ES2260230T3 - Utilizacion del riluzol o sus sales para la prevencion y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia. - Google Patents

Abstract

Utilización del riluzol o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para la preparación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

Description

Utilización del riluzol o sus sales para la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

La presente invención se refiere a la utilización del riluzol o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

El riluzol (2-amino-6-trifluorometoxibenzotiazol) se comercializa para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (Rilutek^{R}). Este compuesto también es útil como anticonvulsionante, ansiolítico e hipnótico (EP0050551), en el tratamiento de la esquizofrenia (EP0305276), en el tratamiento de los trastornos del sueño y de la depresión (EP0305277), en el tratamiento de los trastornos cerebrovasculares y como anestésico (EP0282971), en el tratamiento de los traumatismos espinales, craneales o craneo-espinales (WO94/13.288), como radiorestaurador (WO94/15.600), en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (WO94/15.601), en el tratamiento del neuro-sida (WO94/20.103) y en el tratamiento de las enfermedades mitocondriales (WO95/19.170).

La adrenoleucodistrofia (ALD) ligada al cromosoma X es la más frecuente de las enfermedades genéticas de la mielina que se caracteriza por una desmielinización progresiva del sistema nervioso central, una insuficiencia suprarrenal y una acumulación moderada (X 3 a 5) de los ácidos grasos de cadena muy larga (AGCML) en la mayor parte de los tejidos, incluidos el cerebro y la médula espinal. Esta acumulación de AGCML se produce por un déficit de su \beta-oxidación en el peroxisoma.

Los mecanismos que conducen en el ALD a una desmielinización y a una pérdida de los oligodendrocitos se conocen poco. Una de las posibilidades es que la acumulación de los AGCML lleva a una desestabilización de las membranas mielínicas o a una disfunción de los receptores situados en la superficie de los oligodendrocitos haciéndoles más sensibles a las señales de muerte celular programada (apóptosis). La muerte de los oligodendrocitos también podría producirse por la producción de citoquinas (en particular TNF-\alpha) por los macrófagos activados que están presentes en las lesiones inflamatorias cerebrales del ALD.

En un estudio de la fragmentación del ADN, por el método TUNEL y la expresión de la caspasa-3, el 50% de los oligodendrocitos de cerebros de pacientes ALD presentan señales de muerte celular por apóstosis y la intensidad de los fenómenos apoptóticos está correlacionada con la intensidad de la desmielinización.

Recientemente se ha demostrado una muerte de los oligodendrocitos por apóptosis en otros 2 modelos murinos de enfermedad genética de la mielina: el ratón twitcher (modelo de la enfermedad de Krabbe) y diferentes modelos deficientes en proteína proteolipídica, PLP (ratón jimpy, ratón msd, rata md).

Ahora se ha encontrado que el riluzol opcionalmente en forma de sal farmacéuticamente aceptable reduce la muerte de los oligodendrocitos por apóptosis inducida por el kainato y, por eso se puede utilizar en la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

El protocolo utilizado es el siguiente:

Cultivos enriquecidos en oligodendrocitos

Se obtienen oligodendrocitos a partir de cultivos gliales primarios de médulas espinales según el método descrito por Saneto et coll. (Neuchemistry, a practical approach, IRL Press, Oxford-Washington DC, p27-63 (1987)) ligeramente modificado. Se diseccionan médulas espinales de ratas Wistar de 1 día de edad en condiciones estériles y se separan de las meninges. Se transfieren cinco a diez médulas espinales a un PBS (del inglés phosfate buffer saline, tampón de fosfato salino: NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM) al que se ha añadido 0,25% de tripsina. El tratamiento enzimático se detiene por adición de medio Dulbecco Eagle modificado (DMEM) al que se ha añadido 10% de suero fetal bovino (FBS). Otra etapa de disociación se efectúa por medio de una pipeta de 1 ml y se filtra la suspensión celular. Las células se recogen por centrifugación y se reparten con una densidad de 1,5-2x10^{6} células/25 cm^{2} de medio de cultivo en un medio Dulbecco Eagle modificado (DMEM) al que se ha añadido 10% de suero fetal bovino. Después de 3 días in vitro, los cultivos se alimentan cada día. Cuando se obtiene una monocapa visible, los cultivos se agitan durante 2 horas a 37ºC a 250 rpm, se aparta el medio de cultivo y los frascos se agitan todavía 22 horas. El medio que contiene las células se incuba a 37ºC en cajas de petri durante 1 hora para que las microglías se unan al plástico. Los oligodendrocitos se recogen por centrifugación, se reparten con una densidad de 1,6x10^{6}/cm^{2} y se mantienen en DMEM al 10% de FBS durante 1 ó 2 días. El medio se reemplaza entonces por un medio L15 al que se añade bicarbonato de sodio (22 mM), conalbúmina (0,1 mg/ml), putrescina (0,1 mM), insulina (5 ug/ml), selenito de sodio (31 nM), glucosa (20 mM), progesterona (21 nM), penicilina (100 IU/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y suero de caballo (2%). Los oligodendrocitos se diferencian rápidamente en 24 a 48 horas en fenotipo maduro e inmaduro. Estos cultivos muestran una pureza de aproximadamente el 95% determinado por la inmuno-reactividad al galactocerebrósido-C (Gal-C) y a la proteína acídica fibriliar de la glía (GFPA).

A estos cultivos, se añade a continuación kainato en disolución en PBS en diferentes concentraciones (0,01 mM a 1 mM), riluzol en disolución en NaCl al 0,9% y HCl 0,001N, en diferentes concentraciones (0,01 mM a 10 mM) o disolvente. Después de 48 horas a partir del tratamiento, se cuentan los oligodendrocitos vivos.

Recuento de células

Las células inmuno-reactivas para Gal-C y que exhiben procedimientos enlazados más largos que los diámetros de 2 células se consideran globalmente como oligodendrocitos inmaduros o maduros. El número de oligodendrocitos Gal-C (+) está repartido para 2 recuentos separados de las células marcadas en al menos 12 campos de 0,63 mm^{2} en el microscopio 400x. Los valores se expresan como el número de células por cm^{2} o como el porcentaje de control.

Los análisis estadísticos se efectúan utilizando el ensayo de Student (t-test).

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Ensayo 1 Efecto del kainato sobre los cultivos de oligodendrocitos

Exposición de los cultivos de oligodendrocitos con concentraciones de 0,1 a 1mM de kainato durante 48 horas.

	Número de oligodendrocitos
	% en relación al control \pm desviación estándar
Disolvente solo	100 \pm 17,4
Kainato
0,01 mM	108,2 \pm 25,2
0,1 mM	76,3 \pm 27,9
0,5 mM	25,3 \pm 9,3
1 mM	22,9 \pm 7,1

Estos resultados demuestran que el kainato en dosis de 0,1 a 1 mM induce fuertemente la muerte por apóptosis de los oligodendrocitos.

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Ensayo 2 Investigación del efecto tóxico del riluzol solo sobre los cultivos de oligodendrocitos

Exposición de los cultivos de oligodendrocitos	Número de oligodendrocitos
con concentraciones de 0,01 mM a 10 mM	% en relación al control \pm desviación
de riluzol durante 48 horas.	estándar
Disolvente	100 \pm 8,2
Riluzol
0,01 mM	99,6 \pm 15,7
0,1 mM	94,3 \pm 17,3
1 mM	107,1 \pm 9,5
10 mM	86,9 \pm 16

Estos resultados demuestran que el riluzol en dosis de 0,01 mM a 10 mM no tiene ningún efecto tóxico sobre la supervivencia de los oligodendrocitos y que para una dosis de 10 mM se observa un ligero efecto tóxico.

Ensayo 3 Efecto protector del riluzol sobre la muerte de los oligocitos inducida por el kainato

Exposición de los oligodendrocitos al kainato con una dosis de 1 mM y al riluzol con dosis de 0,01 mM a 10 mM.

	Número de oligodendrocitos
	% en relación al control \pm desviación estándar
Kainato 1.000	22,9 \pm 7,1
Kainato 1 mM + riluzol 0,01 mM	48,7 \pm 7
Kainato 1 mM + riluzol 0,1 mM	65,2 \pm 9,2
Kainato 1 mM + riluzol 1 mM	69,4 \pm 12
Kainato 1 mM + riluzol 10 mM	56,3 \pm 6,9

Estos resultados demuestran que el riluzol disminuye netamente la muerte de los oligodendrocitos por apóptosis inducida por el kainato y ello incluso para una dosis en la que se ha observado un ligero efecto tóxico del riluzol solo y puede así utilizarse en la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

Como sales farmacéuticamente aceptables del riluzol se pueden citar principalmente las sales de adición con los ácidos minerales tales como el hidrocloruro, sulfato, nitrato, fosfato u orgánicos tales como acetato, propionato, succinato, oxalato, benzoato, fumarato, maleato, metanosulfonato, isetionato, acetato de teofilina, salicilato, fenolftalinato, metileno-bis-\beta-oxinaftoato o derivados de sustitución de estos derivados.

Los medicamentos están constituidos por al menos riluzol en forma libre o en forma de una sal de adición con un ácido farmacéuticamente aceptable, en el estado puro o en forma de una composición en la que está asociado a cualquier otro producto farmacéuticamente compatible, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. Los medicamentos según la invención se pueden emplear por vía oral, parenteral o rectal.

Como composiciones sólidas para administración oral, se pueden utilizar comprimidos, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina, sellos) o gránulos. En estas composiciones, el principio activo según la invención está mezclado con uno varios diluyentes inertes, tales como el almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, en corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender otras sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo uno o varios lubricantes tales como estearato de magnesio o el talco, un colorante, un recubrimiento (grageas) o un barniz.

Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden utilizar disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender otras sustancias diferentes de los eluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.

Las composiciones estériles para administración parenteral pueden ser preferentemente disoluciones acuosas o no acuosas, suspensiones o emulsiones. Como disolvente o vehículo se puede emplear agua, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, en particular el aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables, por ejemplo el oleato de etilo, u otros disolventes orgánicos convenientes. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización se puede hacer de muchas formas, por ejemplo, por filtración aseptizante, incorporando en la composición agentes esterilizantes, por irradiación o por calefacción. También pueden prepararse en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en el momento del uso en agua estéril o en cualquier otro medio estéril inyectable.

Las composiciones para administración rectal son los supositorios o cápsulas rectales que contienen, además del producto activo, excipientes tales como manteca de cacao, glicéridos semisintéticos o polietilenglicoles.

Las dosis dependen del efecto buscado, de la duración del tratamiento y de la vía de administración utilizada; generalmente están comprendidas entre 50 y 400 mg por día por vía oral para un adulto con dosis unitarias que van de 25 a 200 mg de sustancia activa.

De forma general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad, el peso y los demás factores propios del sujeto que se va a tratar.

Los siguientes ejemplos ilustran medicamentos según la invención:

Ejemplo A

Se preparan, según la técnica habitual, comprimidos con dosis de 50 mg de producto activo que tenga la siguiente composición:

\bullet	Riluzol	50 mg
\bullet	Manitol	64 mg
\bullet	Celulosa microcristalina	50 mg
\bullet	Excipiente de Polividona	12 mg
\bullet	Carboximetilalmidón sódico	16 mg
\bullet	Talco	4 mg
\bullet	Estearato de magnesio	2 mg
\bullet	Sílice coloidal anhidro	2 mg
\bullet	\begin{minipage}[t]{135mm} Mezcla de metilhidroxipropilcelulosa, polietileneglicol 6.000, dióxido de titanio (72-3,5-24,5) c.s.p. 1 comprimido recubierto de 245 mg. \end{minipage}

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Ejemplo B

Se preparan, según la técnica habitual, cápsulas con dosis de 50 mg de producto activo que tenga la siguiente composición:

\bullet	Riluzol	50 mg
\bullet	Celulosa	18 mg
\bullet	Lactosa	55 mg
\bullet	Sílice coloidal	1 mg
\bullet	Carboximetilalmidón sódico	10 mg
\bullet	Talco	10 mg
\bullet	Estearato de magnesio	1 mg

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Ejemplo C

Se prepara una disolución inyectable que contiene 10 mg de producto activo que tiene la siguiente composición:

\bullet	Riluzol	10 mg
\bullet	Ácido benzoico	80 mg
\bullet	Alcohol bencílico	0,06 cm^{3}
\bullet	Benzoato de sodio	80 mg
\bullet	Etanol al 95%	0,4 cm^{3}
\bullet	Hidróxido de sodio	24 mg
\bullet	Propilenglicol	1,6 cm^{3}
\bullet	Agua \hskip10cm c.s.p.	4 cm^{3}

La invención también se refiere a la utilización del riluzol o de una de sus sales farmacéuticamente aceptables para la preparación de un medicamento útil para la prevención o el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

La invención también se refiere al procedimiento de preparación de medicamentos útiles en la prevención o el tratamiento de la adrenoleucodistrofia que consiste en mezclar el riluzol o las sales farmacéuticamente aceptables de este compuesto con uno o varios diluyentes y/o adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.

Claims (2)

1. Utilización del riluzol o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para la preparación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de la adrenoleucodistrofia.

2. Utilización según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento que contiene de 25 a 200 mg de riluzol.