ES2260762T3

ES2260762T3 - Complejos inmunoterapeuticos proteina de estres-peptido contra el cancer.

Info

Publication number: ES2260762T3
Application number: ES95916256T
Authority: ES
Inventors: Pramod K. Srivastava
Original assignee: Mount Sinai School of Medicine
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-04-06
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2015-04-06
Also published as: US20050163793A1; US20020061316A1; EP0784477A1; ATE320447T1; JP2005015489A; DE69534874T2; US6017544A; US6468540B1; DE69534874D1; JP2008069167A; JPH10506628A; EP0784477B1; US5750119A; PT784477E; AU709643B2; AU2281995A; WO1996010411A1; EP0784477A4; DK0784477T3; CA2201498A1

Abstract

SE MUESTRA UN METODO PARA INHIBIR LA PROLIFERACION DE UN TUMOR EN UN MAMIFERO. EL METODO IMPLICA LOS PASOS DE (A) AISLAR UN COMPLEJO DE PEPTIDOS DE PROTEINA DE CARGA DESDE LAS CELULAS TUMORALES RETIRADAS PREVIAMENTE DEL MAMIFERO Y (B) LA ADMINISTRACION DE NUEVO DEL COMPLEJO DE PEPTIDO DE PROTEINA CARGADO AL MAMIFERO PARA ESTIMULAR EN ESTE UNA RESPUESTA INMUNE CONTRA EL TUMOR A PARTIR DEL COMPLEJO QUE FUE AISLADO. LOS COMPLEJOS DE PEPTIDOS DE PROTEINA CARGADOS TIENEN ESPECIAL UTILIDAD EN LA PRACTICA DE LA INVENCION PRESENTE QUE INCLUYE LOS COMPLEJOS DEL PEPTIDO HSP70, EL PEPTIDO HSP90, Y EL PEPTIDO GP96.

Description

Complejos inmunoterapéuticos proteína de estrés-péptico contra el cáncer.

Campo de la invención

La solicitud se refiere en general al campo de la terapia del cáncer, en particular a la inmunoterapia del cáncer humano.

Antecedentes de la invención

Se ha descubierto que los ratones y las ratas consanguíneos se pueden inmunizar de forma profiláctica contra tumores procedentes de ratones y ratas del mismo contexto genético (Gross (1943) Cáncer Res. 3:323-326; Prehn et al. (1957) J. Natl. Cáncer Inst. 18:769-778; Klein et al. (1960) Cáncer Res. 20:1561-1572; Old et al. (1962) Ann. NY Acad. Sci. 101:80-106; a modo de recapitulación, véase Srivastava et al. (1988) Immunology Today 9:78-83). Estos estudios no solamente demostraron que los ratones vacunados con células cancerosas inactivadas se inmunizaron contra exposiciones posteriores a células cancerosas vivas, sino que también demostraron la existencia de antígenos específicos de tumor.

Estudios posteriores pusieron de manifiesto que el fenómeno de la inmunidad inducida de forma profiláctica es específico de tumor. Aunque los ratones se pueden inmunizar específicamente contra las células tumorales que se usaron para inmunizarlos, todavía permanecen sensibles a exposiciones con otros tumores no relacionados (Basombrio (1970) Cáncer Res. 30:2458-2462, Globerson et al. (1964) J. Natl. Cáncer Inst. 32:1229-1243). La demostración de la inmunogenicidad de las células cancerosas condujo a la búsqueda de las moléculas derivadas del cáncer que provocan resistencia a las exposiciones tumorales. La aproximación general fue fraccionar las proteínas derivadas de células cancerosas y analizar de forma individual su capacidad para inmunizar a ratones contra los cánceres a partir de los cuales se prepararon las fracciones (véase Srivastava et al. (1988), anteriormente mencionado; Old (1981) Cáncer Res. 41:361-375). Se han identificado varias proteínas mediante este método, sin embargo, una gran proporción de estas proteínas están relacionadas con una clase de proteínas conocidas como proteínas inducidas por estrés o proteínas de estrés (Lindquist et al. (1988) Annual Rev. Genet. 22:631-677). Debido a que las proteínas de estrés están entre las proteínas más conservadas y abundantes de la naturaleza, son candidatos improbables como antígenos específicos de tumor. Se ha demostrado posteriormente que las proteínas de estrés se asocian de forma no covalente a una diversidad de péptidos, para formar así complejos proteína de estrés-péptido (Gething et al. (1992) Nature 355:33-45; Lindquist et al. (1988), anteriormente mencionado; Young (1990) Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Flynn et al. 1991) Nature 353:726-730).

Los estudios también han mostrado que los complejos proteína de estrés-péptido pierden su inmunogenicidad al tratarlos con ATP (Udono et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1391-1396). Se sabe que este tratamiento disocia el complejo proteína de estrés-péptido en sus componentes de proteína de estrés y péptido. Considerando que no existen diferencias en la estructura de las proteínas de estrés procedentes de células normales y tumorales, y que las proteínas de estrés se unen a un amplio espectro de péptidos de una forma dependiente de ATP, parece que la antigenicidad del complejo proteína de estrés-péptido no resulta de la proteína de estrés per se, sino del péptido asociado con la proteína de estrés.

Una de las principales dificultades conceptuales en la inmunoterapia del cáncer ha sido la posibilidad de que los cánceres humanos, como los cánceres de animales experimentales, son distintos antigénicamente. Claramente, existen pruebas recientes de la existencia de antígenos tumorales comunes (Kawakami et al. (1992) J. Immunol. 148:638-643; Darrow et al. (1989) J. Immunol. 142:3329-3334), y esto es un buen augurio para las perspectivas de la inmunoterapia del cáncer. Sin embargo, a la vista de las pruebas abrumadoras de los sistemas experimentales y humanos, es razonable asumir que, como mínimo, los tumores humanos mostrarían una enorme diversidad y heterogeneidad antigénica.

La perspectiva de identificación de los antígenos inmunógenos de tumores individuales de pacientes de cáncer (o incluso de "solamente" varios tipos diferentes de antígenos inmunógenos, en caso de que los antígenos sean compartidos), es abrumadora hasta el punto de ser poco factible. Las terapias convencionales del cáncer se basan típicamente en el aislamiento y la caracterización de determinantes antigénicos específicos que se pueden transformar después en el objetivo de inmunoterapias posteriores. Además, aunque los estudios han demostrado que los mamíferos se pueden inmunizar de forma profiláctica contra tumores procedentes de mamíferos del mismo contexto genético, hasta ahora no se ha apreciado que un mamífero que alberga un tumor se pueda inmunizar de forma terapéutica con una composición procedente de su propio tumor como medio para tratar un cáncer preexistente en el animal.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método nuevo para inhibir terapéuticamente la proliferación de tumores en un mamífero. El método descrito aquí no requiere el aislamiento y la caracterización de determinantes antigénicos específicos, y por lo tanto proporciona una aproximación más rápida para hacer y utilizar composiciones inmunógenas eficaces para inhibir la proliferación de tumores predeterminados específicos en mamíferos.

Este y otros objetivos y características de la invención serán aparentes a partir de la descripción y las reivindicaciones siguientes.

Resumen de la invención

La observación de que las proteínas de estrés se unen a los péptidos antigénicos de las células de las que proceden proporciona una aproximación para aislar fácilmente péptidos antigénicos para un tumor preseleccionado. Una vez aislados, los complejos proteína de estrés-péptido se administran de vuelta al animal del que proceden para provocar una respuesta inmunitaria contra un tumor preexistente. Por lo tanto, esta aproximación evita la necesidad de aislar y caracterizar antígenos específicos de tumor, y permite al técnico preparar fácilmente composiciones inmunógenas eficaces contra un tumor preseleccionado.

En su aspecto más amplio, la invención se refiere a un método para inhibir la proliferación de un tumor preseleccionado en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero que recibe terapia una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con un complejo inmunógeno proteína de estrés-péptido purificado de mamífero. El complejo que se ha aislado a partir de una célula tumoral previamente extirpada del mamífero se caracteriza porque es operativo para iniciar en el mamífero una respuesta inmunitaria contra las células tumorales de las que procede. El complejo se administra de vuelta al mamífero posteriormente en una cantidad suficiente para provocar en el mamífero una respuesta inmunitaria contra las células tumorales, y por ello inhibe la proliferación de cualquier célula tumoral que permanezca todavía en el mamífero.

Se contempla que esta aproximación se puede usar en combinación con otras terapias del cáncer convencionales que incluyen, por ejemplo, cirugía, radioterapia y quimioterapia. Por ejemplo, después de la extirpación quirúrgica del tejido canceroso, el técnico, usando los principios descritos aquí, puede aislar complejos proteína de estrés-péptido a partir del tejido extirpado, y administrar el complejo de vuelta al mamífero. El complejo induce posteriormente una respuesta inmunitaria específica contra cualquier célula tumoral restante que no se extirpó durante la cirugía. La aproximación es adecuada para la terapia del cáncer cuando el tumor primario ha metastatizado a ubicaciones diferentes del cuerpo.

El término "tumor", como se usa aquí, se entiende que se refiere a cualquier crecimiento anormal o incontrolado de células que puede dar como resultado la invasión de tejidos normales. Se contempla también que el término abarca crecimientos celulares anormales o incontrolados que han metastatizado, es decir, células anormales que se han propagado desde una ubicación primaria en el cuerpo (es decir, tumor primario) a una ubicación secundaria distante espacialmente del tumor primario.

La expresión "proteína de estrés", como se usa aquí, se entiende que se refiere a cualquier proteína celular que satisface los siguientes criterios. Es una proteína cuya concentración intracelular aumenta cuando una célula se expone a estímulos estresantes, es capaz de unirse a otras proteínas o péptidos, y es capaz de liberar las proteínas o péptidos unidos en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) y/o de pH bajo. Los estímulos estresantes incluyen, pero no se limitan a, choque térmico, privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno e infección con patógenos intracelulares.

Las primeras proteínas de estrés que se identificaron fueron las proteínas de choque térmico (Hsp). Como indica su nombre, las Hsp son inducidas por una célula en respuesta al choque térmico. Se han identificado hasta la fecha tres familias principales de Hsp, que incluyen Hsp60, Hsp70 y Hsp90. Los números reflejan el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en kilodaltons. Los miembros de cada una de las familias están sumamente conservados, véase, por ejemplo, Bardwell et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852; Hickey et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:2615-2626; Jindal (1989) Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. Los miembros de la familia Hsp90 de mamíferos identificados hasta la fecha incluyen Hsp90 citosólico (también conocido como Hsp83) y los homólogos de retículo endoplásmico Hsp90 (también conocido como Hsp83), Hsp87, Grp94 (también conocido como ERp99) y gp96. Véase, por ejemplo, Gething et al. (1992) Nature 355:33-45, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. Los miembros de la familia Hsp70 identificados hasta la fecha incluyen: Hsp70 citosólico (también conocido como p73) y Hsc70 (también conocido como p72); el homólogo de retículo endoplásmico BiP (también conocido como Grp78); y el homólogo mitocondrial Hsp 70 (también conocido como Grp75), Gething et al. (1992), anteriormente mencionado. Hasta la fecha, los miembros de la familia Hsp60 de mamíferos solamente se han identificado en las mitocondrias, Gething et al. (1992), anteriormente mencio-
nado.

Además, se ha descubierto que las familias Hsp-60, Hsp-70 y Hsp-90 están compuestas por proteínas relacionadas con las proteínas de estrés en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, que tienen una identidad de aminoácidos mayor del 35%, pero cuyos niveles de expresión no se alteran por estímulos estresantes. Por lo tanto, se contempla que la definición de proteína de estrés, como se usa aquí, abarca otras proteínas, muteínas, análogos y variantes suyas, que tienen al menos del 35% al 55%, preferiblemente del 55% al 75%, y lo más preferiblemente del 75% al 85% de identidad de aminoácidos con miembros de las tres familias cuyos niveles de expresión en una célula se estimulan en respuesta a estímulos estresantes.

El término "péptido", como se usa aquí, se entiende que se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos aislada a partir de una célula tumoral mamífera en forma de un complejo proteína de estrés-péptido.

La expresión "complejo inmunógeno proteína de estrés-péptido", como se usa aquí, se entiende que se refiere a cualquier complejo que se puede aislar a partir de una célula tumoral de mamífero, y comprende una proteína de estrés asociada de forma no covalente con un péptido. El complejo se caracteriza además porque es operativo para inducir en el mamífero una respuesta inmunitaria contra las células tumorales de las que procede el complejo.

La expresión "respuesta inmunitaria" se entiende que se refiere a cualquier proceso celular que se produce en el mamífero después de la estimulación con un antígeno, y se dirige a la eliminación del antígeno del mamífero. La respuesta inmunitaria está mediada típicamente por una o más poblaciones de células caracterizadas por ser de naturaleza linfocítica y/o fagocítica.

En un aspecto más específico de la invención, la proteína de estrés del complejo proteína de estrés-péptido se selecciona del grupo que consiste en Hsp70, Hsp90 y gp96. Los complejos proteína de estrés-péptido que incluyen Hsp70-péptido, Hsp90-péptido y gp96-péptido se pueden aislar simultáneamente a partir de un grupo de células tumorales extirpadas de un mamífero. Durante la inmunoterapia se contempla que se puede administrar uno o más de los complejos anteriormente mencionados al mamífero para estimular la respuesta inmunitaria óptima contra el tumor.

Se contempla que el método descrito aquí es particularmente útil para el tratamiento del cáncer humano. Sin embargo, se contempla que los métodos descritos aquí serán útiles de forma similar en la inmunoterapia de cánceres en otros mamíferos, por ejemplo, animales de granja (es decir, ganado bovino, caballos, cabras, ovejas y cerdos) y mascotas domésticas (es decir, gatos y perros).

En otro aspecto de la invención, se contempla que la respuesta inmunitaria se efectúa por medio de una cascada de células T, y más específicamente por medio de una cascada de células T citotóxicas. La expresión "célula T citotóxica", como se usa aquí, se entiende que se refiere a cualquier linfocito T que expresa el marcador glucoproteico de superficie celular CD8, que es capaz de encontrar y lisar una célula objetivo que alberga un complejo de histocompatibilidad de clase I en su superficie celular y que está infectada con un patógeno intracelular.

En otro aspecto de la invención, los complejos proteína de estrés-péptido se pueden administrar al mamífero en combinación con una cantidad terapéuticamente activa de una citocina. Como se usa aquí, el término "citocina" se refiere a cualquier polipéptido secretado que influye en la función de otras células que median una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, se contempla que el complejo se puede coadministrar con una citocina para aumentar la respuesta inmunitaria dirigida contra el tumor. Las citocinas preferidas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-1\alpha (IL-1\alpha), interleucina-1\beta (IL-1\beta), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), interferón \alpha (IFN\alpha), interferón \beta (IFN\beta), interferón \gamma (IFN\gamma), factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), factor de necrosis tumoral \beta (TNF\beta), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta).

El complejo se puede administrar a un mamífero cuando se combina con un vehículo, adyuvante o excipiente convencional farmacéuticamente aceptable usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las dosis y los medios de administración de la familia de complejos proteína de estrés-péptido dependerán necesariamente de una diversidad de factores, tales como la estabilidad del complejo en condiciones fisiológicas, la efectividad del complejo para provocar una respuesta inmunitaria, el tamaño y distribución del tumor, y la edad, sexo y peso del mamífero que recibe terapia.

Típicamente, el complejo se debería administrar en una cantidad suficiente para iniciar en el mamífero una respuesta inmunitaria contra el tumor del cual procede el complejo, y en una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de las células tumorales en el mamífero. La cantidad del complejo proteína de estrés-péptido administrada está preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1-1000 microgramos de complejo/kg de peso corporal del mamífero/administración, y lo más preferiblemente alrededor de 100-250 microgramos de complejo/kg de peso corporal del mamífero/administración. Se contempla que la dosis típica estará en el intervalo de alrededor de 5 a alrededor de 20 mg para un sujeto humano que pesa alrededor de 75 kg. Además, se contempla que la intensidad de la respuesta inmunitaria se puede aumentar administrando repetidamente el complejo al individuo. El mamífero recibe preferiblemente al menos dos dosis del complejo proteína de estrés-péptido a intervalos semanales. Si es necesario, la respuesta inmunitaria se puede reforzar en una fecha posterior mediante administración subsiguiente del complejo. Se contempla, sin embargo, que alguien experto en la técnica puede hallar la dosis y el régimen de inmunización óptimos mediante experimentación rutinaria.

Descripción detallada

La invención se basa en la observación de que los complejos proteína de estrés-péptido se unen a péptidos antigénicos de las células de las que proceden. Las terapias del cáncer convencionales se basan en el aislamiento y la caracterización de antígenos específicos de tumor que se convierten después en el objetivo de un régimen terapéutico específico. Debido a la diversidad antigénica de los cánceres mamíferos, el aislamiento y la caracterización de antígenos específicos de tumor para cada tumor específico puede ser poco factible. La presente invención proporciona así una aproximación alternativa a la inmunoterapia del cáncer evitando la necesidad de aislar y caracterizar antígenos específicos de tumor para cada tumor que se trata.

La invención descrita aquí se refiere a un método para inhibir la proliferación de un tumor preseleccionado en un mamífero. El método comprende aislar u obtener células tumorales del mamífero que recibe terapia. Esto se consigue fácilmente usando procedimientos quirúrgicos convencionales conocidos en la técnica. Típicamente, se extirpan células tumorales del mamífero durante la extirpación quirúrgica rutinaria del tumor. Después, el método implica aislar complejos proteína de estrés-péptido de las células tumorales extirpadas. Esto se consigue usando cualquiera de los procedimientos de aislamiento descritos con detalle aquí más adelante. Los complejos proteína de estrés-péptido se caracterizan porque cuando se administran de vuelta al mamífero son capaces de iniciar una respuesta inmunitaria específica contra el mismo tipo de células tumorales del que proceden. Finalmente, el método comprende la etapa de administrar de vuelta al mamífero el complejo proteína de estrés-péptido aislado en una cantidad suficiente para provocar en el mamífero una respuesta inmunitaria contra las células tumorales, por lo que se inhibe la proliferación de cualquier célula tumoral que permanezca en el mamífero.

Se contempla que esta aproximación se puede usar en combinación con una o más terapias convencionales del cáncer que incluyen, por ejemplo, cirugía, radioterapia y quimioterapia. Por ejemplo, después de la escisión quirúrgica de tejido canceroso, el técnico, usando los principios descritos aquí, puede aislar complejos proteína de estrés-péptido a partir del tejido extirpado y administrar el complejo de vuelta al mamífero. El complejo induce entonces en el mamífero una respuesta inmunitaria específica contra cualquier célula tumoral que no se extrajo durante la cirugía. Alternativamente, el método descrito aquí proporciona una aproximación nueva para tratar el cáncer cuando el tumor primario ha metastatizado a múltiples ubicaciones del cuerpo. Por ejemplo, cuando el cáncer ha metastatizado, lo que hace la intervención quirúrgica poco factible, se puede usar un complejo proteína de estrés-péptido solo o en combinación con otro agente quimioterápico estándar en el tratamiento del cáncer.

Se contempla que la invención tiene utilidad particular en la inmunoterapia del cáncer humano, sin embargo, se aprecia que las metodologías descritas aquí se pueden aplicar al tratamiento de cánceres que ocurren, por ejemplo, en animales de granja (es decir, ganado bovino, caballos, ovejas, cabras y cerdos) y mascotas domésticas (es decir, gatos y perros).

La ventaja principal que tiene esta aproximación sobre las metodologías convencionales es que no es necesario aislar y caracterizar el antígeno tumoral específico para cada tumor. Una vez que se ha aislado el complejo proteína de estrés-péptido, simplemente se administra de vuelta al mamífero sin caracterización adicional. Ya que los procedimientos para aislar los complejos inmunógenos son rutinarios y conocidos en la técnica, el técnico puede preparar rápidamente y de forma rutinaria una composición inmunógena específica "hecha a medida" para cada individuo a tratar.

Otra ventaja del presente método sobre las metodologías previas es que la administración de los complejos proteína de estrés-péptido purificados de vuelta al individuo del que proceden elimina el riesgo de inocular al mamífero que recibe terapia agentes potencialmente transformantes (es decir, ADN transformante) y/o agentes inmunosupresores, que pueden ser un problema cuando el complejo está presente en un tumor o extracto tumoral bioquímicamente indeterminado. Además, los complejos proteína de estrés-péptido pueden inducir inmunidad tumoral significativa en ausencia de adyuvantes. Por lo tanto, aunque los adyuvantes pueden aumentar adicionalmente las propiedades inmunoterapéuticas del complejo, su disponibilidad no es una condición previa para inducir una respuesta inmunitaria significativa.

Se contempla que este método se puede usar en el tratamiento de una diversidad de tumores, por ejemplo, tumores que son de origen mesenquimatoso (sarcomas), es decir, fibrosarcomas; mixosarcomas; liposarcomas; condrosarcomas; sarcomas osteogénicos; angiosarcomas; sarcomas endoteliales; linfangiosarcomas; sarcomas sinoviales; sarcomas mesoteliales; tumores de Ewing; leucemias mielógenas; leucemias monocíticas; linfomas malignos; leucemias linfocíticas; plasmocitomas; liomiosarcomas y rabdomiosarcomas.

Además, se contempla que este método se puede usar en el tratamiento de tumores que son de origen epitelial (carcinomas), es decir, carcinomas escamosos o epidérmicos; carcinomas basocelulares; carcinomas de glándulas sudoríparas; carcinomas de glándulas sebáceas; adenocarcinomas; carcinomas papilares; adenocarcinomas papilares; cistoadenocarcinomas; carcinomas medulares; carcinomas indiferenciados (carcinomas simples); carcinomas broncógenos; carcinomas bronquiales; melanocarcinomas; carcinomas de células renales; carcinomas hepatocelulares; carcinomas de vías biliares; carcinomas papilares; carcinomas de células de transición; carcinomas escamosos; coriocarcinomas; seminomas; carcinomas embrionarios, teratomas malignos y teratocarcinomas. Las metodologías genéricas útiles en la preparación de composiciones eficaces para inducir una respuesta inmunitaria contra estos tumores se discuten con detalle aquí más adelante.

Aunque no se desea limitarse por la teoría, se contempla que los complejos proteína de estrés-péptido estimulan una respuesta inmunitaria contra las células tumorales de las que proceden por medio de una cascada de células T. Los experimentos previos han demostrado que los ratones inmunizados de forma profiláctica con preparaciones de proteína de estrés-péptido procedentes de un tumor originario de la misma raza de ratón o rata desarrollan resistencia inmunológica contra el tumor a partir del cual se aislaron. Los ratones, sin embargo, no desarrollan inmunidad contra tumores antigénicamente distintos. Además, los complejos proteína de estrés-péptido procedentes de tejidos normales no provocan resistencia a ninguno de los tumores ensayados. Véase, por ejemplo, Srivastava et al. (1984) Int. J. Casncer 33:417; Srivastava et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3407; Palladino et al. (1987) Cáncer Res. 47:5074; Feldweg et al. (1993) J. Cell Biochem. Suppl. 17D:108 (Abst.); Udono et al. (1993) J. Cell. Biochem. Suppl. 17D:113 y Udono (1993) J. Exp. Med. 178:1391-1396. Recientemente, se ha establecido que la inmunidad profiláctica está mediada típicamente por medio de una cascada de células T, más específicamente por medio de una cascada de células T citotóxicas. Véase, por ejemplo, Blachere et al. (1993) J. Immunother. 14:352-356. Por lo tanto, se contempla que los complejos de proteína de estrés pueden mediar también su efecto terapéuticamente mediante un mecanismo similar; específicamente, por medio de una cascada de células T citotóxicas.

Se contempla que los complejos proteína de estrés-péptido se aislarán típicamente de forma directa a partir del tejido tumoral extirpado del animal a tratar. En ciertas condiciones, sin embargo, la cantidad de tejido tumoral disponible para aislamiento del complejo puede ser limitante. Por lo tanto, se contempla que el tejido tumoral extirpado se puede hacer proliferar usando técnicas bien conocidas en la técnica antes del aislamiento de los complejos proteína de estrés-péptido. Por ejemplo, el tejido tumoral extirpado se puede hacer proliferar in vivo, por ejemplo, transfectando un ratón atímico con una muestra del tejido tumoral, o in vitro, por ejemplo, mediante pases sucesivos de las células tumorales en cultivo. El tejido tumoral proliferado se puede recoger posteriormente y utilizar como material de partida para el aislamiento del complejo proteína de estrés-péptido.

Las proteínas de estrés útiles en la práctica de la presente invención se pueden definir como cualquier proteína celular que satisface los siguientes criterios. Es una proteína cuya concentración intracelular se incrementa cuando una célula se expone a estímulos estresantes, es capaz de unirse a otras proteínas o péptidos, y es capaz de liberar las proteínas o péptidos unidos en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) o pH bajo.

Las primeras proteínas de estrés identificadas fueron las Hsp que se sintetizan en una célula en respuesta a choque térmico. Hasta la fecha, se han identificado tres familias principales de Hsp, e incluyen Hsp60, Hsp70 y Hsp90, en las que los números reflejan el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en kilodaltons. Posteriormente se descubrió que muchos miembros de estas familias se inducen en respuesta a otros estímulos estresantes que incluyen, pero no se limitan a, privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno, e infección con patógenos intracelulares. Véase, por ejemplo: Welch (mayo de 1993) Scientific American 56-64; Young (1990) anteriormente mencionado; Craig (1993) Science 260:1902-1903; Gething et al. (1992) anteriormente mencionado; y Lindquist et al. (1988) anteriormente mencionado, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. Se contempla que las proteínas de estrés de mamífero que pertenecen a las tres familias pueden ser útiles en la práctica de la presente invención.

Las proteínas de estrés principales se acumulan hasta concentraciones muy elevadas en células sometidas a estrés, pero se dan a concentraciones bajas a moderadas en células que no se han sometido a estrés. Por ejemplo, Hsp70 de mamíferos, sumamente inducible, es difícilmente detectable a temperaturas normales, pero se convierte en una de las proteínas sintetizadas de forma más activa en la célula tras choque térmico (Welch et al. (1985), J. Cell. Biol. 101:1198-1211). Por contraste, las proteínas Hsp90 y Hsp60 son abundantes a temperaturas normales en la mayoría, pero no en todas, las células mamíferas, y se inducen aún más mediante calor (Lai et al. (1984), Mol. Cell. Biol. 4:2802-10; van Bergen en Henegouwen et al. (1987), Genes Dev., 1:525-31).

Los miembros de la familia Hsp90 de mamíferos identificados hasta la fecha incluyen Hsp90 citosólico (también conocido como Hsp83) y los homólogos de retículo endoplásmico Hsp90 (también conocido como Hsp83), Hsp87, Grp94 (también conocido como ERp99) y gp96 (Gething et al. (1992), anteriormente mencionado). Los miembros la familia Hsp70 identificados hasta la fecha incluyen: Hsp70 citosólico (también conocido como p73) y Hsc70 (también conocido como p72), el homólogo de retículo endoplásmico BiP (también conocido como Grp78) y el homólogo mitocondrial Hsp 70 (también conocido como Grp75), Gething et al. (1992), anteriormente mencionado. Hasta la fecha, los miembros de la familia Hsp60 de mamíferos se han identificado solamente en las mitocondrias, Gething et al. (1992), anteriormente mencionado.

Las proteínas de estrés están entre las proteínas existentes más conservadas. Por ejemplo, DnaK, el Hsp70 de E. coli, tiene alrededor de un 50% de identidad de aminoácidos con las proteínas Hsp70 de los eucariotas (Bardwell et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852). Las familias Hsp60 y Hsp90 exhiben de forma similar niveles elevados de conservación intrafamiliar (Hickey et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:2615-2626; Jindal (1989) Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283). Además, se ha descubierto que las familias Hsp60, Hsp70 y Hsp90 están compuestas por proteínas que están relacionadas con las proteínas de estrés en la secuencia, por ejemplo, que tienen una identidad de aminoácidos mayor del 35%, pero cuyos niveles de expresión no se alteran por el estrés. Por lo tanto, se contempla que la definición de proteína de estrés, como se usa aquí, abarca otras proteínas, muteínas, análogos y variantes suyas que tienen al menos del 35% al 55%, preferiblemente del 55% al 75%, y lo más preferiblemente del 75% al 85% de identidad de aminoácidos con miembros de las tres familias cuyos niveles de expresión en una célula aumentan en respuesta a un estímulo estresante.

Los complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido de la invención pueden incluir cualquier complejo que contiene una proteína de estrés asociada de forma no covalente con un péptido que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los complejos preferidos incluyen, pero no se limitan a, complejos Hsp70-péptido, Hsp90-péptido y gp96-péptido. Por ejemplo, se puede usar en la práctica de la presente invención la proteína de estrés de mamíferos gp96, que es el homólogo de retículo endoplásmico de Hsp90 citosólico.

Se enumeran con detalle más adelante procedimientos típicos para aislar complejos proteína de estrés-péptido útiles en la práctica de la presente invención.

Purificación de complejos Hsp70-péptido

La purificación de complejos Hsp70-péptido se ha descrito previamente, véase, por ejemplo, Udono et al. (1993), anteriormente mencionado.

Inicialmente, las células tumorales se suspenden en 3 volúmenes de tampón de lisis 1X, que consiste en tampón de fosfato sódico 5 mM (pH 7), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 2 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM. Después, el sedimento se sonica, en hielo, hasta que se lisa >99% de las células, como se determina mediante examen microscópico. Como alternativa a la sonicación, las células se pueden lisar mediante cizallamiento mecánico, y en esta aproximación las células se resuspenden típicamente en bicarbonato sódico 30 mM de pH 7,5 y PMSF 1 mM, se incuban en hielo durante 20 min, y después se homogeneizan en un homogeneizador Dounce hasta que se lisa >95% de las células.

Después, el lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos para eliminar las células sin lisar, los núcleos y otros residuos celulares. El sobrenadante resultante se vuelve a centrifugar a 100.000 g durante 90 minutos, se recoge el sobrenadante y se mezcla con Con A Sepharose equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Ca^{2+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Cuando las células se lisan mediante cizallamiento mecánico, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de mezclar con Con A Sepharose. Después se deja que el sobrenadante interaccione con Con A Sepharose durante 2-3 horas a 4ºC. El material que no interacciona se recoge y se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) con Tris-acetato 10 mM de pH 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCl 10 mM y PMSF 1 mM. Después, se centrifuga el dializado a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 20 min. Después, el sobrenadante resultante se recoge y se aplica en una columna de FPLC Mono Q equilibrada con Tris-acetato 20 mM de pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 0,1 mM y 2-mercaptoetanol 15 mM. Después la columna se hace funcionar con un gradiente de NaCl de 20 mM a 500 mM y las fracciones eluidas se fraccionan mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se caracterizan mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-Hsp70 apropiado (tal como el del clon N27F3-4, de StressGen).

Se mezclan las fracciones intensamente inmunorreactivas con el anticuerpo anti-Hsp70, y se precipitan los complejos Hsp70-péptido con sulfato amónico; específicamente, con un intervalo de sulfato amónico del 50%-70%. El precipitado resultante se recoge después mediante centrifugación a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) y se lava con sulfato amónico del 70%. El precipitado lavado se solubiliza después y se elimina el sulfato amónico residual mediante filtración en gel en una columna Sephadex^{R} G25 (Pharmacia).

El complejo Hsp70-péptido se puede purificar hasta homogeneidad aparente usando este método. Típicamente, se puede purificar 1 mg de complejo Hsp70-péptido a partir de 1 g de células/tejido.

Purificación de complejos Hsp90-péptido

Después, el lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 min para eliminar las células sin lisar, los núcleos y otros residuos celulares. El sobrenadante resultante se vuelve a centrifugar a 100.000 g durante 90 minutos, se recoge el sobrenadante y se mezcla con Con A Sepharose equilibrada con PBS que contiene Ca^{2+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Cuando las células se lisan mediante cizallamiento mecánico, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de mezclar con Con A Sepharose. Después se deja que el sobrenadante interaccione con Con A Sepharose durante 2-3 horas a 4ºC. El material que no interacciona se recoge y se dializa durante 36 horas (tres veces, 100 volúmenes cada vez) con Tris-acetato 10 mM de pH 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCl 10 mM y PMSF 1 mM. Después se centrifuga el dializado a 17.000 rpm (rotor Sorvall SS34) durante 20 min. Después, el sobrenadante resultante se recoge y se aplica en una columna de FPLC Mono Q equilibrada con tampón de lisis. Las proteínas se eluyen después con un gradiente salino de NaCl de 200 mM a 600 mM.

Las fracciones eluidas se fraccionan mediante SDS-PAGE, y las fracciones que contienen los complejos Hsp90-péptido se identifican mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-Hsp90 tal como 3G3 (Affinity Bioreagents). Los complejos Hsp90-péptido se pueden purificar hasta homogeneidad aparente usando este procedimiento. Típicamente, se pueden purificar 150-200 \mug de complejo Hsp90-péptido a partir de 1 g de células/tejido.

Purificación de complejos gp96-péptido

Después, el lisado se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos para eliminar las células sin lisar, los núcleos y otros residuos celulares. El sobrenadante resultante se vuelve a centrifugar a 100.000 g durante 90 minutos, se recoge el sobrenadante y se mezcla con suspensión de Con A Sepharose equilibrada con PBS que contiene Ca^{2+} 2 mM y Mg^{2+} 2 mM. Cuando las células se lisan mediante cizallamiento mecánico, el sobrenadante se diluye con un volumen igual de tampón de lisis 2X antes de mezclar con Con A Sepharose. Después, se deja que el sobrenadante interaccione con Con A Sepharose durante 2-3 horas a 4ºC. La suspensión se carga después en una columna y se lava con tampón de lisis 1X hasta que la DO_{280} cae hasta la línea base. Después, la columna se lava con 1/2 del volumen del lecho de la columna de \alpha-metilmanósido (\alpha-MM), la columna se sella con parafilm y se incuba a 37ºC durante 15 min. La columna se enfría después a temperatura ambiente, se quita el parafilm del fondo de la columna, y se aplican cinco volúmenes de columna de un \alpha-MM a la columna. Después el eluido se fracciona y se caracteriza mediante SDS-PAGE. Típicamente, el complejo gp96-péptido resultante es puro en alrededor de un 60 a un 95%, dependiendo del tipo de células y de la proporción utilizada de tejido respecto de tampón de lisis.

Si es necesaria una purificación adicional, la muestra se puede aplicar a una columna de FPLC Mono Q equilibrada con un tampón que contiene fosfato sódico 5 mM, pH 7. Las proteínas se eluyen después de la columna con un gradiente de NaCl 0-1 M. La fracción de gp96 eluye entre NaCl 400 mM y 550 mM.

Como procedimiento alternativo, la fracción de gp96 aislada del sedimento de 100.000 g se puede resuspender en 5 volúmenes de PBS que contiene desoxicolato sódico del 1% (sin Ca^{2+} ni Mg ^{+2}) e incubar en hielo durante 1 h. La suspensión resultante se centrifuga durante 30 min a 20.000 g, y el sobrenadante resultante se recoge y se dializa con varios cambios de PBS (sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}) para eliminar el detergente. El dializado resultante se centrifuga durante 90 min a 100.000 g y el sobrenadante se purifica adicionalmente. Después, se añade calcio y magnesio al sobrenadante para dar concentraciones finales de 2 mM. Después, la muestra se aplica a una columna de HPLC Mono Q equilibrada con un tampón que contiene fosfato sódico 5 mM, pH 7 y las proteínas se eluyen con un gradiente de NaCl 0-1 M. La fracción de gp96 eluye entre NaCl 400 mM y 550 mM.

Los complejos gp96-péptido se pueden purificar hasta homogeneidad aparente usando este procedimiento. Típicamente, se pueden aislar alrededor de 10-20 \mug de gp96 a partir de 1 g de células/tejido usando este método.

Formulación y administración de los complejos

Una vez que los complejos proteína de estrés-péptido se han purificado a partir del tumor extirpado, se administran de vuelta al mamífero que recibe terapia para estimular en el mamífero una respuesta inmunitaria contra las células tumorales de las que procede el complejo. Los complejos proteína de estrés-péptido de la invención se pueden almacenar o preparar para la administración mezclando con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estos materiales deberían ser atóxicos para el receptor deseado a las dosis y concentraciones empleadas.

Cuando el complejo es hidrosoluble, se puede formular en un tampón apropiado, por ejemplo PBS (fosfato sódico 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1) u otras disoluciones fisiológicamente compatibles. De forma alternativa, si el complejo resultante tiene una solubilidad baja en disolventes acuosos, se puede formular con un tensoactivo no iónico, tal como Tween o polietilenglicol.

Las disoluciones útiles para administración oral o parenteral se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica farmacéutica, descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Las formulaciones pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las formulaciones para administración directa, en particular, pueden incluir glicerol y otras composiciones de elevada viscosidad. Los polímeros biocompatibles, preferiblemente biorreabsorbibles, que incluyen, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, polibutirato, polilactida, poliglicolida y copolímeros de lactida/glicolida, pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación in vivo de los complejos proteína de estrés-péptido.

Las formulaciones para inhalación pueden contener como excipientes, por ejemplo, lactosa. Las disoluciones acuosas pueden contener, por ejemplo, éter polioxietilen-9-laurílico, glucocolato y desoxicolato. Las disoluciones aceitosas pueden ser útiles para administración en forma de gotas nasales. Se pueden aplicar geles de forma tópica intranasal.

Los compuestos proporcionados aquí se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante mezcla con excipientes y vehículos atóxicos farmacéuticamente aceptables. Además, las formulaciones pueden contener opcionalmente uno o más adyuvantes. Los adyuvantes preferidos incluyen, pero no se limitan a, copolímeros tribloque de ácido plurónico, dipéptido de muramilo y sus derivados, endotoxina destoxificada, saponina y sus derivados, tales como QS-21 y liposomas. La presente invención prevé además formulaciones de liberación sostenida en las que el complejo se libera a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.

El modo de administración de la familia de complejos proteína de estrés-péptido preparados de acuerdo con la invención dependerá necesariamente de la estabilidad del complejo en condiciones fisiológicas, y del tamaño y distribución del tumor en el mamífero a tratar. Es probable que la dosis preferida de complejo a administrar dependa de variables tales como el tamaño y la distribución del tumor, la edad, sexo y peso del receptor deseado, el estado de salud general del receptor particular, la eficacia biológica relativa del complejo, la formulación del complejo, la presencia y tipos de excipientes en la formulación, y la vía de administración.

En términos generales, los compuestos de esta invención se pueden proporcionar en una disolución tampón fisiológica acuosa que contiene alrededor del 0,001 al 10% p/v de compuesto para administración parenteral. Las dosis preferidas oscilan de alrededor de 1 a alrededor de 1000 microgramos de complejo/kg de peso corporal del receptor/administración, y lo más preferiblemente oscilan de alrededor de 100 a alrededor de 250 microgramos de complejo/kg de peso corporal del receptor/administración. En particular, se contempla que una dosis típica oscilará de alrededor de 5 mg a alrededor de 20 mg para un sujeto humano que pesa alrededor de 75 kg. Estas cantidades, sin embargo, pueden variar según el adyuvante coadministrado con el complejo.

El complejo preferiblemente comprende parte de una disolución acuosa que se puede administrar usando procedimientos estándar, por ejemplo, de forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intrarraquídea, intracisternal, intraperitoneal, oral, rectal, vaginal, intranasal o mediante administración en aerosol. La disolución acuosa preferiblemente es fisiológicamente aceptable, de forma que además de administrar el complejo deseado al mamífero, la disolución no afecta de forma adversa al equilibrio hidroelectrolítico y/o de la volemia del mamífero. El medio acuoso para el complejo puede comprender así solución salina fisiológica normal (0,9% de NaCl, 0,15 M), pH 7-7,4 u otras sales farmacéuticamente aceptables suyas.

Preferiblemente, el receptor debería ser vacunado tres veces a intervalos de dos semanas. Si es necesario, las respuestas se pueden reforzar en una fecha posterior mediante administración subsiguiente del complejo. Se contempla que la dosis óptima y el calendario de vacunación se pueden determinar empíricamente para cada complejo proteína de estrés-péptido usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Se pueden coadministrar también diversas citocinas, antibióticos y otros agentes bioactivos con los complejos proteína de estrés-péptido. Por ejemplo, diversas citocinas conocidas, es decir, interleucina-1\alpha (IL-1\alpha), interleucina-1\beta (IL-1\beta), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina 11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), interferón \alpha (IFN\alpha), interferón \beta (IFN\beta), interferón \gamma (IFN\gamma), factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), factor de necrosis tumoral \beta (TNF\beta), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) se pueden coadministrar con los complejos para llevar al máximo la respuesta fisiológica. Sin embargo, se anticipa que otras citocinas sin descubrir todavía pueden ser eficaces en la invención. Además, se pueden coadministrar antibióticos convencionales con el complejo proteína de estrés-péptido. La elección de los antibióticos adecuados dependerá, no obstante, de la enfermedad en cuestión.

Ejemplo I

En este ejemplo, se adquieren ratones C57BL/6 y C3H de aproximadamente 100 g de peso de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me. Después se inyectan células tumorales malignas de forma subcutánea en los ratones para inducir tumores experimentales en los ratones. Específicamente, se inyectan células malignas 6139 de carcinoma de células fusiformes subcutáneamente en ratones C3H, se inyectan células malignas de carcinoma de pulmón de Lewis de ratón subcutáneamente en ratones C57BL/6 y se inyectan células de melanoma maligno B16 de ratón subcutáneamente en ratones C57BL/6.

Cuando los tumores han crecido hasta un tamaño tal que son tanto visibles como palpables, se extirpa una muestra del tejido tumoral. Como control se extirpa tejido normal no maligno de algunos ratones que albergan los tumores experimentales.

Después, se aislan los complejos gp96-péptido, Hsp90-péptido y Hsp70-péptido tanto de los tejidos extirpados normales como de los derivados de tumor usando los métodos descritos anteriormente. Una vez aislados, los complejos se combinan con PBS y se administran de vuelta al ratón del que proceden los complejos. Normalmente se ensayan 6 ratones en cada experimento. Los experimentos se realizan usando el calendario mostrado a continuación:

Experimento	Composición administrada de vuelta al ratón
1	gp96-péptido
2	Hsp70-péptido
3	Hsp90-péptido
4	gp96-péptido y Hsp70-péptido
5	gp96-péptido y Hsp90-péptido
6	Hsp70-péptido y Hsp90-péptido
7	Hsp70-péptido, Hsp90-péptido y gp96-péptido
8	tampón sólo

En una serie de experimentos, los complejos se aislan a partir de células tumorales, mientras en una segunda serie los complejos se aislan de células normales. Se inocula a los ratones tres veces a intervalos semanales 20 microgramos (peso total) de el/los complejo(s) preseleccionado(s). Durante la terapia, se mide diariamente el tamaño de cada tumor. Después de 4 semanas se sacrifican los ratones, y se examina histológicamente el desarrollo del tumor. Además, en los ratones sacrificados se examina la presencia o ausencia de metástasis.

Se espera que los tumores de los ratones tratados con complejos procedentes de tejido normal continuarán creciendo y metastatizando. Por contraste, se espera que los tumores de los ratones tratados con los complejos procedentes de tejido tumoral exhiban un crecimiento más lento que los tumores de los animales de control, y en algunos casos, se espera que la masa tumoral pueda disminuir y que el tumor exhiba remisión durante la terapia.

Claims

1. Una composición que comprende complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido purificados de humano aislados de células tumorales humanas, en la que los péptidos están asociados de forma no covalente con las proteínas de estrés, para uso como un medicamento para tratar a un humano que tiene un tumor.

2. Una composición según la reivindicación 1, en la que los complejos están presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de un humano del que proceden dichas células tumorales.

4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que las proteínas de estrés de los complejos son miembros de la familia Hsp 60, la familia Hsp 70 o la familia Hsp 90.

5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los complejos son de tejido tumoral extirpado de dicho humano.

6. Una composición según la reivindicación 1, en la que el tumor a tratar ha metastatizado.

7. Una composición según la reivindicación 1, en la que el tumor a tratar es un melanocarcinoma, carcinoma hepatocelular, leucemia mielógena o carcinoma de células renales.

8. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que los complejos están presentes en una cantidad eficaz para tratar al humano.

9. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que tratar al humano comprende administrar la composición en una cantidad en el intervalo de 1 a 1000 microgramos de complejo por kg de peso corporal del humano por administración.

10. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que tratar al humano comprende administrar la composición en una cantidad en el intervalo de 100 a 250 microgramos de complejo por kg de peso corporal del humano por administración.

11. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para administración repetida.

12. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que además comprende una citocina.

13. Una composición según la reivindicación 12, en la que la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN\alpha, IFN\beta, IFN\gamma, TNF\alpha, TNF\beta, G-CSF, GM-CSF y TGF-\beta.

14. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para coadministración con citocina.

15. Una composición según la reivindicación 14, en la que la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IFN\alpha, IFN\beta, IFN\gamma, TNF\alpha, TNF\beta, G-CSF, GM-CSF y TGF-\beta.

16. El uso de una composición que comprende complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido purificados de humano aislados de células tumorales humanas, en el que los péptidos están asociados de forma no covalente
con las proteínas de estrés, en la fabricación de un medicamento para tratar a un humano que tiene un tu-
mor.

17. El uso según la reivindicación 16 para tratar a un humano del que proceden dichas células tumorales.

18. El uso de una composición que comprende complejos inmunógenos proteína de estrés-péptido purificados de mamífero aislados de células tumorales mamíferas, en el que los péptidos están asociados de forma no covalente con las proteínas de estrés, en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que tiene un tumor.

19. El uso según la reivindicación 18 para tratar a un mamífero del que proceden dichas células tumorales.

20. El uso según la reivindicación 16 ó 18, en el que las proteínas de estrés de los complejos son miembros de la familia Hsp 60, la familia Hsp 70 o la familia Hsp 90.

21. El uso según la reivindicación 18, en el que las células tumorales mamíferas proceden de una mascota doméstica.

22. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que los complejos son de tejido tumoral extirpado de dicho mamífero.

23. El uso según la reivindicación 16 ó 18, en el que el tumor a tratar ha metastatizado.

24. El uso según la reivindicación 16 ó 18, en el que el tumor a tratar es un melanocarcinoma, carcinoma hepatocelular, leucemia mielógena o carcinoma de células renales.

25. Una composición farmacéutica que comprende:

a): una cantidad terapéuticamente eficaz de complejos proteína de estrés-péptido purificados de humano aislados de tejido tumoral humano extirpado de un humano, en el que los péptidos están asociados de forma no covalente con las proteínas de estrés; y

b): un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición según la reivindicación 25, en la que las proteínas de estrés son gp96.

27. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de complejos proteína de estrés-péptido purificados de humano aislados de una célula tumoral humana, en la que los péptidos están asociados de forma no covalente con las proteínas de estrés, y las proteínas de estrés de los complejos son Hsp90.

28. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de complejos proteína de estrés-péptido purificados de humano aislados de una célula tumoral humana, en la que los péptidos están asociados de forma no covalente con las proteínas de estrés, y las proteínas de estrés de los complejos son Hsp70.

29. Una composición según la reivindicación 27, en la que los complejos Hsp90-péptido se purifican hasta homogeneidad aparente.

30. Una composición según la reivindicación 28, en la que los complejos Hsp70-péptido se purifican hasta homogeneidad aparente.

31. Una composición según la reivindicación 27, 28, 29 ó 30, en la que los complejos están presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la reivindicación 25, en la que las proteínas de estrés de los complejos son Hsp70.

33. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la reivindicación 25, en la que las proteínas de estrés de los complejos son Hsp90 o gp96.

34. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la reivindicación 25, en la que los complejos comprenden más de uno de los complejos Hsp70-péptido, complejos Hsp90-péptido y complejos gp96-péptido.

35. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que las proteínas de estrés de los complejos son Hsp70.

36. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que las proteínas de estrés de los complejos son Hsp90 ó gp96.

37. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que los complejos comprenden más de uno de los complejos Hsp70-péptido, complejos Hsp90-péptido y complejos gp96-péptido.

38. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o las reivindicaciones 25 a 32, que comprende además uno o más adyuvantes, agentes quimioterápicos o antibióticos.

39. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o las reivindicaciones 25 a 32, que además comprende saponina.

40. Una composición según la reivindicación 39, en la que la saponina es QS-21.