ES2261509T4 - Procedimiento para plegar polipeptidos sintetizados quimicamente. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para plegar polipéptidos sintetizados químicamente, caracterizado porque comprende tratar a un polipéptido y/o proteína que comprende dos o más residuos de cisteína derivada con un agente reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y temperatura predeterminados.
Description
Procedimiento para plegar polipéptidos
sintetizados químicamente.
La presente invención se refiere un
procedimiento para plegar polipéptido sintetizados químicamente.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para producir
proteínas activas biológicamente.
Durante última década ha habido un aumento en la
demanda de proteínas sintéticas después de la síntesis química
exitosa de la proteasa de VIH completamente activa, una enzima de 99
residuos preparada por métodos altamente optimizados de síntesis de
péptido en fase sólida (SPPS) basada en el método estándar
Boc/Bzl.
La síntesis en 1994 de la ubiquitina cristalina,
una proteína pequeña que consiste de 76 residuos, ha demostrado
adicionalmente que proteínas altamente puras pueden sintetizarse
mediante SPPS basándose en el protocolo Fmoc/t-Bu,
un método opcionalmente más simple y químicamente menos complejo que
el procedimiento Boc/Bzl.
En el año 2000, hay una amplia evidencia
experimental de que las proteínas con un solo dominio que contienen
entre 60 y 100 residuos de aminoácidos pueden producirse
rápidamente, de manera confiable y económica mediante la síntesis
química, con la asistencia de un sintetizador de péptido, en
cantidades que son suficientes para estudios estructurales y
funcionales.
Las proteínas que contienen puentes disulfuro
preparados mediante síntesis química, una vez que se pliegan,
tienen las mismas propiedades que las formas naturales y que las
formas diseñadas genéticamente. Los puentes disulfuro de las
proteínas a partir de estructuras cíclicas sencillas o múltiples
intra- y/o intercadena las cuales imparten limitaciones
conformacionales considerables a las moléculas, contribuyen así de
manera decisiva a la estabilización de la conformación
bioactiva.
Las proteínas con un solo dominio plegado de
estructura conocida pueden prepararse mediante la formación de
pares de los residuos de cisteína en regiones selectivas. Se
desarrollaron varias combinaciones de grupos protectores de
cisteína compatibles con los esquemas de protección comúnmente
utilizados que permiten la desprotección y/o
co-oxidación paso a paso y par por par de los
residuos de cisteína con selectividad completa.
Sin embargo, una demostración de qué tan
demandante es la química implicada en la formación de pares de los
residuos de cisteína en regiones selectivas en proteínas que
contienen múltiples residuos de cisteína es la síntesis reciente de
un péptido semejante a insulina, relaxina de humano. La síntesis del
precursor de la cadena A se lleva a cabo al utilizar los métodos
SPPS, el método Fmoc/t-Bu y una resina basada en
alcohol p-alcoxibencílico, mientras que el
precursor de la cadena B se prepara al utilizar resina PAM (éster de
4-carboxiamidometilbencilo unido a resina basada en
poliestireno) al seguir el método Boc/Bzl. De los cuatro residuos de
cisteína del precursor de la cadena A, dos estuvieron protegidos
como los derivados S-Trt
(S-trifenilmetilo), mientras que los otros tuvieron
protección S-Acm (S-acetamidometilo)
y S-Meb
(S-p-metilbencilo), respectivamente.
Las dos cisteínas del precursor de la cadena B estuvieron
protegidas por los grupos protectores S-Acm y
S-Meb. El puente intramolecular S-S
de la cadena A se obtuvo primero mediante oxidación de yodo en AcOH.
Luego, los dos puentes disulfuro intermoleculares que conectan a
las cadenas A y B se obtuvieron en dos pasos: en el primer paso, el
tiol libre del precursor de la cadena A, obtenido mediante
desbloqueo HF del grupo protector S-Meb, se hizo
reaccionar con el residuo Cys (Npys)
(S-3-nitro-2-piridin
sulfenilo) activado del cadena B (formación dirigida del
heterodisulfuro intermolecular), y en el segundo paso, el puente
S-S remanente se obtuvo mediante remoción
cooxidativa de los grupos S-Acm con yodo.
Los protocolos SPPS ofrecen la posibilidad de
preparar una variedad de polipéptidos mediante síntesis química,
que contienen residuos de cisteína protegidos con el mismo grupo
bloqueador (protector). Una vez que los grupos protectores se
remueven mediante varios reactivos oxidantes los enlaces disulfuro
se forman directamente. Los polipéptidos y/o proteínas que
contienen cisteínas protegidas S-Trt o
S-Acm pueden plegarse realmente de manera eficiente
después del tratamiento con yodo, N-iodosuccinimida
y yoduro de cianógeno bajo condiciones de solvente, pH y tiempo de
reacción cuidadosamente controladas que minimizarán la modificación
de Tyr, Met, y Trp sensible a la oxidación y evitará la
sobreoxidación de los tioles de cisteína a los ácidos sulfónicos
correspondientes.
El trifluoroacetato de talio (III) puede
reemplazar a los agentes oxidantes anteriormente mencionados que
algunas veces dan mejores rendimientos de los enlaces disulfuro. Las
limitaciones principales de este reactivo son su toxicidad, la
dificultad para remover talio a partir del polipéptido blanco y la
necesidad para proteger a los residuos Met y Trp de la
oxidación.
Los reactivos de oxidación que contienen una
mezcla de compuestos de sulfóxido/sililo y ácido trifluoroacético
han sido aplicados exitosamente para la oxidación directa a enlaces
disulfuro de precursores de polipéptido que contienen residuos de
cisteína S-Acm, S-But,
S-Meb y S-Mob
(S-p-metoxibencilo). La necesidad
para proteger al anillo indol del Trp con formilo para evitar la
clorinación bajo condiciones oxidantes es, no obstante, la
principal limitación de esta mezcla.
Los métodos para el plegamiento oxidativo de
precursores politiol lineales, sintéticos (formas polipeptídicas
reducidas) son más populares y más frecuentemente aplicados. En el
método más simple, los enlaces disulfuro apropiados pueden formarse
espontáneamente en la presencia de aire o de algunos otros agentes
oxidantes moderados. Además, el plegamiento y la formación de pares
de cisteína se obtienen tanto en la presencia de las formas
reducidas (RSH) como oxidadas
(R-S-S-R) de un
compuesto sulfhidrilo de bajo peso molecular.
En los polipéptidos sintéticos y proteínas
pequeñas que consisten de un solo dominio, la fuerza de dirección
termodinámica para el plegamiento que resulta a partir una
combinación de enlaces de H, formación de pares iónicos y efectos
hidrófobos por lo visto es suficientemente substancial para producir
espontáneamente los isómeros nativos en oxidación renaturalizante
aleatoria.
A partir de estudios del plegamiento oxidativo
de múltiples proteínas pequeñas que contienen cisteína, semejantes
a inhibidores de enzimas, toxinas u hormonas, se han derivado
informaciones útiles acerca de los motivos estructurales
particulares por ejemplo cisteína estabilizada por
giro-\beta, cisteína estabilizada por plegamiento
de la hélice poli(Pro)-II y cisteína
estabilizada por plegamiento estructural á-\beta, cuya
estabilización es la fuerza de dirección principal para la
formación correcta de puentes disulfuro incluso en moléculas
peptídicas relativamente pequeñas. Si se presta atención a la
elección de reguladores de pH, temperatura y aditivos que
estabilizarán los motivos estructurales secundarios, entonces
incluso se puede obtener in vitro plegamiento correcto
completo de proteínas parcialmente plegadas o mezcladas (plegadas de
manera errónea).
Se han diseñado varios protocolos de plegamiento
para las especies polipeptídicas politiol para minimizar la
formación incorrecta de pares de cisteína intramolecular que lleva a
isómeros no nativos, plegados de manera errónea y a evitar tanto
como sea posible la formación aleatoria de enlace disulfuro
intermolecular que promueve la agregación y precipitación.
Así, la oxidación por aire generalmente se lleva
a cabo a una dilución elevada de la forma politiol precursora (1
mg/ml o por debajo de esta) bajo condiciones neutras o ligeramente
alcalinas. Esta usualmente requiere una larga duración y produce un
subproducto no dañino tal como agua en la reacción. Las oxidaciones
por aire son, no obstante, difíciles de controlar debido a
cantidades traza de iones metálicos que influyen fuertemente sus
velocidades. De manera más importante, las moléculas precursoras
básicas e hidrófobas tienden a agregarse y a precipitarse fuera de
la solución en o cerca de sus puntos isoeléctricos básicos o neutros
durante el procedimiento de plegamiento. Además, los productos
laterales debidos a la oxidación de Met se acumulan durante el
plegamiento. Aunque el número de operaciones químicas necesarias
para plegar precursores de politiol se reduce a un mínimo, la
formación de puentes disulfuro promovida por el oxígeno molecular
del aire da en muchos casos rendimientos bajos, y en algunas
ocasiones no ocurre del todo.
DMSO y ferricianuro de potasio también han sido
utilizados como oxidantes. El ferricianuro de potasio debe, no
obstante, ser utilizado en la oscuridad y, si Met o Trp están
presentes en la cadena polipeptídica, los productos laterales de
oxidación se acumulan durante el plegamiento. El uso de DMSO
frecuentemente da mejores resultados debido al hecho de que los
plegamientos oxidativos pueden ser conducidos bajo condiciones
ácidas a una velocidad eficiente sin productos dañinos en la
reacción. El método es particularmente adecuado para plegamiento de
precursores de polipéptidos básicos e hidrófobos debido a las
características de mayor solubilidad de las especies que se someten
a oxidación en reguladores de pH ácidos. Sin embargo, frecuentemente
han sido reportados los problemas para remover el DMSO a partir del
producto final y la reducción en la selectividad de la formación de
puentes disulfuro. Además, la mezcla de los puentes disulfuro que
lleva a isómeros plegados de manera errónea y la oligomerización no
pueden evitarse siempre incluso con un control cuidadoso de las
condiciones experimentales.
Los mayores rendimientos de formación de pares
de cisteína y plegamiento correctos en precursores de politiol de
proteína pequeña se obtienen más frecuentemente mediante el uso de
reguladores de pH redox tales como glutationa oxidada (GSSG) y
reducida (GSH) y cisteína/cisteína (Cys/Cys).
Así, durante los plegamientos oxidativos de la
Ribonucleasa A (R.R. Hantgan et al. Biochemistry 13, 613,
1974), el dominio nuclear de 49 aminoácidos de hirudina (B.
Chatrenet y J.Y. Chang J. Biol. Chem. 267, 3038, 1992) y el
Inhibidor de la Tripsina Pancreática de Bovino (BPTI) (T.E.
Creighton Methods Enzymol. 131, 83, 1986) inducidos por GSSG/GSH o
Cys/Cys, se forman y se reforman constantemente sulfhidrilos libres
y grupos disulfuro durante todo el procedimiento de plegamiento.
Las velocidades y rendimientos generales usualmente son mejores que
el plegamiento oxidativo en el aire debido a que el intercambio de
tiol/disulfuro ocurre a través de intermediarios de tiolato que
facilitan el recambio del disulfuro no nativo por los naturales. En
cuanto al plegamiento oxidativo en aire, la elevada dilución del
precursor de politiol es necesaria para evitar la agregación,
formación de oligómeros y polímeros y para maximizar los
rendimientos de las especies de proteína blanco.
Durante la primera etapa del plegamiento de
huridina1-49 in vitro, el plegamiento procede
de manera secuencial e irreversible a partir de la forma no
plegada, reducida (politiol) hacia isómeros equilibrados que
contienen uno y dos puentes disulfuro y hacia especies equilibradas
que contienen tres enlaces disulfuro (isómeros mezclados) (J. Y.
Chang Biochem. J. 300, 643, 1994). Casi todas las 75 especies de
proteínas posibles, que incluyen a la proteína nativa, han sido
identificadas: 15 isómeros con un puente S-S, 45
isómeros con dos puentes S-S y 15 isómeros con tres
puentes S-S. Durante la segunda etapa del
plegamiento, las especies mezcladas se reorganizan mediante
recambio de los disulfuros no nativos para conseguir las especies de
proteína nativa. La formación del disulfuro se promueve
principalmente mediante la glutationa oxidada o cisteína, mientras
que el recambio del disulfuro requiere un catalizador tiol por
ejemplo glutationa reducida o cisteína o mercaptoetanol.
La efectividad de los reactivos tiol para
promover el recambio evidentemente está relacionada con su potencial
redox y cada catalizador exhibe una concentración óptima.
Cisteína/cisteína es aproximadamente 10 veces más potente que
GSSG/GSH en el procesamiento de la acumulación de Hirudinas
mezcladas. Esta diferencia ha sido explicada mediante el potencial
redox relativo de los sistemas GSSG/GSH (-0.24 V) y
Cys-Cys/Cys (-0.22 V). Mediante la selección de una
combinación de condiciones óptimas (temperatura, regulador de pH,
sales y mezcla redox) el procesamiento de plegamiento de
Huridina1-49 se acelera hasta el grado que alcanza
su término en 15 minutos.
En general, la conformación nativa de una
proteína sintética que contiene varios enlaces disulfuro debe
formarse espontáneamente bajo condiciones óptimas para plegamiento
de formas politiol. En muchos casos, sin embargo, incluso en
condiciones optimizadas los plegamientos oxidativo mediados por los
reguladores de pH redox anteriormente mencionados se produce una
cantidad considerable de subproductos y formas mal emparejadas. Este
es particularmente el caso en las proteínas que tienen a formar la
conformación nativa solamente en la superficie de membranas
específicas o bajo asistencia de un chaperón molecular específico
(S. Sakakibara Biopolymers, Peptide Science 51, 279, 1999).
Además, a pesar de su amplio uso, la mayoría de
los plegamientos oxidativos de los precursores politiol promovidos
por aire o los pares redox GSSG/GSH y Cisteína/cisteína han sido
conducidos en una manera de ensayo y error, como se demuestra
claramente por los experimentos de plegamiento de quimiocina
sintética y análogos de quimiocina. De hecho, mientras que las
quimiocinas nativas y varios de sus análogos se pliegan fácilmente,
la estructura plegada se estabiliza por dos o tres puentes
disulfuro, varios análogos no se pliegan bien bajo las mismas
condiciones que las moléculas nativas correspondientes lo que
resulta en formas parcialmente plegadas. Estas observaciones
representan una fuerte indicación de que los cambios en la
estructura primaria de los precursores politiol pueden afectar de
manera adversa la inducción de los pliegues locales correctos
(giros-\circ{a}, motivos helicoidales
poliprolina, etc.) en las cadenas polipeptídicas a ser plegadas. Por
lo tanto, la propensión a plegarse de muchos precursores tiol es
principalmente una propiedad intrínseca de la cadena polipeptídica
más que una función del sistema de oxidación específico que actúa
sobre las moléculas.
También ha sido reportado el mejoramiento de la
formación de pares disulfuro seleccionados mediante la adición de
alcoholes, acetonitrilo y DMSO a reguladores de pH a baja fuerza
iónica. Esta estrategia implica el mejoramiento de la formación de
enlaces disulfuro específicos mediante el ajuste de factores
electrostáticos en el medio para favorecer la yuxtaposición de
aminoácidos cargados de manera opuesta que limitan los residuos de
cisteína seleccionados. Las enzimas tales como peptidil disulfuro
isomerasa (PDI) y prolil isomerasa (PPI) también han sido empleadas
como aditivos para catalizar y modular el intercambio de disulfuro.
El tiempo requerido para plegar Huridina in vitro puede
acortarse de 10 h a 30 seg si se añade PDI al regulador de pH para
replegamiento. En este caso, la eficiencia del plegamiento in
vitro no difiere significativamente de la observada in
vivo.
Los precursores polipéptido politiol se obtienen
directamente mediante escisión acidolítica de
polipéptido-resina cuando los residuos de cisteína
están protegidos por grupos de ácido lábil, por ejemplo Trt.
Alternativamente y de manera preferible, los polipéptidos en los
que todas las cisteínas están protegidas por un grupo resistente a
ácido, por ejemplo el grupo acetamidometilo (Acm), se aíslan primero
como derivados de S-cisteína mediante escisión
acidolítica de péptido-resina y luego el grupo Acm
se elimina mediante tratamiento con Hg (AcO)2 en ácido
acético, seguido por la remoción de iones Hg mediante filtración en
gel en la presencia de un gran exceso de mercaptoetanol.
En ambos casos, sin embargo, se ha reportado que
ocurren varias reacciones laterales en los residuos de cisteína y
de triptofano. El anillo indol de triptofano puede derivarse
mediante mercaptoetanol y cisteína que da varias reacciones
laterales, la más importante es la oxidación y alquilatación por
cationes t-butilo durante la remoción acidolítica
de la cadena polipeptídica a partir de la resina.
Así, debido a los inconvenientes de las
metodologías existentes existe una necesidad para procedimientos más
eficientes y más simples para plegar polipéptidos sintetizados
químicamente, y preparar proteínas activas biológicamente mediante
síntesis química.
El objetivo de la presente invención es por lo
tanto el proveer un procedimiento efectivo, simple y rápido para
plegamiento de polipéptidos y/o proteínas, en donde se minimiza
entre otros la formación de isómeros que contienen puentes
disulfuro mal emparejados, y se puede omitir el uso de reactivos
costosos para recambio de disulfuro tales como glutationa o
enzimas, y cuyo método es repetible, sólido y capaz de ser
escalable. Estos y otros objetivos serán evidentes a los expertos
en la técnica.
Además, se provee un procedimiento para la
preparación de proteínas activas biológicamente, que comprende
(a) sintetizar químicamente un polipéptido que
comprende dos o más residuos de cisteína derivados;
(b) tratar a este polipéptido con un agente
reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y
temperatura predeterminados, y
(c) purificar las proteínas plegadas
obtenidas.
\newpage
Así, de conformidad con la invención, se ha
encontrado, de manera inesperada, que las cisteínas derivadas de
S-t-Bu pueden ser desprotegidas, es
decir, al perder la porción S-t-Bu,
mientras que forman puentes disulfuro con otras cisteínas cuando se
incuban en un regulador de pH para plegamiento apropiado a
temperatura y pH adecuados.
De conformidad con la presente invención, el
agente reductor preferiblemente está libre de cisteína. Un exceso
de cisteína puede añadirse al regulador de pH (como por ejemplo se
ilustra en los ejemplos 1-5) o la cisteína puede
ser derivada a partir de dentro del polipéptido (como se ilustra en
el ejemplo 6).
En una modalidad preferida del procedimiento de
la invención el regulador de pH para plegamiento comprende una u
más sales caotrópicas, con el objeto de conducir al polipéptido en
condiciones de equilibrio que permiten que ocurra el plegamiento
natural. Esto puede lograrse, por ejemplo, al colocar al polipéptido
y/o proteína en condiciones completamente desnaturalizantes, por
ejemplo mediante una elevada concentración de las sales
caotrópicas, y luego al diluir la sal caotrópica a una concentración
menor para plegamiento. Las sales caotrópicas preferiblemente se
eligen a partir del grupo que consiste de cloruro de guanidinio y
urea, y preferiblemente están presentes en una concentración de
0.1-1 M durante el plegamiento.
Preferiblemente, la temperatura del regulador de
pH para plegamiento se encuentra entre 25º y 40ºC, más
preferiblemente entre 27º y 38ºC, con el objeto de disminuir los
cambios de degradación peptídica, a la vez que corresponde a las
temperaturas naturales del cuerpo. Más preferiblemente la
temperatura es de aproximadamente 37ºC durante el plegamiento.
De conformidad con otra modalidad preferida del
procedimiento de la invención el regulador de pH para plegamiento
tiene un pH ligeramente alcalino. Preferiblemente, el pH se
encuentra entre 7 y 9, más preferiblemente entre 7 y 8.5 con el
objeto de promover el procedimiento de plegamiento. Como puede estar
claro a partir de lo anteriormente expuesto, el plegamiento de
proteína es dependiente de una serie de interacciones complejas. La
reacción con cisteína, por ejemplo, no ocurre a un pH ácido y
elevados valores de pH incrementan el riesgo de degradación del
polipéptido.
Después del plegamiento, las proteínas blanco
pueden purificarse por métodos bien conocidos en la técnica que
incluyen la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico,
cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía en fase
reversa, cromatografía por afinidad, cromatografía de interacción
hidrófila/ intercambio catiónico (HILIC/CEC), cromatografía por
desplazamiento (DC) y cromatografía por desplazamiento de muestra
(SDM). Más preferiblemente, se emplean la cromatografía de alta
resolución (fase reversa) en elución así como la cromatografía por
desplazamiento.
En una modalidad preferida del procedimiento
para producir proteínas activas biológicamente, el procedimiento
comprende los pasos de
(a) ensamblar un polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína sobre un soporte polimérico insoluble mediante elongación
de cadena paso a paso;
(b) escindir la cadena polipeptídica de
S-t-butil-tio
cisteína a partir del soporte mediante acidolisis;
(c) purificar el polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína obtenido;
(d) plegar el polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína purificado mediante el tratamiento de estos polipéptidos
con un exceso molar de cisteína en un regulador de pH para
plegamiento que comprende una sal caotrópica, preferiblemente
cloruro de guanidinio, y que tiene un pH alcalino y una temperatura
de aproximadamente 37ºC; y
(e) purificar las proteínas plegadas obtenidas
mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa.
En una modalidad ventajosa del procedimiento de
la invención, el soporte polimérico es una poliamida o resina
basada en poliestireno funcionalizada con el aglutinante de ácido
lábil ácido hidroximetilfenoxiacético, puesto que estos soportes
pueden ser utilizados de manera adecuada para sintetizadores
peptídicos completamente automatizados, y generalmente permiten la
síntesis de cadenas polipeptídicas largas.
Como se explicó anteriormente, la presente
invención se basa en el ensamblaje en fase sólida paso a paso de
polipéptidos
S-t-butil-tio
cisteína y el hallazgo de que cantidades considerables de proteínas
nativas, activas biológicamente pueden producirse al someter a
estos polipéptidos a plegamiento en la presencia de un agente
reductor, preferiblemente cisteína, a un pH ligeramente por arriba
de la neutralidad y a una temperatura de aproximadamente 37ºC.
Se ha encontrado sorprendentemente que la
producción de proteínas activas biológicamente se logra con un
exceso molar elevado de cisteína en un procedimiento que remueve el
grupo protector S-t-butilo mientras
que se permite la formación de un puente disulfuro. Este
procedimiento es más simple y más eficiente que los procedimientos
descritos en la técnica precedente para el plegamiento de
polipéptidos que contienen cisteína los cuales se obtienen mediante
síntesis química. La remoción de
S-t-but ocurre así en el mismo paso
que el plegamiento del polipéptido.
\newpage
Alternativamente, el mismo material plegado
también puede obtenerse mediante el uso de una combinación de
S-t-butil-tio
cisteína y cisteína protegida con grupos de ácido lábil adecuados en
posiciones seleccionadas de la cadena polipeptídica para forzar la
formación de los enlaces disulfuro apropiados sin la adición extra
de un agente reductor al regulador de pH para plegamiento. En este
caso los grupos de ácido lábil se remueven cuando el péptido se
escinde a partir de la resina a pH ácido. Las cisteínas libres se
generan así, las cuales a su vez actúan como un "agente
reductor" intramolecular para permitir la remoción de
S-t-butilo y la formación de
disulfuro (como se ilustra en el ejemplo 6).
La esencia de la presente invención se basa
en:
- ensamblaje rápido de las cadenas polipéptidas
S-tio-t-butiladas
sobre el soporte polimérico;
- intercambio de los derivados de
disulfuro-tiol catalizado por cisteína en
condiciones ligeramente alcalinas que conducen a los polipéptidos
cisteinilados que son las formas macromoleculares oxidadas
(proteína-S-S-cisteína;
polipéptido-S-S-cisteína)
del par redox clásico Cisteína/Cisteína;
- la concentración de la forma macromolecular
oxidada que permanece constantemente a una baja durante todo el
procedimiento de plegamiento de manera que se minimiza el
intercambio del disulfuro intermolecular; y
- ausencia de agregación de intermediarios
plegados de manera errónea debido a la formación preferencial y
rápida de formas con formación correcta de pares de cisteína
(estructura nativa).
De conformidad con el procedimiento para
plegamiento de polipéptidos de la presente invención, por ejemplo,
en el primer paso, 10 mg del derivado
S-t-butilo se disuelve a temperatura
ambiente en 1 ml de un regulador de pH, pH 8.0, que comprende 6M de
cloruro de guanidinio, 10 mM de Tris y 0.1 M de Na_{2}HPO_{4} y
la solución resultante se mantiene a temperatura ambiente por
aproximadamente 20 minutos. En el segundo paso, la solución se
diluye inicialmente 10 veces con agua a un pH de 7.2, (0.6 M de
cloruro de guanidinio, 1.0 mM de Tris, 10 mM de Na_{2}HPO_{4} y
una concentración final del derivado de polipéptido a 1 mg/ml) y
luego se añade un gran exceso molar de cisteína (aproximadamente
100 veces sobre la concentración del polipéptido o derivado de
proteína) bajo agitación. La temperatura se incrementa gradualmente
a 37ºC y se mantiene constante por aproximadamente 24 h con el
objeto de permitir que ocurra el plegamiento del polipéptido.
El procedimiento de plegamiento de la presente
invención resulta en un producto altamente homogéneo y es aplicable,
solamente con modificaciones menores, a cualquier polipéptido que
se produce mediante síntesis química en fase sólida como el
derivado de cisteína tio-t-butilo.
Además, el procedimiento de conformidad con la invención tiene
numerosas ventajas adicionales sobre el procedimiento de la técnica
precedente, al emplear formas de politiol precursor, tales como
- los residuos de cisteína de la cadena no están
aquilatados durante la escisión acidolítica del
polipéptido-resina;
- tanto la sobreoxidación de la cisteína hacia
ácido sulfúrico como la oxidación lleva a que no ocurra la
formación de puente disulfuro intermolecular;
- se evita el riesgo de derivación del anillo
indol de Trp por mercaptoetanol, el cual es necesario para eliminar
los iones Hg contaminantes derivados a partir del desbloqueo de Acm
con Hg (AcO)2. De hecho el tiolato de cisteína en la mezcla
para plegamiento de la presente invención no modifica el Trp del
todo;
- los residuos Met, Trp y Tyr sensibles a
oxidación no se modifican durante el plegamiento;
- los costos de producción de los productos
finales de plegamiento generalmente son más bajos en comparación
con aquellos que emplean polipéptidos politioles y reguladores de pH
tipo redox.
Será evidente a aquellos expertos en la técnica
que, a pesar de que las proteínas blanco generalmente se preparan
con un elevado rendimiento al utilizar el procedimiento de la
presente invención, en algunos casos, por ejemplo en el caso de las
proteínas complejas con múltiples enlaces disulfuro, una cierta
población de formas intermediarias que no se ha desarrollado
completamente hacia la estructura nativa (especies plegadas de
manera errónea) puede permanecer en la solución en equilibrio. Las
especies plegadas de manera errónea pueden separarse fácilmente a
partir de las especies correctamente plegadas mediante
RP-HPLC y someterse de nuevo a las condiciones para
plegamiento de la presente invención para incrementar el rendimiento
general del procedimiento.
De conformidad con la invención, el término
polipéptido se refiere un polímero de aminoácidos que se unen
mediante enlaces amida. El término proteína se refiere a las
especies polipeptídicas en su forma tridimensional, como ocurren en
las células y fluidos biológicos de los organismos vivos. Las
proteínas pueden consistir por ejemplo de cadenas polipeptídicas
con un solo plegamiento o pueden ser estructuras complejas que
consisten de cadenas polipeptídicas con múltiples plegamientos.
Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar
la presente invención y no se pretende que limiten la invención más
allá de las limitaciones establecidas en las reivindicaciones.
La figura 1 muestra el perfil de HPLC antes de
la remoción de S-t-Butilo y del
plegamiento de hu-I-309 (ejemplo
4).
La figura 2 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto de la figura 1.
La figura 3 muestra el perfil de HPLC de
hu-I-309 desprotegida, plegada
(ejemplo 4), que demuestra un tiempo de retención más corto.
La figura 4 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto de la figura 3.
La figura 5 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto ilustrado en la figura 3, después
del tratamiento con NEM. No se observó ningún cambio en la masa en
comparación con la figura 4, que indica la ausencia de grupos -SH
libres.
La figura 6 es una gráfica de la comparación
entre la actividad biológica de la I-309
recombinante y la I-309 sintética, plegada de la
presente invención. La actividad biológica se evaluó mediante la
unión de la quimiocina, marcada con 125I, a los linfocitos de
humano.
La figura 7 muestra el perfil analítico del HPLC
de la proteína del ejemplo 5 después del plegamiento.
La figura 8 muestra el perfil preparativo de
HPLC de la proteína plegada del ejemplo 5.
La figura 9 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto purificado del ejemplo 5, que
demuestra el peso molecular esperado.
La figura 10 muestra el perfil de HPLC del
polipéptido del ejemplo 6 antes de la remoción de
S-t-Butilo y del plegamiento.
La figura 11 muestra el resultado de la
determinación de masa del polipéptido de la figura 10 (M=H).
La figura 12 muestra el perfil de HPLC de la
proteína del ejemplo 6 después del plegamiento, que demuestra un
tiempo de retención más corto.
La figura 13 muestra el resultado de la
determinación de masa de la proteína de la figura 12 (M=H), que
demuestra el peso molecular esperado.
Ejemplo
1
El derivado de quimiocina de 71 residuos de
aminoácidos se ensambla en un sintetizador peptídico 433 A (Perkin
Elmer/ABI) que utiliza química de Fmoc/t-Bu y una
resina basada en poliestireno funcionalizada con el enlazador ácido
lábil ácido hidroximetilfenoxiacético (resina de Wang) en la cual
Fmoc-Ser (t-Bu) se une mediante una
esterificación catalizada por DMAP
(4-dimetilaminopiridina). El grado de sustitución
fue de 0.57 mmoles/g. La síntesis se condujo a una escala de 0.27
mmoles que utiliza un exceso de cinco veces de
Fmoc-aminoácidos y reactivos activadores de DCI
(N,N'-diisopropilcarbodiimida)/HOBt
(1-hidroxibenzotriazol) en DMF. El tiempo de
acoplamiento fue de aproximadamente 60 minutos con un monitoreo
espectrofotométrico de desprotección de Fmoc.
Los cuatro tioles de cisteína se protegen con
grupos S-t-Butilo y se utiliza un
esquema de protección máximo para todas las otras cadenas
laterales: Ser (t-Bu), Thr (t-Bu),
Tyr (t-Bu), Asp
(O-t-bu), Glu
(O-t-Bu), Lys (Boc), Tro (Boc), Asn
(Trt), Gln (Trt) y Arg (Pmc). Después de cada acoplamiento, se lleva
a cabo el encasquetamiento con anhídrido acético y DIEA en DMF.
El polipéptido-resina resultante
se trata a temperatura ambiente con una mezcla preparada
recientemente de
TFA/agua/TIS (triisopropilsilano)/fenol (78:5:12:5), v/v/v/p, 10 ml/g de resina) por 2.5-3.0 h. El derivado polipeptídico escindido se precipita mediante filtración directa de la mezcla escindida en éter de metil-t-butilo frío (MTBE) y el precipitado se separa mediante centrifugación, se lava dos veces con éter y se seca en aire.
TFA/agua/TIS (triisopropilsilano)/fenol (78:5:12:5), v/v/v/p, 10 ml/g de resina) por 2.5-3.0 h. El derivado polipeptídico escindido se precipita mediante filtración directa de la mezcla escindida en éter de metil-t-butilo frío (MTBE) y el precipitado se separa mediante centrifugación, se lava dos veces con éter y se seca en aire.
El producto sin purificar se disuelve luego en
ácido acético diluido, se liofiliza, redisuelve en ácido acético al
50% y se aplica a una columna de Sephadex G-50
(70x25 cm) que utiliza ácido acético al 50% como la fase móvil. Las
fracciones colectadas se analizan mediante espectrometría de masa
MALDI-TOF y aquellas que contienen el derivado
polipeptídico deseado (PM 8,436.9 Da) se agrupan y liofilizan
después de su dilución con agua.
Las fracciones agrupadas se disuelven de nuevo
en ácido acético al 50% y se purifican adicionalmente mediante la
carga en una columna C4 Vydac semipreparativa de 250 x 10 mm. Las
muestras se eluyen a una velocidad de flujo de 3 ml/min con un
gradiente lineal de 20-80% de B en 60 minutos,
mientras que B fue TFA al 0.1% en acetonitrilo y A fue TFA al 0.1%
en agua. La detección se hace a 280 nm y solamente las fracciones
que contienen el polipéptido blanco se agrupan y se liofilizan
antes del plegamiento.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El plegamiento del derivado de quimiocina
purificado mediante RP-HPLC se lleva a cabo mediante
la disolución inicial de 10 mg del producto en 1 mg de GnHCl 6M,
Na_{2}HPO_{4} 0.1 M y Tris 10M a pH = 8.0 a temperatura
ambiente. Después de 20 minutos, la solución se diluye mediante la
adición de 10 ml de agua a la concentración final de GnHCl 0.6 M,
Na_{2}HPO_{4} 10 mM, Tris 1 mM, pH = 7.2 y de una concentración
del péptido de 1 mg/ml. El plegamiento se inicia mediante la
adición de cisteína a una concentración de aproximadamente 20 mM
(aproximadamente un exceso molar de 100 veces con respecto a la
concentración del péptido) y gradualmente al incrementar la
temperatura a 37ºC.
La reacción para plegamiento, que ocurre a la
temperatura constante de 37ºC en aire, se monitorea mediante
análisis de RP-HPLC de alícuotas de 25 microlitros
de solución eliminatoria de ácido con ácido acético en un módulo de
separación Waters 2690 equipado con un detector en serie de
fotodiodo Waters 996, al utilizar una columna analítica C4 de Vydac
y un gradiente de acetonitrilo del 20-60% en TFA
0.1%/agua en 40 minutos con una velocidad de flujo de 1.0 ml/min.
Se recolecta 1 microlitro de cada pico de HPLC (que corresponde a
los intermediarios de plegamiento de la reacción del intercambio
tiol - disulfuro), se mezcla con 1 microlitro de una solución
saturada de ácido sinapínico en acetonitrilo 1:2/ TFA al 1% en agua,
se seca bajo vacío y se analiza mediante espectrometría de masa
MALDI-TOF, que utiliza un espectrómetro
Voyager-DE (Perseptive Biosystems, Framingham, MA)
equipado con un láser de nitrógeno. 78% del polipéptido plegado se
formó después de 24 h. El pico cuyo PM corresponde al del producto
plegado se verifica adicionalmente mediante reacción con
N-etilmaleimida (NEM) para detectar la presencia de
grupos tiol líderes (+125 Da para cada SH).
La actividad biológica de
hu-TARC obtenida por la metodología de la presente
invención se lleva a cabo de conformidad con el método de Imai (T.
Imai et al., J. Biol. Chem., 271, 21514, 1996).
Las líneas de células T de humano, Hut78,
Hut102, y Jurkat, así como monocitos, neutrófilos y linfocitos
recién extraídos se evaluaron por su migración a través de un
filtro de policarbonato en respuesta a TARC. No se produjo ninguna
respuesta quimiotáctica en monocitos o neutrófilos, ni por TARC
preparada mediante síntesis química ni por TARC recombinante. En
las líneas de células T Hut78 y Hut102, la TARC sintética así como
la TARC recombinante induce migración con una curva típica en forma
de campana con un efecto máximo a 100 ng/ml.
Ejemplo
2
La síntesis, purificación y plegamiento de
Cys10, 34, 50 (S-t-Bu)
hu-TARC y derivados de Cys11, 34, 50
(S-t-Bu)-hu-TARC
ha sido conducida en las mismas condiciones adoptadas para Cys10,
11, 34, 50 (S-t-Bu)
hu-TARC (ejemplo 1), la única diferencia es la
protección Trt en Cys10 y Cys11, respectivamente, la cual se remueve
de manera concomitante para escindir los precursores polipeptídicos
a partir de la resina. Los rendimientos de las quimiocinas finales
plegadas fueron del 80% y del 79%, respectivamente.
Ejemplo
3
La síntesis, purificación y plegamiento del
derivado de Cys34, 50 (S-Bu) hu-TARC
se condujo en las mismas condiciones de los derivados de los
ejemplos 1 y 2, excepto que ambas Cys10 y Cys11 estuvieron
protegidas por Trt, el cual se remueve durante la escisión final de
la resina por TFA. El rendimiento del producto plegado fue de
aproximadamente 75%.
Ejemplo
4
La síntesis de
hu-I-309 que contiene 6 cisteínas
protegidas (S-t-Bu) se conduce a una
escala de 0.12 mmoles en las mismas condiciones que en el ejemplo 1
que utiliza una resina de Wang Fmoc-Lys(Boc)
(grado de sustitución de 0.61 mmoles/g). El
polipéptido-resina resultante se trata como se
describe en el ejemplo 1 y el material purificado por G50 se
purifica adicionalmente mediante carga en una columna C18 de Vydac
de 250 x 10 mm (como se muestra en la figura 1 y 2).
El plegamiento del derivado de quimiocina
purificado por RP-HPLC se lleva a cabo mediante la
disolución de 65 mg del producto en 60 ml de GuHCl 0.6 M, NaHPO4 10
mM y Tris 1 mM a pH 8.0 y al añadir cisteína a una concentración de
100 veces un exceso molar con respecto al péptido. La solución del
polipéptido se deja a 37ºC por 4 días. Después de la acidulación
con TFA el material plegado se aisla mediante
RP-HPLC al utilizar una columna C18 de Vydac de 250
x 10 mm (como se muestra en la figura 3 y 4). La formación completa
de pares de cisteína se verifica mediante espectrometría de masas
después de reacción con N-etilmaleimida (NEM). No se
observa ningún incremento en el PM que indique ausencia de grupos
tiol libres (como se muestra en la figura 5). El rendimiento de la
quimiocina plegada final fue de casi el 25%. La
hu-I-309 sintética, plegada muestra
una actividad biológica equivalente a la proteína recombinante
(figura 6).
\global\parskip1.000000\baselineskip
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C18 250 x 4.6 mm (Vydac# 238TP54)
- Fase móvil:
- A = H_{2}O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm.
Ejemplo
5
La síntesis y purificación de la proteína
303-372 del circumsporozoito Plasmodium vivax
(PvCS) que contiene 4 cisteínas protegidas
(S-t-Bu) se conduce en las mismas
condiciones como en el ejemplo 1.
El plegamiento se lleva a cabo mediante la
adición de 27 mg del péptido en 2.7 ml de GuHCl 6 M en regulador de
pH Tris 0.1 M, pH 8.5. La solución se mezcla por 10 minutos. Luego
se añaden 13.5 ml de EDTA 1 mM, NaCl 0.2 M regulado en su pH a pH
8.8 en regulador de pH de Tris 0.2 M. Finalmente, se añaden 10.8 ml
de cisteína 35 mM en EDTA 1 mM, NaCl 0.2 M regulado en su pH a pH
8.8 en regulador de pH de Tris 0.2 M. La mezcla de reacción se
lleva a 37ºC. La reacción de plegamiento se sigue en un HPLC de fase
reversa hasta su término (3-6 h) (figura 7A) y la
reacción se detiene mediante enfriamiento por 5 minutos a 4ºC
seguido por adición de TFA al 10% a 4ºC para alcanzar una
concentración final de TFA al 1% (3 ml de TFA al 10%). El producto
se purifica subsecuentemente mediante HPLC en fase reversa (figura
8) y se determina la masa del producto final (figura 9). El
rendimiento del producto oxidado final fue del
70-80%.
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C4 250 x 4.6 mm (Vydac# 214TP54)
- Fase móvil:
- A = H_{2}O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm.
Ejemplo
6
Una síntesis y purificación a gran escala de la
proteína del ciscimsporozoito Plasmodium falciparum (PfCS
282-383) que contiene solamente 2 de 4 cisteínas
protegidas (S-t-Bu) se conduce en
las mismas condiciones como en el ejemplo 1 (como se muestra en las
figuras 10 y 11) excepto por lo siguiente.
El plegamiento se lleva a cabo mediante la
disolución de 1.1 g del péptido parcialmente purificado en 1.0 L de
CH3COONH4 0.1 M, pH 8.0, sin adición de cisteína libre al regulador
de pH para plegamiento. La mezcla de reacción se mantiene a 32ºC
durante 18 h. El producto se purifica luego mediante HPLC en fase
reversa (figura 12 y 13). El rendimiento del producto oxidado final
fue de casi el 37%.
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C18 250 x 4.6 mm (Vydac# 238TP54)
- Fase móvil:
- A = H_{2}O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm.
Claims (13)
1. Procedimiento para plegar polipéptidos
sintetizados químicamente, que comprende tratar a un polipéptido
y/o proteína que comprende dos o más residuos de
S-t-butil-tio-cisteína
con un agente reductor en un regulador para plegamiento que tiene
un pH comprendido entre 7 y 9 y una temperatura comprendida entre
25ºC y 40ºC.
2. Un procedimiento para la preparación de
proteínas activas biológicamente, que comprende
- (a)
- sintetizar químicamente un polipéptido que comprende dos o más residuos de S-t-butil-tio-cisteína;
- (b)
- tratar a este polipéptido con un agente reductor en un regulador para plegamiento que tiene un pH comprendido entre 7 y 9 y una temperatura comprendida entre 25ºC y 40ºC; y
- (c)
- purificar los polipéptidos y/o proteínas plegadas obtenidas.
3. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1 ó 2, donde el agente reductor es cisteína.
4. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1 ó 2 donde el agente reductor es un agente reductor
intramolecular formado por cisteinas libres en las cadenas de
polipéptidos que son generadas desde la cisteina protegida con
grupos de ácido labil en posiciones seleccionadas de la cadena de
polipéptidos que se escinde de la cadena de polipéptido a partir de
la resina de pH ácido.
5. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1-4, donde el regulador para
plegamiento comprende una o más sales caotrópicas.
6. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 5, donde las sales caotrópicas se eligen a partir
del grupo que consiste en cloruro de guanidinio y urea.
7. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 4 - 6, donde las sales caotrópicas en el regulador
para plegamiento están presentes en una concentración de 0.1- 1
M.
8. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1 - 7, donde el pH se encuentra comprendido entre 7
y 8.5.
9. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1 - 8, donde la temperatura se encuentra comprendida
entre 27º y 38ºC.
10. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 9, donde la temperatura es de aproximadamente
37ºC.
11. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 2, que comprende los pasos de
- (a)
- ensamblar un polipéptido S-t-butil-tio cisteína sobre un soporte polimérico insoluble mediante elongación de cadena paso a paso;
- (b)
- escindir la cadena polipeptídica de S-t-butil-tio cisteína a partir del soporte mediante acidolisis;
- (c)
- purificar el polipéptido S-t-butil-tio cisteína obtenido;
- (d)
- plegar el polipéptido S-t-butil-tio cisteína purificado mediante el tratamiento de estos derivados de polipéptido con un exceso molar de cisteína en un regulador de pH para plegamiento que comprende una sal caotrópica y que tiene un pH alcalino y una temperatura de aproximadamente 37ºC; y
- (e)
- purificar las proteínas plegadas obtenidas mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa.
12. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 11, donde la sal caotrópica es cloruro de
guanidinio.
13. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 11 o 12, donde el soporte polimérico es una resina
basada en poliamida o poliestireno funcionalizada con el aglutinante
de ácido lábil ácido hidroximetilfenoxiacético.
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