ES2260220T3

ES2260220T3 - Composiciones de extractos de cartilago y vegetales combinados.

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Publication number: ES2260220T3
Application number: ES01931467T
Authority: ES
Inventors: Bengt Krister Olson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2021-05-10
Also published as: KR20080026663A; PL204004B1; EE05173B1; IL152730A; WO2001085182A3; CZ20023970A3; NO20025381L; US20020012714A1; PL364466A1; KR100917701B1; WO2001085182A2; BRPI0110940B1; RU2271213C2; NO20025381D0; DE60117971D1; BRPI0110940B8; ATE320262T1; KR20030016259A; HK1050629A1; EP1283713B1

Abstract

Una composición que comprende i) extracto de cartílago que se obtiene por hidrólisis proteolítica enzimática, donde el extracto comprende un glicosaminoglicano, o formas sintéticas de un glicosaminoglicano extraíble de cartílago por hidrólisis proteolítica enzimática; ii) un extracto que contiene antioxidantes hidrófilos, y en el que el extracto comprende antioxidantes hidrófilos seleccionados entre un grupo que consiste en polifenoles y ésteres de los mismos, o formas sintéticas de polifenoles y ésteres de los mismos extraíbles de las semillas de uva; y iii) licopeno o un extracto de tomate que comprende licopeno.

Description

Composiciones de extractos de cartílago y vegetales combinados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para uso oral, donde dichas composiciones contienen cartílago o compuestos que se extraen del cartílago así como antioxidantes hidrófilos y lipófilos.

Antecedentes de la invención

Los radicales libres se forman en el cuerpo, p.ej. en la piel, a causa de la radiación ultravioleta, la polución, el alcohol, etc. El exceso de radicales libres puede causar un daño severo en la estructura de los tejidos, incluso en la estructura de la piel, y así comienzan a aparecer señales del envejecimiento.

Por lo tanto, se han utilizado antioxidantes, tanto hidrófilos como lipófilos combinados, para reducir el estrés oxidativo originado por los radicales libres en la piel (Maffei Facino y col.. ("Free Radical Scavenging and Anti-enzyme Activities of Procyanidines from Vitis vinifera" Arzneim.-Forsch./Drug Res., 44(1), Nº 5 (1994), pp 592-601).

La Patente de E.E.U.U. N° 5.648.277 y EP-A-0659402 revelan formulaciones orales que comprenden antioxidantes tanto hidrófilos como lipófilos. Dichas formulaciones, que comprenden un antioxidante lipófilo y uno hidrófilo a proporciones fijadas, puede ser utilizado para la prevención de condiciones fisiopatológicas asociadas por lo menos parcialmente a una superproducción de radicales libres, particularmente envejecimiento, arterioesclerosis y cáncer.

JP 09 241637 revela composiciones que comprenden una sustancia que neutraliza los radicales libres y ácidos urónicos o mucopolisacáridos. La composición obtenida es capaz de eliminar oxígeno activo de radicales libres que provoca acciones dañinas tales como citotoxicidad y que evita y reduce varias enfermedades tales como estrés oxidativo o envejecimiento o por combinación de una sustancia que neutraliza los radicales libres con un componente específico.

También se ha establecido que la administración de complejos de proteínas que contienen mucopolisacáridos derivados de cartílago de origen marino tienen la capacidad de mejorar la textura de la dermis de la piel haciéndola más densa y firme (Kieffer ME, Efsen J., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 1998 Sep; 11(2):129-136).

Resumen de la invención

Los presentes investigadores han descubierto que la combinación única de un extracto de cartílago con una mezcla especial de extracto vegetal proporciona una composición sorprendentemente eficaz para aumentar la síntesis de colágeno en la piel así como para reducir en forma notable el nivel de la oxidación mediada por radicales en el interior de la dermis. Tanto la disminución de la síntesis de colágeno como la oxidación por radicales están asociadas con el proceso de envejecimiento de la piel.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición como se define en las reivindicaciones. La invención se refiere a una composición para administrar en forma oral que comprende generalmente extracto vegetal y extracto de cartílago, donde el extracto vegetal comprende polifenoles y ésteres que proceden del extracto de semillas de uva y licopeno o un extracto de tomate que comprende licopeno.

Como alternativa, se puede definir la invención como una composición para administrar en forma oral que comprende extracto vegetal y extracto de cartílago, donde el extracto vegetal comprende extracto de semillas de uva y licopeno en una proporción peso/peso de entre aproximadamente 5:1 a 15:1, preferiblemente aproximadamente 10:1.

En un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición como la definida en este documento para el tratamiento de marcas de estiramiento, para disminuir la cicatrización, para ayudar en la formación de cicatrices o para tratamiento del acné.

Una composición según se define en este documento para el mantenimiento general de una piel saludable, una demora del comienzo de la degeneración de la piel debida al envejecimiento o exposición a los rayos ultravioleta, y para el tratamiento de las señales del envejecimiento en la piel es otro aspecto adicional de la invención.

Descripción detallada de la invención

Dentro del contexto de la presente invención, el término "hidrófilo" cuando se aplica al antioxidante hidrófilo, significa generalmente que el antioxidante es suficientemente soluble en, y de esa manera es capaz de actuar en, un medio acuoso en el cuerpo. En el presente contexto, un antioxidante se considera hidrófilo si tiene una solubilidad en agua mayor de 0,05 g por cada 100 g de agua. Un antioxidante hidrófilo preferiblemente tiene una solubilidad en agua mayor de 0,5 g, más preferiblemente mayor de 1 g, en particular mayor de 5 g, más particularmente mayor de 10 g, aún más particularmente mayor de 25 g, especialmente mayor de 50 g, tal como mayor de 100 g por cada 100 g de agua.

De forma similar, el término "lipófilo" cuando se aplica al antioxidante lipófilo, significa generalmente que es lo suficientemente soluble en, y de esa manera capaz de actuar en, un medio lípido en el cuerpo. Esto significa también que tiene una solubilidad en agua muy baja. Dentro del presente contexto, un antioxidante se considera lipófilo si tiene una solubilidad en agua menor de 0,05 g por cada 100 g de agua. Un antioxidante lipófilo preferiblemente tiene una solubilidad en agua menor de 0,005 g, en particular menor de 0,0005 g por cada 100 g de agua.

El término "extracto de cartílago" pretende incluir extracto de cartílago que se puede obtener por división proteolítica enzimática y que comprende un glicosaminoglicano. Pueden incluirse formas sintéticas de compuestos extraibles del cartílago y derivados preparados sintéticamente. Los compuestos denominados "extracto de cartílago" también se pueden encontrar en otros tejidos que contienen tejido conectivo, p.ej. piel o cuero, y se pueden extraer del mismo. El cartílago se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en cartílago de animales marinos, cartílago de pescado, cartílago de molusco y cartílago de mamíferos terrestres. Los animales marinos se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en ballena, delfín y foca; los pescados se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en tiburón, salmón, atún, bacalao y otros pescados conocidos; el molusco puede ser un calamar; y el vertebrado terrestre se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en bovino, porcino, pollo, pato y pavo. El cartílago o los extractos del mismo se seleccionan preferiblemente de entre cartílago bovino, cartílago porcino, cartílago de tiburón, cartílago de calamar, cartílago de pollo y cartílago de salmón, y extractos del mismo.

Se puede utilizar cartílago en sí mismo. Típicamente se puede utilizar en forma de cartílago seco, p.ej. cartílago liofilizado triturado. Los extractos útiles de los tipos de cartílago mencionados anteriormente u otros tejidos que contienen los componentes apropiados, pueden prepararse típicamente a través de la hidrólisis proteolítica enzimática parcial del tejido cocido, seguido de filtración y secado del hidrolizado, p.ej. a través de secado en spray o liofilización. Tales extractos tienen la ventaja de ser parcialmente o completamente solubles en medios acuosos. (Preparados de acuerdo con la Patente de EEUU N° 3.862.003)

El extracto de cartílago comprende típicamente uno o más compuestos que se extraen del cartílago, y preferiblemente comprende glicosaminoglicanos, opcionalmente unidos a un péptido. El extracto de cartílago comprende preferiblemente condroitina sulfato, queratán sulfato, ácido hialurónico, o dermatán sulfato o mezclas de los mismos. El término "extracto de cartílago" pretende incluir compuestos que se pueden obtener de cartílago pero cuyos componentes se pueden obtener realmente de otras fuentes. Una fuente de extracto de cartílago preferida particularmente es el cartílago de tiburón.

El término "extracto de cartílago" puede estar relacionado a compuestos extraibles del cartílago o derivados de lo mismo. Según lo establecido, el extracto de cartílago puede provenir de otras fuentes naturales pero puede provenir de una fuente sintética, es decir, preparado sintéticamente o semisintéticamente. Preferiblemente, el extracto de cartílago se extrae de una fuente natural, más preferiblemente, el extracto es extraíble del cartílago, particularmente el extracto se extrae preferiblemente del cartílago.

Según lo establecido, la invención se refiere en un primer aspecto a una composición para administración oral que comprende extracto vegetal y extracto de cartílago donde el extracto vegetal comprende extracto de semillas de uva y extracto de tomate en una proporción peso/peso de entre aproximadamente 2:1 a 1:2, preferiblemente aproximadamente 1:1. Los presentes investigadores encontraron que la única combinación de un extracto de cartílago con una mezcla especial de extracto vegetal proporcionaba una composición sorprendentemente efectiva para aumentar la síntesis de colágeno en la piel, así como para reducir a un nivel notable la radiación ultravioleta y el estrés oxidativo, tal como la oxidación radicalica, relacionada al proceso de degradación en el interior de la dermis.

Los efectos benéficos de un agregado de extracto de semillas de uva y extracto de tomate como antioxidantes mejoraron inesperadamente dramáticamente por la adición de extracto de cartílago. Los resultados fueron en parte sorprendentes debido a que el extracto de cartílago no tiene actividad antioxidante propia.

Típicamente, el extracto de cartílago y el extracto vegetal se presentan en una proporción peso/peso de entre aproximadamente 1:2 a 2:1, preferiblemente aproximadamente 1:1.

El extracto de cartílago comprende preferiblemente glicosaminoglicanos que se seleccionan entre el grupo que consiste en un éster de condroitina, un éster de queratán, ácido hialurónico o un éster de los mismos, un éster de dermatán, heparina, un éster de heparán. Dichas sustancias pueden estar unidas a una proteína o péptido o estar como formas epiméricas o poliméricas de éster de condroitina, un éster de queratán, ácido hialurónico o un éster de los mismos, un éster de dermatán, heparina, un éster de heparina, preferiblemente sulfato de condroitina, sulfato de queratán, ácido hialurónico o un éster de los mismos, un sulfato de dermatán, una heparina, un sulfato de heparán.

Los glicosaminoglicanos se pueden seleccionar del grupo que consiste en condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, y sulfato de queratán, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente unido a un péptido. Más preferiblemente, la composición de la presente invención comprende extracto de cartílago que comprende sulfato de condroitina, opcionalmente unido a un péptido.

En una típica realización de la presente invención en la que el extracto de cartílago comprende 5-100% peso/peso de sulfato de condroitina.

En una forma de realización preferida, la composición de la presente invención comprende menos del 1% peso/peso de colágeno, preferiblemente menos del 0,5%, preferiblemente en particular menos del 0,1% de proteína de colágeno. En la forma típica en que se prepara el extracto de colágeno, el mismo no comprende colágeno en ninguna cantidad apreciable. Preferiblemente el extracto se prepara mediante hidrólisis proteolítica enzimática digiriendo de esa manera las proteínas del colágeno para dar péptidos. La composición que comprende dicho extracto con dicho bajo nivel de colágeno mostró los efectos benéficos inesperados. Por lo tanto, es preferible no agregar adicionalmente colágeno o una fuente del mismo a la composición de la presente invención. En una forma de realización más preferida, la composición se halla esencialmente libre de colágeno.

De forma similar, una composición de la presente invención que típicamente comprende menos del 0,025% de beta-caroteno, preferiblemente menos del 0,02% de beta-caroteno, en particular menos del 0,01% de beta-caroteno. Así, un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que puede conseguir los efectos benéficos según se describe más adelante con muy poco o esencialmente sin beta-caroteno.

A la inversa, lo que se sabe actualmente es que el contenido de licopeno, relativa o absolutamente, es particularmente importante para los efectos benéficos inesperados de la composición de la presente invención. El extracto vegetal, específicamente el extracto de tomate, comprende licopeno. Preferiblemente, el extracto de tomate comprende aproximadamente de 5 a 12%, típicamente aproximadamente 10% de licopeno, peso/peso. El extracto de tomate puede provenir de una única variedad de tomates o de una mezcla.

En una típica realización, la variedad de tomate que se utiliza para preparar el extracto de tomate es Licopersicum aesculentum, proporcionando de tal modo niveles apropiados de licopeno, tanto absolutos como relativos.

En una realización preferida de la presente invención, la composición contiene de 0,1 a 5% de licopeno peso/peso, preferiblemente de 0,2 a 4% de licopeno, tal como de 0,3 a 2% de licopeno, más preferiblemente de 0,3 a 1% de licopeno, particularmente de 0,3 a 0,8%, tal como de 0,3 a 0,6% de licopeno.

En una definición alternativa de la composición de la presente invención, la composición comprende un extracto vegetal y un extracto de cartílago donde el extracto vegetal comprende extracto de semillas de uva y licopeno en una proporción peso/peso de aproximadamente 5:1 a 15:1, preferiblemente aproximadamente 10:1. Según lo establecido, dicha proporción de licopeno, de acuerdo con lo que se sabe actualmente de la invención, es de una importancia significativa para conseguir el sorprendente efecto benéfico antioxidante.

En una realización apropiada, la actividad antioxidante IC_{50} del antioxidante lipófilo es menor de 1,2x10^{-7} para la neutralización de los radicales R\cdot/ROO\cdot en la peroxidación lipídica de un fosfolípido insaturado en un medio acuoso. Típicamente, el antioxidante lipófilo que muestra una actividad antioxidante IC_{50} como máximo de 1,2x10^{-7} para la neutralización de los radicales R\cdot/ROO\cdot en la peroxidación lipídica de un fosfolípido insaturado en un medio acuoso, es el compuesto carotenoide licopeno (también denominado \psi,\psi-caroteno). El licopeno se puede obtener típicamente por extracción de ciertas frutas frescas tales como tomates, sandía, pomelo rojo o fruta guayaba de una forma conocida per se, o se puede preparar sintéticamente de una manera conocida.

Los efectos benéficos de la composición oral de la presente invención son el resultado de la combinación novedosa de tres componentes: extracto de cartílago, extracto de semillas de uva y extracto de tomate. El extracto de semillas de uva proporciona antioxidantes hidrófilos. El extracto de tomate proporciona antioxidantes lipófilos. Por lo tanto, la invención se refiere a una combinación novedosa de antioxidantes con compuestos que se extraen del cartílago. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición para administración oral, dicha composición comprende i) cartílago, uno o más compuestos que se extraen del mismo, o derivados de los mismos; ii) uno o más antioxidantes hidrófilos, y iii) uno o más antioxidantes lipófilos; donde dicha composición aumenta la síntesis de colágeno en por lo menos un 35%, según lo determinado por el Método de Prueba A.

La síntesis de colágeno disminuye notablemente en las células de piel envejecidas. La disminución de colágeno en la piel causa un cambio en la textura y características reológicas de la piel, y los típicos signos de envejecimiento tales como arrugas, disminución de la suavidad, pérdida de elasticidad y firmeza.

Como se muestra en el ejemplo 2, la composición de la presente invención proporciona un aumento sorprendentemente pronunciado en la síntesis de colágeno, en comparación con otras combinaciones y componentes individuales. La síntesis de colágeno se evaluó midiendo la incorporación de prolina radioactiva ([^{14}C]-Prolina) en proteínas que contienen prolina, de las cuales se considera que la mayoría pertenecen al colágeno, donde el 30% de la cantidad total de aminoácidos son prolina.

Los fibroblastos dérmicos cultivados en un medio que contenga una combinación de extracto de semillas de uva (G) y extracto de tomate (T), GT (según se revela en la Patente de EEUU N° 5.648.277), sufrieron una disminución del grado de incorporación de prolina en comparación con el control: el 3,6% de incorporación comparado con el 4,8% en el control, una disminución del 25%. Los cultivos celulares que contienen una combinación de extracto de pescado (F) y extracto de semillas de uva (G), FG, que resultaron en un pequeño incremento en el grado de incorporación de prolina: 5,5% de incorporación, un aumento del 10% en comparación con el control. Los cultivos celulares que contienen solamente extracto de pescado (F) experimentaron un aumento del grado de incorporación de prolina: 6,2% de incorporación, un aumento del 29%.

Las células cultivadas con una composición de acuerdo con la presente invención, que comprende extracto de pescado (F), extracto de semillas de uva (G), y extracto de tomate (T), FGT; extractos en definitiva, dieron sorprendentemente un notable aumento del 80% en la incorporación de prolina: (8,4% de prolina incorporada). El extracto GT dado resulta en una disminución del 25% en la síntesis de colágeno y el extracto F resulta en un aumento del 29% en la síntesis de colágeno, un aumento del 80% en la síntesis de colágeno al combinar F con GT resulta sorprendente.

Uno o más antioxidantes hidrófilos de las composiciones de la presente invención pueden provenir de fuentes naturales o sintéticas, preferiblemente de fuentes naturales. En una realización típica, la fuente natural se selecciona de entre el grupo que consiste en corteza de pino, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Ginkgo biloba, Cardus marianum, Vaccinium myrtillus, Silibum marianum.

En una realización apropiada, uno o más antioxidantes hidrófilos se extraen de las semillas de la uva Vitis vinifera.

La fuente natural de uno o más antioxidantes hidrófilos contiene típicamente hasta un 25% p/p de catequina, epicatequina y ácido gálico; hasta un 90% p/p de dímero, trímero y/o tetrámero de epicatequina, y/o galatos de los mismos; y hasta un 10% p/p de pentámero, hexámero y/o heptámero de epicatequina, y/o galatos de los mismos.

Uno o más antioxidantes hidrófilos se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en polifenoles y ésteres de los mismos; ácido ascórbico (vitamina C) y ésteres de los mismos; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los polifenoles son típicamente catequinas; leucoantocianidinas y flavanonas; flavaninas, flavonas y antocianinas; flavonoles; flavonolignanos; y oligómeros de los mismos.

En una realización preferida, el antioxidante hidrófilo es una catequina que se selecciona de entre el grupo que consiste en proantocianina A2 y oligómero de procianidol (OPC), más preferiblemente un oligómero de procianidol.

Los flavonolignanos son típicamente silimarina o uno de los componentes de los mismos tales como silibina, silidianina, silicristina e isosilibina.

En la composición de la invención, el antioxidante hidrófilo es típicamente uno con una actividad antioxidante IC_{50} de 5x10^{-7} como máximo para la neutralización de los radicales R\cdot/ROO\cdot en la peroxidación lipídica de un fosfolípido insaturado en un medio acuoso.

Según lo establecido, un antioxidante hidrófilo preferido en particular es un extracto de semillas de uva, es decir semillas de Vitis vinifera, dichos extractos se obtienen típicamente extrayendo semillas de uva mediante el uso de disolventes orgánicos tales como acetona y/o acetato de etilo o similares, evaporando los disolventes, redisolviendo el residuo en agua, y filtrando y secando el filtrado, p.ej. por secado en spray o liofilización. Particularmente en una realización preferida, tal extracto contiene típicamente hasta un 25% p/p de catequina, epicatequina y ácido gálico; hasta un 90% p/p de dímero, trímero y/o tetrámero de epicatequina, y/o galatos de los mismos; y hasta un 10% p/p de pentámero, hexámero y/o heptámero de epicatequina, y/o galatos de los mismos.

Uno o más antioxidantes lipófilos también pueden provenir de fuentes naturales o sintéticas, típicamente de una fuente natural. El antioxidante lipófilo puede ser una mezcla de antioxidantes tales como un extracto de una fuente natural que comprende una mezcla compleja de antioxidantes lipófilos. Una fuente natural apropiada del antioxidante lipófilo es una variedad de tomate, particularmente la variedad Lycopersicum aesculentum.

Uno o más antioxidantes lipófilos son típicamente carotenoides, procarotenoides, tocoferoles, fitoesteroles y ubiquinonas. Los carotenoides son particularmente interesantes antioxidantes lipófilos y se pueden seleccionar de entre el grupo que consiste en \alpha-caroteno, \beta-caroteno, \gamma-caroteno, \delta-caroteno, licopeno (\psi,\psi-caroteno), zeaxantina, criptoxantina, luteina, y xantofila.

Según lo establecido, el carotenoide licopeno es un antioxidante lipófilo especialmente interesante. La composición de la presente invención comprende licopeno más preferiblemente. Los extractos que sirven como fuentes de antioxidante lipófilo preferiblemente comprenden 5-12% de licopeno, tal como 7-12% de licopeno, preferiblemente aproximadamente 10% de licopeno. Esto se puede traducir típicamente en una composición de la presente invención que comprende de 0,1 a 5% de licopeno peso/peso, preferiblemente de 0,2 a 4% de licopeno, tal como 0,3 a 2% de licopeno, más preferiblemente de 0,3 a 1% de licopeno, particularmente de 0,3 a 0,8%, tal como de 0,3 a 0,6% de licopeno, peso/peso.

Una fuente natural del antioxidante lipófilo comprende preferiblemente

	5-12%	licopeno
	1-1,5%	tocoferoles
	0,05-0,15%	beta-caroteno
	0,5-0,75%	fitoeno
	0,5-0,55%	fitoflueno;

más preferiblemente comprende

	7-12%	licopeno
	1-1,5%	tocoferoles
	0,05-0,15%	beta-caroteno
	0,5-0,75%	fitoeno
	0,5-0,55%	fitoflueno.

La fuente de uno o más antioxidantes lipófilos comprende preferiblemente menos del 1% de beta-caroteno, tal como menos de un 0,75%, tal como menos del 0,5%, preferiblemente menos del 0,25%, más preferiblemente menos del 0,2%, particularmente menos del 0,15%. Similarmente, una composición de la presente invención típicamente comprende menos del 0,025% de beta-caroteno, preferiblemente menos del 0,02% de beta-caroteno, particularmente menos del 0,01% de beta-caroteno. Así, un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que puede conseguir los efectos benéficos según se describe más adelante con muy poco o esencialmente sin beta-
caroteno.

En una realización típica, el extracto de tomate proporciona la única fuente del antioxidante lipófilo. Alternativamente, el antioxidante lipófilo es el extracto de tomate.

En una realización típica de la invención, la composición comprende

: 20-40% de extracto de cartílago, tal como 25-35%, preferiblemente 27-35%, tal como 30-35% de extracto de cartílago, peso/peso;

: 1-10% de extracto de semillas de uva, tal como 2-8%, preferiblemente 3-7%, tal como 3-5% de extracto de semillas de uva peso/peso; y

: 1-10% de extracto de tomate, tal como 2-8%, preferiblemente 3-7%, tal como 3-5% de extracto de tomate, peso/peso.

Una composición típica de la presente invención comprende extracto de pescado (F), extracto de semillas de uva (G), y extracto de tomate (T) en una proporción en peso de aproximadamente 5:1:1 a 15:1:1, tal como aproximadamente 10:1:1.

Según lo establecido, la composición de la presente invención es capaz de aumentar la síntesis de colágeno en por lo menos un 35%, según lo determinado por el Método de Prueba A. Sin embargo, preferiblemente, el uso de la composición bajo las condiciones del Método de Prueba A proporciona un aumento de la síntesis de colágeno de al menos un 40%, tal como al menos un 45%, tal como al menos un 50%, al menos un 55%, preferiblemente al menos un 60%, tal como al menos un 65%, al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 75%.

Así, un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para aumentar la síntesis de colágeno o aminorar la disminución de la síntesis de colágeno en la dermis que comprende la administración oral de una composición según se define en este documento.

Los presentes investigadores han descubierto que no sólo la composición novedosa de la presente invención causa un aumento de la síntesis de colágeno sino que también posee otros indicadores de su utilidad para el tratamiento del envejecimiento o de la piel expuesta a la radiación ultravioleta. Consecuentemente, en una forma de realización apropiada, la composición reduce los efectos dañinos de los radicales libres en por lo menos un 40% según lo medido por la actividad MMP-1 en comparación con un control bajo las condiciones del Método de Prueba B, tal como por lo menos en un 45%, tal como por lo menos en un 50%. Los radicales libres de oxígeno y los efectos dañinos de los mismos se deben típicamente a la exposición a la radiación ultravioleta pero pueden ser el resultado de otros factores ambientales, fisiológicos o genéticos.

Se considera que la sobreproducción de MMPs inducida por la radiación ultravioleta es una de las principales causas del fotoenvejecimiento. La radiación ultravioleta activa las células dérmicas causando la sobreproducción de MMPs, que son enzimas que degradan el colágeno y otras proteínas que comprenden la matriz dérmica extracelular. A la degradación dérmica (desintegración) le sigue la reparación que es imperfecta. La reparación imperfecta produce un déficit en la integridad estructural de la dermis y se repite con cada exposición intermitente a la radiación ultravioleta causando acumulación de cicatrices dérmicas y finalmente señales visibles de fotoenvejecimiento (2-5). También se confirmó in vitro el efecto de la luz ultravioleta sobre la inducción de MMPs en cultivos de fibroblasto (6,7). Otros estudios que se enfocan en el mecanismo de la inducción de MMPs por radiación ultravioleta sugieren que el oxígeno singlete inducido por la radiación ultravioleta (una especie de oxígeno reactivo) tiene un efecto directo sobre las células, que resulta en la producción de MMPs (8). Por lo tanto los antioxidantes, y específicamente aquellos que absorben al oxígeno singlete contrarrestarán la síntesis de MMP estimulada por la radiación ultravioleta. Sin embargo, no se puede excluir que también otras especies de radicales libres se hallen involucradas en la estimulación de la síntesis de MMP. Tanto las células viejas en cultivo como las células de piel expuestas a la radiación ultravioleta o al sol producen mayores cantidades de MMP. Por lo tanto, la reducción de la actividad MMP-1 a causa del uso de una composición de la presente invención, es un indicador de su utilidad para el mantenimiento de la piel saludable.

Además, la composición de la presente invención disminuye la formación de productos finales de glicosilación avanzada (AGE) en por lo menos un 10%, según lo medido bajo las condiciones del Método de Prueba C en comparación con un control, tal como al menos un 20%, tal como al menos un 30%, 40%, 50%, ó 60%, preferiblemente al menos 70%, particularmente al menos un 80 ó 90%, más preferiblemente al menos un 100 ó 110%.

Los AGE (productos finales de glicación avanzada, también conocidos como productos Amadori) son el resultado de la glicación (glicoxidación), una reacción no específica de unión entre proteínas y carbohidratos. Los AGEs se acumulan tanto en el interior de células individuales como en la matriz extracelular de los tejidos que consisten en proteínas de larga vida tales como el colágeno en la piel. Las proteínas AGE-entrecruzadas son proteínas no-funcionales y tienden a aglomerarse en la matriz extracelular o en el citoplasma de las células y se cree que tienen un efecto perjudicial sobre la síntesis de proteínas en total. Inicialmente, un producto de una etapa temprana (producto Amadori) se forma cuando la glucosa reacciona con las proteínas. Luego, dicho producto Amadori sufre un reordenamiento adicional para formar pigmentos marrones de etapa tardía que pueden entrecruzar proteínas. Después del reordenamiento, los productos de etapa tardía continúan acumulándose en las proteínas de larga vida, tales como el colágeno, durante largos períodos de tiempo, con gran entrecruzamiento de proteínas. Se ha mostrado que la formación de AGE in vivo aumenta con el envejecimiento del organismo y de la célula tanto in vivo como in vitro. Se piensa que el nivel de acumulación de AGE in vivo refleja los niveles de glucosa en suero. Un papel crítico en la formación de AGEs de etapa tardía se adjudica a la oxidación, puesto que la glicación en si misma es un proceso reversible. Sin embargo, la oxidación, es responsable del daño químico permanente y de la pérdida de funcionalidad de las proteínas debida a entrecruzamientos permanentes (9). Aparte de no ser eficientes y de tener un efecto de disminución sobre la síntesis total de proteínas, se ha mostrado que los AGEs son cromóforos que, después de ser irradiados con luz ultravioleta, generan cantidades significativas de radicales activos de oxígeno (10). Por lo tanto, el estrés oxidativo contribuye a la formación de AGEs.

Tras una única dosis de exposición de radiación ultravioleta (5 J/cm^{2}), el nivel de AGE en células de control sin suplemento aumentó aproximadamente 20 veces en comparación con las células de control no-irradiadas. Bajo las mismas condiciones, el nivel de AGE en cultivos con suplemento F aumentó aproximadamente 40 veces, que indica que F no tiene efecto protector sobre la formación de AGE tras la irradiación ultravioleta. El aumento de los niveles de AGE en células tratadas con F fue más intenso a 7,5 J/cm^{2}. La Figura 3 muestra que los niveles de AGE en las células con suplemento FG aumentó en 72 unidades, lo cual se halla dentro del mismo rango que las células de control sin tratar irradiadas (una disminución del 10% con respecto al control).

Notablemente, las células tratadas con FGT mostraron una disminución sorprendente en el nivel de AGE de aproximadamente 22 unidades con respecto a las células no irradiadas, que se traduce en una disminución del 120% de la concentración de AGE con respecto a las células irradiadas no-tratadas.

De este modo las composiciones de la presente invención proporcionaron tanto mejoras en la incorporación de prolina como efectos benéficos en células expuestas a la radiación ultravioleta en términos de actividad MMP-1 y formación de AGE.

Así, un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición apropiada para el tratamiento cosmético de las señales de envejecimiento en la piel y para el mantenimiento general de una piel saludable. Las señales de envejecimiento pueden ser el resultado de varios factores, tales como luz solar, paso del tiempo, dieta, y otras condiciones ambientales.

Típicamente, una composición de la presente invención comprende

: 1-80% p/p de compuestos extraíbles del cartílago, peso/peso;

: 0,1-75% p/p de extracto de semillas de uva, peso/peso; y

: 0,002-25% de licopeno, peso/peso.

Más preferiblemente, una composición de la presente invención comprende

: 27-35%, típicamente 30-35% de extracto de cartílago, peso/peso

: 1-10% de extracto de semillas de uva, tal como 3-5% de extracto de semillas de uva peso/peso; y

: 0,1 a 5% de licopeno, típicamente 0,2 a 1% de licopeno, peso/peso.

Los presentes investigadores prepararon composiciones apropiadas que comprenden

: 100-110 mg de extracto de pescado (como extracto de cartílago)

: 95-105 mg de extractos vegetales

: 25-35 mg de extracto de Acerola

: 60-90 mg de celulosa microcristalina

: 3,5-4,5 mg de dióxido de silicio

donde los extractos vegetales comprenden un oligómero de procianidol y licopeno y los extractos de pescado comprenden un glicosaminoglicano.

Una composición apropiada adicional de acuerdo con la invención comprende

: 100-110 mg de extracto de pescado (como extracto de cartílago)

: 95-105 mg de extractos vegetales

: 60-65 mg de inulina

: 25-35,00 mg de ácido ascórbico

: 10-20 mg de gluconato de cinc

: 10-15 mg de dióxido de silicio

Así, una composición de la presente invención puede comprender además otros componentes, tales como suplementos nutricionales adicionales tales como vitaminas, minerales, aminoácidos y carbohidratos. En una realización preferida, la composición comprende además Vitamina C o un extracto que contiene Vitamina C, tal como si comprende adicionalmente extracto de Acerola.

Según lo establecido, las cantidades relativas y absolutas de los constituyentes son, bajo lo que se sabe actualmente sobre la presente invención, de gran importancia para conseguir los efectos benéficos sorprendentes de las composiciones de la presente invención. Por lo tanto, los antioxidantes hidrófilos y lipófilos preferiblemente se hallan presentes en una proporción p/p en el rango desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 200:1, tal como desde 2:1 a 100:1, en particular desde 5:1 a 50:1, especialmente desde 5:1 a 20:1, preferiblemente desde 5:1 a 15:1, más preferiblemente aproximadamente 7:1 a 12:1, tal como aproximadamente 10:1.

Similarmente, el cartílago, uno o más compuestos extraibles del mismo y los antioxidantes hidrófilos, preferiblemente se hallan presentes en una proporción p/p en el rango desde aproximadamente 1:1 a aproximadamente 200:1, tal como desde 2:1 a 100:1, en particular desde 5:1 a 50:1, especialmente desde 5:1 a 20:1, preferiblemente desde 5:1 a 15:1, más preferiblemente aproximadamente 7:1 a 12:1, tal como aproximadamente 10:1.

Generalmente, un aspecto importante de la presente invención se refiere a una composición donde i) el cartílago, uno o más compuestos extraibles del mismo, o derivados de los mismos, ii) uno o más antioxidantes hidrófilos, y iii) uno o más antioxidantes lipófilos se hallan presentes a la vez en cantidades suficientes para suprimir la actividad MMP-1, para suprimir la formación de AGE o para aumentar la síntesis de colágeno en células de fibroblasto humano cultivadas in vitro.

Similarmente, un aspecto adicional importante de la presente invención se refiere a una composición donde i) el cartílago, uno o más compuestos extraibles del mismo, o derivados de los mismos, ii) uno o más antioxidantes hidrófilos, y iii) uno o más antioxidantes lipófilos se hallan presentes en una proporción apropiada para suprimir la actividad MMP-1, para suprimir la formación de AGE o para aumentar la síntesis de colágeno en células de fibroblasto humano cultivadas in vitro.

En una combinación de realizaciones preferidas, la composición puede comprender 0,25-15 mg de licopeno y 2,5-100 mg de extracto de semillas de uva, preferiblemente desde 0,5-5 mg de licopeno y 5-50 mg de extracto de semillas de uva, particularmente 0,75-2,5 mg de licopeno y 10-30 mg de extracto de semillas de uva, particularmente 1-2,5 mg de licopeno y 10-25 mg de extracto de semillas de uva.

En una combinación adicional de realizaciones, la composición puede comprender 1-2,5 mg de licopeno, 5-50 mg de extracto de semillas de uva y 50-200 mg de extracto de cartílago.

Las composiciones de la invención son para administración oral y se pueden administrar en la forma de una forma de dosaje sólida tal como tabletas, polvos, gránulos, cápsulas, bolsitas o en una forma de dosaje líquido tal como soluciones, suspensiones, tónicos o jarabes. Tales formas de dosaje se pueden preparar de una forma bien conocida en el arte de la tecnología farmacéutica y pueden contener uno o más excipientes que pueden ser cualquiera de aquellos comúnmente usados en el arte. Para composiciones sólidas, se pueden utilizar excipientes sólidos no-tóxicos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, p.ej. grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, fibra de soja, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa tal como celulosa microcristalina, glucosa, sacarosa, dióxido de silicio, carbonato magnésico y similares. Las formas de dosaje líquido se pueden obtener por disolución, dispersión etc. los componentes activos y un adyuvante farmacéutico opcional en un excipiente tal como agua o líquidos basados en agua tales como jugos; aceite o alcohol, para formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición oral de acuerdo con la invención también puede contener cantidades minoritarias de aditivos conocidos en el arte tales como agentes humectantes o emulsificantes, tampones, o similares. Se pueden formular tales formas de dosaje de acuerdo con principios bien conocidos en el arte, véase también p.ej. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsilvania, 15^{va} Edición, 1975; o Martindale, The Extra Pharmacopeia, The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 31^{va} Edición, 1996.

La composición se puede formular de tal manera que el antioxidante lipófilo, tal como el extracto de tomate, o un extracto que comprende licopeno sea formulado para una liberación normal y el antioxidante hidrófilo, tal como extracto de semillas de uva sea formulado para una liberación retrasada o lenta.

Como se ilustra desde el ejemplo 5, cuando se toman las composiciones oralmente, tienen un efecto visible apreciable sobre la condición de la piel. La Figura 4 también muestra que aquellos voluntarios que tomaron una composición de la presente invención notaron mejoras en la condición general de la piel, elasticidad, calidad de la piel alrededor de los ojos y de la piel alrededor de la boca. Así, los resultados en los ejemplos 1-4 se traducen exitosamente in vivo, donde, cuando la composición se toma oralmente la composición aparentemente actúa sistémicamente.

Las composiciones de la presente invención se pueden usar como un producto cosmético oral, un alimento o suplemento alimentario, un farmacéutico o un dietético.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición para usar en el mantenimiento general de una piel saludable, para demorar el comienzo de la degeneración de la piel debida al envejecimiento o exposición a la radiación ultravioleta, y para el tratamiento de los signos del envejecimiento de la piel. Las composiciones de la presente invención son apropiadas en el tratamiento del envejecimiento de la piel, piel expuesta a la luz solar u otras formas de radiación ultravioleta, piel seca, piel áspera, piel decolorada, piel con acné, piel con cicatrices, piel con estrías, eczema y psoriasis.

Un aspecto importante de la invención consiste en un método para el tratamiento cosmético o profiláctico de la piel contra las señales del envejecimiento de la piel, y del daño resultante de la exposición a la radiación ultravioleta, que comprende la administración oral de una composición definida anteriormente. Similarmente, un aspecto adicional de la invención consiste en un método para el tratamiento cosmético o profiláctico del envejecimiento de la piel, piel expuesta a la luz solar u otras formas de radiación ultravioleta, piel seca, piel áspera, piel decolorada, piel con acné, piel con cicatrices, piel con estrías, eczema y psoriasis, que comprende la administración oral de una composición definida anteriormente. Se anticipa el uso de una composición definida anteriormente para la preparación de un agente para impedir o retardar los signos del envejecimiento de la piel, impedir o aminorar los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta, para tratar estrías, para tratar acné, para aminorar los síntomas de eczema, para contribuir a la cicatrización y sanación de heridas, para reducir las cicatrices, para aminorar los síntomas de psoriasis, o para tratar piel áspera, decolorada o seca.

En éstos usos, un dosaje diario promedio típico para una persona adulta es desde 55 a 3700 mg de la mezcla definida anteriormente del componente de cartílago, y tal como desde 70 a 1000 mg de antioxidante hidrófilo y antioxidante lipófilo. La administración puede tener lugar en una dosis diaria o en dosis divididas hasta en cuatro veces al día, tal como 1, 2, 3 ó 4 veces, preferiblemente 1 ó 2 veces diarias.

Las composiciones se pueden envasar de acuerdo con principios bien conocidos en el arte, tales como en envases para tabletas, ampollas o botellas. En el caso de que uno de los componentes sea sensible a la luz, que es el caso en particular si el antioxidante lipófilo es licopeno, es aconsejable proteger la composición de la luz. P.ej. en el caso de las ampollas, esto se puede conseguir apropiadamente si las ampollas son del tipo bien conocido formado a partir de dos hojas de lámina de aluminio y lámina de aluminio recubierta con plástico, respectivamente, tales como de una hoja de un laminado de plástico/aluminio (p.ej. un laminado de láminas de PVC, aluminio y poliamida orientada) con forma (formando depresiones) y una lámina de aluminio delgada, opcionalmente barnizada, respectivamente.

Se ilustra adicionalmente la invención mediante los siguientes ejemplos no-limitantes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Determinación de concentraciones efectivas de antioxidantes hidrófilos, antioxidantes hidrofóbicos y extracto de cartílago

Se probaron diferentes concentraciones de extracto de semillas de uva (1-200 \mugr/ml), extracto de cartílago (0-1000 mg/ml) y extracto de tomate (0-200 \mugr/ml) en forma dependiente de la dosis, en fibroblastos de piel humanos cultivados in vitro. Después de la evaluación de supervivencia celular y de la tasa de crecimiento bajo todas la condiciones de cultivo, se seleccionó una única concentración óptima para cada ingrediente.

Método

Se prepararon soluciones de trabajo de extracto de cartílago, extracto de semillas de uva y pasta de tomate que contienen licopeno, como sigue:

Solución de cartílago (40 mg/ml)

Se disolvieron 200 mg de polvo de pescado (extracto de cartílago preparado mediante hidrólisis proteolítica enzimática de cartílago, filtración y secado en spray del hidrolizado) en 5 ml de solución salina tamponada de Hanks (Hanks) y se filtró en forma estéril.

Solución de semillas de uva (40 mg/ml)

Se disolvieron 200 mg de extracto de semillas de uva (Indena, Milán, Italia) en 5 ml de solución salina tamponada de Hanks (Hanks) y se filtró en forma estéril.

Solución de tomate (pre-concentrado: 100 mg/ml)

Pre-concentrado: se disolvieron 400 mg de pasta de tomate (con 40 mg de licopeno) en 4 ml de tetrahidrofurano, se filtró en forma estéril y se almacenó a -80ºC hasta hacer uso.

Solución de tomate de trabajo (100 \mug/ml)

Solución de tomate de trabajo: se diluye el pre-concentrado 1:1000 inmediatamente antes de usar en medio celular DMEM.

Se cultivaron las células de fibroblasto humano como sigue:

Se sembraron 10.000 células/cavidad en bandejas de 24 cavidades. Se dejaron ligar las células durante toda la noche antes de cambiar el medio a un medio con concentraciones diferentes de extracto de cartílago (F), extracto de semillas de uva (G) y extracto de tomate (T). Se cambió el medio celular, DMEM, (10% de suero fetal bovino, +Glutamina, Penicilina/estreptomicina) cada segundo a tercer día, excepto para los medios con TE que se renovaron a diario. Las células se cultivaron a confluencia (37ºC, 5% CO_{2}, 95% de humedad) y se contaron cada segundo día usando 300 \mul de Tripsina/EDTA por cavidad para desprender las células durante una permanencia de 10 min en la incubadora a 37ºC, donde se utilizaron 200 \mul para contar las células/ml.

Después de 15 días se evaluaron la supervivencia celular y el crecimiento celular.

Se evaluó la supervivencia celular midiendo la absorción de MTT en las células. El nivel de absorción corresponde a niveles de actividad de las mitocondrias que se pueden utilizar como un signo de viabilidad celular. El MTT se reduce a un compuesto de color azul, formazán, que se detecta por absorción UV/VIS a 595 nm con 655 nm como referencia.

Se evaluó el crecimiento celular como una cantidad de células por recipiente de cultivo, las cuales se contaron usando un Counter Coulter® electrónico.

Resultados

Los cultivos celulares suplementados con 70 \mug/ml de extracto de cartílago, 10 \mug/ml de extracto de semillas de uva y 10 \mug/ml de extracto de tomate (= 1,0 \mug/ml licopeno) proporcionaron un ambiente óptimo para el crecimiento celular. Dichas concentraciones no tuvieron efectos tóxicos ni cambiaron la tasa de división celular. Estos resultados se confirmaron adicionalmente mediante un cultivo a largo plazo de fibroblastos en medio de cultivo suplementado con la combinación seleccionada (arriba) durante un período de 50 días. Los niveles de duplicación de la población acumulada (CPDL) monitorizados que corresponden a la cantidad de divisiones celulares y al crecimiento celular no resultaron afectados por los ingredientes probados. Los resultados se exponen en la Tabla 1 y en la Figura 1.

TABLA 1

Día	O	F	FGT	GT
0	18	18	18	18
3	19,17	19,34	18,87	18,8
9	21,4	21,52	21,28	21,32
14	23,08	22,93	23,05	23,02
21	25,65	25,87	25,59	25,67
28	27,53	27,57	27,73	27,78
35	28,88	28,88	29,2	29,15
42	31,45	31,54	31,4	32,03
50	32,98	33,14	33,42	33,39

Ejemplo 2 Efecto de la composición sobre la síntesis de colágeno

Se estableció un sistema de prueba in vitro para probar la influencia de F, G y T sobre la síntesis de colágeno. La síntesis de colágeno se evaluó midiendo la incorporación de prolina radioactiva ([^{14}C]-Prolina) en proteínas que contienen prolina, de las cuales se considera que la mayoría pertenecen al colágeno, donde la cantidad de residuos prolina constituye más del 30% de la cantidad total de aminoácidos. Se agregaron diferentes combinaciones de F, G y T al medio celular en concentraciones óptimas determinadas según se describe en el Ejemplo 1) y se midió la radioactividad de las proteínas secretadas y marcadas después de 24 horas.

Método

Se produjeron extractos de F, G y T como en el Ejemplo 1.

Se llevó a cabo la incorporación de prolina radiomarcada en cultivos celulares de células de fibroblasto humano como sigue (Método de Prueba A): Se agregaron diferentes combinaciones de F, G y T el día siguiente de la siembra y se cultivaron las células a confluencia (aprox. 1 semana). El medio de cultivo se cambió a diario. En la confluencia, el medio se cambió a 0,5 ml de soluciones radioactivas (25 \muCi) + 2,5 ml del medio sin F, G o T.

Las células se dejaron en la incubadora durante las siguientes 24 h y después se cosechó el medio y se sometió al siguiente procedimiento para medir la radioactividad:

Precipitación de TCA: se mezclaron 5 \mul del medio con 20 \mul de BSA (0.5 g/l) y 1 ml de TCA (10%) y se dejaron a -20ºC durante 30 min. Se fundieron las muestras y se pasaron por un filtro de nitrocelulosa para separar la prolina radioactiva libre de las proteínas marcadas. El filtro se transfirió a un tubo al cual se agregaron 2,5 ml de líquido de centelleo. Se dejó el tubo a oscuras durante 1 hora, después de la cual se midió la radioactividad de la muestra de 5 \mul en el contador de centelleo.

Resultados

En las Tablas 2a y 2b se muestra el resumen de los resultados. Los cultivos celulares que contienen el extracto GT dieron una disminución en el grado de incorporación de prolina en comparación con el control de: 3,6% de incorporación comparado con 4,8% en el control, una disminución del 25%. Los cultivos celulares que contienen el extracto FT no tuvieron una influencia significativa sobre la incorporación de prolina, ya que el grado de incorporación fue del 5,0% comparado con 4,8% en el control, un aumento del 4%, solamente. Los cultivos celulares que contienen el extracto FG dieron un pequeño aumento en el grado de incorporación de prolina: 5,5% de incorporación, un aumento del 10% en comparación con el control.

Los cultivos celulares que contienen el extracto F proporcionaron un aumento en el grado de incorporación de prolina: 6,2% de incorporación, un aumento del 29%. Sin embargo, los extractos FGT, dieron sorprendentemente un intenso aumento del 80% en la incorporación de prolina: (8,4% de prolina incorporada).

En este tipo de experimentos, se considera significativa una diferencia mayor del 30%.

TABLA 2

Tratamiento	Actividad	Actividad	% de prolina	Resultado con respecto
	(en dpm)	(en salida de \muCi)	incorporada	al control
GT	4516	0,0015	3,6	20% de disminución
Control	5787	0,0020	4,8	-
FT	4516	0,0021	5,0	sin cambio
FG	5137	0,0023	5,5	10% de aumento
F	5787	0,0026	6,2	30% de aumento
FGT	7738	0,0035	8,4	80% de aumento

Ejemplo 3 Efecto de la composición sobre fibroblastos humanos bajo la exposición a la radiación ultravioleta

La exposición a la radiación ultravioleta A (UVA) es responsable de varios cambios degenerativos en la piel que causan señales visibles de envejecimiento (fotoenvejecimiento). Se probó el efecto protector potencial de los extractos F, G y T y sus combinaciones contra el daño inducido por la radiación ultravioleta por monitorización de marcadores bioquímicos asociados con el fotoenvejecimiento (niveles de MMP-1 y AGEs) tras la irradiación ultravioleta en el cultivo de fibroblasto de piel.

Se expusieron los cultivos de células de fibroblasto humano a una dosis de radiación ultravioleta A cada día durante 4 días consecutivos. Se utilizaron dos dosis diferentes (5 y 7,5 J/cm^{2}) y se corresponden a la máxima dosis tolerada por las células antes de que ocurra la muerte celular.

Se suplementó el cultivo celular con diferentes combinaciones de F, G y T (F, FG, FT, GT y FGT) usando las concentraciones óptimas de F, G y T (según lo determinado y descrito en el Ejemplo 1) y se midió la actividad MMP-1 y la formación de AGE después de 1 día y 4 días.

Métodos

Se produjeron extractos como se describe en el Ejemplo 1.

Se llevaron a cabo cultivos de células como sigue:

Se cambiaron las células con un pasaje determinado a un medio que contiene las combinaciones de tratamiento F, G y T. Se dividieron 1:4 en la confluencia para obtener 4 recipientes para cada tratamiento. En la confluencia se pasaron en serie uno (división 1:4) o dos (división 1:2) a cuatro recipientes nuevos.

Se llevó a cabo la irradiación ultravioleta A del cultivo celular como sigue:

Se produjo una dosis de radiación ultravioleta A usando tubos 6x Philips 40W UVA Cleo Performance. Se utilizó un medidor Hagner UVA para medir la dosis en W/m^{2} y para calcular el tiempo de exposición necesario para conseguir una dosis deseada de 5, 7,5, 10 y 15 J/cm^{2}. Los experimentos preliminares mostraron que la dosis de irradiación óptima que no causa muerte celular era de 7,5 J/cm^{2}.

Se llevó a cabo la determinación de actividad MMP-1 (actividad endógena más niveles latentes) usando un sistema de prueba disponible comercialmente de APBiotech, Código RPN 2629 (Método de Prueba B).

La determinación de AGEs se basó en la técnica ELISA (Método de Prueba C):

Día 1: Se recubrieron las microplacas con 50 ng de AGE/cavidad, diluido en tampón carbonato, durante toda la noche a +4ºC.

Día 2: Se lavaron las cavidades 4 veces con PBST (PBS y 0,05% de Tween 20) y después se bloquearon en 200 \mul/cavidad de PBS-leche (6%) durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Después, en primer lugar, se lavaron 4 veces las cavidades con PBST, antes de agregar a las cavidades 50 \mul de AGE estándar (20-20.000 unidades/cavidad) ó 50 \mul de muestra (50 \mug proteína/ml), seguidos por 50 \mul del anticuerpo policlonal AGE (dilución 1/1000). La placa se dispuso a agitación rápida durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las cavidades 4 veces con PBST antes de agregar el segundo anticuerpo (conejo policlonal, HRP, dilución 1/1000) con 50 \mul/cavidad y se dispuso a agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, se lavaron las cavidades 4 veces en PBST, antes de agregar el sustrato (1 tableta de OPD/3 ml de ddH_{2}O + 1/1000 (v/v) de peróxido de hidrógeno (35%) con 100 \mul/cavidad. Se dejaron las placas en un sitio oscuro, y después del desarrollo del color apropiado, se detuvo la reacción por adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} (1M). Se leyó la absorbancia de la placa a 490 nm (ref. 655 nm)

Resultados

Los resultados de la actividad MMP-1 y de la formación de AGE se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente.

I. Actividad MMP-1

Se mostró que la irradiación ultravioleta A induce la actividad MMP-1 en las células sin tratar (control) tanto en los estudios del día 1 como en los del día 4, confirmando de esa manera la capacidad de inducir MMP-1 por radiación ultravioleta A en fibroblastos cultivados. Durante el proceso de fotoenvejecimiento, aproximadamente se duplicó la actividad MMP-1 de las células de control.

Las células tratadas con GT mostraron un aumento del 34% y del 58% en los días 1 y 4, respectivamente.

Inversamente, en las células con suplemento F se indujo la actividad MMP-1. La actividad MMP-1 aproximadamente se triplicó y cuadruplicó después de la exposición a la radiación ultravioleta en el día 1 y el día 4, respectivamente.

Sorprendentemente, al combinar F con GT para formar FGT no se dio un aumento de la actividad MMP-1 en las células expuestas a la radiación ultravioleta. Así las células tratadas con FGT tienen la mitad de la actividad MMP-1 que las células de control bajo condiciones idénticas.

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TABLA 3

Día 1

	0 J/cm^{2}	5 J/cm^{2}	7,5 J/cm^{2}
control	1	2,01	1,80
GT	1	1,34	1,34
FGT	1	0,97	0,99

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TABLA 3a

Día 4

	0 J/cm^{2}	5 J/cm^{2}	7,5 J/cm^{2}
control	1	2,02	2,3
GT	1	1,37	1,58
FGT	1	1,04	0,99

II. Formación de AGE

Los resultados se exponen en la Figura 3 y en la Tabla 4. Tras una dosis única de exposición a la radiación ultravioleta (5 J/cm^{2}), el nivel de AGE en las células de control sin suplemento aumentó aproximadamente 20 veces en comparación con las células de control no-irradiadas. Bajo las mismas condiciones, el nivel de AGE en cultivos con suplemento F aumentó 40 veces, lo que muestra que F no tiene un efecto protector sobre la formación de AGE tras la irradiación ultravioleta. Según la Figura 3 aparecen los niveles de AGE en las células con suplemento FG aumentados en 72 unidades, lo cual se halla dentro del mismo rango que las células de control sin tratar irradiadas (una disminución del 10% con respecto al control).

Notablemente, las células tratadas con FGT mostraron una disminución sorprendente en el nivel de AGE de aproximadamente 22 unidades con respecto a las células no irradiadas, lo cual se traduce en una disminución del 120% en la concentración de AGE respecto a las células no tratadas irradiadas.

De este modo las composiciones de la presente invención proporcionaron mejoras en la incorporación de prolina así como que proporcionaron efectos benéficos en células expuestas a la radiación ultravioleta en términos de actividad MMP-1 y de formación de AGE.

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TABLA 4

	5 J/cm^{2}	7,5 J/cm^{2}
control	80,06	67,88
F	152,72	258,21
FG	72,04	118,58
FGT	-21,94	-34,92

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Ejemplo 4

Se prepararon composiciones de acuerdo con la invención usando los siguientes ingredientes mezclados en las proporciones especificadas (las cantidades dadas son por unidad de dosaje final):

Como el licopeno es sensible a la oxidación, la mezclas de granulado y la manipulación, compresión de tabletas, almacenamiento de tabletas y envasado en planchas blister Al-Al se llevan todas a cabo bajo atmósfera protectora de nitrógeno.

Composición 1

Código de tableta SF

-: 105 mg de extracto de cartílago (preparado mediante hidrólisis proteolítica enzimática de cartílago, filtración y secado en spray del hidrolizado);

-: 100 mg de extractos vegetales (que contienen aprox. 1,5 mg de licopeno extraído de tomates y aprox. 14 mg de flavonoides extraídos de semillas de uva, el remanente consiste en fibra de soja, aceite de tomate y dióxido de silicio; Alextan® de Indena, Milán, Italia);

-: 30 mg de extracto de Acerola (que contiene aprox. 7,5 mg de ácido ascórbico, el remanente consiste en constituyentes de Acerola y maltodextrina);

-: 66 mg de celulosa microcristalina

-: 4 mg de dióxido de silicio (tamaño de partícula 2,4-3,6 \mum).

La mezcla se llevó a cabo en una mezcladora Lödige durante 6 minutos. La mezcla en polvo se comprimió en tabletas con un peso de 305 mg.

Composición 2

Código de tableta SF-1

-: 30 mg de extracto de Acerola (que contienen aprox. 7,5 mg de ácido ascórbico, el remanente consiste en constituyentes de Acerola y maltodextrina);

-: 81 mg de celulosa microcristalina

-: 4 mg de dióxido de silicio (tamaño de partícula 2,4-3,6 \mum).

La mezcla se llevó a cabo en una mezcladora Lödige durante 6 minutos. La mezcla en polvo se comprimió en tabletas con un peso de 320 mg.

Composición 3

Código de tableta SS

-: 62 mg de inulina

-: 30 mg de ácido ascórbico

-: 15 mg de gluconato de cinc

-: 13 mg de dióxido de silicio (tamaño de partícula 2,4-3,6 \mum).

La mezcla se llevó a cabo en una mezcladora Lödige durante 6 minutos. La mezcla en polvo se comprimió en tabletas con un peso de 325 mg.

Composición típica

FE: 105 mg

GE: 13,75 mg

TE: 14,38 mg (de los cuales, el licopeno es el 10% = 1,44 mg)

Ejemplo 5

La composición en el Ejemplo 1 se probó en un test de consumidor para determinar la percepción de cambios en la piel del consumidor.

129 voluntarios entraron en un estudio de tres meses y tomaron dos tabletas diarias que contenían la composición del Ejemplo 1. Los voluntarios registraron la apariencia y calidad de su piel antes de comenzar la prueba. Después de 1, 2, y 3 meses de suplementación, los voluntarios evaluaron los cambios en la apariencia y calidad de la piel de acuerdo a los siguiente códigos: 0-condición sin cambio, 1-ligeramente mejorada, 2-mejorada, 3-muy mejorada.

La Figura 4 muestra los resultados de la evaluación de los parámetros "condición general de la piel", "elasticidad", calidad de la "piel alrededor de ojos" y "piel alrededor de boca". Las mejoras se porcentuaron con los voluntarios que notaron mejoras.

Referencias

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2. Fisher, G.J. y col. Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light. N. Engl. J. Med. 337, 419-1428 (1997).

3. Fisher, G.J. & Voorhees, J.J.Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce Ap-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 3, 61-68 (1998).

4. Fisher, G.J., Talwar, H.S., Lin, J. & Voorhees, J.J. Molecular mechanisms of photoaging in human skin in vivo and their prevention by all-trans retinoic acid. Photochem. Photobiol. 69, 154-157 (1999).

5. Hase, T. y col. Histological increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects: the possible involvement of matrix metalloproteinase-1 produced by inflammatory infiltrate on collagen degradation. Br. J. Dermatol. 142, 267-273 (2000).

6. Petersen, M.J., Hansen,C. & Craig, S. Ultraviolet A irradiation stimulates collagenase production in cultured human fibroblasts. J. Invest Dermatol. 99, 440-444 (1992).

7. Scharffetter, K. y col. UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo. Arch. Dermatol. Res. 283, 506-511 (1991).

8. Wlaschek, M., Briviba, K. & Stricklin,P. Singlet Oxygen May Mediate Ultraviolet A-Induced Synthesis of Interstitial Collagenase. J. Invest Dermatol. 104, 194-198 (1995).

9. Fu, M.X., Knecht, K.J., Thorpe, S.R. & Baynes, J.W. Role of oxygen in cross-linking and chemical modification of collagen by glucose. Diabetes 41 Suppl 2, 42-48 (1992).

10. Masaki, H.,Okano, Y.& Sakurai, H.Generation of active oxygen species from advanced glycation end- products (AGEs) during ultraviolet light A (UVA) irradiation and a possible mechanism for cell damaging. Biochim. Biophys. Acta 1428, 45-56 (1999).

Claims

1. Una composición que comprende

i) extracto de cartílago que se obtiene por hidrólisis proteolítica enzimática, donde el extracto comprende un glicosaminoglicano,

o formas sintéticas de un glicosaminoglicano extraíble de cartílago por hidrólisis proteolítica enzimática;

ii) un extracto que contiene antioxidantes hidrófilos, y en el que el extracto comprende antioxidantes hidrófilos seleccionados entre un grupo que consiste en polifenoles y ésteres de los mismos, o formas sintéticas de polifenoles y ésteres de los mismos extraíbles de las semillas de uva; y

iii) licopeno o un extracto de tomate que comprende licopeno.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el extracto de cartílago y los compuestos extraíbles del cartílago comprenden glicosaminoglicanos seleccionados entre el grupo que consiste en un éster de condroitina, un éster de keratán, ácido hialurónico o un éster de los mismos, un éster de dermatán, heparina, un éster de heparán,

y epímeros y polímeros de los mismos,

cada uno de los cuales puede estar opcionalmente unido a un péptido.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que los glicosaminoglicanos son seleccionados entre el grupo que consiste en condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, y sulfato de keratán, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente unido a un péptido.

4. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende menos del 1% peso/peso de colágeno, preferiblemente menos del 0,5%, particularmente preferiblemente menos del 0,1%, más preferiblemente siendo libre de colágeno.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el extracto contiene antioxidantes hidrófilos que se obtienen de semillas de uva.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los antioxidantes hidrófilos se extraen de un grupo que consiste en corteza de pino, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus marianum, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que uno o más antioxidantes hidrófilos comprenden un oligómero de procianidol.

8. La composición según la reivindicación 1, en la que el extracto de tomate además comprende un carotenoide seleccionado entre el grupo que consiste en \alpha-caroteno, \beta-caroteno, \gamma-caroteno, \delta-caroteno, zeaxantina, criptoxantina, luteína, y xantofila.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende aproximadamente de 0,1 a 5% de licopeno peso/peso, preferiblemente de 0,2 a 4% de licopeno, tal como de 0,3 y 2% de licopeno, más preferiblemente de 0,3 a 1% de licopeno, particularmente de 0,3 a 0,8%, tal como de 0,3 a 0,6% de licopeno.

10. La composición según la reivindicación 1, en la que el extracto de tomate comprende 5-12% de licopeno; 1-1,5% de tocoferoles; 0,05-0,15% de \beta-caroteno; 0,5-0,75% de fitoeno; y 0,5-0,55% de fitoflueno.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende menos del 0,025% de beta-caroteno, preferiblemente menos del 0,02% de beta-caroteno, particularmente menos del 0,01% de beta-caroteno.

12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el extracto de cartílago obtenido por hidrólisis proteolítica enzimática o formas sintéticas de los compuestos extraídos del cartílago por hidrólisis proteolítica enzimática y los antioxidantes hidrófilos están presentes en una proporción p/p desde 2:1 a 100:1.

13. La composición según la reivindicación 5 que comprende 0,25-15 mg de licopeno y 2,5-100 mg de extracto de semillas de uva.

14. La composición según la reivindicación 5 que comprende 1-2,5 mg de licopeno y 10-25 mg de extracto de semillas de uva.

15. La composición según la reivindicación 13, que comprende 1-2,5 mg de licopeno, 5-50 mg de extracto de semillas de uva y 50-200 mg de extracto de cartílago.

16. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende

i): 20-40% de extracto de cartílago, peso/peso;

ii): 1-10% de extracto de semillas de uva peso/peso; y

iii): 1-10% de extracto de tomate, peso/peso.

17. La composición según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 26 que comprenda además extracto de Acerola.

18. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende

: 100-110 mg de extracto de pescado (como extracto de cartílago)

: 95-105 mg de extractos vegetales

: 25-35 mg de extracto de Acerola

: 60-90 mg de celulosa microcristalina

: 3,5-4,5 mg de dióxido de silicio

en la que los extractos vegetales comprenden un oligómero de procianidol y licopeno y los extractos de pescado comprenden un glicosaminoglicano.

19. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende

: 100-110 mg de extracto de pescado (como extracto de cartílago)

: 95-105 mg de extractos vegetales

: 60-65 mg de inulina

: 25-35 mg de ácido ascórbico

: 10-20 mg de gluconato de cinc

: 10-15 mg de dióxido de silicio

20. La composición según la reivindicación 5, en la que el extracto de semillas de uva está formulado para liberación lenta y el licopeno está formulado para liberación normal.

21. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para utilizar como un producto cosmético oral, un alimento o suplemento alimentario, un farmacéutico o un dietético.

22. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición se administra como un comprimido, polvo, gránulo, granulado, cápsula, bolsita o solución, suspensión, tónico o jarabe.

23. Uso de la combinación de i) extracto de cartílago obtenido por hidrólisis proteolítica enzimática, en la que el extracto comprende un glicosaminoglicano;

o formas sintéticas de un glicosaminoglicano extraíble del cartílago por hidrólisis proteolítica enzimática; ii) un extracto que contiene antioxidantes hidrófilos, en el que el extracto se obtiene de semillas de uva; y en el que el extracto comprende antioxidantes hidrófilos seleccionados del grupo que consiste en polifenoles y ésteres de los mismos; iii) licopeno o un extracto de tomate que comprende licopeno;

o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-22

para la preparación de un agente para impedir o retardar las señales del envejecimiento de la piel, impedir o aminorar los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta, para tratar estrías, para reducir las cicatrices, o para contribuir en la cicatrización.

24. Uso de la combinación de i) extracto de cartílago obtenido por hidrólisis proteolítica enzimática, en la que el extracto comprende un glicosaminoglicano;

o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-22

para la preparación de un agente para el tratamiento del acné.

25. Uso de la combinación de i) extracto de cartílago obtenido por hidrólisis proteolítica enzimática, en la que el extracto comprende un glicosaminoglicano;

o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-22

para la preparación de un agente para aminorar los síntomas de eczema, para aminorar los síntomas de psoriasis, o para tratar piel áspera, decolorada o seca.