ES2260059T3 - Rna mensajero del pca3 en tejidos benignos y malignos de prostata. - Google Patents

Abstract

Un método ¿in vitro¿ para diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en un paciente, dicho método consiste en: (a) determinar la cantidad de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra tomada de dicho paciente y (b) diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en dicho paciente; en el que la presencia de un mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, que da lugar a un mRNA de PCA3 de secuencia más larga que la descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de un estado no maligno de la próstata, mientras que la presencia de un mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de la presencia de o de la predisposición para desarrollar el cáncer de próstata.

Description

RNA mensajero del PCA3 en tejidos benignos y malignos de próstata.

La presente invención se refiere al cáncer de próstata. Más en concreto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico "in vitro" de la presencia de o de la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en un paciente, dicho método consiste en: (a) determinar la cantidad de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra tomada del paciente; y (b) diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar el cáncer de próstata en dicho paciente; la presencia de un mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, que da lugar a un mRNA de PCA3 de secuencia más larga que la descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de un estado no maligno de la próstata, mientras que la presencia de un mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de la presencia de o de la predisposición para desarrollar el cáncer de próstata.

Se proporciona también un método para acotar el cáncer de próstata. La presente invención se refiere además al uso de sondas o de cebadores que se hibridan específicamente con la secuencia adicional descrita en la SEQ ID NO: 1, en comparación con la SEQ ID NO: 2, para la preparación de una composición para diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata.

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico (RNA mensajeros), codificados por el gen PCA3; la expresión diferencial de dos de estas especies de RNA en estados de próstata no malignos y malignos; los métodos de diagnóstico específico del cáncer de próstata, basados en la detección de las especies de RNA relacionadas con el cáncer de próstata; las estrategias terapéuticas para el cáncer de próstata que incluyen estas dos especies de RNA; las moléculas de ácido nucleico y los anticuerpos que tienen afinidad de fijación con los mRNA expresados diferencialmente; los kits que contienen sondas de ácido nucleico o anticuerpos; los bioensayos que utilizan secuencias de ácido nucleico de los mRNA de la presente invención expresados diferencialmente para diagnosticar, evaluar o pronosticar el estado de un mamífero, afectado de o susceptible de desarrollar cáncer de próstata; y los bioensayos para explorar los compuestos que modulan la expresión de los mRNA de la presente invención.

Durante la última década, el cáncer de próstata se ha convertido en la enfermedad maligna diagnosticada más frecuentemente entre los varones y la segunda causa en importancia de las muertes por cáncer en los varones de la población occidental, después del cáncer de pulmón (Landis y col., CA Cancer J. Clin. 48(1), 6-29, 1998). Entre todos los tipos de cáncer, la incidencia del cáncer de próstata es la que tiene mayor aumento con la edad. Dado que la longevidad de la población occidental aumenta, continúa habiendo un aumento correspondiente del número de varones con cáncer de próstata, esperándose solo para esta década un aumento del 60%. La mortalidad ha aumento en un porcentaje inferior, pero en conjunto se ha doblado en los últimos 50 años. Aunque la enfermedad se diagnostica de forma típica en varones de una edad superior a los 65 años, su impacto sigue siendo significativo por el hecho de que la esperanza media de vida de los varones que mueren por cáncer de próstata se ha reducido en 9-10 años. Si se detecta, el cáncer de próstata en fase inicial puede curarse actualmente por cirugía en aproximadamente el 90% de los casos. Por desgracia, la enfermedad se convierte lentamente en fatal cuando el tumor se propaga fuera de la zona de la glándula y forma metástasis en zonas distantes. La detección temprana de la enfermedad, cuando todavía se halla confinada en la glándula de la próstata, y la acotación cuidadosa para efectuar la selección de la terapia apropiada puede contribuir a mejorar los índices de mortalidad.

A pesar de los muchos avances registrados en años recientes, la precisión con la que se puede acotar un individuo que sufre cáncer de próstata no es todavía óptima. La principal razón de ello es que la expansión del tumor fuera de la próstata es generalmente microscópica y no macroscópica. El examen por tacto rectal de la próstata ha sido el principal método de detección local del cáncer de próstata durante muchas décadas, pero con él se suele subestimar el alcance de la enfermedad. Incluso el método de detección por ultrasonidos a través del recto tiene un valor limitado como medio de exploración del cáncer de próstata. La tomografía computerizada y el análisis por la imagen mediante resonancia magnética han resultado en general decepcionantes cuando se han aplicado a la detección del cáncer de próstata (Kirby, Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1, 2-10, 1997). Las estrategias recientes, muy prometedoras, de exploración del cáncer de próstata implican el uso de tecnologías bioquímicas y moleculares, centradas en las proteínas o en los correspondientes ácidos nucleicos, que se expresan con presencia en las células prostáticas (Lange, en: "Principles and Practice of Genitourinary Oncology", coord. Lippincott, editorial Raven Publishers, cap. 41, pp. 417-425, 1997). Los marcadores más notorios de la próstata son el PSA (prostate specific antigen) y el antígeno de PSM (prostate specific membrane).

El PSA es una glucoproteína secretada por el gen de PSA, ubicado en el cromosoma 19. Se expresa bajo control andrógeno por las células epiteliales de la glándula de la próstata y se secreta al plasma seminal. La proteína del PSA se halla normalmente confinada en la próstata, pero en el caso de enfermedad prostática, por ejemplo el cáncer o la BPH (hiperplasia benigna de próstata), se produce un vertido del PSA a la sangre, en la que está presente de diferentes formas, incluida una que está fijada sobre complejos proteicos y otra que no está fijada (El-Shirbiny, Adv. Clin. Chem. 31, 99, 1994). La medición de las concentraciones totales de PSA en suero es uno de los ensayos bioquímicos realizados con mayor frecuencia y aprobados por la FDA para la exploración y la gestión de pacientes con cáncer de próstata. Los estudios realizados hasta el presente sugieren que la exploración basada en el PSA junto con los exámenes por tacto rectal o por ultrasonidos transrectales aumentan las posibilidades de detección del cáncer de próstata en fase inicial, cuando se halla todavía localizado dentro de la glándula propiamente dicha (Brawer y col., J. Urol. 147, 841, 1992). El PSA del suero es útil también para el seguimiento de los pacientes después de la terapia, en especial después de una prostatectomía quirúrgica. Sin embargo, las mediciones del PSA total detectan también niveles anormalmente altos en un gran número de pacientes, que posteriormente se demuestra que no tienen cáncer de próstata. Recientemente, el programa de medir la proporción porcentual entre PSA libre y total parece aumentar la especificidad de la exploración de cáncer de próstata en los varones, cuyos valores de PSA se sitúan entre 4 y 10 ng/ml (Letran y col., J. Urol. 160, 426, 1998).

El gen de PSM codifica a la glucoproteína transmembrana expresada por las células epiteliales de la próstata normal, de hiperplasia benigna de próstata y, en mayor grado, del tejido prostático maligno. Se detectan también niveles bajos de PSM en otros tejidos (Israeli y col., Cancer Res. 54, 1807, 1994). El PSA y el PSM han sido también los objetivos de estrategias moleculares para la detección del cáncer de próstata empleando la RT-PCR (reverse transcription - polimerase chain reaction). Esta tecnología de amplificación de ácidos nucleicos es muy sensible y se utiliza para identificar células basándose en la expresión de RNA mensajeros específicos. Implica la preparación de muestras de RNA a partir de tejidos o de líquidos corporales, la transcripción inversa en cDNA y la amplificación de cDNA específicos mediante el uso de cebadores que toman como diana al gen concreto de interés. Los análisis de RT-PCR de la sangre, los nódulos linfáticos y la médula ósea de pacientes con cáncer de próstata empleando el PSA y el PSM han puesto de manifiesto la sensibilidad extraordinaria de esta estrategia. Sin embargo, el valor clínico de los ensayos moleculares todavía no se ha confirmado (Verkaik y col., Urol. Res. 25, 373, 1997; Gomella y col., J. Urol. 158, 326, 1997).

Sigue habiendo, pues, la necesidad de proporcionar un ensayo más sensible para diagnosticar el cáncer de próstata. Sigue habiendo también la necesidad de un ensayo mejor para la detección del cáncer de próstata. Existe también la necesidad de proporcionar un marcador de cáncer de próstata que sea más específico y más fiable para los métodos de detección, acotación y tratamiento del cáncer de próstata.

La presente invención satisface estas y otras necesidades.

Hace algunos años se descubrió un nuevo marcador del cáncer de próstata, el PCA3, mediante análisis de visualización diferencial destinado a detectar genes asociados con el desarrollo del cáncer de próstata (solicitud de patente internacional PCT/CA 98/00346). El PCA3 está localizado en el cromosoma 9 y se compone de 4 exones. Codifica por lo menos cuatro transcritos diferentes, que se generan por empalme y poliadenilación alternados. Mediante análisis RT-PCR se constató que la expresión del PCA3 se limita a la próstata y está ausente de los demás tejidos, incluidos los testículos, los ovarios, el pecho y la vejiga. El análisis "Northern Blot" indica que el PCA3 se ha expresado en alto grado en la gran mayoría de tipos de cáncer de próstata examinados (47 de 50), mientras que no se detecta expresión o es muy baja en las células de próstata normales o de hiperplasia benigna de próstata de los mismos pacientes. Hay una sobreexpresión, por lo menos 20 veces mayor, del PCA3 en los carcinomas de próstata, si se compara con los tejidos normales o de BPH. La expresión del PCA3 parece aumentar con el grado del tumor y se detecta en lesiones por metástasis.

Resumiendo, la detección del cáncer de próstata basada en marcadores específicos, por ejemplo el PSA y el PSM, es una estrategia muy prometedora para la gestión de la enfermedad. El inconveniente de utilizar el PSA o el PSM para la detección del cáncer de próstata estriba en que se expresan tanto en las células normales como en las cancerosas. Además, los tumores poco diferenciados pueden pasar inadvertidos al diagnóstico, ya que tienden a producir mucha menos proteína PSA que los tumores menos agresivos. Así ocurre en el 10% de los casos de cáncer de próstata. Por otro lado, el PCA3 se expresa diferencialmente en células de próstata cancerosas y normales y su expresión no disminuye cuando aumenta el grado del tumor. El PCA3 podría ser, pues, una herramienta útil que permitiría superar los inconvenientes del PSA y del PSM en el diagnóstico, detección y tratamiento de los pacientes con cáncer de próstata.

La invención se refiere al descubrimiento de distintos RNA de PCA3 asociados con un estado maligno y no maligno de la próstata.

La invención se refiere además a la identificación de que un equilibrio entre el nivel de estos mRNA de PCA3 guarda relación directa con el estado maligno o no maligno de la próstata.

Uno de estos RNA corresponde a una molécula de RNA de PCA3 que tiene una secuencia adicional de 228 bp (representada en la SEQ ID NO 1), insertada entre los exones 3 y 4a, mientras que el otro carece de secuencia adicional (SEQ ID NO 2). El RNA que carece de secuencia adicional está asociado con el cáncer de próstata, mientras que el RNA que la contiene está asociado con un estado no maligno de la próstata. Basándose en la expresión diferencial de estas dos especies de RNA de PCA3, se proporcionan protocolos para el diagnóstico de enfermedades de próstata. Los descubrimientos anteriores podrían conducir además a una estrategia terapéutica para tratar el cáncer de próstata.

La invención se refiere además a reactivos y métodos para evaluar el estado de la próstata en un animal, que consisten en una determinación cuantitativa de la SEQ ID NO: 1 o de fragmentos o variantes de la misma, con respecto a la SEQ ID NO: 2 o fragmentos o variantes de la misma.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al descubrimiento y caracterización de una nueva secuencia expresada en el mRNA de PCA3, que permite la determinación del estado de la próstata de un animal, basándose en la determinación de la abundancia relativa de dos mRNA de PCA3 expresados diferencialmente.

La invención proporciona en general moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican a los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente de la presente invención y a variantes o porciones de los mismos, que conservan su capacidad de permitir la determinación del estado de la próstata.

La invención proporciona además polipéptidos purificados, codificados por los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente, de la presente invención o una porción de fijación a epítope de los mismos.

La invención proporciona también ácidos nucleicos para la detección específica de la presencia de mRNA de PCA3 expresados diferencialmente, asociados con el cáncer de próstata o proteínas o polipéptidos codificados por tales mRNA en una muestra.

La invención proporciona además un método "in vitro" para la detección de ácido nucleico que codifica a los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente.

Se describe además un kit para la detección de la presencia de ácido nucleico que codifica a los mRNA de PCA3, expresados diferencialmente, en una muestra.

La invención proporciona además un método para la detección de mRNA de PCA3, expresados diferencialmente, en una muestra. Proporciona además un método para medir la cantidad de mRNA de PCA3, expresados diferencialmente, en una muestra.

La invención se refiere también a un kit de diagnóstico que consta de un primer recipiente que contiene moléculas de ácido nucleico, específico de los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente, y un segundo recipiente que contiene una sonda, específica de los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente.

La invención se refiere además a métodos de diagnóstico de enfermedades humanas, en particular del cáncer de próstata. Proporciona, con preferencia, un método de diagnóstico de la presencia o de la predisposición para desarrollar el cáncer de próstata en un paciente.

Después de haber identificado la expresión diferencial de los mRNA como marcadores del estado prostático de un animal y, más en concreto, después de haber puesto de manifiesto que la presencia de la secuencia adicional, que interrumpe a la secuencia codificadora de la proteína codificada PCA3, guarda relación directa con un cáncer maligno, la presente invención proporciona los medios para interrumpir la secuencia codificadora de la proteína PCA3, empleando cualquier método de ingeniería genética, ya conocido por los expertos, y evalúa si tal interrupción puede invertir el fenotipo maligno.

Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de los términos empleados en la presente invención se facilita a continuación un gran número de definiciones.

Tal como se emplea aquí, la terminología "estado no maligno de la próstata" indica un estado prostático no canceroso. Por lo tanto, esta terminología incluye un estado normal y un estado prostático benigno (por ejemplo, la
BPH).

Dado que los marcadores diferenciadores entre estado prostático maligno y no maligno actúan a nivel de mRNA y de proteína (es decir, un marcador expresado), una de las ventajas de la presente invención es permitir la diferenciación del estado prostático en un animal utilizando un gran número de medios a disposición de los expertos. Los ejemplos no limitadores de tales medios incluyen las sondas de ácido nucleico, los anticuerpos, los ligandos y los PNA, en células que pueden obtenerse fácilmente que expresan estos marcadores diferenciadores. Un ejemplo no limitante de los mismos son los linfocitos, que permiten la diferenciación a partir de una simple muestra de
sangre.

El término "muestra" empleado aquí indica en sentido lato todos los tipos de muestras de un animal, en las que pueda analizarse la expresión diferencial de ácidos nucleicos o de proteínas de PCA3 de cadena corta y/o larga de la presente invención. Los ejemplos no limitantes de las mismas incluyen las biopsias, la sangre, los aspirados con aguja fina, la orina y la médula ósea.

Las secuencias de nucleótidos se presenta en esta descripción mediante una hebra simple, en la dirección de 5' a 3', de izquierda a derecha, empleando los símbolos de nucleótidos de una sola letra, que se utilizan habitualmente en la técnica y con arreglo a las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y tecnológicos y la nomenclatura empleados en esta descripción tienen los mismos significados que entienden normalmente los expertos del ámbito científico, al que pertenece esta invención. En general, los procedimientos para los cultivos celulares, la infección, los métodos de biología molecular y similares son los habituales que se aplican en la técnica. Estos métodos estándar se describen en manuales de referencia, por ejemplo el de Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, editorial Cold Spring Harbor Laboratories) y Ausubel y col. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Nueva York).

La presente descripción emplea un gran número de términos de la tecnología del DNA recombinante (rDNA) usados habitualmente. Sin embargo, por razones de claridad y de consistencia se facilitan las definiciones de ejemplos selectos de tales términos de rDNA.

Tal como se emplea en esta descripción, "molécula de ácido nucleico" indica un polímero de nucleótidos. Los ejemplos no limitantes de ello incluyen las moléculas de DNA (es decir, DNA genómico, cDNA) y RNA (es decir, mRNA). La molécula de ácido nucleico puede obtenerse por técnicas de clonación o sintetizarse. El DNA puede tener doble hebra o hebra simple (hebra codificadora o hebra no codificadora [antisentido]).

El término "DNA recombinante" ya conocido por la técnica indica una molécula de DNA que resulta de unir segmentos de DNA. A menudo se denomina también ingeniería genética.

El término "segmento de DNA", empleado aquí, indica una molécula de DNA que contiene un tramo o secuencia lineal de nucleótidos. Cuando esta secuencia se lee con arreglo al código genético, puede codificar a un tramo o secuencia lineal de aminoácidos, que se denomina polipéptido, proteína, fragmento de proteína y similares.

El término "par de amplificación" indica un par de oligonucleótidos (óligos) de la presente invención que se seleccionan para utilizarse juntos para amplificar una secuencia seleccionada de ácido nucleico mediante uno de los muchos tipos de procedimientos de amplificación, con preferencia la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Otros tipos de procesos de amplificación incluyen la reacción en cadena de ligasa (LCR), la amplificación con desplazamiento de hebra o la amplificación basada en secuencias de aminoácidos, tal como se explica seguidamente con mayor detalle. Tal como se conoce habitualmente en la técnica, los óligos se diseñan para fijarse sobre una secuencia complementaria en condiciones seleccionadas.

En una forma particular de ejecución de los métodos y usos de la invención, la amplificación de la muestra de ácido nucleico de un paciente se lleva a cabo en condiciones que favorecen la amplificación del ácido nucleico más abundante y expresado diferencialmente. En una forma preferida de ejecución de los métodos y usos de la invención se lleva a cabo una RT-PCR en una muestra de mRNA de un paciente en condiciones que favorecen la amplificación del mRNA de PCA3 más abundante. En otra forma de ejecución de los métodos y usos de la invención, la amplificación de los ácidos nucleicos de PCA expresados diferencialmente se lleva a cabo simultáneamente. Como es obvio, los expertos en la materia se darán cuenta de que tales métodos pueden adaptarse a la detección de proteínas expresadas diferencialmente en lugar de secuencias de ácido nucleico expresadas diferencialmente.

El ácido nucleico (es decir, DNA o RNA) para la puesta en práctica de la presente invención puede obtenerse con arreglo a métodos bien conocidos.

Las sondas o los cebadores de tipo oligonucleótido que pueden utilizarse en la presente invención pueden tener cualquier longitud idónea, en función del forma de ensayo concreto y de las necesidades particulares de los genomas diana empleados. En general, las sondas o los cebadores de tipo oligonucleótido tienen por lo menos una longitud de 12 nucleótidos, con preferencia entre 15 y 24 moléculas y pueden adaptarse para que encajen especialmente en un sistema elegido de amplificación de ácidos nucleicos. Como ya es conocido habitualmente en la técnica, las sondas y cebadores de tipo oligonucleótido pueden diseñarse tomando en consideración el punto de fusión de hibridación de los mismos con su secuencia diana (véase más abajo y el manual de Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, 2ª edición, ed. CSH Laboratories; o Ausubel y col., 1994, en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., N.Y.).

El término "oligonucleótido" o molécula o secuencia de "DNA" indica una molécula formada por los desoxirribonucleótidos de adenina (A), guanina (G), timina (T) y/o citosina (C). Cuando adopta la forma de doble hebra, puede contener o incluir un "elemento regulador" según la presente invención, término que se define en esta descripción. El término "oligonucleótido" o "DNA" puede estar presente en moléculas o fragmentos lineales de DNA, en virus, en plásmidos, en vectores, en cromosomas o en DNA derivado sintéticamente. Tal como se emplea aquí, las secuencias concretas de DNA de doble hebra pueden describirse con arreglo a la convención normal de escribir la secuencia únicamente en la dirección de 5' a 3'. Hay que advertir además que "oligonucleótido" puede tener la forma de hebra simple.

La "hibridación de ácidos nucleicos" indica en general una hibridación de dos moléculas de ácido nucleico de hebra simple, que tienen secuencias de bases complementarias, que en condiciones apropiadas formarán una estructura de doble hebra, favorecida termodinámicamente. Los ejemplos de hibridación pueden encontrarse en los dos manuales de laboratorio mencionados anteriormente (Sambrook y col., 1989, lugar citado; y Ausubel y col., 1994, lugar citado) y que son de dominio general en la técnica. En el caso de hibridación con un filtro de nitrocelulosa, por ejemplo según el procedimiento bien conocido Southern Blotting, el filtro de nitrocelulosa puede incubarse a 65ºC durante una noche con una sonda marcada en una solución que contiene un 50% de formamida, contenido alto de sal (5 x SSC o 5 x SSPE), 5 x solución de Denhardt, 1% de SDS y 100 \mug/ml de DNA portador (carrier) desnaturalizado (p.ej. DNA de esperma de salmón). La sonda de fijación no específica puede eliminarse seguidamente por lavado del filtro varias veces con 0,2 x SSC/0,1% de SDS a una temperatura que se elige con vistas a la restricción (stringency) deseada: temperatura ambiente (restricción baja), 42ºC (restricción moderada) o 65ºC (restricción elevada). La temperatura elegida se basa en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de DNA. Obviamente pueden sintetizarse y detectarse también los híbridos de RNA-DNA. En tales casos, las condiciones de hibridación y de lavado pueden adaptarse con arreglo a métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Se emplearán con preferencia condiciones restrictivas (stringent) (ver Sambrook y col., 1989, lugar citado).

Las sondas que puede utilizarse según la invención pueden depositarse sobre sustratos de origen natural, por ejemplo estructuras de azúcar-fosfato, ditionatos, alquil-fosfonatos, \alpha-nucleótidos y similares. Las estructuras de azúcar-fosfato modificados se describen en general en Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23, 295 y en Moran y col. 1987, Nucleic acid molecule, Acids Res. 14, 5019. Las sondas que pueden utilizarse en la invención pueden construirse de ácido ribonucleico (RNA) o de ácido desoxirribonucleico (DNA) y con preferencia de DNA.

Los tipos de métodos de detección, en los que pueden utilizarse sondas incluyen el Southern Blot (detección de DNA), las manchas realizadas con puntos o con rayas (dot or slot blots) (DNA, RNA) y el Northern Blot (detección de RNA). Aunque menos preferidas, las proteínas marcadas pueden utilizarse también para detectar una secuencia concreta de ácido nucleico, a la que se unen aquellas. En fecha más recientes se han descrito los PNA (Nielsen y col., 1999, Current Opin. Biotechnol. 10, 71-75). Los PNA pueden utilizarse para detectar los mRNA de la presente invención. Otros métodos de detección incluyen kits que contienen sondas en una forma de presentación de tipo varilla de nivel (dipstick) y similares.

Aunque la presente invención no depende específicamente del uso de un marcador para la detección de una secuencia concreta de ácido nucleico, tal marcador puede ser beneficioso ya que puede aumentar la sensibilidad de la detección. Además permite la automatización. Las sondas pueden marcarse con arreglo a numerosos métodos bien conocidos (Sambrook y col., 1989, lugar citado). Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen el H^{3}, C^{14}, P^{32} y S^{35}. Los ejemplos no limitantes de marcadores detectables incluyen a ligandos, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. Otros marcadores detectables que pueden utilizarse con las sondas incluyen a la biotina y a los radionucleótidos. Los expertos en la materia verán obviamente que la elección de un marcador concreto conlleva una forma concreta de unión a la sonda.

Ya es conocido en general que los nucleótidos radiactivos pueden incorporarse a las sondas de la invención por varios métodos. Los ejemplos no limitantes incluyen el tratamiento con quinasas de los extremos 5' de las sondas empleando ATP-gamma-P^{32} y quinasas de tipo polinucleótido, utilizando el fragmento de Klenow de Pol I de E. coli en presencia de dNTP radiactivo (es decir, sonda de DNA marcada uniformemente empleando cebadores de oligonucleótidos aleatorios en geles de bajo punto de fusión), empleando el sistema SP6/T7 para transcribir un segmento de DNA en presencia de uno o varios NTP radiactivos y similares.

Tal como se emplea aquí, "oligonucleótidos" u "óligos" define una molécula que tiene dos o más nucleótidos (ribo- o desoxirribonucleótidos). El tamaño del óligo puede venir dictado por la situación particular y en último término por el uso concreto del mismo y los expertos en la materia sabrán adaptarlo en consecuencia. Un oligonucleótido puede sintetizarse químicamente o derivarse por clonación con arreglo a métodos bien conocidos.

El término "cebador" indica un oligonucleótido que es capaz de fusionarse sobre una secuencia diana, creando así una región de doble hebra que en condiciones idóneas puede servir como punto de inicio de la síntesis de DNA.

La amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada o diana puede efectuarse por un gran número de métodos idóneos. Véase, en general, Kwoh y col., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25. Se han descrito numerosas técnicas de amplificación que pueden adaptarse fácilmente para satisfacer las demandas concretas de un experto en la materia. Los ejemplos no limitantes de técnicas de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con desplazamiento de hebra (SDA), la amplificación basada en la transcripción, el sistema de replicasa Q\beta y NASBA (Kwoh y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Lizardi y col., 1988, BioTechnology 6, 1197-1202; Malek y col., 1994, Methods Mol. Biol. 28, 253-260; y Sambrook y col., 1989, lugar citado). La amplificación se lleva a cabo con preferencia empleando la PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo con arreglo a técnicas bien conocidas. Véase, p.ej. las patentes US-4 683 195; 4 683 202; 4 800 159; y 4 965 188 (las descripciones de las cuatro patentes US se incorporan a la presente como referencias). En general la PCR consiste en un tratamiento de la muestra de ácido nucleico (p.ej. en presencia de una polimerasa de DNA estable al calor) en condiciones de hibridación, con un cebador oligonucleótido para cada hebra de la secuencia concreta que se pretende detectar. Un producto de extensión de cada cebador, que se sintetiza, es complementario de cada una de las dos hebras de ácido nucleico, siendo los cebadores lo suficientemente complementarios de cada hebra de la secuencia concreta para hibridarse con ella. El producto de extensión sintetizado a partir de cada cebador puede ser también como molde para la ulterior síntesis de productos de extensión empleando los mismos cebadores. Después de un número suficiente de ciclos de síntesis de productos de extensión se analiza la muestra para evaluar si está presente la secuencia o secuencias a detectar. La detección de la secuencia amplificada puede llevarse a cabo por visualización después de una tintura con EtBr del DNA después de la electroforesis a través de gel, o bien utilizando un marcador detectable con arreglo a técnicas ya conocidas, y similares. Para un repaso de las técnicas PCR (véase PCR Protocols, A Guide to Methods and Aplications, Michael y col. (coord.), editorial Acad. Press, 1990).

La reacción en cadena de la ligasa (LCR) se lleva a cabo con arreglo a técnicas conocidas (Weiss, 1991, Science 254, 1292). La adaptación del método para satisfacer las demandas concretas podrán efectuarla los expertos en la materia. La amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) se lleva a cabo con arreglo a técnicas conocidas o adaptaciones de las mismas para satisfacer requisitos concretos (Walker y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396; y los mismos, 1992, Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696).

Tal como se emplea aquí, el término "gen" tiene el significado bien conocido de la técnica y se refiere a una secuencia de ácido nucleico que define a una proteína individual o a un polipéptido. Un "gen estructural" indica una secuencia de DNA que se transcribe a un RNA y se traduce en una proteína que tiene una secuencia específica de aminoácidos, dando lugar de este modo a un polipéptido o proteína específicos. Los expertos en la materia advertirán fácilmente que la secuencia de ácido nucleico de la invención puede incorporarse a cualquiera de los numerosos formatos de kit establecidos, que son bien conocidos en la técnica.

Una región "heteróloga" (es decir, de un gen heterólogo) de una molécula de DNA es un subsegmento de DNA dentro de un segmento mayor, que en la naturaleza no está asociado con él. El término "heterólogo" puede utilizarse igualmente para definir dos segmentos de polipéptidos que no estén unidos entre sí en la naturaleza. Los ejemplos no limitantes de genes heterólogos incluyen los genes informantes (reporter), tales como la luciferasa, la cloranfenicol-acetil-transferasa, la \beta-galactosidasa y similares, que pueden yuxtaponerse o unirse a las regiones heterólogas de control o a polipéptidos heterólogos.

El término "vector" ya se conocido habitualmente en la técnica y define un DNA plásmido, un DNA fago, un DNA vírico y similares, que pueden servir como vehículos de DNA, en el que puede clonarse el DNA definido aquí. Existen numerosos tipos de vectores que son bien conocidos en la técnica.

El término "expresión" define un proceso, mediante el cual se transcribe un gen a un mRNA (transcripción), después se traduce el mRNA (traducción) a un polipéptido (o proteína) o varios.

El término "vector de expresión" define un vector o un vehículo, ya descrito antes, pero diseñado para permitir la expresión de una secuencia insertada a raíz de la transformación en un hospedante. Los genes clonados (secuencia insertada) se emplean normalmente bajo el control de las secuencias de un elemento de control, por ejemplo las secuencias de un promotor. La colocación de un gen clonado bajo el control de tales secuencias se denomina a menudo como unión operativa con los elementos o secuencias de control.

Las secuencias unidas operativamente pueden incluir también dos segmentos que se transcriben al mismo transcrito de RNA. Por lo tanto, dos secuencias, tales como una secuencia promotora y una secuencia "informante" están unidas operativamente si la transcripción que comienza en el promotor produce un transcrito de RNA de la secuencia informante. Con el fin de estar "unidas operativamente" no es necesario que las dos secuencias sean inmediatamente adyacentes una de otra.

Las secuencias de control de expresión pueden variar en función de si el vector se ha diseñado para expresar el gen unido operativamente a un hospedante procariota o eucariota o ambos (vectores lanzadera) y puede contener además elementos de transcripción, por ejemplo elementos mejoradores (enhancer), secuencias de terminación, elementos de especificidad de tejido y/o sitios de iniciación y de terminación de la traducción.

Las expresiones procariotas son útiles para la obtención de grandes cantidades de la proteína codificada por la secuencia de DNA de interés. Esta proteína puede purificarse con arreglo a protocolos estándar, que se basan en la ventaja de las propiedades intrínsecas de la misma, por ejemplo su tamaño y carga (p.ej. la electroforesis a través de gel SDS, la filtración a través de gel, la centrifugación, la cromatografía de intercambio iónico, etc.). Además, la proteína de interés puede purificarse mediante cromatografía de afinidad empleando anticuerpos monoclonales o policlonales. La proteína purificada puede utilizarse para aplicaciones terapéuticas.

El constructo de DNA puede ser un vector que contenga un promotor que esté unido operativamente a una secuencia de oligonucleótido descrita en esta solicitud, que a su vez esté unida operativamente a un gen heterólogo, por ejemplo el gen de la molécula informante (reporter) de luciferasa. El término "promotor" significa una región reguladora de DNA, capaz de fijarse directa o indirectamente sobre la polimerasa de RNA en una célula y de iniciar la transcripción de una secuencia codificadora hacia la línea de salida (downstream, en dirección a 3'). El promotor puede estar unido por su extremo 3' con el sitio de iniciación de la transcripción y entenderse hacia la línea de entrada (upstream, en dirección a 5') para incluir el número mínimo de bases o de elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima de la línea de fondo. Dentro del promotor se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (definido de modo conveniente por el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de fijación de proteína (secuencias de consenso), que son las que efectúan la fijación de la polimerasa de RNA. Los promotores eucariotas contienen a menudo, no siempre, recuadros (boxes) "TATA" y recuadros "CCAT". Los promotores procariotas contienen -10 y -35 secuencias de consenso, que sirven para iniciar la transcripción y los productos transcritos contienen una secuencia de Shine-Dalgarno, que sirve como secuencia de fijación de ribosoma durante la iniciación de la traducción.

Tal como se emplea aquí, el término "derivado funcional", en el contexto de un derivado funcional de una secuencia ya sea de ácido nucleico, ya sea una secuencia de aminoácidos, denota una molécula que conserva la actividad biológica (ya sea funcional, ya sea estructural), de modo que esta es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Este derivado funcional o equivalente puede ser un derivado natural o puede prepararse por síntesis. Tales derivados incluyen a las secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de uno o de varios aminoácidos, con la condición de que se conserve la actividad biológica de la proteína. Lo mismo se aplica a derivados de secuencias de ácidos nucleicos, que pueden tener sustituciones, deleciones o adiciones de uno o de varios nucleótidos, con la condición que se mantenga en general la actividad biológica de la secuencia. Referido a una secuencia de proteína, el aminoácido sustituyente tiene propiedades físico-químicas similares a las del aminoácido sustituido. Las propiedades físico-químicas similares incluyen la similitud de carga, de voluminosidad, de carácter hidrófobo, de carácter hidrófilo y similares. El término "derivados funcionales" incluye a "fragmentos", "segmentos", "variantes", "análogos" y "derivados químicos".

Por lo tanto, el término "variante" indica aquí una proteína o molécula de ácido nucleico que es sustancialmente similar en estructura y en actividad biológica a la proteína o ácido nucleico descrito en esta invención.

Los derivados funcionales pueden sintetizarse químicamente o producirse por tecnología de DNA recombinante. Todos estos métodos son ya conocidos en la técnica.

Tal como se emplea aquí, el término "derivados químicos" indica restos químicos adicionales que normalmente no forman parte del objeto de la presente invención. Tales restos pueden afectar las propiedades físico-químicas del derivado (p.ej. la solubilidad, la absorción, la vida media y similares, una menor toxicidad). Tales restos se ilustran en el manual de Remington: Pharmaceutical Sciences (1980). Los métodos para unir estos restos químicos a un péptido son bien conocidos en la técnica.

El término "alelo" indica una forma alternativa de un gen, que ocupa un lugar determinado de un cromosoma.

Como ya es conocido en general, una "mutación" es un cambio detectable del material genético, que puede transmitirse a una célula hija. Ya es bien conocido que una mutación puede ser, por ejemplo, un cambio detectable en uno o en varios desoxirribonucleótidos. Por ejemplo, los nucleótidos pueden añadirse, suprimirse, sustituirse por, invertirse o trasponerse a una nueva posición. Existen mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas experimentalmente. El resultado de una mutación de una molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico mutante. Un polipéptido mutante puede codificarse desde esta molécula de ácido nucleico mutante.

Tal como se emplea aquí, el término "purificado" indica una molécula que se ha separado de un componente celular. Por ejemplo, una "proteína purificada" es la que se ha purificado hasta un nivel que no se encuentra en la naturaleza. Una molécula "sustancialmente pura" es una molécula que falta en todos los demás componentes celulares.

Tal como se emplea aquí, los términos "molécula", "compuesto" o "agente" se utilizan indistintamente y en sentido lato para indicar moléculas o compuestos naturales, sintéticos o semisintéticos. El término "molécula" indica por tanto, por ejemplo, compuestos químicos, macromoléculas, extractos celulares o de tejidos (de plantas o de animales) y similares. Los ejemplos de moléculas incluyen las moléculas de ácidos nucleicos, péptidos, ligandos, incluidos los anticuerpos, hidratos de carbono y agentes farmacéuticos. Los agentes pueden elegirse y explorarse con una gran variedad de medios, incluida la exploración aleatoria, la selección racional y el diseño racional, empleando por ejemplo métodos de modelado de proteínas o de ligandos, por ejemplo el modelado computerizado. El término "seleccionado racionalmente" o "diseñado racionalmente" se emplea para definir compuestos que se han elegido en base a la configuración de los dominios de interacción de la presente invención. Los expertos en la materia ya entienden que las macromoléculas que tienen modificaciones que no son de origen natural se incluyen también dentro del alcance del término "molécula". Por ejemplo, los peptidomiméticos, bien conocidos en la industria farmacéutica y denominados en general análogos de péptidos, pueden generarse por el modelado recién mencionado. De manera similar, los polipéptidos descritos en esta solicitud pueden modificarse para mejorar su estabilidad. Se da por supuesto que en la mayoría de casos, esta modificación no altera la actividad biológica de la proteína. Las moléculas identificadas con arreglo a las enseñanzas de la presente invención tienen un valor de diagnóstico de enfermedades o estados patológicos, en los que la fisiología o la homeostasis de la célula y/o del tejido está comprometida por un defecto de la expresión de los mRNA del PCA3. Como alternativa, las moléculas identificadas con arreglo a las enseñanzas de la presente solicitud pueden ser útiles para el desarrollo de compuestos que pueden modular la expresión de un mRNA de PCA3 expresado diferencialmente o modular la actividad o el nivel de una proteína codificada por el mismo.

Tal como se emplea aquí, agonistas y antagonistas incluyen también potenciadores de compuestos conocidos que tienen las propiedades de tal agonista o antagonista.

Los moduladores del nivel o de la actividad de la proteína PCA3 que carecen de la secuencia adicional descrita en esta solicitud pueden identificarse y seleccionarse poniendo en contacto la célula indicadora con un compuesto o una mezcla o biblioteca de moléculas durante un período predeterminado de tiempo.

La proteína PCA3 que contiene la secuencia adicional puede actuar de control.

Se describen también moléculas de ácido nucleico antisentido, que pueden utilizarse por ejemplo para disminuir o eliminar la expresión del mRNA del PCA3 que carece de la secuencia adicional descrita en esta invención o la expresión de la proteína codificada por él. Una molécula de ácido nucleico antisentido proporcionada aquí significa una molécula capaz de formar un dúplex o tríplex estable con una porción de su secuencia de ácido nucleico diana (DNA o RNA). El uso de moléculas de ácido nucleico antisentido y el diseño y modificación de tales moléculas es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en los documentos WO 96/32966, WO 96/11266, WO 94/15646, WO 93/08845 y US-5 593 974. Las moléculas de ácido nucleico antisentido descritas aquí pueden derivarse de las moléculas de ácido nucleico y modificarse con arreglo a métodos bien conocidos. Por ejemplo, algunas moléculas antisentido pueden diseñarse para que sean más resistentes a la degradación, para aumentar su afinidad con su secuencia diana, para facilitar su transporte hacia los tipos de células o hacia compartimentos celulares elegidos y/o para mejor su solubilidad en lípidos mediante el empleo de análogos de nucleótido y/o sustituyendo fragmentos elegidos químicamente de los mismos, como ya es bien sabido en la técnica.

Para identificar antagonistas puede utilizarse una célula indicadora. Por ejemplo, la molécula o moléculas ensayadas se incuban con una célula hospedante en combinación con uno o varios agonistas, que se mantienen en una concentración predeterminada. La indicación y fuerza relativa de las propiedades antagonistas de la o las moléculas puede obtenerse comparando el nivel de expresión genética de la célula indicadora en presencia del agonista, en ausencia de las moléculas ensayadas frente a la presencia de los mismos. Evidentemente, el efecto antagonista de una molécula puede determinarse también en ausencia del agonista, comparando simplemente el nivel de expresión del gen informante (reporter) producto en presencia y en ausencia de la o de las moléculas ensayadas.

Se da por supuesto que el modelo experimental "in vivo" puede utilizarse también para efectuar un ensayo "in vitro". Por ejemplo pueden prepararse extractos celulares de las células indicadoras y utilizarse en uno de los ensayos "in vitro" ya mencionados.

Tal como se emplea aquí, la expresión "células indicadoras" indica células que expresan un mRNA de PCA3 expresado diferencialmente con arreglo a la presente invención. La proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico puede unirse a un fenotipo o característica identificable o seleccionable. Tales células indicadoras pueden utilizarse en ensayos de exploración de la presente invención. Las células indicadoras pueden diseñarse para que expresen un derivado, fragmento, homólogo o mutante elegido del mRNA del PCA3 expresado diferencialmente de la presente invención. Las células pueden ser células de levadura o células eucariotas superiores, por ejemplo células de mamíferos. Cuando se tiene que identificar un reactivo de unión de la proteína PCA3, la interacción entre los dos reactivos deberá ser capaz de servir de diana para la modulación de la actividad de esta proteína codificada por PCA3.

La célula indicadora puede ser una célula de levadura que albergue vectores que permitan el uso de la tecnología de dos híbridos, bien conocida en la técnica (Ausubel y col., 1994, lugar citado) y puede utilizarse para verificar un compuesto o una serie de compuestos. Un gen informante (reporter) que codifica a un marcador seleccionable o a una proteína ensayable puede estar unido operativamente a un elemento de control, de tal manera que la expresión del marcador seleccionable o de la proteína ensayable dependa de la interacción de la proteína codificada por el PCA3 y su reactivo de unión. Tal célula indicadora puede utilizarse para explorar rápidamente y con gran eficacia una gran serie de moléculas a ensayar.

El gen informante puede ser la luciferasa o la \beta-Gal.

Puede ser útil expresar una proteína descrita en esta invención como proteína de fusión. El diseño de constructos para ello y la expresión y la producción de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica (Sambrook y col., 1989, lugar citado; y Ausubel y col., 1994, lugar citado).

Los ejemplos no limitadores de tales proteínas de fusión incluyen una fusión de hematoglutinina y una fusión de glutiona-S-transferasa (GST) y una fusión de proteína de fijación de maltosa (MBP). En ciertas formas de ejecución puede ser útil introducir un sitio de rotura para proteasa entre las dos secuencias de polipéptido, que se han fusionado. Estos sitios de rotura con proteasa entre los polipéptidos fusionados de forma heteróloga son bien conocidos en la técnica.

Puede ser beneficioso fusionar la proteína descrita en esta invención con secuencias de péptido señal para permitir una secreción de la proteína de fusión en una célula hospedante. En la técnica se conocen péptidos señal de diversos organismos. La OmpA bacteriana y la Suc2 de levadura son dos ejemplos no limitantes de proteínas que contienen secuencias de señal.

Puede ser también beneficioso introducir un engarce (linker) (conocido en general) entre el dominio de interacción y la porción de polipéptido heterólogo. Tal proteína de fusión se emplea en ensayos de la presente invención y con fines de purificación, con fines de detección y similares.

Para mayor seguridad, las secuencias y polipéptidos útiles para la puesta en práctica de la invención incluyen, sin limitarse a ellos, mutantes, homólogos, subtipos, alelos y similares. Se da por supuesto que en general las secuencias de la presente invención codificarán a una proteína PCA3 funcional (aunque defectuosa). Para los expertos en la materia está claro que, si el PCA3 descrito en esta invención, sus variantes, derivados o fragmentos conservan su función, entonces podrán determinarse aplicando las enseñanzas y ensayos descritos aquí y las enseñanzas generales de la técnica.

Tal como se ilustra a continuación, la proteína PCA3 descrita en esta invención puede modificarse por ejemplo mediante mutagénesis, para dilucidar la relación entre estructura y función de la misma y permitir un mejor diseño e identificación de los compuestos moduladores. Sin embargo, algunos derivados o análogos, que han perdido su función biológica, pueden resultar todavía útiles, por ejemplo para generar anticuerpos. Estos anticuerpos pueden utilizarse con fines de detección o de purificación. Estos anticuerpos podrían actuar además como inhibidores competidores o no competidores y constatarse que son moduladores de la actividad de la proteína PCA3, descrita en esta invención.

Una célula hospedante o una célula indicadora ha sido "transfectada" con un DNA exógeno o heterólogo (p.ej. un constructo de DNA), cuando tal DNA se ha introducido dentro de dicha célula. El DNA transfectado puede o no integrarse (unirse con enlace covalente) al DNA cromosómico, que constituye el genoma de la célula. En procariotas, levaduras y células de mamíferos, por ejemplo, el DNA transfectado puede mantenerse en un elemento episómico, por ejemplo un plásmido. En lo que respecta a las células eucariotas, una célula transfectada establemente es una célula en la que el DNA transfectado se convierte en integrado dentro de un cromosoma, de modo que las células hijas lo heredan por replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra con la capacidad que tienen las células eucariotas de establecer líneas celulares o clones formados por una población de células hijas que contienen el DNA transfectado. Los métodos de transfección son bien conocidos en la técnica (Sambrook y col., 1989, lugar citado; Ausubel y col., 1994, lugar citado). El uso de una célula de mamífero como indicadora puede proporcionar la ventaja de aportar un factor intermedio que permite por ejemplo la interacción de dos polipéptidos que se ensayan, que pueden no estar presentes en eucariotas o procariotas inferiores. Se da por supuesto que los extractos de células de mamíferos, por ejemplo, pueden utilizarse para compensar la falta de ciertos factores.

En general, las técnicas de preparación de anticuerpos (incluidos los anticuerpos monoclonales y los hibridomas) y de detección de antígenos empleando anticuerpos son bien conocidas en la técnica (Campbell, 1984, en: "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publisher, Amsterdam, Holanda; y en Harlow y col., 1988, en: Antibody -A Laboratory Manual, CSH Laboratories).

La presente invención se refiere además a anticuerpos policlonales, monoclonales y versiones humanizadas de los mismos, anticuerpos quiméricos y similares, que inhiben o neutralizan sus dominios de interacción respectivos y/o son específicos de los mismos.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico "in vitro" de la presencia de o de la predisposición para desarrollar cáncer de próstata y a un método "in vitro" de acotación del cáncer de próstata.

Por consiguiente, la presente invención proporciona también un kit para el diagnóstico y/o acotación del cáncer de próstata o de la predisposición para contraerlo, que contiene un ácido nucleico, una proteína o un ligando. Por ejemplo, un kit dividido en compartimentos puede incluir cualquier kit, en el que los reactivos están alojados en recipientes separados. Tales recipientes incluyen a los pequeños recipientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficaz de los reactivos de un compartimento a otro compartimento, de modo que las muestras y los reactivos no se contaminan entre sí y los agentes o soluciones de cada recipiente pueden añadirse de forma cuantitativa de un compartimento a otro. Tales recipientes incluyen un recipiente que recibirá la muestra a ensayar (DNA, proteína o células), un recipiente que contiene los cebadores empleados en el ensayo, recipientes que contienen enzimas, recipientes que contienen reactivos de lavado y recipientes que contienen los reactivos empleados para detectar los productos de extensión.

La invención proporciona también un kit que contiene el cebador oligonucleótido descrito en esta invención, que es específico de uno de los mRNA de PCA3 que carece de la secuencia adicional de la presente invención, o del mRNA de PCA3 que contiene la secuencia adicional de la presente invención.

Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes después de la descripción que sigue.

En las figuras se representa:

En la figura 1 se representa la estructura genómica del PCA3 y la ubicación de los oligonucleótidos empleados para la PCR.

En la figura 2 se representa un gel para la separación de los productos de la RT-PCR del PCA3, amplificados a partir de biopsias de tejidos de cáncer de próstata y de hiperplasia benigna de próstata, empleando los cebadores del ejemplo 1.

En la figura 3 se representan secuencias de ácido nucleico de los fragmentos de PCA3 amplificados por RT-PCR, con o sin la secuencia adicional de la presente invención. Las secuencias se amplifican empleando cebadores de PCR ubicados en el exón 3 y en el exón 4a. Las secuencias de los cebadores se representan con letra negrita. Las letras mayúsculas indican los ácidos nucleicos comunes a ambas secuencias.

En la figura 4 se representa la secuencia de aminoácidos prevista de los mRNA del PCA3 que contiene la secuencia adicional de la presente invención. Esta secuencia corresponde a los aminoácidos 1-23 del polipéptido PCA3 original.

Y en la figura 5 se representan ejemplos de péptidos PCA3 que llevan un epítope antigénico que consta de 8 aminoácidos (calculado con arreglo a H.G. Rammensee, en http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm).

La presente invención proporciona una molécula de mRNA de PCA3 expresada diferencialmente, aislada y/o purificada. Con preferencia el mRNA de PCA3 o la molécula de ácido nucleico contiene una secuencia de polinucleótido que es idéntica en un 90% (con mayor preferencia es idéntica en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) a la secuencia elegida entre el grupo formado por:

(a) una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido PCA3 expresado diferencialmente, que consta de una secuencia completa de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

(b) una secuencia de nucleótido complementaria de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) o (b).

La molécula de ácido nucleico aislada puede contener una secuencia de nucleótido mRNA de PCA3 expresado diferencialmente que tiene una identidad o similitud superior al 90% con la secuencia de nucleótido representada con la SEQ ID NO: 1 (con preferencia, superior al 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%).

La molécula de ácido nucleico aislada puede contener la secuencia de mRNA de PCA3 expresada diferencialmente, que carece de la secuencia adicional representada por la SEQ ID NO: 1.

En otra forma de ejecución de los métodos y usos de la invención, la molécula de ácido nucleico de secuencia de mRNA menos la secuencia adicional, expresada diferencialmente, codifica a la secuencia de aminoácidos de PCA3 expresada diferencialmente, representada por la SEQ ID NO: 3.

Aunque la solicitud de patente PCT CA 98/00346 describe un gran número de mRNA empalmados de modo alternativo, anterior a la presente invención, no había identificado ningún mRNA de PCA3 que contenga una secuencia adicional entre el exón 3 y el exón 4a. Además, tampoco se había realizado la identificación de esta secuencia adicional como marcador distintivo del estado de la próstata. Por otro lado, tampoco se ha efectuado la correlación entre el mRNA de PCA3 menos la secuencia adicional y el cáncer de próstata (como opuesta al mRNA de PCA3 que contiene la secuencia adicional en caso no existir cáncer de próstata [es decir, en próstata normal o en BPH]). Por lo tanto, la secuencia adicional del mRNA de PCA3 permite un pronóstico o diagnóstico de enfermedades prostáticas de un paciente. La molécula de ácido nucleico del PCA3 contiene con preferencia una secuencia de polinucleótido que es idéntica en un 90% (con mayor preferencia es idéntica en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) con uno de los mRNA expresados diferencialmente y descritos antes.

Se describen también en esta invención los equivalentes funcionales de las moléculas de ácido nucleico aisladas y descritas aquí y de los derivados de las mismas. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico representadas en la SEQ ID NO: 1 y en la SEQ ID NO: 2 pueden alterarse mediante sustituciones, adiciones o deleciones, que proporcionen moléculas funcionalmente equivalentes. Debido a la degeneración de las secuencias que codifican a los nucleótidos, en la práctica de esta invención pueden utilizarse otras secuencias de DNA que codifiquen sustancialmente a la misma secuencia de aminoácidos que se representa en la SEQ ID NO: 3.

Además, la secuencia de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que resulta de la adición, deleción o sustitución por lo menos de un nucleótido del extremo 5' y/o del extremo 3' de la fórmula de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 1 ó 2 o un derivado de la misma. En este sentido puede utilizarse cualquier nucleótido o polinucleótido, con la condición de que su adición, deleción o sustitución no altere sustancialmente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, que se codifica con la secuencia de nucleótidos que contiene la secuencia adicional. Además, la molécula de ácido nucleico descrita en esta invención puede tener, si fuera necesario, sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, añadidos a su extremo 5' y/o extremo 3'. Dentro de esta invención se incluyen, pues, todas las variaciones de la secuencia de nucleótidos que codifica al nucleótido PCA3 y fragmentos de la misma, si están permitidas por el código genético.

Además es posible suprimir (delete) codones o sustituir uno o varios codones por codones distintos a los codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero que tiene sustancialmente la misma actividad o utilidad que el polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico sin modificar. Tal como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos son funcionalmente equivalentes al igual que las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso en el caso de que las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no guarden relación con la degeneración del código genético.

Los expertos en la materia sabrán apreciar que los genomas contienen a menudo ligeras variaciones alélicas entre los individuos. Por consiguiente, la molécula aislada de ácido nucleico abarca también a las variaciones alélicas, en el supuesto de que la secuencia sea un derivado funcional de la secuencia codificadora del mRNA de PCA3 expresado diferencialmente. Si un alelo de PCA3 no codifica la secuencia idéntica a la representada por las SEQ ID NO: 1 ó 2, entonces podrá aislarse e identificarse como PCA3 empleando las mismas técnicas descritas aquí y especialmente las técnicas de la PCR para amplificar el gen apropiado con cebadores basados en las secuencias aquí descritas.

Los expertos en la materia advertirán que los organismos diferentes de los humanos pueden contener también mRNA de PCA3 expresados diferencialmente (por ejemplo eucariotas; más en concreto, mamíferos, aves, peces y plantas; más en concreto: gorilas, monos y chimpancés). La invención incluye pero no se limita a: los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente, aislados a partir de los organismos recién mencionados.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico incluyen también a las sintetizadas químicamente. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico con secuencia de nucleótido descrita aquí o que codifique a los productos del gen PCA3 expresados diferencialmente, descritos aquí, pueden diseñarse y, si es necesario, dividirse en fragmentos menores que sean apropiados. Así puede sintetizarse un oligómero que corresponda a la molécula de ácido nucleico o a cada uno de los fragmentos divididos. Estos oligonucleótidos sintéticos pueden obtenerse por ejemplo por el método del triéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191, 1981, o utilizando un sintetizador automático de DNA.

La presente invención proporciona además polipéptidos purificados, expresados diferencialmente (con preferencia sustancialmente puros), que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la descrita aquí para el PCA3 o un derivado funcional del mismo. El polipéptido tiene con preferencia la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 3 o un mutante o una variación del mismo o que tiene una similitud por lo menos del 80% o una similitud por lo menos del 90% con el mismo (con preferencia una identidad del 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o bien una similitud por lo menos del 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con el mismo) o por lo menos 6 aminoácidos contiguos del mismo (con preferencia por lo menos 10, 15, 20, 25 ó 50 aminoácidos contiguos del mismo).

Las muestras de la presente invención incluyen células, extractos proteicos, extractos de membranas celulares y líquidos biológicos. La muestra variará en base al formato del ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos empleados como muestras.

Como fuente del péptido descrito aquí puede utilizarse cualquier organismo, en el supuesto de que el organismo fuente contenga de forma natural dicho péptido.

Tal como se emplea aquí, la expresión "organismo fuente" indica un organismo original, a partir del cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la subunidad, con independencia del organismo en el que la subunidad se expresa y en último término del que se aísla la subunidad.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico para la detección específica de la presencia del ácido nucleico del PCA3 en una muestra, que consiste en las moléculas de ácido nucleico descritas antes o por lo menos un fragmento de las mismas, que se fija en condiciones restrictivas (stringent) al ácido nucleico del PCA3.

En una forma de ejecución, la presente invención proporciona sondas de ácido nucleico que son complementarias de la secuencia de nucleótidos que contiene por lo menos 10 nucleótidos consecutivos (con preferencia: 15, 18, 20, 25 ó 30) de la molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de polinucleótido que es idéntica por lo menos en un 90% con la secuencia elegida entre el grupo formado por:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido PCA3 que contiene la secuencia completa de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica al gen PCA3 que contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó 2;

(c) una secuencia de nucleótidos complementaria de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a) o de (b) y

(d) una secuencia de nucleótidos como la descrita previamente.

En una forma de ejecución del método recién descrito, se inmoviliza una sonda de ácido nucleico sobre un soporte sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a: plásticos, por ejemplo policarbonato, hidratos de carbono complejos, por ejemplo agarosa o Sepharose, y resinas acrílicas, por ejemplo la poliacrilamida y las bolas de látex. Los métodos para fijar las sondas de ácido nucleico sobre dichos soportes sólidos son bien conocidos en la técnica.

Las muestras a ensayar, idóneas para los métodos de sondas de ácidos nucleicos de la presente invención, incluyen por ejemplo las células, los extractos de ácidos nucleicos de células y los líquidos biológicos. Esta muestra empleada en los métodos recién descrito puede variar en base al formato del ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos que se van a ensayar. Los métodos para obtener los extractos de ácidos nucleicos de las células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado.

En otra forma de ejecución, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra, que consiste en: a) poner en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico descrita antes en condiciones de hibridación específicas, de modo que tenga lugar tal hibridación y b) detectar la presencia de la sonda fijada sobre la molécula de ácido nucleico. Los expertos en la materia sabrán seleccionar la sonda de ácido nucleico con arreglo a los métodos ya conocidos de la técnica, descritos anteriormente. Las muestras a analizar incluyen pero no se limitan a: muestras de RNA de tejidos humanos.

Después de haber identificado que la secuencia de PCA3 adicional descrita aquí puede utilizarse como marcador para distinguir entre estados malignos y no malignos de próstata, las sondas que son específicas para esta secuencia adicional (o variantes o fragmentos de la misma) pueden utilizarse también con arreglo a la presente invención. Evidentemente, dado que en ciertas formas de ejecución dichas sondas pueden detectar el DNA genómico, debería eliminar la señal positiva procedente del DNA genómico con el fin de detectar específicamente el mRNA de PCA3 expresado diferencialmente.

Aunque la presente invención se demuestra específicamente empleando cebadores que se hibridan con las secuencias del exón 3 y del exón 4a, los expertos en la materia comprenderán fácilmente que pueden utilizarse también cebadores derivados de otras regiones del PCA3. Por ejemplo, los cebadores podrían derivarse de secuencias del exón 2, del exón 4b, del exón 4c o de la secuencia adicional de los mismos. Los métodos para derivar dichos cebadores específicos a partir de secuencias conocidas son bien conocidos en la técnica.

La presente invención se refiere además a un kit para detectar la presencia de un mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra que contiene por lo menos un recipiente que tiene alojado en su interior la sonda de ácido nucleico descrita antes. El kit puede contener además uno o varios de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda de ácido nucleico fijada. Los ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a: sondas radiomarcadas, sondas marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina) y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina o estreptavidina).

Con mayor detalle, un kit dividido en compartimentos incluye cualquier kit en el que los reactivos están contenidos en recipientes separados. Tales recipientes incluyen pequeños recientes de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficaz de los reactivos de un compartimento a otro compartimento, de modo que las muestras y los reactivos no se contaminan entre sí y los agentes o soluciones de cada recipiente pueden añadirse en forma cuantitativa de un compartimento a otro. Tales recipientes incluyen un recipiente que recibirá la muestra a ensayar, un recipiente que contiene la sonda o los cebadores empleados en el ensayo, los recipientes que contiene reactivos de lavado (por ejemplo solución salina tamponada con fosfato, tampones Tris y similares) y recipientes que contiene los reactivos empleados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo fijado, el producto amplificado o similares.

Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que las sondas de ácido nucleico descritas aquí pueden incorporarse fácilmente a uno de los formatos establecidos de kit, que son bien conocidos en la técnica.

Las sondas o anticuerpos descritos aquí pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen: plásticos, por ejemplo policarbonato, hidratos de carbono complejos, por ejemplo agarosa o Sepharose, resinas acrílicas, por ejemplo poliacrilamida o bolas de látex. Los métodos para fijar anticuerpos sobre dichos soportes sólidos son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos inmovilizados pueden utilizarse para ensayos "in vitro", "in vivo" e "in situ" así como para la inmunocromatografía.

Se describe un método para detectar un polipéptido PCA3 expresado diferencialmente, en una muestra, que consiste en: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo descrito antes (o una proteína) en condiciones tales que se formen inmunocomplejos y b) detectar la presencia del anticuerpo fijado sobre el polipéptido. En concreto, los métodos consisten en incubar una muestra a analizar con uno o varios anticuerpos descritos aquí y ensayar si el anticuerpo se fija sobre la muestra a analizar. Los niveles relativos de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra permiten distinguir entre un estado prostático maligno y no maligno.

Se describe también un método para detectar un anticuerpo de PCA3 en una muestra, que consiste en: a) poner en contacto una muestra con la proteína PCA3 expresada diferencialmente, descrita antes, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos y b) detectar la presencia de la proteína fijada sobre el anticuerpo o del anticuerpo fijado sobre la proteína. En detalle, los métodos consiste en incubar una muestra a analizar con una o varias proteínas de la presente invención y detectar si el anticuerpo se ha fijado sobre la muestra.

Se describe también un kit que contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de detección mencionados anteriormente.

El kit contiene: i) un primer recipiente que contiene un anticuerpo descrito antes, e ii) un segundo recipiente que contiene un conjugado que consta de un reactivo de fijación del anticuerpo y un marcador.

El kit puede contener: i) un primer recipiente que contiene una proteína descrita antes y con preferencia ii) un segundo recipiente que contiene un conjugado que consta de un reactivo de fijación de la proteína y un marcador. Más específicamente, un kit de diagnóstico contiene una proteína PCA3 expresada diferencialmente, descrita anteriormente, para detectar anticuerpos en el suero de animales o seres humanos potencialmente infectados.

El kit descrito en esta invención puede contener además uno o varios recipientes que contengan uno o varios de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de anticuerpos fijados. Los ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos secundarios marcados o, como alternativa, si el anticuerpo primario está marcado, reactivos de fijación cromóforos, enzimáticos o de anticuerpo, que sean capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit dividido en compartimentos puede ser el descrito anteriormente para kits de sondas de ácido nucleico.

\newpage

Los expertos en la materia advertirán con facilidad que los anticuerpos descritos aquí pueden incorporarse fácilmente a uno de los formatos de kit ya establecidos y bien conocidos en la técnica.

Se da por supuesto que, aunque la siguiente discusión se centra específicamente en paciente humanos, las enseñanzas pueden aplicarse también a cualquier animal que exprese diferencialmente los mRNA de PCA3.

Los métodos de diagnóstico y de exploración de la invención pueden ser especialmente útiles para un paciente del que se sospecha que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con un nivel de expresión alterado del PCA3, en base a la historia familiar, o un paciente en el que se desee el diagnóstico de una enfermedad relacionada con el PCA3 (p.ej. el cáncer de próstata).

Según la invención, la exploración presintomática de un individuo que necesite tal exploración es posible ahora empleando un DNA que codifique a la proteína PCA3 o el gen de PCA3 de la invención o fragmentos del mismo. El método de exploración de la invención permite un diagnóstico presintomático de la presencia del mRNA de PCA3 menos la secuencia adicional del PCA3, expresado diferencialmente en individuos y por lo tanto una opinión respecto a la verosimilitud de que tales individuos puedan desarrollar o hayan desarrollado una enfermedad asociada con el PCA3 o tengan un estado prostático normal. Esto es especialmente útil para la identificación de portadores de genes PCA3 alterados, por ejemplo, individuos que tengan un historial familiar de enfermedades asociadas con el PCA3. El diagnóstico temprano es también deseable para maximizar el tiempo adecuado para la intervención.

En un método de exploración de la invención se toma una muestra de tejido de un individuo y se explora para detectar (1) la presencia del mRNA de PCA3 carente de la secuencia adicional de la presente invención; (2) la presencia de mRNA de PCA3 que contiene la secuencia adicional de la presente invención y/o (3) la presencia de la proteína PCA3 expresada diferencialmente. El mRNA de PCA3 puede caracterizarse y compararse para determinar (a) los niveles y/o (b) el tamaño del mRNA de PCA3 expresado diferencialmente. Finalmente, la proteína PCA3 expresada diferencialmente puede (a) detectarse y/o (b) cuantificarse empleando un ensayo biológico de la actividad de PCA3 o utilizando un ensayo inmunológico y anticuerpos de PCA3. De este modo, la presencia de un mRNA de PCA3 carente de la secuencia adicional (o un mRNA que no modifique y/o no interrumpa la secuencia codificadora de PCA3) y/o de la proteína codificada con ella indicaría que el paciente corre el riesgo de desarrollar cáncer de próstata o ha desarrollado cáncer de próstata. La presencia de un mRNA de PCA3 que contenga la secuencia adicional de la presente invención y/o de la proteína codificada por ella, en ausencia de mRNA de PCA3 carente de la secuencia adicional y/o de la proteína codificada por ella, indicaría que el paciente todavía no ha desarrollado cáncer de próstata y/o corre un riesgo bajo de desarrollar cáncer de próstata.

Los efectos terapéuticos de los ácidos nucleicos terapéuticos pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, invertir o modificar el proceso del mRNA de PCA3 expresado diferencialmente, carente de la secuencia adiciona descrita en esta invención. Además, la expresión de un mRNA de PCA3 expresado diferencialmente, que contenga la secuencia adicional descrita en esta invención, en un nivel más alto que el mRNA de PCA3 carente de la secuencia adicional, podría tener efectos de inversión del cáncer en las células.

Se describen también aquí composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz de por lo menos un oligonucleótido antisentido de un mRNA de PCA3 carente de secuencia adicional, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales óligos antisentido incluyen, pero no se limitan a: por lo menos una secuencia de oligonucleótido de una longitud de 12 a 500 bases, que es complementaria por lo menos de una porción de la SEQ ID NO: 2.

De este modo, en sentido lato, la invención proporciona medios para desplazar el equilibrio entre la cantidad de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente, de forma que se pueda modular el estado maligno de una célula.

La especificidad de expresión genética en las células de cáncer de próstata puede conferirse empleando secuencias reguladoras apropiadas, específicas de las células, por ejemplo mejoradores (enhancer) y promotores específicos de células. Por lo tanto puede utilizarse una terapia genética para aliviar la patología relacionada con el PCA3 mediante la inhibición de la expresión inapropiada de una forma concreta del PCA3. Se puede utilizar también la terapia genética para aliviar tales patologías proporcionando el nivel de expresión apropiado de una forma concreta del PCA3. En este caso, las secuencias concretas de ácido nucleico del PCA3 pueden codificarse con constructos de DNA o de RNA que se administran en forma de virus, del modo descrito anteriormente.

Se describen los anticuerpos de PCA3 definidos anteriormente (con preferencia, anticuerpos murinos de PCA3 y anticuerpos murino-humanos de PCA3 quimérico y fragmentos y regiones de los mismos), que inhiben o neutralizan la actividad biológica del PCA3 "in vivo" y son específicos del PCA3. Estos anticuerpos pueden utilizarse con fines terapéuticos en sujetos que tengan patologías o estados patológicos asociados con la presencia de una expresión aberrante del PCA3. Los anticuerpos y fragmentos, regiones o derivados de los mismos contienen con preferencia por lo menos una región que reconoce un epítope de PCA3 que tiene actividad biológica inhibidora y/o neutralizadora "in vivo".

El tratamiento consiste en la administración parenteral de una dosis única o de múltiples dosis del anticuerpo, fragmento o derivado. Para el uso farmacéutico humano son preferidos los anticuerpos, fragmentos o regiones, murinos y quiméricos, que tienen una gran afinidad y despliegan una potente inhibición y/o neutralización del PCA3.

Los anticuerpos monoclonales pueden administrarse por cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción en el organismo del mamífero. Debido al hecho de que las proteínas son susceptibles de ser digeridas cuando se administran por vía oral, ordinariamente se aplicará la administración parenteral para optimizar la absorción, es decir, la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.

Los anticuerpos monoclonales pueden administrarse ya sea como agentes terapéuticos individuales, ya sea en combinación con otros agentes terapéuticos. Pueden administrase solos, pero en general se administran con un excipiente farmacéutico elegido en base a la vía de administración elegida y a la práctica farmacéutica estándar.

La dosis administrada puede variar, evidentemente, en función de factores conocidos, como son las características farmacodinámicas del agente concreto y su modo y vía de administración, de la edad, la salud y el peso del paciente receptor, la naturaleza y la extensión de los síntomas, el tipo de tratamiento concomitante, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Normalmente, la dosis diaria del ingrediente activo puede situarse entre 0,1 y 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Ordinariamente para conseguir los resultados deseados es eficaz la administración de una dosis de 0,5 a 50 miligramos por kilogramo de peso corporal y con preferencia de 1 a 10, dividida en subdosis de 1 a 6 veces al día o en una forma de administración continua.

Las formas de dosificación (composición) idóneas para la administración interna contienen en general de 1 miligramo a 500 miligramos de ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará presente normalmente en una cantidad del 0,5 al 95% en peso, porcentaje referido al peso total de la composición.

Los fármacos citotóxicos que pueden combinarse con anticuerpos y después utilizarse en la terapia "in vivo" incluyen, pero no se limitan a: daunorrubicina, doxorrubicina, metotrexato y mitomicina C.

Los animales no humanos abarcan cualquier animal que tenga interrupción transgénica o alteración del o de los genes endógenos (animales "knock-out") y/o dentro de cuyo genoma se haya introducido uno o varios transgenes que dirigen la expresión de los mRNA de PCA3 humanos expresados diferencialmente. Es también preferida la introducción de ácidos nucleicos antisentido de PCA3.

Tales animales no humanos comprenden los vertebrados, por ejemplo roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, anfibios, reptiles, etc. Los animales no humanos preferidos se eligen entre especies de mamíferos no humanos, con mayor preferencia animales de la familia de los roedores, incluidas las ratas y los ratones, con mayor preferencia los ratones.

Los animales transgénicos son animales, en los que se ha introducido por medios no naturales (p.ej. por manipulación humana) uno o varios genes que no son de origen natural, p.ej. genes ajenos, genes endógenos de ingeniería genética, etc. Los genes introducidos de forma no natural, conocidos como transgenes, pueden proceder de la misma especie o de una especie diferente del animal, pero que normalmente no se encuentran en el animal en la configuración y/o en el lugar cromosómico que se ha atribuido a los transgenes. Los transgenes pueden abarcar las secuencias de DNA ajeno, es decir, secuencias que normalmente no están presentes en el genoma del animal hospedante. Como alternativa o adicionalmente, los transgenes pueden abarcar secuencias de DNA endógeno que son anormales por el hecho de que se han dispuesto o mutado "in vitro" con el fin de alterar el modelo normal "in vivo" de expresión del gen o de alterar o eliminar la actividad biológica de un producto genético endógeno codificado por el gen.

Los animales transgénicos no humanos se producen por introducción de transgenes en la línea germinal del animal no humano. Para introducir los genes de la invención se utilizan células diana embrionarias de varias etapas de desarrollo. Se aplican diferentes métodos en función del estadio de desarrollo de la o de las células diana embrionarias. Estos métodos son bien conocidos en la técnica.

Los transgenes pueden introducirse en animales no humanos con el fin de proporcionar modelos animales de las enfermedades humanas. Los transgenes que dan lugar a tales modelos animales incluyen, p.ej. los transgenes que codifican a los mRNA de PCA3 expresado diferencialmente, asociados con un estado maligno de la próstata (p.ej. cáncer de próstata) o un estado no maligno de la próstata.

Después de haber identificado una secuencia marcadora en un mRNA de PCA3 expresado diferencialmente y una correlación entre el equilibrio del nivel de expresión de los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente (o de proteínas codificadas por ellos) y los estados prostáticos malignos y no malignos, la presente invención abre las puertas a numerosos métodos, ensayos y reactivos para el pronóstico, el diagnóstico, la acotación, la predisposición y la terapia del cáncer de próstata. La presente invención proporciona medios para evaluar el cáncer de próstata mediante la identificación del mRNA de PCA3 carente de secuencia adicional según la presente invención (o una proteína codificada por ella). Para identificar tal molécula de ácido nucleico (o tal proteína) pueden utilizarse numerosos métodos, cebadores, sondas, anticuerpos y reactivos, que los expertos en la materia comprenderán fácilmente, si conocen el ámbito de la presente invención.

La presente invención se ilustra con mayor detalle con los siguientes ejemplos no limitadores.

Ejemplo 1 Identificación de los mRNA de PCA3 expresados diferencialmente y correlación de su expresión con la enfermedad prostática

Se desarrollan cebadores de PCR específicos del PCA3 con el fin de analizar la expresión del PCA3 en diferentes muestras. Para ser capaces de discernir entre secuencias amplificadas de mRNA (RNA mensajero) y DNA genómico, se diseñan estos cebadores para que abarque un intrón, en este caso el intrón 3. Tal como se ilustra en la figura 1, el cebador sentido de PCA3 se sitúa dentro del exón 3 y el cebador antisentido de PCA3 se sitúa dentro del exón 4a. Las muestras, en las que se quiere analizar la expresión del PCA3, son virutas de tejido congelado, extraídas de la próstata mediante resección transuretral (BPH, 4 pacientes) o próstatas congeladas, obtenidas por prostatectomía radical (cáncer de próstata, 6 pacientes). Se procesan las muestras de prostatectomía radical en secciones congeladas para obtener secciones seleccionadas específicamente que contengan células del cáncer de próstata. Se extrae el RNA de las muestras congeladas empleando en método de extracción de RNA en fase líquida (Trizol®). A continuación se tratan los ácidos nucleicos extraídos con DNasa con el fin de digerir el DNA genómico. El RNA tratado con DNasa se somete a transcripción inversa en el cDNA empleando la transcriptasa inversa y después se somete a análisis por PCR empleando cebadores de PCA3. La PCR se realiza durante 35 ciclos con la Taq-DNA-polimerasa, se separa el material amplificado a través de geles de agarosa y se visualiza por tinción con bromuro de etidio. Tal como se representa en la figura 2, la amplificación por PCR del PCA3 genera dos productos, que pueden separarse por tamaño y difieren en su abundancia relativa. El amplicón menor (277 bp) se halla de forma predominante o exclusiva en las muestras de pacientes de cáncer de próstata (figura 2, fila superior), mientras que el amplicón mayor (505 bp) es más prominente en muestras de pacientes de un estado prostático no maligno (BPH; figura 2, fila inferior). El examen patológico de las biopsias de los pacientes confirma el diagnóstico inicial de cada paciente, excepto en el paciente 1 de BPH, del que se detecta que tiene cáncer de próstata.

Con el fin de confirmar el origen de los fragmentos amplificados, estos se aíslan del gel y se secuencian. Las secuencias se representan en la figura 3. Como era de esperar, el fragmento menor, de 277 bp, corresponde a las regiones de los exones 3 y 4a, comprendidas en los cebadores de la PCR del PCA3. El fragmento mayor, de 505 bp, es idéntico al fragmento menor, excepto en la secuencia identificada que se sitúa entre el exón 3 y el exón 4a. Obviamente, el análisis directo por PCR de todas las muestras sin transcripción inversa no proporciona material amplificado, confirmando la hipótesis de que el producto mayor de la amplificación procede del DNA genómico.

Por lo tanto, el mRNA de PCA3 está presente por lo menos en dos formas distintas dentro de la célula, una forma pequeña carente de la secuencia adicional identificada aquí (llamada a continuación secuencia 2; SEQ ID NO: 2) así como una forma grande que tiene esta secuencia adicional (llamada a continuación secuencia 1; SEQ ID NO: 1). La presencia de la secuencia adicional en la secuencia 1 interrumpe el marco de lectura previsto, que codifica a la proteína PCA3. La secuencia prevista de la proteína codificada por este mRNA de PCA3 largo se representa en la figura 4. Tal como se ilustra en la figura 2, los niveles de expresión relativos de las dos secuencias de mRNA de PCA3 varían en función del tipo de célula. Las células del cáncer de próstata expresa de forma predominante la secuencia 2, mientras que las células de la BPH expresan principalmente la secuencia 1.

Estas observaciones demuestran que es posible discernir entre un estado maligno y un estado no maligno de la próstata. Además resulta tentador predecir que los niveles relativos de los dos tipos de mRNA del PCA3 permitirán discernir el estado benigno del estado maligno.

Ejemplo 2 Evaluación del estado prostático de un paciente empleando la RT-PCR

Se extraen muestras del paciente y se prepara el RNA de las mismas del modo conocido habitualmente. Se preparan mezclas de transcripción inversa como RT del modo siguiente: 0,2 \mug de RNA total + 0,6 \mug de pdN6 (cebadores hexámeros aleatorios) + 1,25 mM de dNTP + 200 U de M-MLV transcriptasa inversa en 50 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de DTT. Se incuba la mezcla a 40ºC durante 1 h.

Se mezclan 4 \mul de la mezcla reaccionante de RT anterior en 50 \mul de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,5 mM de dNTP, 0,5 \muM de cada cebador y 2,5 U de Taq-DNA-polimerasa. Para el análisis por PCR se efectúa la amplificación durante 35 ciclos (1 min a cada una de las temperaturas siguientes: 94ºC, 60ºC, 72ºC) y posterior extensión a 72ºC durante 10 min. Se analizan los productos de la PCR por la electroforesis convencional a través de un gel de agarosa.

Referencias

Landis y col., 1998, CA Cancer J. Clin. 48(1), 6-29

Kirby, 1997, Prostate cancer and prostatic diseases 1, 2-10

Lange, 1997, en: Principles and Practice of Genitourinary Oncology, coord. Lippincott, editorial Raven Publishers, cap. 41, pp. 417-423

El-Shirbiny, 1994, Adv. Clin. Chem. 31, 99

Brawer y col., 1992, J. Urol. 147, 841

Letran y col., 1998, J. Urol. 160, 426

Israeli y col., 1994, Cancer Res. 54, 1807

Verkaik y col., 1997, Urol. Res. 25, 373

Gomella y col., 1997, J. Urol. 158, 326

H.G. Rammensee en:

http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm

SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:4:

11

\vskip1.000000\baselineskip

extremo C/ratón:

12

\newpage

extremo C/humano:

13

extremo N/ratón:

14

extremo N/humano:

15

Claims (12)

1. Un método "in vitro" para diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en un paciente, dicho método consiste en:

(a) determinar la cantidad de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra tomada de dicho paciente y

(b) diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en dicho paciente;

en el que la presencia de un mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, que da lugar a un mRNA de PCA3 de secuencia más larga que la descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de un estado no maligno de la próstata, mientras que la presencia de un mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2, es indicativa de la presencia de o de la predisposición para desarrollar el cáncer de próstata.

2. Un método "in vitro" para acotar el cáncer de próstata en un paciente, dicho método consiste en:

(a) determinar la cantidad de mRNA de PCA3 expresado diferencialmente en una muestra tomada de dicho paciente y

(b) diagnosticar la presencia de o la predisposición para desarrollar cáncer de próstata en dicho paciente;

en el que el aumento de un nivel de un mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia definida en SEQ ID NO: 2 si se compara con un nivel de un mRNA de PCA3 largo que tiene la secuencia comprendida entre el exón 3 y el exón 4a, dando lugar así a un mRNA de PCA3 que tiene una secuencia que es más larga que la definida en la SEQ ID NO: 2, guarda relación con un aumento del carácter maligno del cáncer de próstata.

3. El método "in vitro" de la reivindicación 1, en el que el nivel del mRNA de PCA3 corto, que predomina sobre el mRNA de PCA3 largo, es indicativo de la presencia de o de la predisposición para desarrollar cáncer de prós-
tata.

4. El método "in vitro" de la reivindicación 1, en el que el diagnóstico de la presencia de o de la predisposición para desarrollar cáncer de próstata consiste en la determinación cuantitativa de:

(a) un mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia definida con la SEQ ID NO: 2, que está asociado con un estado maligno de la próstata; y

(b) un mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, dando lugar a un mRNA de PCA3 que tiene una secuencia más larga que la definida en la SEQ ID NO: 2, que está asociado con un estado no maligno de la próstata;

en el que el nivel de dicho mRNA de PCA3 corto, que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 2, si se compara con el nivel de dicho mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, guarda relación con el estado de la próstata de dicho paciente.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha cuantificación de dicho mRNA de PCA3 corto y dicho mRNA de PCA3 largo se realiza simultáneamente.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que dicho mRNA de PCA3 largo, que tiene una secuencia entre el exón 3 y el exón 4a, tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 1.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que dicha secuencia entre el exón 3 y el exón 4a está situada entre los nucleótidos 27 y 254 de la SEQ ID NO: 1.

8. Uso de sondas o cebadores que se hibridan específicamente con la secuencia adicional representada en la SEQ ID NO: 1 por comparación con la SEQ ID NO: 2 para la fabricación de una composición de diagnóstico de la presencia de o de la predisposición para desarrollar cáncer de próstata.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha secuencia adicional está ubicada entre el exón 3 y el exón 4a y está situada entre los nucleótidos de 27 a 254 de la SEQ ID NO: 1.

10. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que dicha sonda o cebador es una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de una secuencia de nucleótidos que consta por lo menos de 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos existente entre el exón 3 y el exón 4a, situada entre los nucleótidos de 27 a 254 de la SEQ ID NO: 1.

\newpage

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica al polipéptido PCA3, tal como se representa en la SEQ ID NO: 3.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos representada entre los nucleótidos de 27 a 254 de la SEQ ID NO: 1.