BRPI0707733B1 - antígeno isolado, composição de vacina, uso da referida composição e método para produção de uma proteína de antígeno - Google Patents

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Abstract

antígenos de gripe, composições de vacina, e métodos relacionados. a presente invenção refere-se à intersecção dos campos de munologia e produção de proteína, e, particularmente, a antígenos e vacinas úteis na prevenção de infecção por vírus de gripe. são providos antígenos de proteína recombinantes, composições e métodos para a produção e uso de tais antígenos e composições de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTÍGENO ISOLADO, COMPOSIÇÃO DE VACINA, USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE ANTÍGENO".
Pedidos de Patente Relacionados O presente pedido de patente é relacionado a e reivindica prioridade sob 35 USC 119(e) a U.S.S.N. 60/773.378, depositado em 13 de fevereiro de 2006 (o pedido de patente '378'), e a U.S.S.N. 60/813.955, depositado em 15 de junho de 2006 (o pedido de patente '955'); os conteúdos totais dos pedidos '378' e '955' sendo incorporados aqui por referência. Antecedentes da Invenção A gripe tem uma longa história caracterizada por ondas de doenças pandêmicas, doenças epidêmicas, ressurgências e deflagrações. A gripe é uma doença altamente contagiosa que pode estar devastando igualmente ambos os países em desenvolvimento e desenvolvidos. O vírus da gripe apresenta uma das maiores ameaças à população humana. Apesar dos esforços da vacinação anual, as infecções de vírus resultam em morbidez e mortalidade substanciais. Embora doenças epidêmicas de gripe ocorram quase todo ano, felizmente as doenças pandêmicas não ocorrem muito frequentemente. Contudo, cepas recentes de gripe têm aparecido, visto que se está novamente diante do potencial de uma doença pandêmica de gripe. O vírus de gripe aviária do tipo H5N1, atualmente causando uma doença pandêmica em aves domésticas na Ásia, bem como regiões do leste da Europa, tem persistentemente se difundido por todo o globo. A difusão rápido de infecção, bem como transmissão de espécies cruzadas de pássaros para indivíduos humanos, aumenta o potencial de deflagrações em populações humanas e o risco de uma doença pandêmica. O vírus é altamente patogênico, resultando em uma taxa de mortalidade de mais de cinquenta por cento em pássaros, bem como poucos casos humanos que foram identificados. Se o vírus fosse alcançar transmissão de humano a humano, ele não teria o potencial para resultar em doença rápida, muito difundida, e mortalidade. A maior defesa contra a gripe é a vacinação. Os vírus da gripe são vírus de RNA de filamento negativo, segmentados, pertencentes à famí- lia Orthomyxoviridae. Os antígenos virais são imunogenes altamente eficazes, capazes de induzir ambas as respostas sistêmicas e de anticorpo mu-cosal. A glicoproteína hemaglutinina de vírus da gripe (HA) é geralmente considerada o antígeno viral mais importante com relação ao estímulo de neutralização de anticorpos e desenho de vacina. A presença de neuramini-dase viral (NA) foi mostrada ser importante para geração de respostas imunes protetoras de braço múltiplo contra o vírus. Antivirais que inibem atividade de neuraminidase têm sido desenvolvidos, e podem ser um tratamento antiviral adicional sob infecção. Um terceiro componente considerado útil no desenvolvimento de antivirais e vacinas de gripe é proteína de canal de íon M2.
Subtipos do vírus da gripe são designados por HA e NA diferentes, resultantes da alteração antigênica. Além disso, novas cepas do mesmo subtipo resultam de alteração de antígeno, ou mutações nas moléculas de HA ou NA que geram epitopos novos e diferentes. Embora 15 subtipos anti-gênicos de HA tenham sido documentados, somente três destes tipos H1, H2 e H3 circularam extensivamente em seres humanos. A vacinação tornou-se suprema na questão de qualidade de vida aperfeiçoada em nações ambas industrializadas e subdesenvolvidas. A maioria de vacinas disponíveis ainda segue os princípios básicos de aspectos que imitam infecção de modo a induzir uma resposta imune que pode proteger contra a infecção relevante. Contudo, a geração de vírus atenuados de vários subtipos e combinações pode consumir tempo e ser custosa. Novas tecnologias emergentes em compreensão profunda de uma biologia molecular de patogenia, patogêne-se, e suas interações com um sistema imune individual, têm resultado em novas aproximações para desenvolvimento de vacina e distribuição de vacina. Desse modo, enquanto os avanços tecnológicos têm aperfeiçoado a capacidade de produzir composições de vacina de antígenos de gripe aperfeiçoadas, permanece uma necessidade de proporcionar fontes adicionais de vacinas e novos antígenos para produção de vacinas para tratar subtipos e cepas emergentes. O desenho e desenvolvimento aperfeiçoados de vacina para subtipos de vírus da gripe, bem como métodos de produção e uso de tais composições de matéria, são necessários, que proporcionam fontes pouco custosas e altamente acessíveis de tais composições terapêuticas.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a antígenos de gripe e componente de vacina produzido em plantas. A presente invenção proporciona um ou mais antígenos de gripe como uma fusão com uma proteína termoestá-vel. A invenção proporciona adicionalmente composições de vacina contendo antígenos de gripe. Além disso, a invenção proporciona vacinas de gripe compreendendo pelo menos dois antígenos de gripe diferentes. Em algumas concretizações, as composições da invenção incluem um ou mais componentes de planta. Ainda adicionalmente providos são métodos para produção e uso do antígeno e composições de vacina da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos figura 1. Esquemático de proteína hemagíutínina (HA) e domínios de proteína. Os números 1, 2 e 3 na esquerda superior correspondem aos domínios 1,2 e 3 aqui descritos. Os domínios 1,2, e 2, 1 se dobram juntos para formar um domínio de haste (SD). O domínio 3 é um domínio globular (GD). As faixas apresentadas nos itens 1-6 correspondem às posições de aminoácido de HA. figura 2. Mapa do plasmídeo pET32. A esquerda superior indica a região entre o promotor T7 e o terminador T7 necessitando de plasmídeo modificado usado para clonagem de antígeno-alvo. figura 3: Esquemático dos contruto de pET-PR-LicKM-KDEL e pET-PR-LicKM-VAC inseridos em um vetor pET32a modificado. figura 4\ Esquemático da organização de vetor pB1121. figura 5: Organização esquemática da derivação do plasmídeo pBID4 de um vetor pBI após excisão do gene GUS e a adição de um plasmídeo derivado de TMV. figura 6: Esquemático da fusão de HA, domínios de HA, e NA em seqüência de lichenase, com ou sem seqüências-alvo que foram postas em um vetor. figuras 7A,B'. Ensaios de lichenase de extratos de plantas que expressam LicKM e proteínas de fusão. (7A) Expressão transiente de liche-nase em Nicotiana benthamiana. (7B) Zimograma de proteínas de fusão de HA de lichenase em plantas (seta). figura 8. Análise de Western de extratos de plantas que expressam proteínas de fusão Lic-HA usando anticorpos anti-HA e anti-LicB. figura 9. Ensaios de lichenase de extratos de plantas expressando proteínas de fusão Lic-NA. figura 10. Análise de Western de extratos de plantas que expressam proteínas de fusão Lic-HA. figura 17: Ensaio de hemaglutinação de célula vermelha de sangue com proteínas de fusão de lichenase de HA expressas em planta. figura 12. Resposta de anticorpo de camundongos imunizados com a vacina de gripe H5N1 teste, com e sem adjuvante. figura 13. Inibição de atividade de hemaglutinação por diluições de soro obtidas de camundongos imunizados com vacina teste H5N1, com e sem adjuvante. figuras 14A-D. Sintomas em seguida a provocação de vírus H3N2 em vacina teste de gripe H3N2 e grupos de tratamento de controle. (14A) Resultados máximos médios totais de contagens de sintoma clínico. (14B) Resultados máximos médios totais de contagens de célula em lavagens nasais após provocação de vírus. (14C) Resultados máximos médios totais de perda de peso em animais. (14D) Máxima média total de mudança de temperatura em animais. figura 15. Liberação de vírus em seguida a provocação de vírus H3N2 em vacina teste de gripe H3N2 e grupos de tratamento de controle. O grupo 1 representa os resultados do grupo de tratamento de controle negativo; O grupo 2 representa os resultados de animais tratados com artigo Teste 1 (CMB F1); O grupo 3 representa os resultados de animais tratados com o artigo teste 2 (CMB F2); O grupo 4 representa os resultados de animais tratados com artigo Teste 3 (CMB F3); e o grupo D representa os resultados de animais tratados de controle positivo. N se refere ao número de animais avaliados em cada grupo (8 em cada grupo). figura 16. Caracterização de antígenos de vírus A/Wyoming3/03 de gripe produzidos em plantas. (16A) Análise de ELISA de LicKM-(SD) e LicKM-(GD) usando soro de ovelha elevado contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03. Vírus homólogo (A/W/3/03) e NA produzidos por planta foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. (16B) Análise de imunomanchamento de LicKM-HA (SD) (rota 3) e LicKM-HA (GD) (rota 3) usando soro de coelho elevado contra MicKM (anti-LicKM) e soro de ovelha elevado contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03 de gripe (anti-HA). MicKM (rota 2) e vírus homólogo (rota 1) foram usados como controles. (16C) Análise de ELISA de NA usando soro de ovelha elevado contra vírus reagrupados NIBRG-18 (anti-H7N2) e vírus reagrupados NIBRG-17 (anti-H7N1). Vírus homólogo (A/W/3/03) avaliados usando soro de ovelha para NIBRG-18 (anti-H7N2) foi usado como um controle positivo. (16D) Inibição específica de cepa de atividade de neuraminidase em seguida a pré-incubação com soro de ovelha contra NIBRG-18 (anti-H7N2) ou NIBRG-17 (anti-H7N1). A atividade enzimática média de três réplicas é mostrada com desvios padrão. figura 17. Titulações de inibição de hemaglutinação de soro de furões imunizados com VCI mais adjuvantes, VC2 sem adjuvante, ou VC2 mais adjuvante. As amostras de soro foram coletadas antes da primeira dose (Pré-imm), 14 dias após a primeira dose (D1), 14 dias após a segunda dose (D2), 10 dias após a terceira dose (D3), e 4 dias pós-provocação (Pós-Ch). Titulações médias geométricas com desvios padrão são mostradas. figura 18. Monitoramento de pós-provocação de furões imunizados com VC1 mais adjuvante, VC2 sem adjuvante, ou VC2 mais adjuvante. Valores médios com desvios padrão são mostrados, e análise estatística de dados foi conduzida usando ANOVA com a correção de Bonferroni para teste múltiplo. A significância estatística foi definida como p £ 0,05. (18A) Pico de pós-infecção de abrigo de vírus. (18B) Perda de peso máxima pós-infecção. (18C) Temperatura de pico que ocorre pós-infecção. (18D) Pico de classificações de sintoma pós-infecção. (18E) Peco de contagens de leucóci-to total por ml de amostras de lavagem nasal pós-infecção.
Descrição Detalhada da Invenção A invenção se refere a antígenos de gripe úteis na preparação de vacinas contra infecção de gripe, e proteínas de fusão compreendendo tais antígenos de gripe operavelmente ligados à proteína termoestável. A invenção se refere a métodos de produção de antígenos providos, incluindo, mas não limitados a, produção em sistemas de planta. Adicionalmente, a invenção se refere a vetores, proteínas de fusão, células de planta, plantas e composições de vacina compreendendo os antígenos e proteínas de fusão da invenção. Ainda adicionalmente providos são métodos de indução de resposta imune contra infecção de gripe em um indivíduo compreendendo administrar composições de vacina da invenção a um indivíduo.
Antígenos de gripe Proteínas de antígeno de gripe da presente invenção incluem qualquer proteína imunogênica ou peptídeo capaz de induzir uma resposta imune contra vírus da gripe. Geralmente, proteínas imunogênicas de interesse incluem antígenos de gripe (por exemplo, proteína de gripe, proteínas de fusão, etc.), porções imunogênicas destas, ou variantes imunogênicas destas, e combinações de quaisquer das precedentes.
Antígenos de gripe para uso de acordo com a presente invenção podem incluir proteínas de gripe de comprimento total, ou fragmentos de proteínas de gripe, e/ou proteínas de fusão compreendendo proteínas de gripe de comprimento total, ou fragmentos de proteínas de gripe. Onde fragmentos de proteínas de gripe são utilizados, se sozinhos ou em proteínas de fusão, tais fragmentos retêm atividade imunológica (por exemplo, reatividade cruzada com anticorpos antigripe). Baseado em sua capacidade de induzir resposta imunoprotetora contra infecção viral, hemagíutínina e neuraminidase são antígenos primários de interesse na geração de vacinas. Antígenos adicionais, tal como canal de íon de membrana M2, podem ser úteis na produção de vacinas (por exemplo, combinação de vacinas) de modo a aperfeiçoar a eficiência de imunoproteção.
Desse modo, a invenção proporciona células de planta e plantas que expressam uma proteína heteróloga (por exemplo, proteína de gripe, ou um fragmento desta, uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de gripe, ou fragmento desta). Uma proteína heteróloga da invenção pode compreender qualquer antígeno de gripe de interesse, incluindo, mas não limitado a, hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), canal de íon de membrana M2 (M2), uma porção de hemaglutinina (HA), uma porção de neuraminidase (NA), e uma porção de canal de íon de membrana (M2), ou proteínas de fusão, fragmentos, ou combinações de hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), canal de íon de membrana M2 (M2), ou porção de hamaglutinin (HA), uma porção de neuraminidase (NA), e/ou uma porção de canal de íon de membrana (M2).
Seqüências de aminoácido de uma variedade de proteínas de gripe de HA, NA e M2 diferentes (por exemplo, de subtipos diferentes, ou cepas ou isolados) são conhecidos na técnica, e são disponíveis em bases de dados públicas, tal como o Banco de Gene (GenBank). Seqüências de proteína de comprimento total exemplares para HA e NA de dois subtipos de gripe de interesse particular hoje, bem como seqüência para M2, são providas abaixo: V: Vietnam H5N1 HA (HAV) SEQ ID NO.: 1 AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH
AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIV
EKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVS
SACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPND
AAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKP
NDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINS
SMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGF
IEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDK
MNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTL
DFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTY
DYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALALMVAGLSLWM
CSNGSLQCRICI NA(NAV) SEQ ID NO.: 2: M/VP/VQK//nGS/CMVTG/l'SLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNL
LTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHL
ECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESV
AWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
ECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEEC
SCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPN
DGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPN
GWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRG
RPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK W: Wyoming H3N2 HA (HAW) SEQ ID NO.: 3: MKTIIALSYILCLVFSQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTN
ATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVE
RSKAYSNC YPYDVWYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSAC
KRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDS
DQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILL
INSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNV
NRITYGACPflYVKQ/V7LKL47GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVD
GWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEF
SEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERT
KKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQI
KGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI NA (NAW) SEQ ID NO.: 4: MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEP
TIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSA
GGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLM
NELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGR
LVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIV
HTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVS
SYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWM
GRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEG
KSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADIN
LMPI
Proteína de gripe Hong Kong SEQ ID NO.:5: LTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
Proteínas de gripe Hemaglutinina Em certas concretizações, a hemaglutinina de comprimento total (HA) é utilizada em composições de vacina da invenção. Em algumas concretizações, um ou mais domínios de HA são usados. Em certas concretizações, dois ou três ou mais domínios são utilizados, como um ou mais poli-peptídeos separados ou ligados juntos em um ou mais polipeptídeos de fusão. Certas concretizações exemplares proporcionam antígeno de gripe compreendendo domínio 1-2 e domínio 2-1 (referidos como HA1_2) ou domínio 3 de HA, de comprimento total. HA Vietnam [H5N1]: Peptídeo de sinal H5N1 HA SEQ ID NO: 6: AKAGVQSVKMEKI-VLLFAIVSLVKS
Domínio 1-2 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 7: DQJCIGYHANNS-TEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL
Domínio 3 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 33: CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYP GDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF RNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPT TYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNF IAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
Domínio 2-1 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 8: NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRER RRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKA IDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCD NECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
Domínio de transmembrana de H5N1 HA SEQ ID NO.: 9: LSIYSTVASSLALAMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI HA A/Wyoming (H3N2) Peptídeo de sinal de H3N2 SEQ ID NO.: 10: MKTIIALSYIL- CLVFS
Domínio 1 -2 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 11: QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVINATELVQ
SSSTGGI
Domínio 3 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 12: CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNC YPYD VPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRL NWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRI TVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
Domínio 2-1 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 13: NSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPflYWCQ/VTLKLATGMRNVPEKQT RGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQIN GKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVAL ENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIR NGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
Domínio de transmembrana de H3N2 HA SEQ ID NO.: 14: WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
Em certas concretizações, antígeno de neuraminidase de comprimento total (NA) é utilizado em antígenos de vacina da invenção. Em algumas concretizações, um domínio de NA é usado. Em certas concretizações, dois ou três ou mais domínios são providos em antígenos da invenção. Certas concretizações exemplares proporcionam antígeno de gripe compreendendo NA de comprimento total, carecendo de seqüência de peptídeo de âncora.
Neuraminidase NA Vietnam Peptídeo de âncora H5N1 NA SEQ ID NO.: 15: MNPNQTIITIG-SICMVTGIVS Η5Ν1 NA SEQ ID NO.: 16: LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPI
NGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSN
GTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGIS
GPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPS
NGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWH
GSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGV
KGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAIT
DWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGV
NSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
Peptídeo de âncora de H3N2 NA SEQ ID NO.: 17: MNPNKQIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF H3N2 NA SEQ ID NO.: 18: KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKP
QCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLN
NVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLH
VCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTD
GSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDN
WKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEG
GHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINR
QVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVF
CGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Conquanto seqüências de antígenos de gripe exemplares sejam providas aqui, e domínios representados para cada um de HA e NA e M2 foram providos para cepas exemplares, será apreciado que qualquer seqüência tendo características imunogênicas de um domínio de HA e/ou NA e/ou M2 podem alternativa ser empregada. Um versado na técnica será prontamente capaz de gerar seqüências tendo pelo menos 75%, 80%, 85% ou 90% ou mais de identidade para antígenos providos. Em certas concretizações, os antígenos de gripe compreendem proteínas incluindo aquelas tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou mais identidades para um domínio de HA e/ou NA e/ou M2, ou uma porção de um domínio de HA e/ou NA e/ou M2, no qual no qual a proteína de antígeno retém atividade imunogênica. Por exemplo, seqüências tendo identidade suficiente para antígeno(s) de gripe que retém características imunogênicas são capazes de se ligarem com anticorpos que reagem com antígeno(s) de domínio provido(s) nas mesmas. As características imunogênicas freqüentemente incluem três a-presentações dimensionais de aminoácidos ou grupos laterais relevantes. Um versado na técnica pode identificar prontamente seqüências de identidade com diferenças modestas na seqüência (por exemplo, com diferença nos limites e/ou algumas alternativas de seqüências que, não obstante, preservam as características imunogênicas). Por exemplo, seqüências cujos limites são pertos de (por exemplo, dentro de cerca de 15 aminoácidos, 14 aminoácidos, 13 aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos, 10 aminoácidos, 9 aminoácidos, 8 aminoácidos, 7 aminoácidos, 6 aminoácidos, 4 aminoácidos, 3 aminoácidos, 2 aminoácidos, ou 1 aminoácido) dos limites de domínio designados aqui em qualquer extremidade da seqüência de aminoácido designada podem ser consideradas por compreenderem o domínio relevante de acordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção contempla o uso de uma seqüência de antígeno de gripe para compreender resíduos que se aproximam da designação de domínio. Por exemplo, domínio(s) de HA foi(foram) projetado(s) e expresso(s) como uma proteína de fusão de estrutura interna como um antígeno da invenção (vide Exemplificação aqui). Adicionalmente, será apreciado que quaisquer domínios, domínios parciais, ou regiões de seqüências de aminoácido de antígeno de gripe (por exemplo, HA, ΝΑ, M2) que são imunogênicos podem ser gerados usando-se aos constructo e métodos aqui providos. Ainda adicionalmente, domínios ou subdomínios podem ser combinados, separada e/ou consecutivamente para produção de antígenos de gripe.
Como antígenos exemplares, usou-se seqüências de hemaglutinina, neuraminidase e M2 de subtipos particulares conforme descrito em detalhe aqui. Vários subtipos de vírus de gripe existem e continuam a serem identificados à medida que novos subtipos aparecem. Será compreendido por um versado na técnica que os métodos e composições aqui proporcio- nados podem ser adaptados para utilizar seqüências de subtipos adicionais. Tal variação é contemplada e envolvida dentro dos métodos e composições aqui providos.
Fusões de Polipeptídeo de Gripe com Proteínas Termoestáveis Em certos aspectos da invenção, são providos antígeno(s) de gripe compreendendo polipeptídeos de fusão que compreendem uma proteína de gripe (ou um fragmento ou variante desta) operavelmente ligada a uma proteína termoestável. Os polipeptídeos de fusão da invenção podem ser produzidos em qualquer sistema de expressão disponível conhecido na técnica. Em certas concretizações, as proteínas de fusão da invenção são produzidas em uma planta ou porção desta (por exemplo, planta, célula de planta, raiz, broto, etc).
Enzimas ou outras proteínas que não são encontradas naturalmente em células de humanos ou animais são particularmente apropriadas para uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção. As proteínas termoestáveis que, quando fundidas, conferem termoestabilidade a um produto de fusão, são úteis. A termoestabilidade permite que a proteína produzida mantenha conformação, e mantenha proteína produzida à temperatura ambiente. Esta característica facilita recuperação fácil, de tempo eficiente e custo eficaz de um polipeptídeo de fusão. Uma família representativa de enzimas termoestáveis úteis de acordo com a invenção é a família de glucanohi-drolase. Estas enzimas clivam especialmente ligações 1,4-β glucosídicas que são adjacentes às ligações 1,3-β em polissacarídeos ligado misturados (Hahn et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:10417). Tais enzimas são encontradas em cereais, tais como aveia e cevada, e são também encontradas em um número de fungos e espécies bacteriais, incluindo C. thermocel-lum (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol., 36:698). Desse modo, proteínas termoestáveis exemplares para uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção incluem enzimas glicosidase. Proteínas glicosidase termoestáveis exemplares incluem aquelas representadas pelos números de acesso no Banco de Gene (GeneBank) selecionados a partir daqueles colocados na Tabela A, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados aqui por referência pela incorporação total da informação de acesso no Banco de Gene (GenBank) para cada número referenciado. Enzimas termoestáveis exemplares de uso em proteínas de fusão da invenção incluem Clostridium thermocellum P29716, Brevibacillus brevis P37073, e Rhodthermus marinus P45798, cada uma das quais sendo incorporadas aqui por referência em seus números de acesso no banco de Genes (GenBank). As proteínas de fusão representativas ilustradas nos Exemplos utilizam enzima termoestável modificada isolada de Clostridium thermocellus; contudo, qualquer proteína termoestável pode ser similarmente utilizada de acordo com a presente invenção.
Tabela A: Proteínas glicosidase termoestáveis Quando se designam proteínas de fusão e polipeptídeos de a-cordo com a invenção, é desejável, naturalmente, preservar a imunogenicidade do antígeno. Ainda adicionalmente, é desejável em certos aspectos da invenção proporcionar constructo que proporcionam termoestabilidade de uma proteína de fusão. Esta característica facilita a recuperação fácil, de tempo eficiente e de custo eficaz do antígeno-alvo. Em certos aspectos, modelos de fusão de antígeno podem ser selecionados, que proporcionam vantagens adicionais, incluindo aumento de imunogenicidade potencial para incorporar determinantes de vacina múltiplos, ainda carente antes da exposição imunogênica a vacinação dos indivíduos. Qualidades benéficas adicionais de peptídeos de fusão de interesse incluem proteínas que proporcionam facilidade de manipulação para incorporação de um ou mais antígenos, bem como proteínas que têm potencial para conferir facilidade de produção, purificação e/ou formulação de preparações de vacina. Um versado na técnica apreciará que apresentação tridimensional pode afetar cada uma destas características benéficas. A preservação de imunidade ou qualidades preferenciais, portanto, podem afetar, por exemplo, a escolha de co-participantes de fusão, e/ou escolha de localização de fusão (por exemplo, terminal-N, termi-nal-C, combinações destes). Alternativa ou adicionalmente, preferências podem afetar o comprimento de segmento selecionado para fusão, se ele for comprimento de antígeno, ou comprimento de co-participante de fusão selecionado. A presente invenção demonstrou fusão bem-sucedida de uma variedade de antígenos com uma proteína termoestável. Por exemplo, tem-se usado a molécula veículo termo-estável LicB, também referida como li-chenase, para produção de proteínas de fusão. LicB é 1,3-1,4-β glucanase (LicB) de Clostridium termocellum (Acesso no Banco de Genes: X63355 [gi:40697]). A MicB pertence a uma família de proteínas globulares. Baseado na estrutura tridimensional de LicB, seus terminais N e C estão situados próximos um ao outro na superfície, em proximidade ao domínio ativo. A LicB também tem uma estrutura de laço exposta à superfície que está localizada distante do domínio ativo. Tem-se gerado constructo, tal que a estrutura de laço e os terminais N e C de proteína podem ser usados como locais de inserção para polipeptídeos de antígeno de gripe. Os polipeptídeos de antígeno de gripe podem ser expressos como fusões de terminal N ou C, ou como insertos no laço da superfície. Importantemente, a LicB mantém sua atividade enzimática em pH baixo e a alta temperatura (até 75°C). Desse modo, o uso de LicB como uma molécula veículo contribui para vantagens, incluindo similarmente intensificação de imunogenicidade específica de alvo, potencial para incorporar determinantes de vacina múltiplos, e formulação direta de vacinas que podem ser distribuídas nasal, oral ou parenteralmente. Além disso, a produção de fusões de LicB em plantas deve reduzir o risco de contaminação com patogenias animais ou humanas. Vide exemplos providos aqui.
Proteínas de fusão da invenção compreendendo antígeno de gripe podem ser produzidas em qualquer de uma variedade de sistemas de expressão, incluindo ambos sistemas in vitro e in vivo. Um versado na técnica apreciará prontamente que otimização de seqüências de ácido nucléico para um sistema de expressão particular é freqüentemente desejável. Por exemplo, na exemplificação aqui provida, seqüência otimizada para expressão de antígeno de gripe-fusões de LicB em plantas providas. Vide Exemplo 1. Desse modo, um antígeno(s) de gripe que codifica ácido nucléico relevante, proteína(s) de fusão, e fragmentos destes, de acordo com a invenção, é pretendido para ser envolvido com constructo de ácido nucléico da invenção.
Para produção em sistemas de planta, plantas transgênicas expressando antígeno(s) de gripe (por exemplo, proteína(s) de gripe, ou fragmentos ou fusões destes), podem ser usadas. Alternativa ou adicionalmente, plantas trangênicas podem ser produzidas usando-se métodos bem-conhecidos na técnica para gerar colheitas de produção estáveis. Adicionalmente, plantas utilizando sistemas de expressão transientes podem ser utilizadas para produção de antígeno(s) de gripe. Quando se utiliza sistemas de expressão de planta, se expressão transgênica ou transiente em plantas é utilizada, qualquer de expressão nuclear, expressão de cloroplasto, expressão mitocondrial, ou expressão viral, podem levar vantagem de acordo com a aplicabilidade do sistema para antígeno desejado. Além disso, sistemas de expressão adicionais para produção de antígenos e proteínas de fusão de acordo com a presente invenção podem ser utilizados. Por exemplo, sistemas de expressão de mamífero (por exemplo, linhas de célula de mamíferos (por exemplo, CHO, etc)), sistemas de expressão bacteriais (por exemplo, E. coli), sistemas de expressão de inseto (por exemplo, baculovírus), sistemas de expressão de levedura, e sistemas de expressão in vitro (por exemplo, lisatos reticulados) podem ser usados para expressão de antígenos e proteínas de fusão da invenção.
Produção de Antígenos da Gripe De acordo com a presente invenção, antígenos da gripe (incluindo proteína(s) de gripe, fragmentos, variantes, e/ou fusões destes) podem ser produzidos em qualquer sistema desejável; a produção não é limitada a sistemas de planta. Constructo de vetor e sistemas de expressão são bem-conhecidos na técnica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antígenos da gripe aqui providos. Por exemplo, antígenos da gripe (incluindo fragmentos, variantes, e/ou fusões) podem ser produzidos em sistemas de expressão conhecidos, incluindo sistema de célula de mamíferos, animais transgênicos, sistemas de expressão microbiais, sistemas de célula de inseto, e sistemas de planta, incluindo sistemas de planta transgênicos e de planta. Particularmente onde antígenos da gripe são produzidos como proteínas de fusão, pode ser desejável produzir tais proteínas de fusão em siste- mas sem planta.
Em algumas concretizações da invenção, os antígenos da gripe são desejavelmente produzidos em sistemas de planta. As plantas são relativamente fáceis de manipular geneticamente, e têm várias vantagens sobre fontes alternativas, tais como fluidos humanos, linhas de célula de animal, microorganismos recombinantes e animais transgênicos. As plantas têm maquinaria de modificação pós-translacional sofisticada para proteínas que é similar àquela de mamíferos (embora deva ser notado que existem algumas diferenças nos modelos de glicosilação entre plantas e mamíferos). Isto capacita à produção de reagentes bioativos em tecidos de planta. Também, as plantas podem ser economicamente produzir quantidades muito grandes de biomassa sem requerer facilidades sofisticadas. Além disso, as plantas não são submetidas à contaminação com patogenias animais. Similar aos lipossomos e microcápsulas, as células de planta são esperadas proporcionar proteção para a passagem de antígeno ao trato gastrointestinal.
As plantas podem ser utilizadas para produção de proteínas he-terólogas, via uso de vários sistemas de produção. Tal sistema inclui uso de plantas transgênicas/geneticamente modificadas onde um gene que codifica produto alvo é permanentemente incorporado no genoma da planta. Sistemas transgênicos podem gerar sistemas de produção de colheita. Uma variedade de proteínas estranhas, incluindo muitas de origem de mamífero, e muitos antígenos candidatos de vacina, tem sido expressa em plantas transgênicas, e mostram ter atividade funcional. (Tacker et al., 2000, J. Infect. Dis., 182:302; e Thanavala et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 102:3378). Adicionalmente, a administração de plantas transgênicas não-processadas que expressam antígeno de superfície maior de hepatite B em voluntários humanos não-imunizados resulta em produção de resposta imune (Kapusta etal., 1999, FASEB J., 13:1796).
Um sistema para expressão de polipeptídeos em plantas utiliza vetores virais projetados para expressar seqüências estranhas (por exemplo, expressão transiente). Esta aproximação permite o uso de plantas saudáveis não-transgênicas como sistemas de produção rápidos. Desse modo, plantas geneticamente projetadas e plantas infectadas com vírus de planta recombinantes que servem como "fábricas verdes" para gerar rapidamente e produzir proteínas específicas de interesse. Vírus de planta têm certas vantagens que os tornam atrativos como vetores de expressão para produção de proteína estranha. Vários membros de vírus de RNA de planta têm sido bem-caracterizados, e clones de cDNA infecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez que o material genético viral infeccioso entre em uma célula hospedeira susceptível, ele replica a altos níveis e se espalha rapidamente através de toda a planta. Existem várias aproximações para produção de polipeptídeos alvos usando vetores de expressão viral de planta, incluindo incorporação de polipeptídeos alvos nos genomas virais. Uma aproximação envolve projeto de proteínas de revestimento de vírus que infectam bactéria, animais ou plantas, para funcionarem como moléculas veículos para peptídeos antigênicos. Referidas proteínas veículos têm o potencial de agregar e formar partículas similares a vírus recombinante que revelam epitopos antigênicos desejados. Esta aproximação permite produção eficiente de tempo de vacinas candidatas, visto que a natureza da partícula de uma vacina candidata facilita recuperação fácil e de custo eficaz do tecido de planta. Vantagens adicionais incluem imunogenicidade específica de alvo aumentada, o potencial para incorporar determinantes múltiplos de vacina, e facilidade de formulação em vacinas que pode ser distribuída nasal, oral ou parenteralmente. Como um exemplo, folhas de espinafre contendo partículas virais de planta recombinantes transportando epitopos de vírus fundidos para proteína de revestimento têm resposta imune gerada após administração (Modelska etal., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 95:2481; e Yusibov etal., 2002, Vaccine, 19/20:3155).
Sistemas de Expressão de Planta Qualquer planta susceptível a incorporação e/ou manutenção de ácido nucléico heterólogo, e capaz de produzir proteína heteróloga, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em geral, será freqüentemente desejável utilizar plantas que são responsáveis pelo crescimento sob condições definidas, por exemplo, em uma estufa e/ou em sistemas aquosos. Po- de ser desejável selecionar plantas que não são tipicamente consumidas pelos seres humanos ou animais domesticado, e/ou não são tipicamente parte da cadeia de alimentação humana, de modo que elas podem ser crescidas do lado de fora sem interesse que polinucleotídeo expresso possa ser indesejavelmente ingerido. Em algumas concretizações, contudo, será desejável empregar plantas comestíveis. Será desejável utilizar plantas que acumulam polipeptídeos expressos em porções comestíveis de uma planta.
Freqüentemente, certas características de planta desejáveis serão determinadas pelo polinucleotídeo particular a ser expresso. Para dar, mas uns poucos exemplos, quando um polinucleotídeo codifica uma proteína a ser produzida em alto rendimento (conforme será frequentemente o caso, por exemplo, quando proteínas de antígeno são para serem expressas), será freqüentemente desejável selecionar plantas com biomassa relativamente alta (por exemplo, tabaco, que tem vantagens adicionais que são altamente susceptíveis a infecção viral, tem um período de crescimento curto, e não está na cadeia de alimentação humana). Onde um polinucleotídeo codifica proteína de antígeno cuja atividade total requer (ou é inibida por) uma modificação pós-translacional particular, a capacidade (ou inabilidade) de certas espécies de planta em efetuar modificação relevante (por exemplo, uma gli-cosilação particular) pode direcionar seleção. Por exemplo, as plantas são capazes de efetuar certas modificações pós-translacionais (por exemplo, glicosilação); contudo, as plantas não gerarão modelos de sialação que é encontrado em modificações pós-translacionais de mamífero. Desse modo, a produção de planta de antígeno pode resultar na produção de uma entidade diferente do que a seqüência de proteína idêntica em sistemas alternativos.
Em certas concretizações da invenção, plantas de colheita, ou plantas relacionadas à colheita, são utilizadas. Em certas concretizações específicas, plantas comestíveis são utilizadas.
Plantas para uso de acordo com a presente invenção incluem Angiospermas, Briófitos (por exemplo, Hepaticae, Musci, etc), Pterofitos (por exemplo, samambaias, rabo-de-cavalo, licopódio), Gimnospermas (por e- xemplo, coníferas, cicase, Ginko, Gnetales), e Algas (por exemplo, Clorofí-ceas, Faeofíceas, Rodofíceas, Mixofíceas, Xantofícea, e Euglenofícea). Plantas exemplares são membros da família Leguminosas (Febaceae; por exemplo, ervilha, alfafa, feijão-soja); Gramíneas (Poaceae; por exemplo, milho, trigo, arroz); Solanaceae, particularmente do gênero Lycopersicon (por exemplo, tomate), Solanum (por exemplo, tomate, berinjela), Capsium (por exemplo, pimenta), ou Nicotiana (por exemplo, tabaco); Umbelliferae, particularmente do gênero Daucus (por exemplo, cenoura), Apium (por exemplo, aipo, ou Rutuceae (por exemplo, laranjas); Compositae, particularmente do gênero Lactuca (por exemplo, alface), Brassicaceae (Cruciferae), particularmente do gênero Brassica ou Sinapis). Em certas espécies, as plantas da invenção podem ser plantas do gênero Brassica ou Arabidopsis. Alguns membros da família Brassicaceae exemplares incluem Brassica campestris, B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra, B. oleracae, B. tournifortii, Sinapis alba, e Rapharnus sativus. Algumas plantas adequadas que são melhoráveis a transformação e são comestíveis como brotos germinados incluem alfafa, munguba, rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo, ruibarbo, uma folha de planta folhosa tal como repolho ou alface, agrião, ervas tais como salsa, trevo, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.
Introdução de Vetores e Plantas Em geral, vetores podem ser distribuídos para plantas de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, os vetores podem ser diretamente aplicados a plantas (por exemplo, inoculações abrasivas virais, inoculações de pulverização mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula, ou eletroporação). Alternativa ou adicionalmente, virions podem ser preparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e podem ser aplicados a outras plantas de acordo com técnicas conhecidas.
Uma ampla variedade de vírus é conhecida que infecta várias espécies de planta, e pode ser empregada para expressão de polinucleotídeo de acordo com a presente invenção (vide, por exemplo, em The Classi-fication and Nomenclature of Viruses, "Sixth Report of the International Com- mittee on Taxonomy of Viruses" (Ed. Murphy et at), Springer Verlag; New York, 1995, os conteúdos totais dos quais sendo aqui incorporados por referência; Grierson et al., Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984; Gluzman et al., Communictions in Molecular Biology; Viral Vec-tors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189; e Mathew, Plant Viruses Online (http://image.fs.uidaho.edu/vide/). Em certas concretizações da invenção preferivelmente do que distribuição de um vetor viral simples a uma célula de planta, vetores diferentes múltiplos são distribuídos que, juntos, permitem replicação (e, opcionalmente, movimento de célula a célula e/ou de longa distância) de vetor(es) viral(is). Algumas ou todas das proteínas podem ser codificadas pelo genoma de plantas transgênicas. Em certos aspectos, descritos em maiores detalhes aqui, estes sistemas incluem um ou mais componentes de vetor viral.
Sistemas de vetores que incluem componentes de dois vírus de planta heteróloga de modo a alcançar um sistema que infecta prontamente uma faixa ampla de tipos de planta ainda impõem pouco ou nenhum risco de difusão de infecção. Um sistema exemplar foi descrito anteriormente (vide, por exemplo, publicação PCT WO 00/25574 e Publicação de Patente dos Estados Unidos 2005/0026291, ambas das quais sendo incorporadas aqui por referência. Conforme notado aqui, em aspectos particulares da presente invenção, vetores virais são aplicados a plantas (por exemplo, planta, porção de planta, broto, etc), por exemplo, através da infiltração ou inoculação mecânica, pulverização, etc. Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta de um genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usada para preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente empregados de acordo com a presente invenção têm genomas de ssRNA. ssRNA pode ser preparado por transcrição de uma cópia de DNA do genoma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vitro ou in vivo. Dada à pronta disponibilidade de sistemas de transcrição in vitro de facilidade de uso (por exemplo, SP6, T7, lisato reticulócito, etc), e também a conveniência de manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado que os vetores de ssRNA da invenção freqüentemente serão preparados por transcrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase.
Em certas concretizações da invenção preferivelmente do que introdução de um tipo de vetor viral simples em uma planta, vetores virais diferentes múltiplos são introduzidos. Tais vetores podem, por exemplo, trans-complementar um outro com relação às funções de tal replicação, movimento de célula a célula, e/ou movimento de longa distância. Os vetores podem conter polinucleotídeos diferentes que codificam antígeno de gripe da invenção. A seleção para planta(s) ou porções desta(s) que expressam polipeptídeos múltiplos que codificam um ou mais antígeno(s) de gripe pode ser realizada conforme descrito acima para polinucleotídeos ou polipeptídeos simples.
Sistemas de Expressão de Tecido de Planta Conforme discutido acima, de acordo com a presente invenção, antígenos da gripe podem ser produzidos em qualquer sistema desejável. Constructo de vetores e sistemas de expressão são bem-conhecidos na técnica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antígenos de gripe aqui providos. Por exemplo, produção de planta transgênica é conhecida, e geração de constructo e produção de planta podem ser adaptadas de acordo com técnicas conhecidas na técnica. Em algumas concretizações, sistemas de expressão transiente em plantas são desejáveis. Dois destes sistemas incluem produção de raízes clonais e sistemas de planta clonal, e derivados destes, bem como produção de sistemas de brotos germinados.
Plantas Clonais As raízes clonais mantêm vetores de expressão viral de RNA, e produzem estavelmente proteína-alvo uniformemente na raiz total sobre períodos estendidos de tempo e subculturas múltiplas. Em contraste às plantas, onde o gene-alvo é eliminado via recombinação durante movimento de célula a célula ou de longa distância, em culturas de raiz, a integridade de um vetor viral é mantida e níveis de proteína-alvo produzida sobre o tempo são similares àqueles observados durante classificação inicial. As raízes clonais permitem facilidade de produção de material de proteína heteróloga para formulação oral de antígeno e composições de vacina. Métodos e rea- gentes para geração de uma variedade de entidades clonais derivadas de plantas que são úteis para a produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção) foram descritos anteriormente, e são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Publicação PCT WO 05/81905, que é incorporada aqui por referência). As entidades clonais incluem linhas de raiz clonal, linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula de planta clonal, e plantas clonais capazes de produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção). A invenção proporciona adicionalmente métodos e reagentes para expressão de polinucleotídeo de antígeno e produtos de polipeptídeo em linhas de célula clonal derivadas de vários tecidos de planta (por exemplo, raízes, folhas), e em plantas totais derivadas de células simples (plantas clonais). Tais métodos são tipicamente baseados no uso de vetores de planta viral de vários tipos.
Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona métodos de obtenção de uma linha de raiz clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe compreendendo as etapas de: (i) introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno da gripe da invenção em uma planta ou porção desta; e (ii) geração de uma ou mais linhas de raiz clonal a partir de uma planta. As linhas de raiz clonal podem ser geradas, por exemplo, pela infecção de uma planta ou porção de planta (por exemplo, uma peça colhida de planta) com um Agrobacterium (por exemplo, A. Rhizogenes) que causa formação de raízes com pêlos. As linhas de raiz clonal podem ser classificadas em vários modos para identificar linhas que mantêm vírus, linhas que expressam um polinucleotídeos que codificam um antígeno da gripe da invenção em altos níveis, etc. A invenção proporciona adicionalmente linhas de raiz clonal, por exemplo, linhas de raiz clonal produzidas de acordo com os métodos da invenção, e envolve adicionalmente métodos de expressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeo(s) que codifica(m) antígeno(s) da gripe da invenção u-sando as linhas de raiz clonal. A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração de uma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica an- tígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica um antígeno da gripe da invenção: (ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células sob condições adequadas para proliferação de célula de raiz. A invenção proporciona linhas de célula de raiz e métodos de expressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos usando linhas de célula de raiz clonal.
Em um aspecto, a invenção proporciona métodos de geração de uma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células em cultura sob condições apropriadas para proliferação de célula de raiz. A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração de uma linha de célula de planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção em células de uma linha de célula de planta mantida na cultura; e (ii) enriquecimento das células que contêm o vetor viral. O enriquecimento pode ser realizado, por exemplo, por (i) remoção de uma porção das células a partir da cultura; (ii) diluição das células removidas de modo a reduzir a concentração de célula; (iii) permitindo que as células diluídas proliferem; e (iv) classificação das células que contêm o vetor viral. As linhas de célula de planta clonal podem ser usadas para produção de um antígeno da gripe de acordo com a presente invenção. A invenção inclui um número de métodos de geração de plantas clonais, células das quais contêm um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. Por exemplo, a invenção proporciona métodos de geração de uma planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo as etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células liberadas sob condições apropriadas para formação de uma planta. A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração de uma planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linha célula de planta clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção; e (ii) manutenção das células sob condições apropriadas para formação de uma planta. Em geral, as plantas clonais de acordo com a invenção podem expressar qualquer polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. Tais plantas clonais podem ser usadas para produção de um polipeptídeo de antígeno.
Conforme notado acima, a presente invenção proporciona sistemas para expressão de um polinucleotídeo ou polinucleotídeo(s) que codificam antígeno(s) da gripe da invenção em linhas de raiz clonal, linhas de raiz clonal, linhas de planta clonal (por exemplo, as linhas de célula derivadas de folha, caule, etc), e em plantas clonais. Um polinucleotídeo de codificação de antígeno da gripe da invenção é introduzido em uma célula de planta ancestral usando um vetor viral de planta cujo genoma inclui o polinucleotídeo de codificação de um antígeno da gripe da invenção operavelmen-te ligado a (isto é, sob controle de) um promotor. Uma linha de célula clonal ou linha de célula de planta clonal é estabelecida de uma célula contendo o vírus de acordo com qualquer de várias técnicas adicionalmente descritas abaixo. O vetor de vírus de planta ou porções deste pode ser introduzido em uma célula de planta por infecção, pela inoculação com uma transcrição viral ou clone de cDNA infeccioso, por eletroporação, por transferência de gene mediada por T-DNA, etc.
As seções que se seguem descrevem métodos para geração de linhas de raiz de clonal, linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula de planta clonal, e plantas clonais que expressam um polinucleotídeo que codi- fica antígeno da gripe da invenção são, em seguida, descritas. Uma "linha de raiz é distinguida de uma "linha de célula de raiz" em que uma linha de raiz produz estruturas atuais similares à raiz ou raízes, enquanto uma linha de célula de raiz consiste em células de raiz que não formam estruturas similares à raiz". O uso do termo "linha" é pretendido para indicar que células da linha podem proliferar e passar informação genética para as células de pro-genia. As células de uma linha de célula tipicamente proliferam na cultura sem ser parte de uma estrutura organizada, tal como aquela encontrada em uma planta intacta. O uso do termo "linha de raiz" é pretendido para indicar que as células na estrutura de raiz podem proliferar sem ser parte de uma planta completa. É notado que o termo "célula de planta" envolve raízes de célula. Contudo, para distinguir os métodos da invenção para gerar linhas de raiz e linhas de célula de raiz daqueles usados para gerar diretamente linhas de célula de planta de tecido sem raiz (conforme oposto para gerar linhas de célula de planta clonal de linhas de raiz clonal ou plantas clonais derivadas de linhas de raiz clonal), os termos "célula de planta" e "linha de célula de planta" conforme usados aqui, geralmente se referem a células e linhas de célula que consistem de tecido de planta sem raiz. As células de planta podem ser, por exemplo, folha, caule, broto, parte de flor, etc. É notado que sementes podem ser derivadas das plantas clonais geradas como derivadas aqui. Tais sementes também conterão um vetor viral como plantas obtidas de tais sementes. Métodos para obtenção de estoques de semente são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos 2004/0093643).
Linhas de Raiz Clonal A presente invenção proporciona sistemas para geração de uma linha de raiz clonal em que um vetor de planta viral é usado para direcionar expressão de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. Um ou mais vetores de expressão incluindo um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção operavelmente ligado a um promotor são introduzidos em uma planta ou uma porção desta de acordo com qualquer de uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, folhas de planta podem ser inoculadas com transcrições virais. Os próprios vetores podem ser diretamente aplicados a plantas (por exemplo, via inoculações abrasivas, inoculações de spray mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula, ou eletroporação). Alternativa ou adicionalmente, virions podem ser preparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e aplicados a outras plantas de acordo com técnicas conhecidas.
Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta de um genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usada para preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente empregados de acordo com a presente invenção têm genomas de ssRNA. ss-RNA podem ser preparados por transcrição de uma cópia de DNA do genoma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vivo ou in vitro. Dada a pronta disponibilidade de facilidade de uso de sistemas de transcrição in vitro (por exemplo, SP6, T7, lisato reticulócito, etc), e também a conveniência de manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado que os vetores de ssRNA da invenção serão freqüentemente preparados por transcrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase. Clones de cDNA infecciosos podem ser usados. Transferência de gene mediada agro-bacterialmente pode ser usada para transferir ácidos nucléicos virais, tais como vetores virais (ou genomas virais totais ou porções destes) em células de planta usando-se, por exemplo, agro-infiltração, de acordo com métodos conhecidos na técnica. A planta ou porção de planta pode, em seguida, ser mantida (por exemplo, cultivada ou crescida) sob condições adequadas para replica-ção de uma transcrição viral. Em certas concretizações da invenção, o vírus se espalha além de uma célula iniciatmente inoculada, por exemplo, localmente de célula a célula e/ou sistemicamente de uma folha inicialmente inoculada em folhas adicionais. Contudo, em algumas concretizações da invenção, o vírus não se espalha. Desse modo, um vetor viral pode conter genes que codificam MP e/ou CP funcionais, mas podem estar carecendo de um ou ambos de tais genes. Em geral, um vetor viral é introduzido em células múltiplas (infectadas) em uma planta ou porção desta.
Em seguida a introdução de um vetor viral na planta, folhas são colhidas. Em geral, as folhas podem ser colhidas a qualquer tempo em seguida a introdução de um vetor viral. Contudo, pode ser desejável manter a planta por um período de tempo em seguida à introdução de um vetor viral na planta, por exemplo, um período de tempo suficiente para replicação e, opcionalmente, difusão do vírus a partir das células nas quais foi inicialmente introduzido. Uma cultura de raiz clonal (ou culturas múltiplas) é preparada, por exemplo, por métodos conhecidos adicionalmente descritos abaixo.
Em geral, qualquer método disponível pode ser usado para preparar uma cultura de raiz clonal de uma planta ou tecido de planta em que um vetor viral foi introduzido. Tal método emprega genes que existem em certos plasmídeos bacteriais. Estes plasmídeos são encontrados em várias espécies de Agrobacterium que infectam e transferem DNA a uma ampla variedade de organismos. Como um gênero, Agrobacterium pode transferir DNA a um conjunto grande e diverso de tipos de planta, incluindo numerosas espécies de angiosperma dicot e monocot e gimnosperma (vide Gelvin, 2003, Microbial. Mol. Biol. Rev., 67:16, e referências neste, todos dos quais sendo incorporados aqui por referência). A base molecular de transformação genética de células de planta é transferência de uma bactéria e integração em um genoma nuclear de planta de uma região de um grande plasmídeo (Ri) rizogênico ou (Ti) de indução de um tumor que reside dentro de várias espécies de Agrobacterium. Esta região é referida como a "região T", quando presente no plasmídeo, e como "T-DNA" quando excizado a partir do plasmídeo. Geralmente, uma molécula de T-DNA de filamento simples é transferida para uma célula de planta na infecção Agrobacterial que ocorre naturalmente, e é, por último, incorporada (na forma de filamento duplo) no genoma. Sistemas baseados nos plasmídeos Ti são amplamente usados para introdução de material genético estranho em plantas, e para produção de plantas transgênicas. A infecção de plantas com várias espécies de Agrobacterium e transferência do T-DNA tem um número de efeitos. Por exemplo, A. tumefaciens causa doença de bile de coroa, enquanto A. rhizogenes causa desen- volvimento de raízes com pelos no local de infecção, uma condição conhecida como "doença de raiz com pêlo". Cada raiz ocorre de uma célula geneticamente transformada simples. Desse modo, as células de raiz nas raízes são clonais, e cada raiz representa uma população clonal de células. Raízes produzidas por infecção de A. rhizogenes são caracterizadas por uma alta taxa de crescimento e estabilidade genética (Giri et al., 2000., Biotech. Adv., 18:1, e referências neste, todas das quais sendo aqui incorporadas por referência). Em adição, tais raízes são capazes de regenerar plantas geneticamente estáveis (Giri etal., 2000, supra).
Em geral, a presente invenção envolve o uso de qualquer cepa de Agrobacteria (por exemplo, qualquer cepa de A. rhizogene) que é capaz de induzir formação de raízes de células de planta. Conforme mencionado acima, uma porção do plasmídeo Ri (Ri-T-DNA) é responsável por causar doença de raiz com pelo. Enquanto transferência desta porção do plasmídeo Ri para células de planta pode convenientemente ser acompanhada por infecção com Agrobacteria que abriga o plasmídeo Ri, a invenção envolve o uso de vários outros métodos de introdução da região relevante em uma célula de planta. Tais métodos incluem qualquer método disponível de introdução de células de planta em material genético incluindo, mas não limitada a, biolísticos, eletroporação, entendimento de DNA mediado por PEG, vetores baseados em Ti, etc. Porções relevantes do Ri T-DNA podem ser introduzidas em células de planta pelo uso de um vetor viral. Os genes de Ri podem ser incluídos no mesmo vetor que contém um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção, ou em um vetor viral diferente, que pode ser o mesmo, ou um tipo diferente daquele vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. É notado que o Ri-T-DNA total não pode ser requerido para produção de raízes com pêlos, e a invenção envolve o uso de porções do Ri-T-DNA, provido que tais porções contêm material genético suficiente para induzir formação de raiz, conforme conhecido na técnica. Material genético adicional, por exemplo, genes presentes dentro do plasmídeo Ri, mas não dentro do T-DNA, pode ser transferido para uma célula de planta de acordo com a invenção, particularmente genes onde os produtos de expressão facilitam integração do T-DNA no DNA de célula de planta.
De modo a preparar uma linha de raiz clonal de acordo com certas concretizações da invenção, porções de folha colhidas são contactadas com A. rhizogenes sob condições adequadas para infecção e transformação. Porções de folha são mantidas na cultura para permitir desenvolvimento de raízes com pelos. Cada raiz é clonal, isto é, células na raiz são derivadas de uma célula ancestral simples na qual o Ri T-DNA foi transferido. De acordo com a invenção, uma porção de tais células ancestrais conterá um vetor viral. Desse modo, as células em uma raiz derivada de tais células ancestral conterão um vetor viral, visto que elas serão replicadas e serão transmitidas durante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterão o vetor viral. É notado que desde que um vetor viral é herdado de células filhas dentro de uma raiz clonal, o movimento de um vetor viral dentro da raiz não é necessário para manter o vetor viral através de toda a raiz. As raízes com pelos clonais individuais podem ser removidas de uma porção de folha e adicionalmente cultivadas. Tais raízes também são referidas aqui como linhas de raiz. Raízes clonais isoladas continuam a crescer em seguida ao isolamento.
Uma variedade de linhas de raiz clonal diferentes foi gerada u-sando os métodos da invenção. As linhas de raiz foram geradas usando vetores virais contendo polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção (por exemplo, codificando peptídeo imunogênico). As linhas de raiz foram testadas por Western blot. As linhas de raiz revelam uma variedade de níveis de expressão diferentes de vários polipeptídeos. As linhas de raiz que revelam alta expressão foram selecionadas e adicionalmente cultivadas. As linhas de raiz foram subseqüentemente testadas novamente e mostradas para manter altos níveis de expressão sobre períodos estendidos de tempo, incluindo estabilidade. Níveis de expressão foram comparáveis a ou maiores do que expressão em plantas intactas infectadas com o mesmo vetor viral usado para gerar linhas de raiz clonal. Em adição, a estabilidade de expressão das linhas de raiz foi obtida em plantas infectadas com o mesmo vetor viral. Até 80% de tais plantas infectadas com vírus revertidas em tipo selvagem após 2-3 passagens. (Tais passagens envolvem inoculação de plantas com transcrições, permitindo que a infecção (local ou sistêmica) se torne estabelecida, tomando uma amostra de folha, e inoculando plantas recentes que são subseqüentemente testadas para expressão).
As linhas de raiz podem ser cultivadas em uma grande escala para produção de antígeno dos polipeptídeos da invenção conforme discutido adicionalmente abaixo. É notado que linhas de raiz clonal (e linhas de célula derivadas de linhas de raiz clonal) podem geralmente ser mantidas no meio que não inclui vários compostos, por exemplo, hormônios de crescimento de planta, tais como auxinas, citoquinas, etc, que são tipicamente empregadas na cultura de raiz e células de planta. Esta característica reduz o dispêndio associado com cultura de tecido, e os inventores esperam que contribuirá significantemente à praticabilidade econômica de produção de proteína usando plantas.
Qualquer de uma variedade de métodos pode ser usada para selecionar raízes clonais que expressam um polinucleotídeo que codifica antígeno(s) da gripe da invenção. Western blots, ensaios ELISA, etc, podem ser usados para detectar um polipeptídeo codificado. No caso de marcadores detectáveis, tais como GFP, métodos alternativos, tais como classificações visuais, podem ser realizados. Se um vetor viral compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável é usado, uma seleção apropriada pode ser imposta (por exemplo, o material de folha e/ou raízes derivadas deste podem ser cultivados na presença de uma condição antibiótica ou nutricional apropriadas e raízes sobreviventes identificadas e isoladas). Certos vetores virais contêm dois ou mais polinucleotídeos que codificam antígeno da gripe da invenção, por exemplo, dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídeos diferentes. Se um destes é um marcador selecionável ou detectável, as raízes clonais que são selecionadas ou detectadas por seleção ou detecção de expressão do marcador terão uma alta probabilidade de também expressar o segundo polinucleotídeo. A classificação de linhas de raiz que contêm polinucleotídeos particulares pode ser realizada usando PCR e outros métodos de detecção de ácido nucléico.
Alternativa ou adicionalmente, linhas de raiz clonal podem ser classificadas pela presença do vírus pela inoculação de plantas hospedeiras que formarão lesões locais como um resultado de infecção de vírus (por e-xemplo, plantas hospedeiras hipersensíveis). Por exemplo, 5 mg de tecido de raiz pode ser homogeneizado em 50 pl de tampão de fosfato, e usado para inocular uma folha simples de uma planta de tabaco. Se o vírus está presente em culturas de raiz, dentro de dois ou três dias lesões características aparecerão nas folhas infectadas. Isto significa que a linha de raiz contém vírus recombinante que transporta o polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção (gene-alvo). Se nenhuma lesão local é formada, não existe vírus, e a linha de raiz é rejeitada como negativa. Este método é altamente eficiente em tempo e custo. Após classificar inicialmente a presença de vírus, as raízes que contêm o vírus podem ser submetidas à classificação secundária, por exemplo, por Western blot ou ELISA para selecionar altos expressores. Classificações adicionais, por exemplo, classificações para crescimento rápido, crescimento em meio particular, ou sob condições ambientais particulares, etc, podem ser aplicados. Estes métodos de classificação podem, em geral, serem aplicados no desenvolvimento de qualquer das linhas de raiz clonal, linhas de célula clonal, linhas de célula de planta clonal, e/ou plantas clonais aqui descritas.
Conforme será evidente a um versado na técnica, uma variedade de modificações pode ser feita à descrição dos métodos da invenção para gerar linhas de raiz clonal que contêm um vetor viral. Tais modificações estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, enquanto é geralmente desejável introduzir o vetor viral em uma planta intacta ou proteína desta antes da introdução dos genes de Ri-T-DNA, em certas concretizações da invenção o Ri-DNA é introduzido antes da introdução do vetor viral. Em adição, é possível contactar plantas intactas com A. rhizogenes preferivelmente do que colheita de porções de folha e, em seguida, expondo-as ao bacteri- um.
Outros métodos de gerar linhas de raiz clonais de células simples da planta ou porção desta que abriga um vetor viral podem ser usados (isto é, métodos não usando A. rhizogenes ou material genético a partir de plasmídeo Ri). Por exemplo, tratamento com certos hormônios de planta ou combinações de hormônios de planta é conhecido para resultar na geração de raízes de tecido de planta.
Linhas de Célula Clonal Derivadas de Linhas de Raiz Clonal Conforme descrito acima, a invenção proporciona métodos para gerar linhas de raiz clonais, no qual as células nas linhas de raiz contêm um vetor viral. Conforme é bem-conhecido na técnica, uma variedade de linhas de célula diferentes pode ser gerada de raízes. Por exemplo, linhas de raiz de célula podem ser geradas de células de raiz individuais obtidas a partir da raiz usando uma variedade de métodos conhecidos. Tais linhas de célula de raiz podem ser obtidas de vários tipos de célula de raiz diferentes dentro da raiz. Em geral, o material de raiz é colhido e dissociado (por exemplo, fisicamente e/ou enzimaticamente digerido) para liberar células de raiz individuais, que são, em seguida, adicionalmente cultivadas. A formação completa de protoplasto não é geralmente necessária. Se desejado, células de raiz podem ser revestidas em concentrações de célula muito diluídas, de modo a obter linhas de célula de raiz de células de raiz simples. Linhas de célula de raiz derivadas dessa maneira são linhas de célula clonais contendo o vetor viral. Tais linhas de célula de raiz, portanto, exibem expressão estável do polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. As linhas de célula de planta clonais podem ser obtidas em uma maneira similar a partir de raízes clonais, por exemplo, por cultura de células de raiz dissociadas na presença dos hormônios de planta apropriados. Classificações e etapas sucessivas de enriquecimento podem ser usadas para identificar linhas de célula que expressam o polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção em níveis altos. Contudo, se a linha de raiz clonal da qual a linha de célula é derivada já expressa em altos níveis, tais classificações adicionais podem ser desnecessárias.
Como no caso das linhas de célula clonais, as células de uma linha de célula de raiz clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e, conterá, portanto, também o vetor viral, visto que ele será replicado, e será transmitido durante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterão o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral é herdado pelas células filhas dentro da linha de célula de raiz clonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessário para manter o vetor viral. As linhas de célula de raiz clonais podem ser usadas de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção conforme descrito abaixo.
Linhas de Célula de Planta Clonal A presente invenção proporciona métodos para gerar uma linha de célula de planta clonal na qual um vetor viral de planta é usado para direcionar expressão de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. De acordo com o método da invenção, um ou mais vetor(es) de expressão viral incluindo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de gripe da invenção ligado operavelmente a um promotor é introduzido em células de uma linha de célula de planta que é mantida na cultura de célula. Um número de linhas de célula de plantas de vários tipos de planta é conhecido na técnica, qualquer dos quais podendo ser usado. Linhas de célula recentemente derivadas podem ser geradas de acordo com métodos conhecidos para uso na prática da invenção. Um vetor viral é introduzido nas células da linha de célula de planta de acordo com qualquer de um número de métodos. Por exemplo, protoplastos podem ser produzidos e transcrições virais em seguida eletroporadas nas células. Outros métodos de introdução de um vetor viral de planta nas células de uma linha de célula de planta podem ser usados.
Um método de gerar linhas de célula de planta clonais, de acordo com a invenção, e um vetor viral para introdução em células de planta (por exemplo, protoplastos), podem ser usados conforme segue: em seguida a introdução do vetor viral, a linha de célula de planta pode ser mantida na cultura de tecido. Durante este tempo, o vetor viral pode replicar, e os polipeptídeos que codificam antígeno da gripe da invenção podem ser expressos. As linhas de célula de planta clonais são derivadas a partir da cultura, por exemplo, por um processo de enriquecimento sucessivo. Por exemplo, amostras podem ser removidas da cultura, opcionalmente com diluição de modo que a concentração de células é baixa, e revestidas em placas de Pe-tri em gotículas individuais. As gotículas são, em seguida, mantidas para permitir divisão de célula.
Será apreciado que as gotículas podem conter um número variável de células, dependendo da densidade inicial da cultura e da quantidade de diluição. As células podem ser diluídas tal que muitas gotículas contêm ou 0 ou 1 célula se é desejado obter-se linhas de célula clonais expressando o polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invenção após somente uma etapa simples de enriquecimento. Contudo, pode ser mais eficiente selecionar uma concentração tal que células múltiplas estejam presentes em cada gotícula e, em seguida, classificar as gotículas para identificar aquelas que contêm expressão de células. Em geral, qualquer procedimento de classificação apropriado pode ser empregado. Por exemplo, seleção ou detecção de um marcador detectável, tal como GFP, pode ser usado. Western blots ou ensaios ELISA podem ser usados. Gotículas individuais (100 pl) contêm mais do que células o bastante para realização destes ensaios. Etapas múltiplas de enriquecimento são realizadas para isolar linhas de célula de expressão mais altas. Linhas de célula de planta clonais simples (isto é, populações derivadas de uma célula ancestral simples) podem ser geradas por limitação adicional de diluição usando-se métodos padrão para clonagem de célula simples. Contudo, é necessário isolar linhas clonais individuais. Uma população contendo linhas de célula clonais múltiplas pode ser u-sada de um polipeptídeo que codifica antígeno(s) da gripe da invenção.
Em geral, certas concretizações acima descritas para geração de linhas de raiz clonais se aplicam a geração de linhas de célula de planta clonais. Por exemplo, uma diversidade de vetores virais contendo um ou mais polipeptídeos que codificam antígeno(s) da gripe da invenção pode ser usada como podem combinações de vetores diferentes múltiplos. Métodos de classificação similares podem ser usados. Como no caso das linhas de raiz clonais e linhas de célula de raiz clonais, células de uma linha de célula de planta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral é herdado por células filhas dentro da linha de célula de planta clonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessário para manter o vetor viral. A linha de célula de planta clonal pode ser usada para produção de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invenção conforme descrito abaixo.
Plantas Clonais Plantas clonais podem ser geradas a partir de raízes clonais, linhas de célula de raiz clonais, e/ou linhas de célula de planta clonais produzidas de acordo com os vários métodos acima descritos. Métodos para geração de plantas a partir de raízes, linhas de célula de raízes, e linhas de célula de plantas, tais como as linhas de raiz clonais, linhas de célula de raiz clonais, e linhas de célula de planta clonais aqui descritas são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Peres et al, 2001, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 65:37; e referência modelo operam na biologia molecular de planta e biotecnologia citadas aqui). A invenção proporciona, portanto, um método de gerar uma planta clonal compreendendo etapas de (i) gerar uma linha de raiz clonal, linha de célula de raiz clonal, ou linha de célu- clonais e linhas de célula de planta clonais, as células de uma planta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral é herdado por células filhas dentro da planta clonal, o movimento do vetor viral não é necessário para manter o vetor viral.
Sistemas de Expressão de Planta de Brotos e Brotos Germinados Sistemas e reagentes para gerar uma variedade de brotos e brotos germinados que são úteis para a produção de antígeno(s) de gripe de acordo com a presente invenção foram descritos anteriormente e são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Publicação PCT WO 04/43886, que é aqui incorporada por referência). A presente invenção proporciona adicionalmente brotos germinados, que podem ser comíveis, como uma biomassa contendo um peptídeo ou proteína de antígeno de gripe. Em certos aspectos, a biomassa é provida diretamente para consumo de composições de antígeno. Em alguns aspectos, a biomassa é processada antes do consumo, por exemplo, por homogeneização, trituração, secagem ou extração. Em certos aspectos, o antígeno de gripe é purificado a partir da biomassa e formulado em uma composição farmacêutica.
Adicionalmente providos são métodos para produção de antíge-no(s) de gripe em brotos germinados que podem ser consumidos ou colhidos vivos (por exemplo, brotos germinados do gênero Brassica). Em certos aspectos, a presente invenção envolve crescimento de uma semente a um broto germinado comestível em um ambiente regulável contido (por exemplo, internos, em um recipiente, etc). A semente pode ser uma semente geneticamente projetada que contém um cassete de expressão que codifica um antígeno de gripe, cuja expressão é acionada por um promotor exoge-namente induzível. Uma variedade de promotores exogenamente induzíveis pode ser usada que sejam induzíveis, por exemplo, por luz, calor, fitohormô-nios, nutrientes, etc.
Em concretizações relacionadas, a presente invenção proporciona métodos de produção de antígeno(s) de gripe em brotos germinados primeiro pela geração de um estoque de semente para o broto germinado pela transformação de plantas com um cassete de expressão que codifica antígeno de gripe usando sistema de transformação de Agrobacterium, no qual a expressão do antígeno de gripe é acionada por um promotor induzí-vel. Sementes transgênicas podem ser obtidas a partir da planta transformada, crescida em um ambiente regulável contido, e induzida para expressar o antígeno de gripe.
Em algumas concretizações, métodos são providos que envolvem infecção de brotos germinados com um cassete de expressão viral que codifica um antígeno de gripe, expressão da qual pode ser acionada por qualquer de um promotor viral ou um promotor induzível. Os brotos germinados são crescidos por dois a quatorze dias em um ambiente regulável contido, ou pelo menos até que níveis do antígeno de gripe tenham sido obtidos para consumo ou colheita. A presente invenção proporciona adicionalmente sistemas para produção de antígeno(s) de gripe em brotos germinados que incluem uma unidade de alojamento com controle de clima e em broto germinado contendo um cassete de expressão que codifica um ou mais antígenos de gripe, no qual expressão é acionada por um promotor constitutivo ou induzível. Os sistemas da invenção podem proporcionar vantagens únicas sobre o ambiente externo ou estufa, que não podem ser controlados. Desse modo, a presente invenção capacita ao cultivador precisar o tempo de indução de expressão do antígeno de gripe. Ele pode também reduzir grandemente o custo de produção de antígeno(s) de gripe.
Em certos aspectos, brotos transientemente transfectados contêm seqüências de vetor viral que codificam um antígeno de gripe da invenção. Os brotos são crescidos por um período de tempo de modo a permitir produção de um ácido nucléico viral no broto, seguido por um período de crescimento no qual cópias múltiplas de vírus são produzidas, resultando, desse modo, na produção de antígeno.
Em certos aspectos, sementes geneticamente projetadas ou embriões que contêm um transgene que codifica um antígeno de gripe são crescidos ao estágio de broto de semente em um ambiente regulável contido. O ambiente regulável contido pode ser uma unidade de alojamento ou ambiente no qual as sementes podem ser crescidas interiormente. Todos os fatores ambientais do ambiente regulável contido podem ser controlados. Desde que os brotos não requerem luz e iluminação para crescerem, o que pode ser custoso, as sementes geneticamente projetadas ou embriões podem ser crescidas ao estágio de semente germinada em interiores na ausência de luz.
Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um ambiente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umidade, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação de ar), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açúcar, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico, etc), e similares.
De acordo com certos métodos da presente invenção, expressão do transgene que codifica um antígeno de gripe pode ser controlada por um promotor exogenamente induzível. Promotores exogenamente induzíveis são propensos a aumentar ou diminuir a expressão de um transgene em resposta a um estímulo externo, preferivelmente do que interno. Um número destes fatores ambientais pode agir como indutores para expressão dos transgenes transportados pelos cassetes de expressão dos brotos geneticamente projetados. Os promotores podem ser um promotor induzível de calor, tal como um promotor de choque de calor. Por exemplo, usando-se como um promotor de choque de calor, a temperatura do ambiente contido pode simplesmente ser elevada para induzir expressão do transgene. Outros promotores incluem promotores induzíveis de luz. Os promotores induzíveis de luz podem ser mantidos como promotores constitutivos se a luz no ambiente regulável contido está sempre ligada. Alternativa ou adicionalmente, a expressão do transgene pode ser ligada em um tempo particular durante desenvolvimento ligando-se simplesmente a luz. O promotor pode ser um promotor quimicamente induzível que é usado para induzir expressão da transgene. De acordo com estas concretizações, o químico pode simplesmente ser enevoado ou pulverizado em uma semente, embrião, ou broto para induzir expressão do transgene. A pulverização e enevoamento podem ser precisamente controladas e direcionadas em uma semente particular, embrião, ou broto ao qual é pretendido. O ambiente contido é destituído de vento ou correntes de ar, que podem dispersar o químico para fora a partir do alvo pretendido, de modo que o químico fica no alvo para qual ele foi pretendido.
De acordo com a presente invenção, o tempo de expressão que é induzido pode ser selecionado para maximizar a expressão de um antígeno de gripe no broto de semente pelo tempo de colheita. A indução de expressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por e-xemplo, indução de expressão em um embrião em um número particular de dias após germinação, pode resultar em síntese máxima do antígeno de gripe no tempo de colheita). Por exemplo, a indução de expressão a partir do promotor 4 dias após germinação pode resultar em mais síntese de proteína do que indução de expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5 dias. Aqueles técnicos no assunto apreciarão que a maximização da expressão pode ser alcançada por experimentação de rotina. Em algumas concretizações, os brotos germinados são colhidos em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação.
Em casos onde o vetor de expressão tem um promotor constitutivo ao invés de um promotor induzível, o broto germinado pode ser colhido em um certo tempo após transformação do broto de semente. Por exemplo, se um broto germinado fosse viralmente transformado em um estágio anterior de desenvolvimento, por exemplo, no estágio de embrião, os brotos germinados podem ser colhidos em um tempo quando expressão está em sua pós-transformação máxima, por exemplo, em cerca de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Pode também ser que brotos se desenvolvam um, dois, três ou mais meses pós-transformação, dependendo da germinação da semente.
Geralmente, uma vez que a expressão do antígeno(s) de gripe se inicia, as sementes, embriões ou brotos germinados são permitidos crescerem até que níveis suficientes de antígeno(s) de gripe sejam expressos. Em certos aspectos, níveis suficientes são níveis que proporcionariam um benefício terapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material em bruto ingerido. Alternativa ou adicionalmente, níveis suficientes são níveis dos quais o antígeno de gripe pode ser concentrado ou purificado a partir da biomassa e formulado em uma composição farmacêutica que proporciona um benefício terapêutico a um indivíduo após administração. Tipicamente, o antígeno não é uma proteína expressa no broto germinado na natureza. Em qualquer taxa, o antígeno de gripe é tipicamente expresso em concentrações acima daquela que estaria presente no broto germinado na natureza.
Uma vez que a expressão do antígeno de gripe é induzida, crescimento é permitido continuar até o estágio de broto germinado, em cujo tempo os brotos germinados são colhidos. Os brotos germinados podem ser colhidos vivos. A colheita de brotos germinados vivos tem várias vantagens, incluindo esforço e quebra mínimos. Os brotos germinados da presente invenção podem ser crescidos hidroponicamente, tornando a colheita uma ação simples de se elevar o broto germinado de sua solução hidropônica. Nenhum solo é requerido para o crescimento dos brotos germinados da invenção, mas pode ser provido se considerado necessário ou desejável pelo versado na técnica. Devido aos brotos serem crescidos sem solo, nenhuma limpeza de material de broto germinado é requerida na hora da colheita. Sendo capaz de colher o broto germinado diretamente de seu ambiente hi-dropônico sem lavagem ou esfregamento, minimizando-se a quebra do material colhido. A quebra e definhamento de plantas induzem apoptose. Durante apoptose, certas enzimas proteolíticas tornam-se ativas, que podem degradar a proteína farmacêutica expressa no broto germinado, resultando na atividade terapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por a-poptose pode diminuir significantemente a produção de proteína de plantas maduras. Usando-se os métodos da presente invenção, apoptose pode ser evitada quando nenhuma colheita ocorre até o momento das proteínas serem extraídas da planta.
Por exemplo, brotos vivos podem ser moídos, triturados ou misturados para produzir uma pasta fluida de biomassa de broto germinado, em inibidores de protease contendo tampão. O tampão pode ser mantido a cerca de 4°C. Em alguns aspectos, a biomassa de broto germinado é seca a ar, pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas maduras, alguns destes métodos, tais como secagem a ar, podem resultar em uma perda de atividade da proteína farmacêutica. Contudo, devido aos brotos germinados serem muito pequenos e terem uma grande área superficial em razão de volume, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles técnicos no assunto apreciarão que muitas técnicas para colheita da biomassa que minimizam a proteólise da proteína expressa são disponíveis, e podem ser aplicadas a presente invenção.
Em algumas concretizações, os brotos germinados são comestíveis. Em certas concretizações, os brotos germinados que expressam níveis suficientes de antígenos de gripe são consumidos após colheita (por exemplo, após colheita, dentro de um período mínimo em seguida a colheita), de modo que absolutamente nenhum processamento ocorre antes dos brotos de semente serem consumidos. Desse modo, qualquer quebra prote-olítica induzida pela colheita do antígeno de HPV antes da administração do antígeno de gripe a um paciente em necessidade de tratamento é minimizada. Por exemplo, brotos germinados que estão prontos para serem consumidos podem ser distribuídos diretamente a um paciente. Alternativa ou adicionalmente, sementes geneticamente projetadas ou embriões são distribuídos a um paciente em necessidade de tratamento e desenvolvidos ao estágio de broto germinado pelo paciente. Em um aspecto, um suprimento de brotos germinados geneticamente projetados é provido a um paciente, ou a um médico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoque contínuo de brotos germinados que expressam certos antígenos de gripe pode ser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para populações em paí- ses em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos não são oferecidos ou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da invenção podem ser crescidos torna os brotos germinados da presente invenção particularmente desejáveis para tal população em desenvolvimento. A natureza regulável do ambiente contido concede vantagens para a presente invenção sobre crescimento de plantas no ambiente externo. Em geral, o crescimento de brotos germinados geneticamente projetados que expressa proteínas farmacêuticos em plantas proporciona um produto farmacêutico mais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens) e com menos esforço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvolvimento de plantas geneticamente projetadas. O ambiente regulável contido usado na presente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de polinização cruzada na natureza.
Por exemplo, um promotor induzível de calor do mesmo modo não seria usado nos exteriores porque a temperatura no exterior não pode ser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora que a temperatura exterior se elevasse acima de um certo nível. Similarmente, o promotor seria desligado toda hora que a temperatura externa caísse. Tais alterações de temperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo, ligando a expressão no dia e desligando a noite. Um promotor induzível de calor, tal como aquele aqui descrito, não seria mesmo prático para uso em uma estufa, que é susceptível a alterações climáticas para quase o mesmo grau conforme os exteriores. O crescimento de plantas geneticamente projetadas em uma estufa é muito custoso. Em contraste, no presente sistema, muita variável pode ser controlada de modo que a quantidade máxima de expressão pode ser alcançada com toda colheita.
Em certas concretizações, os brotos germinados da presente invenção são crescidos em bandejas que podem ser irrigadas, pulverizadas, ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvolvimento do broto germinado. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais aparelhos de irrigação, pulverização, enevoamento e drenagem que podem distribuir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, e em quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Por exemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas. A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos no solo do ambiente. Tipicamente, a água de drenagem é tratada conforme a-propriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta no ambiente.
Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidas dentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz é requerida para os brotos germinados crescerem, as bandejas contendo sementes, embriões ou brotos germinados podem ser apertadamente empilhadas verticalmente uma sobre a outra, proporcionando uma grande quantidade de biomassa por unidade de espaço de solo em uma facilidade de alojamento construída especificamente para esta proposta. Em adição, as pilhas de bandejas podem ser dispostas em séries horizontais dentro de uma unidade de alojamento. Uma vez que os brotos tenham crescido a um estágio apropriado para colheita (cerca de dois a quatorze dias), as bandejas de broto individuais são movidas em uma facilidade de processamento, ou manualmente, ou por meios automáticos, tal como uma correia veículo. O sistema da presente invenção é único em que ele proporciona uma biomassa de broto germinado que é uma fonte de um antígeno(s) de gripe. Se diretamente consumida ou processada na forma de uma composição farmacêutica, porque os brotos germinados são crescidos em um ambiente regulável contido, a biomassa de broto germinado e/ou composição farmacêutica derivada a partir da biomassa podem ser providas a um consumidor em baixo custo. Em adição, o fato que as condições para crescimento dos brotos germinados podem ser controladas torna a qualidade e pureza do produto consistentes. O ambiente regulável contido da invenção também torna óbvio muitas regulações seguras da EPA que pode impedir cientistas de desenvolverem produtos agriculturais geneticamente projetados ao ar livre.
Brotos T ransformados Uma variedade de métodos pode ser usada para transformar cé- lulas de planta e produzir brotos germinados geneticamente projetados. Dois métodos disponíveis para a transformação de plantas que requerem que linhas de células transgênicas sejam geradas in vitro, seguido por regeneração das linhas de célula nas plantas totais, incluem transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens e bombardeio de microprojétil, ou eletroporação. A transformação viral é um método mais rápido e menos custoso de transformação de embriões e brotos germinados que podem ser colhidos sem um retardo experimental ou geracional antes da obtenção do produto desejado. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnica a-preciaria como ajustar e otimizar os protocolos de transformação que foram usados tradicionalmente para plantas, sementes, embriões, ou brotos germinados.
Cassetes de Expressão de Transformação de Agrobacterium Agrobacterium é um gênero representativo da família gram-negativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta, tais como doença de bile de coroa e raiz com pelo. Em tecido de planta de-diferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácido conhecidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizados pela planta. Os genes bacteriais responsáveis pela expressão de opines são uma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expressão quiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema de transformação de Agrobacterium pode ser usado para gerar brotos germinados comestíveis, que são meramente colhidos antes das plantas amadurecerem. Os métodos de transformação de Agrobacterium podem facilmente serem aplicados para regenerar brotos germinados que expressam antígenos de gripe.
Em geral, a transformação das plantas envolve a transformação de células de planta crescidas em cultura de tecido por co-cultivo com um Agrobacterium tumefaciens conduzindo uma planta/vetor bacterial. O vetor contém um gene que codifica um antígeno de gripe. O Agrobacterium transfere o vetor para a célula hospedeira da planta e é, em seguida, eliminado usando tratamento antibiótico. As células de planta transformadas que ex- pressam o antígeno de gripe são selecionadas, diferenciadas, e, finalmente, regeneradas em plantinhas completas (Hellen et al., 2000, Plant Mol). Biol., 42:819; Pilon-Smits et al., Plant Physiolog. 119(1):123; Barfield etal., 1991, Plant Cell Peports, 10:308; e Riva et al., J. Biotechnology 1(3); cada um do qual é incorporado aqui por referência.
Vetores de expressão para uso na presente invenção incluem um gene (ou cassete de expressão) que codifica um antígeno de gripe designado para operação em plantas, com seqüências companheiras a montante e a jusante do cassete de expressão. As seqüências companheiras são geralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcionam características necessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria ao hospedeiro de planta desejado. O construto básico bacterial/vetor de planta pode desejavelmente proporcionar uma origem de replicação de procariote de hospedeiro de faixa ampla, um marcador selecionável de procariote. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, tais como ampicilina ou tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificam funções adicionais que são bem-conhecidas podem também estarem presentes no vetor.
Seqüências de Agrobacterium T-DNA são requeridas para transferência mediada por Agrobacterium de DNA para o cromossomo da planta. Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos e substituídos com seqüências que codificam o antígeno de gripe. As seqüências de limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integração da região de T-DNA no genoma da planta. Se expressão do antígeno de HPV não é prontamente acessível para detecção, o construto bacterial/de vetor de planta pode também incluir um gene marcador selecionável para determinação se uma célula de planta foi transformada, por exemplo, o gene de resistência nptll karamicin. No mesmo ou diferente vetor bacterial/de planta (plasmídeo Ti) são seqüências Ti. Seqüências Ti incluem os genes de virulência, que codificam um conjunto de proteínas responsáveis pela excisão, transferência e integração do T-DNA no genoma da planta (Caiu, 1987, Caiense, 237:1176). Outras seqüências adequadas para permissão de integração da seqüência heteróloga no genoma da planta podem incluir seqüências de transposon, e similares, para recombinação homóloga.
Certos constructo incluirão o cassete de expressão que codifica uma proteína de antígeno. Um, dois ou mais cassetes de expressão podem ser usados em uma dada transformação. O cassete de expressão recombi-nante contém, em adição á seqüência que codifica antígeno de gripe, pelo menos os seguintes elementos: uma região de promotor, seqüências não-transladadas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não o gene expresso tem seu reconhecimento), e seqüências de terminação de transcrição e terminação. Em adição, terminadores de transcrição e translação podem ser incluídos nos cassetes de expressão ou genes quiméricos da presente invenção. Seqüências de secreção de sinal que permitem processamento e translocação da proteína, conforme apropriado, podem também serem incluídas no cassete de expressão. Uma variedade de promotores, seqüências de sinal, e terminadores de transcrição e translação são descritos (vide, por exemplo, Lawton etal., 1987, Plant Mol). Biol 9:315; e Patente dos Estados Unidos N° 5.888.789, incorporados aqui por referência. Em adição, genes estruturais para resistência a antibiótico são comumente utilizados como um fator de seleção (Fraley et al., 1983, Proc). Natl. Acad. Sei., USA 80:4803, aqui incorporado por referência. Locais de enzima de restrição únicos nas extremidades 5' e 3' do cassete permitem fácil inserção em um vetor pré-existente. Outros sistemas de vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium, conduzindo pelo menos uma seqüência limite de T-DNA, são descritos em PCT/EP99/07414, incorporado aqui por referência.
Regeneração Sementes de plantas transformadas podem ser colhidas, secas, limpas e testadas para viabilidade e para a presença e expressão de um produto de gene desejado. Uma vez que este tenha sido determinado, estoque de semente é tipicamente armazenado sob condições apropriadas de temperatura, umidade, saneamento e segurança a serem usadas quando necessário. As plantas totais podem então serem regeneradas de protoplas- tos cultivados (vide, por exemplo, Evans etal., Handbook of Plant Cell Cultu-res, Vol. 1, MacMillan Publishing Co). New York, 1983; e Vasil l. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984, e Vol. III, 1986, incorporados aqui por referência. Em certos aspectos, as plantas são regeneradas somente ao estágio de broto germinado. Em alguns aspectos, as plantas totais são regeneradas para produzir estoques de semente, e brotos germinados são geradas a partir das sementes do estoque de semente.
Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados e cultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas pela presente invenção de modo que as plantas totais são recuperadas, que contêm o gene transferido. É sabido que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir das células de cultura ou tecidos, incluindo, mas não limitadas a, todas as espécies maiores de plantas que produzem brotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa, munguba, rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo, ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, tais como salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.
Os meios para regeneração variam de uma espécie de plantas para a próxima. Contudo, aqueles técnicos no assunto apreciarão que geralmente uma suspensão de protoplantas transformadas contendo cópias do gene heterólogo é primeiro provida. Tecido de calo é formado, e brotos podem ser induzidos de calo e, subseqüentemente, arraigados. Alternativa ou adicionalmente, formação de embrião pode ser induzida a partir da suspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. O afundamento da semente na água, ou a pulverização da semente com água para aumentar o teor de umidade da semente para entre 35-45%, inicia a germinação. Para a germinação proceder, as sementes são tipicamente mantidas em ar saturado com água sob condições de temperatura controlada e fluxo de ar. O meio de cultura geralmente conterá vários aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoquinins. É também vanta- joso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para espécies, tal como alfafa. Brotos e raízes normalmente se desenvolvem simultaneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo, e da história da cultura. Se estas três variáveis são controladas, então a regeneração é totalmente reproduzível e repetível.
As plantas maduras, crescidas a partir de células de planta transformadas, são plantas transgênicas homozigóticas de auto e não-segregação, são identificadas. Uma planta congênita produz sementes contendo as seqüências que codificam o antígeno da invenção. Tais sementes podem ser germinadas e crescidas ao estágio de broto germinado para produzir o(s) antígeno(s) de gripe de acordo com a presente invenção.
Em concretizações relacionadas, sementes da presente invenção podem ser formadas em produtos de semente, e vendidas com instruções de como desenvolver brotos para o estágio de broto germinado apropriado para administração ou colheita em uma composição farmacêutica. Em algumas concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades concretizando os traços desejados podem ser desenvolvidos de plantas congênitas da invenção.
Integração Direta Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de células de planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode também ser usada na presente invenção (vide, por exemplo, Kikkert et al., 1999, Plant: J. Tissue Cult. Assoe., 35:43; e Bates, 1994, Mol. Biotech., 2:135). Mais particularmente, vetores que expressam antígenos de HPV da presente invenção podem ser introduzidos nas células de planta por uma variedade de técnicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcadores selecionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem incluir seqüências que permitem sua seleção e propagação em um hospedeiro secundário, tais como seqüências contendo uma origem de replicação e marcador selecionável. Tipicamente, hospedeiros secundários incluem bactéria e levedura. Em uma concretização, o hospedeiro secundário é bactéria (por exemplo, Escherichia coli, a origem de replicação é um origem tipo ColE1 de replicação), e o marcador selecionável é um gene que codifica resistência a ampicilina. Tais seqüências são bem-conhecidas na técnica, e são comercialmente disponíveis (por exemplo, Clontech, Paio Alto, CA ou Stratagene, La Jolla, CA).
Os vetores da presente invenção podem também serem modificados em plasmídeos de transformação de planta intermediários que contêm uma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, uma região limite de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e ácidos nucléicos que codificam antígeno ou cassetes de expressão descritos acima. Vetores adicionais podem incluir um tumor de planta desarmado incluindo plasmídeo de Agrobacterium tumefaciens.
De acordo com esta concretização, transformação direta dos vetores da invenção envolve micro injeção dos vetores diretamente nas células da planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante (vide, por exemplo, 1985, Mol. Gen. Genet., 202:179, incorporado aqui por referência). O material genético pode também ser transferido na célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (vide, por exemplo, Krens etal., 1982, Nature 296:72). Outro método de introdução de ácidos nucléicos em plantas via penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com um ácido nucléico, ou dentro da matriz de gotas pequenas, ou partículas, ou na superfície (vide, por exemplo, Klein etal., 1987, Nature 327:70; Knudsen et al, 1991, Planta 185:330). Ainda outro método de introdução é fusão de protoplastos com outras entidades, ou minicélulas, células, lisos-somos, ou outros corpos de superfície de lipídeo fusíveis (vide, por exemplo, Fraley et al., 1982, Proc). Natl. Acad. Sei. USA (1859). Vetores da invenção podem também serem introduzidos nas células da planta por eletroporação (vide, por exemplo, Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5824). De acordo com esta técnica, protoplastos de planta são eletropo-rados na presença de plasmídeos contendo umo construto de gene. Impulsos elétricos de reversibilidade de resistência de campo alta permeabilizam biomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos de planta eletroporados reformam a célula, dividem a parede, e formam calo da planta, que podem ser regenerados para formar brotos germinados da invenção. Aqueles técnicos no assunto apreciarão como utilizar estes métodos para transformar células de planta que podem ser usadas para gerar brotos germinados comestíveis.
Transformação Viral Similares a sistemas de expressão convencionais, vetores de vírus de planta podem ser usados para produzir proteína de comprimento total, incluindo antígeno de comprimento total. De acordo com a presente invenção, os vetores de vírus de planta podem ser usados para infectar e produzir antígeno(s) em sementes, embriões, brotos germinados, etc, sistemas virais que podem ser usados para expressar tudo de peptídeos curtos a proteínas complexas grandes. Especificamente, o uso de vetores tobamoviral é descrito (vide, por exemplo, McCormick et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:703; Kumagai et al., 2000, Gene , 245:169; e Verch etal., 1998, J. Immunol. Methods 220:69; cada um do qual incorporado aqui por referência). Desse modo, vetores virais de planta têm uma capacidade demonstrada de expressar peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes.
Em certas concretizações, brotos germinados que expressam antígeno de gripe são gerados utilizando um sistema de hospedeiro/vírus. Os brotos transgênicos produzidos por infecção viral proporcionam uma fonte de proteína transgênica que já foi demonstrado ser segura. Por exemplo, os brotos são livres de contaminação com patogenias animais. Diferentemente, por exemplo, tabaco, proteínas de um broto comestível podiam pelo menos na teoria serem usadas em aplicações orais sem purificação, reduzindo, desse modo, significantemente, os custos. Em adição, um sistema de vírus/broto oferece uma rota muito mais simples, menos custosa para escala e fabricação, visto que transgenes são introduzidos no vírus, que pode ser desenvolvido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Em contraste, plantas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que sementes suficiente ou material de planta estejam disponíveis para ensaios de grande escala ou comercialização.
De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de planta têm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como vetores para expressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um número de vírus de RNA de planta são bem caracterizadas, e existe conhecimento considerável de biologia, genéticas e seqüência regulatória de vírus. Muitos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA infecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez que o material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele replica a altos níveis e se espalha rapidamente através de um broto germinado total (um a dez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente e economicamente recuperadas de tecido de broto germinado infectado. Os vírus têm uma faixa ampla de hospedeiro, capacitando o uso de umo construto simples para infecção de várias espécies susceptíveis. Estas características são prontamente transferíveis para os brotos.
Seqüências estranhas podem ser expressas de vírus de RNA de planta, tipicamente pela substituição de um dos genes virais com seqüência desejada, pela inserção de seqüências estranhas no genoma do vírus em uma posição apropriada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínas estruturais de um vírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podem ser combinadas para expressarem seqüências estranhas por transcomple-mentação de funções vitais de um vírus. Um número de estratégias diferentes existe como ferramentas para expressar seqüências estranhas nas plantas infectadas por vírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV), vírus de mosaico de alfafa (AIMV), e quimeras destes. O genoma de AIMV é um representante da família Bromoviridae de vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA subgenômi-co (RNA4) Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replicases de vírus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteína de movimento de célula a célula P3 e a proteína de revestimento (CP). A CP é transladada de RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genômico, e é requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o envolvimento da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, replicação, estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA (vide, por exemplo, Boi et al., 1971, Virology (1971) 46:73; Van Der Vossen et al., 1994, Virology 202:891; Yusibov et al., Virology 208:405; Yusibov et al., 1998, Virology 242:1; Boi et al., (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol., 80:1089; De Graaff, 1995, Virology 208:583; Jaspars etal., Adv. Vírus Res 19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology 146: 177; Neeleman etal., 1991, Virology 181:687; Neeleman etal., 1993, Virology, 196:883; Van Der Kuyl etal., 1991, Virology 183:731; Van Der Kuyl et al., 1991, Virology, 185:496). A encapsidação de partículas virais é tipicamente requerida para movimento de longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da semente, embrião, ou broto germinado, e para infecção sistêmica. De acordo com a presente invenção, inoculação pode ocorrer em qualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões e brotos, a difusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Virions de AIMV são en-capsidatados por uma CP única (24 kD), formando mais do que um tipo de partícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâmetro) e forma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) de uma partícula dependem do tamanho do RNA encapsidatado. Após montagem, o terminal N do AIMV CP é para estar localizado na superfície das partículas de vírus, e não parece interferir com a montagem do vírus (Boi et al., 1971, Virology 6:73). Adicionalmente, o AIMV CP com um adicional de 38 peptídeo aminoácidos em seu terminal N forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusibov et al., 1995, J. Gen. Virol., 77:567). O AIMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um número de plantas de colheita agriculturalmente valiosas, incluindo sementes de planta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam o AIMV CP um excelente candidato como uma molécula veículo e AIMV um vetor candidato atrativo para a expressão de seqüências estranhas para a expressão de seqüências estranhas na planta no estágio de broto de desenvolvimento. Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal como TMV, o AIMV CP encapsidata o genoma de TMV sem interferir com a infectividade do vírus (Yusibov et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:5784, incorporado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírus veículo para AIMV CP fundido às seqüências estranhas. TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindo em um RNA simples mais de sentido encapsidatado com uma CP de 17,0 kD, que resulta em partículas em forma de haste (300 nm de comprimento). A CP é a única proteína estrutural de TMV, e é requerida para encapsidação e movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro infectado (Saito et al., 1990, Virology 176:329). As 183 e 128 kD de proteínas são transladadas de RNA genômico, e são requeridas para replicação de vírus (Ishikawa et al., 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). A proteína de 30 kD é a proteína de movimento de célula a célula de vírus (Meshi et al., 1987, EMBO J. 6:2557). As proteínas de movimento e de revestimento são transladadas de RNAs subgenômicos (Hunter et al., 1976, Nature 260:759; Bruening et al., 1976, Virology 71:498; e Beachy et al., 1976, Virology 73:498; cada um do qual sendo incorporado aqui por referência).
Outros métodos de transformação de tecidos de planta incluem transformação da flor de uma planta. A transformação de Arabidopsis thalia-na pode ser alcançada pela imersão das flores da planta em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (Curtis et al., 2001, Transgenic Res., 10:363; e Qing etal., MolecularBreeding: New Strategies in Plant Improvement, 1:67). Plantas transformadas são formadas na população de sementes geradas pelas "plantas imersas". Em um ponto específico durante desenvolvimento da flor, um poro existe na parede do ovário através da qual Agrobacterium tumefaciens ganha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ovário, o Agrobacterium tumefaciens prolifera e transforma os óvulos individuais (Desfeux et al., 2000, Plant Physiology, 123:895). Os óvulos transformados seguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.
Produção e Isolamento de Antígeno Em geral, métodos conhecidos padrão na técnica podem ser usados para cultura ou crescimento de plantas, células de planta, e/ou tecidos de planta da invenção (por exemplo, plantas clonais, células de planta clonais, raízes clonais, linhas de raiz clonais, brotos, brotos germinados, plantas, etc.), para produção de antígeno(s). Uma ampla variedade de meio de cultura e biorreatores foram empregados para cultura de células de raiz com pelos, linhas de célula de raiz e células de planta (vide, por exemplo, Giri et al., 2000, Biotecnolol. Adv., 18:1; Rao et al., 2002, Biotechnol. Adv., 20:101; e referências em ambos dos precedentes, todos dos quais sendo aqui incorporados por referência). Plantas clonais podem ser crescidas em qualquer maneira adequada.
Em certas concretizações, os antígenos de gripe da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido. Em algumas concretizações, um antígeno de gripe é expresso em uma planta ou porção desta. As proteínas são isoladas e purificadas de acordo com condições e técnicas convencionais conhecidas na técnica. Estas incluem métodos, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletroforese, e similares. A presente invenção envolve a purificação e escala alcançável de produção de antígeno(s) de gripe usando qualquer de uma variedade de sistemas de expressão de planta conhecido na técnica e providos aqui, incluindo sistemas de expressão de planta virais aqui descritos.
Em muitas concretizações da presente invenção, será desejável isolar produtos de antígeno de vacina. Onde uma proteína da invenção é produzida de tecido(s) de planta ou uma porção deste(s), por exemplo, raízes, células de raiz, plantas, células de planta que as expressam, métodos descritos em detalhes adicionais aqui, ou quaisquer métodos aplicáveis conhecidos na técnica, podem ser usados para qualquer de um isolamento parcial ou completo de material de planta. Onde é desejável isolar um produto de expressão de alguma ou toda de células de planta ou tecidos que a expressam, quaisquer técnicas de purificação disponíveis podem ser empregadas. Aqueles técnicos no assunto são familiares com uma faixa ampla de procedimentos de fracionamento e separação (vide), por exemplo, Scopes et al., Protein Purification: Principie and Practice, 3ã Edição, Janson et al., 1993; Protein Purification: Principies, High Pesolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 1998; Springer-Verlag, NY, 1993; e Roe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001, cada um do qual sendo aqui incorporado por referência. Freqüentemente, será desejável produzir um produto mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 6.740.740 e 6.841.659 para discussão de certos métodos úteis para purificação de substâncias de tecidos ou fluidos de planta.
Aqueles técnicos no assunto também apreciarão que um método de obtenção de produtos de vacina desejado é por extração. O material de planta (por exemplo, raízes, folhas, etc) pode ser extraído para remover produtos desejados de biomassa residual, aumentando, desse modo, a concentração e pureza de um produto. As plantas podem ser extraídas em uma solução tampão. Por exemplo, o material de planta pode ser transferido em uma quantidade de água gelada a uma razão de um para um por peso, que foi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores de protease podem ser adicionados conforme requerido. O material de planta pode ser rompido por mistura ou moagem vigorosas enquanto suspenso na solução tampão, e a biomassa extraída removida por filtração ou centrifugação. O produto transportado na solução pode adicionalmente ser purificado por etapas adicionais, ou convertido a um pó seco por congelamento-secagem ou precipitação. A extração pode ser efetuada por prensagem. As plantas ou raízes podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou moídas à medida que elas passam através de rolos proximamente espaçados. Os fluidos expressos a partir das plantas ou raízes moídas são coletados e processados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. A extração por prensagem permite a liberação de produtos em uma forma mais concentrada. Contudo, o rendimento total do produto pode ser mais baixo do que se um produto fosse extraído em solução.
Vacinas A presente invenção proporciona proteínas de antígeno farmacêuticas para uso terapêutico, tal como proteína(s) de antígeno, ou por-ção(ões) imunogênica(s) desta(s) ativa(s) como uma vacina para tratamento terapêutico e/ou profilático de infecção de gripe. Adicionalmente, a invenção proporciona uso veterinário, visto que proteína de antígeno ou porção imunogênica desta é ativa em aplicações veterinárias. Em certas concretiza- ções, antígeno(s) pode(m) ser produzido(s) por planta(s) ou porção desta(s) (por exemplo, raiz, célula, broto, linha de célula, planta, etc.) da invenção. Em certas concretizações, os antígenos de HPV são expressos em plantas, células de planta, e/ou tecidos de planta (por exemplo, brotos, brotos germinados, raízes, cultura de célula, células clonais, linhas de célula clonais, plantas clonais, etc.), e podem ser usados diretamente de uma planta, ou parcialmente purificados ou purificados na preparação para administração farmacêutica a um indivíduo. A presente invenção proporciona plantas, células de planta, e tecidos de planta que expressam antígeno(s) de gripe que mantêm atividade farmacêutica quando administrados a um indivíduo em necessidade deste. Em certas concretizações, os indivíduos incluem vertebrados, (por exemplo, mamíferos, tais como seres humanos). De acordo com a presente invenção, os indivíduos incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovinos, caninos, felinos, etc. Em certos aspectos, uma planta comestível ou porção desta (por exemplo, broto, raiz) é administrada oralmente a um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em alguns aspectos, um ou mais antígeno(s) de gripe é (são) provido(s) em uma preparação farmacêutica, conforme descrito aqui.
As composições de vacina da invenção compreendem um ou mais antígenos de gripe. Em certas concretizações, pelo menos dois antígenos de gripe da invenção são incluídos em uma composição de vacina administrada.
De acordo com a presente invenção, o tratamento de um indivíduo com um antígeno de vacina é pretendido para induzir um efeito fisiológico. Uma proteína de vacina pode ter propriedades curativas ou paliativas contra uma enfermidade ou doença, e pode ser administrada para aliviar melhora, aliviar, retardar começo de reverso, ou diminuir sintomas ou severidade de uma doença ou enfermidade. Um antígeno de vacina pode ter propriedades profiláticas, e pode ser usado para impedir ou retardar começo de uma doença, ou diminuir a severidade de tal doença, enfermidade, ou condição patológica quando ela aparece. Um efeito fisiológico induzido pelo tra- tamento de um indivíduo com antígeno de acordo com a presente invenção pode incluir uma resposta imune eficaz tal que infecção por um organismo é impedida.
Em algumas concretizações, as vacinas da invenção são distribuídas por rotas orais e/ou mucosais. A administração oral e/ou mucosal tem o potencial de impedir a infecção de tecidos mucosais, a abertura principal de infecção para muitas patogenias. A distribuição oral e/ou mucosal pode iniciar resposta imune sistêmica. Tem sido progresso considerável no desenvolvimento de sistemas de expressão heterólogos para a administração oral de antígenos que estimulam o sistema imune mucosal, e pode iniciar imunidade sistêmica. Esforços prévios na distribuição de vacina oral, contudo, têm demonstrado um requerimento de quantidades consideráveis de antígeno em alcançar eficiência. Desse modo, a produção econômica de grandes quantidades de antígenos alvos é um pré-requisito para a criação de vacinas orais eficazes. O desenvolvimento de plantas que expressam antígenos, incluindo antígenos termoestáveis, representa uma aproximação mais realísticas a tais dificuldades.
As preparações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em uma ampla variedade de modos ao indivíduo, tais como, por exemplo, oral, enteral, nasal, parenteral, intramuscular ou intravenosa, retal, vaginal, tópica, ocular, pulmonarmente, ou por aplicação de contato. Em certas concretizações, um antígeno de gripe expresso em uma planta ou porção desta é administrado a um indivíduo oralmente por administração direta da planta ao indivíduo. Em alguns aspectos, uma proteína de vacina expressa em uma planta ou porção desta é extraída e/ou purificada, e usada para a preparação de uma composição farmacêutica. Pode ser desejável formular tais produtos isolados para seu uso pretendido (por exemplo, como um agente farmacêutico, composição de vacina, etc.). Em algumas concretizações, será desejável formular os produtos junto com alguns ou todos dos tecidos de planta que os expressam.
Onde é desejável formular o produto junto com o material de planta, será freqüentemente desejável ter uma planta que seja não tóxica ao recipiente relevante (por exemplo, um humano ou outro animal). Tecido de planta relevante (por exemplo, células, raízes, folhas) pode simplesmente ser colhido e processado de acordo com técnicas conhecidas na técnica, com devida consideração para manter atividade do produto expresso. Em certas concretizações da invenção, é desejável ter expressado o antígeno de vacina em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestíveis da planta), de modo que o material pode ser subseqüentemente comido. Por exemplo, onde o antígeno de vacina é ativo após distribuição oral (quando corretamente formulado), pode ser desejável produzir a proteína de antígeno em uma porção de planta comestível, e para formular o antígeno de vacina expresso para distribuição oral junto com o algum ou todo do material de planta com o qual a proteína foi expressa.
Os antígenos de vacina providos podem ser formulados de a-cordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um produto de vacina pode ser formulada junto com um ou mais materiais veículos farmaceuticamente adequados, orgânicos ou inorgânicos, líquido ou sólido. Um antígeno de vacina produzido de acordo com a presente invenção pode ser empregado em formas de dosagem tais como comprimidos, cápsulas, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, ungüen-tos, aerossóis, pacotes de pó, soluções líquidas, solventes, diluentes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou emulsificante, conservantes, e ligações sólidas, considerando-se que a atividade biológica da proteína não seja destruída por tal forma de dosagem.
Em geral, as composições podem compreender qualquer de uma variedade de veículo(es) farmaceuticamente aceitável(eis) diferente(s), adjuvante(s), ou uma combinação de um ou mais tal(is) adjuvante(s). Conforme aqui usado, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante" inclui solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacte-rial ou antifungal, agentes de absorção e retardamento, e similares, compatíveis com administração farmacêutica. Os materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como sódio carbo-ximetil celulose, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte, gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de suposi-tório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de girassol; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tal como propileno glicol; ésteres, tais como etil oleato e etil laurato; agar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotô-nica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes não-tóxicos, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aromatizantes, e agentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador (vide também Ftemingtorís Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição, E. W. martin (Mack Publishing Co., Easton PA, 1975)). Por exemplo, o produto de antígeno de vacina pode ser provido como uma composição farmacêutica por meio de processos convencionais de produção de granulação por mistura, dissolução, liotilização, ou processos similares.
Componentes adicionais de vacina As vacinas da invenção podem incluir adicionalmente qualquer adjuvante adequado para aumentar a imugenicidade da vacina quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, tal(is) adjuvante(s) pode(m) incluir, sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS), incluindo subtrações purificadas de grau de alimentação QS, tais como Quil A e QS-21, alum, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freund incompleto; adjuvante de Freund completo; lipídeo A 3 De-O-monofosforil aci-latado (3D-MPL). Adjuvantes adicionais podem incluir oligonucleotídeos i-munomodulatórios, por exemplo, seqüência CpG não-metilatada conforme descrito em WO 96/02555. Combinações de adjuvantes diferentes, tais como aquelas mencionadas aqui acima, são contempladas como proporcionando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célula ΤΗ1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A razão de QS21:3D-MPL será tipicamente na ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; e freqüentemente substancialmente 1:1. Em algumas concretizações, a faixa de energia ótima é 2,5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21. Doses de extratos de QS purificados para uso em uma formulação de vacina humana são de 0,01 mg a 10 mg por quilograma de peso corpóreo.
Deve ser notado que certas proteínas termoestáveis (por exemplo, lichenase) podem demonstrar atividade de potencialização de imunor-resposta, tal que o uso de tal proteína se em uma fusão com um antígeno de HPV ou separadamente pode ser uso considerado de um adjuvante. Desse modo, as composições de vacina da invenção podem adicionalmente compreender um ou mais adjuvantes. Certas composições de vacina podem compreender dois ou mais adjuvantes. Além disso, dependendo da formulação e rotas de administração, certos adjuvantes podem ser desejados em formulações e/ou combinações particulares.
Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito de uma vacina da invenção pelo abaixamento da absorção de um ou mais componentes do produto de vacina (por exemplo, proteína) que é subcutâ-nea ou intramuscularmente injetada. Isto pode ser efetuado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade pobre em água. A taxa de absorção do produto então depende de sua taxa de dissolução, que, por sua vez, pode depender do tamanho e forma. Alternativa ou adicionalmente, absorção retardada de um produto parenteralmente administrado por dissolução ou suspensão do produto em um veículo de óleo. Formas de depósito injetáveis são produzidas pela formação de matrizes de microcápsulas da proteína em polímeros biodegradáveis, tais como polilacti-de-poliglicolide. Dependendo da razão de produto para polímero e da natureza do polímero particular empregada, a taxa de liberação pode ser controlada. Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e po-li(anidridos). Formulações injetáveis de depósito podem ser preparadas por encerramento do produto em lipossomos ou microemulsões, que são compatíveis com os tecidos do corpo. Veículos de distribuição poliméricos alter- nativos podem ser usados para formulações orais. Por exemplo, polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico, etc., podem ser formulados como micropartículas, por exemplo, em combinação com um veículo de distribuição polimérico.
Preparações enteralmente administradas de antígenos de vacina podem ser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensão e de emulsão, e podem ser compostas com quaisquer veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes emulsifican-tes. Os antígenos podem ser administrados por meio de bombas ou formas de liberação sustentada, especialmente quando administrados como uma medida preventiva, de modo a prevenir o desenvolvimento de doença em um indivíduo, ou para melhorar ou retardar doença estabelecida. Compostos ativos suplementares, por exemplo, compostos independentemente ativos contra a doença ou condição clínica a ser tratada, ou compostos que aumentam a atividade de um composto da invenção, podem ser incorporados em ou administrados com as composições. Agentes aromatizantes e colorantes podem ser usados.
Os produtos de vacina da invenção, opcionalmente juntos com tecido de planta, são particularmente bem adequados para administração oral como composições farmacêuticas. Formulações líquidas orais podem ser usadas e podem ser de utilidade particular para populações pediátricas. O material de planta colhido pode ser processado em qualquer de uma variedade de modos (por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamento, extração, etc.), dependendo das propriedades do produto terapêutico desejado e sua forma desejada. Tais composições conforme descritas acima podem ser ingeridas oralmente somente, ou ingeridas com alimento ou alimentação, ou com uma bebida. As composições para administração oral incluem plantas; extração das plantas, e proteínas purificadas de plantas infectadas providas como pós secos, produtos alimentícios, solventes aquosos ou não-aquosos, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteres orgânicos injetáveis. Veículos aquosos incluem água, soluções de água-álcool, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e veículos paren-terais mediais tamponados, incluindo solução de cloreto de sódio, solução de dextrose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio, solução de Ringer contendo lactose, ou óleos fixados. .Exemplos de pós secos incluem qualquer biomassa de planta que foi secada, por exemplo, secada por congelamento, secada em ar, ou secada por pulverização. Por exemplo, as plantas podem ser secadas a ar por colocação das mesmas em um secador de ar comercial a cerca de 48 °C (120 graus Fahrenheit) até que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade em peso. As plantas secas são armazenadas para processamento adicional como sólidos de massa, ou adicionalmente processadas por moagem a um pó de tamanho de malha desejado. Alternativa ou adicionalmente, secagem por congelamento pode ser usada para produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos podem ser secados por congelamento pela colocação dos mesmos em um secador a vácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode ser adicionalmente processado conforme descrito aqui. O material derivado de planta pode ser administrado como, um junto com uma ou mais preparações herbáceas. Alguns exemplos de preparações herbáceas incluem tinturas, extratos (por exemplo, extratos aquosos, extratos de álcool), decocções, preparações secas (por exemplo, secadas a ar, secadas por pulverização, ou secadas por congelamento), pós, (por e-xemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparações herbáceas podem ser providas em qualquer veículo de distribuição padrão, tais como uma cápsula, comprimido, supositório, dosagem líquida, etc. Aqueles técnicos no assunto a-preciarão as várias formulações e modalidades de distribuição de preparações herbáceas que podem ser aplicadas a presente invenção.
As linhas de raiz, linhas de células, plantas, extrações, pós, preparações secas e proteína purificada ou produtos de ácido nucléico, etc. da invenção podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais exci-pientes conforme notado acima. Formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revestimentos de liberação controlada, e outros revestimentos bem-conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida o agente ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem compreender, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do que diluen-tes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxiliares de comprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem compreender agentes de tamponamento. Elas podem opcionalmente conter agentes de opacidade, e podem ser de uma composição que elas liberam o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, em uma certa parte do trato intestinal, e/ou em uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Em alguns métodos, uma planta ou porção desta expressando um antígeno de gripe de acordo com a presente invenção, ou biomassa destas, é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais composições comestíveis são tipicamente consumidas como produto em bruto de comer, se em uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. O material de planta pode ser diretamente ingerido sem uma etapa de processamento anterior, ou após preparação culinária mínima. Por exemplo, a proteína de vacina pode ser expressa em um broto que pode ser comido diretamente. Por exemplo, antígenos de vacina podem ser expressos em um broto de altafa, broto de munguba, ou broto de espinafre, ou broto de folha de alface, etc. Em uma concretização, a biomassa planta pode ser processada, e o material recuperado após a etapa de processamento é ingerido. Métodos de processamento úteis de acordo com a presente invenção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de alimentação. Os produtos finais de tais métodos incluem tipicamente uma quantidade substancial de um antígeno expresso, e podem ser convenientemente comidos ou bebidos. O produto final pode ser misturado com outro alimento ou formas de alimentação, tais como sais, veículos, intensificadores de sabor, antibióticos, e similares, e consumidos na forma sólida, semi-sólida, de suspensão, de emulsão, ou líquida. Tais métodos podem incluir uma etapa de conservação, tal como, por exemplo, pasteurização, cozimento, ou adição de agentes de conservação e de preservação. Qualquer planta pode ser usada e processada na presente invenção para produzir matéria de planta comível ou bebível. A quantidade de antígeno de HPV em uma preparação derivada de planta pode ser testada por métodos padrão na técnica, por exemplo, eletroforese de gel, ELISA, ou análise de mancha de Western, usando-se uma sonda ou anticorpo específico para o produto. Esta determinação pode ser usada para padronizar a quantidade de proteína de antígeno de vacina ingerida. Por exemplo, a quantidade de antígeno de vacina pode ser determinada e regulada, por exemplo, por mistura de bateladas de produto tendo níveis eficientes de produto de modo que a quantidade de material a ser bebida ou comida para ingerir uma dose simples pode ser padronizada. O ambiente regulável contido da presente invenção, contudo, deve minimizar a necessidade de efetuar tais procedimentos de padronização.
Uma proteína de vacina produzida em uma planta e comida por um indivíduo pode ser preferivelmente absorvida pelo sistema digestivo. Uma vantagem da ingestão de tecido de planta que tenha sido apenas minimamente processado é proporcionar encapsulamento ou seqüestro da proteína em células da planta. Desse modo, o produto pode receber pelo menos alguma proteção de digestão no trato digestivo superior antes de alcançar o intestino, e uma proporção mais alta de produto ativo seria disponível para percepção.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas terapeuticamente ou profilaticamente. As composições podem ser usadas para tratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, qualquer indivíduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver infecção de gripe, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode ser considerado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnosticado com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo é co- nhecido como tendo sido, ou para ser pretendido para estar em situações com risco relativamente alto de exposição à infecção de gripe, este indivíduo será considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se membros de uma família de indivíduos, amigos ou parentes foram diagnosticados com infecção de gripe, o indivíduo pode ser considerado estar em risco de desenvolver a doença.
As formas de dosagem líquida para administração oral incluem, mas não estão limitadas a, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, micro emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos agentes ativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool i-sopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzílico, benzoato de benzílico, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de milho, óleo de germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleo de gergelim), glicerol, tetrahidrofurfurílico álcool, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sor-bitan, e misturas destes. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem incluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentes emulsificantes e agentes de suspensão, agentes adoçantes, aromatizantes e de perfume.
As composições para administração retal ou vaginal podem ser supositórios ou enemas de retenção, que podem ser preparados pela mistura das composições desta invenção com excipientes ou veículos não-irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ou uma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos na temperatura do corpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vaginal, e liberam a proteína ativa.
As formas de dosagem para administração tópica ou transder-mal de uma composição de vacina desta invenção incluem ungüentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplastros. O agente ativo, ou preparação deste, é misturado sob condições esté- reis com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme podem ser requeridos. Para administração transmucosal ou transdermal, penetrantes apropriados à barreira a ser permeada podem ser usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, para administração transdermal, detergentes, sais de bile, e derivados ácidos fusídicos. A administração transmucosal pode ser acompanhada através do uso de pulverizações nasais ou supositórios. Para administração transdermal, antígeno, ou uma porção imunogênica deste, podem ser formulados em ungüentos, pomadas, géis ou cremes, conforme geralmente conhecidos na técnica. Formulação oftálmica, gotas no ouvido e gotas no olho são também contempladas como estando dentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a presente invenção contempla o uso de emplastros transdermais, que têm a vantagem adicional de proporcionar distribuição controlada de uma proteína de vacina ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas por suspensão ou dispensa do produto de vacina no meio correto. Intensificadores de absorção podem serem usados para aumentar o fluxo da proteína de vacina através da pele. A taxa pode ser controlada, ou pela provisão de uma membrana de controle de taxa, ou pela dispersão da proteína de vacina em uma matriz de polímero ou gel.
As composições da invenção são administradas em tais quantidades e por tal tempo conforme é necessário para alcançar o resultado desejado. Em certas concretizações da presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma composição farmacêutica é aquela quantidade eficaz para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doença em um indivíduo. Desse modo, a "quantidade eficaz para tratar, atenuar ou prevenir doença", conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica, mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenir doença em qualquer indivíduo. Por exemplo, a "quantidade terapeuticamente eficaz" pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir infecção (por exemplo, infecção viral, infecção de gripe), etc. A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indiví- duo, dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do estágio da doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administração, e similares. Antígenos de anthrax da invenção, incluindo antígeno(s) que expressa(m) plantas e/ou preparações destes, podem ser formulados em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", conforme aqui usada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de composição de vacina apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, contudo, que o uso diário total das composições da presente invenção é tipicamente decidido por um médico atendente dentro do escopo do julgamento médico. O nível de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquer paciente particular ou organismo pode depender de uma variedade de fatores, incluindo a severidade ou risco de infecção; a atividade do composto específico empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo do paciente, dieta do paciente, condições far-macocinéticas do paciente, o tempo de administração, rota de administração, e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou coincidental com a composição de vacina empregada; e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.
Será apreciado que as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser empregadas em terapias de combinação (por exemplo, combinação de terapias de combinação), isto é, as composições farmacêuticas podem ser administradas concorrentemente com, antes de, ou subseqüente a, um ou mais outros procedimentos de vacinação desejados. A combinação particular de terapias (por exemplo, vacinas, tratamento terapêutico de infecção de gripe) para empregar em um regime de combinação levará em conta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos desejados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciado que as terapias e/ou vacinas empregadas podem alcançar um efeito desejado para a mesma enfermidade (por exemplo, um composto da invenção pode ser administrado concorrentemente com outra vacina de gripe), ou eles po- dem alcançar efeitos diferentes.
Em certas concretizações, as composições de vacina compreendem pelo menos dois antígenos de gripe. Por exemplo, certas composições de vacina podem compreender pelo menos dois antígenos da invenção (por exemplo, um domínio de HA e um domínio NA contendo antígeno da invenção). Em alguns aspectos, tal combinação de vacinas pode incluir uma proteína de fusão termoestável compreendendo antígeno de gripe; em alguns aspectos, duas ou mais proteínas de fusão termoestáveis compreendendo antígeno de gripe são providas.
Onde combinações de vacina são utilizadas, será compreendido que qualquer combinação de antígenos de gripe pode ser usada para tais combinações. Composições podem incluir antígenos de gripe múltiplos, incluindo antígenos múltiplos aqui providos. Além disso, composições podem incluir um ou mais antígenos aqui providos com um ou mais antígenos adicionais. Combinações de antígenos de gripe incluem antígenos de gripe derivados de um ou mais vários subtipos ou cepas, tal que imunização confere resposta imune contra mais do que um tipo de infecção. Combinações de antígeno de gripe podem incluir pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais antígenos derivados de subtipos ou cepas diferentes. Em algumas combinações, pelo menos dois ou pelo menos três antígenos de subtipos diferentes são combinados em uma composição de vacina. Além disso, combinações de vacina podem utilizar antígeno de gripe e antígeno de um ou mais agentes infecciosos únicos.
Kits Em um aspecto, a presente invenção proporciona um envoltório ou kit farmacêutico incluindo antígenos de gripe de acordo com a presente invenção. Em certas concretizações, os envoltórios ou kits farmacêutico incluem brotos germinados vivos, entidade clonal ou plantas que produzem um antígeno de gripe de acordo com a invenção, ou preparações, extratos, ou composições farmacêuticas contendo vacina em um ou mais recipientes preenchidos com opcionalmente um ou mais ingredientes adicionais de composições farmacêuticas da invenção. Em algumas concretizações, en- voltórios farmacêuticos ou kits incluem composições farmacêuticas compreendendo antígeno de gripe purificado de acordo com a presente invenção, em um ou mais recipientes opcionalmente preenchidos com um ou mais ingredientes adicionais de composições farmacêuticas da invenção. Em certas concretizações, o envoltório farmacêutico ou kit inclui um agente terapêutico aprovado adicional (por exemplo, antígeno de gripe, vacina de gripe) para uso como uma terapia de combinação. Opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, com avisos que refletem aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.
Os kits são providos que incluem reagentes terapêuticos. Como um exemplo, mas não limitativo, vacina de gripe pode ser provida como formulações orais e administradas como terapia. Alternativa ou adicionalmente, a vacina de gripe pode ser provida em uma formulação injetável para administração. Em algumas concretizações, a vacina da gripe pode ser provida em uma formulação inalável para administração. Doses farmacêuticas ou instruções, portanto, podem ser providas no kit para administração a um indivíduo que sofre de, ou está em risco de infecção de gripe.
Os exemplos representativos que se seguem são pretendidos para ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devem ser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção e muitas concretizações adicionais destas, em adição à-quelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles técnicos no assunto a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os e-xemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patente aqui citada. Os exemplos seguintes contêm informação, exemplificação e guia, que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas várias concretizações, e os equivalentes destas.
Exemplificação Exemplo 1. Geração de Constructo Candidatas de Vacina Geração de seqüências de antígeno de vírus hemaglutinina Seqüências de nucleotídeo que codificam domínio de haste de HA (SD) 1-2 e domínio globular de HA (GD) 3 de cada de vírus de gripe tipo Vietnam H5N1 e Wyoming H3N2 foram sintetizadas e confirmadas como sendo corretas. O ácido nucléico produzido foi digerido com endonucleases de restrição Bglll/Hindlll, locais para quais foram projetados em qualquer extremidade de domínios de codificação de seqüência. Os fragmentos de DNA resultantes foram fundidos em seqüência que codifica uma molécula veículo termoestável projetada. HA Vietnam ΓΗ5Ν11 (Domínio SD 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO.:19) AGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGC AAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGA TATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGGGAGGAGGAAACACTAAG TGCCAGACTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACAT TCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGG CTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGAA GGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAG GATGGCAAGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGA GCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATT GATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCA GTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGA GAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTAC AACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCC ACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAG GGATAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAG TGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACC CACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGT GAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTAAGCTT
(Domínio SD 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO.:20) DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLNTKCQTPMGAI NSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIA GFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIID
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(Domínio GD 3): HA3V: (SEQ ID NO.:21) AGATCTTGCGATCTTGATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCT CTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAA CGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGAT CTTTGTTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCTTC TTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCT TGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACC AGGGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAA CTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAG GATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGC AGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCT ACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGA ACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAA CGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTAC GCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGC TTGAGTACGGAAACTGCAAGCTT
(Domínio GD 3): HAV3: (SEQ ID NO.:8) CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYP GDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFF RNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPT TYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNF IAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
(comprimento total): HAS_V: (SEQ ID NO.:22) GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTT TCCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCC GTGCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCA AGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGAT ATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTGATGGAGTGA AGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAA
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AAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCACCATCACCATCACCACAA
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AGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCT
GGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGA
TTCAGGCATCAGAATTCTGAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGT
CTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATT
GGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAG
GTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAG
ATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCA
GCACACTATTGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGG
ACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGC
TTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGAGTCTATTAGGAA
CGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAACAGG
TTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTC
TTAAGCTT
(Domínio SD 1-2): HA1_2: (SEQ ID NO.:24) QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGIN SECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQ/VTLKL4TOMRNVPEKQTR GIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQING KLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALE NQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRN GTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
(Domínio GD 3): HA3W: (SEQ ID NO.:25) QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGIN SECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVXQ/VTLKLATGMRNVPEKQTR GIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQING KLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALE
NQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRN
GTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
(Domínio GD 3): HA3W: (SEQ ID NO.:12) CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNC YPYD VPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRL NWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRI TVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
(comprimento total): HASW: (SEQ ID NO.:26) GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTT TCCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCC GTGCTCAAAAGTTGCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTT GGACATCACGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACG ATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACT GGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCA CTCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAA CAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGC TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTC TTCTG G AACTCTTG AGTTC AACAACG AGTCTTTCAACTG GGCTGGAGTT ACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTT TCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCT CTTAACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTG GGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTC AGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGT GATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCTAGG ATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTTATTAA CTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGT GGAAAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACT CTGAGTGCATTACTCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCA GAACGTGAACAGGATTACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAG AACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGA CTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATGGATGGGA
GGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGG
AACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAG
ATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCC
ACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCT
TGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCT
GAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGACTGATTC
TGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAA
CGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGAT
AACGCTTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGT
ACCGTGATGAGGCTCTTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCT
TAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTCTTCATGATCACCACCACCACAAG
GATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
Geração de seqüências de antígeno de neuraminidase de vírus de gripe Seqüências de nucleotídeo que codificam neuraminidase de cada de vírus de gripe tipo Vietnam H5N1(NAV) e Wyoming H3N2 (NAW) foram sintetizadas e confirmadas como sendo corretas. O ácido nucléico produzido foi digerido com endonucleases de restrição Sall, locais para quais foram projetados em qualquer extremidade de domínios de codificação de seqüência. Os fragmentos de DNA resultantes foram fundidos na estrutura no terminal C em seqüência que codifica uma molécula veículo termo-estável projetada. NAV(N1): (SEQ ID NO.:27) GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTT
CCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCG
TGCTCAAAATGTCGACCTTATGCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTT
GGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCAGCATCAGTCTGAGCCAAT
TTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGTTAAGTTGG
CTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAA
GGATAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGG
GAGCCATTCATTTCTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTAC
TCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAAGCACTCTAACGGAACTGTGAAGGAT
AGGTCTCCACACAGGACTCTTATGTCTTGTCCAGTTGGAGAAGCTCCAT
CTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTGCTTG
CCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAAC
GGAGCTGTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAA
GTCTTGGAGGAACAACATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGC
GTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGATGACTGATGGACCATCTAATGGAC
AGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGAAAGGTTGTGAAGTC
TGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTGCTAT
CCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGAT
CTAACAGGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGG
TTACATTTGCTCTGGAGTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGA
ACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATCTAATGGAGCTGGAGGAGTGAAG
GGATTCTCTTTCAAGTACGGAAACGGAGTTTGGATTGGAAGGACTAAGT
CTACTAACTCTAGGAGTGGATTCGAGATGATTTGGGACCCAAACGGATG
GACTGAGACTGATTCTTCTTTCTCTGTGAAGCAGGATATTGTGGCTATTA
CTGATTGGAGTGGATACTCTGGATCTTTCGTTCAGCACCCAGAGCTTAC
TGGACTTGATTGCATTAGGCCATGCTTCTGGGTTGAACTTATTAGGGGA
AGGCCAAAGGAGTCTACTATTTGGACTTCTGGATCTTCTATTTCTTTCTG
CGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAGATGGAGCTGA
GCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAGG
ATGAGCTTTGACTCGAG NAV: (SEQ ID N0.:16) LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPI
NGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSN
GTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGIS
GPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPS
NGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWH
GSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGV
KGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAIT
DWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGV
NSDTVGWSWPDGAELPFTIDK NAW(N2): (SEQ ID NO.:28) GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTT
CCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCG
TGCTCAAAATGTCGACAAGCAGTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAAC
CAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTGAGAGGAACATTACTGAGA
TTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGCCCAAAGTTG
GCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCG
CTCCATTCTCTAAGGATAACTCAATTAGGCTTTCTGCTGGAGGAGATATT
TGGGTTACAAGGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACC
AGTTCGCTCTTGGACAAGGAACTACTCTTAACAACGTGCACTCTAACGA
TACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTACTCTTTTGATGAACGAGCTT
GGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGCTTGGTCAT
CTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGG
AGATGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTG
GATTCTATTGTTTCTTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGA
GTGTGTGTGCATTAACGGAACTTGCACTGTGGTTATGACTGATGGATCT
GCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTCATTGAGGAGGGAAAGA
TTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATGTGCTCAGCATGTTGAGGAGTGT
TCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACT
GGAAGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATTAACATTAAGGATTACTC
TATTGTGTCATCTTATGTGTGCTCTGGACTTGTTGGAGATACTCCAAGGA
AGAACGATTCTTCTTCATCTTCACACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAG
GGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGATGATGGAAACGATGTT
TGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATACGAGACT
TTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAA
CAGGCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAAT
TTTCTCTGTGGAGGGAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAG
CTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGAGACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACT
CTATTGTGGTGTTCTGCGGAACTTCTGGAACTTACGGAACTGGATCTTG
GCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATCATCAC
CATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG NAW: (SEQ ID NO.: 18): KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKP
QCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLN
NVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLH
VCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTD
GSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDN
WKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEG
GHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINR
QVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVF
CGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Geração de construto de veículo termoestável C. thermocellum lichenase, LicB, nativa de comprimento total, consiste seqüencialmente de um peptídeo guia (Lp), uma porção N-terminal (A), um laço superficial (I), uma porção terminal-C (C), uma caixa Pro-Thr, e um domínio de ligação de celulossomo (C-BD). Removeu-se as seqüências de codificação Lp, caixa Pro-Thr e C-BD a partir do gene que codifica LicB, circularmente permutou-se a molécula para inverter os terminais N e C (Mu-siychuk, et al., 2007, Influenza and Other Respiratory Viruses, 1:1), e incor-porou-se locais de endonuclease de restrição únicos para clonagem de se-qüências-alvo nos novos terminais N e C, bem como no laço superficiais (I). A seqüência de molécula veículo projetada resultante foi verificada, e é designada LicKM. SEQ ID NO.: 29: GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGT
ATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAG
GCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACC
ATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAG
GATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAA
CGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTA
TGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGA
AGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATG
ATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATG
ATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCA
AACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGT
TTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACG GTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACG GAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCAT CATCAT 7GACTCGAGCTC SEQ ID NO.:30: MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNP
WDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWR
PDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPL
QAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFN
CVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHH
Para certos constructo, projetou-se um peptídeo de sinal PR1a e seqüência KDEL nos terminais N e C de LicKM. O ácido nucléico e seqüência de aminoácidos destes constructos são mostrados em SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:32. SEQIDNO.:31: GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTT
CTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGT
GCCCAAAATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAA
GTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGA
ACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACA
ACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAA
GGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTT
CATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAG
TGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAG
AGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTT
GGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAAC
TCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGAT
CTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACT
TTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTT
AACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGAT
TCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATAAGG
ATGAACTTTGACTCGAGCTC SEQ ID NO.: 32: MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGY
GYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWY
KNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIP
VTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVV
NTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDR
EYVDHHHHHHKDEL
Geração de constructo de antígeno recombinante Usou-se vetores de expressão pET, derivados de plasmídeo pBR322, projetados para levar vantagem das características do gene bacte-riófago T7 10 que promove transcrição e translação em alto nível. O bacteri-ófago que codifica polimerase de RNA é altamente específico para as seqüências de promotor T7, que são raramente encontradas em genomas outros do que genoma de fagos T7 (figura 2). pET-32 foi usado para fusão dos constructo HA e NA na região de laço de uma seqüência de lichenase modificada que tinha sido clonada neste vetor. O domínio catalítico do gene de lichenase com seqüência PR-1A a montante ("Proteína 1A Relacionada à Patogenia"), com um retículo endoplasmático (KDEL), ou uma seqüência de retenção vacuolar (VAC) e uma etiqueta His6 a jusante, foram clonados entre os locais Pacl e Xholl em um vetor pET-32 modificado (em que a região entre o promotor E7 e o terminador T7 foi excizada). Desse modo, o pET-PRACS-LicKM-KDEL e pET-PRACS-LicKM-VAC foram obtidos (figura 3). O domínio de HA de fragmento de DNA ou NA foi subclonado na porção de laço (I) de LicKM para dar uma fusão na estrutura de leitura correta para translação. Fusões de LicKM-ΝΑ foram construídas. O fragmento de DNA de NAW ou NAV foi subclonado no terminal C de LicKM usando um local Sall para dar uma fusão na estrutura de leitura correta para translação.
Exemplo 2. Geração de Vetores de Antígeno Candidato de Vacina Constructo de antígeno-alvo LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), ou LicKM-ΝΑ foram individualmente subclonadas no vetor viral escolhido (pBI-D4). pBI-D4 é um vetor binário derivado de pBI121 no qual o gene relator que codifica para E. coli β-D-glucoronidase (GUS) foi substituído por um "po-liligador" onde, entre os locais Xbal e Saci, um vetor derivado de TMV foi clonado (figura 4). pBÍ-D4 é um construto baseado em TMV na qual um gene estranho a ser expresso (por exemplo, antígeno-alvo, tal como LicKM-HA(GD), LicKM-HA(GD), LicKM-ΝΑ) substitui o gene de proteína de revestimento (CP) de TMV). O vírus retém o gene TMV 126/183kDa, o gene de proteína de movimento (MP), e o promotor de mRNA subgenômico de CP (sgp), que se estende na estrutura de leitura aberta de CP (ORF). O códon de partida para CP sofreu mutação. O vírus carece de CP e, portanto, não pode se mover através de toda planta hospedeira via floema. Contudo, o movimento de célula a célula de infecção viral permanece funcional, e o vírus pode se mover vagarosamente para as folhas superiores dessa maneira. Um local de clonagem múltiplo (Pacl-Pmel-Agel-Xhol) foi projetado na extremidade de sgp para expressão de genes estranhos, e é seguido pela região não-transladada TMV 3' (NTR). O promotor 35S é fundido na extremidade 5' da seqüência viral. A seqüência de vetor é posicionada entre os locais BamHI e Saci de pBI121. A ribozima de cabeça de martelo é colocada 3' da seqüência viral (Chen etal., 2003, Mol. Breed., 11:287). Estos contruto incluem fusões de seqüências que codificam LicKM-HA-SD, LicKM-HA(GD) ou NA, em seqüências que codificam o peptídeo de sinal de proteína PR-1a de tabaco, uma etiqueta 6x His e a seqüência âncora de retenção de ER KDEL, ou seqüência de classificação vacuolar (figura 5). Para constructo que contêm seqüência codificando PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL e PR-LicKM-NA-KDEL, o DNA de codificação foi introduzido como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. Além disso, HAW (HA Wyoming), HAV (HA Vietnam), NAW (NA Wyoming), e NAV (NA Vietnam) foram introduzidos diretamente como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. A seqüência de nucleotídeo foi subseqüentemente verificada estendendo-se sobre as junções de subclonagem dos contruto de expressão final (figura 6).
Exemplo 3: Geração de Plantas e Produção de Antígeno Infiltração de Agrobacterium de plantas Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacterium al- cançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al., 1993, J. Virol. Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foram infiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para expressar LicKM-HA ou LicKM-NA. A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) foi transformada com os contruto de pBI-D4-PR-LiKM-HA-(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL, e pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL. Culturas de Agrobacterium foram crescidas e induzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sei., 122:101). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca) foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4 com 25 pg/ml de kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em 500 ml de YEB com 25 pg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanosulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 pg/ml de acetosiringone. A cultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a um O.D6oo de -1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 x g por 15 minutos e ressus-pensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sacarose, 200 pM de acetosiringona) a um O.D6oo 2,4, mantidas por 1 hora à temperatura ambiente, e usadas para infiltração de Agrobacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadas com a suspensão de Agrobacterium u-sando-se uma seringa disponível sem uma agulha. As folhas infiltradas foram colhidas 4-7 dias (por exemplo, 6 dias) pós-infiltração.
As plantas foram classificadas para a presença de expressão de antígeno-alvo por avaliação de ensaio de atividade de lichenase e análise de imunomanchamento (figuras 7, 8, 9 e 10). A análise de zimograma revelou que expressão de ambas proteínas quiméricas de HA e NA nas folhas infiltradas de Nicotiana benthamiana testadas. A expressão está associada com atividade de lichenase (figuras 7 e 9). A faixa de atividade relacionada às proteínas de fusão mostra um peso molecular mais alto do que o controle de lichenase, e o mesmo peso molecular do produto expresso após agro-infiltração, confirmando a presença de todo produto de fusão.
Geração de raiz clonal e linha de raiz clonal Explantes de folha de Nicotiana benthamiana de cm x 1 cm de largura são obtidos de folhas após esterilização em 0,1% de NH4CI e seis lavagens em dH2O estéril. Os explantes são levemente danificados com uma faca no lado abacsial e co-cultivados com Agrobacterium rhizogenes, cepa A4, contendo ou a pBID4-Lic-HA-KDEL ou o pBID4-Lic-NA-KDEL. Os explantes são incubados por 2 minutos com uma cultura de Agrobacterium durante a noite (O.D. 6oonm=O,8-1), centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm a 4°C, e ressuspensos em meio de MMA para um OD 600 final = 0,5 na presença de 20 mM de acetosiringona. No final da incubação, os explantes foram secados em papel estéril e transferidos em 0,8% de placas de MS agar na presença de 1% de glicose, e 20 mM de acetosiringona. As placas foram paralaminadas e mantidas à temperatura ambiente por dois dias. Os explantes são então transferidos nas placas de MS na presença de 500 mg/l de Cefotaxin (Cif), 100 mg/l de Timentin (Tim) e 25 mg/l de karamicin. Após a-proximadamente 5 semanas, a geração de raízes transgênicas é obtida de explantes de folha de Nicotiana benthamiana transformados com Agrobacterium rhizogenes contendo os constructo de pBID4-Lic-HA-KDEL e pBID4-LicKM-NA- Após transformação, raízes com pêlos podem ser cortadas e colocadas em uma linha no meio K3 livre de hormônio sólido. Quatro a seis dias mais tarde as raízes que cresceram mais ativamente são isoladas e transferidas para meio K3 semi-sólido. As raízes selecionadas são cultivadas em um oscilador rotativo a 24°C no escuro, e linhas clonais são isoladas e subcultivadas semanalmente. As raízes e/ou linhas clonais podem ser classificadas para a presença de expressão de antígeno-alvo pela avaliação de ensaio de atividade de lichenase e análise de imunomanchamento.
Exemplo 4: Produção de Candidato de vacina Amostras de 100 mg de material de folha infiltrado de N. benthamiana foram colhidas em 4, 5, 5 e 7 dias pós-infecção. O tecido fresco foi analisado para expressão de proteína após ser colhido ou coletado a -80°C para a preparação de extratos de planta bruta subseqüentes, ou para purifi- cação de proteína de fusão.
As amostras frescas foram ressuspensas em PBS frio 1x inibidores de protease (Roche) em uma razão p/v 1/3 (1 ml/0,3 g de tecido), e moí-das com um pilão. Os homogenados foram fervidos por 5 minutos em tampão de carregamento de gel SDS, e então clareados por centrifugação por 5 minutos a 12.000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos em um tubo fresco e 20 pl, 1 μΙ ou suas diluições foram separadas em 12% de SDS-PAGE e analisadas por análise de Western blot usando-se anticorpos poli-clonais de camundongo anti-His6-HA ou antilichenase de coelho e/ou por análise de zimograma para avaliar atividade hidrolítica indicando atividade funcional de lichenase. A zimografia é um método eletroforético para medição de atividade de enzima. O método é baseado em um gel de sódio dode-cil sulfato impregnado com um substrato que é degradado pela enzima dissolvida durante o período de incubação. O manchamento do gel revela atividade enzimática como faixas brancas em um pano de fundo vermelho escuro. Dentro de uma certa faixa, a intensidade de faixa pode estar relacionada à quantidade de enzima carregada. A expressão de HA em plantas Nicotiana benthamiana infiltradas ou com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes contendo o plasmídeo pBID4-LicKM-HA(SD) ou pBID4-LicKM-HA(GD)-KDEL conduz a uma faixa específica correspondente ao peso molecular da proteína quimérica LicKM-HA(SD)-KDEL ou LicKM-HA(GD)-KDEL se a mobilidade eletroforética de proteína HA na proteína de fusão corresponde ao PM teórico (o PM da enzima de lichenase é cerca de 28 kD). A quantificação das proteínas quiméricas Lic-HA-KDEL e Lic-NA-KDEL expressas no extrato bruto pode ser feita por imunomanchamento ambos nos tecidos manualmente infiltrados e nos tecidos infiltrados a vácuo.
Purificação de antígenos Folhas de plantas infiltradas com Agrobacterium tumefaciens contendo os contruto de pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL, pBID4-MicKM-HA(GD)-KDEL, e pBID4-comprimento total-NA-KDEL foram moídas por homogeneização. Tampão de extração com inibidores de protease "livres de EDTA" (Roche) e Triton-X-100 1% foi usado a uma razão de 3 volumes p/v, e oscilado por 30 minutos a 4°C. Os extratos foram clareados por centrifugação a 9000 x g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi seqüencialmente filtrado através de tecido Mira, centrifugado a 20.000 x g por 30 minutos a 4°C, e filtrado através de um filtro de 0,45 pm, antes de purificação cromato-gráfica. O extrato resultante foi cortado usando-se precipitação de sulfato de amônia. Brevemente, (NH4)2SO4 foi adicionado ao extrato a 20% de saturação, incubado em gelo, e centrifugado a 18.000 x g por 15 minutos. O pélete foi descartado e (NH4)2SO4 adicionado vagarosamente a 60% de saturação, incubado em gelo por 1 hora, e centrifugado a 18.000 x g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o pélete resultante ressuspensa em tampão, em seguida mantido em gelo por 20 minutos, seguido por centrífuga a 18.000 x g por 30 minutos, e o sobrenadante dializado durante toda noite 10000 volumes de tampão de lavagem: Proteínas quiméricas LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL e NA-KDEL de comprimento total His-etiquetadas foram purificadas pelo uso de IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography", GE Health) à temperatura ambiente sob gravidade. A purificação foi realizada sob condições de não-desnaturação. As proteínas foram coletadas como frações de 0,5 ml, que foram unificadas, adicionadas com 20 mM de EDTA, dializadas contra PBS 1X durante a noite a 4°C, e analisadas por SDS-PAGE.
Alternativa, frações foram coletadas juntas adicionadas com 20 mM de EDTA, dializada contra NaH2PH4 10 mM, durante a noite, a 4°C, e purificada por Cromatografia de Troca de Ânion. Para purificação de LICKM-HA(SD)-KDEL, LIC-KM-HA(GD)-KDEL, e NA-KDEL de comprimento total, coluna de troca de ânion Q Sepharose de Fluxo Rápido (Amersham Pharmacia Biosciences) foi usada. Amostras de afinidade de LICKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL e NA-KDEL de comprimento total, ou proteínas quiméricas purificadas de troca de íon foram separadas em 12% de géis de poliacrilamida, seguido por manchamento de Coomassie. As proteínas separadas foram também eletroforeticamente transferidas nas membranas de PVDF para análise de Western blot usando-se anticorpo de antilichenase e sucessivamente com peroxidase de IgG anti-coelho-anticorpo conjugado.
As frações coletadas após diálise foram analisadas por imunomanchamento usando-se ambos pAb α-lichenase e o pAb a-anti-His6. A His-etiqueta foi mantida pelas proteínas quiméricas expressas, e a concentração final da proteína purificada foi avaliada por software.
Ensaio de Hemaglutinação Três espécies de células de sangue vermelhas (RBC's) de duas fontes diferentes foram usadas para demonstrar atividade hemaglutinante em preparações produzidas de planta de vacinas de gripe. O material de vacina ensaiado foi referido como "domínio 3" (domínio globular) de ou Gripe A/Wyoming/03/03 (um vírus H3N2) ou Gripe A/Vietnam/1194/2004 (um vírus H5N1). RBC's de galinha, peru e cavalo foram lavados individualmente em salina tamponada de fosfato (PBS) três vezes e ajustados para 0,5% v/v com PBS. Placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo foram testadas com PBS apenas para garantia de qualidade demonstrando que somente placas Falcon consistentemente proporcionavam delineação clara entre resultados positivo e negativo. O material de vacina foi avaliado em duplicata partindo-se de 0,5 mg/ml, e diluído 2 vezes na plana por pipetação de 25 pl de material em 25 μΙ de PBS etapa a etapa. 25 μΙ de uma suspensão 0,5% de uma espécie de RBC/placa foi então dispensado em todas as cavidades daquela placa. As placas foram sacudidas para distribuir RBC's e incubadas a 4°C por 4 horas antes de determinar resultados positivos de negativos. O domínio 3 de Gripe A/Vietnam/1194/2004 (um vírus H5N1) deu consistente e reproducivelmente um resultado positivo no RBC de ave, mas não no RBC de cavalo. A diluição de ponto final foi consistentemente 8 em réplicas e repetições experimentais, indicando que o domínio 3 H5 pode hemaglutinar RBC de ave a uma concentração de 62,5 25 pg (figura 11).
Exemplo 5: Estudos de Imunogenicidade Estudo de imunogenicidade inicial Um estudo de imunogenicidade inicial foi conduzido para determinar se fusões de LicKM-antígeno produzida de planta pode induzir soro específico IgG em camundongos intraperitonealmente imunizados, e se os anticorpos induzidos podem neutralizar vírus de gripe in vitro. O estudo usou LicKM, LicKM-HA(SD), LicKM-HA(SD), e NA recombinante enriquecida de folhas infiltradas de Agrobacterium de N. benthamiana para pureza de 75%, conforme descrito acima.
Camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade foram imunizados com 100 pg por dose de LicKM-HA(SD), LicKMHA(GD) recombinantes, e 50 pg por dose de NA recombinante. Três imunizações de imu-nogênio foram administradas intraperitonealmente no dia 1, o primeiro impulso 14 dias mais tarde, seguido por um segundo impulso 10 dias mais tarde. A primeira dose incluía adjuvante de Freund completo a uma razão de volume de 1:1, a segunda dose não incluía qualquer adjuvante. Um grupo de controle negativo recebeu 250 pg por dose de LicKM recombinante. Três camundongos estavam em cada grupo. Soros pré-imunes foram coletados um dia antes da primeira dosagem, e soros foram subseqüentemente coletados no dia 28, após o segundo impulso. As titulações de anticorpo IgG específico de gripe foram determinadas usando-se um ensaio ELISA (figura 12).
Inibição de atividade de hemaglutinação de vírus por soros imunes elevados contra vacina de gripe Os soros pré-imunes e soros pós-segundo impulso de camundongos imunizados, conforme descrito acima, foram avaliados para a capacidade de titulações de anticorpo para inibir atividade de hemaglutinação de vírus de gripe inativado. 4 unidades de HA de gripe A inativa-da/Vietnam/vírus 1194/2004 (um vírus H5N1) foram combinadas com 25 pl de diluições de soros pré-imunes ou soros coletados após o segundo impulso de vacina. A inibição de atividade de hemaglutinação em RBC de ave foi avaliada conforme descrito no Exemplo 4. As titulações de anticorpo resultantes foram eficazes na inibição de hemaglutinação de vírus. Os resultados exemplares representados na figura 13, e resumidos na Tabela 1, demons- tram que anticorpos elevados podem proteger contra atividade de hemaglutinação de vírus.
Tabela 1: Inibição de hemaglutinação por soros imunes eleva-dos contra vacina de gripe experimental______________________________ Exemplo 6: Sistema Modelo de Vacinações de Gripe A. Vacinação Intramuscular O furão, um modelo de animal estabelecido para o estudo de infecção de gripe, foi usado para determinar a eficiência de vacinas de gripe (por exemplo, Boyd et al., 1975; Chen et al., 1995; Scheiblauer et al., 1995; Sweet et al., 1980, Microbiol. Rev., 44:303; Maassab etal., 1982, J. Infact. Dis., 146:780; Toms etal., 1977; Webster etal., 1994; Fenton etal., 1981; e Webster et al., 1994). Estudos de transmissão utilizando um modelo de animal furão não somente demonstrou doador para difusão de recipiente de vírus de gripe, mas também os efeitos de mutações na virulência de vírus (Herlocher et al., 2001; e Herlocher et al., 2002). O modelo de provocação de vacina primitivo usado nos estudos aqui descritos foi bem-sucedidamente testado com vacinas de gripe sem adjuvante inativadas.
Produção de Artigos Testes Avaliou-se a imunogenicidade e eficiência protetora de antígenos produzidos de planta em furões. O artigo teste consistia em antígeno-alvo purificado em plantas. Domínios de HA de uma cepa de gripe tipo A (A/Wyoming/3/03 [H3N2] foram projetados como fusões com molécula veículo termo-estáveis e produzidos em um sistema de expressão baseado em planta, conforme descrito acima. NA de uma mesma cepa foi produzida em um sistema de expressão baseado em planta, conforme descrito acima. Os artigos testes não contêm quaisquer ácidos nucléicos, substância tóxica, ou agente infeccioso.
Especificamente, seqüências de nucleotídeo codificando aminoácidos 17 a 67 mais 294 a 532 de HA, que juntas compreendem o domínio de haste (Wilson et al., 1981, nature 289:366), foram inseridas em LicKM (número de acesso no banco de gene DQ776900) para dar LicKM-HA(SD). Seqüências de nucleotídeo que codificam aminoácidos 68 a 293 de HA, compreendendo o domínio globular (Wilson et al, supra), foram similarmente inseridas para dar LicKM-HA(GD). Seqüência que codifica o peptídeo de sinal da proteína PR1a relacionada à patogenia de Nicotiana tabacum (Pfitz-ner et al., 1987, Nucleic Acids Res., 15:4449) foi incluída no terminal N das fusões. As seqüências que codificam a etiqueta de purificação de afinidade de poli-histidina (6xHis), e o sinal de retenção de retículo endoplasmático (KDEL), foram incluídos no terminal C. As fusões de LicKM foram introduzidas no vetor híbrido pBDI4 (Wilson et al., supra), que permite transcrição de genoma viral a partir do promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor, seguido por replicação viral e expressão de seqüência alvo de mRNA subgenômico de proteína de revestimento (TMV) de vírus de mosaico de tabaco (Shivprasad et al., 1999, Virology, 255:312), e que é derivada de plasmídeo binário pBI121 Agrobacterial (Chen et al., 2003, Mol, Breed, 11:287), para a expressão transiente de alvos em folhas. Em adição, seqüência codificando aminoácidos 38 e 469 de NA da mesma cepa de gripe foi introduzida em pBID4 e 6xHis mais KDEL foram incluídas no terminal C.
Os vetores projetados contendo antígenos de gripe foram introduzidos em cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 por eletroporação. As suspensões de A. tumefaciens recombinante foram introduzidas em plantas Nicotiana benthamiana por inoculação de folhas aproximadamente seis semanas após semeadura de modo a introduzir seqüência-alvo nos tecidos de folha. As plantas foram crescidas em pote com solo sob condições de 12 horas de luz/12 hora no escuro a 21 °C. As folhas foram colhidas quatro a sete dias após inoculação, dependendo do construto de expressão. Extratos de proteína foram preparados por moagem de folhas em um tampão compreendendo 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0; 100 mM de cloreto de sódio; 10 mM de sódio dietilditiocarbamato; e 10 mM de β-mercaptoetanol. Os an- tígenos recombinantes foram enriquecidos por precipitação de sulfato de amônia, seguido por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (por exemplo, pelo uso de etiqueta 6xHis), e cromatografia de troca de ânion, com diálise após cada etapa, a pelo menos 80% de pureza.
As reações de antígenos produzidos por planta com anti-soros de referência foram avaliadas por análise de ELISA (figura 16A), e sob condições de desnaturação por imunomanchamento (figura 16B). Para ELISA, placas de 96 cavidades foram revestidas com LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD) e NA purificadas de plantas ou revestidas com vírus de gripe inati-vada A/Wyoming/3/03. As placas revestidas foram incubadas com anti-soros de ovelha elevados contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03, anti-soros de ovelha elevados contra vírus reagrupados NIBRG-18 (H7N2), ou anti-soros de ovelha de vírus reagrupados elevados contra NIBRG-17 (H7N1). Para análise de imunomancha, 100 ng de LicKM-HA(SD), 100 ng de LicKM-HA(GD), e uma quantidade de gripe A/Wyoming/3/03 correspondendo a 100 ng de HA, foram separados por SDS-PAGE, transferidos para membrana de fluoreto de polivinilideno, e incubados com anti-soros de coelho contra LicKM, ou anti-soros de ovelha elevados contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03. A atividade de NA foi avaliada de acordo com o protocolo padrão WHO WHO/CDS/CSR/NCS 2002.5 Rev. 1. A inibição de atividade de NA foi avaliada por pré-incubação de NA produzida por planta com anti-soros de ovelha elevados contra vírus reagrupados homólogos (N1BRG-18 [H7N2] ou heterólogos (NIBRG-17 [H7N1] antes da condução do ensaio de neuraminidase.
Em ambos ensaios ELISA e de imunomancha, LicKM-HA(SD) foi mais fortemente reconhecido pelos soros de referência do que LicKM-HA(GD), embora soros de coelho elevados contra LicKM reconheceram cada fusão a uma extensão similar (figura 16B). Em adição, NA produzida por planta foi reconhecida por soros de ovelha policlonais de referência elevados contra vírus H7N2 reagrupados (figura 16C), e mostrou atividade enzimática que foi inibida por soros de referência em uma maneira específica de cepa (figura 16C).
Vacinação Estudos de furões efetuados sob UK Home Office license, conforme requerido peio UK Animal (Scientific Procedures) Act, 1986. "Fitch" macho ou furões albinos (Highgate Farm, Highgate, England), de 4,5 meses de idade, pesando de 441 a 629 gramas no início do estudo, e mantidos em Lab-Diet de furão de alta densidade (IPS Product Supplies, Lindres, reino Unido), foram transferidos para tratamento conforme mostrado na Tabela 2.
Tabela 2. Grupos de Tratamento *TCID50 ("Dose de Infecção de Cultura de Tecido") = o nível de diluição de um vírus no qual metade de uma série de cavidades de laboratório contém vírus de crescimento ativos.
Estes grupos de oito furões foram imunizados subcutaneamente por imprimadura e impulsão duas vezes (nos dias 0, 14 e 28) com formulações de vacina candidata (VC1 mais adjuvante, VC2, VC2 mais adjuvante) contendo combinações de antígenos de gripe produzidos por plantas (Tabela 1). Animais de VC1 receberam 100 pg de LicKM-HA(SD) e 100 pg de LicKM-GD mais 1,3 mg de alum. Animais de VC2 receberam 100 pg de LicKM-(SD) e 100 pg de LicKM-(GD), e 50 pg de NA, mais 1,3 mg de alum "mais adjuvante"), ou mais nenhum alum ("NENHUM adjuvante). 100 pg de LicKM-(SD) e 100 pg de LicKM-(GD) distribuídos juntos correspondem a a-proximadamente 100 pg de HA. Os animais de controle negativo receberam adjuvante alum sozinho, e aos animais de grupo de controle positivo foram dados uma dose intranasal simples de vírus da gripe A/Wyoming/3/03 (0,5 ml a uma concentração de 105,5 TCID50 por ml no dia 0). Em seguida a imunização, o animais foram monitorados diariamente para lesões ou irritação, mobilidade, eritema e atividade geral.
Os animais foram provocados intranasalmente enquanto sob anestésico com 0,5 ml de vírus de gripe Α/Wyoming a uma concentração de 105,5 TCID5o por ml dez dias após a dose final. Amostras de sangue foram coletadas de veias terminais superficiais nos dias de vacinação, provocadas, e quatro dias pós-provocação, e lavagens nasais foram coletadas por quatro dias pós-provocação. Titulações Hl de soros foram determinadas para vírus de gripe homólogos A/Wyoming/3/03 e vírus de gripe heterólogos A/Sydney/5/97 (H3N2), A/Califórnia/7/04 (H3N2) e A/New Caledonia/20/99.
As vacinações, procedimentos e provocações de vírus da gripe foram efetuados de acordo com a tabela colocada na Tabela 3. Nenhum e-feito adverso foi notado em quaisquer animais que receberam candidatos de vacina produzida por planta. Os animais foram implantados com transpon-ders para identificação individual e monitoramento da temperatura do corpo. A dosagem foi efetuada em três ocasiões separadas em pontos de tempo detalhados na tabela de estudo (Tabela 3). O material de teste preparado em avanço foi aliquotado para cada dose. O material de teste foi misturado com adjuvante imediatamente antes da administração. ____________Tabela 3. Tabela de Estudo____________________________________ Análise Sinais clínicos (registros de saúde), peso corpóreo e mudanças de temperatura foram registrados. Uma vez diariamente, pós-infecção, cada animal examinado para lesões ou irritação, mobilidade, eritema e atividade geral, e observações foram registradas para determinação de registros de saúde. Cada animal foi classificado como segue: espirro ou ruído nasal (ponto 1); descarga purulenta a partir das narinas externas (ponto 1); atividade espontânea ou movimento diminuídos (ponto í); nenhuma atividade espontânea ou agilidade diminuídas (pontos 2). "Atividade espontânea ou movimento diminuídos" e "nenhuma atividade espontânea ou agilidade diminuídas" foram pontos de classificação mutuamente exclusivos. A perda máxima no peso do dia de infecção foi calculada para cada animal. O aumento máximo na temperatura do corpo do dia de infecção foi calculado para cada animal. O desvio médio e padrão de registro de saúde máximo, perda de peso, e mudança de temperatura para cada animal em qualquer dia foi calculado pelo grupo de tratamento, e comparado por ANOVA. Uma medição similar a AUC compreendendo a soma de saúde, perda de peso, e registros de mudanças de temperatura em cada dia pós-infecção foi calculada para cada animal; desvios médio, mediano e padrão de grupo de tratamento foram calculados e comparados por ANOVA ou teste de Krustal-Wallis, conforme apropriado. Em seguida a provocação com vírus, cada um dos grupos de tratamento demonstrou recuperação da provocação conforme indicado por sinais clínicos, e mudanças na temperatura e peso corpóreo. Os grupos de animais que receberam a vacina de teste foram protegidos e mostraram pouco ou nenhum sintoma de doença em seguida a provocação com vírus de gripe homólogo. Ambos os candidatos de vacina teste proporcionaram proteção total aos animais (figura 14).
As lavagens nasais foram coletadas após provocação de vírus. O volume de recuperação de lavagem nasal foi medido, e o peso da lavagem nasal foi monitorado. A resposta celular inflamatória foi avaliada em lavagens nasais pós-provocação por manchamento com azul de Trypan (u-sado para determinar contagens de célula totais), e contagem de leucócito. As contagens de célula na lavagem nasal foram resumidas por desvio médio, mediano e padrão de dados transformados de log em cada dia de amostragem pós-infecção; grupos de tratamento foram comparados por ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis, conforme apropriado. Similar aos sinais clínicos discutidos acima, o monitoramento de lavagens nasais indicou grupos de tratamento recebendo cada uma das vacinas de tratamento de teste demonstrou proteção de infecção igual a, maior do que grupos de controle positivo (figura 14).
Abrigo viral foi determinado usando-se titulação de célula de rim canino Madin-Darby (MDCK) nas amostras de lavagem nasal. O ponto final do ensaio de titulação de MDCK foi determinado pela realização de um ensaio de hemaglutinação com células de sangue vermelha de peru. O cálculo de Karber foi usado para determinar log-ιο TCID5o/ml para cada amostra. O abrigo nasal a partir das amostras de lavagem nasal foi determinado nas amostras de lavagem nasal pós-infecção. O abrigo de titulação máxima para cada animal foi log-transformado; desvios médio, mediano e padrão de grupos de controle foram calculados e comparados por teste de Kruskal-Wallis. A proporção de animais em cada grupo de tratamento com qualquer abrigo de vírus em qualquer tempo foi tabulada, e os grupos foram contrastados usando-se um teste X2 para independência. Os resultados do abrigo de vírus são representados na figura 15. Somente o grupo de tratamento de controle negativo resultou em abrigo significante de vírus (figura 15).
Ensaios de inibição de hemagíutínina (HAI) foram realizados conforme descrito no Exemplo 5 usando-se amostras de soros pré e pós-vacinação contra vírus homólogos (vírus de Gripe A/Wyoming/3/2003 (H3N2)) para confirmar soro-negatividade dos animais como guia e se ou não animais soro-convertem em seguida à imunização e infecção. As titulações de HAI foram tabuladas e animais com a 4 vezes que ocorre entre o dia 0 e o dia terminal foram identificados. A atividade de inibição de hemaglutinina (Hl) de soros de animais imunizados está relacionada como um correlato de proteção (Brown et al., 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; e Hobson etal., 1972, J. Hyg., 70:767). Os resultados de tal experimento são apresentados na Tabela 4. Todos os animais em grupos imunizados com vacinas testes contra H3N2 ou respostas imunes específicas de alvo fortes montadas de controle positivo com alta atividade de inibição de hemaglutinação de soros. Em seguida a uma primeira dose de vacina, VC2 mais adjuvante geram altas titulações de HAI. VC2 sem adjuvante geram uma resposta protetora, embora titulações não tão altas com adjuvantes após uma primeira dose. Contudo, em seguida a uma segunda dose, as titulações alcançaram níveis similares a CMBI com adjuvante. VC1 mais adjuvante também resultou em geração de níveis protetores de anticorpo que foram significantemente mais altos em seguida a uma segunda dose de vacina. ____________Tabela 4: Resumo dos dados de HAI de Furão__________________ Os resultados de um segundo experimento de ensaio de HA são apresentados ma figura 17. Nenhuma atividade de Hl foi observada em soros pré-imunes de qualquer animal, ou em soros de animais NC (figura 17). Contudo, os soros de todos os furões vacinados com VC2 mais adjuvante exibiram titulações de Hl altas na faixa de 1:320 a 1:2560 (titulação média 1273) em seguida a primeira dose (figura 17). Respostas inferiores e titulações de Hl mais baixas em seguida à primeira dose foram observadas entre animais que receberam VC1 mais adjuvante (figura 17), sugerindo que NA pode ter modulado a resposta imune. Cinco dos oito animais que receberam VC2 dão titulações de Hl na faixa de 1:160 a 1:1280, onde vacinas de gripe inativadas comerciais na ausência de adjuvante tipicamente induzem titulações de Hl muito baixas, se houver (Potter et al., 1972, Br. J. Exp. Pathol., 53:168; Potter etal., 1973, J. Hyg. (Lond), 71:97; e Potter et al., 1973, Arch. Gesamte Virusforsch., 42:285). Em seguida a segunda dose de VC1 mais adjuvante, VC2, ou VC2 mais adjuvante, soros de todos os furões tinham titulações de Hl na faixa de 1:640 a 1:2560, e estas permaneceram similarmente altos após a terceira dose (figura 17). Os soros de todos destes animais tinham titulações em excesso de 1:40, relacionados por alguns como a titulação de Hl mínima consistente com proteção em seres humanos (Brown etal., 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; e Hobson etal., 1972, J. Hyg., 70:767).
As titulações de Hl nos soros de furões que receberam duas destas três doses de qualquer dos candidatos de vacina produzidos de planta foram equivalentes a ou maior do que aquelas nos soros de animais de controle positivo intranasalmente infectados (figura 17), e estavam em excesso daquelas observadas em outros estudos de furão. Por exemplo, furões intramuscularmente imunizados com uma vacina de gripe H3N2 inati-vada comercial foram reportados para desenvolver titulações de Hl de 1:20 após receberem duas doses (Lambkin et al., 2004, vaccine, 22:4390). Os soros de furões imunizados com VC1 mais adjuvante, VC2, ou VC2 mais adjuvante tinham titulações de Hl quatro a vinte vezes mais baixas contra as cepas de vírus H3N2 heterólogo A/Sydney/5/97 e A/California/7/04 do que contra A/Wyomimg/3/03, mas estas titulações estavam todas em excesso do limite 1:40 consistente com proteção, sugerindo o potencial para estes candidatos de vacina para proteger contra cepas H3N2 heterólogas. Titulações de Hl abaixo de 1:10 foram observadas contra gripe A/New Caledonia/20/99 (H1N1), indicando a especificidade de subtipo H3 da resposta de anticorpo de Hl.
Em seguida a imunogenicidade e eficiência protetora, estudo foi conduzido para avaliar a eficiência protetora de antígenos de HA e NA pro- duzidos por planta em furões imunizados por provocações intranasais com vírus de gripe de crescimento vivo A/Wyoming/3/03. A extensão de infecção viral em seguida a provocação foi determinada para cada animal por monitoramento da titulação de abrigo de vírus em lavagens nasais por quatro dias pós-provocação. Somente um a-nimal que recebeu qualquer das três formulações de vacina candidata mostrou abrigo de viris detectável, e ainda em menos do que 102 TCID50, onde animais nos grupos NC mostraram abrigo de vírus na faixa de 106 a 107 TCID50 (figura 18A). O nível de abrigo de vírus no grupo PC estava na faixa de 102 a 103 TCID50, maior do que para qualquer animal nos grupos de vacina candidata (figura 18A). A evidência de proteção foi observada para animais recebendo quaisquer das formulações de vacina candidata. A perda de peso pós-infecção foi grandemente reduzida em furões que receberam VC1 mais adjuvante, VC2 mais adjuvante, ou o vírus homólogo, comparada àqueles do grupo NC (figura 18B). A redução na perda de peso para animais que receberam VC2 foi menos surpreendente (figura 18B). Em adição, a elevação na temperatura do corpo em furões imunizados com qualquer das formulações de vacina candidata foi reduzida comparada àquela observada para animais em quaisquer grupos NC ou PC (figura 18C). Além disso, o pico médio de registro de sintoma, um índice indicando a freqüência de vários sintomas relacionado à gripe em seguida a provocação, foi reduzido em animais que receberam as formulações de vacina candidata comparado àqueles no grupo NC (figura 18D). Similarmente, contagens de leucócito nas lavagens nasais de furões, tomadas como um indicador de infecção de trato respiratório superior, foram reduzidas em recipientes de vacina candidata comparadas a animais no grupo NC (figura 18E). O estudo de provocação indica que os antígenos de HA e NA produzidos de planta conferem um alto grau de imunidade protetora em furões, mostrando promessa de desenvolvimento de vacina. Nos estudos futuros, nós elucidaremos o papel protetor de LicKM-SD e LicKM-GD quando administrados individualmente, e o papel de NA em respostas imunes de facilitação adicional. B. Vacinação Intranasal A imunogenicidade de vacinas candidatas é avaliada em seguida a imunização intranasal em camundongos Balb/c ou animais modelos furão. O desenho do estudo é similar àquele de imunização intramuscular discutida nos Exemplos acima. Em breve, grupos de camundongos ou furões (aproximadamente 8-10 animais/grupos) são imunizados intranasalmente com três doses (100 pg/dose) de antígeno-alvo em cerca dos dias 0, 14 e 28, na presença ou ausência de adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio, MALP-2, etc). Amostras de soros e lavagens nasais são coletadas em cada dia de vacinação antes da administração do antígeno, e dez dias após a terceira dose. Os animais imunizados são provocados após a última dose pela rota nasal com a cepa homóloga de vírus da gripe conhecida para infectar os animais, e para produzir sintomas de infecção respiratória com febre. A natureza da resposta imune é examinada pela determinação do nível de abrigo de vírus, perda de peso pós-infecção, elevação na temperatura do corpo, pico médio de registros de sintoma, e contagens de leucócitos em lavagens nasais, conforme medidos após provocação do vírus. A presença de anticorpos em NA e/ou HA, bem como atividade de neutralização de HI e vírus, é examinada. C. Estudos de Escalação de Dose Composições e doses ótimas de antígenos e adjuvantes, rota de administração, bem como regimes de imunização, podem ser adicionalmente avaliados usando estudos de escalação de dose. Antecipou-se o teste de três a seis composições de vacina de teste neste estudo. O estudo é realizado usando-se ambas a rota intramuscular (Tabela 3) e rota intranasal. Similar àquela imunização intramuscular e intranasal discutida nos Exemplos acima, grupos de animais (aproximadamente 8-10 animais/grupos) são imunizados intranasalmente com várias doses de vacina de teste, na presença ou ausência de adjuvante (por exemplo, hidróxido de alumínio, MALP-2, etc). Vide Tabela 5 para uma tabela de dosagem exemplar.
Como em outros estudos, amostras de soros e lavagens nasais são coletadas em cada dia de vacinação antes da administração do antígeno, e dez dias após a terceira dose. Os animais imunizados são provocados após a última dose por rota nasal com a cepa homóloga de vírus de gripe conhecida para infectar animais e para produzir sintomas de infecção respiratória com febre. A natureza da resposta imune pode ser determinada pelo exame do nível de abrigo de vírus; perda de peso pós-infecção; elevação na temperatura do corpo; pico médio de registros de sintoma; contagens de leucócitos em lavagens nasais; presença de anticorpos em NA, HA e/ou M2; inibição de hemaglutinação; e/ou atividade de neutralização de vírus.
Tabela 5: Desenho Exemplar para Estudo de Escalação de Dose em A-nimais *i.m. = injeção intramuscular REIVINDICAÇÕES

Claims (32)

1. Antígeno isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um componente de uma proteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína lichenase; em que o componente de proteína de membrana integral compreende pelo menos uma porção imunogênica selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de hemaglutinina (HA), uma porção imunogênica de neuraminidase (NA) e uma porção imunogênica de M2, e em que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32.
2. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos uma porção imunogênica de HA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 24, e/ou em pelo menos uma porção imunogênica de NA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18.
3. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de proteína de membrana integral consiste no comprimento total de HA selecionado de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3, ou consiste no comprimento total de NA selecionado de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4.
4. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30.
5. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
6. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e um antígeno compreendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína lichenase, e; em que o componente de proteína de membrana integral compreende pelo menos uma porção imunogênica selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de HA, uma porção imunogênica de NA, e uma porção imunogênica de M2; em que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32; e em que a composição é capaz de elicitar uma resposta imune após administração a um indivíduo.
7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos componentes de proteína de membrana integral consiste de pelo menos uma porção imunogênica de HA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 24, e/ou pelo menos uma porção imunogênica de NA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18.
8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o componente de proteína de membrana integral compreende uma porção imunogênica de HA e uma porção imunogênica de NA.
9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o componente de proteína de membrana integral compreende HA de comprimento total selecionada de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3, e NA de comprimento total selecionada de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4.
10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30.
11. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um segundo antígeno, que compreende um componente de proteína de membrana integral de gripe A fundido a uma proteína lichenase, em que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32; em que o componente de proteína de membrana integral do segundo antígeno compreende pelo menos uma porção imunogênica que é distinta da porção imunogênica do primeiro antígeno e é selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de HA, uma porção imunogênica de NA, e uma porção imunogênica de M2.
13. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno foi produzido em uma planta selecionada a partir de uma planta transgênica e uma planta que expressa transientemente o antígeno.
14. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende antígeno que é purificado, parcialmente purificado, ou não-purificado a partir de células de planta, uma planta, sementes, fruta, ou um extrato destas.
15. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um adjuvante de vacina selecionado do grupo consistindo em alum, MF59, saponina, e MALP2.
16. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um terceiro antígeno.
17. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o terceiro antígeno compreende um componente de proteína de membrana integral de gripe A fundido a uma proteína lichenase; em que o componente de proteína de membrana integral do terceiro antígeno compreende pelo menos uma porção imunogênica que é distinta da porção imunogênica do primeiro antígeno e a porção imunogênica do segundo antígeno, e é selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de HA, uma porção imunogênica de NA, e uma porção imunogênica de M2.
18. Composição de vacina antigripe A, caracterizada pelo fato de que é para uso na indução de uma resposta imune protetora contra infecção de gripe A em um indivíduo, em que a composição de vacina compreende um antígeno compreendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína lichenase; em que o componente de proteína de membrana integral compreende pelo menos uma porção imunogênica selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de HA, uma porção imunogênica de NA, e uma porção imunogênica de M2; em que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32; e em que a composição é administrada a um indivíduo em uma quantidade eficaz e a administração é suficiente pra estimular a produção de anticorpos específicos de antígeno, ou estimular uma resposta imune celular pelo indivíduo; induzindo, desse modo, uma resposta imune protetora.
19. Composição para uso como definido na reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para ser administrada oralmente, intranasalmente, subcutaneamente, intravenosamente, intraperitonealmente, ou intramuscularmente.
20. Composição para uso como definido na reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um ser humano, um pássaro, um porco, ou um cavalo.
21. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30.
22. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
23. Método para produção de uma proteína de antígeno compreendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína lichenase, caracterizado pelo fato de que compreende: a. preparar um construto de ácido nucléico que codifica um antígeno compreendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína lichenase; b. introduzir o ácido nucléico da etapa a em uma célula; e c. incubar a célula sob condições favoráveis para expressão da proteína de antígeno; produzindo, desse modo, a proteína de antígeno; em que o componente de proteína de membrana integral compreende pelo menos uma porção imunogênica selecionada do grupo consistindo em uma porção imunogênica de HA, e uma porção imunogênica de NA, e em que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 ou SEQ ID NO:32.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o componente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos uma porção imunogênica de HA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 24, e/ou pelo menos uma porção imunogênica de NA selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30.
26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína lichenase é uma proteína LicKM tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:32.
27. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína de antígeno está sob controle de um promotor viral.
28. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o construto de ácido nucléico compreende adicionalmente sequência de ácido nucléico de vetor e/ou sequências que codificam proteínas virais.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor binário.
30. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de planta, por exemplo, uma célula de planta selecionada a partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete, mustarda, munguba, brócolis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho, trevo, petúnia, tomate, batata, nicotina, espinafre e célula de lentilha.
31. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína de antígeno é produzida em uma célula de raiz clonal e/ou em mudas germinadas.
32. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar a proteína de antígeno parcialmente purificada ou purificada que é produzida.
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