ES2265689T3

ES2265689T3 - Composiciones terapeuticas para el tratamiento de la hipersecrecion mucosa.

Info

Publication number: ES2265689T3
Application number: ES99941754T
Authority: ES
Inventors: Conrad Padraig Microbio. Res. Authority QUINN; Keith Alan Microbio. Res. Authority FOSTER; John Andrew Microbio. Res Authority CHADDOCK
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Public Health England
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2007-02-16
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: ATE328612T1; CA2341429C; PT1107794E; CY1105199T1; JP4558935B2; GB9818548D0; WO2000010598A2; CA2341429A1; WO2000010598B1; EP1107794A2; WO2000010598A3; US6632440B1; AU756063B2; EP1107794B1; AU5525099A; DE69931794D1; JP2002523377A; DK1107794T3; DE69931794T2

Abstract

Un compuesto para el tratamiento de la hipersecreción de moco a partir de una célula de secreción mucosa, comprendiendo dicho compuesto: (i) un dominio de inhibición que consiste de o que comprende una cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento o una variante de la misma que inhibe la exocitosis; (ii)un dominio de transposición que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula; y (iii) un dominio objetivo, en donde el dominio objetivo se enlaza a una célula de secreción mucosa; en donde dicho compuesto no es una neurotoxina clostridial.

Description

Composiciones terapéuticas para el tratamiento de la hipersecreción mucosa.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el tratamiento de la hipersecreción mucosa, con composiciones para esto y con la fabricación de esas composiciones. La presente invención se relaciona particularmente, aunque no exclusivamente, con el tratamiento de la bronquitis crónica en el caso de una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), asma y otras condiciones clínicas que involucren a una COPD.

El moco es una capa delgada de líquido viscoso elástico protector que reviste las vías respiratorias. Es una solución acuosa al 1-2%, en la cual los principales componentes son los glicoconjugados conocidos como mucinas. El moco, que incluye a las mucinas, es secretado por células secretoras de moco, por las células caliciformes epiteliales superficiales de las vías respiratorias mayores y por las células mucosas de las glándulas submucosas. La liberación de mucina ocurre por medio de tres mecanismos: la secreción constitutiva, la secreción regulada y la actividad en la superficie celular de la proteasa. Entre estos, se regula la secreción que responda a estímulos externos y son responsables de la intervención terapéutica en la COPD y el asma. La secreción regulada implica involucra la liberación de gránulos intracelulares por medio de acoplamiento y fusión de los gránulos con el exterior de la célula para liberar sus contenidos sobre la superficie de la vía aérea. La fusión de los gránulos ya sea con la membrana plasmática de la célula epitelial o con la membrana de otros gránulos conduciendo a la liberación a través de complejos multigranulados fusionados a la superficie de la célula. La secreción regulada de mucinas se controla por medio de factores humorales y de mecanismos neurales. Los mecanismos neurales en los humanos involucran una contribución menor de la ruta simpática y a un componente parasimpático colinérgico mayor. Otra importante ruta neural que regula la secreción de mucina, particularmente la hipersecreción de condiciones patológicas, es aquella de la ruta No Adrenérgica, No Colinérgica (NANC). El componente NANC involucra tanto a una ruta ortodrómica que involucra transmisores neuropéptidos y no péptidos, como a una ruta eferente sensorial local que involucra a las fibras antidrómicas a partir de fibras sensoriales C.

La COPD es una condición respiratoria común, siendo la cuarta causa más común de muerte en la mediana edad en el mundo occidental. La COPD comprende dos enfermedades relacionadas, que usualmente ocurren juntas, enfisema y bronquitis crónica. La base patológica de la bronquitis crónica es la hipersecreción mucosa. La excesiva secreción bronquial crónica conduce a la expectoración, y puede durar desde unos pocos días hasta muchos años. La hipersecreción mucosa de la COPD conduce a la obstrucción de las vías respiratorias menores produciendo un flujo respiratorio máximo reducido y una lenta desocupación pulmonar forzada. Existe una reversión mínima de la función de las vías respiratorias deterioradas de la COPD por medio de los broncodilatadores y actualmente es una terapia no efectiva para la hipersecreción mucosa.

La hipersecreción mucosa es también un factor que contribuye significativamente a la patofisiología del asma. Es un componente clave en el estado asmático, y contribuye a los síntomas crónicos y a la morbilidad del asma. El componente de hipersecreción mucosa del asma no está bien controlado por las terapias actuales, particularmente en los casos severos y crónicos.

WO 95/17904 describe los usos de las holotoxinas botulínicas para tratar diferentes desordenes y los dolores asociados. En particular, se describe un método para tratar condiciones tales como las secreciones colinérgicas controladas, que incluyen exudación, lagrimeo y secreciones mucosas.

WO 97/13410 describe el uso de enlaces aminados para mejorar la actividad biológica de las moléculas conjugadas.

WO 96/33273 describe conjugados que contienen como componentes a las neurotoxinas clostridiales, cuyos conjugados son capaces de modificar las funciones aferentes sensoriales periféricas.

Por lo tanto, sería deseable tratar, reducir o prevenir la hipersecreción mucosa que causa o conduce a estas condiciones enfermizas.

La invención provee un compuesto para tratar la hipersecreción mucosa que comprende la inhibición de la secreción mucosa por las células secretoras de moco. Este compuesto puede ser producido por medio de la modificación de una neurotoxina clostridial o un fragmento de la misma.

Una ventaja de la invención es que provee y utiliza ahora un agente para el tratamiento efectivo de la hipersecreción mucosa y para estados enfermizos asociados, ofreciendo un alivio a los pacientes que hasta ahora no contaban con un agente así.

La presente invención representa por lo tanto una propuesta nueva diferente para el tratamiento de la hipersecreción mucosa por medio de la inhibición de los procesos de secreción, concretamente de uno, de otro o de ambos entre las secreciones mucosas por parte de las células secretoras de moco y la secreción de neurotransmisores que regulan la secreción de moco. Los agentes de la presente invención reducen la secreción de moco y/o previenen la hipersecreción de la COPD y del asma, y de cualquier otra enfermedad en la cual la hipersecreción mucosa es un elemento causante.

Un compuesto de la invención típicamente inhibe la exocitosis en las células secretoras de moco o en las neuronas que controlan o dirigen la secreción mucosa. Este compuesto se administra a un paciente que sufre de hipersecreción mucosa y la inhibición de la exocitosis en las células especificadas resulta en la reducción de la secreción de moco. Los estados específicos de enfermedad causados por, o exacerbados por hipersecreción están localizados en las vías respiratorias, y por lo tanto una modalidad de la invención comprende la administración tópica a las vías respiratorias o a una región seleccionada o a una porción seleccionada de las vías respiratorias de un compuesto que inhibe la exocitosis en las células secretoras de moco o en las neuronas que controlan o dirigen la secreción mucosa.

Un compuesto de las modalidades de la invención es un polipéptido que consiste de, o que contiene un dominio inhibidor que inhibe la exocitosis en las células secretoras de moco o inhibe la exocitosis en una célula neuronal, inhibiendo directamente de ese modo la exocitosis de moco o de uno o más de los componentes del moco, o inhibe indirectamente la secreción mucosa por medio de la inhibición de la exocitosis del neurotransmisor que a su vez conduciría a, o estimularía de otra forma la secreción mucosa. El dominio de inhibición contiene una cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento o una variante de la misma que inhibe la exocitosis.

El compuesto comprende además un dominio de transposición que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula. Este dominio puede contener una región H_{N} de un polipéptido botulínico, o un fragmento o variante del mismo que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula.

El compuesto contiene un dominio objetivo que se enlaza a (i) una célula de secreción mucosa, o (ii) una célula neuronal que controla o dirige la secreción mucosa. Se considera entonces al compuesto, específico para estos tipos de células. También es opcional para el compuesto el ser relativamente no específico, pero para lograr la inhibición de la secreción mucosa por medio del direccionamiento del compuesto a través de la escogencia de la ruta de administración - se administra por lo tanto preferiblemente el compuesto a las células epiteliales de secreción mucosa en las vías respiratorias, específicamente en los pulmones. Mientras que un compuesto no específico puede afectar la exocitosis en muchas células de una gran variedad de tipos, generalmente solamente aquellas células que son estimuladas serán afectadas, y estas células estimuladas, en estados típicos de la enfermedad, serán aquellas que están secretando moco y contribuyendo a la enfermedad.

Cuando están presentes los dominios objetivo adecuados, incluyen, pero no se restringen a, un dominio seleccionado entre la Sustancia P, VIP, los agonistas adrenoreceptores beta_{2}, el péptido para liberación de gastrina y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina. Las células precisas a las cuales está dirigido en las modalidades preferidas de la invención, se seleccionan de (a) las células que secretan mucinas, tales como las células caliciformes epiteliales y las células que secretan moco de la glándula submucosa, (b) las células que secretan componentes acuosos del moco, tales como las células Clara y las células serosas, y (c) las células que controlan o dirigen la secreción mucosa, tales como las fibras C "eferentes sensoriales", o las fibras del sistema neural NANC. El compuesto puede administrarse como una preparación sustancialmente pura dirigida totalmente al mismo tipo de células, o puede ser una mezcla de compuestos dirigidos respectivamente a células diferentes.

El compuesto de las modalidades específicas de la invención comprende un primero, un segundo y un tercer dominios. El primer dominio se adapta para escindir una o más vesículas o proteínas asociadas a la membrana plasmática esenciales para la exocitosis. Este dominio evita la exocitosis una vez que ha sido suministrado a una célula objetivo. El segundo dominio transpone al compuesto dentro de la célula. Este dominio libera al primer dominio dentro de la célula. El tercer dominio se enlaza a la célula objetivo, esto es, se enlaza a (i) una célula secretora de mucosa, o (ii) a una célula neuronal que controla o dirige la secreción mucosa, y puede ser llamada como una fracción objetivo ("TM"). El compuesto puede derivarse de una toxina y se prefiere que tal compuesto esté libre de la neurotoxina clostridial y libre de cualquier precursor de la neurotoxina clostridial que pueda ser convertido en una toxina. La toxina botulínica o la tetánica son fuentes adecuadas de dominios para los compuestos de la invención.

En uso, el agente de las modalidades específicas de la invención tiene una variedad de funciones discretas. Se enlaza a una estructura superficial (el Sitio de Enlazamiento {BS}) que es característica de, y tiene un grado de especificidad por, las células secretoras relevantes y/o las neuronas en las vías respiratorias responsables por la secreción mucosa y/o la regulación de dicha secreción. Entra a la célula a la cual se enlaza por medio de un proceso de endocitosis. Solamente ciertos BS de la superficie celular puede sufrir endocitosis, y preferiblemente, el BS al cual se enlaza el agente es uno de éstos. El agente entra al citosol y modifica a los componentes de la maquinaria exocitótica presente en la célula secretora relevante y/o en las neuronas en las vías respiratorias responsables de la secreción de moco y/o la regulación de dicha secreción.

Sorprendentemente, pueden producirse los agentes de la presente invención por medio de la modificación de una neurotoxina clostridial o de un fragmento de la misma. Las neurotoxinas clostridiales comparten una arquitectura común de un disulfuro catalítico de cadena L (LC, aproximadamente de 50 kDa) enlazada a un receptor de enlazamiento y transposición de cadena H (HC, aproximadamente 100 kDa). El polipéptido de HC se considera que contiene el todo o parte de dos dominios funcionales distintos. El terminal carboxílico que es la mitad de la HC (aproximadamente 50 kDa), llamado el dominio H_{c}, está involucrado en el enlazamiento neuroespecífico de alta afinidad de la neurotoxina a los receptores de la superficie celular sobre la neurona objetivo, mientras que la mitad amino terminal, llamada el dominio H_{N} (aproximadamente 50 kDa), se considera que media la transposición de al menos alguna porción de la neurotoxina a través de las membranas celulares, de tal manera que la actividad funcional de la LC se expresa dentro de la LC se expresa dentro de la célula objetivo. El dominio H_{N} que tiene también la propiedad, bajo condiciones de pH bajo, de formar canales permeables de iones en membranas lipídicas, puede relacionarse de alguna manera con su función de transposición.

Para la neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A), se considera que estos dominios residen dentro de los residuos aminoácidos 872-1296 para el H_{c}, dentro de los residuos aminoácidos 449-871 para el H_{N} y dentro de los residuos 1-448 para la LC. La digestión con tripsina degrada efectivamente al dominio H_{c} de la BoNT/A para generar un fragmento no tóxico designado como LH_{N}, que ya no es capaz de enlazarse a, y de entrar a las neuronas. El fragmento LH_{N} producido así, también tiene la propiedad de mejorar la solubilidad en comparación tanto con la holotoxina original como con la LC aislada.

Por lo tanto, es posible proveer definiciones funcionales de los dominios dentro de la molécula de la neurotoxina, como sigue:

(A): cadena liviana de la neurotoxina clostridial:

: Una metaloproteasa que exhibe alta especificidad del sustrato por la vesícula y/o la membrana plasmática asociada a las proteína involucradas en el proceso exocitotóxico.

: En particular, descompone a uno o más entre SNAP-25, VAMP (sinaptobrevina/celubrevina) y sintaxina.

(B): dominio H_{N} de la cadena pesada de la neurotoxina clostridial:

: Una porción de la cadena pesada que permite la transposición de esa porción de la molécula de la neurotoxina de tal manera que ocurre una expresión funcional de la actividad de la cadena liviana dentro de una célula objetivo.

: El dominio responsable por la transposición de la actividad de la endopeptidasa, seguido del enlazamiento de la neurotoxina a su receptor específico de la superficie celular a través del dominio de enlazamiento, dentro de la célula objetivo.

: El dominio responsable por la formación de poros permeables a los iones en las membranas lipídicas bajo condiciones de bajo pH.

: El dominio responsable por el incremento de la solubilidad del polipéptido completo comparado con la solubilidad de la cadena liviana sola.

(C): dominio H_{c} de la cadena pesada de la neurotoxina clostridial:

: Una porción de la cadena pesada que es responsable por el enlazamiento de la holotoxina nativa al(los) receptor(es) de la superficie de la célula, involucrados en la acción intoxicante de la toxina clostridial antes de la internalización de la toxina dentro de la célula.

La identidad de los marcadores de reconocimiento celular para estas toxinas no es bien entendida en la actualidad y no se han identificado aún especies receptoras específicas, aunque Kozaki y colaboradores han reportado que la sinaptotagmina puede ser el receptor para la neurotoxina botulínica tipo B. Es probable que cada una de las neurotoxinas tenga un receptor diferente.

Por medio del enlazamiento covalente de una neurotoxina clostridial, o de un híbrido de dos neurotoxinas clostridiales, en los cuales la región H_{C} de la cadena H ha sido removida o modificada, a una nueva molécula o fracción, la Fracción Objetivo (TM), que se une a una BS sobre la superficie de las células secretoras relevantes y/o las neuronas en las vías respiratorias responsables por la secreción de moco y/o la regulación de dicha secreción, se produce un agente nuevo capaz de inhibir la secreción mucosa. Un aspecto adicional sorprendente de la presente invención es que si la cadena L de una neurotoxina clostridial, o un fragmento de la cadena L que contiene actividad de la endopeptidasa, se enlaza en forma covalente a la TM que puede también llevar a cabo la internalización de la cadena L, o un fragmento de la cadena L que contiene la actividad de la endopeptidasa, dentro del citoplasma de las células secretoras relevantes y/o las neuronas en las vías respiratorias responsables por la secreción de moco y/o la regulación de dicha secreción, esto produce también un nuevo agente capaz de inhibir la secreción mucosa.

Por lo tanto, la invención puede proveer así un compuesto que contiene un primer dominio equivalente a una cadena liviana de una toxina clostridial, y un segundo dominio provee los aspectos funcionales del H_{N} de la cadena pesada de una toxina clostridial, mientras que carece de los aspectos funcionales de un dominio H_{C} de la toxina clostridial, y un tercer dominio que se une a la célula que controla la secreción mucosa o a la secreción mucosa objetivo.

Para los propósitos de la invención, la propiedad o propiedades funcionales del H_{N} de una cadena pesada de una toxina clostridial que son exhibidas por el segundo dominio del polipéptido de la invención son la transposición del primer dominio dentro de una célula objetivo una vez que el compuesto está próximo a la célula objetivo. Las referencias que se hacen más adelante a un dominio H_{N} o a las funciones de un dominio H_{N}, son referencias a esta propiedad o propiedades. No se requiere del segundo dominio para exhibir otras propiedades del dominio H_{N} de una cadena pesada de una toxina clostridial. Un segundo dominio de la invención puede ser por lo tanto relativamente insoluble, pero retener la función de transposición de una toxina nativa - se usa éste si la solubilidad no es esencial para su administración o si se imparte la necesaria solubilidad a una composición preparada con ese dominio y uno o más de los otros componentes por medio de uno o más de dichos otros componentes.

El polipéptido de la invención puede obtenerse por medio de la expresión de un ácido nucleico recombinante, preferiblemente un ADN, y es un polipéptido único, es decir, no escindido en dominios separados de cadena pesada y cadena liviana. El polipéptido está por lo tanto disponible en cantidades grandes y convenientes a través del uso de técnicas recombinantes.

El primer dominio comprende opcionalmente un fragmento o una variante de una cadena liviana de toxina clostridial. El fragmento es opcionalmente un N-terminal, o un fragmento C-terminal de la cadena liviana, o es un fragmento interno, mientras que retiene sustancialmente la habilidad para escindir a la vesícula o a la proteína asociada a la membrana plasmática, esencial para la exocitosis. Los dominios necesarios para la actividad de la cadena liviana de las toxinas clostridiales, son descritos en J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 21, julio 1992, páginas 14721-14729. La variante tiene una secuencia de péptidos diferente de la de la cadena liviana o del fragmento, aunque es muy capaz de escindir la vesícula o la proteína asociada a la membrana plasmática. Se la obtiene convenientemente por medio de inserción, supresión y/o sustitución de una cadena liviana o fragmento de la misma. En las modalidades de la invención que se describen más abajo, una variante de secuencia comprende (i) una extensión N-terminal de una cadena liviana de toxina clostridial o fragmento, (ii) una cadena liviana de toxina clostridial o fragmento modificado por medio de la alteración de al menos un aminoácido, (iii) una extensión C-terminal de una cadena liviana de toxina clostridial o fragmento, o (iv) combinaciones de 2 o más de (i)-(iii).

En una modalidad de la invención descrita en un ejemplo más abajo, la cadena liviana de la toxina y la porción de la cadena pesada de la toxina son de toxina botulínica tipo A. En una modalidad adicional de la invención que se describe en un ejemplo más adelante, la cadena liviana de la toxina y la porción de la cadena pesada de la toxina son de la toxina botulínica tipo B. El polipéptido comprende opcionalmente una cadena liviana o fragmento o variante de un tipo de toxina y una cadena pesada o fragmento o variante de otro tipo de toxina.

En un polipéptido de acuerdo con la invención, dicho segundo dominio preferiblemente comprende una porción H_{N} de cadena pesada de toxina clostridial, o un fragmento variante de una porción H_{N} de cadena pesada de toxina clostridial. El fragmento es opcionalmente un N-terminal o un C-terminal o un fragmento interno, mientras que retiene la función del dominio H_{N}. Las enseñanzas de las regiones dentro del H_{N} responsable por su función, son proveídas por ejemplo en la Biochemestry 1995, 34, páginas 15175-15181 y Eur. J. Biochem, 1989, 185, páginas 197-203. La variante tiene una secuencia diferente del dominio H_{N} o fragmento, aunque también retiene la función del dominio H_{N}. Se la obtiene convenientemente por medio de inserción, supresión y/o sustitución de un dominio H_{N} o fragmento del mismo. En las modalidades de la invención, descritas más abajo, ella comprende (i) una extensión N-terminal a un dominio H_{N} o fragmento, (ii) una extensión C-terminal a un dominio H_{N} o fragmento, (iii) una modificación a un dominio H_{N} o fragmento, por alteración de al menos un aminoácido, o (iv) combinaciones de 2 o más de (i)-(iii). La toxina clostridial es preferiblemente toxina botulínica o toxina tetánica.

Estos polipéptidos de la invención contienen típicamente por lo tanto dos o más primero y segundo dominios del polipéptido, enlazados por medio de puentes de disulfuro dentro de moléculas compuestas, y enlazados además a un tercer dominio.

La TM provee especificidad por el BS sobre las células secretoras y/o neuronales relevantes, responsables por la secreción de moco en las vías respiratorias. El componente de la TM del agente puede contener una de muchas moléculas para enlazamiento a las células, incluyendo, pero limitándose a, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo (Fab, F(ab)'_{2}, F_{v}, ScFv, etc.), lecitinas, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento o péptidos.

Se conoce en el estado del arte que la porción del H_{C} de la molécula de neurotoxina, puede ser removida de las otras porciones de la cadena H, conocida como H_{N}, de tal manera que el fragmento H_{N} permanece enlazado por medio de puente disulfuro a la cadena L de la neurotoxina, proveyendo un fragmento conocido como LH_{N}. Por lo tanto, en una modalidad de la presente invención, el fragmento LH_{N} de una neurotoxina clostridial se enlaza covalentemente, utilizando uniones que puedan incluir una o más regiones espaciadoras, a una TM.

El dominio H_{C} de una neurotoxina clostridial puede ser mutado o modificado, por ejemplo, por medio de modificaciones químicas, para reducir o preferiblemente para incapacitar su habilidad para enlazar la neurotoxina a los receptores en la conexión neuromuscular. Esta neurotoxina clostridial se enlaza entonces covalentemente, utilizando uniones que pueden incluir a una o más regiones espaciadoras, a una TM.

La cadena pesada de una neurotoxina clostridial, en la cual el dominio H_{C} se muta o se modifica, por ejemplo, por medio de modificaciones químicas para reducir o preferiblemente para incapacitar su habilidad para unir la neurotoxina a los receptores en la conexión neuromuscular, se puede combinar con la cadena L de una neurotoxina clostridial diferente. Este híbrido, la neurotoxina clostridial modificada se enlaza entonces covalentemente, utilizando uniones que pueden incluir a una o más regiones espaciadoras, a una TM.

En otra modalidad de la invención, el dominio H_{N} de una neurotoxina clostridial se combina con la cadena L de una neurotoxina clostridial diferente. Este híbrido LH_{N} se enlaza entonces covalentemente, utilizando uniones que pueden incluir a una o más regiones espaciadoras, a una TM. En una modalidad adicional de la invención, la cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento de la cadena liviana que contiene la actividad de la endopeptidasa, se enlaza covalentemente, utilizando uniones que pueden incluir a una o más regiones espaciadoras, a una TM que puede también efectuar la internalización de la cadena L, o a un fragmento de la cadena L que contiene la actividad de la endopeptidasa, dentro del citoplasma de las células secretoras y/o neuronales en las vías respiratorias responsables por la secreción de moco y/o la regulación de dicha secreción.

El agente se expresa opcionalmente en forma recombinante como una proteína de fusión que incluye una TM apropiada además de a cualquiera de las regiones espaciadoras deseadas. El agente expresado en forma recombinante se puede derivar por completo del gen que codifica a un serotipo de neurotoxina, o puede ser una quimera derivada de los genes que codifican a uno o más de los serotipos. En otra modalidad de la invención, el fragmento LH_{N} requerido, que puede ser un híbrido de L y de H_{N} de diferentes tipos clostridiales, se expresa en forma recombinante como una proteína de fusión con la TM, y puede incluir una o más regiones espaciadoras.

La cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento de la cadena liviana que contiene la actividad de la endopeptidasa, se puede expresar en forma recombinante como una proteína de fusión con una TM que también puede efectuar la internalización de la cadena L, o un fragmento de la cadena L que contiene la actividad de la endopeptidasa, dentro del citoplasma de las células secretoras y/o neuronales relevantes en las vías respiratorias responsables por la secreción de moco y/o de la regulación de dicha secreción. La proteína de fusión expresada puede incluir también a una o más regiones espaciadoras.

Un fragmento de neurotoxina como el descrito en la presente invención puede ser preparado a través de métodos bien conocidos en el estado del arte de las proteínas, incluyendo, pero no limitándose a, escisión proteolítica o por medio de estrategias de ingeniería genética. Dicho fragmento es preferiblemente un fragmento no tóxico. La conjugación puede ser de naturaleza química, utilizando enlazadores químicos o covalentes. Los conjugados de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar por medio de métodos convencionales conocidos en el estado del arte.

En un tercer aspecto, la invención provee una composición para ser usada en el tratamiento de la hipersecreción mucosa, la cual comprende

un compuesto de acuerdo a cualquiera del segundo aspecto de la invención; y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, adyuvante y/o propelente,

en donde la composición es para su administración a las vías aéreas de un paciente.

La administración por medio de aerosol es la ruta preferida de administración, aunque la presente invención abarca también a cualquier tipo de administración que libere al compuesto en el epitelio de las vías respiratorias. La administración nasal es opcional, aunque se prefiere bucal. El compuesto puede por lo tanto ser formulado para administración oral por medio de un aerosol o nebulizador, o como un polvo seco para inhalación, utilizando excipientes convencionales, adyuvantes y/o propelentes. La invención provee por lo tanto adicionalmente, una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En uso, el compuesto será generalmente empleado en una composición farmacéutica junto con un portador farmacéutico para humanos, un diluyente y/o excipiente, aunque la forma exacta de la composición dependerá del modo de administración. El compuesto puede, por ejemplo, ser empleado en la forma de una solución en aerosol o nebuli-
zador.

En una modalidad específica de la invención, descrita con más detalle más adelante, un polipéptido de acuerdo con la invención contiene a la Sustancia P, y a una cadena L y a una región de cadena pesada H_{N} de toxina botulínica A. En uso, éste puede ser administrado a un paciente por medio de un aerosol. Se prepara y se convierte a una solución del polipéptido en un aerosol utilizando un nebulizador para inhalación dentro de los pulmones de partículas nebulizadas con diámetro de 1-5 micrómetros.

Los rangos de dosificación para administración de los compuestos de la presente invención son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el rango de las dosis requeridas depende de la naturaleza precisa del conjugado, de la vía de administración, de la naturaleza de la formulación, de la edad del paciente, de la naturaleza, grado o severidad de la condición del paciente, de las contraindicaciones, si las hay, y del juicio del médico que atiende al paciente. Sin embargo, se pueden esperar grandes variaciones en la dosis requerida, dependiendo de la naturaleza precisa del conjugado. Las variaciones en los niveles de estas dosis se pueden ajustar utilizando rutinas estándar empíricas para optimización, como es bien conocido en el estado del arte.

Las formas fluidas de dosificación unitaria se preparan utilizando al compuesto y a un vehículo estéril libre de pirógenos. El compuesto, dependiendo del vehículo y de la concentración utilizados, pueden ser ya sea disueltos o suspendidos en el vehículo. En la preparación de las soluciones, el compuesto puede ser disuelto en el vehículo, siendo preparada la solución en forma isotónica si fuera necesario, por medio de la adición de cloruro de sodio, y luego esterilizada por medio de filtración a través de un filtro estéril utilizando técnicas asépticas antes del llenado en viales o ampolletas estériles apropiadas y selladas. Alternativamente, si la estabilidad de la solución es adecuada, la solución en los contenedores sellados puede ser esterilizada por medio de autoclavado. Pueden disolverse convenientemente en el vehículo aditivos tales como amortiguadores, solubilizantes, estabilizantes, preservativos o bactericidas, agentes de suspensión o emulsificantes y/o agentes anestésicos locales.

Los polvos secos que se disuelven o se suspenden en un vehículo adecuado antes de usarlos, se pueden preparar introduciendo el medicamento preesterilizado y otros ingredientes en un contenedor estéril utilizando técnicas asépticas en un área estéril. Alternativamente, la droga y los otros ingredientes se pueden disolver en contenedores adecuados utilizando técnicas asépticas en un área estéril. Se hace entonces criodesecación del producto y se sellan los contenedores en forma aséptica.

Las composiciones adecuadas para administración a través del tracto respiratorio incluyen aerosoles, soluciones nebulizables o polvos microfinos para insuflación. En el último caso, se prefieren los tamaños de partícula de menos de 50 micrones, especialmente menores de 10 micrones. Tales composiciones pueden ser elaboradas en una forma conveniente y empleadas junto con dispositivos convencionales de administración.

En otros aspectos de la invención, se provee el uso de un compuesto que inhiba la exocitosis en las células de secreción mucosa o en las neuronas que controlan o dirigen la secreción mucosa por medio de la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipersecreción mucosa, asma o COPD.

La invención provee aún adicionalmente, un método para la elaboración de una composición farmacéutica, que comprende:

-: obtener una neurotoxina clostridial y modificarla para remover o inhabilitar su porción H_{c}; u

-: obtener una porción H_{c} de la neurotoxina clostridial de la cual ha sido removida o inhabilitada;

-: enlazar la toxina con una fracción objetivo que una a (i) una célula de secreción mucosa, o (ii) a una célula neuronal que controle o dirija la secreción mucosa.

La invención provee adicionalmente un método de elaboración de una composición farmacéutica que comprende la obtención de un primer componente que tiene los siguientes dominios:

-: un dominio de inhibición que inhibe la exocitosis en una célula de secreción mucosa o en una célula neuronal que controle o dirija la secreción mucosa;

-: un dominio de transposición que transpone el dominio de inhibición dentro de la célula; y

-: el enlazamiento del primer componente a un segundo componente que se une a (i) una célula de secreción mucosa, o (ii) una célula neuronal que controla o dirija la secreción mucosa.

El primero y el segundo componentes se formulan preferiblemente en una composición que puede administrase en forma oral en combinación con uno o más o con un excipiente, un adyuvante y un propelente.

Se ilustran ahora las modalidades específicas de la invención en los siguientes ejemplos con referencia a los dibujos acompañantes en los cuales:

Fig. 1 ilustra la preparación del conjugado de la sustancia P-LH_{N}/A del Ejemplo 1;

Fig. 2 muestra la detección por transferencias de Western de la sustancia conjugada P-LH_{N}/A;

Fig. 3 muestra el análisis SDS-PAGE de un esquema de purificación de WGA-LH_{N}/A;

Figs.4-6 muestran la inhibición de la liberación del neurotransmisor a partir de las células neuronales cultivadas; y

Fig. 7 muestra como WGA-LH_{N}/A inhibe la liberación de, pero no tiene especificidad para, las neuronas eDRG.

Ejemplo 1 Método para la preparación de los Conjugados de la Sustancia P-LH_{N}/A

El péptido liofilizado fue rehidratado en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% hasta una concentración final de 10 mM. Se almacenaron las alícuotas de esta solución a -20ºC hasta su uso. Se desalinizó a LH_{N}/A dentro de
PBSE (PBS que contiene EDTA 1 mM). La solución resultante (3-5 mg/ml) reaccionó con un exceso molar de tres o cuatro veces de SPDP por medio de la adición de una solución estándar 10 mM de SPDP en DMSO. Después de 3 horas a temperatura ambiente, se terminó la reacción por desalinización sobre una columna PD-10 dentro de
PBSE.

Una porción de LH_{N}/A derivatizada fue removida de la solución y reducida con DTT (5 mM, 30 min). Se analizó esta muestra espectrofotométricamente a 280 nm y a 343 nm para determinar el grado de derivatización. El grado de derivatización logrado fue típicamente de 2 mol/mol.

La mayor parte de LH_{N}/A derivatizada y del péptido de la sustancia P se mezclaron en proporciones tales que el péptido estaba en un exceso molar de cuatro veces. A la reacción de conjugación se le permitió proceder durante más de 16 horas a 4ºC.

La mezcla del producto se centrifugó para eliminar cualquier precipitado que se hubiera desarrollado. El sobrenadante fue aplicado a una columna PD-10 equilibrada en PBS y las fracciones de proteína fueron eluidas por medio de la adición de PBS. El péptido y los subproductos de la reacción eluyeron después del pico principal de la proteína y fueron descartados.

La mezcla del conjugado se concentró por encima de 1 mg/ml por medio de centrifugación a través de concentradores (con un límite de exclusión de peso molecular de 10000). La mezcla concentrada del conjugado se analizó por medio de SDS-PAGE y de las transferencias de Western (probadas con anticuerpo de antisustancia P) para confirmar el enlazamiento del péptido de la sustancia P a LH_{N}/A.

El método descrito es para el enlazamiento en forma covalente del péptido de la sustancia P a LH_{N}/A a través de un enlazador SPDP. El residuo de sulfhidrilo se incorpora dentro del C-terminal del residuo de la sustancia P, en este caso por medio de la adición de un residuo de cisteína. Se encuentran disponibles enlazadores alternativos, incluidos los enlazadores que utilizan una química similar de derivatización pero que generan enlaces covalentes no reducibles entre las especies enlazadas.

La secuencia del péptido de la Sustancia P utilizada en este ejemplo particular es RPKPQQFFGLMC, aunque las secuencias alternativas también son adecuadas, por ejemplo CRPKPQQFFGLM, esto es la sustancia P con una Cys N-terminal.

El método descrito no hace uso de ningún sistema de marcación (por ejemplo, poli His) para purificar al conjugado a partir del LH_{N}/A. Esto ha demostrado ser un método exitoso para la preparación del péptido opioide LH_{N}/A de tal manera que la función de enlazamiento del receptor del péptido no fue comprometida. Una aplicación similar puede ser aplicada a la síntesis del subP-LH_{N}/A.

La Figura 1 ilustra la preparación del conjugado de la sustancia P con LH_{N}/A del Ejemplo 1. En los resultados mostrados en la Figura 1, se aplicaron las muestras de LH_{N}/A y de la sustancia P-LH_{N}/A en las concentraciones indicadas a nitrocelulosa y probadas con anticuerpo antisustancia P de conejo (las dos filas superiores). El surgimiento de reacciones entrecruzadas con el conjugado (segunda fila), en vez de LH_{N}/A (primera fila), es indicativo de la sustancia P conjugada a LH_{N}/A. la inferior de control ilustra la presencia de LH_{N}/A.

La Figura 2 muestra la detección por medio de las transferencias de Western del conjugado sustancia P-LH_{N}/A. Las muestras de sustancia P-LH_{N}/A (senda 3) y LH_{N}/A (senda 2) fueron sometidas a electroforesis a lo largo de los marcadores de peso molecular (senda 1). La detección de la sustancia P por medio de antisuero de antisustancia P de rata indicó una proteína con un peso molecular aproximadamente de 100 kDa en la senda del conjugado, pero no una banda así en la senda únicamente de LH_{N}/A. Por lo tanto, el conjugado de LH_{N}/A no contiene sustancia
P.

Ejemplo 2 Método para la preparación de un agente de amplia especificidad

Conjugación y purificación de WGA-LH_{N}/A. WGA (10 mg/ml en suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS)) reaccionó con una concentración igual de SPDP (10 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO)) durante una hora a temperatura ambiente. Los subproductos de la reacción fuero removidos por medio de desalinización dentro de PBS antes de la reducción del enlazador de entrecruzamiento con ditiotreitol. La tiopiridona y el DTT fueron removidos entonces por medio de desalinización dentro de PBS para dar como resultado un WGA derivatizado (dWGA) con 1 mol de -SH incorporada por mol de WGA.

LH_{N}/A a una concentración de 3-5 mg/ml en PBSE (PBS que contiene EDTA 1 mM) reaccionó con un exceso molar de tres a cuatro veces de SPDP (10 mM en DMSO). Después de 3 horas a temperatura ambiente se terminó la reacción por desalinización sobre una columna PD-10 dentro de PBSE.

El WGA derivatizado (dWGA) y LH_{N}/A derivatizado (dLH_{N}/A) fueron mezclados en una proporción molar 3:1. Después de 16 horas a 4ºC se centrifugó la mezcla para eliminar cualquier precipitado que se hubiera desarrollado. El sobrenadante fue concentrado por medio de ultrafiltración antes de la aplicación a una columna de Sefarosa^{TM} 12 sobre un sistema cromatográfico FPLC® (Pharmacia). La columna fue eluida con PBS y las fracciones que contenían material conjugado con alto peso molecular (separado del dWGA libre) fueron reunidas y aplicadas en Agarosa-N-acetilglucosamina lavada con PBS (GlcNAc-agarosa). El conjugado WGA-LH_{N}/A enlazado a GlcNAc-agarosa y fue eluido de la columna por medio de la adición de N-acetilglucosamina 0,3 M en PBS. El perfil de elución fue seguido a 280 nm y se reunieron las fracciones que contenían conjugado, se las dializó contra PBS, y se las almacenó a 4ºC hasta su uso.

La Figura 3 muestra el análisis por ASDS-PAGE del esquema de purificación de WGA-LH_{N}/A. Las fracciones de proteína fueron sometidas a SDS-PAGE sobre 4-20% de poliacrilamida antes de coloración con azul de Coomassie. Las sendas 6-8 fueron corridas en presencia de DTT 0,1 M. Las sendas 1 (& 7) y 2 (& 8) representan WGA derivatizado y LH_{N}/A derivatizado, respectivamente. Las sendas 3-5 representan una mezcla de conjugación, posterior a la cromatografía sobre Sefarosa 12 y posterior a la cromatografía de afinidad sobre GlcNAc, respectivamente. La senda 6 representa una muestra de material final reducido. Las masas moleculares aproximadas (kDa) se indican sobre la Figura.

Ejemplo 3 Preparación y mantenimiento de los cultivos neuronales y la inhibición de la liberación del neurotransmisor

Las células PC-12 fueron sembradas con una densidad de 4 x 10^{5} células/pozo sobre placas de 24 pozos (matrigel recubierto) (NUNC^{TM}) a partir de las reservas cultivadas en suspensión. Las células fueron cultivadas durante 1 semana antes de uso en RPMI, suero de caballo al 10%, suero fetal bovino al 5%, L-glutamina al 1%. Las células SH-SY5Y fueron sembradas con una densidad de 5 x 10^{5} células/pozo sobre placas de 24 pozos (FALCON^{TM}). Las células fueron cultivadas en HAM-F 12: MEM (1:1 v/v), suero fetal bovino al 15%, aminoácidos no esenciales MEM al 1%, L-glutamina 2 mM durante 1 semana antes de usarlas. Las neuronas de la médula espinal embriónica (eSC) fueron preparadas a partir de médulas espinales disecadas a partir de fetos de ratas Sprague Dawley de 14-15 días de edad, y fueron utilizadas después de 21 días en cultivo utilizando una modificación del método previamente descrito.

Inhibición de la liberación de transmisores. Las células PC-12 o SH-SY5Y fueron lavadas con una solución salina balanceada (BSS: NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 4,2 mM, MgCl_{2} 1,2 mM, KH_{2}PO_{4} 0,44 mM, glucosa 5 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4) y cargadas durante 1 hora con noradrenalina [^{3}H] (2 \muCi/ml, 0,5ml/pozo) en BSS que contiene ácido ascórbico 0,2 mM y pargylina 0,2 mM. Las células fueron lavadas 4 veces (a intervalos de 15 minutos durante 1 hora), luego se determinó la liberación basal por medio de una incubación de 5 minutos con BSS (K^{+} 5 mM). Las células fueron despolarizadas entonces con K^{+} 100 mM (BSS con Na^{+} reducida de conformidad) durante 5 minutos para determinar la liberación estimulada. Se removió el superfusato (0,5 ml) a tubo sobre hielo y breve centrifugación para precipitar cualquier célula separada. Las células adherentes se solubilizaron en ácido acético 2 M/ácido trifluoroacético al 0,1% (250 \mul/pozo). La cantidad de radiomarcador liberado y no liberado fue determinada por medio de recuento por centelleo líquido de los superfusatos aclarados y los lisados celulares, respectivamente. Se calculó la incorporación total por medio de la adición de la radio actividad liberada y la retenida, y se calculó el porcentaje de liberación ((recuentos liberados/recuentos totales incorporados) x 100). Las neuronas eSC fueron cargadas con [^{3}H]-glicina durante 30 minutos antes de la determinación de la liberación basal del transmisor y estimulada por potasio. Se utilizó una muestra de células lisadas con NaOH 0,2 M para determinar los recuentos totales, a partir de los cuales se podría calcular el porcentaje de liberación.

Las Figuras 4-6 muestran la inhibición de la liberación del neurotransmisor a partir de las células neuronales cultivadas. Las células PC12 (Figura 4), y SH-SY5Y (Figura 5) y las neuronas eSC (Figura 6) expuestas durante tres días a un rango de concentraciones de WGA-LH_{N}/A (símbolos rellenos) y LH_{N}/A (símbolos sin relleno) fueron evaluadas por la liberación estimulada de [^{3}H]-noradrenalina (células SH-SY5Y y PC12) o la capacidad de liberación de [^{3}H]-glicina (eSC). Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición comparado con los controles no tratados. Cada concentración fue evaluada por triplicado. Para cada tipo de célula, la curva de respuesta a la dosis es representativa de al menos tres experimentos. Cada punto mostrado es la media de al menos tres determinaciones \pm SE de la media. La Figura 7 muestra las curvas de respuesta a la dosis de la inhibición de WGA-LH_{N}/A de la liberación de la sustancia P eDRG y eSC[^{3}H]-glicina. Las células fueron expuestas a los conjugados durante tres días. Se muestran las curvas representativas. Media de IC_{50} eDRG: 0,32 \pm 0,05 \mug/ml (n = 4), eSC: 0,06 \pm 0,01\mug/ml (n = 3). El agente descrito en esta invención puede ser utilizado in vivo, ya sea directamente o como una sal farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de las condiciones que involucran hipersecreción mucosa, incluidos COPD y asma.

Claims

1. Un compuesto para el tratamiento de la hipersecreción de moco a partir de una célula de secreción mucosa, comprendiendo dicho compuesto:

(i): un dominio de inhibición que consiste de o que comprende una cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento o una variante de la misma que inhibe la exocitosis;

(ii): un dominio de transposición que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula; y

(iii): un dominio objetivo, en donde el dominio objetivo se enlaza a una célula de secreción mucosa;

en donde dicho compuesto no es una neurotoxina clostridial.

2. Un compuesto de acuerdo a la Reivindicación 1, que inhibe la exocitosis en la célula de secreción mucosa, inhibiendo por lo tanto la exocitosis de moco o a uno o más de los componentes mucosos o la inhibición de exocitosis del neurotransmisor.

3. Un compuesto de acuerdo a la Reivindicación 1, en donde el dominio objetivo comprende a un dominio seleccionado entre la Sustancia P, VIP, agonistas adrenoreceptores beta_{2}, el péptido de liberación de gastrina, y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina.

4. Un compuesto de acuerdo a la Reivindicación1, en donde el dominio de transposición comprende una región H_{N} de un polipéptido botulínico, o un fragmento o una variante de la misma que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula.

5. Una composición para tratar la hipersecreción mucosa, que comprende:

: un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4; y

: al menos uno entre un excipiente, un adyuvante y un propelente, en donde la composición es para administración oral o nasal del compuesto a un paciente, preferiblemente por medio de la administración del compuesto a las vías respiratorias de un paciente.

6. Una composición de acuerdo a la Reivindicación 5, en una formulación para administración por medio de aerosol.

7. El uso de un compuesto para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipersecreción mucosa, en donde dicho compuesto comprende:

(i): un dominio de inhibición que consiste de o que comprende una cadena liviana de una neurotoxina clostridial, o un fragmento o una variante del mismo que inhibe la exocitosis;

(ii): un dominio objetivo, en donde el dominio objetivo se enlaza a una célula de secreción mucosa y/o a una célula neuronal que controla o dirige la secreción mucosa; y

(iii): un dominio de transposición que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula, en donde dicho compuesto no es una neurotoxina clostridial.

8. El uso de un compuesto para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del asma, en donde dicho compuesto comprende:

9. El uso de un compuesto para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en donde dicho compuesto comprende:

10. Un método para la elaboración de un compuesto de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, que comprende:

\sqbullet: obtener una neurotoxina clostridial y modificarla para remover o inhabilitar su porción H_{c}, proveyendo por lo tanto un primer componente; o

\sqbullet: obtener una neurotoxina clostridial cuya porción H_{c} ha sido removida o inhabilitada, proveyendo por lo tanto un primer componente;

\sqbullet: el enlazamiento del primer componente con un segundo componente que se une a una célula de secreción mucosa.

11. Un método para la elaboración de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, que comprende obtener un primer componente que tiene los dominios:

\sqbullet: un dominio de inhibición que inhibe la exocitosis en una célula de secreción mucosa;

\sqbullet: un dominio de transposición que transpone al dominio de inhibición dentro de la célula; y

\sqbullet: el enlazamiento del primer componente a un segundo componente que se une a una célula de secreción mucosa.

12. Un método de acuerdo a la Reivindicación 10 u 11, que comprende la formulación del primero y del segundo componentes en una composición que puede ser administrada en forma oral o nasal en combinación con uno o más entre un excipiente, un adyuvante y un propelente.