ES2263637T3

ES2263637T3 - Hpv-e7 para el tratamiento del papilomavirus humano.

Info

Publication number: ES2263637T3
Application number: ES01950461T
Authority: ES
Inventors: John Neefe; Stephen Goldstone; Mark Winnett; Marvin Siegel; Leslie Boux
Original assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Current assignee: Stressgen Biotechnologies Corp
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2021-06-26
Also published as: EP1296711A2; US20020110566A1; PL359930A1; KR20080075560A; DE60119734T2; PT1296711E; HUP0301308A2; MXPA02012858A; SK18362002A3; KR20030025939A; EP1296711B1; RU2282461C2; US20040235741A1; WO2002000242A8; US7211411B2; BR0111956A; NO20026044D0; US20080063661A1; DE60119734D1; NZ523408A

Abstract

El uso de una proteína de fusión que comprende (1) una proteína de choque térmico (Hsp) o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) un antígeno del papilomavirus humano (HPV) en el que dicho antígeno de HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la papilomatosis respiratoria recurrente en un sujeto identificado como que tiene la papilomatosis respiratoria recurrente.

Description

HPV-E7 para el tratamiento del papilomavirus humano.

Campo de la invención

La invención se refiere a terapias para las infecciones del virus del papiloma humano.

Antecedentes de la invención

Es habitual la infección con el virus del papiloma humano (HPV). El HPV se puede transmitir por vía sexual, y se estima que el 20-80% de los seres adultos sexualmente activos ha sido infectado. Aunque la mayoría de las infecciones son asintomáticas, la infección puede conducir al desarrollo de verrugas genitales (que tienen una incidencia de aproximadamente un 1-5% entre adultos) y al cáncer del tracto anogenital. Otro tipo de cáncer, el cáncer cervical, está fuertemente asociado con el HPV (Frazer, Genitourin. Med. 72: 398-403, 1996). Los tipos 6, 11, 16, 18, 31, y 33 del HPV están asociados a menudo con un aumento del riesgo de cáncer, siendo detectados los tipos 16 y/o 18 en más del 90% de los carcinomas cervicales (van Driel y col., Arzn. Med. 28: 471-477, 1996). Los tipos 6 y 11 están también asociados con las verrugas anogenitales. Para revisiones acerca de los virus del papiloma y sus patologías asociadas, véase Shah y col., "Capitulo 66: Papillomaviruses, "En: Virology, 3ª Edición, Fields y col., Eds., Raven Press, Philadelphia, pp 2077-2109, 1996, y zur Hausen, J. Natl. CancerInst. 92: 690-698, 2000.

El Documento WO 98/04706 describe polipéptidos y agregados de polipéptidos que comprenden antígenos derivados de papiloma, y las composiciones de los mismos y su uso, por ejemplo, para coadyuvantes para las respuestas inmunógenas y de vacunas en la estimulación de las respuestas inmunes específicas de HPV. Roden y col., Virology 270: 254-257 (2000) describen la vacunación con partículas similares a virus, que comprenden ambos tipos genitales L1 y L2 de los HPV 6, 16 y 18, y observan la inducción de los anticuerpos neutralizantes específicos del tipo. Kawana y col., J. virol. 73: 6188-6190 (1999) describen un epítopo neutralizante en la proteína de cápsida menor L2 de los tipos de HPV 16 y 6.

No existe en la actualidad un medio seguro y efectivo para tratar o evitar las verrugas o las enfermedades descritas anteriormente para que se dirijan al sistema inmune. Se han impedido los esfuerzos para desarrollar dichas terapias por diversas razones, una de las cuales es el dogma que los antígenos procedentes de un tipo de HPV único estimulan una respuesta inmunoespecífica limitada del tipo. En consecuencia, se ha sugerido que es necesario un cocktail que contenga antígenos procedentes de HPV de varios tipos diferentes para una terapia de HPV ampliamente efectiva (Caine y col., Science 288: 1753, 2000).

Resumen de la invención

La presente invención se basa en parte, en el descubrimiento que se puede usar una proteína de fusión que comprende una proteína de choque térmico o un fragmento inmunoestimulador de la misma para tratar una enfermedad o afección que esté producida por la infección con otro tipo de HPV. Por ejemplo un antígeno de HPV de tipo 16, fusionado con una proteína bacteriana de choque térmico (hsp), fue efectivo en el tratamiento de verrugas anogenitales humanas producidas por tipos de HPV diferentes del tipo 16 (por ejemplo, tipos de HPV 6 y 11). Este resultado soporta do aseveraciones: (1) que las verrugas se pueden tratar con una proteína de HPV y (2) que los agentes terapéuticos apuntados a HPV no necesitan contener los antígenos de la proteína de diferentes tipos de HPV con el fin de ser ampliamente efectivos.

De acuerdo con esto, la invención presenta el uso de una proteína de fusión comprendiendo (1) una hsp, o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) una proteína de HPV en la que dicha proteína de HPV está constituida por una proteína E7 de, por ejemplo, el tipo 16 de HPV o un fragmento antigénico del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una verruga en un sujeto. Estos componentes se pueden denominar en el presente documento como "componente (1)" y "componente (2)", de manera respectiva. La hsp (o el fragmento inmunoestimulador de la misma) y la proteína HPV (o el fragmento antigénico de la misma) se pueden combinar de manera simple en la misma preparación mediante fusión (es decir, se puede usar una proteína de fusión que tenga los componentes descritos en el presente documento o una molécula de ácido nucleico que la codifique). Cuando se fusionan, el componente (1) y el componente (2) podrían ser adecuados para administrarse de manera simultánea. El uso descrito anteriormente puede incluir una etapa en la se identifica una verruga que un sujeto tiene, o que es sospechoso de tener, (en el contexto del tratamiento del sujeto, se podría hacer la identificación antes que comience la administración del agente terapéutico). Los médicos y otras personas normalmente expertas en la técnica son completamente capaces de identificar dichos sujetos.

Los usos de la invención son también adecuados para evitar una verruga, en cuyo caso se identifica un sujeto que lo desee, o que podría beneficiarse de la prevención de la verruga (más bien que un sujeto que ya tiene una
verruga).

La invención también presenta los usos de una proteína de fusión que comprenden (1) una hsp, o un fragmento inmunoestimulador da la misma, y (2) una proteína de un HPV de un segundo tipo en el que dicha proteína de un HPV está constituida por la proteína E7, por ejemplo, el tipo 16 o un fragmento antigénico del mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o afección producida por una infección con un HPV de un primer tipo (por ejemplo, tipo 5, 6, 11, 18, 31, 33, 35, 45, 54, 60, o 70).

Esto es, el HPV del "primer tipo" y el HPV del "segundo tipo" son diferentes uno respecto del otro; hay dos tipos diferentes de HPV. Se pueden combinar de manera simple la hsp (o el fragmento inmunoestimulador de la misma) y la proteína HPV (o el fragmento antigénico de la misma) en la misma preparación mediante fusión (es decir, se puede administrar una proteína de fusión que tenga los componentes descritos en el presente documento o una molécula de ácido nucleico que la codifique). Cuando se fusionan, el componente (1) y el componente (2) podrían ser adecuados para administrarse de manera simultánea. Aquí de nuevo, el uso puede incluir una etapa en la que se identifica un sujeto que tiene, o es sospechoso de tener, una infección por HPV (o una enfermedad o afección asociada con ella).

Cuando a un sujeto que está infectado con un primer tipo de HPV se le suministra una composición que incluye un HPV de un segundo tipo, puede llevarse a cabo el uso antes que se caracterice una infección por HPV, antes que se manifieste, o antes que se produzca (es decir, no se necesita conocer el tipo particular de HPV en sujeto que se ha infectado con, o con el que se infectará, antes que pueda comenzar el tratamiento o profilaxis). Cuando los usos son preventivos, pueden incluir una etapa en la que se identifica un sujeto que desee, o que podría beneficiarse de, la prevención de una infección HPV.

Las composiciones descritas en el presente documento son adecuadas para ser administradas en cantidades que son suficientes para tratar la verruga (como, por ejemplo, reduciendo el tamaño o alterando la forma de la verruga, o por mejoramiento de un síntoma asociado con una verruga (por ejemplo, el dolor asociado a menudo con una verruga plantar); cuando un sujeto tiene más de una verruga, se puede llevar a cabo el tratamiento reduciendo el número de verrugas). De manera similar, las composiciones descritas en el presente documento son adecuadas para administrarse en cantidades que son suficientes para tratar la enfermedad (por ejemplo, cáncer (tal como cáncer cervical o cáncer anal) u otra afección (por ejemplo, displasia (tal como displasia cervical o anal)) que se producen por, o se asocian con una infección por HPV. Aunque las verrugas se mencionan de manera separada anteriormente, las verrugas constituyen también una afección producida por o asociada con el HPV. Los médicos y otras personas normalmente expertas en la técnica reconocen como "tratamiento" efectivo de una verruga o una enfermedad o afección asociada con HPV cuando existe una disminución en un efecto fisiológico indeseable asociado con la verruga o la enfermedad o afección. Las manifestaciones clínicas y fisiológicas de una verruga, así como aquellas enfermedades o afecciones asociadas con una infección por HPV, se describen en, por ejemplo, Fauci y col., Harrison's Principles of Internal Medicine, 14ª Edición, McGraw-Hill Press, Nueva Cork, pp 302-303 y 1098-1100, 1998.

Los "sujetos" que se pueden beneficiar de los procedimientos descritos en el presente documento son aquellos que se pueden infectar por los virus del papiloma (por ejemplo, mamíferos tales como seres humanos, ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, y cabras), y animales domésticos (por ejemplo, gatos y perros)). La verruga puede ser una que se produce en los genitales, piel, u órganos internos del sujeto (tales como las verrugas que aparecen en las cuerdas vocales en la papilomatosis respiratoria recurrente (RRP, conocida también como papilomatosis laringeal juvenil (JLP) o ataque RRP en adultos)).

La invención incluye de manera adicional el uso de una o más de las composiciones descritas en el presente documento (que incluyen aquellas que contienen proteínas de fusión, o las moléculas de ácido nucleico que las codifican) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del sujeto que tiene verrugas o una enfermedad o afecciones asociadas con (o producidas por) una infección por HPV, de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.

Un "fragmento antigénico" de una proteína (por ejemplo, una proteína de HPV) es cualquier porción de la proteína que, cuando se administra en forma de una composición farmacéutica de acuerdo con los usos descritos en el presente documento, desencadena en un sujeto una respuesta inmune que es específica del fragmento o específica para la proteína de la cual se obtuvo el fragmento. La respuesta inmune puede ser una respuesta humoral o mediada por células. Por ejemplo, un fragmento antigénico puede ser un antígeno del péptido HLA de clase I, tal como se describe a continuación. Una persona normalmente experta en la técnica reconocerá que se puede generar la respuesta inmune deseada en el contexto de la presente invención no solo mediante proteínas intactas y fragmentos de las mismas, sino también mediante proteínas mutantes (por ejemplo, los que contiene una o más adiciones, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos) o delecciones en su secuencia de aminoácidos). Se pueden fabricar fácilmente antígenos de HPV mutantes y ensayarse para su capacidad de trabajar en el contexto de la presente invención.

Un fragmento "inmunoestimulador" de una proteína (por ejemplo, una hsp) es cualquier porción de la proteína que, cuando se administra en forma de una composición farmacéutica de acuerdo con los usos descritos en el presente documento, desencadena una respuesta inmune por un antígeno. Por ejemplo, si se desencadena la respuesta inmune con una proteína HPV cuando se administra la proteína HPV en forma de una composición farmacéutica con (por ejemplo, fusionada a) un fragmento de una hsp, este fragmento es un fragmento inmunoestimulador de una hsp. Una persona normalmente experta en la técnica reconocerá que se puede desencadenar también la respuesta inmune por los mutantes hsps (por ejemplo, los hsps que contienen una o más adiciones, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos) o delecciones en la secuencia de aminoácidos). Se pueden fabricar y ensayar fácilmente los mutantes hsps dada su capacidad para desencadenar una respuesta inmune en un antígeno de
HPV.

Los usos de la invención proporcionan un medio eficiente de: (1) tratar o evitar verrugas y (2) tratar o evitar una enfermedad o afección producida por (o asociada con) una infección con un tipo de HPV con (es decir, usando) una composición que contenga una proteína E7 de HPV u otro tipo. Consecuentemente, se puede usar en muchos, sino en la mayor parte de sujetos una composición que contenga un antígeno de HPV que este constituido por una proteína E7 de HPV, indiferente del tipo de HPV con que se hayan infectado (o con que se puedan infectar a continuación). Es sorprendente que las composiciones con HPV sean efectivas en estas circunstancias (es decir, circunstancias que requieren reactividad cruzada). Se ha considerado que los antígenos de HPV de un tipo no pueden desencadenar una respuesta inmune efectiva frente a otro tipo. A partir de la siguiente descripción detallada, y también a partir de las reivindicaciones, serán aparentes otras características o ventajas de la presente invención.

Descripción detallada

La invención se refiere a agentes terapéuticos basados en HPV ampliamente efectivos que comprenden una proteína hsp y una HPV (por ejemplo, un antígeno de proteína) en los que dicha proteína de HPV está constituida por una proteína E7 e HPV. Sin limitar la invención a los usos en los que los agentes terapéuticos basados en HPV ejercen su efecto a través de un mecanismo particular, se consideran los agentes para producir una respuesta inmune que mejore las verrugas y otras afecciones (por ejemplo, displasia) y enfermedades (por ejemplo, cáncer) asociadas con las infecciones por HIV. Las composiciones que contienen una proteína E7 de HPV o una de tipo HPV son útiles en el tratamiento o prevención de las verrugas u otras enfermedades o afecciones asociadas con HPV que se producen por una infección por HPV U otro tipo (es decir, uno diferente). Se describen a continuación diversos materiales y procedimientos adecuados para uso en conexión con la invención.

Preparación de las proteínas de fusión

Se conocen y están disponibles para aquellas personas normalmente expertas en la técnica las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas hsp y HPV. De esta manera, se pueden preparar fácilmente los constructos de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de fusión útiles en los usos de la invención usando procedimientos de rutina. Se pueden encontrar ejemplos de las secuencias de ácido nucleico que codifican una hsp fusionada de manera opcional con un antígeno (por ejemplo, un antígeno de HPV) en las Publicaciones Internacionales N^{os} WO 89/12455, WO 94/29459, WO 98/23735, y WO 99/07860. Se describen a continuación de manera adicional los procedimientos por los que las proteínas, que incluyen proteínas de fusión, se pueden expresar y purificar.

Sin tener en cuenta la configuración final de la composición que se use para la preparación de una composición farmacéutica que es adecuada para la administración, el componente (1) y el componente (2) pueden incluir lo siguiente.

Antígenos de la proteína HPV

Cualquier antígeno E7 de HPV es adecuado para uso en las composiciones (por ejemplo, las proteínas de fusión descritas en el presente documento) de la presente invención.

Hsps

Se han asilado, clonado, y caracterizado una variedad de hsps a partir de diversas series de organismos (Mizzen, Biotherapy 10:173-189, 1998; tal como se usa en el presente documento, el término "proteína(s) de choque térmico" o su abreviatura (hsp(s) es sinónimo con, o abarca, las proteínas denominadas como "proteínas de estrés"). Las hsp inmunoestimuladoras, o fragmentos inmunoestimuladores de las mismas, son adecuadas para uso en las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, como parte de un polipéptido de fusión) Hsp70, hsp60, hsp20-30, y hsp10 están entre los principales determinantes reconocidos para las respuestas inmunes del huésped a la infección por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. De manera adicional, se encontró que hsp65 del Bacilo de Calmette Guerin (BCG), una cepa de Mycobacterium Bovis, era un agente inmunoestimulador efectivo, tal como se describe en los ejemplos a continuación.

Son bien conocidas en la técnica las familias de los genes hsp y hsps, cualquiera de las cuales se pueden usar tal como se describe en el presente documento para el componente (1). Estas incluyen, por ejemplo, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, Hsp70, Hsp60, TF55, Hsp40, FKBPs, ciclofilinas, Hsp20-30, ClpP, GrpE, Hsp10, ubiquitina, calnexina y disulfuro isomerasas de la proteína. Véase, por ejemplo, Macario, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70, 1995; Parsell y col., Rev. Genet. 27:437-496, 1993; y la Patente de los Estados Unidos Nº 5.232.833. La hsp puede ser, pero no se limita a, la hsp de un mamífero, de una bacteria, o de una micobacteria.

La Grp170 (para la proteína regulada con glucosa) es un ejemplo de una hsp de la familia de la hsp100-200. La Grp170 reside en el lumen del retículo endoplásmico, en el compartimento pre-Golgi, y puede jugar un papel en el plegado y ensamblaje de la inmunoglobulina.

Entre los ejemplos de hsps de la familia de la hsp100 se incluyen Hps110 de mamíferos, Hsp104 de levaduras y la has hsps de E. coli ClpA, Club, ClpC, ClpX y ClpY.

Entre los ejemplos de hsps de la familia hsp90 se incluyen HtpG en E. coli, Hsp83 y Hsc83 en levaduras, y Hsp90alfa, Hsp90beta, y Grp94 en seres humanos. Hsp90 enlaza grupos de proteínas que son típicamente moléculas reguladoras celulares, tales como los receptores de las hormonas esteroides (por ejemplo, receptores glucocorticoides, del estrógeno, de la progesterona, y de la testosterona), factores de transcripción y proteínas quinasas que juegan un papel en los mecanismos de transducción de la señal. Las proteínas Hsp90 participan también en la formación de grandes complejos de proteínas abundantes, que incluyen otras proteínas de estrés.

Lon es una proteasa tetramérica dependiente de ATP que degrada las proteínas no nativas en E. coli.

Entre los ejemplos de hsps de la familia hsp70 incluyen Hsp72 y Hsc73 de células de mamíferos, el DnaK de bacterias o micobacterias tales como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, y Mycobacterium Bovis (tales como el Bacilo de Calmette Guerin; denominado en el presente documento como hsp71), el DnaK de E. coli, levaduras, y otros procariotas, y BiP y Grp78. Hsp70 es capaz de enlazar de manera específica el ATP así como polipéptidos y péptidos desplegados; hsp70 participa en el plegamiento y desplegamiento de las proteínas así como en el montaje y desmontaje de los complejos de proteínas.

Un ejemplo de una hsp de la familia Hsp60 es la Hsp65 de micobacteria. Se conoce comúnmente también la Hsp60 como GroEL. Hsp60 forma grandes complejos oligoméricos y parece jugar un papel clave en el plegado de la proteína. Las Hsp60 homólogas están presentes en la mitocondria y los cloroplastos eucariotas.

Entre los ejemplos de hsps de la familia TF55 se incluyen Tcpl, TriC, y el termosoma. Estas proteínas se producen de manera típica en el citoplasma de los eucariotas y algunas arqueobacterias, y forman anillo multi miembros, promoviendo el plegado de la proteína. Son débilmente homólogos de la Hsp60.

Entre los ejemplos de hsps de la familia Hsp40 se incluyen DnaJ de eucariotas tales como E. coli y micobacteria y HSJ1, HDJ1, y Hsp40. Hsp40 como acompañante molecular en el plegado de la proteína, termotolerancia y replicación del ADN, entre otras actividades celulares.

Entre los ejemplos de FKBP se incluyen FKBP12, FKBP13, FKBP25, y FKBP59, Fprl y Nepl. Estas proteínas tienen normalmente actividad de la peptidil prolil isomerasa e interactúan con inmunosupresores tales como FK506 y rapamicina. Las proteínas se encuentran normalmente en el citoplasma y el retículo endoplásmico.

Entre los ejemplos de ciclofilinas se incluyen ciclofilinas A, B, y C. Estas proteínas tienen actividad de la peptidil prolil isomerasa e interactúan con los inmunosupresores de la ciclosporina A.

La Hsp20-30 se denomina también como Hsp pequeña. Hsp20-30 se encuentra normalmente en complejos homooligoméricos grandes o posiblemente en complejos heterooligoméricos. Un organismo o tipo celular puede expresar diversos tipos diferentes de Hsps pequeña. Hsp20-30 interactúa con las estructuras citoesqueléticas y puede jugar un papel regulador en la polimerización / despolimerización de la actina. Hsp20-30 se desfosforila rápidamente tras el estrés o exposición de las células restantes a los factores de crecimiento. Los Hsp20-30 homólogos incluyen alfa-cristalina.

La ClpP es una proteasa de E. coli implicada en la degradación de las proteínas anormales.

Los homólogos de ClpP se encuentran en los cloroplastos. ClpP forma un complejo heterooligomérico con ClpA.

La GrpE es una proteína de E. coli de aproximadamente 20 kDa que está implicada en el rescate de las proteínas dañadas por estrés así como en la degradación de las proteínas dañadas. GrpE juega un papel en la regulación de la expresión génica del estrés en E. coli.

Entre los ejemplos de Hsp10 se incluyen GroES y Cpn 10. Hsp10 se encuentra en E. coli y en la mitocondria y los cloroplastos de las células eucariotas Hsp10 forma un anillo de siete miembros que se asocia con los oligómeros de Hsp60. Hsp10 está implicada también en el plegado de la proteína.

Se ha encontrado que la ubiquitina enlaza proteínas en coordinación con la eliminación proteolítica de las proteínas mediante las proteínas citosólicas dependientes de ATP.

Se pueden obtener las proteínas de estrés útiles en la presente invención a partir de enterobacterias (por ejemplo., E. coli), micobacteria (de manera particular M. leprae, M. tuberculosis, M. vaccae, M. smegmatis, y M. bovis), levaduras, Drosophila, vertebrados (por ejemplo, aves o mamíferos tales como roedores o primates, incluyendo seres humanos).

Expresión y purificación de la proteína

Se pueden producir las proteínas de manera recombinante. De manera más específica las hsps (o fragmentos de las mismas) y los antígenos E7 de HPV (o fragmentos de los mismos), que son adecuados para administrarse en combinación como proteínas de fusión que contienen el componente (1) y el componente (2) que están constituidos por una proteína E7 de HPV o fragmento antigénico de la misma que puede producirse de manera recombinante en bacterias, levaduras, plantas o células de plantas, o animales o células de animales. Por ejemplo, se pueden producir las hsps, los antígenos HPV, y las proteínas de fusión que los contienen mediante transformación (es decir, transfección, transducción, o infección) de una célula huésped con una secuencia de ácido nucleico en un vehículo de expresión adecuado. Los vehículos de expresión adecuados incluyen plásmidos, partículas víricas, y fagos. Para las células de insectos, son adecuados los vehículos de expresión de baculovirus. Se puede integrar el vehículo de expresión total, o una parte del mismo, en el genoma de la célula huésped. En algunas circunstancias, es deseable expresar un vector de expresión inducible, por ejemplo, el Sistema de Expresión Inducible LACSWITCH® (Stratagene; La Jolla, CA).

Aquellas personas expertas en el campo de la biología molecular comprenderán que se puede usar cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para proporcionar proteínas recombinantes (por ejemplo, proteínas de fusión) útiles en los procedimientos descritos en el presente documento. No son críticos para la invención la célula huésped precisa y el vector usados.

Tal como se ha señalado anteriormente, el componente (1), el componente (2) y las proteínas de fusión que los contienen se pueden producir mediante las células de las plantas. Para las células de plantas son adecuados los vectores de expresión vírica (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor y virus del mosaico del tabaco) y los vectores de expresión de plásmidos (por ejemplo, plásmido Ti). Dichas células están disponibles de un amplio intervalo de fuentes (por ejemplo, the American Type Culture Collection, Manassas, VA; véase también, por ejemplo, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1994). Los procedimientos de transformación y la elección del vehículo de expresión dependerán del sistema de huésped seleccionado. Se describen los procedimientos de transformación en, por ejemplo, Ausubel (más arriba). Se pueden escoger los vehículos de expresión entre aquellos proporcionados en, por ejemplo, Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987.

Se pueden cultivar las células huésped que cosechan el vehículo de expresión en un medio nutriente convencional adaptado a las necesidades para la activación o represión del gen escogido, la selección de transformantes o la amplificación de un gen escogido.

Cuando sea apropiado o beneficioso, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la presente invención puede incluir una secuencia señal para la excreción de la proteína de fusión para, por ejemplo, facilitar el aislamiento de la proteína a partir de un cultivo celular. Pueden ser también necesarias las señales de iniciación específica para la traducción eficiente de las secuencias insertadas de ácido nucleico. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En algunos casos, se deberán proporcionar las señales de control traduccional exógeno, que incluyen, tal vez, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación deberá estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control traduccional exógeno y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, naturales o sintéticos. Se puede mejorar la eficiencia de la expresión mediante la inclusión de elementos mejoradores apropiados de la transcripción o traducción (por ejemplo, unos descritos en Bittner y col., Methods in Enzymol. 153:516, 1987).

El componente (1), el componente (2) tal como se describen en el presente documento, y las proteínas de fusión que los contienen pueden ser solubles bajo condiciones fisiológicas normales. De manera adicional, dicha proteínas de fusión pueden incluir una o más proteínas sin relacionar (es decir, una no hsp, no HPV) (en total o en parte) para crear una, al menos, proteína tripartita de fusión. La "tercera" proteína puede ser una que facilite la purificación, detección, o solubilización de la proteína de fusión, o que proporcione alguna función diferente. Por ejemplo, se puede usar el vector de expresión pUR278 (Ruther y col., EMBO J. 2:1791, 1983) para crear las proteínas de fusión lacZ, y se pueden usar los vectores pGEX para expresar los polipéptidos anteriores como proteínas de fusión que contienen la glutatión S-transferasa (GST). De manera general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante la adsorción con perlas de glutatión-agarosa, seguido por la elusión en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o emplazamientos de ruptura del factor Xa de la proteasa de tal manera que se puede liberar el producto de gen diana clonado a partir de la fracción GST. La "tercera" proteína puede ser también una región Fc de la inmunoglobulina. Dicha proteína de fusión puede purificarse fácilmente usando una columna de afinidad. Por supuesto, las proteínas de fusión útiles en los usos de la invención pueden incluir más de un componente (1) y7o más de un componente (2), y los componentes (1) y (2) pueden enlazarse de manera directa o indirecta (por ejemplo, pueden estar presentes entre ellas uno o más residuos de aminoácidos).

Se puede purificar una proteína (por ejemplo, una hsp, un antígeno de HPV o una proteína de fusión que contiene una hsp) utilizando un anticuerpo al cual se enlaza de manera específica la proteína. Una persona normalmente experta en la técnica puede usar procedimientos de purificación basados en la afinidad para purificar proteínas. Véase por ejemplo, Janknecht y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8972, 1981, para la purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en las líneas celulares humanas. En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de la vacuna tal que el marco de lectura abierto de los genes se fusiona traduccionalmente en una marca amino Terminal constituida por seis residuos de histidina. Los extractos de células infectadas con el virus de la vacuna recombinante se cargan sobre columnas de ácido nitriloacético Ni^{2+} -agarosa, y las proteínas marcadas con histidina se eluyen de manera selectiva con tampones que contienen imidazol. Se puede usar el mismo procedimiento para un cultivo bacteriano.

Se pueden producir también las proteínas, entre las que se incluyen las proteínas de fusión (de manera particular aquellas que contienen fragmentos antigénicos cortos) mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

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Una vez aisladas, las proteínas pueden, si se desea, purificarse y/o concentrarse de manera adicional, con el fin de que un procesamiento adicional no perjudique su capacidad para desencadenar una respuesta inmune suficiente para ser efectiva en los procedimientos de la invención. Son bien conocidos en la técnica una variedad de procedimientos para purificar y concentrar las proteínas (véase, por ejemplo., Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work y Burdon, Eds.; Elsevier, 1980), que incluyen la ultracentrifugación y/o la precipitación (por ejemplo, con sulfato de amonio), la microfiltración (por ejemplo, mediante filtros de acetato de celulosa de 0,45 \mum), la ultrafiltración (por ejemplo, con el uso de una membrana dimensionada y la filtración mediante recirculación), la filtración en gel (por ejemplo, columnas rellenas con Sefarosa CL-6B, CL-4B, CL-2B, 6B, 4B o 2B, Sephacryl S-400 o S-300, Superosa 6 o Ultrogel A2, A4, o A6; disponibles todas de Pharmacia Corp.), cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC), y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Secuencias de HPV reactivas cruzadas

Una persona normalmente experta en la técnica puede determinar si se puede usar una composición que contiene un antígeno de HPV en el que dicho antígeno es una proteína E7 de HPV o fragmento antigénico de la misma de un primer tipo para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un sujeto que ha sido infectado con un segundo tipo de HPV. Los ensayos en los cuales s puede basar dicha determinación incluyen ensayos predictivos (por ejemplo, aquellos que emplean modelos de ordenador) y ensayos biológicos (de los cuales uno de los ensayos es para reactividad cruzada). Se pueden usar uno o ambos tipos de ensayos (de manera no sorprendente, se podrían esperar los resultados obtenidos en un ensayo predictivo para ensayarse de manera adicional en un ensayo biológico). Siguen los ejemplos de cada uno.

Se puede ensayar la reactividad cruzada (es decir, la capacidad de una composición que contiene un antígeno de HPV de un tipo en el que dicho antígeno es una proteína E7 de HPV para tratar de manera efectiva un sujeto que se infecta con un HPV de otro tipo, o que tiene una enfermedad o afección asociada con un HPV de otro tipo, usando procedimientos inmunológicos bien establecidos. Se pueden usar, por ejemplo, mediante ingeniería en ratones bi-transgénicos para expresar la región de enlace del antígeno de la molécula I de clase MHC humana y del gen CD8 humano (Lustgarten y col., Human Immunol. 52:109, 1997; Vitiello y col., J. Exp. Med. 173:1007, 1991) para demostrar la inmunoreactividad cruzada.

De manera más específica, se puede usar HLA-A2/CD8 de ratón bi-transgénico (Lustgarten y col, más arriba) para demostrar la reactividad cruzada de los linfocitos T citotóxicos (CTL) elevando la E7 de HPV16 frente a los péptidos derivados de la proteína E7 de HPV6 y 11 usando técnicas inmunológicas estándar (véase, por ejemplo, Coligan y col. Eds., Currents Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, 1999). De manera breve, los ratones se inmunizan de una a tres veces a intervalos de siete a 21 días con la proteína de fusión HspE7 (basándose en las moléculas de la Hsp65 de BCG y la E7 de HPV16). Se suspende la HspE7 en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administra de manera subcutánea en una dosis que oscila entre 1 \mug y 1000 \mug por ratón. Siete días a continuación de la administración final de HspE7, se sacrifican los ratones, se eliminan sus bazos, y se disocia el tejido en una suspensión de células únicas. Se reestimulan los CTL que son específicos para la E7 de HPV mediante la adición de los péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la E7 de HPV16, la E7 de HPV6 y la E7 de HPV11 en el medio de cultivo a una concentración de 1 \muM. Se pueden reestimular las células en, por ejemplo, placas con 6 pocillos que tienen un péptido diferente en cada pocillo. Se pueden usar los péptidos (por ejemplo, los diez péptidos) con la afinidad de enlace por HLA-A2 predicha más alta, tal como se define mediante el algoritmo de ordenador, para cada HPV16, HPV6, y HPV11 (o cualquier otro tipo de HPV; véase Parker y col., J. Immunol. 152:163, 1994; el algoritmo está también disponible en Internet a través de BIMAS (Bioinformatics & Molecular Análisis Section) en el sitio web del National Institutes of Health (con acceso el 26 de Junio de 2001 en http://bimas.dcrt.nih.gov/). De manera adicional, se podrían usar, cuando sean diferentes, los péptidos correspondientes de los otros dos genotipos de HPV (es decir, el péptido 11 - 20 de la E7 de HPV16 y los 11 péptidos 11 - 20 de HPV6).

Tras un período (por ejemplo, una semana) de reestimulación in vitro, se podría medir la actividad de los CTL mediante la lisis de células diana T2 pulsada con los péptidos de enlace HLA-A2 derivados de la E7 de HPV16, la E7 de HPV6 y la E7 de HPV11. De manera adicional, se pueden medir los linfocitos T específicos del antígeno, que reconocen los péptidos de enlace HLA-A2 derivados de la E7 de HPV16, la E7 de HPV6 y la E7 de HPV11, mediante el análisis ELISPOT de las células que secretan IFN-\gamma usando los procedimientos descritos anteriormente (Asal y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145, 2000). Se podrían llevar a cabo estos análisis en ratones transgénicos para otros alelos HLA.

De manera alternativa, se puede medir la capacidad de los CTL, que se induce mediante la inmunización con HspE7, para reaccionar de manera cruzada con los péptidos derivados de las proteínas E7 de HPV6 u 11 en los sujetos HLA-A2 positivos humanos que experimentan terapia para las verrugas genitales usando HspE7. Se pueden aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sujetos (por ejemplo, pacientes humanos) antes del tratamiento y diversos días (por ejemplo, 7 días) después de cada tratamiento con HspE7. Se pueden analizar las células mediante MHC fluorogénica de los complejos de péptidos (tetrámeros, Altman y col., Science 274:94, 1996) o por análisis ELISPOT (Asal y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145, 2000). Se pueden ensayar las células directamente a partir de sangre periférica y siguiendo la reestimulación in vitro tal como se ha descrito por Youde y col. (Cancer Res. 60:365, 2000). Para la reestipulación in vitro se cultivan 2 x 10^{6}/ml de PBMC en RPMII640 con suero AB humano al 10% (RAB) y péptido a una concentración de 10 \mug/ml. Podrían derivarse los péptidos reestimulantes de la E7 de HPV16 y podrían comprender los péptidos (por ejemplo, los diez péptidos) con la afinidad de enlace por HLA-A2 predicha más alta, tal como se define por el algoritmo del ordenador (Parker y col., más arriba). Sobre el Día 4, se añade 1 ml de RAB que contiene 25 unidades / ml de IL-2 a cada pocillo. Sobre el Día 6, se sustituye 1 ml de medio con 1 ml de medio que contiene 10 unidades / ml de IL-2. Sobre el Día 7, se resuspende el PBMC antólogo irradiado (fresco o congelado y posteriormente descongelado) en 3 x 10^{6} células / ml en RAN que contiene 10 \mug/ml de péptido y 3 \mug/ml de microglobulina \beta2. Se dejan adherir las células que presentan antígeno durante dos horas y a continuación se lavan para eliminar las células no adherentes antes de la adición de 1-2 x 10^{6} células efectoras / ml. Sobre el Día 9, se añade un ml de RAB que contiene 25 unidades / ml de IL-2 a cada pocillo. Sobre el Día 13, los contenidos de los pocillos se dividen en placas múltiples y el medio (que contiene 10 unidades / ml de IL-2) se restaura en el volumen original. Se usan la células sobre el Día 14. Se preparan los tetrámeros para el análisis FACS, tal como se ha descrito anteriormente (Altman y col., Science 274:94, 1996). Los péptidos usados para cargar los tetrámeros son péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la molécula E7 de HPV16, HPV6 y HPV11. Se usan los péptidos (por ejemplo, los diez péptidos) con la afinidad de enlace por HLA-A2 predicha más alta, tal como se definen mediante el algoritmo del ordenador (Parker y col., más arriba) para cada HPV16, HPV6 y HPV11. De manera adicional, se usan también cuando son diferentes, los péptidos correspondientes de los otros dos genotipos de HPV (es decir, el péptido 11-20 de la E7 de HPV16 y los 11 péptidos 11-20 de la HPV 6) Se tiñen los PBMC frescos o reestimulados con los tetrámeros del péptido E7 de HPV marcados con PE y los anticuerpos anti-CD8 marcados con FITC y se analizan mediante citometría de flujo, tal como se ha descrito. Se lleva a cabo el análisis ELISPOT de los linfocitos T específicos del antígeno que reconoce los péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la E7 de HPV16, la E7 de HPV6 y la E7 de HPV11 presentes en el PBMC fresco y reestimulado usando los procedimientos descritos anteriormente (Asal y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145, 2000). Es muy probable que estas técnicas se puedan aplicar a los sujetos con otros haplotipos HLA.

De manera adicional, es posible ensayar la capacidad de la PBMC humana derivada de voluntarios sanos HLA-A2 positivos sin tratar anteriormente con HspE7, estimulados in vitro con la proteína HspE7 o los péptidos derivados de la E7 del HPV de tipo 16, para reaccionar de manera cruzada con células pulsadas con los péptidos correspondientes de los otros dos genotipos de HPV (6 y 11). Las células se estimulan y ensayan usando procedimientos comunes en la técnica. De manera breve, se aísla PBMC de sangre periférica, se separan las células adherentes de las células no adherentes, y se cultivan las células adherentes para generar células dendríticas (DC) tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan y col., Eds., John Wiley & Sons, pp 7.32.7-8, 1999). Se criopreservan las células no adherentes en FCS al 90% / DMSO al 10% para uso en un punto posterior en el ensayo.

Para la estimulación, se pulsan las CD con 50 \mug/ml de HspE7 o con 40 \mug/ml del péptido apropiado y 3 \mug/ml de microglobulina \beta_{2} durante 24 horas a 37ºC, CO_{2} (Kawashima y col., Human Inmunol. 59:1, 1998). Los péptidos usados son péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la molécula E7 de HPV16, HPV6 y HPV11. Se usan los péptidos (por ejemplo, los diez péptidos) con la afinidad de enlace por la HLA-A2 predicha más alta, tal como se define por el algoritmo del ordenador (Parker y col., más arriba) para cada HPV16, HPV6 y HPV11. De manera adicional, se podrían usar, cuando son diferentes los péptidos correspondientes de los otros dos tipos de HPV (es decir, el péptido 11-20 de la E7 de HPV16 y los 11 péptidos 11-20 del HPV6). Se aíslan las células CD8^{+} a partir de las células no adherentes antólogas criopreservadas mediante selección positiva usando perlas inmunomagnéticas (Miltenyi Bostec). Las DC cargadas con el péptido / proteína se irradian a 40 rads y se mezclan con las células CD8^{+} autólogas en una relación de 1:20 en, por ejemplo, placas con 48 pocillos que contienen 0,25 x 10^{5} DC y 5 x 10^{5} células CD8^{+} y 10 ng/ml de IL-7 en 0,5 ml de RAB. Sobre los días 7 y 14, las células se reestimulan con APC adherente pulsada con péptidos antólogos (Kawashima y col., Human Immunol. 59:1, 1998). Se alimentan los cultivos cada 2-3 días con 10 U7ml de hIL-2. Se analizan los linfocitos T específicos del péptido E7 de HPV mediante los complejos de péptidos con MHC fluorogénico (tetrámeros, Altman y col., Science 274:94, 1996) o mediante análisis ELISPOT (Asal y col., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145, 2000) tras 7 y 14 días de estimulación in vitro. Para el análisis FACS, se preparan los tetrámeros tal como se ha descrito anteriormente (Altman y col. Science 274:94, 1996). Los péptidos usados para cargar los tetrámeros podrían ser los péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la molécula E7 de HPV16, HPV6 y HPV11, tal como se ha descrito anteriormente. Se tiñen los linfocitos T específicos del péptido con los tetrámeros del péptido E7 de HPV marcados con PE y anticuerpo anti-CD8 marcado con FITC y se analizan mediante citometría de flujo (Youde y col. Cancer Res. 60:365, 2000). Se lleva a cabo el análisis ELISPOT de los linfocitos T específicos del antígeno, que reconocen los péptidos de enlace con HLA-A2 derivados de la E7 de HPV16, la E7 de HPV6 y la E7 de HPV11 usando los procedimientos descritos anteriormente (Asal y col. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:145, 2000). Es probable que pudieran aplicarse estas técnicas a sujetos con otros haplotipos HLA.

Administración de las composiciones

La invención incluye una proteína de fusión que comprende un antígeno de la proteína HPV en el que dicho antígeno de la proteína HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma y una hsp (o un fragmento inmunoestimulador de la misma) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar las afecciones mencionadas en el presente documento. De manera opcional, se pueden suspender estas proteínas en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un diluyente (por ejemplo, PBS) o una solución de bicarbonato (por ejemplo, NaHCO_{3} 0,24 M). Se seleccionan los vehículos útiles sobre la base del modo y ruta de administración y sobre la práctica farmacéutica estándar. Se describen en Remington's Pharmaceutical Science los vehículos y diluyentes farmacéuticamente adecuados, así como las necesidades farmacéuticas para su uso. Se puede incluir también un coadyuvante, por ejemplo, una toxina de cólera, una enterotoxina lábil al calor de Escherichia coli (LT), un liposoma, o un complejo inmunoestimulador (ISCOM).

La(s) proteína(s) (por ejemplo, la proteína de fusión) no necesita ser adecuada para administrarse al sujeto directamente. En cambio, es adecuada para administrarse una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína; siendo expresada la proteína en el sujeto in vivo. El ácido nucleico puede ser una parte de un vector (tal como un vector vírico, por ejemplo, una parte de un genoma del vector vírico), o encapsulado, por ejemplo, en los liposomas. De manera alternativa, el ácido nucleico es adecuado para liberarse como un ácido nucleico desnudo.

Se pueden formular las composiciones en forma de una solución, suspensión, supositorio, comprimido, gránulos, un polvo, una cápsula, pomada, o crema. Como se ha señalado anteriormente se pueden incluir en la preparación de estas composiciones, uno o más vehículos farmacéuticos. Los ejemplos adicionales de vehículos u otros aditivos farmacéuticamente aceptables incluyen solventes (por ejemplo, agua o solución salina fisiológica), agentes solubilizantes (por ejemplo, etanol, polisorbatos, o Cremophor EL®), agentes para devolver la isotonicidad, conservantes, agentes antioxidantes, excipientes (por ejemplo, lactosa, almidón, celulosa cristalina, manitol, maltosa, hidrógeno fosfato d calcio, anhídrido de ácido silícico ligero, o carbonato de calcio), ligantes (por ejemplo, almidón, polivinilpirrolidona, hidroxipropil celulosa, etil celulosa, carboxi metil celulosa, o goma arábiga), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, o aceites endurecidos), o estabilizantes (por ejemplo, lactosa, manitol, maltosa, polisorbatos, macrogeles, o aceites de castor polioxietilén endurecidos). Si es necesario, (o deseado) se pueden añadir glicerina, dimetilacetamida, lactato de sodio, un tensioactivo, hidróxido de sodio, etiléndiamina, etanolamina, bicarbonato de sodio, arginina, meglumina, o trisaminometano. Se pueden usar polímeros biodegradables tales como poli-D,L-láctido-co-glicólido o poliglicólido como una matriz de volumen si se desea la liberación lenta de la composición (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.417.986, 4.675.381, y 4.450.150). Se pueden formar con estos componentes preparaciones farmacéuticas tales como soluciones, comprimidos, gránulos o cápsulas. Si se pretende administrar la composición de manera oral, se pueden añadir aromatizantes y colores.

Las composiciones terapéuticas son adecuadas para administrarse mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, tópica, intraperitoneal, intrapleural, oral, subcutánea, intramuscular, intradermica, sublingual, intraepidérmica, nasal, intrapulmonar (por ejemplo, mediante inhalación), vaginal, o rectal.

La cantidad de la composición administrada dependerá, por ejemplo, de la composición particular, si se administra un coadyuvante con la composición, el tipo de coadyuvante coadmnistrado, el modo y frecuencia de administración, y el efecto deseado (por ejemplo, la protección o tratamiento). Las dosificaciones se determinan de manera rutinaria por aquellas personas normalmente expertas en la técnica en el curo de desarrollo de los fármacos o agentes profilácticos. De manera general, las composiciones de la presente invención son adecuadas para administrarse en cantidades que oscilan entre 1 ng y 1 mg por dosis de humano adulto que e puede usar de manera general. Se repite la administración tanto como sea necesario, ya que se puede determinar por una persona normalmente experta en la técnica. Se puede seguir por ejemplo una dosis de preparación por tres dosis de estímulo a intervalos semanales o mensuales. Se puede proporcionar una dosis de estímulo a las 3 a 12 semanas posteriores, usando la misma formulación. Se pude tomar suero o células T del sujeto para ensayar la respuesta inmune desencadenada por la composición frente al antígeno de HPV incluido en, por ejemplo, la proteína de fusión o la proteína conjugada. Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para ensayar o células T citotóxicas frente a un antígeno específico. Se pueden proporcionar tantos estímulos adicionales como sean necesarios. Variando la cantidad de, por ejemplo, la proteína de fusión en la composición, se puede optimizar el protocolo de inmunización para desencadenar una respuesta inmune
máxima.

Por supuesto, las proteínas descritas en el presente documento son también adecuadas para su liberación administrando a un ácido nucleico, tal como un vector vírico (por ejemplo, un vector retrovírico o adenovírico).

Sin más elaboración, se cree que una persona experta en la técnica puede, basándose en la descripción anterior y en el ejemplo siguiente, utilizar la presente invención en su máxima extensión.

Ejemplo

Se acopló un polipéptido de fusión que contenía la BCG Hp65 de M. Bovis con la proteína E7 del HPV de tipo 16 que se produjo de manera recombinante y se formuló tal como se describe en el Documento WO 99/07860. Hsp65 es un miembro de la familia Hsp60 de las proteínas de estrés. Se hicieron las siguiente observaciones en el curso de un ensayo clínico humano para ensayar la eficacia de este polipéptido de fusión en el tratamiento de las lesiones intraepiteliales escamosas de grado alto (HSIL).

Participaron veintidós pacientes en un ensayo multicentro placebo controlado, doble ciego, aleatorizado de la HspE7 en el tratamiento de HSIL anal. Los pacientes elegibles tenían confirmada la biopsia de HSIL anal y fueron negativos para el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Se tipificaron los pacientes para el HPV usando células obtenidas de una torunda anal, pero no se les requirió tener HPV-16. No se tipificaron las lesiones individuales para HPV. Los pacientes recibieron tres inyecciones subcutáneas de100 \mug de HspE7 o placebo a intervalos mensuales. Se evaluaron para la respuesta al tratamiento mediante frotis Pap anales, anoscopia de alta resolución (HRA) con biopsia, y evaluación médica global Los que no respondieron (es decir, aquellos con HSIL anal persistente) ras 12 o 24 semanas en el ensayo controlado se dejaron entrecruzar en un ensayo de marca abierta en el que recibieron tres inyecciones de 500 \mug de HspE7 a intervalos mensuales. La asignación del tratamiento fue doble ciego en el ensayo placebo controlado y no se ha interrumpido el ciego.

Para determinar el(los) tipo(s) de HPV que infecta(n) a los pacientes se usó un frotis Dacron para recoger los especimenes del ano de los pacientes en la visita para detectar la enfermedad del ensayo placebo controlado aleatorizado, justo antes de la biopsia. Tras el transporte en un Medio de Transporte de Muestras (Digene), se aisló ADN y se usó para determinar el tipo de HPV. De manera breve, se usó MY09/MY11 como primer lote de consenso para amplificar el ADN de HPV mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tras la etapa de amplificación, se emborronaron las muestras sobre una membrana de nylon y se sondaron con oligonucleótidos marcados con biotina específicos para los 29 tipos diferentes de HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 66, 68, 69, 70, 73, AE2, Pap155, y Pap291), más una sonda vertida que contenía los cebadores para los 10 tipos de HPV (2, 13, 34, 42, 57, 62, 64, 67, 72, y W13B). Se puntuaron positivas o negativas las muestras que produjeron un "dot blot" para el tipo de HPV por comparación con los controles estandarizados usando una escala de 5 puntos; fue positiva una puntuación de 1 o mayor.

Para verificar que fue satisfactoria la PCR, se llevó a cabo la amplificación del control de la beta globina y la detección de la sonda para cada muestra. Si la muestra no fue positiva para la presencia de la beta globina, se consideró la etapa de la PCR un fracaso técnico. Si la sonda de consenso no dio como resultado una puntuación de 2 o más, se consideró la muestra "HPV negativa".

En el momento de su entrada en el ensayo de marca abierto, 14 de los 22 pacientes (64%) tenían verrugas anogenitales que habían persistido a lo largo del ensayo doble ciego anterior en el que recibieron tres inyecciones mensuales de 100 \mug de HspE7 o placebo. De estos 14 pacientes, 8 pacientes (57%) fueron peor, 4 paciente (29%) no experimentaron cambio, y 2 pacientes (14%) mejoraron (uno espectacularmente y otro mínimamente) a la vez que se entrecruzaron en el ensayo de marca abierto. Un paciente adicional tenía un condiloma presente al comienzo del ensayo doble ciego que se resolvió antes del inicio del ensayo doble ciego, y se omitió de este análisis, así como los otros siete pacientes que tenían verrugas no detectables durante cualquier ensayo. Los condilomas estuvieron presentes en el interior del canal anorectal en los 14 pacientes (100%) y en la piel perianal así como en 6 de los 14 pacientes (43%). De los 14 pacientes con verrugas al comienzo del ensayo da marca abierto, el centro investigador determinó que era necesaria la ablación quirúrgica para 11 pacientes (79%), la ablación local (por ejemplo, nitrógeno líquido, electrocauterización) era necesaria para 2 pacientes (14%), y el tratamiento tópico (es decir, imiquimod) era necesario para 1 paciente (7%). Estos pacientes eligieron posponer el tratamiento recomendado por el centro investigador, consintiendo en vez de ello en recibir tres inyecciones de 500 \mug de HspE7 a intervalos mensuales en el ensayo de marca abierto.

Un mes después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7, 2 pacientes (14%) no tenían verrugas detectables, 11 pacientes (79%) tenían una reducción en el tamaño o número de verrugas en comparación con su estado tras su entrada en el ensayo de marca abierto, y 1 paciente (7%) experimento un aumento en el tamaño de la verruga (Tabla 1). Durante el tiempo del punto de evaluación primaria del ensayo de marca abierto (4 meses después de la dosis final) un paciente adicional experimentó una mejora de la respuesta de parcial a completa (es decir, sin verrugas visibles), dando un total de tres (21%) respondedores completos (Tabla 1). Ninguno de estos respondedores recayó durante los seis meses de evaluación en el ensayo de marca abierto. Diez pacientes (71%) continuaron presentando mejora con respuesta parcial (es decir, reducción significativa adicional de las verrugas en tamaño con disminución continuada de la extensión del tratamiento necesaria para eliminar las verrugas restantes). El no respondedor (7%) no mejoró durante el final del ensayo de marca abierto.

TABLA 1 Resumen de respuestas para las verrugas anogenitales tras el tratamiento con HspE7

	Número (%) de pacientes
Resultado	Semana 12*	Semana 24\dagger
	(n = 14)	(n = 14)
Respondedor completo	2 (14)	3 (21)
Respondedor parcial	11 (79)	10 (71)
Sin responder	1 (7)	1 (7)
\hskip0.5cm * Un mes después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7.
\hskip0.5cm \dagger Cuatro meses después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7.

Al término del ensayo, el centro investigador no recomendó tratamiento adicional para los tres respondedores completos. Tal como se relaciona en la Tabla 2, el tratamiento recomendado por el centro investigador para los respondedores parciales fue la terapia ablativo (6 de 14, 43%) o tratamiento con un agente tópico (4 de 14, 29%); se recomendó cirugía adicional para el no respondedor (1 de 14, 7%). Los 22 pacientes apuntaron un protocolo de registro para completar a largo plazo su respuesta y consintieron en posponer el tratamiento recomendado por los investigadores.

TABLA 2 Evaluaciones de respuesta de la verruga anogenital y tratamiento clínico recomendado

	Línea base*	Semana 12\dagger	Semana 24\ddagger
Número de	Tratamiento	Respuesta de	Tratamiento	Respuesta de	Tratamiento
paciente	recomendado	verruga	recomendado	verruga	recomendado
003	Cirugía	CR	Tópico	CR	Ninguno
004	Cirugía	PR	Ablación	PR	Ablación
005	Tópico	PR	Tópico	CR	Ninguno
006	Cirugía	PR	Cirugía	PR	Ablación
008	Ablación	PR	Tópico	PR	Tópico
009	Cirugía	PR	Ablación	PR	Tópico
010	Cirugía	PR	Ablación	PR	Ablación
011	Cirugía	CR	Tópico	CR	Ninguno
014	Cirugía	PR	Tópico	PR	Tópico
016	Cirugía	Peor	Cirugía	Peor	Cirugía
017	Ablación	PR	Tópico	PR	Tópico
020	Cirugía	PR	Ablación	PR	Ablación
021	Cirugía	PR	Ablación	PR	Ablación
022	Cirugía	PR	Ablación	PR	Ablación
* La línea base se refiere al comienzo del ensayo de marca abierto.
\dagger Un mes después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7.
\ddagger Cuatro meses después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7.
Abreviaturas: CR = respuesta completa; PR = respuesta parcial.

En los 14 pacientes diagnosticados con verrugas anogenitales, se detectó el ADN de HPV de los múltiples tipos de HPV en especimenes de frotis anal durante la detección de enfermedades para el primer ensayo controlado, aleatorizado (Tabla 3). HPV-6 y/o 11 estuvieron presentes en 12 pacientes (86%). Un paciente tuvo únicamente HPV-16 y los tipos relacionados y otro paciente no pudo ser tipificado. Tres de los 14 pacientes (21%) fueron positivos para HPV-16. La mayor parte de los pacientes cuyas verrugas mejoraron (11 de 13, 85%) no tuvieron HPV-16. El no respondedor tampoco tenía HPV-16 (véase Tabla 3).

TABLA 3 Tipos de HPV en pacientes con verrugas anogenitales

Número de	Tipo de HPV en los especimenes de frotis anal	Respuesta de la verruga
paciente	en la detección de la enfermedad*	en la semana 24 \dagger
003	6, 11, 16	CR
004	6, 54	PR
005	6,70	CR
006	6, 11, 45	PR
008	16, 31, 55	PR
009	6, 11, 59	PR
010	6, 11, 45, 54	PR
011	HPV positivo, tipo desconocido	CR
014	6, 11	PR
016	11, 61	Peor
017	HPV negativo	PR
020	6, 11 16	PR
021	6, 31, 53, 58, 59, 61, 66	PR
022	6	PR
* Visita para detectar la enfermedad del ensayo clínico placebo controlado, aleatorizado.
\dagger Cuatro meses después del tratamiento final con 500 \mug de HspE7.
Abreviaturas: HPV = papilomavirus humano; CR = respuesta completa; PR = respuesta parcial

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En este ensayo entrecruzado de marca abierto de HspE7 (500 \mug en 3 intervalos mensuales) que implica a pacientes con HSIL anal persistente y verrugas anogenitales concomitantes, 3 de los 14 pacientes (17%) que tuvieron verrugas en la línea base no tuvieron verrugas más grandes 4 meses después de la dosis final. Otros 10 pacientes (71%) experimentaron una mejora en sus síntomas (es decir, las verrugas se redujeron significativamente de tamaño y la disminución continuada de la extensión del tratamiento necesitó eliminar las verrugas restantes). Un paciente (7%) no mejoró durante el curso del ensayo y el centro investigador recomendó cirugía adicional.

Antes de la incorporación en el ensayo de marca abierto, la mayor parte de los pacientes en este centro de ensayo podrían tener que someterse a intervención quirúrgica para la eliminación de sus verrugas (11 d 14, 79%). Al término del ensayo, se recomendó tratamiento quirúrgico únicamente para un paciente. Se recomendó la terapia ablativo local (por ejemplo, nitrógeno líquido, electrocauterización) para seis pacientes (43%) y se recomendó tratamiento con un agente tópico (por ejemplo, imiquimod) para cuatro pacientes (29%). Tres pacientes no necesitaron tratamiento adicional.

Las respuestas parecen ser progresivas durante 6 meses y el no respondedor recayó durante este período. La resolución gradual y progresiva del condiloma está de acuerdo con lo que se podría esperar de una respuesta inmunológica del huésped tras la inducción de la inmunidad mediada por células por la Hsp E7.

Dos pacientes en el ensayo doble ciego tuvieron alguna mejora en su condiloma antes de apuntarse al ensayo doble ciego. Hasta la fecha, no hemos interrumpido el ciego y no conocemos si estos pacientes recibieron 100 \mug de HspE7 o placebo. Sin embargo, basándose en la repuesta observada en el ensayo de marca abierto de tres inyecciones mensuales de 500 \mug de HspE7, parece que la dosis más alta es más activa que la de 100 \mug

Se detectó el ADN de HPV-16 en los especimenes de frotis anal en únicamente 3 de los 13 pacientes (23%) cuyas verrugas mejoraron tras el tratamiento con HspE7. Se detectó el ADN de HPV-6, HPV-11, o ambos en la mayor parte de los pacientes cuyas verrugas respondieron al tratamiento con HpsE7.

En resumen, los resultados presentados aquí sugieren que HspE7 es ampliamente activa en las verrugas anogenitales. La actividad no parece limitarse a los paciente HPV-16 positivos, pero cruza múltiples tipos de HPV. Se predice que HpsE7 será activo en el tratamiento de las enfermedades inducidas por la región anogenital y que esta actividad no se limitará a los pacientes HPV-16 positivos.

Las observaciones informadas aquí sugieren que el tratamiento terapéutico con HspE7 puede constituir un tratamiento no quirúrgico nuevo y simple para las verrugas anogenitales que, como mínimo, podría disminuir el peso de la verruga, reduciendo por tanto la extensión del tratamiento y la morbilidad resultante. La enfermedad anorectal interna requiere a menudo tratamiento adicional que puede ser bastante doloroso y debilitante. Cualquier tratamiento que proporcione una respuesta incluso parcial que reduzca o elimine la cantidad o extensión de la terapia "quirúrgica" o ablativo se traduce en una reducción de la morbilidad, menor pérdida de tiempo de trabajo, y calidad mejorada de vida.

Estos resultados indican que una composición con proteína de choque térmico / antígeno de HPV de tipo 16 efectiva eliminando o reduciendo verrugas que se piensa que están producidas de manera predominante por los tipos 6 y 11 de HPV. De significativa importancia son las observaciones que (1) se pueden tratar todas las verrugas con composiciones basadas en HPV, y (2) una composición de HPV de tipo 16 fue efectiva en el tratamiento de una afección producida de manera presumible por otro HPV diferente que el del tipo 16. El resultado reactivo cruzado posterior fue completamente inesperado, proporcionando la creencia mantenida que solo una composición específica del tipo podría desencadenar una respuesta inmune específica del tipo.

Para elucidar un posible mecanismo para la reactividad cruzada observada del polipéptido de fusión, se calcularon los enlaces teóricos para diversas moléculas HLA de clase I y los péptidos E7 de los tipos 16, 6, y 11 de HPV. Se calculó la T_{1/2} de disociación usando el algoritmo descrito en Parker y col., J. Immunol. 152:163, 1994 (véase también el sitio web descrito anteriormente). Se resumen los datos en la Tabla 4.

TABLA 4

1

2

3

4

Las secuencias de péptidos en negrita indican la parte superior de los dos ligantes para cada molécula de HLA, y para cada proteína E7 d cada tipo de HPV.

Los resultados de la Tabla 4 sugieren que, dependiendo de la molécula de HLA específica examinada, el antígeno E7 de HPV de tipo 16 puede desencadenar una respuesta inmuno mediada frente al antígeno E7 de otros tipos de HPV. Por ejemplo, para HLA B 2705, se predijo un nivel alto de enlace para los péptidos de partida del aminoácido en posición 76 de E7 para los tres tipos de HPV. De esta manera, es posible que, para los pacientes que expresan esta molécula de HLA, una composición E/ de HPV de tipo 16 podría ser reactivo cruzada y útil para el tratamiento o prevención de la infección por los tipos 6 y 11 de HPV. Cada un de los fragmentos de péptidos en negrita de la Tabla 4 representa un fragmento antigénico posible que se puede incluir en las composiciones (por ejemplo, los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento), como un sustituto para los antígenos víricos de E7 completo. Por supuesto, se pueden usar también dos o más supuestos epitopos de HLA, o un fragmento largo que contiene muchos supuestos epitopos de HLA.

Claims

1. El uso de una proteína de fusión que comprende (1) una proteína de choque térmico (Hsp) o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) un antígeno del papilomavirus humano (HPV) en el que dicho antígeno de HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la papilomatosis respiratoria recurrente en un sujeto identificado como que tiene la papilomatosis respiratoria recurrente.

2. El uso de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (1) una Hsp o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) un antígeno de HPV, en el que dicho antígeno de HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la papilomatosis respiratoria recurrente en un sujeto identificado como que tiene papilomatosis respiratoria recurrente.

3. El uso de una proteína de fusión que comprende (1) una Hsp o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) un antígeno de HPV, en el que dicho antígeno de HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, en un sujeto, de una enfermedad o afección producida por una infección con un tipo de HPV que es diferente del tipo de HPV del cual se deriva la proteína E7 de HPV o el fragmento antigénico de la misma, en el que la enfermedad o afección es una verruga, verrugas plantares, cáncer cervical, displasia cervical, cáncer anal, displasia anal, o papilomatosis respiratoria recurrente.

4. El uso de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende (1) una Hsp o un fragmento inmunoestimulador de la misma, y (2) un antígeno de HPV, en el que dicho antígeno de HPV está constituido por una proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, en un sujeto, de una enfermedad o afección producida por una infección con un tipo de HPV que sea diferente del tipo de HPV del cual se deriva la proteína E7 de HPV o el fragmento antigénico de la misma, en el que la enfermedad o afección es una verruga, verrugas plantares, cáncer cervical, displasia cervical, cáncer anal, displasia anal, o papilomatosis respiratoria recurrente.

5. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sujeto tiene una papilomatosis respiratoria recurrente asociada con la infección por el HPV de tipo 6 o con el HPV de tipo 11.

6. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sujeto tiene una verruga en un órgano interno o las cuerdas vocales.

7. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la papilomatosis respiratoria recurrente es una papilomatosis respiratoria recurrente juvenil o una papilomatosis respiratoria recurrente que comienza en un adulto.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que la papilomatosis respiratoria recurrente juvenil es una papilomatosis laringeal juvenil.

9. El uso de la reivindicación 1 ó 3, en el que la composición farmacéutica contiene aproximadamente de 50 a 5000 \mug, de 100 a 2000 \mug o 500 \mug de la proteína de fusión.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composición está libre de coadyuvantes.

11. El uso de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto es un mamífero.

12. El uso de la reivindicación 11, en la que el mamífero es un ser humano.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la Hsp o el fragmento inmunoestimulador de la misma es una proteína Hsp60, Hsp70 o una Hsp micobacteriana o un fragmento inmunoestimulador de la misma.

14. El uso de la reivindicación 13, en la que la Hsp micobacteriana o el fragmento inmunoestimulador de la misma es una Hsp de Mycobacterium Bovis o una proteína Hsp60 micobacteriana o un fragmento inmunoestimulador de la misma.

15. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína E7 de HPV o fragmento antigénico de la misma es una proteína E7 de HPV de tipo 16 o fragmento antigénico de la misma.

16. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la Hsp o fragmento inmunoestimulador de la misma es una proteína Hsp60 micobacteriana o la Hsp65 del Bacilo Calmette Guerin (BCG) de Mycobacterium Bovis o un fragmento inmunoestimulador de la misma y la proteína E7 de HPV o un fragmento antigénico de la misma es la proteína E7 del HPV de tipo 16 o un fragmento antigénico de la misma.

17. El uso de la reivindicación 3 ó 4, en el que el sujeto tiene una enfermedad o afección asociada con la infección de HPV de los tipos 5, 6, 11, 18, 31, 33, 35, 45, 54, 60, o 70.

18 El uso de la reivindicación 3 ó 4, en el que el sujeto tiene una verruga asociada con la infección de HPV del tipo 6 o de HPV de tipo 11.

19. El uso de la reivindicación 18, en el que la verruga es una verruga anogenital.

20. El uso de la reivindicación 3, 4, 17 o 18, en el que la proteína E7 de HPV o fragmento antigénico de la misma es una proteína E7 de HPV de tipo 16 o el fragmento antigénico de la misma.

21. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión comprende una Hsp.

22. El uso de la reivindicación 21, en el que la Hsp es una proteína Hsp60.

23. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión comprende una proteína E7 de HPV.

24. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión comprende una proteína Hsp y una E7 de HPV.

25. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión comprende una proteína Hsp60 y una proteína E7 de HPV de tipo 16.

26. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína de fusión comprende la proteína Hsp65 del Bacilo Calmette Guerin (BCG) de Mycobacterium Bovis y la proteína E7 de HPV de tipo 16.

27. El uso de la reivindicación 2 ó 4, en el que el ácido nucleico está contenido en el interior de un vector vírico.