ES2261422T3

ES2261422T3 - Derivados de amida de acido 2-amino-3-hidroxi-4-terc-leucilamino-5-fenilpentanoico.

Info

Publication number: ES2261422T3
Application number: ES01943442T
Authority: ES
Inventors: Pascal Furet; Carlos Garcia-Echeverria; Patricia Imbach; Marc Lang; Johann Zimmermann
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: US20030166572A1; DE60119514D1; EP1290012A2; ATE325809T1; EP1290012B1; PT1290012E; AU2001266019A1; WO2001089282A3; GB0012795D0; US20060205673A1; DE60119514T2; WO2001089282A2; JP2003533541A; CA2405871A1

Abstract

Un compuesto de fórmula I en el que n es 0 ó 1; R1 y R2 son independientemente del otro un radical alifático o un radical aromático, aromático-alifático, cicloalifático, cicloalifático-alifático, heterocíclico o heterocíclico-alifático, no teniendo cada radical más de 20 átomos de carbono; R3 es hidrógeno, oxaalquilo, un radical alifático o un radical con hasta 20 átomos de carbono de la fórmula - (Y)m-R6, en la que Y es alquilo, m es 0 ó 1 y R6 es un radical monocíclico no substituido o substituido con 5 ó 6 miembros de anillo que contiene hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde dicho radical monocíclico también puede estar condensado a un anillo benzoico; R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno; un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo;N-alquilcarbamoílo; N, N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro; en donde los radicales que contienen carbono R4 y R5 tienen hasta 12 átomos de carbono; X es nitrógeno, oxígeno o azufre; y si uno de los radicales R4 o R5 es hidrógeno, el otro es como se define anteriormente para R4 y R5 con la excepción de hidrógeno, y si R4 es metoxi, R2 es como se define anteriormente con la excepción de bencilo monosubstituido en la posición 4 por halógeno, alquilo, alcoxi o hidroxialcoxi; o una sal del mismo.

Description

Derivados de amida de ácido 2-amino-3-hidroxi-4-terc-leucilamino-5-fenilpentanoico.

La invención se refiere a derivados de amida de ácido 2-amino-3-hidroxi-4-terc-leucilamino-5-fenilpentanoico, a procedimientos para la preparación de los mismos, a medicamentos que comprenden esos compuestos y al uso de los mismos en la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico de animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos.

La invención se refiere a compuestos de fórmula I

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en la que

n es 0 ó 1;

R_{1} y R_{2} son independientemente del otro un radical alifático o un radical aromático, aromático-alifático, cicloalifático, cicloalifático-alifático, heterocíclico o heterocíclico-alifático, no teniendo cada radical más de 20 átomos de carbono;

R_{3} es hidrógeno, oxaalquilo, un radical alifático o un radical con hasta 20 átomos de carbono de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6}, en la que Y es alquilo, m es 0 ó 1 y R^{6} es un radical monocíclico no substituido o substituido con 5 ó 6 miembros de anillo que contiene hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde dicho radical monocíclico también puede estar condensado a un anillo benzoico;

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno; un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo; N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro; en donde los radicales que contienen carbono R_{4} y R_{5} tienen hasta 12 átomos de carbono;

X es nitrógeno, oxígeno o azufre; y

si uno de los radicales R_{4} o R_{5} es hidrógeno, el otro es como se define anteriormente para R_{4} y R_{5} con la excepción de hidrógeno, y si R_{4} es metoxi, R_{2} es como se define anteriormente con la excepción de bencilo monosubstituido en la posición 4 por halógeno, alquilo, alcoxi o hidroxialcoxi;

o una sal de los mismos.

Dentro del contexto de la presente solicitud, los términos generales usados anteriormente y posteriormente aquí tienen preferiblemente los siguientes significados:

n es 0 ó 1, preferiblemente 0.

Un radical alifático tiene hasta 12 átomos de carbono, preferiblemente hasta 7 átomos de carbono, lo más preferiblemente hasta 4 átomos de carbono, y es tal radical hidrocarbonado alifático no substituido o substituido, es decir tal radical alquinilo, alquenilo o preferiblemente alquilo no substituido o substituido, seleccionándose preferiblemente de forma independiente uno o más substituyentes del grupo que consiste en hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; guanidino; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo; N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro.

Un radical alifático R_{1} es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente terc-butilo.

Un radical alifático R_{3} es preferiblemente alquilo inferior no substituido o alquilo inferior substituido por hidroxi, carboxi, amino, carbamoílo, guanidino, mercapto o alquiltio, lo más preferiblemente una cadena lateral de los aminoácidos alanina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina o arginina, especialmente valina.

Un radical alifático R_{4} es preferiblemente metoxi.

Un radical aromático R_{1} o R_{2} no tiene más de 20 átomos de carbono, especialmente no más de 12 átomos de carbono, y no está substituido o está substituido, preferiblemente en cada caso fenilo o naftilo, especialmente 1-naftilo, no substituido o substituido, seleccionándose preferiblemente de forma independiente uno o más substituyentes del grupo que consiste en un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo, N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro, seleccionándose más preferiblemente de alquilo, por ejemplo metilo, etilo o propilo; alcoxi, por ejemplo metoxi o etoxi; amino di-substituido, por ejemplo dimetilamino; halógeno, por ejemplo cloro o bromo; y halogenoalquilo, por ejemplo trifluorometilo.

En un radical aromático-alifático de R_{1} o R_{2} que no tiene más de 20 átomos de carbono, el resto aromático es como se define anteriormente y el resto alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C_{1}-C_{2}, que está substituido preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no está substituido. Un radical aromático-alifático R_{1} es preferiblemente bencilo o naftalen-1-ilmetilo. Un radical aromático-alifático R_{2} es preferiblemente bencilo substituido en el resto bencénico por 1-5, preferiblemente por 1-3, grupos metoxi; bencilo substituido en el resto bencénico, preferiblemente en la posición 4, por un grupo dimetilamino; o naftalen-1-ilmetilo. Lo más preferiblemente, un radical aromático-alifático R_{2} es 2,3,4- o 3,4,5-trimetoxibencilo.

Un radical cicloalifático R_{1} o R_{2} tiene hasta 20, especialmente hasta 10, átomos de carbono, es mono- o poli-cíclico y está substituido preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no está substituido, por ejemplo tal como un radical cicloalquilo, especialmente tal como un radical cicloalquilo de 5 ó 6 miembros, tal como preferiblemente ciclohexilo.

En un radical cicloalifático-alifático R_{1} o R_{2} que no tiene más de 20 átomos de carbono, el resto cicloalifático es como se define anteriormente y el resto alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C_{1}-C_{2}, que está substituido preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no está substituido, por ejemplo ciclohexilmetilo.

Un radical heterocíclico R_{1} o R_{2} contiene hasta 20 átomos de carbono, generalmente hasta 12 átomos de carbono, y está substituido preferiblemente como se define para el radical aromático o no está substituido y es preferiblemente un radical monocíclico saturado o insaturado que tiene 5 ó 6 miembros de anillo y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno o azufre, por ejemplo, tienilo o piridilo, o un radical bi- o tri-cíclico en el que, por ejemplo, un radical bencénico está condensado al radical monocíclico mencionado, especialmente, por ejemplo, indolilo, tal como 5-indolilo, o quinolilo, tal como 8-quinolilo.

En un radical heterocíclico-alifático R_{1} o R_{2} que no tiene más de 20 átomos de carbono, el resto heterocíclico es como se define anteriormente y el resto alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C_{1}-C_{2}, que está substituido preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no está substituido. Un radical heterocíclico-alifático R_{1} o R_{2} es, por ejemplo, indolilmetilo, especialmente 5-indolilmetilo, o quinolilmetilo, especialmente 8-quinolilmetilo.

El oxaalquilo R_{3} es un radical de la fórmula -G(-O-CH_{2}-CH_{2})_{t}-R_{7}, en el que G y R_{7} son alquilo, preferiblemente alquilo inferior, y t es de 1 a 3, preferiblemente 2, y es especialmente 2-(1,4-dioxahexil)etilo.

En un radical de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6} que tiene hasta 20 átomos de carbono, Y es alquilo, preferiblemente alquilo inferior, m es 0 ó 1 y el radical R^{6} es un radical monocíclico saturado o insaturado que tiene 5 ó 6 miembros de anillo y hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y que contiene alternativamente un anillo benzoico condensado, estando tal radical preferiblemente substituido según se define para el radical aromático o preferiblemente no estando substituido. Un radical R_{6} está unido preferiblemente a Y a través de un átomo de carbono de anillo y es, por ejemplo, un miembro no substituido o substituido seleccionado del grupo que consiste en ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentadienilo, fenilo, pirrolidilo, pirazolidilo, imidazolidilo, tetrahidrofurilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, furilo, tienilo, piridilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, indenilo, naftilo, indolilo y quinolilo. Lo más preferiblemente, un radical de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6} es piperidilo, especialmente 4-piperidilo, piperazinetilo, especialmente piperazin-1-iletilo, morfoliniletilo, especialmente morfolin-4-iletilo, piridilmetilo, tal como 2-, 3- ó 4-piridilmetilo, o una cadena lateral de los aminoácidos fenilalanina, tirosina, triptófano o histidina.

X es preferiblemente oxígeno (-O-).

El alquilo es preferiblemente alquilo inferior.

El sufijo "inferior" indica un radical que tiene hasta e incluyendo 7, preferiblemente hasta e incluyendo 4, átomos de carbono.

El alquilo inferior es, por ejemplo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo o n-heptilo, preferiblemente isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopropilo, etilo o metilo, lo más preferiblemente isobutilo, etilo o metilo.

El hidroxi eterificado es, por ejemplo, alcoxi, especialmente alcoxi inferior, tal como etoxi o metoxi. El hidroxi esterificado es preferiblemente hidroxi esterificado por un ácido carboxílico orgánico, tal como ácido alcanoico, o un ácido mineral, tal como un ácido halohídrico, por ejemplo alcanoiloxi inferior, o especialmente halógeno, tal como yodo o especialmente flúor, cloro o bromo.

El carboxi esterificado es, por ejemplo, alcoxicarbonilo, especialmente alcoxi(inferior)-carbonilo, tal como, por ejemplo, metoxicarbonilo.

El alcanoílo es, por ejemplo, alquilcarbonilo, especialmente alquil(inferior)-carbonilo, tal como, por ejemplo, acetilo.

El amino mono- o di-substituido es, por ejemplo, N-alquilamino o N,N-dialquilamino, especialmente N-alquil(inferior)-amino o N,N-di-alquil(inferior)-amino, tal como, por ejemplo N-metilamino o N,N-dimetilamino.

El halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor, cloro o bromo.

La estructura de fórmula I que se muestra anteriormente indica la configuración absoluta.

Grupos formadores de sales en un compuesto de fórmula I son grupos o radicales que tienen propiedades básicas o ácidas. Los compuestos que tienen al menos un grupo básico o al menos un radical básico, por ejemplo un grupo amino libre, un radical pirazinilo o un radical piridilo, pueden formar sales de adición de ácidos, por ejemplo con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o un ácido fosfórico, o con ácidos carboxílicos o sulfónicos orgánicos adecuados, por ejemplo ácidos mono- o di-carboxílicos alifáticos, tales como ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico o ácido oxálico, o aminoácidos tales como arginina o lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tales como ácido benzoico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácidos carboxílicos aromáticos-alifáticos, tales como ácido mandélico o ácido cinámico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, tales como ácido nicotínico o ácido isonicotínico, ácidos sulfónicos alifáticos, tales como ácido metano-, etano- o 2-hidroxietano-sulfónico, o ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo ácido benceno-, p-tolueno- o naftaleno-2-sulfónico. Cuando están presentes varios grupos básicos, pueden formarse sales de adición de mono- o poli-ácidos.

Los compuestos de fórmula I que tienen grupos ácidos, por ejemplo un grupo carboxi libre en el radical R_{10}, pueden formar sales metálicas o amónicas, tales como sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, por ejemplo sales sódicas, potásicas, magnésicas o cálcicas, o sales amónicas con amoníaco o aminas orgánicas adecuadas, tales como monoaminas terciarias, por ejemplo trietilamina o tri-(2-hidroxietil)-amina, o bases heterocíclicas, por ejemplo N-etilpiperidina o N,N-dimetilpiperazina.

Los compuestos de fórmula I que tienen grupos tanto ácidos como básicos pueden formar sales internas.

Con propósitos de aislamiento o purificación, así como en el caso de compuestos que se usan adicionalmente como productos intermedios, también es posible usar sales farmacéuticamente inaceptables. Sin embargo, solo las sales atóxicas farmacéuticamente aceptables se usan con propósitos terapéuticos y por lo tanto estas sales se prefieren.

Debido a la estrecha relación entre los nuevos compuestos en forma libre y en forma de sus sales, incluyendo las sales que pueden usarse como productos intermedios, por ejemplo en la purificación de los nuevos compuestos o para la identificación de los mismos, debe entenderse anteriormente y posteriormente aquí que cualquier referencia a los compuestos libres incluye las sales correspondientes, cuando sea apropiado y oportuno.

Los compuestos de fórmula I tienen propiedades farmacológicas valiosas y pueden usarse, por ejemplo, como fármacos para tratar enfermedades proliferativas.

Los compuestos de fórmula I inhiben la actividad del proteasoma. Se sabe que las proteínas elegidas para la degradación por el complejo proteasómico multicatalítico tienen, entre otras cosas, funciones en el control del ciclo celular (por ejemplo, ciclinas, p21, p27) y la apoptosis (por ejemplo, p53) (Rolfe, M., Chiu, I. M. y Pagano, M., The ubiquitin-mediated proteolytic pathway as therapeutic area. J. Mol. Med. 75, 1997, 5-17). Los inhibidores del proteasoma son por lo tanto adecuados para el tratamiento de enfermedades proliferativas que responden a la inhibición de la actividad del proteasoma. Pueden mencionarse enfermedades proliferativas como la psoriasis y los tumores, en particular tumores sólidos como tumor de colon, tumor de mama, tumor de pulmón y tumor de próstata.

WO 00/64863 describe el uso de derivados de ácidos 2,4-diamino-3-hidroxicarboxílico estructuralmente relacionados como inhibidores del proteasoma que pueden usarse en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de animales que sufren enfermedades proliferativas.

Lum RT y otros 81998) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8: 209-214 describe inhibidores del proteasoma 20S estructuralmente diferentes que contienen un grupo de cabeza indanona acoplado a di- y tri-péptidos.

Kungl AJ y otros (1998) Biochemistry 37:2778-2786 describe compuestos estructuralmente relacionados que son útiles en el tratamiento de la infección por HIV.

Inhibición de Proteasoma 20S

El complejo proteasómico multicatalítico es responsable de la proteolisis dependiente de ATP de la mayoría de las proteínas celulares. Aunque el proteasoma 20S contiene el núcleo proteolítico, no puede degradar proteínas in vivo a no ser que se compleje con protecciones de 19S, en cualquier extremo de su estructura, que contiene de por sí múltiples actividades de ATPasa. La mayor estructura se conoce como el proteasoma 26S y rápidamente degradará proteínas que se han elegido para la degradación mediante la adición de múltiples moléculas del polipéptido ubiquitina de 8,5 kDa. Según se menciona anteriormente, las proteínas elegidas para la degradación proteasómica tienen funciones en el ciclo celular. Los compuestos de fórmula I son por lo tanto altamente adecuados para el tratamiento de enfermedades que responden a la inhibición de la actividad del proteasoma 20S, que es el caso para las enfermedades proliferativas mencionadas anteriormente.

La inhibición de la actividad similar a quimotripsina del proteasoma 20S puede demostrarse mediante el siguiente experimento. Se basa en la hidrólisis del péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC (Succinil-leucina-leucina-valina-tirosina-7-amino-4-metil-cumarina), que es segmentado exclusivamente en el enlace Y-AMC por el proteasoma 20S. La hidrólisis de este péptido se efectúa mediante un incremento en la intensidad de fluorescencia (\lambda_{ex} (longitud de onda de excitación): 355 nm; \lambda_{em} (longitud de onda de emisión): 460 nm) debido a la liberación de la fluorescencia de 2-aminobenzoílo internamente extinguida que acompaña a la difusión separada del producto de hidrólisis
Suc-LLVY.

Se preincuban 2 \mul de una solución 1 mM de un compuesto de prueba en DMSO (dimetilsulfóxido, concentración final 20 \muM en el pocillo) durante 60 minutos a temperatura ambiente en placas de microvaloración negras de 96 pocillos junto con una mezcla de 1 \mul de proteasoma 20S de placenta humana purificado. (Diabetes Forschungsinstitut, Düsseldorf, Alemania; aproximadamente 100 ng de proteasoma, dependiendo de la preparación de proteasoma) y 47 \mul de tampón-Ca [CaCl_{2} 5 mM, Tris/HCl (hidrocloruro de tris-(hidroximetil)aminometano) 20 mM, pH 8,0)]. Se mezclan y se añaden 3 \mul de una solución 2,67 mM de Suc-LLVY-AMC (Bachem, Suiza) en DMSO (concentración final en el pocillo 80 \muM) y 47 \mul de tampón-Ca. La mezcla resultante se incuba durante 3-24 h a 37ºC. Si se desea, la proteolisis del substrato puede detenerse mediante la adición de 50 \mul de solución de parada (ácido monocloroacético 100 mM, NaOH 130 mM, ácido acético 100 mM, pH = 4,3). La fluorescencia se controla con un lector de placas de microvaloración FLUOROSKAN ASCENT™.

Para cada serie de medidas se han llevado a cabo dos experimentos de control:

1.): valor 0%: se usan 2 \mul de DMSO en el ensayo descrito anteriormente en lugar de 2 \mul de una solución 1 mM de un compuesto de prueba en DMSO y 48 \mul de tampón-Ca en lugar de una mezcla de 47 \mul de tampón-Ca y 1 \mul de proteasoma purificado.

2.): valor 100%; en el ensayo descrito anteriormente se usan 2 \mul de DMSO en lugar de 2 \mul de una solución 1 mM del compuesto de prueba en DMSO.

Cálculo

% de \ actividad \ restante = \frac{(valor \ con \ compuesto - valor \ 0%)}{(valor \ 100% - valor \ 0%)} \cdot 100%

El valor IC_{50} se define como la concentración de un compuesto a la que la actividad restante es 50%. Los compuestos de fórmula I exhiben un valor de IC_{50} para la inhibición de la actividad similar a quimotripsina del proteasoma 20S en el intervalo de entre 1 nM y 1 \muM, especialmente entre 2 nM y 200 nM.

La actividad antiproliferativa de los compuestos de fórmula I puede demostrarse in vitro contra, por ejemplo, la línea celular de carcinoma de mama humano MDA-MB435 (HTB-129) obtenida de the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, EE.UU. de A.). Habitualmente, se usa el ensayo de proliferación "CellTiter96™" (Promega, Madison MI) siguiendo el procedimiento recomendado por el suministrador. Este ensayo se realiza en placas de 96 pocillos preparadas para cultivo tisular. Las células se siembran en una densidad de 2,5 x 10^{4} por pocillo en 50 \mul de MEM [medio esencial mínimo] completo (Gibco-Life Technologies) complementado con 10% de suero de ternero fetal, 100 U/ml de PenStrep, piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 4 mM, HEPES 20 mM y aminoácidos no esenciales. Las células se incuban durante 24 horas a 37ºC en atmósfera humidificada equilibrada con CO_{2} al 5%. Los compuestos de prueba se añaden al sobrenadante celular como diluciones en serie en 50 \mul de MEM completo por pocillo. Las células se incuban durante al menos 48 horas a 37ºC en atmósfera humidificada equilibrada con CO_{2} al 5%. El colorante de tetrazolio se añade al sobrenadante celular en un volumen de 15 \mul por pocillo y los cultivos celulares se incuban durante 4 horas. Posteriormente, la reacción se detiene mediante la adición de 100 \mul de solución de parada por pocillo y las placas se incuban durante una hora adicional. La conversión del colorante de tetrazolio mediante células metabólicamente activas da formazano soluble. La absorbancia del sobrenadante celular de color azul es proporcional a la cantidad de células viables. La absorbancia se controla a la longitud de onda de 550 y 630 mm usando un lector de placas de microvaloración (Dynatech MR5000). Se preparan diluciones en serie de compuesto diluyendo en primer lugar la solución de reserva de compuesto 10 mM (en DMSO) hasta una solución de prueba 60 \muM en MEM completo seguido por nueve diluciones 1:3 sucesivas en MEM completo. Los pocillos que contienen MEM completo sirven como control negativo, fondo (0%). Los pocillos que contienen células y MEM/DMSO al 0,6% sirven como control positivo (100%).

El cálculo del % de actividad restante se realiza como se describe anteriormente con respecto a la inhibición de la actividad similar a quimotripsina del proteasoma 20S. El valor de IC_{50} se define como la concentración de un compuesto a la que la actividad restante es 50%.

Los compuestos de fórmula I exhiben un valor de IC_{50} para la actividad antiproliferativa en el intervalo de entre 20 nM y 2 \muM, especialmente entre 50 nM y 1 \muM.

La acción antitumoral de los compuestos de fórmula I también puede demostrarse in vivo.

Evaluación in vivo de la acción antitumoral en ratones desnudos usando xenoinjertos de tumor humano

Ratones BALB/c nu/nu hembra o macho (Novartis animal farm, Sisseln, Suiza o Bomholtgaard, Copenhague, Dinamarca) con tumores humanos trasplantados subcutáneamente se usan para la evaluación de la acción antitumoral de los compuestos de fórmula I contra líneas celulares que se originan a partir de los cuatro tipos de tumores, tumor de mama: MCF-7; tumor de pulmón: NCI H596; tumor de colon: HCT 116 y tumor de próstata: PC 3.

Materiales

Carcinoma de colon humano HCT 116 (ATCC CCL 247), carcinoma pulmonar de células escamosas humano NCI H596 (ATCC HTB 178), carcinoma de mama dependiente de estrógenos MCF-7 (ATCC HTB 22) y la línea celular de cáncer de próstata humano PC3 se obtienen de the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, EE.UU. de A.). Las células se cultivan a 37ºC en una atmósfera de 5% p/p de CO_{2} y 80% de humedad relativa en los siguientes medios: NCI H 596: RPMI 1640, FBS (suero bovino fetal) al 20% v/v, glutamina al 1% p/v; HCT-116: 5A de McCoy, FBS al 10% v/v, glutamina al 1% p/v; PC 3: RPMI 1640; FBS al 20% v/v, glutamina al 1% p/v; MCF-7, RMPI 1640, FBS al 20% v/v, glutamina al 1% p/v. Todas estas líneas celulares son adherentes y pueden liberarse enjuagando con sal equilibrada de Hank y tratamiento con tripsina al 0,25% p/v. Todas estas células se preparan como reservas principales de células (en medios de cultivo complementados para contener FBS al 20% v/v y DSMO al 7% v/v) y se almacenan a -125ºC (vapores de nitrógeno líquido). Las reservas de células de trabajo se preparan a partir de las reservas principales descongelando y expandiendo las células a lo largo de tres pasajes, que se distribuyen a continuación a viales y se congelan. La viabilidad (prueba de exclusión con azul de tripano usando azul de tripano al 0,5% p/v) antes de la congelación es > 90% para todas las líneas celulares).

Establecimiento de tumores sólidos en ratones desnudos

Los ratones se mantienen bajo condiciones controladas (Condiciones Higiénicas Óptimas, [OHC]) con acceso libre a alimento y agua estériles. Los tumores se establecen después de la inyección subcutánea de células (un mínimo de 2 x 10^{6} células en 100 \mul de PBS (solución salina tamponada con fosfato o medio) en ratones portadores (4-8 ratones por línea celular). Las inyecciones se realizan s.c. en el flanco izquierdo del ratón a medio camino entre la cola y la cabeza. Los tumores resultantes se hacen pasar en serie durante un mínimo de tres trasplantes consecutivos antes del inicio del tratamiento. Los tumores se trasplantan cuando el tumor alcanza un volumen de 800 a 1000 mm^{3}.

Trasplante de tumores sólidos en ratones desnudos

Ratones donantes son anestesiados (Forene®, Abbott, Suiza) y sacrificados mediante dislocación cervical. La piel se desinfecta y el tumor se retira mediante disección. Los bordes externos de la masa del tumor se retiran usando un escalpelo y la masa resultante se corta en trozos de aproximadamente 3-4 mm de altura. Se cortan secciones de 3-4 mm^{2} y se ponen en NaCl estéril al 0,9% p/v. Las secciones de tumor que son necróticas no se usan.

Se implantan fragmentos tumorales s.c. en el flanco izquierdo de los ratones receptores. Los ratones receptores son anestesiados (Forene®, Abbott, Suiza) y la piel de todo el lomo y los costados de los ratones se desinfecta. La piel de 0,5 a 1 cm por encima de la cola se eleva y se realiza una sola incisión de 1 a 1,5 cm. Las secciones de tumor se introducen en una aguja de trocar de calibre 13. La aguja de trocar se introduce en la abertura de la piel y se hace avanzar bajo la piel hasta un punto a medio camino entre la cabeza y la cola. El fragmento de tumor se deposita haciendo avanzar el trocar. La herida se sutura usando una o dos grapas metálicas.

En el caso de tumores de mama dependientes de estrógenos, nódulos de estrógeno (17b-estradiol, 5 mg/nódulo, que da una liberación sostenida a lo largo de 60 días, se obtiene de Innovative Research of America, Sarasota, EE.UU. de A.), se colocan subcutáneamente en el otro flanco.

Se deja que los tumores se incrementen hasta que el tamaño es de 100 a 150 mm^{3} antes de que se comience el tratamiento. Los tumores se miden a continuación y se ponen en grupos (normalmente n = 6 a 8) que se equilibran de acuerdo con el tamaño medio y el intervalo de volúmenes de tumor. Los grupos se asignan aleatoriamente a grupos de tratamiento.

Preparación y aplicación de compuestos de prueba

Soluciones de reserva de 40 mg/ml de compuesto se disuelven en DMSO al 100% y se agitan a temperatura ambiente hasta que se obtienen soluciones transparentes. Antes de cada administración, se añade Tween® 80 (Fluka, Buchs, Suiza; monoestearato de polioxietilensorbitán) al 10% a la solución de reserva y a continuación se diluye 1:20 (v/v) con NaCl al 0,9% p/v o agua estériles. Las soluciones y diluciones se preparan diariamente antes de la aplicación. Las aplicaciones se dan 7 días a la semana (p.o., i.p., s.c. o i.v.). Los volúmenes de aplicación son: p.o. 25 ml/kg; i.p. 25 ml/kg; s.c. 10 ml/kg; i.v. 10 ml/kg.

Medida de los volúmenes de los tumores

El crecimiento tumoral se verifica una vez, dos veces o tres veces a la semana (dependiendo de la velocidad de crecimiento de la línea tumoral) y 24 horas después del último tratamiento midiendo diámetros perpendiculares. Se usan calibres capaces de determinar distancias de mm. Los volúmenes de los tumores se calculan de acuerdo con la fórmula L x D^{2} x \pi/6 (L: longitud; D: diámetro). La actividad antitumoral se expresa como % de T/C (incremento medio de volúmenes de tumores de animales tratados dividido por el incremento medio de volúmenes de tumores de animales de control multiplicado por 100). La regresión del tumor (%) representa el menor volumen medio del tumor en comparación con el volumen medio del tumor al inicio del tratamiento. Delta (\Delta) volúmenes de tumores comparaba el cambio en el volumen del tumor a lo largo de la duración del experimento (volumen el último día del tratamiento menos volumen el primer día de tratamiento). Cualesquiera animales en los que el tumor alcance un tamaño que supere aproximadamente de 1500 a 2000 mm^{3} se sacrifican.

Medidas adicionales

También se recogen pesos corporales y datos de supervivencia. Delta (\Delta) pesos corporales se calcula como una indicación de la capacidad de tolerancia al tratamiento (peso el último día de tratamiento - peso el primer día de tratamiento). La pérdida de peso corporal estadísticamente significativa o las mortalidades se consideran indicadores de una escasa capacidad de tolerancia al tratamiento. Adicionalmente, los ratones se controlan una vez o dos veces al día con respecto a la salud general.

Análisis estadístico

El enfoque básico para los análisis estadísticos es usar pruebas para comparaciones múltiples para juzgar la significación estadística de las diferencias entre grupos de tratamiento y las diferencias dentro de un grupo para determinar si el tratamiento inducía regresiones estables de una enfermedad o un tumor. Como los volúmenes de tumores subcutáneos no siempre están distribuidos normalmente, se determinan las diferencias en los volúmenes de tumores subcutáneos entre grupos de tratamiento usando la prueba ANOVA unidireccional de Kruskat-Wallis no paramétrica sobre datos ordenados por rangos y la significación estadística de las diferencias entre grupos de tratamiento en comparación con grupos de control se determinan usando la prueba de Dunnett. Las comparaciones por pares entre todos los grupos se realizan usando el método de Student-Newman-Keuls (SNK). Si solo se comparan dos grupos, se usa la prueba de suma de rangos. Los pesos corporales de los animales están distribuidos normalmente y los cambios en los pesos corporales dentro de un grupo se analizan mediante pruebas t apareadas y entre diferencias de grupos se analizan mediante un ANOVA unidireccional y comparaciones por pares realizadas usando la prueba de Tukey. Para todas las pruebas el nivel de significación se fija en p < 0,05.

Otra prueba in vivo para determinar la acción antitumoral de los compuestos de fórmula I es el siguiente ensayo en fibras huecas:

Ensayo en Fibras Huecas: evaluación de la acción antitumoral en ratones desnudos

En este ensayo, cuatro tumores humanos diferentes encapsulados en fibras huecas se implantan subcutáneamente y/o intraperitonealmente en ratones desnudos (ratones desnudos hembra exógamos atímicos (Ncr nu/nu)). Los animales se tratan a continuación con un compuesto de prueba formulado en un vehículo apropiado, mientras que los animales de control se tratan con el vehículo solo. Al final del experimento, las fibras se recuperan y el número de células viables se mide usando un ensayo metabólico [MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]. La actividad del compuesto de prueba se mide comparando el crecimiento de células en los animales experimentales (T) con el crecimiento de células en los animales de control tratados con el vehículo solo (C) y se expresa como % de T/C.

Materiales

Carcinomas de colon humanos SW 620 y LS 174T y carcinoma de mama MDA-MB-435S se obtienen de the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, EE.UU. de A.). El carcinoma de colon MIP 101, que expresa altos niveles de pgp-1, se estableció originalmente a partir de un paciente del Dana Farber Cancer Institute, Boston, EE.UU. de A. Todas las líneas celulares se hacen crecer de acuerdo con técnicas de cultivo tisular estándar en RPMI 1640 que contiene los siguientes aditivos: 5% de FBS (suero bovino fetal), 5 mg/ml de insulina, 5 mg/ml de transferrina, 5 ng/ml de ácido selenioso, ß-estradiol 1 nM, testosterona 1 nM.

Diseño del ensayo

Las líneas celulares de tumores sólidos humanos se encapsulan en fibras huecas de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) que son permeables a moléculas < 500.000 daltons y que tienen un diámetro interno de 1 mm (Biopore, Spectrum Medical, CA, EE.UU. de A.). Después de la incubación y antes de la implantación en los animales, se deja que las células se unan a la superficie interna de la fibra mediante incubación en el medio de cultivo tisular durante 24 horas. Cuatro fibras huecas se implantan a continuación en un animal intraperitonealmente o subcutáneamente. En el montaje experimental se usan de cuatro a seis animales por grupo y el experimento consiste en un mínimo de tres grupos:

1. Grupo "tiempo 0"

2. Grupo de control (placebo)

3. Grupo "tratado" (compuesto probado)

El tratamiento comienza 24 horas después de la implantación de las fibras. Los animales se tratan una vez al día, los días 1, 3 y 5. En el mismo momento en el que comienza el tratamiento, los animales del grupo "Tiempo 0" se sacrifican, las fibras se recuperan y se determina el número de células viables al comienzo del experimento (T_{0}). El día 7 después de la implantación todos los animales son sacrificados, las fibras se recuperan y se determina el número de células viables para el Control (C_{v}) y para los grupos "Tratados" (T_{v}). Se calcula a continuación % de T/C de acuerdo con la fórmula:

% T/C = (T_{v} - T_{0})/(C_{v} - T_{0}) \ x \ 100%

Encapsulación de células tumorales en fibras huecas

Las fibras se cortan a la longitud deseada y se sumergen durante al menos 72 h en etanol al 70%. Posteriormente, las fibras y los instrumentos para la encapsulación se esterilizan. La línea celular de tumor sólido humano desarrollada en cultivo tisular se tripsiniza, se suspende en una pequeña cantidad de medio de cultivo tisular y se transfiere a las fibras usando una jeringa. Las fibras se termosellan y se incuban a 37ºC durante 24 h en una atmósfera que comprende CO_{2} al 5%. Las fibras se implantan a continuación subcutánemente y/o intraperitonealmente en los ratones desnudos.

Determinación de células viables en fibras huecas

Se añade 1 g de MTT a 200 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato), se agita durante 20 minutos y se filtra (filtro de 0,22 micras). Se mezclan 10 ml de esta solución con 40 ml de RMPI 1640 con aditivos para dar la solución de trabajo de MTT. Las fibras recuperadas se incuban en 5 ml de RPMI 1640 durante 30 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5% para la estabilización. Se añaden 0,5 ml de solución de trabajo de MTT a cada pocillo de la placa de muestras. Las placas se incuban a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 4 h. El MTT se aspira de cada pocillo de la placa de muestras. Se añaden 2 ml de solución acuosa de sulfato de protamina al 2,5% a cada pocillo de la placa de muestras. Las placas se incuban a 4ºC durante 24 h. El sulfato de protamina se aspira de cada pocillo de la placa de muestras. Se añaden 2 ml de sulfato de protamina a cada pocillo y las placas se incuban a 4ºC durante 2-4 h más. Cada fibra se transfiere a un pocillo en una placa de 24 pocillos. Las fibras se acortan dejándolas que descansen sobre el fondo de los pocillos y se secan durante la noche. Se añaden 250 \mul de DMSO a cada pocillo. Las placas se ponen en una batidora orbital durante 4 h con una cubierta para proteger el MTT de la luz. Se transfieren 150 \mul de cada muestra al pocillo apropiado en una placa de 96 pocillos. Las placas se leen a 540 nm usando DMSO como el pocillo del blanco.

La biodisponibilidad después de la administración oral de compuestos de fórmula I puede mostrarse, por ejemplo, en la siguiente prueba:

Para la administración por vía oral, se prepara una solución de la substancia de prueba (25 mg/ml) en un disolvente adecuado tal como Cremophor RH40®/Maisine®/propilenglicol/etanol (38/32/15/15). Ratones Balb/c hembra se mantienen en ayunas durante 24 horas antes del inicio y a lo largo del experimento se da agua a voluntad. En diversos momentos después de la administración del fármaco, se obtienen muestras de sangre sacrificando los animales bajo anestesia cortando la vena yugular, seguido por dislocación cervical. Las muestras se recogen en tubos heparinizados (típicamente 0,4-0,6 ml). Para el análisis de muestras se usan extracción en fase sólida y HPLC. La concentración de fármaco en las muestras se calcula mediante análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados de la relación de las áreas de los picos (inhibidor/patrón interno) de patrones de sangre fortificada ("spiked") frente a la concentración. A partir de los datos de concentración frente al tiempo, se calcula el valor del "Área Bajo la Curva" (AUC) mediante la regla trapezoidal.

Se da preferencia a compuestos de fórmula I, en los que

n es 0 ó 1;

R_{1} no tiene más de 20 átomos de carbono y es un miembro seleccionado del grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{7}, cicloalquil-alquilo(C_{1}-C_{7}), fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}), naftil-alquilo(C_{1}-C_{7}) y quinolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), no estando los miembros substituidos o estando substituidos por uno o más radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{7}, alcanoiloxi C_{1}-C_{7}, halógeno, carboxi, alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo, formilo, alcanoílo C_{1}-C_{7}, amino, N-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, mercapto, sulfo, alquil(C_{1}-C_{7})-tio, carbamoílo, N-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, ciano, nitro y alquilo C_{1}-C_{7} que puede estar substituido él mismo por dichos radicales;

R_{2} no tiene más de 20 átomos de carbono y es un miembro seleccionado del grupo que consiste en fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}), naftil-alquilo(C_{1}-C_{7}), quinolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), indolil-alquilo(C_{1}-C_{7}) y N-alquil(C_{1}-C_{7})-indolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), no estando los miembros substituidos o estando substituidos por uno o más radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{7}, alcanoiloxi C_{1}-C_{7}, halógeno, carboxi, alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo, formilo, alcanoílo C_{1}-C_{7}, amino, N-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, mercapto, sulfo, alquil(C_{1}-C_{7})-tio, carbamoílo, N-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, ciano, nitro y alquilo C_{1}-C_{7} que puede estar substituido él mismo por dichos radicales;

R_{3} es hidrógeno, un radical de la fórmula -G(-O-CH_{2}-CH_{2})_{t}-R_{7}, en el que G y R_{7} son alquilo C_{1}-C_{7} y t es de 1 a 3, alquilo C_{1}-C_{7} no substituido o alquilo C_{1}-C_{7} substituido por hidroxi, carboxi, amino, carbamoílo, guanidino, mercapto o alquil(C_{1}-C_{7})-tio y que no tiene más de 12 átomos de carbono, o un radical de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6}, en la que Y es alquilo C_{1}-C_{7}, m es 0 ó 1 y R_{6} es fenilo, hidroxifenilo, imidazolilo, indolilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo o piridilo;

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{7}, alcanoiloxi C_{1}-C_{7}, halógeno, carboxi, alcoxi(C_{1}-C_{7})-carbonilo, formilo, alcanoílo C_{1}-C_{7}, amino, N-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-amino, mercapto, sulfo, alquil(C_{1}-C_{7})-tio, carbamoílo, N-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-carbamoílo, ciano, nitro y alquilo C_{1}-C_{7} que puede estar substituido él mismo por dichos radicales, en donde los radicales que contiene carbono R_{4} y R_{5} tienen hasta 12 átomos de carbono; y

X es nitrógeno, oxígeno o azufre; y

si uno de los radicales R_{4} y R_{5} es hidrógeno, el otro es como se define anteriormente para R_{4} y R_{5} con la excepción de hidrógeno, y si R_{4} es metoxi, R_{2} es como se define anteriormente con la excepción de bencilo monosubstituido en la posición 4 por halógeno, alquilo, alcoxi o hidroxialcoxi;

o una sal de los mismos.

Se preferencia especialmente a compuestos de fórmula I, en los que

n es 0 ó 1;

R_{1} no tiene más de 20 átomos de carbono y es un miembro seleccionado del grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{7}, cicloalquil-alquilo(C_{1}-C_{7}), fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}), naftil-alquilo(C_{1}-C_{7}) y quinolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), no estando substituidos o estando substituidos los miembros por uno o más radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo; N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro;

R_{2} no tiene más de 20 átomos de carbono y es un miembro seleccionado del grupo que consiste en fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}), naftil-alquilo(C_{1}-C_{7}), quinolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), indolil-alquilo(C_{1}-C_{7}) y N-alquil(C_{1}-C_{7})-indolil-alquilo(C_{1}-C_{7}), no estando substituidos o estando substituidos los miembros por uno o más radicales seleccionados independientemente del grupo que consiste en un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo; N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro;

R_{3} es hidrógeno, oxaalquilo, un radical alifático o un radical con hasta 20 átomos de carbono de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6}, en la que Y es alquilo, m es 0 ó 1 y R_{6} es un radical monocíclico no substituido o substituido con 5 ó 6 miembros de anillo que contiene hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde dicho radical monocíclico también puede estar condensado en un anillo benzoico;

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno; un radical alifático; hidroxi libre, eterificado o esterificado; carboxi libre o esterificado; formilo; alcanoílo; amino no substituido, mono- o di-substituido; mercapto; sulfo; alquiltio; carbamoílo; N-alquilcarbamoílo; N,N-dialquilcarbamoílo; ciano y nitro; en donde los radicales que contienen carbonos R_{4} y R_{5} tienen hasta 12 átomos de carbono; y

X es oxígeno; y

o una sal de los mismos.

Se da especial preferencia a compuestos de fórmula I, en los que

n es 0 ó 1;

X es oxígeno; y

o una sal de los mismos.

Se da especial preferencia a compuestos de fórmula I, en los que

n es 0;

R_{3} es hidrógeno, oxaalquilo, un radical alifático o un radical con hasta 20 átomos de carbono de la fórmula -(Y)_{m}-R_{6}, en la que Y es alquilo, m es 0 ó 1 y R_{6} es un radical monocíclico no substituido o substituido con 5 ó 6 miembros de anillo que contiene hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde dicho radical monocíclico también puede estar condensado a un anillo benzoico; y

o una sal de los mismos.

Se da preferencia por encima de todo a compuestos de fórmula I, en los que

n es 0 ó 1;

R_{1} es alquilo C_{1}-C_{7}, fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}) o naftil-alquilo(C_{1}-C_{7});

R_{2} es mono-, di- o tri-alcoxi(C_{1}-C_{7})-fenil-alquilo(C_{1}-C_{7}), N,N-di-alquil(C_{1}-C_{7})-aminofenil-alquilo(C_{1}-C_{7}) o naftil-alquilo(C_{1}-C_{7});

R_{3} es alquilo C_{1}-C_{7};

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C_{1}-C_{7} o halógeno; y

X es oxígeno; y

o una sal de los mismos.

Los más especialmente preferidos son los compuestos de fórmula I descritos en los Ejemplos y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los compuestos de fórmula I o las sales de los mismos se preparan de acuerdo con procedimientos conocidos de por sí. Los procedimientos de acuerdo con la invención son como sigue:

a) un compuesto de fórmula II

2

en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula II, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o una sal de tal compuesto, se hace reaccionar con un ácido de fórmula III

3

en la que n, R_{1} y X son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula III, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o un derivado de ácido reactivo adecuado de tal compuesto, y cualesquiera grupos protectores presentes se retiran, o

b) un compuesto de fórmula IV

4

en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula IV, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o una sal de tal compuesto, se hace reaccionar con un ácido de fórmula V

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5

en la que n, R_{1} y X son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula V, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o un derivado de ácido reactivo adecuado de tal compuesto, y cualesquiera grupos protectores presentes se retiran,

y, si se desea, un compuesto de fórmula I obtenido mediante el procedimiento a) o b) se convierte en otro compuesto de fórmula I, un compuesto libre de fórmula I obtenido se convierte en una sal o una sal de un compuesto de fórmula I obtenida se convierte en otra sal o en su forma libre.

Notas Generales

Los productos finales de fórmula I pueden contener substituyentes que también pueden usarse como grupos protectores en materiales de partida para la preparación de otros productos finales de fórmula I. Así, dentro del alcance de este texto, solo un grupo fácilmente retirable que no sea un constituyente del producto final deseado particular de fórmula I se denomina un "grupo protector", a no ser que el contexto indique otra cosa.

Los grupos protectores, y la manera en la que se introducen y se retiran, se describen, por ejemplo, en "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres, Nueva York 1973, y en "Methoden der organischen Chemie", Houben Weyl, 4ª edición, Vol. 15/l, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974 y en Theodora W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Nueva York 1981. Una característica de los grupos protectores es que pueden retirarse fácilmente, es decir, sin la presencia de reacciones secundarias no deseadas, por ejemplo mediante solvolisis, reducción, fotolisis o alternativamente bajo condiciones fisiológicas.

Procedimiento a)

La reacción se lleva a cabo disolviendo un compuesto de fórmula III en un disolvente adecuado, por ejemplo N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida o N-metil-2-pirrolidona, y mediante la adición de una base adecuada, por ejemplo trietilamina, diisopropiletilamina o N-metilmorfolina, y un agente de acoplamiento adecuado, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol (DCC/HOBT); tetrafluoroborato de O-(1,2-dihidro-2-oxo-1-piridil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TPTU) o hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC). Para una revisión de otros posibles agentes de acoplamiento, véase, por ejemplo, Klauser; Bodansky, Synthesis 1972, 453-463. La mezcla de reacción se agita a una temperatura de entre aproximadamente -10ºC y temperatura ambiente durante de 0,5 a 1 hora. Se añade un compuesto de fórmula II y se agita durante aproximadamente 16 horas a la misma temperatura para dar un compuesto de fórmula I.

Procedimiento b)

La reacción se lleva a cabo bajo las condiciones descritas para el procedimiento a).

Nuevos materiales de partida y/o productos transitorios, así como procedimientos para la preparación de los mismos, son asimismo la materia de esta invención. En la modalidad preferida, se usan tales materiales de partida y condiciones de reacción así seleccionadas a fin de permitir que se obtengan los compuestos preferidos.

Los materiales de partida de fórmulas II-V son conocidos, son capaces de ser preparados de acuerdo con procedimientos conocidos o pueden obtenerse comercialmente. En particular, pueden usarse procedimientos como los descritos en los Ejemplos.

Un compuesto de fórmula II, en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, se obtiene por ejemplo mediante la siguiente secuencia de reacciones:

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un compuesto de fórmula VI

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se hace reaccionar con un compuesto de fórmula VII

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(VII),H_{2}N-R_{2}

en la que R_{2} es como se define anteriormente bajo la fórmula I. La reacción se lleva a cabo calentando los reaccionantes de fórmulas VI y VII durante varias horas, por ejemplo de 4 a 6 horas, en presencia de un disolvente inerte, por ejemplo etanol o isopropanol, a una temperatura de aproximadamente 60-90ºC. La hidrólisis del grupo éster etílico del producto obtenido da un compuesto de fórmula VIII

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en la que R_{2} es como se define anteriormente bajo la fórmula I. Un compuesto de fórmula VIII se hace reaccionar a continuación con un compuesto de fórmula IX

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en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, para obtener un compuesto de fórmula X

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en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I. La reacción se lleva a cabo como se describe en el procedimiento a. A partir de esto, el compuesto correspondiente de fórmula II se prepara retirando el grupo protector terc-butoxicarbonilo N-terminal de manera conocida, por ejemplo bajo las condiciones descritas en Th. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, Nueva York 1991 (2ª ed., pp. 328-330).

Un compuesto de fórmula IV, en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, puede obtenerse, por ejemplo, mediante la siguiente secuencia de reacciones:

un compuesto de fórmula II, en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I, se hace reaccionar con un compuesto de fórmula XI

10

para obtener un compuesto de fórmula XII

11

en la que los substituyentes son como se definen anteriormente bajo la fórmula I. Los compuestos de fórmula XII corresponden a compuestos de fórmula I, en la que n es 1, R_{1} es bencilo y X es oxígeno. La reacción se lleva a cabo como se describe en el procedimiento a. La retirada del grupo protector terc-butoxicarbonilo N-terminal de un compuesto de fórmula XII de manera conocida (véase anteriormente) da un compuesto de fórmula IV.

La invención se refiere en particular al uso de un compuesto de fórmula I para la preparación de una composición farmacéutica para tratar animales de sangre caliente, especialmente seres humanos, que sufren una enfermedad proliferativa, especialmente una enfermedad tumoral y en particular una enfermedad tal que responde a la inhibición del complejo proteasómico multicatalítico. Dosis eficaces, por ejemplo dosis diarias de aproximadamente 0,05 g a aproximadamente 10 g, preferiblemente de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 5 g, por ejemplo de aproximadamente 0,15 g a 1,5 g, de un compuesto de fórmula I se administran a una animal de sangre caliente de aproximadamente 70 kg de peso corporal de acuerdo con la especie, la edad, el estado individual, el modo de administración y el síndrome individual.

La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz, especialmente una cantidad eficaz en la prevención o la terapia de una de las enfermedades mencionadas anteriormente, del ingrediente activo junto con portadores farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la administración tópica, enteral, por ejemplo oral o rectal, o parenteral, que pueden ser inorgánicos u orgánicos, sólidos o líquidos. Para la administración oral, se usan especialmente tabletas o cápsulas de gelatina que comprenden el ingrediente activo junto con diluyentes, por ejemplo lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicerol, y/o lubricantes, por ejemplo ácido silícico, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales como estearato magnésico o cálcico, y/o polietilenglicol. Las tabletas también pueden comprender aglutinantes, por ejemplo silicato de magnesio y aluminio, almidones, tales como almidón de maíz, trigo o arroz, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona y, si se desea, desintegrantes, por ejemplo almidones, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico, y/o mezclas efervescentes, o adsorbentes, colorantes, saboreantes y edulcorantes. Los compuestos farmacológicamente activos de la presente invención también pueden usarse en forma de composiciones administrables parenteralmente o en forma de soluciones para infusión. Tales soluciones son preferiblemente soluciones o suspensiones acuosas isotónicas, que, por ejemplo, en el caso de las composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un portador, por ejemplo manitol, pueden prepararse antes de usar. Las composiciones farmacéuticamente pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Las presentes composiciones farmacéuticamente que, si se desea, pueden comprender substancias farmacológicas activas adicionales, tales como antibióticos, se preparan de una manera conocida de por sí, por ejemplo por medio de procedimientos de mezcladura, granulación, combinación, disolución o liofilización convencionales. Las concentraciones de ingrediente o ingredientes activos, por supuesto, variarán dependiendo, por ejemplo, del compuesto de fórmula I empleado, el tratamiento deseado y la naturaleza de la forma. Las presentes composiciones farmacéuticas comprenden aproximadamente de 1% a 100%, especialmente de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, de ingrediente o ingredientes activos.

Las composiciones para administración oral, por ejemplo, pueden obtenerse formulando un compuesto de fórmula I con un medio portador que comprende una fase hidrófila, una fase lipófila y un tensioactivo. Preferiblemente, la composición está en la forma de un "preconcentrado para microemulsión" o "preconcentrado para emulsión", en particular del tipo que proporciona microemulsiones o emulsiones de aceite en agua. Sin embargo, la composición puede estar en la forma de una microemulsión o una emulsión que contiene adicionalmente una fase acuosa, preferiblemente agua. Un "preconcentrado para microemulsión" es una formulación que forma espontáneamente una microemulsión en un medio acuoso, por ejemplo en agua o en los jugos gástricos después de la aplicación oral. Una microemulsión es una suspensión coloidal no opaca o substancialmente no opaca que se forma espontáneamente o de forma substancialmente espontánea cuando sus componentes se ponen en contacto. Una microemulsión es termodinámicamente estable. Un "preconcentrado para emulsión" es una formulación que forma espontáneamente una emulsión en un medio acuoso, por ejemplo en agua o en los jugos gástricos, después de la aplicación oral. La emulsión formada es opaca y termodinámicamente estable. La fase lipófila puede comprender de aproximadamente 10 a 85% en peso del medio portador; el tensioactivo puede comprender de aproximadamente 5 a 80% en peso del medio portador y la fase hidrófila puede comprender de aproximadamente 10 a 50% en peso del medio portador.

La fase hidrófila puede seleccionarse de, por ejemplo, Transcutol® (C_{2}H_{5}-[O-(CH_{2})_{2}]_{2}-OH), Glycofurol® (también conocido como éter polietilenglicólico de alcohol tetrahidrofurfurílico) y 1,2-propilenglicol, o mezclas de los mismos, y es preferiblemente 1,2-propilenglicol. Puede incluir co-componentes hidrófilos adicionales, por ejemplo alcanoles C_{1}-C_{5}.

Componentes de la fase lipófila preferidos son triglicéridos de ácidos grasos de cadena media, mono-, di- y tri-glicéridos mixtos y aceites vegetales etoxilados transesterificados.

Ejemplos de tensioactivos adecuados son:

i): Productos de reacción de un aceite de ricino natural o hidrogenado y óxido de etileno. Los aceites disponibles bajo el nombre comercial Cremophor® (BASF, AG, Alemania) son especialmente adecuados. Particularmente adecuados son Cremophor RH 40® y Cremophor RH 60®. También son adecuados aceites de ricino polietilenglicólicos tales como el que está disponible bajo el nombre comercial Cremophor EL®. Productos similares o idénticos que también pueden usarse están disponibles bajo los nombres comerciales Nikkol®, Mapeg®, Incrocas® y Tagat®.

ii): Ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán, por ejemplo ésteres del tipo conocido y disponible comercialmente bajo el nombre comercial Tween®.

iii): Ésteres de ácido graso polioxietilénico, por ejemplo ésteres de ácido polioxietilenesteárico del tipo conocido y disponible comercialmente bajo el nombre comercial Myrj®.

iv): Copolímeros y copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, por ejemplo del tipo conocido y disponible comercialmente bajo los nombres comerciales Pluronic®, Emkalyx® y Poloxamer®, se prefieren especialmente Pluronic F68® y Poloxamer 188®.

v): Dioctilsulfosuccinato o di-[2-etilhexil]-succinato.

vi): Fosfolípidos, en particular lecitinas.

vii): Mono- y di-ésteres de ácido graso propilenglicólicos.

El tensioactivo seleccionado preferiblemente tiene un HLB (equilibrio hidrófilo/lipófilo) de al menos 10.

Las características físicas completas de los productos mencionados aquí por el nombre comercial pueden obtenerse, por ejemplo, de H. P. Fiedler, "Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und Angrenzende Gebiete", Editio Cantor, D-7960 Aulendorf, Alemania, tercera edición corregida y aumentada (1989).

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir aditivos o ingredientes adicionales, por ejemplo antioxidantes. Exhiben propiedades especialmente ventajosas cuando se administran oralmente, por ejemplo en términos de consistencia y alto nivel de biodisponibilidad obtenido en experimentos de biodisponibilidad estándar. Los parámetros farmacocinéticos, por ejemplo absorción y niveles en sangre, también se hacen sorprendentemente más predecibles y los problemas en la administración con absorción errática pueden eliminarse o reducirse. Adicionalmente, la composición farmacéutica es eficaz con materiales superficieactivos, por ejemplo sales biliares, presentes en el tracto gastrointestinal.

Las composiciones farmacéuticas para uso oral se combinan preferiblemente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo rellenándolas en envueltas para cápsulas oralmente administrables. Las envueltas para cápsulas pueden ser envueltas para cápsulas de gelatina blanda o dura. Sin embargo, si se desea, las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma de solución para bebida y pueden incluir agua o cualquier otro sistema acuoso, para proporcionar sistemas de emulsión o microemulsión adecuados para bebida.

La presente invención se refiere en particular al uso de compuestos de fórmula I en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, por ejemplo de un tumor sólido, y a su uso para el tratamiento de tal enfermedad proliferativa.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención pero no limitan el alcance de la misma de ningún modo.

Abreviaturas

salmuera: solución saturada de cloruro sódico

DIEA: N-etildiisopropilamina

DMF: N,N-dimetilformamida

t.d.: temperatura de descomposición

equiv: equivalente(s)

ES-MS: Espectroscopía de masas con pulverización electrónica

h: hora(s)

Me: metilo

min: minuto(s)

p.f.: punto de fusión

temp.: temperatura

THF: tetrahidrofurano

TFA: ácido trifluoroacético

TPTU: tetrafluoroborato de O-(1,2-dihidro-2-oxo-1-piridil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

t_{R}: tiempo de retención

Ejemplo 1 Éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxi-bencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

Se disuelve N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina (1,05 equivalentes) en N,N-dimetilacetamida y se añaden diisopropiletilamida (3,1 equiv.) y TPTU (1,05 equiv.). La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 0,5-1 h y a continuación se añade [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxi-bencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico. Después de 16 h a temperatura ambiente, se añade acetato de etilo, la mezcla se lava con una solución de NaHCO_{3} al 5% y salmuera. La capa orgánica se seca, el disolvente se evapora y el residuo se cromatografía sobre gel de sílice (disolvente: diclorometano-metanol). Se obtiene el compuesto del título: ES-MS: 847,0; pico simple a t_{R} = 7,73 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 1.1

Se añaden 2,6 ml (18 mmol) de 1-naftilmetilamina a la solución de 3,02 g (9 mmol) de éster etílico de ácido (2S,3R)-3-((S)-1-terc-butoxicarbonilamino-2-feniletil)-oxiran-2-carboxílico* en 23 ml de etanol y se agita durante 4,75 h a 70-80ºC. Después de la retirada del disolvente bajo presión reducida, el producto en bruto se purifica por medio de cromatografía en columna sobre gel de sílice (disolvente: hexanos-acetato de etilo 3:1) para dar éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenil-pentanoico; ES-MS: 493,0, pico simple a t_{R} = 11,18 min (Sistema A).

* La síntesis de este compuesto es descrita por Dieter Scolz y otros, en Journal of Medicinal Chemistry 1994, Vol, 37, Nº 19, pp. 3079-3089.

Etapa 1.2

Se añaden 7,8 ml de solución de LiOH 1 M en 10 min a una solución de 3,20 g (6,5 mmol) de éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico en 30 ml de THF absoluto y se agita durante 5 h a temperatura ambiente. Después de la terminación, la mezcla de reacción se ajustó hasta pH 4,0 con HCl 1N. El producto precipitado se filtró, se lavó repetidamente con agua y se secó para obtener ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico; p.f., 225-227ºC, pico simple a t_{R} = 9,68 min (Sistema A).

Etapa 1.3

Se añaden 392 mg (1,32 mmol) de TPTU (Aldrich 36,572-6) y 0,82 ml (4,8 mmol) de DIEA (Fluka 03340) a la suspensión de 558 mg (1,2 mmol) de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico en 10 ml de DMF absoluta a temperatura ambiente. Después de 1 h, se añaden a 0ºC 416 mg (1,44 mmol) de (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida** y la mezcla de reacción se agita durante 1 h a 0-5ºC y a continuación 1 h a temperatura ambiente. Después de la terminación, la mezcla se vierte sobre agua de hielo, se extrae el acetato de etilo y la capa orgánica se lava subsiguientemente con agua en solución salina. Después de la filtración de MgSO_{4} y la evaporación, el producto en bruto se purificó por medio de cromatografía en columna sobre gel de sílice (disolvente: hexanos-acetato de etilo 1:2) para dar éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propil}-carbámico; p.f., 95-98ºC, pico simple a t_{R} = 11,54 min (Sistema A).

** La síntesis de este compuesto es descrita por A. Billich y otros en Antiviral Chemistry & Chemotherapy 1995, Vol. 6, Nº 5, pp. 327-336.

Etapa 1.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-[(naf-
talen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico. El grupo protector terc-butoxicarbonilo N-terminal se retira mediante el tratamiento de éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propil}-carbámico con una solución 4N de HCl en dioxano usando un protocolo conocido en la técnica. Después de la evaporación del disolvente, el compuesto en bruto se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad. El compuesto se usa sin purificación adicional; ES-MS: 600,1; pico simple a t_{R} = 7,31 min (Sistema G).

Ejemplo 2 Éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilaminobencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 840,0, pico simple a t_{R} = 6,87 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 2.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico como se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 4-N-dimetilbencilamina como un reaccionante; ES-MS: 486,0, pico simple a t_{R} = 8,35 min (Sistema A).

Etapa 2.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico como se describe en el Ejemplo, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico como el material de partida; p.f. 202-204ºC, pico simple a t_{R} = 6,90 min (Sistema A).

Etapa 2.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilaminobencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metil-butiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; p.f. 89-91ºC, pico simple a t_{R} = 10,21 min (Sistema A).

Etapa 2.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilamino-bencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.4; ES-MS: 593,0; pico simple a t_{R} = 6,03 min (Sistema G).

Ejemplo 3 Éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S2R,3R)-1-bencil-3-[(S)-1-(5-bromo-2-hidroxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-2-hidroxi-3-(4-metoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(5-bromo-2-hidroxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-(4-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 875,9, pico simple a t_{R} = 6,74 min (Sistema D).

Ejemplo 4 Éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3-metoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil]-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 827,1, pico simple a t_{R} = 8,35 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 4.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 3-metoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 473, pico simple a t_{R} = 5,49 min (Sistema C).

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Etapa 4.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico
según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenil-pentanoico como el material de partida; t.d. 210ºC, pico simple a t_{R} = 4,80 min (Sistema C).

Etapa 4.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido [(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3-metoxibencilamino)-propil]-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; ES-MS: 679,0, pico simple a t_{R} = 5,89 min
(Sistema C).

Etapa 4.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-(3-metoxibencilamino)-5-fenilpentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido [(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3-metoxibencilamino)-propil]-carbámico según se
describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 580,1; pico simple a t_{R} = 6,69 min (Sistema G).

Ejemplo 5 Éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 857,1, pico simple a t_{R} = 7,46 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 5.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 2,4,-dimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 503,0, pico simple a t_{R} = 5,57 min (Sistema C).

Etapa 5.2

Se prepara (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico como el material de partida; t.d. 221ºC, pico simple a t_{R} = 4,92 min (Sistema C).

Etapa 5.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; ES-MS: 709,0, pico simple a t_{R} = 5,89 min (Sistema C).

Etapa 5.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(2,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido ((1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 610,1; pico simple a t_{R} = 7,45 min (Sistema G).

Ejemplo 6 Éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1. La purificación del compuesto en bruto se realiza mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 887,0, pico simple a t_{R} = 7,41 min (Sistema F).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 6.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 3,4,5-trimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 533,0, pico simple a t_{R} = 5,34 min (Sistema C).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 6.1

Etapa 6.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico como el material de partida; t.d. 206,8ºC, pico simple a t_{R} = 4,66 min (Sistema C).

Etapa 6.3

Se prepara éter terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxi-
bencil)-3-metil-butiramida de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; ES-MS: 739,0, pico simple a t_{R} = 5,69 min
(Sistema C).

Etapa 6.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido [(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)propil]-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 640,2; pico simple a t_{R} = 6,44 min (Sistema H).

Ejemplo 7 Éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1. El compuesto en bruto se purifica mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 887,0, pico simple a t_{R} = 7,18 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

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Etapa 7.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 2,3,4-trimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 533,0, pico simple a t_{R} = 13,17 min (Sistema B).

Etapa 7.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico como el material de partida; t.d. 207ºC, pico simple a t_{R} = 11,69 min (Sistema B).

Etapa 7.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico a partir de ácido (2R,3S,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; ES-MS: 739,0, pico simple a t_{R} = 5,90 min (Sistema C).

Etapa 7.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido [(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-propil]-carbámico
según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 640,1; pico simple a t_{R} = 6,53 min (Sistema H).

Ejemplo 8 Éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 857,1, pico simple a t_{R} = 8,25 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 8.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 3,4-dimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 503,0, pico simple a t_{R} = 5,22 min (Sistema C).

Etapa 8.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4-dimetoxibencilamino)pentanoico como el material de partida; t.d. 222ºC, pico simple a t_{R} = 4,54 min (Sistema C).

Etapa 8.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; p.f., 143,6ºC, pico simple a t_{R} = 5,57 min (Sistema C).

\newpage

Etapa 8.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 610,1; pico simple a t_{R} = 6,61 min (Sistema G).

Ejemplo 9 Éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,5-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(3,5-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 857,1, pico simple a t_{R} = 7,61 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 9.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,5-dimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 3,5-dimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 503,0, pico simple a t_{R} = 5,82 min (Sistema C).

Etapa 9.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4-dimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,5-dimetoxibencilamino)-pentanoico como el material de partida; t.d. 206ºC, pico simple a t_{R} = 4,92 min (Sistema C).

Etapa 9.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,5-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(3,5-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; p.f., 138,2ºC, pico simple a t_{R} = 5,87 min (Sistema C).

Etapa 9.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(3,5-dimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,5-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 609,1; pico simple a t_{R} = 7,07 min (Sistema G).

Ejemplo 10 Éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene a partir de N-benciloxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 887,0, pico simple a t_{R} = 7,28 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 10.1

Se prepara éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.1, pero usando 2,4,5-trimetoxibencilamina como un reaccionante; ES-MS: 533,0, pico simple a t_{R} = 5,33 min (Sistema C).

\newpage

Etapa 10.2

Se prepara ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.2, pero usando éster etílico de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico como el material de partida; p.f., 206ºC, pico simple a t_{R} = 11,25 min (Sistema B).

Etapa 10.3

Se prepara éster terc-butílico de ácido {(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propil)-carbámico a partir de ácido (2R,3R,4S)-4-terc-butoxicarbonilamino-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico y (S)-2-amino-N-(2-hidroxi-4-metoxibencil)-3-metilbutiramida según se describe en el Ejemplo 1, Etapa 1.3; ES-MS: 739,0, pico simple a t_{R} = 5,66 min (Sistema C).

Etapa 10.4

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de éster terc-butílico de ácido [(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-propil]-carbámico
según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 639,1; pico simple a t_{R} = 7,33 min (Sistema G).

Ejemplo 11 Éster butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-terc-butoxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico (descrita en el Ejemplo 6), y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1. El compuesto en bruto se purifica mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 853,1, pico simple a t_{R} = 7,28 min (Sistema F).

Ejemplo 12 [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butilamino]-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de ácido 1-naftilacético (Fluka, Buchs, Suiza) y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1. El compuesto en bruto se purifica mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 921,0, pico simple a t_{R} = 7,56 min (Sistema F).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 12.1

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de éster terc-butílico de ácido [(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarba-
moil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico (Ejemplo 11) según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 753,1; pico simple a t_{R} = 7,56 min (Sistema F).

Ejemplo 13 [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de ácido 1-naftilacético (Fluka, Buchs, Suiza) y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1. El compuesto en bruto se purifica mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 921,0, pico simple a t_{R} = 7,71 min (Sistema F).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 13.1

Éster terc-butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-terc-butoxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico (descrito en el Ejemplo 7) y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1. El compuesto en bruto se purifica mediante HPLC semipreparativa. El compuesto purificado se recoge en acetato de etilo y se lava varias veces con NaHCO_{3} al 5% y a continuación salmuera. La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4} y el disolvente se evapora hasta sequedad; ES-MS: 853,1, pico simple a t_{R} = 7,34 min (Sistema F).

Etapa 13.2

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de éster terc-butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-propilcarba-
moil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 753,1; pico simple a t_{R} = 5,58 min (Sistema F).

Ejemplo 14 [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene a partir de ácido 1-naftilacético (Fluka, Buchs, Suiza) y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 921,1, pico simple a t_{R} = 7,47 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 14.1

Éster terc-butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-terc-butoxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico (descrito en el Ejemplo 10), y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 853,1, pico simple a t_{R} = 7,29 min (Sistema E).

Etapa 14.2

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de éster terc-butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarba-
moil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 753,1 pico simple a t_{R} = 5,71 min (Sistema E).

Ejemplo 15 [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenil-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de ácido 1-naftilacético (Fluka, Buchs, Suiza) y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenil-pentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 880,5, pico simple a t_{R} = 8,83 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 15.1

Éster terc-butílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-terc-butoxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenil-pentanoico (descrito en el Ejemplo1), y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 813,4, pico simple a t_{R} = 8,94 min (Sistema E).

Etapa 15.2

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenil-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de éster terc-butílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propilcarba-
moil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 713,4; pico simple a t_{R} = 7,56 min (Sistema E).

Ejemplo 16 [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-2-(4-dimetilamino-bencilamino)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-pentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de ácido 1-naftilacético (Fluka, Buchs, Suiza) y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetil-butirilamino)-2-(4-dimetilamino-bencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 874,5, pico simple a t_{R} = 8,23 min (Sistema E).

El material de partida se obtiene como sigue:

Etapa 16.1

Éster terc-butílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilaminobencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico

El compuesto del título se obtiene partiendo de N-terc-butoxicarbonil-L-terc-leucina y [(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-amino-2-(4-dimetilaminobencilamino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, y usando las condiciones de acoplamiento descritas en el Ejemplo 1; ES-MS: 806,4, pico simple a t_{R} = 8,36 min (Sistema E).

Etapa 16.2

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-((S)-2-amino-3,3-dimetilbutirilamino)-2-(4-dimetilaminobencil-amino)-3-hidroxi-5-fenilpentanoico

El compuesto del título se obtiene partiendo de éster terc-butílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilaminobencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarba-
moil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico según se describe en el Ejemplo 1; ES-MS: 706,4; pico simple a t_{R} = 7,07 min (Sistema E).

Condiciones de HPLC Analítica

17

18

19

Ejemplo 17 Inhibición de la actividad similar a quimotripsina del proteasoma 20S

Valores de IC_{50} ejemplares determinados de acuerdo con la prueba descrita anteriormente para los compuestos de fórmula I se dan posteriormente (Tabla 1).

TABLA 1

Ejemplo	IC_{50} [\muM]	Ejemplo	IC_{50} [\muM]
1	0,26	9	0,19
2	0,6	10	0,2
3	0,8	11	1,04
4	1,5	12	0,011
5	1,6	13	0,018
6	0,05	14	0,029
7	0,1	15	0,15
8	0,15	16	0,16

Ejemplo 18 Composiciones para aplicación oral

20,0 g de una solución para aplicación oral pueden prepararse como sigue (% significa peso de ingrediente/peso total de la solución):

Cremophor RH 40®	9,6 g (48%)
mono-, di-, tri-glicéridos de aceite de maíz	5,8 g (29%)
propilenglicol	3,8 g (19%)
compuesto de fórmula I	0,8 g (4%)

La solución se mantiene a temperatura ambiente hasta el uso.

Claims

1. Un compuesto de fórmula I

12

en el que

n es 0 ó 1;

X es nitrógeno, oxígeno o azufre; y

o una sal del mismo.

2. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

n es 0 ó 1;

X es nitrógeno, oxígeno o azufre; y

o una sal del mismo.

3. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

n es 0 ó 1;

X es oxígeno; y

o una sal del mismo.

4. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

n es 0 ó 1;

X es oxígeno; y

o una sal del mismo.

5. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

n es 0;

o una sal del mismo.

6. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

n es 0 ó 1;

R_{3} es alquilo C_{1}-C_{7};

R_{4} y R_{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi C_{1}-C_{7} y halógeno; y

X es oxígeno; y

o una sal del mismo.

7. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en

éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil-3-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(4-dimetilaminobencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-3-[(S)-1-(5-bromo-2-hidroxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-2-hidroxi-3-(4-metoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3-metoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico,

éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(2,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico,

éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S}-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,4-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido ((S)-1-{(1S,2R,3R)-1-bencil-3-(3,5-dimetoxibencilamino)-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-propilcarbamoil}-2,2-dimetilpropil)-carbámico,

éster bencílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico,

éster terc-butílico de ácido {(S)-1-[(1S,2R,3R)-1-bencil-2-hidroxi-3-[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropilcarbamoil]-3-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-propilcarbamoil]-2,2-dimetilpropil}-carbámico,

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-
naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-2-(3,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico,

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S}-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-
naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-2-(2,3,4-trimetoxibencilamino)-pentanoico,

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-
naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenil-(2,4,5-trimetoxibencilamino)-pentanoico,

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-
naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-2-[(naftalen-1-ilmetil)-amino]-5-fenilpentanoico,

[(S)-1-(2-hidroxi-4-metoxibencilcarbamoil)-2-metilpropil]-amida de ácido (2R,3R,4S)-2-(4-dimetilaminobencilamino)-4-[(S)-3,3-dimetil-2-(2-naftalen-1-ilacetilamino)-butirilamino]-3-hidroxi-5-fenilpentanoico,

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

8. Una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Una compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto, para usar en un método para el tratamiento terapéutico del cuerpo de un ser humano o un animal.

10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto junto con un portador farmacéutico.

11. Una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades proliferativas en animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos, que comprende, en una dosis eficaz contra la enfermedad, un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto, junto con un portador farmacéutico.

12. El uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto, para la preparación de composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de enfermedades proliferativas.

13. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 o de una sal de tal compuesto, caracterizado porque

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a) un compuesto de fórmula II

13

en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son como se definen para los compuestos de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula II, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o una sal de tal compuesto, se hace reaccionar con un ácido de fórmula III

14

en la que n, R_{1} y X son como se definen para los compuestos de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula III, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o un derivado de ácido reactivo adecuado de tal compuesto, y cualesquiera grupos protectores presentes se retiran, o

b) un compuesto de fórmula IV

15

en la que R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son como se definen para los compuestos de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula IV, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o una sal de tal compuesto, se hace reaccionar con un ácido de fórmula V

16

en la que n, R_{1} y X son como se definen para los compuestos de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, protegiéndose los grupos funcionales presentes en un compuesto de fórmula V, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, si es necesario, mediante grupos protectores fácilmente retirables, o un derivado de ácido reactivo adecuado de tal compuesto, y cualesquiera grupos protectores presentes se retiran,