PL204004B1 - Kompozycja zawierająca ekstrakty chrząstki oraz hydrofilowe i lipofilowe przeciwutleniacze oraz jej zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji do stosowania doustnego, która zawiera chrząstkę lub związki ekstrahowane z chrząstki, oraz hydrofilowe i lipofilowe przeciwutleniacze oraz jej zastosowania.

Wolne rodniki tworzą się w organizmie, np. w skórze, na skutek działania promieniowania UV, zanieczyszczeń, alkoholu, itp. Nadmiar wolnych rodników może powodować ciężkie uszkodzenia struktury tkanki, w tym struktury skóry, przez co zaczynają pojawiać się oznaki starzenia.

W związku z tym stosuje się przeciwutleniacze, zarówno hydrofilowe jak i lipofilowe jako ich kombinację, w celu zmniejszenia stresu oksydacyjnego powodowanego przez wolne rodniki w skórze (Maffei Facino i in., „Free Radical Scavenging and Anti-enzyme Activities of Procyyanidnes from Vitis vinifera”, Arzneim. - Forsch./Drug Res., 44(1), Nr 5(1994), str. 592-601).

W opisie patentowym USA nr 5648277 ujawniono preparaty doustne, zawierające zarówno przeciwutleniacze hydrofilowe jak i lipofilowe.

W japoń skim opisie patentowym nr JP 09241637 ujawniono kompozycje, zawierają ce aktywny łapacz wolnych rodników i kwasy uronowe lub mukopolisacharydy.

Ustalono także, że podawane kompleksy białkowe zawierające mukopolisacharydy pochodzące z chrząstki zwierząt morskich mają zdolność poprawiania struktury skóry właś ciwej poprzez powodowanie jej gęstnienia i sztywnienia. (Kieffer ME, Ef sen J., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., 1998 Sep; 11(2): 129-136).

Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili, że rezultatem wyjątkowej kombinacji ekstraktu chrząstki ze specjalną mieszanką ekstraktów roślinnych jest zaskakująco skuteczna kompozycja zwiększająca syntezę kolagenu w skórze oraz redukująca w znacznym stopniu powodowane przez wolne rodniki utlenianie wewnątrz skóry właściwej. Zarówno spadek syntezy kolagenu jak i utlenianie rodnikowe są związane z procesami starzenia się skóry.

W pierwszym aspekcie, wynalazek dotyczy kompozycji która zawiera:

i) ekstrakt chrząstki, otrzymywany przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne, który to ekstrakt obejmuje glikozoaminoglikan lub syntetyczne formy glikozoaminoglikanów ekstrahowanych z chrzą stki przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne;

ii) jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy wybranych z grupy składającej się z polifenoli i ich estrów, które to hydrofilowe przeciwutleniacze są ekstrahowalne z pestek winogron lub są syntetycznymi formami hydrofilowych przeciwutleniaczy ekstrahowalnych z pestek winogron; i iii) likopen lub ekstrakt z pomidora zawierający likopen;

przy czym hydrofilowy przeciwutleniacz i likopen są obecne w stosunku wagowym od 1:1 do

200:1.

Generalnie, wynalazek dotyczy więc kompozycji do podawania doustnego, zawierającej ekstrakt roślinny i ekstrakt z chrząstki, w której ekstrakt roślinny obejmuje ekstrakt z pestek winogron i ekstrakt z pomidorów.

Wynalazek może być alternatywnie określony jako kompozycja do podawania doustnego, zawierająca ekstrakt roślinny i ekstrakt z chrząstki, w której ekstrakt roślinny stanowi ekstrakt z pestek winogron i likopen w stosunku wagowo/wagowym około 5:1 do 15:1, korzystnie około 10:1.

Dalszym aspektem wynalazku jest kompozycja taka jak tu określona, służąca generalnie do utrzymywania zdrowej skóry, do opóźniania początku degeneracji skóry spowodowanej starzeniem się lub ekspozycją na UV, oraz do usuwania oznak starzenia się skóry.

Używany w opisie wynalazku termin „hydrofilowy” stosowany dla przeciwutleniacza hydrofilowego generalnie oznacza, że przeciwutleniacz jest wystarczająco rozpuszczalny, a przez to zdolny do funkcjonowania, w medium wodnym w ciele. W obecnym kontekście, przeciwutleniacz jest uważany za hydrofilowy, jeśli ma rozpuszczalność w wodzie powyżej 0,05 g na 100 g wody. Przeciwutleniacz hydrofilowy korzystnie ma rozpuszczalność w wodzie powyżej 0,5 g, bardziej korzystnie powyżej 1 g, w szczególnoś ci powyż ej 5 g, bardziej szczególnie powyż ej 10 g, najbardziej szczególnie powyż ej 25, zwłaszcza powyżej 50 g, taką jak powyżej 100 g na 100 g wody.

Podobnie, termin „lipofilowy dla przeciwutleniacza lipofilowego generalnie oznacza, że jest on wystarczająco rozpuszczalny, a przez to zdolny do działania, w medium lipidowym w ciele. Oznacza to również, że ma on bardzo niską rozpuszczalność w wodzie .W tym opisie, przeciwutleniacz jest uważany za lipofilowy, jeśli ma rozpuszczalność w wodzie poniżej 0,05 g na 100 g wody. Przeciwutleniacz lipofilowy korzystnie ma rozpuszczalność w wodzie poniżej 0,005 g, w szczególności poniżej 0,0005 g na 100 g wody.

PL 204 004 B1

Termin „ekstrakt chrząstki obejmuje ekstrakt chrząstki otrzymanej przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne i obejmuje glikozoaminoglikan. Może obejmować syntetyczne formy związków ekstrahowalnych z chrząstki i syntetycznie wytworzone pochodne. Związki określane jako „ekstrakt chrząstki” mogą również występować w innej tkance zawierającej tkankę łączną, np. skórze lub w skórze zwierzęcej, i mogą być z niej wyekstrahowane. Chrząstka może być wybrana z grupy składającej się z chrząstki zwierząt morskich, chrząstki rybiej, chrząstki mięczaków i chrząstki ssaków żyjących na lądzie. Zwierzęta morskie mogą być wybrane z grupy składającej się z walenia, delfina i foki; ryba może być wybrana z grupy składającej się z rekina, łososia, tuńczyka, dorsza i innych znanych ryb; mięczakiem może być kałamarnica; a ssak żyjący na lądzie może być wybrany z grupy składającej się z bydła, świni, kurcząt, kaczki i indyka. Chrząstka lub ekstrakt chrząstki są korzystnie wybrane z chrzą stki bydlę cej, chrzą stki ś wiń skiej, chrzą stki rekina, chrzą stki kał amarnicy, chrzą stki kurczaka i chrząstki łososia oraz ekstraktów z nich.

Może być stosowana chrząstka jako taka. Typowo może ona być stosowana w formie chrząstki suszonej, np. liofilizowanej i rozdrobnionej. Użyteczne ekstrakty wyżej wymienionych ekstraktów chrząstki lub innych tkanek zawierających odpowiednie składniki mogą być typowo wytworzone przez częściową proteolityczną hydrolizę enzymatyczną gotowanej tkanki, a następnie filtrację i suszenie hydrolizatu, np. poprzez suszenie rozpyłowe lub liofilizację. Zaletą takich ekstraktów jest to, że są one częściowo lub całkowicie rozpuszczalne w medium wodnym (wytworzone według opisu patentowego US 38622003).

Ekstrakt chrząstki typowo zawiera jeden lub więcej związków ekstrahowalnych z chrząstki, a korzystnie zawiera glikozoaminoglikany, ewentualnie związane z peptydem. Ekstrakt chrząstki korzystnie stanowi siarczan chondroityny, siarczan keratanu, kwas hialuronowy lub siarczan dermatanu lub ich mieszaniny. Termin „ekstrakt chrząstki” obejmuje związki, które otrzymywalne są z chrząstki, ale związki mogą być faktycznie otrzymane z innych źródeł. Szczególnie korzystnym źródłem ekstraktu chrząstki jest chrząstka rekina.

Termin „ekstrakt chrząstki” może odnosić się do związków ekstrahowalnych z chrząstki lub ich pochodnych. Jak stwierdzono, ekstrakt chrząstki może pochodzić z innych źródeł naturalnych, ale może być również ze źródła syntetycznego, to jest wytworzony syntetycznie lub półsyntetycznie. Korzystnie, ekstrakt chrząstki jest ekstrahowany ze źródła naturalnego, najkorzystniej ekstrakt jest ekstrahowany z chrząstki.

Jak stwierdzono, wynalazek dotyczy w pierwszym aspekcie kompozycji do podawania doustnego, zawierającej ekstrakt roślinny i ekstrakt z chrząstki, w której ekstrakt roślinny stanowi ekstrakt z pestek winogron i ekstrakt z pomidorów w stosunku wagowo/wagowym około 2:1 do 1:2, korzystnie około 1:1. Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili nieoczekiwanie, że wynikiem wyjątkowego połączenia ekstraktu chrząstki ze specjalną mieszanką ekstraktów roślinnych jest zaskakująco skuteczna kompozycja do zwiększania syntezy kolagenu w skórze oraz redukcji w znaczącym stopniu procesu degradacji skóry właściwej, powodowanej przez promieniowanie UV i stres oksydacyjny, taki jak utlenianie rodnikowe.

Korzystne efekty kombinacji ekstraktu z pestek winogron i ekstraktu z pomidorów jako przeciwutleniaczy nieoczekiwanie radykalnie polepszył dodatek ekstraktu chrząstki. Wyniki były zaskakujące po części dlatego, że ekstrakt chrząstki nie ma sam z siebie aktywności przeciwutleniającej.

Typowo, ekstrakt chrząstki i ekstrakt roślinny są obecne w stosunku wagowo/wagowym około 1:2 do 2:1, korzystnie około 1:1.

Ekstrakt chrząstki korzystnie zawiera glikozoaminoglikany wybrane z grupy składającej się z estru chondroityny, estru keratanu, kwasu hialuronowego lub jego estru, estru dermatanu, heparyny, estru heparanu. Mogą być one związane z białkiem lub peptydem lub mogą być epimerycznymi lub polimerycznymi formami estru chondroityny, estru keratanu, kwasu hialuronowego lub jego estru, estru dermatanu, heparyny, estru heparanu, korzystnie siarczanu chondroityny, siarczanu keratanu, kwasu hialuronowego lub jego estru, siarczanu dermatanu, heparyny, siarczanu heparanu.

Glikozoaminoglikany mogą być wybrane z grupy składającej się z 4-siarczanu chondroityny, 6-siarczanu chondroityny i siarczanu keratanu, z których każdy może być ewentualnie związany z peptydem. Najbardziej korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera ekstrakt chrząstki, zawierający siarczan chondroityny, ewentualnie związany z peptydem.

W typowym wykonaniu wynalazku ekstrakt chrzą stki zawiera 5-100% siarczanu chondroityny.

W korzystnej realizacji, kompozycja według wynalazku zawiera poniż ej 1% wagowych kolagenu, korzystnie poniżej 0,5%, szczególnie korzystnie poniżej 0,1% białka kolagenu. Przy typowym sposobie

PL 204 004 B1 sporządzania ekstraktu kolagenu, nie zawiera on kolagenu w istotnej ilości. Ekstrakt korzystnie wytwarza się poprzez proteolityczną hydrolizę enzymatyczną, w której białko kolagenu trawi się do peptydów. Kompozycja zawierająca ten ekstrakt mający niski poziom kolagenu wykazywała nieoczekiwane korzystne efekty. W konsekwencji, do kompozycji według wynalazku korzystnie nie dodaje się dalej kolagenu ani jego źródła. W najkorzystniejszym wykonaniu kompozycja jest zasadniczo wolna od kolagenu.

Podobnie, kompozycja według wynalazku zazwyczaj zawiera poniżej 0,025% beta-karotenu, korzystnie poniżej 0,02% beta-karotenu, szczególnie korzystnie poniżej 0,01%. Zatem, dalszym aspektem wynalazku jest kompozycja, która może wywierać korzystne skutki jakie opisano wyżej przy bardzo małej ilości beta-karotenu lub zasadniczo bez beta-karotenu.

W przeciwień stwie do tego, obecnie zrozumiano, ż e zawartość likopenu, wzglę dna lub bezwzględna, jest szczególnie ważna dla osiągnięcia nieoczekiwanych korzystnych efektów działania kompozycji według wynalazku. Ekstrakt roślinny, zwłaszcza ekstrakt z pomidorów, stanowi likopen. Korzystnie, ekstrakt z pomidorów zawiera wagowo około 5 do 12%, zwykle w przybliżeniu 10% likopenu. Ekstrakt z pomidorów może pochodzić od jednej odmiany lub od mieszanki pomidorów.

W typowej realizacji wynalazku, odmianą pomidora stosowan ą do wytworzenia ekstraktu z pomidorów jest odmiana Lycopersicum aesculentum, dostarczająca odpowiednie, względne i bezwzględne, poziomy likopenu.

W korzystnej realizacji wynalazku, kompozycja zawiera 0,1 do 5% wagowych likopenu, korzystnie 0,2 do 4% wagowych likopenu, tak jak 0,3 do 2% likopenu, najbardziej korzystnie 0,3 do 1% likopenu, szczególnie 0,3 do 0,8%, tak jak 0,3 do 0,6% likopenu.

W alternatywnej definicji kompozycji wedł ug wynalazku, kompozycja zawiera ekstrakt roś linny i ekstrakt chrzą stki, gdzie ekstrakt roś linny stanowi ekstrakt z pestek winogron i likopen w stosunku wagowym 5:1 do 15:1, korzystnie około 10:1. Jak stwierdzono, likopen w wymienionym stosunku ma zgodnie z obecnym rozumieniem wynalazku istotne znaczenie dla uzyskiwania nieoczekiwanego korzystnego efektu przeciwutleniającego.

W odpowiedniej realizacji, aktywność przeciwutleniają ca IC50 przeciwutleniacza lipofilowego jest niższa niż 1,2 x 10^-7 dla wychwytywania rodników R7ROO^ w peroksydacji lipidowej nienasyconego fosfolipidu w medium wodnym. Typowo, przeciwutleniaczem lipofilowym wykazującym aktywność przeciwutleniającą IC50 przeciwutleniacza lipofilowego co najwyżej 1,2 x 10^-7 dla wychwytywania rodników R7ROO^ w peroksydacji lipidowej nienasyconego fosfolipidu w medium wodnym jest związek karotenoidowy likopen (określany także ψ,ψ-karoten). Likopen może być typowo otrzymany przez ekstrakcję z pewnych świeżych owoców, takich jak pomidory, arbuzy, czerwone grapefruity lub guawa w sposób jako taki znany, lub może być wytworzony syntetycznie w znany sposób.

Korzystne efekty działania kompozycji doustnej według wynalazku są rezultatem nowej kombinacji trzech składników; ekstraktu chrząstki, ekstraktu z pestek winogron i ekstraktu z pomidorów. Ekstrakt z pestek winogron dostarcza przeciwutleniaczy hydrofilowych. Ekstrakt z pomidorów dostarcza przeciwutleniaczy lipofilowych. Wynalazek dotyczy zatem nowej kombinacji przeciwutleniaczy ze związkami ekstrahowalnymi z chrząstki. Następny aspekt niniejszego wynalazku stanowi zatem kompozycja do podawania doustnego, która zawiera i) chrząstkę, jeden lub więcej związków ekstrahowalnych z chrząstki, lub jego pochodne; ii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy hydrofilowych; oraz iii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy lipofilowych; która to kompozycja zwiększa syntezę kolagenu o co najmniej 35% w oznaczeniu metodą testową A.

W starzejących się komórkach skóry synteza kolagenu zauważalnie spada. Spadek kolagenu w skórze powoduje zmianę struktury i cech reologicznych skóry, oraz typowe oznaki starzenia, takie jak zmarszczki, zmniejszona gładkość, utrata elastyczności i sztywności.

Jak przedstawiono w przykładzie 2, kompozycja według wynalazku powoduje zaskakująco radykalne zwiększenie syntezy kolagenu, w porównaniu z innymi kombinacjami i pojedynczymi składnikami. Syntezę kolagenu oceniano przez pomiar wprowadzenia radioaktywnej proliny ([¹⁴C]proliny) do białek zawierających prolinę, którymi jak się uważa jest głównie kolagen, w którym 30% całkowitej liczby aminokwasów stanowi prolina.

Hodowla fibroblastów skóry właściwej w medium zawierającym kombinację (GT) ekstraktu z pestek winogron (G) i ekstraktu z pomidorów (T) (jak ujawniona w opisie patentowym USA nr 5648277) powodowała spadek stopnia wprowadzania proliny w porównaniu z badaniem kontrolnym: 3,6% wprowadzania w porównaniu z 4,8% w badaniu kontrolnym, co stanowi spadek o 25%. Hodowle komórkowe zawierające kombinację (FT) ekstraktu ryb (F) i ekstraktu z pomidorów (T) nie miały znaczącego

PL 204 004 B1 wpływu na wprowadzanie proliny, ponieważ stopień wprowadzania wynosił 5,0% w porównaniu z 4,8% w badaniu kontrolnym i, co stanowi wzrost tylko o 4%. W hodowlach komórkowych zawierających kombinację (FG) ekstraktu z ryb (F) i ekstraktu z winogron (G) następował mały wzrost stopnia wprowadzania proliny: 5,5% wprowadzania, co stanowi 10% wzrost w porównaniu do badania kontrolnego. W hodowlach komórkowych zawierających tylko ekstrakt z ryb (F) następował wzrost stopnia wprowadzania proliny: 6,2% wprowadzania, co stanowi 29% wzrost.

W komórkach hodowanych z kompozycją według wynalazku (FGT), zawierającą ekstrakt z ryb (F), ekstrakt z pestek winogron (G) i ekstrakt z pomidorów (T) następował jednakże radykalny 80% wzrost wprowadzania proliny: (8,4% wprowadzania proliny). Przy 25% spadku syntezy kolagenu spowodowanym przez ekstrakt GT i 29% wzroście syntezy kolagenu spowodowanym przez ekstrakt F, 80% wzrost syntezy kolagenu po połączeniu F z GT jest zaskakujący.

Jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy w kompozycji według wynalazku może być ze źródeł naturalnych lub syntetycznych, korzystnie źródeł naturalnych. W typowej realizacji, źródło naturalne jest wybrane z grupy składającej się z kory sosnowej, Vitis vinofera, Camelia sinensis, Aesculus hipocastanum, Gingo biloba, Cardus marianum, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum.

W odpowiedniej realizacji, jeden lub wię cej niż jeden hydrofilowy przeciwutleniacz jest ekstrahowalny z pestek winogron Vitis vinifera.

Naturalne źródło jednego lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy zazwyczaj zawiera do 25% wagowych katechiny, epikatechiny i kwasu galusowego; do 90% wagowych dimeru, trimeru i/lub tetrameru epikatechiny i/lub jej galusanów; oraz do 10% wagowych pentameru, heksameru i/lub heptameru epikatechiny i/lub jej galusanów.

Jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy może być wybranych z grupy składającej się z polifenoli i ich estrów; kwasu askorbinowego (witaminy C) i jego estrów; oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli. Polifenolami są typowo katechiny; leukoantocyjanidyny i flawanony; flawaniny, flawony i antocyjaniny; flawonole; flawolignany; i ich oligomery.

W korzystnej realizacji, przeciwutleniaczem hydrofilowym jest katechina wybrana z grupy składającej się z proantocyjaniny A2 i oligomerycznego procyjanidolu (OPC), najbardziej korzystnie oligomeryczny procyjanidol.

Flawolignanami są zwykle silimaryna lub jeden z jej składników, takich jak silibina, silidianina, silikrystyna i izosilibina.

W kompozycji wedł ug wynalazku, przeciwutleniaczem hydrofilowym jest zwykle przeciwutleniacz, który wykazuje aktywność przeciwutleniającą IC50 co najwyżej 5x10^-7 dla wychwytywania rodników R7ROO· w peroksydacji lipidowej nienasyconego fosfolipidu w medium wodnym.

Jak stwierdzono, szczególnie korzystnym przeciwutleniaczem hydrofilowym jest ekstrakt z pestek winogron, np. pestek Vitis vinifera, który to ekstrakt jest zwykle otrzymywany przez ekstrahowanie pestek winogron przy użyciu rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton i/lub octan etylu lub podobne, odparowanie rozpuszczalników, ponowne rozpuszczenie pozostałości w wodzie, oraz przesączenie i suszenie przesączu, np. przez suszenie rozpyłowe lub liofilizację. W szczególnie korzystnej realizacji, ekstrakt taki zwykle zawiera do 25% wagowych katechiny, epikatechiny i kwasu galusowego; do 90% wagowych dimeru, trimeru i/lub tetrameru epikatechiny i/lub jej galusanów; oraz do 10% wagowych pentameru, heksameru i/lub heptameru epikatechiny i/lub jej galusanów.

Jeden lub więcej z lipofilowych przeciwutleniaczy może pochodzić również ze źródeł naturalnych lub syntetycznych, zwykle ze źródła naturalnego. Przeciwutleniacz lipofilowy może być mieszaniną przeciwutleniaczy takich jak ekstrakt ze źródła naturalnego, obejmujący kompleksową mieszaninę przeciwutleniaczy lipofilowych. Odpowiednim naturalnym źródłem przeciwutleniacza lipofilowego jest odmiana pomidora, szczególnie odmiana Lycopersicum aesculentum.

Jednym lub więcej przeciwutleniaczami lipofilowymi są zwykle karotenoidy, prokarotenoidy, tokoferole, fitosterole i ubichinony. Karotenoidy są szczególnie interesującymi przeciwutleniaczami lipofilowymi i mogą być wybrane z grupy składającej się z α-karotenu, β-karotenu, γ-karotenu, δ-karotenu, likopenu (ψ,ψ-karoten), zeaksantyny, kryptoksantyny, luteiny i ksantofilu.

Jak stwierdzono, szczególnie interesującym przeciwutleniaczem lipofilowym jest karotenoid likopen. Kompozycja według wynalazku najbardziej korzystnie zawiera likopen. Ekstrakty służące jako źródło przeciwutleniacza lipofilowego korzystnie zawierają 5-12% likopenu, jak 7-12% likopenu, korzystnie w przybliżeniu 10% likopenu. Zwykle przekłada się to na kompozycję według obecnego wynalazku zawierającą wagowo 0,1 do 5% likopenu, korzystnie 0,2 do 4% likopenu, jak 0,3 do 2% likopenu, najbardziej korzystnie 0,3 do 1% likopenu, szczególnie 0,3 do 0,8%, jak 0,3 do 0,6% likopenu.

PL 204 004 B1

Naturalne źródło przeciwutleniacza lipofilowego korzystnie zawiera:

5-12%

1-1,5%

0,05-0,15%

0,5-0,75%

0,5-0,55% likopenu tokoferoli beta-karotenu fitoenu fitofluenu najbardziej korzystnie zawierając:

7-12% likopenu

1-1,5% tokoferoli

0,05-0,15% beta-karotenu

0,5-0,75% fitoen

0,5-0,55% fitofluenu.

Źródło jednego lub więcej przeciwutleniaczy korzystnie zawiera mniej niż 1% beta-karotenu, tak jak mniej niż 0,75%, tak jak mniej niż 0,5%, korzystnie mniej niż 0,25%, najbardziej korzystnie mniej niż 0,2%, szczególnie mniej niż 0,15%. Podobnie, kompozycja według obecnego wynalazku zwykle zawiera mniej niż 0,025% beta-karotenu, korzystnie mniej niż 0,02% beta-karotenu, szczególnie mniej niż 0,01% beta-karotenu.

Zatem dalszy aspekt wynalazku dotyczy kompozycji, która wywiera korzystne skutki takie jak opisano wyżej przy bardzo małej zawartości beta-karotenu lub zasadniczo będąc wolna od betakarotenu.

W typowej realizacji, jedynym źródłem przeciwutleniacza lipofilowego jest ekstrakt z pomidorów. Alternatywnie, przeciwutleniacz lipofilowy stanowi ekstrakt z pomidorów.

W typowej realizacji wynalazku kompozycja zawiera:

20-40% wagowych ekstraktu chrząstki, tak jak 25-35%, korzystnie 27-35%, tak jak 30-35% ekstraktu chrząstki;

1-10% wagowych ekstraktu z pestek winogron, na przykład 2-8%, korzystnie 3-7%, na przykład 3-5%; i

1-10% wagowych ekstraktu z pomidora, na przykład 2-8%, korzystnie 3-7%, na przykład 3-5%.

Typowa kompozycja według obecnego wynalazku zawiera ekstrakt z ryb (F), ekstrakt z pestek winogron (G) i ekstrakt z pomidora (T) w stosunku wagowym od 5:1:1 do 15:1:1, takim jak około 10:1:1.

Jak stwierdzono, kompozycja według obecnego wynalazku jest zdolna do zwiększania syntezy kolagenu o co najmniej 35%, w oznaczeniu metodą testową A. Jednak korzystnie, zastosowanie kompozycji w warunkach metody testowej A powoduje zwiększenie syntezy kolagenu o co najmniej 40%, jak na przykład o co najmniej 45%, jak na przykład o co najmniej 50%, jak co najmniej 55%, korzystnie co najmniej 60%, tak jak na przykład co najmniej 65%, co najmniej 70%, najbardziej korzystnie co najmniej 75%.

Sposób zwiększania syntezy kolagenu lub zmniejszenia spadku syntezy kolagenu w skórze właściwej, polega na doustnym podawaniu określonej tu kompozycji.

Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili, że nowa kompozycja według wynalazku nie tylko powoduje zwiększenie syntezy kolagenu, ale ma również inne wskaźniki jej użyteczności w traktowaniu starzejącej się skóry lub skóry po ekspozycji na promieniowanie UV. Zgodnie z tym, w odpowiedniej realizacji, kompozycja zmniejsza szkodliwe efekty wolnych rodników o co najmniej 40% przy pomiarze aktywności MMP-1 w porównaniu z badaniem kontrolnym w warunkach metody testowej B, jak na przykład o co najmniej 45%, tak jak o co najmniej 50%. Wolne rodniki tlenowe i ich szkodliwe efekty są zwykle związane z ekspozycją na promieniowanie UV, ale mogą być spowodowane innymi czynnikami środowiskowymi, fizjologicznymi lub genetycznymi.

Indukowana przez promieniowanie UV nadprodukcja enzymów MMP jest uważana za jedną z głównych przyczyn fotostarzenia. Promieniowanie UV aktywuje komórki skóry właściwej, powodując nadprodukcję enzymów MMP, które są enzymami degradującymi kolagen i inne białka, wchodzące w skład matrycy skóry właściwej. Po degradacji termicznej (rozpad) następuje naprawa, która jest niedoskonała. Niedoskonała naprawa skutkuje deficytem integralności strukturalnej skóry właściwej i jest powtarzana z każ d ą ekspozycją na promieniowanie UV, prowadzą c do akumulacji blizn skóry i w koń cu do widocznych oznak fotostarzenia (2-5). Wpł yw ś wiatł a UV na indukowanie enzymów MMP potwierdzono również in vitro w hodowlach fibroblastów (6, 7). Inne badania, skupione na mechanizmie indukcji MMP przez UV sugerują, że indukowany przez UV tlen singletowy (reaktywna cząstka tlenowa)

PL 204 004 B1 ma bezpośredni efekt na komórki, powodując produkcję MMP (8). Zatem przeciwutleniacze, a specyficznie te przeciwutleniacze, które wychwytują tlen singletowy, będą przeciwdziałać stymulowanej przez UV syntezie MMP. Jednakże nie można wykluczyć, że w syntezę MMP zaangażowane są inne wolne rodniki. Stare komórki w hodowli, jak również komórki skóry poddane ekspozycji na światło słoneczne lub UV produkują większe ilości MMP. Zmniejszenie aktywności MMP-1 jako rezultat zastosowania kompozycji według wynalazku jest zatem wskaźnikiem jej użyteczności dla utrzymania zdrowej skóry.

Ponadto, kompozycja według obecnego wynalazku zmniejsza tworzenie końcowych produktów późnej glikozylacji (AGE) o co najmniej 10%, przy pomiarze w warunkach metody testowej C w porównaniu z badaniem kontrolnym, tak jak o co najmniej 20%, tak jak o co najmniej 30%, 40%, 50% lub 60%, korzystnie co najmniej 70%, szczególnie co najmniej 80 lub 90%, najbardziej korzystnie co najmniej 100% lub 110%.

AGE (końcowe produkty późnej glikacji, znane również jako produkty Amadori'ego) powstają w wyniku glikacji (glikooksydacji), reakcji niespecyficznego wiązania między białkami a węglowodanami. AGE akumulują się zarówno w komórkach indywidualnych jak i w zewnątrzkomórkowej matrycy tkanek, w których skład wchodzą białka długożyjące, takie jak kolagen w skórze. Białka usieciowane przez AGE są białkami niefunkcjonalnymi i wykazują tendencję do agregacji w matrycy zewnątrzkomórkowej lub w cytoplazmie komórek i są uważane za mające szkodliwy wpływ na całkowitą syntezę białek. Początkowo, kiedy glukoza reaguje z białkami, tworzy się produkt wczesnego etapu (produkt Amadori'ego). Ten produkt Amadori'ego podlega następnie dalszym przegrupowaniom z wytworzeniem brązowych pigmentów późnego etapu, które mogą sieciować białka. Po przegrupowaniu, przez długie okresy czasu kontynuowana jest akumulacja produktów etapu późnego w białkach długożyjących, takich jak kolagen, z towarzyszącym silnym sieciowaniem białek. Wykazano, że tworzenie AGE in vivo zwiększa starzenie organizmu i starzenie komórkowe zarówno in vivo jak i in vitro. In vivo, uważa się że poziom akumulacji AGE odzwierciedla poziom glukozy w osoczu. Krytyczna rola w tworzeniu AGE późnego etapu jest przypisywana utlenianiu, ponieważ glikacja jako taka jest procesem odwracalnym. Jednakże utlenianie jest odpowiedzialne za trwałe uszkodzenie chemiczne i ubytek funkcjonalności białek z powodu trwałego sieciowania (9). Poza tym, że AGE są nieefektywne i wywierają wpływ na zmniejszenie całkowitej syntezy białek, wykazano że są chromoforami, które po napromieniowaniu światłem UV generują znaczące ilości aktywnych rodników tlenowych (10). Stress oksydacyjny przyczynia się zatem do tworzenia AGE.

Po ekspozycji na pojedynczą dawkę promieniowania UV (5 J/cm²), poziom AGE w niesuplementowanych komórkach kontrolnych zwiększył się około 20 razy w porównaniu z nienapromieniowanymi komórkami kontrolnymi. W tych samych warunkach poziom AGE w hodowlach suplementowanych F zwiększył się około 40 razy, co wskazuje że F nie ma działania ochronnego na tworzenie AGE po napromieniowaniu UV. Wzrost poziomów AGE w komórkach traktowanych F był bardziej radykalny przy 7,5 J/cm². Z Figury 3 wynika, że poziomy AGE w komórkach suplementowanych FG wzrosły do 72 jednostek, co leży w tym samym zakresie co dla nietraktowanych napromieniowanych komórek kontrolnych (10% spadek względem badania kontrolnego).

Co warte zauważenia, komórki traktowane FGT wykazały zaskakujący spadek poziomu AGE o około 22 jednostki względem komórek nienapromieniowanych, co przekłada się na 120% spadek stężenia AGE względem nietraktowanych napromieniowanych komórek kontrolnych.

Zatem kompozycje według wynalazku powodują polepszenie wprowadzania proliny jak również zapewniają korzystne skutki w komórkach poddanych ekspozycji na UV pod względem aktywności MMP-1 i tworzenia AGE.

Zatem następnym aspektem wynalazku jest kompozycja odpowiednia do kosmetycznego traktowania oznak starzenia się skóry i do ogólnego utrzymania zdrowej skóry. Oznaki starzenia mogą być skutkiem wielu czynników, takich jak światło słoneczne, czas, dieta i inne warunki środowiskowe.

Zwykle, kompozycja według wynalazku zawiera:

1-80% wagowych związków ekstrahowalnych z chrząstki;

0,1-75% wagowych ekstraktu z pestek winogron; i

0,002-25% wagowych likopenu.

Najbardziej korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera:

27-35% wagowych, typowo 30-35%, ekstraktu chrząstki;

1-10% wagowych, na przykład 3-5%, ekstraktu z pestek winogron; i

0,1-5% wagowych, typowo 0,2 do 1%, likopenu.

PL 204 004 B1

Twórcy obecnego wynalazku wytworzyli odpowiednie kompozycje, zawierające:

100-110 mg ekstraktu z ryb;

95-105 mg ekstraktów roślinnych

25-35 mg ekstraktu Acerola

60-90 mg celulozy mikrokrystalicznej

3,5-4,5 mg ditlenku krzemu;

gdzie ekstrakty roślinne stanowią oligomeryczny procyjanidol i likopen, a ekstrakt z ryb stanowi glikozoaminoglikan.

Następna odpowiednia kompozycja według wynalazku zawiera:

100-110 mg ekstraktu z ryb;

95-105 mg ekstraktów roślinnych

60-65 mg inuliny

25-35,00 mg kwasu askorbinowego

10-20 mg glukonianu cynku

10-15 mg ditlenku krzemu;

gdzie ekstrakty roślinne stanowią oligomeryczny procyjanidol i likopen, a ekstrakt z ryb stanowi glikozoaminoglikan.

Zatem, kompozycja według obecnego wynalazku może dodatkowo zawierać inne składniki, takie jak dalsze suplementy żywieniowe, takie jak witaminy, minerały, aminokwasy i węglowodany. W korzystnym wykonaniu, kompozycja zawiera dodatkowo witaminę C lub ekstrakt zawierają cy witaminę C, na przykład dodatkowo zawiera ekstrakt z Acerola.

Jak stwierdzono, względne i bezwzględne ilości składników są, zgodnie z obecnym rozumieniem wynalazku, bardzo ważne dla uzyskania zaskakujących korzystnych efektów stosowania kompozycji według wynalazku. Zgodnie z tym, przeciwutleniacze hydrofilowe i lipofilowe są korzystnie obecne w stosunku wagowym w zakresie od około 1:1 do około 200:1, jak na przykład od 2:1 do 100:1, w szczególności od 5:1 do 50:1, zwłaszcza od 5:1 do 20:1, korzystnie od 5:1 do 15:1, najbardziej korzystnie około 7:1 do 12:1, tak jak około 10:1.

Podobnie, chrząstka, jeden lub więcej związków ekstrahowalnych z chrząstki oraz przeciwutleniacze hydrofilowe są korzystnie obecne w stosunku wagowym w zakresie od około 1:1 do około 200:1, tak jak na przykład od 2:1 do 100:1, w szczególności od 5:1 do 50:1, zwłaszcza od 5:1 do 25 20:1, korzystnie od 5:1 do 15:1, najbardziej korzystnie około 7:1 do 12:1, tak jak na przykład około 10:1.

Generalnie, ważny aspekt obecnego wynalazku dotyczy kompozycji, w której i) chrząstka, jeden lub więcej związków ekstrahowalnych z chrząstki lub jego pochodne; ii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy hydrofilowych; oraz iii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy lipofilowych, są obecne w ilościach dostatecznych do stłumienia aktywności MMP-1, do stłumienia tworzenia AGE lub do zwiększenia syntezy kolagenu w hodowli komórkowej fibroblastów ludzkich in vitro.

Podobnie, dalszy ważny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji, w której i) chrząstka, jeden lub więcej związów ekstrahowalnych z chrząstki lub jego pochodne; ii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy hydrofilowych; oraz iii) jeden lub więcej przeciwutleniaczy lipofilowych, są obecne w stosunku odpowiednim do stłumienia aktywności MMP-1, do stłumienia tworzenia AGE lub do zwiększenia syntezy kolagenu w hodowli komórkowej fibroblastów ludzkich in vitro.

W kombinacji korzystnych realizacji, kompozycja może zawierać 0,25-15 mg likopenu i 2,5-100 mg ekstraktu z pestek winogron, korzystnie od 0,5-5 mg likopenu i 5-50 mg ekstraktu z pestek winogron, w szczególności 0,75-2,5 mg likopenu i 10-30 mg ekstraktu z pestek winogron, zwłaszcza 1-2,5 mg likopenu i 10-25 mg ekstraktu z pestek winogron.

W dalszej kombinacji korzystnych realizacji, kompozycja może zawierać 2,5 mg likopenu, 5-50 mg ekstraktu z pestek winogron i 50-200 mg ekstraktu chrząstki.

Kompozycje według wynalazku przystosowane są do podawania doustnego i mogą być podawane w postaci stałych form dawkowania, takich jak tabletki, proszki, granulaty, kapsułki, saszetki lub w postaci ciekł ych form dawkowania, takich jak roztwory, zawiesiny, toniki lub syropy. Takie formy dawkowania mogą być wytworzone w sposób dobrze znany w technologii farmaceutycznej i mogą zawierać jedną lub więcej substancji pomocniczych, którymi mogą być wszelkie substancje pomocnicze zwykle stosowane w technologii. Dla kompozycji stałych mogą być stosowane typowe nietoksyczne zaróbki stałe, w tym nieograniczająco, np. farmaceutyczne rodzaje mannitolu, laktozy, skrobi, włókien sojowych, stearynianu magnezu, sacharyny sodowej, talku, celulozy, takie jak celuloza mikrokryPL 204 004 B1 staliczna, glukozy, sacharozy, dwutlenku krzemu, węglanu magnezu lub podobne. Ciekłe formy dawkowania można otrzymać przez rozpuszczenie, zdyspergowanie, itp., składników czynnych i ewentualnych farmaceutycznych środków pomocniczych w zaróbce, takiej jak woda lub ciecze na bazie wody, takie jak soki, olej lub alkohol, otrzymując roztwór lub zawiesinę. W razie potrzeby, kompozycja doustna według wynalazku może również zawierać niewielkie ilości dodatków znanych w tej dziedzinie, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, bufory lub podobne. Takie formy dawkowania można formułować zgodnie z zasadami dobrze znanymi w sztuce, patrz również Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylwania, wyd. 15, 1975; lub Martindale, The Extra Pharmacopeia, The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, wyd. 31, 1996.

Kompozycja może być tak przygotowana, że przeciwutleniacz lipofilowy, taki jak ekstrakt z pomidora, lub ekstrakt zawierający likopen, jest formułowany dla normalnego uwalniania, a przeciwutleniacz hydrofilowy, taki jak ekstrakt z pestek winogron, jest formułowany dla uwalniania przedłużonego lub powolnego.

Jak zilustrowano w przykładzie 5, kompozycje przyjmowane doustnie mają wyraźnie widoczny wpływ na stan skóry. Figura 4 obrazuje również, że u ochotników przyjmujących kompozycję według wynalazku zauważono poprawę ogólnego stanu skóry, miękkości, jakości skóry wokół oczu i skóry wokół ust. Zatem, wyniki z przykładów 1-4 przenoszą się pomyślnie na skutki in vivo, a kompozycja widocznie działa systemicznie po podaniu doustnym.

Kompozycje według wynalazku mogą być stosowane jako doustny produkt kosmetyczny, produkt spożywczy lub suplement spożywczy, produkt farmaceutyczny lub dietetyczny.

Dalszy aspekt wynalazku dotyczy kompozycji do stosowania do ogólnego utrzymania zdrowej skóry, do opóźniania pojawienia się degeneracji skóry z powodu starzenia lub ekspozycji na UV, oraz do traktowania oznak starzenia się skóry. Kompozycje według wynalazku są odpowiednie do traktowania starzejącej się skóry, skóry poddanej ekspozycji na światło lub inne formy promieniowania UV, suchej skóry, szorstkiej skóry, odbarwionej skóry, skóry trądzikowej, skóry z bliznami, skóry ze zmarszczkami mimicznymi, wyprysków i łuszczycy.

Sposób kosmetycznego lub profilaktycznego traktowania skóry przeciwko oznakom starzenia się skóry oraz uszkodzeniom wynikającym z ekspozycji na promieniowanie UV, obejmuje doustne podawanie wyżej określonej kompozycji. Podobnie, kosmetyczne lub profilaktyczne traktowanie starzejącej się skóry, skóry poddanej ekspozycji na światło lub inne formy promieniowania UV, suchej skóry, szorstkiej skóry, odbarwionej skóry, skóry trądzikowej, skóry z bliznami, skóry ze zmarszczkami mimicznymi, wyprysków i łuszczycy, obejmuje doustne podawanie określonej wyżej kompozycji. Przewidywane jest zastosowanie kompozycji określonej wyżej do wytwarzania środka do zapobiegania lub spowalniania oznak starzenia skóry, zapobiegania lub zmniejszania szkodliwych efektów ekspozycji na promieniowanie UV, do traktowania zmarszczek mimicznych, do traktowania skóry trądzikowej, do zmniejszania objawów wyprysków, do zmniejszania blizn, do zmniejszania objawów łuszczycy lub do traktowania szorstkiej skóry, skóry przebarwionej lub suchej.

W tych zastosowaniach, typowa dawka dzienna dla przeciętnej dorosłej osoby, wynosi od 55 do 3700 mg powyżej określonej mieszaniny składnika chrząstkowego, przeciwutleniacza hydrofilowego i przeciwutleniacza lipofilowego, na przykład dawka taka jak od 70 do 1000 mg. Podawanie może się odbywać w jednej dawce dziennej lub w dawkach podzielonych do czterech razy dziennie, tak jak 1, 2, 3 lub 4 razy dziennie, korzystnie 1 lub 2 razy dziennie.

Kompozycje mogą być pakowane zgodnie z zasadami dobrze znanymi w tej dziedzinie, jak na przykład w pojemniki tabletek, opakowania blistrowe lub butelki. W przypadku kiedy jeden z komponentów jest wrażliwy na światło, co ma miejsce w szczególności kiedy przeciwutleniaczem lipofilowym jest likopen, zalecane jest osłanianie kompozycji od światła. W przypadku np. opakowań blistrowych można to osiągnąć jeśli opakowania blistrowe są dobrze znanego typu utworzonego z dwóch arkuszy, odpowiednio folii aluminiowej i powlekanej aluminium folii plastykowej, na przykład, odpowiednio, z ukształtowanego ( z wytworzonymi wgłębieniami) arkusza laminatu plastykowo/aluminiowego (np. laminatu PVC, aluminium i orientowanej folii poliamidowej) oraz cienkiej, ewentualnie lakierowanej folii aluminiowej.

Wynalazek jest dalej zilustrowany w następujących przykładach.

PL 204 004 B1

P r z y k ł a d 1

Oznaczanie efektywnych stężeń przeciwutleniaczy hydrofilowych, przeciwutleniaczy lipofilowych i ekstraktu z chrząstki

Różne stężenia ekstraktu z pestek winogron (1-200 mikrogramów/ml), ekstraktu chrząstki (0-1000 mg/ml) i ekstraktu z pomidorów (0-200 mikrogramów/ml) testowano w sposób zależny od dawki w hodowli komórek fibroblastów ludzkich in vitro. Po ocenie przeżywania komórek i szybkości wzrostu we wszystkich warunkach hodowli wybierano pojedyncze optymalne stężenie dla każdego ze składników.

Metodyka

Roztwory robocze ekstraktu chrząstki, ekstraktu z pestek winogron i pastę pomidorową zawierającą likopen sporządzono w sposób następujący:

Roztwór chrząstki (40 mg/ml):

200 mg proszku rybiego (ekstrakt chrząstki sporządzony przez enzymatyczną hydrolizę proteolityczną chrząstki, filtrację i suszenie rozpyłowe hydrolizatu) rozpuszczono w 5 ml buforowanego roztworu solanki Hanksa (Hanks) i jałowo przesączono.

Roztwór pestek winogron (40 mg/ml):

200 mg ekstraktu z pestek winogron (Indena, Mediolan, Włochy) rozpuszczono w 5 ml buforowanego roztworu solanki Hanksa (Hanks) i jałowo przesączono.

Roztwór pomidorów (preroboczy: 100 mg/ml):

400 mg pasty pomidorowej (zawierającej 40 mg likopenu) rozpuszczono w 4 ml tetrahydrofuranu, jałowo przesączono i do użycia przechowywano w temperaturze - 80°C.

Roztwór roboczy pomidorów (100 μg/ml):

Roztwór roboczy pomidorów: roztwór preroboczy rozcieńczono w stosunku 1:1000 bezpośrednio przed użyciem w pożywce DMEM do hodowli komórkowych.

Komórki fibroblastów ludzkich hodowano w sposób następujący:

W 24-studzienkowych tacach posiano komórki w ilości 10000 komórek na studzienkę. Komórki pozostawiono do przywierania przez noc, po czym zmieniono pożywkę na pożywkę zawierającą różne stężenia ekstraktu chrząstki (F), ekstraktu z pestek winogron (G) i ekstraktu z pomidorów (T). Pożywkę komórkową DMEM (10% bydlęcej surowicy płodowej + glutamina, penicylina/streptomycyna) zmieniano co drugi-trzeci dzień, z wyjątkiem pożywki zawierającej TE, którą zmieniano codziennie. Komórki namnażano do zlania się (37°C, 5% CO₂, 95% wilgotności) i zliczano co drugi dzień, stosując 300 pl trypsyny/EDTA na studzienkę do oddzielenia komórek podczas 10 minutowego pobytu w inkubatorze w 37°C, i 200 pl do zliczenia liczby komórek na ml.

Przeżywalność komórek i wzrost komórek oceniano przez czas do 15 dni.

Przeżywalność komórek oceniano, mierząc wychwyt MTT w komórkach. Poziom wychwytu koresponduje z poziomami aktywności mitochondrialnej, którą można użyć jako oznakę żywotności komórek. MTT jest redukowany do niebiesko zabarwionego związku, formazanu, który jest wykrywany poprzez absorpcję UV/VIS przy 595 nm, z 655 nm jako odniesieniem.

Wzrost komórek oceniano jako liczbę komórek na kolbę hodowlaną, którą obliczano stosując elektroniczny licznik Coulter'a.

Wyniki

Hodowle komórkowe suplementowane 70 pg/ml ekstraktu chrząstki, 10 pg/ml ekstraktu z pestek winogron i 10 pg/ml ekstraktu z pomidorów (=1,0 pg/ml likopenu) stanowiły optymalne środowisko dla wzrostu komórek. Stężenia te nie miały toksycznego wpływu ani nie zmieniały szybkości podziału komórkowego. Ten rezultat został dalej potwierdzony przez długotrwałą hodowlę fibroblastów w pożywce komórkowej suplementowanej wybranymi kombinacjami (powyżej) przez okres 50 dni. Testowane składniki nie wpływały na obserwowane kumulatywne poziomy podwojenia populacji (CPDL) odpowiadające liczbie podziałów komórkowych i wzrostowi komórek. Wyniki przedstawiono w tabeli 1 i na Figurze 1.

PL 204 004 B1

T a b e l a 1

Dzień	O	F	FGT	GT
0	18	18	18	18
3	19,17	19,34	18,87	18,8
9	21,4	21,52	21,28	21,32
14	23,08	22,93	23,05	23,02
21	25,65	25,87	25,59	25,67
28	27,53	27,57	27,73	27,78
35	28,88	28,88	29,2	29,15
42	31,45	31,54	31,4	32,03
50	32,98	33,14	33,42	33,39

P r z y k ł a d 2

Wpływ kompozycji na syntezę kolagenu

Opracowano układ testowy in vitro do testowania wpływu F, G i T na syntezę kolagenu. Syntezę 14 kolagenu oceniano przez pomiar inkorporowania radioaktywnej proliny ([¹⁴C]-proliny) do białek zawierających prolinę, którymi jak się uważa jest głównie kolagen, w którym liczba reszt proliny stanowi ponad 30% całkowitej liczby aminokwasów. Do pożywki komórkowej dodawano różne kombinacje F, G i T w optymalnych stężeniach oznaczonych jak opisano w przykł adzie 1) i po 24 h mierzono radioaktywność wydzielanych i znakowanych białek po 24 h.

Metodyka

Ekstrakty F, G i T wytworzono jak w przykładzie 1.

Inkorprowanie radioznakowanej proliny w hodowlach komórkowych fibroblastów ludzkich prowadzono jak następuje (metoda testowa A): różne kombinacje F, G i T dodano dzień po zaszczepieniu i komórki namnażano do zlania się (około 1 tydzień). Pożywkę hodowlaną zmieniano codziennie. Po zlaniu się pożywkę zmieniono na 0,5 ml roztworów radioaktywnych (25 μ^) + 2,5 ml pożywki bez F, G lub T.

Komórki pozostawiono w inkubatorze przez następne 24 h i następnie pożywkę zebrano i poddano następującej procedurze w celu pomiaru radioaktywności:

Strącanie TCA: 5 μl pożywki zmieszano z 20 μl BSA (0,5 g/l) i 1 ml TCA (10%) i pozostawiono w temperaturze -20°C przez 30 minut. Próbki rozmrożono i przepuszczono przez filtr nitrocelulozowy w celu separacji wolnej radioaktywnej proliny od białek znakowanych. Filtr przeniesiono do probówki, do której dodano 2,5 ml cieczy scyntylacyjnej. Probówkę pozostawiono w ciemności na 1 godzinę, po czym zmierzono radioaktywność na próbce 0,5 μl za pomocą licznika scyntylacyjnego.

Wyniki

Podsumowanie wyników przedstawiono w Tabeli 2a i 2b. W hodowlach komórkowych zawierających ekstrakt GT następował spadek inkorporacji proliny w porównaniu z kontrolą: 3,6% inkorporowania w porównaniu z 4,8% dla kontroli, co stanowi 25% spadek. Hodowle komórkowe zawierające ekstrakt FT nie miały znaczącego wpływu na inkorporowanie proliny, ponieważ stopień inkorporowania wyniósł 5,0% w porównaniu z 4,8% dla kontroli, co stanowi tylko 4% wzrost. W hodowlach komórkowych zawierających ekstrakt FG następował mały wzrost stopnia inkorporowania proliny: 5,5% inkorporowania, co stanowi 10% wzrost w porównaniu do kontroli.

W hodowlach komórkowych zawierających ekstrakt F następował wzrost stopnia inkorporowania proliny: 6,2% inkorporowania, co stanowi wzrost 29%. Jednakże ekstrakty FGT zaskakująco powodowały dramatyczny 80% wzrost inkorporowania proliny (inkorporowane 8,4% proliny).

W tym rodzaju eksperymentów różnica powyżej 30% jest uważana za znaczącą.

PL 204 004 B1

T a b e l a 2

Traktowanie	Aktywność w dpm	Aktywność w pCi Moc wydawana	% inkorporowania proliny	Wynik względem kontroli
GT	4516	0,0015	3,6	20% spadek
Kontrola	5787	0,0020	4,8	-
FT	4516	0,0021	5,0	Bez zmian
FG	5137	0,0023	5,5	10% wzrost
F	5787	0,0026	6,2	30% wzrost
FGT	7738	0,0035	8,4	80% wzrost

P r z y k ł a d 3

Wpływ kompozycji na fibroblasty ludzkie po ekspozycji na UV

Ekspozycja na UV jest odpowiedzialna za różne zmiany degeneracyjne w skórze prowadzące do widocznych oznak starzenia (fotostarzenie). Potencjalny efekt ochronny ekstraktów F, G i T i ich kombinacji przeciwko uszkodzeniom indukowanym przez UV testowano przez monitorowanie markerów biochemicznych związanych z fotostarzeniem (poziomy MMP-1 i AGE) w hodowli fibroblastów skóry po napromieniowaniu UV.

Hodowle komórkowe fibroblastów ludzkich poddano ekspozycji na jedną dawkę promieniowania UVA codziennie przez 4 kolejne dni. Zastosowano dwie różne dawki (5 i 7,5 J/cm²) odpowiadające maksymalnej dawce tolerowanej przez komórki zanim nastąpi śmierć komórki.

Hodowle komórkowe suplementowano różnymi kombinacjami F, G i T (F, FG, FT, GT i FGT), stosując optymalne stężenia F, G i T (jak oznaczone i opisane w przykładzie 1) i mierzono aktywność

MMP-1 i AGE po 1 dniu i 4 dniach.

Metodyka

Ekstrakty wytworzono jak opisano w przykładzie 1.

Hodowlę komórek prowadzono jak następuje:

Komórkom w danym pasażu zmieniano pożywkę na pożywkę zawierającą kombinacje F, G i T. Po zlaniu się dzielono je w stosunku 1:4, otrzymując 4 kolby dla każdego traktowania. Po zlaniu się jedną (podział 1:4) lub dwa (podział 1:2) pasażowano kolejno do czterech nowych kolb.

Napromieniowanie hodowli komórkowych UV przeprowadzono jak następuje.

Dawkę UVA wytworzono stosując probówki 6xPhilips40W UVA Cleo Performance. Do pomiaru dawki w W/m² i do obliczenia czasu ekspozycji potrzebnego do uzyskania żądanej dawki 5, 7,5, 10 i 15 J/cm² zastosowano miernik Hagner UVA. Wstępne eksperymenty pokazały, że optymalna dawka napromieniowania niepowodująca śmierci komórek wynosiła 7,5 J/cm².

Oznaczenie aktywności MMP-1 (aktywność endogenna plus poziomy utajone) przeprowadzono stosując dostępny w handlu system testowy z firmy APBiotech, kod RPN 2629 (metoda testowa B).

Oznaczenie AGE oparto na technice ELISA (metoda testowa C):

Dzień 1: Mikropłytki powlekano 50 ng AGE/studzienkę, rozcieńczonym w buforze węglanowym, przez noc w temperaturze +4°C.

Dzień 2: Studzienki przemywano 4 razy PBST (PBS i 0,05% Tween 20) i następnie blokowano w stężeniu 200 μΐ/studzienkę mleczkiem PBS (6%) przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT). Studzienki następnie przemywano 4 razy PBST, po czym do studzienek dodawano najpierw 50 μl wzorca AGE (20-20000 jednostek/studzienkę) lub 50 μl próbki (50 μg białka/ml), a następnie 50 μl przeciwciała poliklonalnego AGE (rozcieńczenie 1/1000). Płytkę umieszczano pod silnym mieszaniem na 2 h w temperaturze pokojowej. Studzienki przemyto 4 razy PBST, po czym dodano drugie przeciwciało (poliklonalne królicze, HRP, rozcieńczenie 1/1000) w ilości 50 μl/studzienkę i umieszczono pod mieszaniem na 2 h w temperaturze pokojowej. Na koniec, studzienki przemyto 4 razy w PBST, po czym dodano substrat (1 tabletka OPD/3 ml ddH2O + 1/1000 (v/v) nadtlenku wodoru (35%)) w ilości 100 μl/studzienkę. Płytkę pozostawiono w ciemnym miejscu, a po rozwinięciu się odpowiedniego koloru reakcję zatrzymywano przez dodanie 50 μl H₂SO₄ (1M). Absorbancję płytki odczytywano przy 490 nm (ref. 655 nm).

PL 204 004 B1

Wyniki

Wyniki dla aktywności MMP-1 i tworzenia AGE przedstawiono na Figurach odpowiednio 2 i 3.

I. Aktywność MMP-1

Wykazano, że promieniowanie UVA indukuje aktywność MMP-1 w komórkach nietraktowanych (kontrola) w badaniach zarówno dnia 1 jak i dnia 4, potwierdzając w ten sposób zdolność indukowania MMP-1 przez UVA w hodowlach fibroblastów. Aktywność MMP-1 w komórkach kontrolnych w przybliżeniu podwoiła się podczas procesu fotostarzenia.

Komórki traktowane GT wykazały wzrost 34% i 58% w dniach odpowiednio 1 i 4.

I odwrotnie, aktywność MMP-1 była indukowana w komórkach suplementowanych F. Aktywność MMP-1 w przybliżeniu wzrosła trzykrotnie i czterokrotnie po ekspozycji na UV odpowiednio dnia 1 i 4.

Zaskakująco, połączenie F z GT z wytworzeniem FGT nie skutkowało wzrostem aktywności MMP-1 w komórkach poddanych ekspozycji na UV. Zatem komórki traktowane FGT miały połowę tej aktywności MMP-1 co komórki kontrolne w identycznych warunkach.

T a b e l a 3

Dzień 1

	0 J/cm2	5 J/cm2	7,5 J/cm2
kontrola	1	2,01	1,80
GT	1	1,34	1,34
FGT	1	0,97	0,99

T a b e l a 3a

Dzień 4

	0 J/cm2	5 J/cm2	7,5 J/cm2
kontrola	1	2,02	2,3
GT	1	1,37	1,58
FGT	1	1,04	0,99

II. Tworzenie AGE

Wyniki zobrazowano na Figurze 3 i w tabeli 4. Po ekspozycji na pojedynczą dawkę promieniowania UV (5 J/cm²) poziom AGE w niesuplementowanych komórkach kontrolnych wzrósł około 20krotnie w porównaniu z nienapromieniowanymi komórkami kontrolnymi. W tych samych warunkach, poziom AGE w komórkach suplementowanych F wzrósł 40 razy, co pokazuje, że F nie ma działania ochronnego przed tworzeniem AGE po napromieniowaniu UV. Z figury 3 wynika, że wzrost poziomów AGE w komórkach suplementowanych FG wyniósł 72 jednostki, co znajduje się w tym samym zakresie co wzrost w nietraktowanych komórkach kontrolnych (10% spadek względem kontroli).

Warte zauważenia jest to, że w komórkach traktowanych FGT nastąpił zaskakujący spadek poziomu AGE o około 22 jednostki w porównaniu z komórkami nienapromieniowanymi, co przekłada się na 120% spadek stężenia AGE względem nietraktowanych komórek napromieniowanych.

Zatem kompozycje według niniejszego wynalazku powodują zwiększenie inkorporowania proliny oraz dostarczają korzystnych skutków w komórkach poddanych ekspozycji na UV pod względem aktywności MMP-1 i tworzenia AGE.

T a b e l a 4

	5 J/cm2	7,5 J/cm2
kontrola	80,06	67,88
F	152,72	258,21
FG	72,04	118,58
FGT	-21,94	-34,92

PL 204 004 B1

P r z y k ł a d 4

Kompozycje według wynalazku wytworzono stosując następujące składniki, zmieszane w podanych proporcjach (ilości podano na końcową jednostkę dawkowania):

Likopen jest wrażliwy na utlenianie, zatem wszystkie operacje mieszania granulatu i manipulacji nim, prasowania tabletek, przechowywania tabletek i pakowania ich do blistrów alu-alu prowadzono pod ochroną azotu.

Kompozycja 1 (kod tabletek SF)

- 105 mg wyciągu chrząstki (wytworzonego przez enzymatyczną hydrolizę proteolityczną chrząstki, sączenie i suszenie rozpyłowe hydrolizatu);

- 100 mg wyciągów roślinnych (zawierających około 1,5 mg likopenu wyekstrahowanego z pomidorów i około 14 mg flawonoidów wyekstrahowanych z pestek winogron, reszta będąca włóknem sojowym, olejem pomidorowym i dwutlenkiem krzemu; Alextan® z firmy Indena, Mediolan, Włochy);

- 30 mg wyciągu Acerola (zawierającego około 7,5 mg kwasu akorbinowego, pozostałe składniki to Acerola i maltodekstryna);

- 66 mg celulozy mikrokrystalicznej

- 4 mg dwutlenku krzemu (wielkość cząstek 2,4-3,6 pm).

Mieszanie prowadzono w mieszalniku Lodige przez 6 minut. Mieszankę proszkową prasowano na tabletki o ciężarze 305 mg.

Kompozycja 2 (kod tabletek SF-1)

- 105 mg wyciągu chrząstki (wytworzonego przez enzymatyczną hydrolizę proteolityczną chrząstki, sączenie i suszenie rozpyłowe hydrolizatu);

- 100 mg wyciągów roślinnych (zawierających około 1,5 mg likopenu wyekstrahowanego z pomidorów i około 14 mg flawonoidów wyekstrahowanych z pestek winogron, reszta będąca włóknem sojowym, olejem pomidorowym i dwutlenkiem krzemu; Alextan® z firmy Indena, Mediolan, Włochy);

- 30 mg wyciągu Acerola (zawierającego około 7,5 mg kwasu akorbinowego, pozostałe składniki to Acerola i maltodekstryna);

- 4 mg dwutlenku krzemu (wielkość cząstek 2,4-3,6 pm).

Mieszanie prowadzono w mieszalniku Lodige przez 6 minut. Mieszankę proszkową prasowano na tabletki o ciężarze 320 mg.

Kompozycja 3 (kod tabletek SS)

- 105 mg wyciągu chrząstki (wytworzonego przez enzymatyczną hydrolizę proteolityczną chrząstki, sączenie i suszenie rozpyłowe hydrolizatu);

- 100 mg wyciągów roślinnych (zawierających około 1,5 mg likopenu wyekstrahowanego z pomidorów i około 14 mg flawonoidów wyekstrahowanych z pestek winogron, reszta będąca włóknem sojowym, olejem pomidorowym i dwutlenkiem krzemu; Alextan® z firmy Indena, Mediolan Włochy);

- 62 mg inuliny;

- 30 mg kwasu askorbinowego;

- 15 mg glukonianu cynku;

- 81 mg celulozy mikrokrystalicznej

- 13 mg dwutlenku krzemu (wielkość cząstek 2,4-3,6 pm).

Mieszanie prowadzono w mieszalniku Lodige przez 6 minut. Mieszankę proszkową prasowano na tabletki o ciężarze 320 mg.

Typowa kompozycja

FE: 105 mg

GE: 13,75 mg

TE: 14,38 mg (z czego likopen stanowi 10% = 1,44 mg)

P r z y k ł a d 5

Kompozycję w przykładzie 1 testowano w teście konsumenckim w celu określenia percepcji zmian skóry przez konsumenta.

W trzymiesięcznych badaniach wzięło udział 129 ochotników, przyjmujących dwa razy dziennie tabletkę zawierającą kompozycję z przykładu 1. Przed rozpoczęciem testu zapisywali oni wygląd i jakość ich skóry. Po 1, 2 i 3 miesiącach suplementowania oceniali oni zmiany wyglądu i jakości skóry, stosując następujące kody: 0 - stan niezmieniony, 1 - lekka poprawa, 2 - poprawa, 3 - znaczna poprawa.

PL 204 004 B1

Figura 4 pokazuje wyniki oceny parametrów „ogólny stan skóry”, „giętkość”, jakość „skóry wokół oczu” i „skóry wokół ust”. Poprawa jest wyrażona w procentach ochotników, u których taka poprawa nastąpiła.

Claims (26)

1. Kompozycja znamienna tym, ż e zawiera

i) ekstrakt chrzą stki, otrzymywalny przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne, który to ekstrakt obejmuje glikozoaminoglikan, lub syntetyczne formy glikozoaminoglikanów ekstrahowalnych z chrząstki przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne, ii) jeden lub wię cej hydrofilowych przeciwutleniaczy wybranych z grupy skł adają cej się z polifenoli i ich estrów, które to hydrofilowe przeciwutleniacze są ekstrahowalne z pestek winogron lub są syntetycznymi formami hydrofilowych przeciwutleniaczy ekstrahowalnych z pestek winogron i iii) likopen lub ekstrakt z pomidora zawierający likopen, przy czym hydrofilowy przeciwutleniacz i likopen są obecne w stosunku wagowym w zakresie od 1:1 do 200:1.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ekstrakt chrząstki i związki ekstrahowalne z chrząstki obejmują glikozoaminoglikany wybrane z grupy składającej się z estru chondroityny, estru keratanu, kwasu hialuronowego lub jego estru, estru dermatanu, heparyny, estru heparanu oraz ich epimerów i polimerów, przy czym każdy z nich może być ewentualnie związany z peptydem.

3. Kompozycja wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e glikozoaminoglikany są wybrane z grupy składającej się z 4-siarczanu chondroityny, 6-siarczanu chondroityny i siarczanu keratanu, z których każdy może być ewentualnie związany z peptydem.

4. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeże ń, znamienna tym, że ekstrakt chrząstki obejmuje siarczan chondroityny, ewentualnie związany z peptydem.

5. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeż eń, znamienna tym, że zawiera mniej niż 1% wagowy kolagenu, korzystnie mniej niż 0,5%, szczególnie korzystnie mniej niż 0,1%, najbardziej korzystnie będąca wolną od kolagenu.

6. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeż eń, znamienna tym, ż e jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy obejmuje oligomeryczny procyjanidol.

7. Kompozycja wed ł ug któregokolwiek z poprzednich zastrzeż e ń , znamienna tym, ż e jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy jest ekstrahowalny z pestek winogron Vitis vinifera.

8. Kompozycja wed ł ug któregokolwiek z poprzednich zastrzeż e ń , znamienna tym, ż e jeden lub więcej hydrofilowych przeciwutleniaczy jest z pestek winogron Vitis vinifera.

9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że odmianą pomidorów jest Lycopersicum aesculentum.

10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że lipofilowy przeciwutleniacz dodatkowo zawiera karotenoid wybrany z grupy składającej się z α-karotenu, β-karotenu, γ-karotenu, δ-karotenu, zeaksantyny, kryptoksantyny, luteiny i ksantofilu.

11. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że zawiera 0,1 do 5% wagowych likopenu lub 0,2 do 4% likopenu lub 0,3 do 2% likopenu lub 0,3 do 1% likopenu lub

0,3 do 0,8% lub 0,3 do 0,6% likopenu.

12. Kompozycja według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że zawiera mniej niż 0,025% beta-karotenu lub mniej niż 0,02% beta-karotenu lub mniej niż 0,01% beta-karotenu.

13. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że hydrofilowe i lipofilowe przeciwutleniacze są obecne w stosunku wagowym w zakresie od 2:1 do 100:1 lub od 5:1 do 50:1 lub od 5:1 do 20:1 lub od 5:1 do 15:1 lub 7:1 do 12:1 lub 10:1.

14. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że ekstrakt chrząstki otrzymywalny przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne lub syntetyczne formy związków ekstrahowalnych z chrząstki przez enzymatyczne rozszczepienie proteolityczne, i hydrofilowe przeciwutleniacze są obecne w stosunku wagowym w zakresie od 1:1 do 200:1 lub od 2:1 do 100:1 lub od 5:1 do 50:1 lub od 5:1 do 20:1 lub od 5:1 do 15:1 lub 7:1 do 12:1 lub 10:1.

15. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 8 do 14, znamienna tym, że zawiera 0,25-15 mg likopenu i 2,5-100 mg ekstraktu z pestek winogron lub 0,5-5 mg likopenu i 5-50 mg ekstraktu

PL 204 004 B1

95-105 mg 25-35 mg 60-90 mg

3,5-4,5 mg

95-105 mg 60-65 mg 25-35 mg 10-20 mg 10-15 mg z pestek winogron lub 0,75-2,5 mg likopenu i 10-30 mg ekstraktu z pestek winogron lub 1-2,5 mg likopenu i 10-25 mg ekstraktu z pestek winogron.

16. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 8 do 15, znamienna tym, że zawiera 1-2,5 mg likopenu, 5-50 mg ekstraktu z pestek winogron i 50-200 mg ekstraktu chrząstki.

17. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 9 do 13, znamienna tym, że zawiera:

i) 20-40% wagowych ekstraktu chrząstki lub 25-35% lub 27-35% lub 30-35% ekstraktu chrząstki, ii) 1-10% wagowych ekstraktu z pestek winogron lub 2-8% lub 3-7% lub 3-5% ekstraktu z pestek winogron i iii) 1-10% wagowych ekstraktu z pomidora lub 2-8% lub 3-7% lub 3-5% ekstraktu z pomidora.

18. Kompozycja według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że dodatkowo zawiera ekstrakt Acerola.

19. Kompozycja według dowolnego z zastrzeżeń 8 do 18, znamienna tym, że zawiera:

100-110 mg ekstraktu z ryb, ekstraktów roślinnych, ekstraktu Acerola, celulozy mikrokrystalicznej, ditlenku krzemu, gdzie ekstrakty roślinne obejmują oligomeryczny procyjanidol i likopen, a ekstrakt z ryb obejmuje glikozoaminoglikan.

20. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 8 do 19, znamienna tym, że zawiera:

100-110 mg ekstraktu z ryb, ekstraktów roślinnych, insuliny, kwasu askorbinowego, glukonianu cynku, ditlenku krzemu, gdzie ekstrakty roślinne obejmują oligomeryczny procyjanidol i likopen, a ekstrakt z ryb obejmuje glikozoaminoglikan.

21. Kompozycja według dowolnego z zastrzeżeń 8 do 20, znamienna tym, że ekstrakt z pestek winogron jest sformułowany dla powolnego uwalniania a likopen jest sformułowany dla normalnego uwalniania.

22. Kompozycja określona w dowolnym z poprzednich zastrzeżeń do zastosowania jako doustny produkt kosmetyczny, środek spożywczy lub suplement spożywczy, produkt farmaceutyczny lub dietetyczny.

23. Kompozycja określona w dowolnym z poprzednich zastrzeżeń, znamienna tym, że podawana jest w formie stałej postaci dawkowania, takiej jak tabletki, proszki, granulat, kapsułki, saszetki, lub w formie ciekłej postaci dawkowania, takiej jak roztwory, zawiesiny, toniki lub syropy.

24. Kompozycja określona w dowolnym z poprzednich zastrzeżeń, do zastosowania w kosmetycznym traktowaniu starzejącej się skóry, skóry eksponowanej na światło słoneczne i inne formy promieniowania UV, suchej skóry, szorstkiej skóry, odbarwionej skóry, skóry z trądzikiem, skóry zbliznowaciałej, zmarszczek mimicznych, wyprysków i łuszczycy.

25. Kompozycja określona w zastrz. 1 do 23 do zastosowania w zwiększaniu syntezy kolagenu lub zmniejszaniu spadku syntezy kolagenu w skórze właściwej.

26. Zastosowanie kompozycji określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 23 do wytwarzania środka do zapobiegania lub spowalniania oznak starzenia skóry, zapobiegania lub zmniejszania szkodliwych efektów ekspozycji na promieniowanie UV, do kosmetycznego traktowania zmarszczek mimicznych, do kosmetycznego traktowania trądzika, do zmniejszania objawów wyprysków, do wspomagania tworzenia blizn, do zmniejszania blizn, do zmniejszania objawów łuszczycy lub do kosmetycznego traktowania szorstkiej, odbarwionej lub suchej skóry.