacion usando cromatograffa de afinidad con protema A/G, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se clasifican en las clases IgG, IgA, IgE, IgD e IgM, prefiriendose los anticuerpos IgG.

Se entiende que la expresion “protema fisiologicamente activa” significa una protema que tienen sustancialmente las mismas actividades biologicas como una correspondiente protema fisiologicamente activa de origen mairnfero (especialmente de ser humano). Dicha protema puede ser nativa o geneticamente recombinante, preferentemente geneticamente recombinante. Las protemas fisiologicamente activas, geneticamente recombinantes, se pueden preparar mediante la produccion en celulas bacterianas tales como E. coli; celulas de levadura; o celulas cultivadas procedentes de animales tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas C127 o celulas COS. Las protemas preparadas de este modo se afslan y purifican de varias formas antes de usar. Dichas protemas geneticamente recombinantes abarcan las que tienen la misma secuencia de aminoacidos que la correspondiente protema nativa, asf como las que comprenden delecion, sustitucion o adicion de uno o mas aminoacidos en la secuencia de aminoacidos pero que retienen las actividades biologicas mencionadas anteriormente. Adicionalmente, dichas protemas incluyen las modificadas qmmicamente, por ejemplo con PEG. etc.

Cuando una protema fisiologicamente activa es una glicoprotema, puede tener cadenas de azucar de cualquier origen, preferentemente de origen marnffero. Los offgenes de mamffero incluyen, por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas BHK, celulas COS y celulas procedentes de ser humano, siendo las mas preferidas las celulas CHO.

Ademas, se divulga que una protema fisiologicamente activa puede ser EPO, que se puede preparar de cualquier modo, por ejemplo obteniendo de orina humana de varias formas u produciendola con tecnicas de ingenieffa genetica en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de levadura, celulas de ovario de hamster chino (CHO); celulas BHK, celulas COS o celulas procedentes de ser humano o similares (por ejemplo, como se describe en el documento JP KOKAI 61-12288). La EPO preparada de este modo se extrae, se afsla y se purifica de varias formas antes de usar. Ademas, la EPO se puede modificar qmmicamente, por ejemplo con PEG etc. (vease la publicacion internacional n.° WO90/12874). La EPO, como se usa en el presente documento, incluye adicionalmente las que estan inicialmente sin glicosilar pero qmmicamente modificadas con PEG, etc. Asimismo, tambien se incluyen analogos de la EPO, que estan modificados para tener al menos un sitio adicional para glicosilacion unida a N o unida a O en la secuencia de aminoacidos de la EPO (veanse, por ejemplo, los documentos JP KOKAI 08-151398, JP KOHYO 08-506023). En lugar de incrementar el numero de sitios de glicosilacion, las analogos de la EPO tambien se pueden modificar para tener un contenido incrementado de cadenas de azucar, tales como acido sialico para una cantidad incrementada de cadenas de azucar.

Ademas, se divulga que una protema fisiologicamente activa puede ser G-CSF, se puede usar cualquier G-CSF siempre que este altamente purificado. El G-CSF como se usa en el presente documento se puede preparar de cualquier forma, por ejemplo obteniendo de lmeas de celulas tumorales humanas cultivadas o produciendo con tecnicas de ingenieffa genetica en celulas bacterianas, tales como E. coli, celulas de levadura; celulas cultivadas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

procedentes de animales tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas C127 o celulas COS. El G- CSF preparado de este modo se extrae, se a^sla y se purifica de varias formas antes de usar. Se prefieren los producidos de forma recombinante en celulas E. coli, celulas de levadura; celulas CHO. Los mas preferidos son los producidos de forma recombinante en celulas CHO. Ademas, EL G-CSF se puede modificar qmmicamente, por ejemplo con PEG etc. (vease la publicacion internacional n.° WO90/12874).

Cuando una protema fisiologicamente activa es un anticuerpo monoclonal, se puede preparar de cualquier modo. En principio, se puede producir un anticuerpo monoclonal usando tecnicas conocidas mediante inmunizacion de un antfgeno sensibilizante de acuerdo con procedimientos convencionales para inmunizacion, fusionando los inmunecitos resultantes con celulas parentales conocidas mediante procedimientos convencionales para fusion celular y, despues, cribando las celulas productoras de anticuerpos monoclonales a traves de procedimientos convencionales para el cribado.

Como alternativa, los genes de anticuerpos se clonan a partir de hibridomas, se integran en vectores adecuados y despues se transforman en huespedes para producir moleculas de anticuerpo usando tecnologfa de recombinacion genica. Los anticuerpos geneticamente recombinantes producidos de este modo tambien se pueden usar en la presente invencion (vease, por ejemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Mas espedficamente, el ADNc de los dominios variables de anticuerpo (dominios V) se sintetiza a partir de ARNm de hibridoma usando la transcriptasa inversa. Tras la obtencion de ADN que codifica los dominios V del anticuerpo diana, el ADN esta ligado al ADN que codifica los dominios constantes del anticuerpo deseado (dominios C) y se integran en un vector de expresion. Como alternativa, el ADN que codifica los dominios V del anticuerpo se puede integrar en un vector de expresion portador del ADN de los dominios C del anticuerpo. La construccion de ADN se integra en un vector de expresion de forma que se expresa bajo el control de una region reguladora de la expresion, por ejemplo un potenciador o un promotor. Despues, las celulas huesped se transforman con este vector de expresion para la expresion de anticuerpos.

En la presente invencion, es posible usar anticuerpos geneticamente recombinantes (por ejemplo, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados) que se modifican artificialmente con el fin de atenuar las caractensticas como heteroantfgeno para el ser humano, Estos anticuerpos modificados se pueden preparar de un modo conocido. Un anticuerpo quimerico esta compuesto por dominios variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de mairnfero no humano (por ejemplo, raton) y dominios constantes de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano. Para obtener anticuerpos quimericos, los ADN que codifican dichos dominios variables de anticuerpo de raton pueden ligarse a ADN que codifican los dominios constantes de anticuerpo humano y despues se integran en un vector de expresion, seguido de transformacion en un huesped para la produccion de anticuerpos.

Los anticuerpos humanizados tambien se denominan anticuerpos humanos reformados y se obtienen mediante injerto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpos de mai^ero no humanos (por ejemplo, raton) para sustituir a las de anticuerpos humanos. Tambien se conocen procedimientos de recombinacion genica estandar para este fin. Mas espedficamente, una secuencia de ADN disenada para permitir la union entre CDR de anticuerpo de raton y las regiones marco (FR) de anticuerpo humano se sintetizan mediante PCR de varios oligonucleotidos que se preparan para que tengan secciones solapantes unas con otras en los extremos. El ADN obtenido de este modo se liga al ADN que codifica los dominios constantes del anticuerpo humano y se integra en un vector de expresion, seguido de transformacion en un huesped para producir anticuerpos (vease la publicacion de patente europea n.° EP 239400 y la publicacion internacional n.° WO 96/02576). Las fR del anticuerpo humano, que se liga a traves de las CDR, se seleccionan de un modo tal que las regiones determinantes de la complementariedad formen un sitio de union a antfgeno favorable. En caso necesario, se pueden efectuar sustituciones de aminoacidos en las regiones marco de los dominios variables de anticuerpo de forma que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo humanizado reformado pueden formar u sitio de union a antfgeno adecuado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Un anticuerpo del receptor anti-IL-6 humanizado (hPM-1) se pueden presentar como ejemplo preferido para dichos anticuerpos humanizados reformados (vease la publicacion internacional n.° WO92-19759). Ademas de esto, tambien se prefieren para su uso en la presente invencion un anticuerpo monoclonal anti-antfgeno HM1.24 humanizado (vease la publicacion internacional n.° WO98-14580), un anticuerpo anti-peptido relacionado con la hormona paratiroidea humanizado (anticuerpo anti-PTHrP, vease la publicacion internacional n.° WO98-13388) y un anticuerpo anti-factor tisular humanizado (vease la publicacion internacional n° WO99-51743) y similares.

Los procedimientos para obtener anticuerpos humanos tambien se conocen. Por ejemplo, los linfocitos humanos se sensibilizan in vitro con un antfgeno deseado o una celula de expresion del antfgeno deseado y despues los linfocitos sensibilizados se usan con celulas de mieloma humano (por ejemplo, U266) para dar los anticuerpos humanos deseados que tienen actividad de union al antfgeno (vease el documento JP KOKOKU 01-59878). Como alternativa, los animales transgenicos que tienen todos los repertorios de los genes de anticuerpos humanos se pueden inmunizar con un antfgeno para obtener los anticuerpos humanos deseados (veanse las publicaciones internacionales n.° WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Existen tecnicas adicionales usando bibliotecas de anticuerpos humanos para dar anticuerpos humanos mediante

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

adsorcion. Por ejemplo, los dominios variables de anticuerpo humano pueden expresarse cada uno como un anticuerpo de una sola cadena (scFv) sobre la superficie de los fagos mediante tecnologfa de expresion en fagos, seguido de seleccion de fagos que se unen al antigeno. Analizando los genes de los fagos seleccionados, es posible determinar las secuencias de ADN que codifican los dominios variables de anticuerpo humano que se unen al antigeno. Una vez que se han identificado las secuencias de ADN de la union de ScFv al antfgeno, las secuencias se pueden usar para construir vectores de expresion adecuados para obtener anticuerpos humanos. Estas tecnicas ya se conocen bien y se pueden encontrar en los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388.

Adicionalmente, tambien se prefieren los anticuerpos humanos producidos en animales transgenicos y similares.

Adicionalmente, el anticuerpo como se usa en el presente documento abarca fragmentos de anticuerpos, incluidos Fab, (Fab')2, Fc, Fc' y Fd, asf como anticuerpos reformados, incluidos anticuerpos de una sola cadena monovalentes o polivalentes (scFv).

Como se usa en el presente documento, preferentemente se entiende que la expresion “muestra que contiene protema fisiologicamente activa” o una “muestra que contiene anticuerpo” significa un medio de cultivo de celulas de mairnfero (por ejemplo, celulas CHO) que contienen moleculas proteicas o moleculas de anticuerpo fisiologicamente activas producidas mediante cultivo, que despues pueden someterse a purificacion parcial o a otro(s) tratamiento(s) determinado(s).

Como se divulga en el presente documento, las impurezas se eliminan en una muestra que contiene protema fisiologicamente activa mediante un metodo que comprende las etapas de:

1) formar la muestra que contiene protema fisiologicamente activa en una solucion acuosa de baja conductividad a un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa; y

2) eliminar las partmulas resultantes como se describe en las reivindicaciones.

Cualquier sustancia puede eliminarse como una impureza mediante el metodo de la presente invencion, siempre y cuando no sea una protema diana a purificar. Entre los ejemplos de tales impurezas se incluyen contaminantes de ADN, virus, protema A (eluida de las columnas), endotoxinas, HCP (protemas derivadas de las celulas huesped), asf como componentes del medio Hy-Fish (FL) e IGF, siendo preferentes los contaminantes de ADN o los virus. Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresion “contaminantes de ADN” significa moleculas de ADN presentes en una muestra que contiene protema fisiologicamente activa Los ejemplos incluyen ADN derivados del huesped y ADN virales derivados de contaminacion.

No hay una limitacion concreta al tipo de virus que se va a eliminar mediante el procedimiento de la presente invencion. Se puede eliminar cualquier virus, incluyendo virus de ADN y de ARN. Los ejemplos de virus de ARN incluyen retrovirus (por ejemplo, X-MuLV), reovirus (por ejemplo, Reo 3) y parvovirus (por ejemplo, MVM). Los ejemplos ilustrativos de virus eliminados mediante el metodo de la presente invencion incluyen, por ejemplo, X- MuLV, PRV, Reo 3, MVM, VSV, herpes simple, CHV, Sindbis, paperas, viruela, sarampion, rubeola, gripe, herpes zoster, citomegalovirus, parainfluenza, EB, HIV, HA, HB, NANB, ATL, ECHO y parvovirus, prefiriendose X-MuLV, Reo 3, MVM y PRV.

Como se usa en el presente documento, generalmente se entiende que la expresion “solucion acuosa de baja conductividad” significa una solucion acuosa que tiene una molaridad de 0 a 100 mM, preferentemente de 0 a 50 mM, mas preferentemente de 0 a 30 mM, o que tiene una fuerza ionica de 0 a 0,2, preferentemente de 0 a 0,12, o que tiene una conductividad de 0 a 200 mS/m, preferentemente de 0 a 200 mS/m, mas preferentemente de 0 a 150 mS/m.

El punto isoelectrico de una protema fisiologicamente activa se refiere al valor de pH al cual la protema fisiologicamente activa no tiene una carga neta aparente en una solucion acuosa. El punto isoelectrico se puede determinar de un modo conocido por los expertos en la tecnica, por ejemplo por medio del enfocado isoelectrico donde una protema fisiologicamente activa se somete a electroforesis en soluciones de varios niveles de pH para determinar el pH al cual la protema no migrara. Un pH igual o inferior al del punto isoelectrico de una protema fisiologicamente activa es, preferentemente, un pH por debajo del punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa.

Cuando las impurezas son moleculas de ADN en el metodo de la presente invencion, preferentemente el pH se ajusta a un nivel igual o inferior al punto isoelectrico de una protema fisiologicamente activa, de modo que la protema fisiologicamente activa esta cargada positivamente y las moleculas de ADN estan cargadas negativamente.

En general, el ADN tiene cargas ionicas negativas muy fuertes que son el resultado de los grupos fosfato en la estructura (los grupos fosfato hallados dentro de los enlaces fosfodiester fuertemente acidos en los acidos nucleicos tienen un valor de pK de aproximadamente 1). Por esta razon, el ADN puede estar cargado negativamente a cualquier pH y es posible usar un pH deseado en el intervalo de igual o inferior al punto isoelectrico de una protema

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

fisiologicamente activa. Dado que el nivel de pH requerido variara entre diferentes tipos de protemas fisiologicamente activas, los expertos en la tecnica pueden seleccionar un nivel de pH deseado en el intervalo de igual o inferior al punto isoelectrico de una protema fisiologicamente activa de una forma conocida, por ejemplo preparando muchas muestras con pH diferentes y midiendo sus parametros, tales como el % de eliminacion de aDn y el % de recuperacion de protemas, como se describe en la seccion de Ejemplos mas adelante. Dicho pH es, normalmente un pH de 2,0 o mayor, preferentemente un pH de 3,0 o mayor y, particularmente preferentemente un pH de 4,0 o mayor.

Para confirmar si las moleculas de ADN estan cargadas negativamente, se pueden usar procedimientos conocidos tales como los que usan una curva de titulacion electroforetica (CTE) (vease Ion Exchange Chromatography Principles and Methods, Pharmacia (recientemente Amersham Biosciences), pp. 52-56).

Ademas, en el metodo de la presente invencion, una muestra que contiene protema fisiologicamente activa tambien se puede convertir en una solucion acuosa acida o alcalina de baja conductividad, seguido de ajuste de la muestra resultante con un tampon hasta un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa.

Por tanto, como se divulga en la presente invencion, se eliminan las impurezas en una muestra que contiene protema fisiologicamente activa mediante un metodo que comprende las etapas de:

1) convertir la muestra que contiene protema fisiologicamente activa en una solucion acuosa acida o alcalina de baja conductividad;

2) ajustar la muestra resultante con un tampon a un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa; y

3) eliminar las partmulas resultantes. Las impurezas eliminadas mediante el metodo de la presente invencion son como se ha descrito anteriormente.

Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresion “solucion acuosa acida de baja conductividad” significa una solucion acuosa de pH 2,0 a pH 3,9, preferentemente de pH 2,0 a pH 3,0, que tiene una molaridad de 0 a 100 mM, preferentemente de 0 a 50 mM, mas preferentemente de 0 a 30 mM, o que tiene una fuerza ionica de 0 a 0,2, preferentemente de 0 a 0,12, o que tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m, preferentemente de 0 a 200 mS/m, mas preferentemente de 0 a150 mS/m. La solucion acuosa acida se puede seleccionar de soluciones acuosas de acido clortndrico, acido cftrico, acido acetico y otros acidos. El tipo, la conductividad y el pH de la solucion acuosa acida de baja conductividad variaran en funcion del tipo de protema fisiologicamente activa o anticuerpo que se va a purificar. Los expertos en la tecnica determinaran facilmente las condiciones optimas para estos parametros en experimentos preliminares, como se describe en el presente documento.

Asimismo, como se usa en el presente documento, se entiende que la expresion “solucion acuosa acida de baja conductividad” significa una solucion acuosa normalmente de pH 7,5 a pH 13, que tiene una molaridad de 0 a l00 mM, preferentemente de 0 a 50 mM, mas preferentemente de 0 a 30 mM, o que tiene una fuerza ionica de 0 a 0,2, preferentemente de 0 a 0,12, o que tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m, preferentemente de 0 a 200 mS/m, mas preferentemente de 0 a150 mS/m. El pH de esta solucion variara en funcion del tipo de protema fisiologicamente activa o anticuerpo que se va a purificar.

En el metodo de la presente invencion, despues de convertir una muestra que contiene protema fisiologicamente activa en una solucion acuosa acida de baja conductividad, la muestra resultante se ajusta con un tampon hasta un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa. Los ejemplos de un tampon incluyen Tris-HCl, fosfato, Tris, Na2HPO4 y NaOH.

Ademas, en la presente invencion, una muestra que contiene anticuerpo normalmente se puede someter a cromatograffa de afinidad en la protema A o G y luir con una solucion acuosa acida de baja conductividad, seguido de ajustar la fraccion eluida resultante con un tampon hasta un pH deseado en el intervalo de igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa.

Por tanto, en todavfa otra realizacion preferida de la presente invencion se eliminan las impurezas en una muestra que contiene protema fisiologicamente activa mediante un metodo que comprende las etapas de:

1) someter una muestra que contiene anticuerpo a cromatograffa de afinidad en la protema A o G y eluir la muestra con una solucion acuosa acida de baja conductividad;

2) ajustar la fraccion eluida resultante con un tampon a un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa; y

3) eliminar las partmulas resultantes de acuerdo con las reivindicaciones. Las impurezas eliminadas mediante el metodo de la presente invencion son como se ha descrito anteriormente.

La solucion acuosa acida de baja conductividad usada en este metodo puede ser cualquiera de las indicadas anteriormente. Los ejemplos de un tampon incluyen Tris-HCl, fosfato, Tris, Na2HPO4 y NaOH.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En el metodo de la presente invencion, la solucion ajustada a un pH igual o inferior al punto isoelectrico de la protema fisiologicamente activa en la etapa anterior, a su vez, produce parffculas (es decir, se enturbia). Estas parffculas se pueden eliminar mediante filtracion a traves de un filtro para garantizar una eliminacion suficiente de las impurezas tales como los contaminantes de ADN. Ejemplos de un filtro disponible para filtracion incluyen, entre otros, un sistema de filtro de acetato de celulosa de 1,0 - 0,2 pm (Corning) o TFF.

Como alternativa, estas parffculas tambien se pueden eliminar mediante centrifugacion o cualquier otra tecnica para una eliminacion eficiente de parffculas; los procedimientos para la eliminacion no estan limitados a la filtracion a traves de un filtro.

Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, los inventores de la presente invencion estiman que cuando las impurezas son moleculas de ADN, cada una de estas parffculas es un conjugado formado entre la protema activa fisiologicamente y el ADN. Tambien estiman que cuando el Ph se ajusta por debajo del punto isoelectrico de una protema, la protema esta cargada positivamente y las moleculas de ADN estan cargadas negativamente, lo que tiene como resultado una conjugacion entre ADN y protema. Ademas, la conversion en una solucion acuosa de baja conductividad potenciara adicionalmente la conjugacion. La eliminacion de las parffculas mediante filtracion tiene como resultado una perdida pequena de protema fisiologicamente activa porque se elimina en forma de conjugados de ADN-protema fisiologicamente activa. No obstante, dicha pequena perdida constituye solo un pequeno porcentaje de la cantidad total de la protema fisiologicamente activa; aproximadamente el 90 % de la protema fisiologicamente activa se puede recuperar, como se describira en la seccion Ejemplo mas adelante.

Los inventores de la presente invencion tambien estiman que la cromatograffa en columna de protema A/G sola puede no ser suficiente para asegurar la separacion eficaz entre el contaminante de aDn y la protema fisiologicamente activa porque se forman conjugados de ADN-protema en la resina de la columna. La protema fisiologicamente activa purificada de este modo esta disponible para su uso como formulacion farmaceutica tras la posterior purificacion mediante cromatograffa de intercambio cationico, cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de hidroxiapatita o combinaciones de las mismas.

El ensayo de ADN cuantitativo se puede conseguir, sin limitaciones, el ensayo de ADN total umbral junto con extraccion de ADN antes del ensayo.

El ensayo cuantitativo de virus se puede realizar mediante, sin limitaciones, ensayo de DICT50 (dosis infecciosa de cultivo tisular (50 %)), que se mide mediante la infectividad vital en las celulas de deteccion en combinacion con RT/Q-PCR y Q-PCR que permiten la determinacion de la cantidad de virus en fracciones.

A continuacion, la presente invencion se describira adicionalmente en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Investigacion de la composicion tampon para la cromatograffa de afinidad de protema A en la purificacion de hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado)

1.1. Procedimientos de la prueba

(1) Material de prueba (muestra que contiene anticuerpo)

Una muestra que contiene el medio de cultivo (en lo sucesivo en el presente documento abreviado a MC) de celulas CHO productoras del anticuerpo hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado), que se ha centrifugado para eliminar las celulas y almacenarlas a -80 °C, se filtro a traves de un sistema de filtro de acetato de celulosa (abreviado a AC) de 0,22 pm (CORNING) y se uso como muestra de prueba para investigacion de purificacion. El anticuerpo hPM-1 se preparo como se describe en el ejemplo de referencia 2 del documento JP KOKAI 08-99902 usando el promotor Ia del factor de elongacion humano mostrado en el Ejemplo 10 de la publicacion internacional n.° WO92/19759 (punto isoelectrico: pH 9,0).

(2) Instrumento usado para el examen

Para la fraccion eluida de HCl

HPLC: L-6200 Intelligent Pump (HITACHI)

Detector L-4200 UV-VIS (HITACHI)

D-2500 Chromato-Integrator (HITACHI) Columna: HR5/2 (Pharmacia), DI de 5 mm * 20 mm de

A

Medios: POROS 50A (PerSeptive), Lote de 0,4 ml;

A250-039, Code; SPECIAL

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Para las particulas

HPLC: Waters PrepLC4000 System (Waters)

Waters20o0 System Controller (Waters) Waters486 Tunable Absorbance Detector (Waters)

Waters741 Data Module (Waters) Espectrofotometro: U-2000 (HITACHI)

Columna: XK26 (Pharmacia), DI de 26 mm * 100 mm de

A

Medios: POROS 50A (PerSeptive), Lote de 53 ml;

A250-039, Code; SPECIAL

(3) Analisis y ensayo Ensayo hPM-1:

hPM-1 se analiza mediante HPLC de fase inversa en una columna PLRP-S (Polymer Laboratories) con un gradiente lineal. Ensayo de ADN:

El ADN se mide mediante el ensayo de ADN total del umbral. Antes del ensayo se realiza extraccion de ADN (por ejemplo, usando un kit de extraccion de ADN, Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.). Asimismo, para la medicion se usa un kit de ensayo de ADN total del umbral (Molecular Devices).

Turbidimetna:

Cada muestra de ensayo se monitoriza para determinar la formacion de particulas midiendo su absorbancia a 660 nm en un espectrofotometro U-2000 (HITACHI).

1.2. Investigacion y condiciones de elucion

Las condiciones de la elucion se investigaron a varias composiciones tampon para determinar la elucion en la cromatograffa de afinidad de protema A midiendo el % de recuperacion de hPM-1 y la eliminacion del ADN mediante elucion. La muestra que contiene anticuerpo anterior se sometio a la columna en las condiciones indicadas en la Tabla 1 siguiente. La resina de la protema A se equilibro con el tampon de equilibrado indicado en la Tabla 1 y despues se cargo con la muestra que contiene el anticuerpo anterior, seguido de lavado 1, lavado 2 y elucion. El perfil de elucion se monitorizo a a280 para aislar un pico de protema. En la tabla, el tampon C-P indica tampon citrato-fosfato.

Tabla 1

: Metodo de elucion 1 Metodo de elucion 2 Metodo de elucion 3

Equilibrado: NaCl 1M/Tampon C-P 100mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampon C-P 10 mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampon C-P 100mM pH 7,5

Lavado 1: NaCl 1M/Tampon C-P 100mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampon C-P 10 mM pH 7,5 NaCl 1M/Tampon C-P 100 mM pH 7,5

Lavado 2: Tampon C-P 100 mM pH 7,5 Tampon C-P 10 mM pH 7,5 Tampon C-P 100 mM pH 7,5

Elucion: Tampon C-P 100 mM pH 2,6 HCl 2,5 mM pH 2,6 HCl 2,5 mM pH 2,6

No se observaron diferencias cromatograficas entre los metodos de elucion 1, 2 y 3.

Cada fraccion de elucion se ajusto a pH 7,0 con solucion Tris 300 mM, lo que indica que las particulas se generaban en las fracciones eluidas con HCl (metodos de elucion 2 y 3). Se realizo investigacion adicional para determinar la correlacion entre la formacion de particulas y el % de recuperacion de hPM-1 o la cantidad de ADN residual.

Para analizar la correlacion de las particulas, la fraccion eluida de HCl del metodo de elucion 2 se suplemento con NaCl y se analizo la correlacion entre concentraciones de NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM) y varios factores. En el analisis de la correlacion entre las concentraciones de NaCl y varios factores, las muestras filtradas y sin filtrar se prepararon del siguiente modo: cada fraccion de elucion de protema A suplementada con NaCl se ajusto a pH 7,0 con una solucion Tris 300 mM y despues se filtro o no a traves de un filtro CA de 0,22 pm. Las muestras filtradas y no filtradas se midieron para el % de recuperacion de hPM-1 (solo muestras filtradas) y la cantidad de ADN residual.

1.3. % de recuperacion

El % de recuperacion de hPM-1 se midio para los metodos de elucion individuales. Como resultado, el % de recuperacion fue tan elevado como de 98,6 % en el metodo de elucion 1. Por el contrario, el % de recuperacion vario de 83,8 % a 97,1 % en el metodo de elucion 2 y de 83,5 % a 93,7 % en el metodo de elucion 3, se estimo que estas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

variaciones se de^an a lo pequeno de la escala de analisis (volumen de la resina: 0,4 ml). Cuando la escala de purificacion se aumento, se confirmo que el % de recuperacion de hPM-1 se estabilizo a 90 % o mas (metodo de elucion 2). Por tanto, tambien se descubrio que el % de recuperacion de hPM-1 segma siendo alto, incluso en la elucion de HCl.

1.4. Correlacion entre las concentraciones de NaCl en la fraccion eluida de HCl y varios factores

La Tabla 2 resume los analisis de la correlacion entre las concentraciones de NaCl en la fraccion eluida de HCl y varios factores.

Tabla 2

Concentracion de NaCl: 0 mM 50 mM 100 mM

Turbidez (pH no ajustado): 0,004 0,007 0,011

Turbidez (pH ajustado): 0,252 0,049 0,020

% de recuperacion de hPM-1 (filtrado) (%): 81 86 88

Cantidad de ADN (sin filtrar) (pg de ADN/mg de hPM-1): 98 220 241

Cantidad de ADN (filtrado) (pg de ADN/mg de hPM-1): 11 30 250

Para las muestras filtradas, el % de recuperacion de hPM-1 fue del 88 % a NaCl 100 mM, 86 % a NaCl 50 mM y 81 % a NaCl 0 mM. La cantidad de ADN residual fue baja a NaCl 0 mM en las muestras filtradas y no filtradas. En particular, la muestra filtrada suplementada con NaCl 0 mM tema un contenido de ADN muy bajo de 11 pg de ADN/mg de hPM-1.

Las muestras con pH ajustado con una turbidez mas alta tienden a proporcionar un % de recuperacion hPM-1 menor y una cantidad menor de ADN residual tras la filtracion. Este resultado sugiere una elevada posibilidad de que tanto hPM-1 como el ADN contribuyen a la formacion de partmulas. Se ha estimado que hPM-1 y ADN probablemente interaccionen entre sf para formar partmulas ajustando el pH a 7,0. Con objeto de conseguir un % de recuperacion de hPM-1 mas alto, es preferible incrementar la concentracion de NaCl en la fraccion eluida de HCl. Para disminuir una cantidad de ADN residual, por otro lado, es deseable eliminar la suplementacion de NaCl en fraccion eluida de HCl.

Ejemplo 2: Purificacion del anticuerpo anti-PTHrP humanizado

Una muestra que contiene un anticuerpo anti-PTHrP humanizado (un medio de cultivo del cultivo de celulas CHO), filtrado a traves de filtros CA SARTOBRAN P de 0,45 y 0,2 pm (sartorius)) se purifico mediante cromatograffa en columna de afinidad de protema A en las condiciones indicadas mas adelante. El anticuerpo anti-PTHrP se preparo como se describe en la publicacion internacional n.° WO98/13388 (punto isoelectrico: pH 8,3).

2.1. Condiciones experimentales

Aparato de purificacion: Explorador AKTA (Amersham Pharmacia Biotech)

Columna: HR5/5, C10, XK-26 (Amersham Pharmacia Biotech) Resina: rProtein A Sepharose Fast Flow Carga: carga directa del medio de cultivo (pH 6,6 a pH 7,5) Ajuste de la fraccion de elucion: Fracciones de elucion se ajustan a varios niveles de pH con una solucion Tris acuosa 1M y despues se filtran a traves de un filtro de acetato de celulosa (en lo sucesivo abreviado a AC) de 0,2 pm para eliminar el ADN (las condiciones se analizan en (1) mas adelante).

La columna de la protema A se equilibro suficientemente con tampon de citrato-fosfato que contiene NaCl 150 mM (pH 7,5) y despues se cargo con el MC que contiene el anticuerpo anterior. Despues, a columna se lavo con tampon de citrato-fosfato que contiene NaCl 150 mM (pH 7,5) para eliminar las impurezas no unidas, se lavo despues con tampon de citrato-fosfato (pH 7,5) para disminuir la conductividad y despues se eluyo con acido cftrico acuoso 20 mM. El perfil de elucion se monitorizo a A280 para aislar un pico de protema. Esta fraccion de elucion de la protema A se uso para el siguiente analisis de las condiciones.

2.2. Analisis de las condiciones de eliminacion para el ADN residual en la fraccion eluida

Para garantizar una eliminacion eficiente de ADN residual, se investigo el pH optimo para la filtracion a traves de un filtro. La fraccion de elucion de la protema A se ajusto con una solucion Tris acuosa 1,0 M a los siguientes niveles de pH. 2,7 (sin ajustar), 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5. Despues, se dejo que cada muestra reposara durante un periodo de tiempo dado, se filtro a traves de un filtro de AC de 0,22 pm y despues se ajusto a pH 7 con una solucion

5

10

15

20

25

30

35

40

Tris acuosa 1,0 M, seguido de ensayo de ADN. En la tabla 3 se enumeran los niveles de pH examinados y los periodos de reposo, junto con la cantidad de ADN residual.

____________________________________Tabla 3

Eliminacion del ADN residual (unidad: pg/ml)

: pH 7,5 pH 7,0 pH 6,5 pH 6,0 pH 5,5 pH 5,0 pH 4,5 pH 4,0 Directo (pH 2,7)

0 h: 984 83,3 53,8 <22,5 <15,0 17,2 54,1 32,052 40,878

6 h: 816 51,9 <15,0 <22,5 <15,0 <15,0 44,0 38,172 42,078

24 h: 310 46,6 <15,0 <22,5 <15,0 <15,0 39,7 42,528 30,222

(ADN en el medio de cultivo: 6,637,200 pg/ml; ADN en la muestra sin filtrar: 25,110 pg/ml)

Como se muestra en la tabla, la cantidad de ADN residual estaba por debajo del ftmite de deteccion a pH 5,5 y pH

6,0 en todos los casos en los que se dejo que las muestras reposaran durante 0, 6 y 24 horas. Asimismo, la eliminacion de ADN residual alcanzo un pico aproximadamente a pH 5,5 y pH 6,0, mientras que se observo una menor eficiencia de la eliminacion de ADN a niveles de pH mayores y menores.

Ejemplo 3: Purificacion de anticuerpo monoclonal anti-antigeno HM1.24 humanizado

Una muestra que contiene un anticuerpo monoclonal anti-antigeno HM1.24 (un medio de cultivo del cultivo de celulas CHO) se purifico mediante cromatograffa en columna de afinidad de protema A en las condiciones indicadas en la Tabla 4 a continuacion. El anticuerpo monoclonal anti-antigeno HM1.24 se preparo como se describe en la publicacion internacional n.° WO98/14580 (punto isoelectrico: pH 9,0).

3.1. Condiciones experimentales

Columna: rProtein A FF, 5 ml (DI 16 mm * A 25 mm)

Caudal: 5 ml/min (150 cm/h)

Muestra: carga directa del medio de cultivo

Tabla 4

Equilibrado (20 CV): Tampon C-P 10 mM, NaCl 1M, pH 7,5

Carga: Carga directa de MC

Lavado 1 (20 CV): Tampon C-P 10 mM, NaCl 1M, pH 7,5

Lavado 2 (20 CV): Tampon C-P 10 mM, pH 7,5

Elucion (10 CV): Acido cftrico, pH 2,5

Lavado 3 (4 CV): NaOH 0,1M

La columna de la protema A se equilibro suficientemente con tampon de citrato-fosfato que contiene NaCl 150 mM (pH 7,5) y despues se cargo con el MC que contiene el anticuerpo anterior. Despues, a columna se lavo con tampon de citrato-fosfato que contiene NaCl 150 mM (pH 7,5) para eliminar las impurezas no unidas, se lavo despues con tampon de citrato-fosfato (pH 7,5) para disminuir la conductividad y despues se eluyo con acido cftrico acuoso 20 mM. El perfil de elucion se monitorizo a A280 para aislar un pico de protema. Esta fraccion de elucion de la protema A se uso para la siguiente investigacion de las condiciones.

3.2. Investigacion de las condiciones de eliminacion para el ADN residual en la fraccion eluida

Para garantizar una eliminacion eficiente de ADN residual, se investigo el pH optimo para la filtracion a traves de un filtro. La fraccion de elucion de la protema A se ajusto con una solucion Tris acuosa 1,0 M a los siguientes niveles de pH (pH = 4,5-7,5). Despues, se dejo que cada muestra reposara durante un periodo de tiempo dado, se filtro a traves de un filtro de AC de 0,22 pm y despues se ajusto a pH 7 con una solucion Tris acuosa 1,0 M, seguido de ensayo de ADN y HPLC de fase inversa para el ensayo del anticuerpo monoclonal anti-antfgeno HM1.24 humanizado. La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo de ADN, mientras que la Tabla 6 muestra el rendimiento del anticuerpo monoclonal anti-antfgeno HM1.24 humanizado.

Tabla 5

Eliminacion del ADN residual (unidad: pg/ml)

Experimento 1

: pH 7,5 pH 6,5 pH 5,5

0 h: 1142 624 113

6 h: 3288 1157 117

(ADN en el medio de cultivo: 235200 pg/ml)

Experimento 2

: pH 5,5 pH 5,0 pH 4,5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Eliminacion del ADN residual (unidad: pg/ml)

Experimento 1

0 h: 137 67 86

6 h: 94 34 164

(ADN en el medio de cultivo: 5448000 pg/ml; ADN en la muestra sin filtrar: 4330 pg/ml)

Tabla 6

% de recuperacion del anticuerpo monoclonal anti-anffgeno HM1.24 humanizado mediante filtracion

: pH 5,5 pH 5,0 pH 4,5

0 h: 98,1 % 89,6 % 87,8 %

6 h: 89,3 % 91,1 % 98,6 %

Aunque las muestras purificadas mediante la cromatograffa de afinidad de la protema A todav^a eran ricas en ADN, el experimento 1 indico que la cantidad de ADN disminma con la disminucion del pH del orden de pH 7,5, pH 6,5 y pH 5,5, y que habfa una tendencia a eliminar mas ADN a 0 horas que a las 6 horas. En el experimento 2, se llevo a cabo el mismo experimento en las condiciones de pH = 4,5, 5,0 y 5,5, lo que indico que se habfa eliminado ADN suficiente en la misma medida, con independencia del pH y del periodo de reposo dentro del intervalo analizado. Ademas, el calculo del % de recuperacion indico poca perdida del anticuerpo monoclonal anti-anffgeno HM1.24 humanizado.

Ejemplo 4: Purificacion del factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF) (ejemplo de referencia)

Se uso una muestra que contiene G-CSF (del cultivo de celulas CHO; Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) para el siguiente analisis de las condiciones (punto isoelectrico: pH 5,5 - 5,7).

4.1. Investigacion de las condiciones de eliminacion para el ADN residual en la fraccion eluida

Para garantizar una eliminacion eficiente de ADN residual, se investigo el pH optimo para la filtracion a traves de un filtro. La muestra que contiene G-CSF se diluyo en una solucion acida de baja conductividad (HCl acuoso 2,5 mM) y se convirtio adicionalmente en solucion acuosa acida de baja conductividad usando 20 % de acido clortffdrico, seguido de la adicion del ADN de la muestra. La muestra que contiene G-CSF tratada de este modo se ajusto con una solucion Tris acuosa 1,0M al siguiente nivel de pH (pH = 4,3 o 6,6) y despues se filtro a traves de un filtro de AC de 0,22 pm. Despues se realizo un ensayo de ADN en las fracciones tanto filtrada como no filtrada. La Tabla 7 muestra los resultados del ensayo de ADN.

Tabla 7

Eliminacion del ADN residual (unidad: pg/ml)

pH para la filtracion: pH 6,6 pH 4,3

Sin filtrar: 4,3 ^ 105 4,3 x 105

Filtrado: 2,8 x 104 < 90

Esta investigacion confirma la reduccion eficiente del ADN en la muestra que contiene G-CSF rica en ADN cuando la muestra se filtro a pH 4,3; es decir, la cantidad de ADN residual estaba por debajo del ffmite de deteccion del ensayo.

Ejemplo 5: Efectos de la eliminacion de virus sobre la purificacion de hPM-1 (anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado)

5.1 Material de prueba (muestra que contiene anticuerpo)

Las muestras que contienen el medio de cultivo (MC) de las celulas CHO que producen el anticuerpo hPM-1 (anticuerpo frente al receptor de IL-6 humanizado), que se habfan centrifugado para eliminar las celulas y almacenado a -80 °C, se suplementaron con X-MuLV, Reo3 y MVM, respectivamente, seguido de filtracion a traves de un filtro de 0,45 pm (Bottle Top Filter, CORNING) para su uso como muestras de prueba para purificacion o investigacion. El anticuerpo hPM-1 se preparo como se describe en el ejemplo 1. Los virus usados para el analisis se obtuvieron cada uno de la ATCC (Coleccion Americana de Cultivos Tipo).

5.2 Purificacion mediante cromatograffa en columna de rProtema

Las muestras suplementadas con virus preparadas en 5.1 se purificaron mediante cromatograffa en columna de rProtema. Las condiciones detalladas son como se muestra a continuacion.

Resina: rProteina Sepharose Fast Flow Instrumento: AKTA explorer100, AKTApurifier Columna: XK16/20, XK16/40

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Altura de la resina: 11,5 cm Condiciones de elucion

Equilibrado: NaCI 1 mol/l, tampon C-P 20 mmol/l, pH 7,5 ± 0,2, Conductividad 8,5 ± 0,5 S/m Lavado 1. NaCl 1 mol/l, tampon C-P 20 mmol/l, pH 7,5 ± 0,2, Conductividad 8,5 ± 0,5 S/m Lavado 2. Tampon C-P 10 mmol/l, pH 7,7 ± 0,2, Conductividad 165 ± 20 mS/m Elucion: HCl 2,5 mmol/l, pH 2,7 ± 0,2, Conductividad 107 ± 10 mS/m

5.3 Tratamiento a pH bajo

Las fracciones de elucion obtenidas en 5.2 se ajustaron a pH 3,2 ± 0,1 con 1 mol/l de acido clorhndrico y se mantuvieron a temperatura ambiente de 15 ± 5 °C durante 30 minutos o mas. Despues, cada fraccion de elucion se ajusto a pH 7,2 ± 0,1 con una solucion Tris 300 mmol/l, 40,0 ml de los cuales se filtro a continuacion a presion de 0,03 ± 0,01 MPa usando una unidad de filtracion equipada con un filtro de fibra de vidrio (Millipore) (0,2 pm, PALL) conectado al lado primario y un Biolnert (0,2 pm, PALL) (un soporte de filtro PALL equipado con un ajustador de 915 mm) conectado al lado secundario.

5.4 Deteccion de virus

Todas las muestras recogidas se midieron mediante el ensayo de la DICT50. En la prueba de capacidad de aclaramiento para X-MuLV y MVM, estos virus se detectaron no solo mediante el ensayo de DICT50 que se midio mediante infectividad viral en las celulas de deteccion, sino tambien mediante RT/Q-PCR y Q-PCR que permitio la determinacion de la cantidad de virus en fracciones.

5.5 Resultados

Los resultados de la deteccion en 5.4 se muestran en las tablas siguientes.

Tabla 8 Titulo ^ del virus (ensayo de la DICT50: Log-ip/ml)

: Reo3 MVM

Ciclo 1: Ciclo 2 Ciclo 1 Ciclo 2

Sin filtrar: 5,76 5,76 4,80 4,18

Filtrado: < 1,03 < 1,03 < 1,03 < 1,03

Tabla 9 Titulo del virus (PCR: Log-ip Copias/5 pl)

: X-MuLV MVM

Ciclo 1: Ciclo 2 Ciclo 1 Ciclo 2

Sin filtrar: 5,05 4,77 4,18 2,83

Filtrado: < 7,90 < 1,90 < 1,30 < 1,90

Como se ha mostrado anteriormente, el proceso de purificacion de la presente invencion alcanza VRL (valores de reduccion logantmica) muy altos para todos los virus analizados y este analisis confirma que los virus se eliminaban hasta un nivel inferior al lfmite de deteccion del ensato despues del tratamiento a pH bajo y la filtracion.

Aplicabilidad industrial

El metodo de la presente invencion permite una eliminacion eficiente de impurezas tales como contaminantes de ADN de un modo muy sencillo y es significativamente ventajoso en la purificacion de anticuerpos. El metodo consigue una concentracion de ADN extremadamente baja (por ejemplo, 22,5 pg/ml) cuando las impurezas son moleculas de ADN. El metodo de la presente invencion tambien permite reducir los costes y tiene un gran significado en este campo.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para eliminar virus en una muestra que contiene anticuerpos, que comprende las etapas de:

1) someter la muestra que contiene anticuerpo a una columna de cromatograffa de afinidad de protema A o G;

2) eluir la muestra con una solucion acuosa acida de conductividad baja de 0 a 50 mM;

3) ajustar la fraccion eluida resultante con un tampon hasta un pH igual o menor que el punto isoelectrico del anticuerpo, donde la molaridad de la fraccion eluida ajustada es de 0 a 50 mM y

4) eliminar las partfculas resultantes.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la solucion acuosa acida de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 30 mM, expresado en molaridad.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde la solucion acuosa acida de baja conductividad tiene una conductividad de 0 a 300 mS/m.
4. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la solucion acuosa acida se selecciona de soluciones acuosas de acido clorhndrico, acido cftrico y acido acetico.
5. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el pH de la fraccion eluida resultante se ajusta a igual o menor que el punto isoelectrico del anticuerpo e igual o mayor que el pH de 2,0.
6. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la muestra que contiene el anticuerpo tiene los virus a un tftulo de virus de 1,03 (Log10/ml) o menor tras el tratamiento de la eliminacion de virus.
7. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG.
8. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.
9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado.
10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-antfgeno HM1.24 humanizado.
11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-peptido relacionado con la hormona paratiroidea humanizado (anticuerpo anti-PTHrP).
12. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde las partfculas se eliminan mediante filtracion a traves de un filtro.
13. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el tampon es una solucion acuosa de Tris.
14. Un metodo para fabricar una formulacion de anticuerpo medica, que comprende una etapa de purificacion donde se usa el metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.