ES2267103T3 - Transglutaminasas microbianas, su produccion y uso. - Google Patents
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Abstract
SE PUEDEN PRODUCIR PREPARADOS DE TRANSGLUTAMINASA MEDIANTE UNA AMPLIA GAMA DE HONGOS, ESPECIALMENTE ASCOMICOTINA, BASIDIOMICOTINA Y ZIGOMICOTA, Y BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS Y GRAMPOSITIVAS, ESPECIALMENTE STREPTOMYCES LYDICUS, NRRL B-3446. TAMBIEN SE DESCRIBE UNA CONSTRUCCION DE ADN QUE CODIFICA UNA NUEVA TRANSGLUTAMINASA Y QUE COMPRENDE LA SECUENCIA DE ADN OBTENIBLE A PARTIR DEL PLASMIDO EN E. COLI, DSM 10175, JUNTO CON UN METODO DE PRODUCCION DE LAS TRANSGLUTAMINASAS, UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE LA TRANSGLUTAMINASA Y UN METODO PARA PRODUCIR UNA COMPOSICION DE GEL O DE GELACION DE PROTEINA.
Description
Transglutaminasas microbianas, su producción y
su uso.
La presente invención se refiere a las
transglutaminasas microbianas, a un constructo de ADN que codifica
una transglutaminasa, a un método para producir las
transglutaminasas, y a una composición que comprende la
transglutaminasa derivada de éstas.
Las transglutaminasas (EC 2.3.2.13) son enzimas
capaces de catalizar una reacción de transferencia de acilo en la
que un grupo \gamma-carboxi-amida
de un residuo de glutamina con enlaces peptídicos es el donante de
acilo. Los grupos amino primarios en una variedad de compuestos
pueden funcionar como aceptadores de acilo con la formación
posterior de \gamma-amidas monosustituidas de
ácido glutámico con enlaces peptídicos. Cuando el grupo
\varepsilon-amino de un residuo de lisina en una
cadena peptídica sirve como aceptador de acilo, las
transglutaminasas forman enlaces entrecruzados
\gamma-glutamio-\varepsilon-lisilo
intramoleculares o intermoleculares.
Esta actividad de entrecruzamiento peptídico ha
demostrado ser útil para una variedad de objetivos industriales,
incluyendo la gelificación de proteínas, la mejora de la calidad de
la cocción de la harina, la producción de materias alimentarias
como la pasta a partir de una proteína, grasa y agua, la
preparación de queso a partir de un concentrado de leche, la unión
de un producto a base de carne picada, la mejora del sabor y de la
textura de las proteínas alimentarias, el acabado con caseína en el
tratamiento del cuero, etc.
Un conjunto amplio de transglutaminasas ha sido
identificado y caracterizado a partir de varios animales y de
algunas especies vegetales. La transglutaminasa más usada derivada
de un animal, FXIIIa, es una enzima de multisubunidades
Ca^{2+}-dependiente que es un producto inhibido,
propiedades que suponen una desventaja para muchas aplicaciones
industriales y para la producción. Una transglutaminasa
Ca^{2+}-dependiente del molde de limo Physarum
polycephalum ha sido descrito en Klein et al.,
(1992).
Sólo algunas transglutaminasas microbianas han
sido descritas, es decir, las tranglutaminasas de las especies
Streptoverticillium mobaraense, Streptoverticillium
cinnamoneum, y Streptoverticillium griseocarneum (en US
5.156.956) y de las especies consideradas Streptomyces
lavendulae (en US 5.252.469).
US 5.156.956 expone que, después de una extensa
investigación, las transglutaminasas que incluían la criba de una
gama amplia de organismos y de más de 5000 productos aislados de
origen microbiano, se encontró que sólo las tres especies
mencionadas arriba de Streptoverticillium producían la
transglutaminasa. Los elementos de este género anterior
Streptoverticillium están ahora generalmente incluidos
dentro del género Streptomyces (Kaempfer et al.
(1991), y Ochi et al. (1994)).
US 5.252.469 expone la transglutaminasa de las
que se pensó que eran dos especies relacionadas: Streptomyces
sp., y Streptomyces lavendulae. No obstante, de los
datos descritos para la cepa S. lavendulae contemplada es
evidente para el experto en la materia que la cepa descrita no es
S. lavendulae.
Las Streptoverticillia están clasificadas
juntas en el grupo F Cluster (clusters 55 a 67) de
Streptomyces y géneros relacionados (Williams et al.).
En consecuencia, las transglutaminasas microbianas son todas
conocidas y originadas a partir de elementos de este grupo Cluster
tal y como se define en Williams et al. Streptomyces
lavendulae está también clasificado en el grupo F Cluster.
Todas las transglutaminasas microbianas
conocidas han sido identificadas usando un ensayo enzimático
convencional donde la hidroxilamina es convertida en ácido
hidroxámico (Folk, J. E. & Cole, P. W. (1966)).
Para las cepas del constructo que sobreproducen
diferentes enzimas, se usan mucho las técnicas de ADN
recombinantes. Para el mismo objetivo, el gen de transglutaminasa
de Streptoverticillium mobaraense ha sido clonado para la
expresión en Escherichia coli, Streptomyces lividans, y
Saccharomyces cerevisiae (Washizu et al., Tahekana
et al., y EP-A-0 481 504).
Incluso el más exitoso de estos enfoques (Washizu et al.)
resultó en un rendimiento de producción muy inferior al rendimiento
en la cepa de tipo salvaje de S. mobaraense, a pesar de una
extensa experimentación y optimización. Así, no ha tenido éxito
ninguno de los esfuerzos para sobreproducir la enzima de S.
mobaraense, aunque incluían varios enfoques diferentes tales
como la síntesis química de un gen optimizado por codones y su
expresión posterior (como una fusión del péptido señal heterólogo
divisible a la transglutaminasa madura) para el periplasma de E.
coli; o la expresión como una fusión similar a la
transglutaminasa madura en S. cerevisiae; o expresión como
una fusión similar a la protransglutaminasa en S.
cerevisiae; o aislamiento tradicional y expresión de la
secuencia de ADN natural que codifica la preproenzima en S.
lividans.
US 5.252.469 expone cepas muy relacionadas con
S. mobaraense que producen cantidades más altas de
transglutaminasa por técnicas convencionales.
El objetivo de la invención es el de
proporcionar nuevas transglutaminasas derivadas de manera
microbiana, preferiblemente en forma de un solo componente o
monocomponente, un gen nuevo que codifica una transglutaminasa, y
un método para producir la transglutaminasa con un mejor
rendimiento y una pureza más alta que los hasta ahora posibles por
la tecnología del ADN recombinante, al igual que el uso de la
transglutaminasa bien sola o en combinación con otras enzimas para
el uso en una variedad de fines industriales, incluyendo la
gelificación de proteínas; la mejora de la calidad de la cocción de
la harina; la producción de alimentos como la pasta o ingredientes
alimentarios a partir de una proteína, grasa y agua; la preparación
de queso a partir de un concentrado de leche; la unión de la carne
picada o productos a base de pescado; la mejora del sabor y de la
textura de proteínas alimentarias; el acabado con caseína en el
tratamiento del cuero; el abrillantado del calzado, etc.
Los inventores tuvieron éxito en aislar y
caracterizar una secuencia de ADN de una cepa de Streptomyces
lidicus, que mostraba actividad transglutaminasa, de ese modo
permitiendo preparar una transglutaminasa monocomponente.
En consecuencia, la invención se refiere a una
transglutaminasa con la secuencia de aminoácidos dada en la SEC ID
Nº. 2, o un análogo de dicha transglutaminasa que comprende una
secuencia de aminoácidos con al menos el 80% identidad con la
secuencia de aminoácidos dada en la SEC ID Nº. 2, y que muestra
actividad relativa óptima a un pH de al menos 8.5.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la producción de la transglutaminasa que comprende el
cultivo en un medio nutritivo adecuado de Streptomyces
lidicus, NRRL B-3446.
La invención se refiere también a una
composición de transglutaminasa que comprende la preparación de la
transglutaminasa de la presente invención y de un
estabilizador.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método de proteínas de entrecruzamiento en el que se pone en
contacto una composición de transglutaminasa que comprende la
preparación de la transglutaminasa según la presente invención con
un sustrato proteínico.
Además, la presente invención se refiere al uso
de la preparación de la transglutaminasa de la presente invención
en la harina, productos a base de carne, productos a base de
pescado, cosméticos, queso, productos lácteos, productos
alimentarios gelificados y brillo para el calzado.
Se cree que la secuencia de ADN mostrada en la
SEC ID Nº. 1 es idéntica a la secuencia de ADN que se puede obtener
a partir del plásmido en E. coli, DSM 10175.
La cepa de E. coli fue depositada bajo el
número de deposición DSM 10175 el 23 Agosto 1995 en el DSM -
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Maascheroder Weg 1b, D-38125 Braunschweig,
Alemania, según el tratado de Budapest.
En la presente descripción y reivindicaciones,
el término "transglutaminasa" está destinado a ser entendido
como una enzima capaz de catalizar una reacción de transferencia de
acilo donde un grupo gamma-carboxiamida de un
residuo de glutamina con enlaces peptídicos es el donante de acilo.
El término "transglutaminasa
Ca^{2+}-independiente" se destina a ser
entendido como una transglutaminasa activa en la ausencia de iones
Ca^{2+}, es decir en presencia de EDTA en exceso.
La transglutaminasa puede ser un componente
originado en un sistema enzimático producido por un microorganismo
dado, tal sistema enzimático principalmente comprendiendo
diferentes componentes enzimáticos. De forma alternativa, la
transglutaminasa puede ser un único componente, es decir un
componente esencialmente libre de otros componentes enzimáticos que
se originan normalmente en un sistema enzimático producido por un
microorganismo dado, el único componente siendo un componente
recombinante, es decir producido por donación de una secuencia de
ADN que codifica el único componente y la posterior célula
transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped. El
huésped es preferiblemente un huésped heterólogo, pero el huésped
puede también ser el huésped homólogo bajo ciertas condiciones.
La transglutaminasa nativa o no modificada puede
ser de origen microbiano.
Está contemplado que las transglutaminasas
pueden ser obtenidas por o derivadas de un hongo, una bacteria o
una levadura. El componente enzimático derivado puede ser un
componente homólogo o heterólogo. Preferiblemente, el componente es
homólogo. No obstante, un componente heterólogo que es reactivo
inmunológicamente con un anticuerpo dirigido contra una
transglutaminasa altamente purificada y el cual está derivado de un
microorganismo específico es también preferido.
En este contexto el término "derivable" o
"derivado de" no sólo está destinado a indicar una
transglutaminasa producida por una cepa del organismo en cuestión,
sino también una transglutaminasa codificada por una secuencia de
ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo huésped
transformado con dicha secuencia de ADN. Además, el término se
destina a indicar una transglutaminasa que está codificada por una
secuencia de ADN de origen sintético y/o ADNc y que tiene las
características de identificación de la transglutaminasa en
cuestión.
En general, se piensa que las transglutaminasas
contienen un residuo de cisteína en el centro activo que es
esencial para la catálisis. Esto está basado en la observación de
que los compuestos que reaccionan con grupos tiol libres inhiben
las transglutaminasas. Estos compuestos son p. ej. el ácido
monoyodoacético o las sales de mercurio.
Las transglutaminasas inhibidas por otros tipos
de compuestos podrían tener mecanismos catalíticos diferentes y así
diferenciar las transglutaminasas en grupos análogos a la
clasificación de las proteasas. Las cuatro clases de proteasas son
distinguidas según su inhibición por diferentes compuestos. Por
ejemplo las serina proteasas son normalmente inhibidas por
fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) mientras que las cisteína
proteasas son inhibidas por los mismos compuestos que inhiben las
transglutaminasas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
preparación de la transglutaminasa nueva que es producible mediante
el cultivo de una bacteria que, a diferencia de las
transglutaminasas microbianas conocidas, no pertenece al Cluster F
de Streptomyces y de géneros relacionados.
Las bacterias preferidas son
gram-negativas o gram-positivas.
Ejemplos de bacterias
gram-negativas productoras de transglutaminasa son
cepas de los géneros Pseudomonas, Hafnia, Hydrogenophaga, y
Zymomonas.
Ejemplos preferidos de Bacterias
gram-negativas productoras de TGasa son cepas de
las especies Pseudomonas putida, Pseudomonas putida, Pseudomonas
amyloderamosa, Hafnia alvei, Hydrogenophaga palleroni
(Basónimo: Pseudomonas palleroni), Moo5A10 y
Zymomonas mobilis; especialmente Pseudomonas putida,
DSM 1693; Pseudomonas putida, NCIMB 9869; Pseudomonas
amyloderamosa, ATCC 21262; Hafnia alvei, DSM
30163; Hydrogenophaga palleroni, DSM 63;
Moo-5A10, DSM 10094, y Zymomonas
mobilis, DSM 424.
Ejemplos de Bacterias
gram-positivas productoras de TG-asa
son cepas de los géneros Streptomyces, Rothia, Bacillus,
Kitasatoa y Bacteridium.
Ejemplos preferidos de bacterias
gram-positivas productoras de TGasa son cepas de
las especies Streptomyces lydicus, Streptomyces nigrescens,
Streptomyces sioyaensis, Streptomyces platensis, Rothia
dentocariosa, Bacillus badius, Bacillus mycoides, Bacillus firmus,
Bacillus aneurinolyticus, Bacillus megaterium, Bacillus sp., B.
amyloliquefaciens, Kitasatao purpurea, Bacteridium sp. y
Bacillus megaterium.
Las más preferidas son las cepas Streptomyces
lydicus, DSM 40555 y NRRL B-3446;
Streptomyces nigrescens, ATCC 23941; Streptomyces
sioyaensis, ATCC 13989; Streptomyces platensis, DSM
40041; Bacillus badius, DSM 23; Bacillus mycoides, GJB
371; Bacillus firmus, ATCC 17060; Bacillus firmus,
DSM 12; Bacillus aneurinolyticus, ATCC 12856; Bacillus
megaterium, ATCC 13632; Bacillus megaterium, ATCC 15450;
Bacillus megaterium, AJ 3355 y Ferm-P 1201;
Bacillus sp., ATCC 21537; B. amyloliquefaciens, ATCC
23843; Kitasatao purpurea, DSM 43362; Bacteridium sp.
DSM 10093, Bacteridium sp., CBS 495.74.
Las preparaciones de transglutaminasa bacteriana
preferidas de la invención muestran actividad óptima a un pH de al
menos 8.5, más preferiblemente de al menos 9.0.
Además, la actividad transglutaminasa de
preparaciones de transglutaminasa bacteriana preferidas de la
invención es inhibida por fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), ver
ejemplo 16.
Preferiblemente, la transglutaminasa es una
transglutaminasa recombinante, es decir una transglutaminasa libre
esencialmente de otras proteínas o proteínas enzimáticas del
microorganismo padre. Una transglutaminasa recombinante puede ser
clonada y expresada según técnicas estándar convencionales para el
experto en la materia.
De manera ventajosa, se puede usar una
transglutaminasa madre de origen bacteriano, p. ej. una
transglutaminasa derivable de una cepa del género Streptomyces,
Actinoplanes, Amorphosporangium, Amycolata, Dactolosporangium,
Bacteridium, Kitasatoa, Micronospora, o Bacillus. Por
ejemplo, la transglutaminasa madre puede ser derivable de una cepa
de las especies Streptomyces lidicus (depositadas en ARS
Patent Culture Collection North Central Region, 1815 North
University Street, Peonia, Illinois 61604, U.S.A., NRLL
B-3446 (anterior Streptomyces
libani).
En una forma de realización preferida, la
transglutaminasa madre es una transglutaminasa de Streptomyces
lidicus, NRRL B-3446, o es un análogo funcional
de dicha transglutaminasas madre que comprende una secuencia de
aminoácidos que es homóloga al menos al 80% a la secuencia de
aminoácidos de la transglutaminasa ma-
dre.
dre.
Esta propiedad del análogo se destina a indicar
el grado de identidad entre el análogo y la transglutaminasa madre
que indica una derivación de la primera secuencia a partir de la
segunda. En particular, un polipéptido se considera homólogo a la
transglutaminasa madre si una comparación de las secuencias de
aminoácidos respectivas revela una identidad superior al 80%, 85%,
90% o incluso al 95%. Las comparaciones de la secuencia pueden ser
realizadas por medio de algoritmos conocidos, tales como los
descritos por Lipman y Pearson (1985).
Estas transglutaminasas madres son capaces de
polimerizar \alpha-caseína y son por lo tanto
útiles para muchos fines industriales.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para producir transglutaminasa que comprende el cultivo en
un medio nutritivo adecuado de Streptomyces lidicus, NRRL
B-3446.
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición de transglutaminasa que comprende una
preparación de transglutaminasa bacteriana según el modo descrito
anteriormente y de un estabilizador.
La invención también se refiere a un método de
proteínas de entrecruzamiento en el que se pone en contacto una
composición de transglutaminasa que comprende la preparación de
transglutaminasa bacteriana según la presente invención con un
sustrato proteínico.
La preparación de transglutaminasa según la
invención es útil en harina, productos a base de carne, productos a
base de pescado, cosméticos, queso, productos lácteos, productos
alimentarios gelificados y brillo para el calza-
do.
do.
En este contexto, el "análogo" de la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº. 1 se destina a indicar
cualquier secuencia de ADN que codifica una enzima que muestra
actividad transglutaminasa, cuya secuencia de ADN
análoga
análoga
- a)
- puede ser aislada a partir de otro organismo o uno relacionado (p. ej. el mismo) que produce la enzima con actividad transglutaminasa según la secuencia de ADN mostrada en SEC ID Nº. 1, p. ej. usando los procedimientos descritos en la presente, y así, p. ej. ser alélico o una variante de la especie del ADN
- i)
- tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No. 1, o
- ii)
- codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº. 1.
- dicha secuencia comprendiendo las secuencias de ADN mostradas en la presente,
- b)
- puede ser construida en base a las secuencias de ADN mostradas en SEC ID Nº. 1, p. ej. por introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la transglutaminasa codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. No obstante, en este caso los cambios de aminoácidos son preferiblemente de naturaleza inferior, es decir, son sustituciones de aminoácidos conservadoras que no influyen significativamente en el doblamiento o en la actividad de la proteína, pequeñas eliminaciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace. Véase en general Vado et al. (1991). Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de los aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), los aminoácidos acídicos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), los aminoácidos polares (tales como cisteína, glutamina y asparraguina), los aminoácidos hidrofóbicos (tales como prolina, leucina, isoleucina, valina), los aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y los aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).
Será evidente para los expertos en la técnica
que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula y además resultan en
un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad
del polipéptido codificado por el constructo de ADN según la
invención, y en consecuencia preferiblemente no sometido a la
sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos
en la técnica, tales como mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis
de barrido de alanina (Cunningham y Wells, (1989). En esta última
técnica se introducen mutaciones en cada residuo en la molécula, y
las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su actividad
biológica (es decir transglutaminasa) para identificar residuos
aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula.
Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden
también ser determinados por análisis de la estructura cristalina
según está determinado por técnicas tales como la resonancia
magnética nuclear, la cristalografía o el marcado por fotoafinidad.
Véase, por ejemplo, de Vos et al., (1992); Smith et
al., (1992); Wlodaver et al.,
(1992).
(1992).
La homología a la que se hace referencia arriba
está determinada como el grado de identidad entre las dos
secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a
partir de la segunda. La homología puede de manera adecuada ser
determinada mediante programas informáticos conocidos en la técnica
tales como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG
(Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970)). Usando GAP p. ej. con los
ajustes siguientes para la comparación de la secuencia de ADN:
penalización de la creación de huecos de 5.0 y penalización de la
extensión de huecos de 0.3, la zona de codificación de la secuencia
de ADN puede mostrar cierto grado de identidad preferiblemente de
al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 82%, más
preferiblemente de al menos el 85%, especialmente de al menos el
90%, con la zona de codificación de la secuencia de ADN mostrada en
la SEC ID No. 1 o la secuencia de ADN obtenible a partir del
plásmido en E. coli, DSM 10175.
En otros aspectos la invención se refiere a un
vector de expresión que alberga un constructo de ADN de la
invención, una célula que comprende el constructo de ADN o vector
de expresión y un método para producir una enzima que presenta
actividad transglutaminasa, dicho método comprende el cultivo de
dicha célula bajo condiciones que permiten la producción de la
enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
En otro aspecto ulterior la invención se refiere
a una enzima que presenta actividad transglutaminasa, dicha
enzima
- a)
- es codificada por un constructo de ADN de la invención
- b)
- es producida por el método de la invención.
La secuencia de ADN de la invención que codifica
una enzima que presenta actividad transglutaminasa puede ser
aislada por un método general que implica
- -
- la clonación, en vectores adecuados, de un banco de ADN de Streptomyces lydicus,
- -
- la transformación de las bacterias adecuadas o células huéspedes de levadura con dichos vectores,
- -
- el cultivo de las células huéspedes bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificada por un clon en el banco de ADN,
- -
- la selección de clones positivos determinando cualquier actividad transglutaminasa de la enzima producida por tales clones, y
- -
- el aislamiento del ADN que codifica la enzima de tales clones.
El método general está posteriormente descrito
en WO 94/14953 cuyo contenido está incorporado en la presente por
referencia. Una descripción más detallada del método de selección
está proporcionada en el ejemplo 15 más abajo.
La secuencia de ADN del constructo de ADN de la
invención puede ser aislada mediante métodos muy conocidos. Así, la
secuencia de ADN puede, por ejemplo, ser aislada estableciendo un
banco de ADNc o genómico de un organismo que se prevé que contenga
la secuencia, y seleccionando los clones positivos por
procedimientos convencionales. Ejemplos de tales procedimientos son
la hibridación a sondas oligonucleótidas sintetizadas según la
secuencia de aminoácidos completa mostrada en la SEC ID nº. 2, o
una subsecuencia de la misma conforme a técnicas estándar (ver
Sambrook et al., 1989), y/o la selección de clones que
expresan una actividad transglutaminasa tal como se ha definido
anteriormente, y/o la selección de clones que producen una proteína
que es reactiva con un anticuerpo dirigido contra la enzima
transglutaminasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC ID nº. 2.
Un método preferido de aislamiento de un
constructo de ADN de la invención de un banco de ADNc o genómico es
el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
sondas oligonucleótidas degeneradas preparadas en base a la
secuencia de aminoácidos de la enzima transglutaminasa madre. Por
ejemplo, la PCR puede ser realizada usando las técnicas descritas
en la patente estadounidense nº. 4.683.202 o por R.K. Saiki et
al. (1988).
De forma alternativa, la secuencia de ADN del
constructo de ADN de la invención puede ser preparado
sintéticamente por métodos estándar establecidos, p. ej. el método
de la fosforamidita descrito por Beaucage y Caruthers (1981), o el
método descrito por Matthes et al. (1984). Según el método de
la fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en
un sintetizador de ADN automático, purificados, recocidos, ligados
y clonados en los vectores apropiados.
Finalmente, el constructo de ADN puede ser de
origen mixto genómico y sintético, mixto sintético y ADNc o mixto
genómico y ADNc preparado ligando los fragmentos de origen
sintético, genómico o ADNc (según sea apropiado), los fragmentos
correspondiendo a varias partes de la molécula de ADN recombinante
entera, conforme a técnicas estándar.
La secuencia de ADN que codifica para la enzima
transglutaminasa puede por ejemplo ser aislada mediante la
selección de un banco de ADN de Streptomyces lydicus, y
seleccionando los clones que expresan la actividad enzimática
apropiada (es decir la actividad transglutaminasa) o de E.
coli, DSM 10175, depositados bajo el tratado de Budapest el 23
Agosto, 1995, a DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, D-38124
Braunschweig, Alemania). La secuencia de ADN apropiada puede luego
ser aislada del clon p. ej. como se describe en el ejemplo 1.
Se espera que una secuencia de ADN que codifica
para una enzima homóloga, es decir una secuencia de ADN análoga,
sea obtenible a partir de otros microorganismos. Por ejemplo, la
secuencia de ADN puede ser derivada seleccionando de forma similar
un banco de ADN de otra bacteria, preferiblemente una bacteria
gram-positiva, más preferiblemente una cepa de una
Streptomyces sp., en particular una cepa de S.
platensis.
De forma alternativa, el ADN que codifica para
una transglutaminasa de la invención puede ser aislada
convenientemente, según unos procedimientos bien conocidos, del ADN
de una fuente adecuada, así como cualquiera de los organismos
anteriormente mencionados, usando sondas de oligonucleótidos
sintéticas preparadas en base a una secuencia de ADN descrita en la
presente. Por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos adecuada puede
ser preparada en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEC ID nº. 1 o cualquier subsecuencia adecuada de la
misma.
misma.
La secuencia de ADN puede posteriormente ser
insertada en un vector de expresión recombinante. Este puede ser
cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá a menudo de la célula huésped en la que se introduzca.
Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir
un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya
replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej.
un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al
introducirse en una célula huésped, se integra en el genoma de la
célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s)
donde se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica
la transglutaminasa debería operativamente ser conectado a un
promotor y una secuencia de terminación adecuados. El promotor
puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped que se elija y puede ser
derivado de genes que codifican proteínas homólogas o heterólogas a
la célula huésped. Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican para la transglutaminasa, el
promotor y el terminador, respectivamente, y para insertarlos en
los vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
La célula huésped que es transformada con la
secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención es
preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula
fúngica tal como una levadura o una célula fúngica filamentosa, o
una célula procariótica tal como una célula bacteriana. En
particular, la célula eucariótica puede pertenecer a una especie de
Aspergillus, Fusarium o Trichoderma, más
preferiblemente Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o
Aspergillus Niger. Las células fúngicas pueden ser
transformadas por un proceso que implica la formación del
protoplasto y la transformación de los protoplastos seguida de la
regeneración de la pared celular según el modo conocido per
se. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped
está descrito en EP 238 023 (de Novo Nordisk A1S), el contenido
siendo incorporado en la presente por referencia. La célula huésped
puede también ser una célula de levadura, p. ej. una cepa de
Saccharomyces, en particular Saccharomyces kluyveri o
Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccaromyces
sp., tal como Schizosaccharomyces pombe, una cepa de
Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp. tal como Yarrowia
lipolytica, o Kluyveromices sp. tal como
Kluyveromyces lactis. La célula huésped puede también ser una
célula bacteriana, preferiblemente una cepa de bacterias gram
positivas, más preferiblemente Bacillus o
Streptomyces, especialmente Bacillus subtilis, Bacillus
licheniforrnis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans, S. lydicus o Streptomyces
murinus; o bacterias gram negativas, preferiblemente
Escherichia, más preferiblemente E. coli. La
transformación de las bacterias puede por ejemplo ser efectuada por
la transformación del protoplasto o usando células competentes en
cierto modo conocido per se.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en los vectores
adecuados que contienen la información necesaria para la
replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (véase,
por ejemplo, Sambrook et al. (1989)).
El vector de expresión de la invención puede
también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en
eucariotas, las secuencias de la poliadenilación pueden ser
operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica el
agente redox del disulfuro de la proteína de la invención. Las
secuencias de terminación y de poliadenilación pueden de manera
adecuada derivar de las mismas fuentes que el promotor.
En otro aspecto ulterior, la presente invención
se refiere a un método para producir una enzima según la invención,
donde una célula huésped adecuada transformada con una secuencia de
ADN que codifica la enzima es cultivada bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es
recuperada del cultivo.
El medio usado para el cultivo de las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para desarrollar las células huéspedes en cuestión. La
transglutaminasa expresada puede convenientemente ser segregada en
el medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo por
procedimientos bien conocidos incluyendo la separación de las
células del medio por centrifugado o por filtración, la
precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una
sal tal como sulfato de amonio, seguida de procedimientos
cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio fónico,
la cromatografía de afinidad, o similares. La transglutaminasa
expresada puede también enlazarse a la pared celular.
Aunque la transglutaminasa útil puede ser
añadida como tal se prefiere que sea formulada en una composición
adecuada. La transglutaminasa para ser usada industrialmente puede
estar en cualquier formar adecuada para el uso en cuestión, p. ej.
en forma de un polvo seco o granulado, en particular un granulado
no pulverulento, un líquido, en particular un líquido estabilizado,
o una enzima protegida. Los granulados pueden ser producidos, p.
ej. como se describe en US 4.106.991 y US 4.661.452, y pueden
opcionalmente ser revestidos por métodos conocidos en la técnica.
Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser
estabilizadas añadiendo estabilizadores aceptables nutricionalmente
tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, ácido
láctico o otro ácido orgánico según los métodos establecidos. Las
enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito
en EP 238.216. La preparación enzimática de la invención puede
también comprender un conservante.
Normalmente, para la inclusión en harina,
productos a base de carne, queso y otros productos lácteos,
productos a base de pescado, cosméticos, varios alimentos
gelificados, puede ser ventajoso que la preparación enzimática esté
en forma de un producto seco, p. ej. un granulado no pulverulento,
mientras que para la inclusión con un líquido es ventajoso en forma
líquida.
La invención está posteriormente ilustrada en
los ejemplos no limitativos siguientes.
El límite de detección del ensayo de
incorporación de [1,4-^{14}C]putrescina
resultó ser 1/20 del límite de detección del ensayo de
hidroxamato.
El ensayo usado es una versión modificada
ligeramente del procedimiento original (Curtis, C. G. & Lorand,
L. (1976)). La actividad transglutaminasa es medida como la
incorporación de [1,4-^{14}C]putrescina en
\alpha-caseína.
Para 20 \mu\ell de muestra se añade 5
\mu\ell [1.4-^{14}C]putrescina (1.85
MBq/m en 2% etanol acuoso; actividad específica 4.22 GBq/mmol) y 20
\mu\ell de \alpha-caseína (2% en 50 mM de
Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de DTT, pH 7.5). La
incubación se desarrolla durante 2 h a la temperatura ambiente tras
lo cual 30 \mu\ell de la mezcla del ensayo es esparcida en un
filtro redondo pequeño Whatman 3MM. El filtro es inmediatamente
puesto en un cesto sumergido en 10% ácido tricloroacético frío y
lavado durante 20 min para eliminar el exceso de radioactividad.
Después de este primer lavado los filtros son lavados tres veces
con ácido tricloroacético al 5% frío, una vez con etanol
frío:acetona (50:50, v:v) y una vez con acetona fría. Cada uno de
estos lavados se desarrolla durante 5 min. en todas las fases del
lavado la cantidad de líquido del lavado debería ser al menos de 5
m\ell/filtro. Los filtros lavados son contados directamente en
viales luminiscentes.
Unidades: una actividad enzimática que incorpora
1 nmol de [1,4-^{14}C]putrescina por hora
está definida como 1 U.
Las bacterias crecidas en placas de agar
triptona-levadura fueron usadas para la inoculación
de frascos de agitación. Los frascos de agitación contenían 100 ml
de los medios catalogados más abajo. Los cultivos fueron incubados
a 30ºC durante 1-12 días mientras que se agitaba a
250 rpm. Las muestras (5 ml) fueron tomadas del caldo y analizadas
por su actividad de Tgasa sea en el caldo crudo, en el sobrenadante
libre de células (después del centrifugado durante 15 min a 2300 x
g) o en el granulado celular que fue resuspendido en una cantidad
igual de medio estéril.
La tabla siguiente muestra ejemplos de especies
bacterianas que producen Tgasa tras el cultivo en los medios
catalogados. La actividad Tgasa es dada en unidades/ml.
\newpage
Los medios usados fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
La solución del oligoelemento para el medio K
(mg/l agua Milli Q): MnCl_{2} x 4H_{2}O: 100, CoCl x 6
H_{2}O: 36.34, CuSO_{4} x 5 H_{2}O: 15.64, Na_{2}MoO_{4} x
2 H_{2}O: 10, ZnCl_{2}: 20, LiCl: 5, SnCl_{2} x 2 H_{2}O: 5,
H_{3}BO_{3}: 310, KBr: 20, KI: 20,5
Na_{2}-EDTA: 8.
Se encontró que la cantidad de actividad
transglutaminasa encontrada en los caldos de cultivo de los
microorganismos dependía de los medios de crecimiento usados para
el cultivo. Se cree que esto es válido para todos los
microorganismos, es decir hongos o bacterias.
Las cepas seleccionadas fueron desarrolladas en
los distintos medios (véase ejemplo 1 arriba) para investigar el
efecto del medio en la expresión de la actividad Tgasa. En la tabla
siguiente se da un ejemplo para Tgasa de Pseudomonas putida e
Hydrogenophaga palleroni. Las demás cepas investigadas
fueron Streptomyces lydicus, Pseudomonas putida (DSM 1693),
Rothia dentocariosa, Bacillus firmus, Bacillus badius, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus megaterium
(3 cepas, ver ejemplo 1), Bacillus mycoides, Zymomonas mobilis,
Hafnia alvei, Kitasatao purpurea, Bacteridium sp., cepa
Moo5A10.
\vskip1.000000\baselineskip
| Medio | Actividad (U/ml) | Actividad (U/ml) |
| Ps. putida (NCIMB 9869) | Hy. palleroni | |
| N | 0 | 0 |
| J | 0.08 | 0 |
| A | 1.4 | 0 |
| D | 1.4 | 0 |
| Q | 1.8 | 0.6 |
| L | 0.12 | 0.18 |
| H | 0.4 | 0 |
| P | 0.2 | 0.07 |
La dependencia de la temperatura fue investigada
usando una modificación del ensayo de putrescina descrito en el
ejemplo 1.
En este experimento las dependencias de la
temperatura de las Tgasas se examinaron en las cepas siguientes:
Pseudomonas putida (NCIMB 9869), Bacteridium sp. (DSM
10093), cepa Moo5A10, Bacillus firmus, Bacillus badius y
Rothia dentocariosa.
Las muestras conteniendo Tgasa de estas cepas
fueron evaluadas a 20, 30, 40 y 55ºC (2 h de incubación). Las
muestras fueron fluido del cultivo sin células (Pseudomonas
putida, Bacteridium sp., cepa Moo5A10), o bien células
centrifugadas resuspendidas en medio estéril (Bacillus firmus,
Bacillus badius) o caldo de cultivo crudo (Rothia
dentocariosa).
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades TGasa de las cepas seleccionadas
fueron investigadas usando un tampón
Britton-Robinson modificado ajustado a pH 6.5, 7,
7.5, 8, 8.5 y 9. Una solución de \alpha-caseína
al 4% fue hecha en 50 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, pH 7.5 y
diluido 1:1 en 200 mM de tampón Britton-Robinson
(0.1 M CH_{3}COOH, 0.2 M H_{3}BO_{3}) en los valores de pH
anteriormente mencionados.
La actividad TGasa fue medida a 20ºC en un
ensayo estándar con 2 horas de incubación y 2 mM de EDTA. Las cepas
investigadas fueron Bacteridium sp., Moo5A10, Bacillus firmus,
Bacillus mycoides, Bacillus badius, Bacillus aneurinolyticus,
Rothia dentocariosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de los iones Ca^{2+} en la actividad
TGasa fue investigada en muestras seleccionadas libres de Ca^{2+}
derivadas después del tratamiento con Centricon. Las muestras
fueron aplicadas a un concentrador Centricon de 10 kD,
centrifugadas (sin actividad en el filtrado), las enzimas en el
reintento fueron resuspendidas en una cantidad igual de
Tris-tampón libre de Ca^{2+} (0.1 M, pH 7.5) y
centrifugadas nuevamente para resolverlas del filtro. Todas las
muestras fueron concentradas y diluidas una segunda vez para
asegurar unas condiciones libres de Ca^{2+}.
Muestras del tratamiento del centricon fueron
incubadas tanto en presencia (2 mM CaCl_{2}) como en ausencia de
Ca^{2+} (5 mM EDTA) para determinar los efectos del Ca^{2+}. La
actividad TGgasa fue medida antes del tratamiento con centricon
(establecida al 100%) y después del primer y segundo tratamiento
con Centricon. Sólo unas cepas seleccionadas fueron investigadas:
Bacteridium, MooSA10, Bacillus firmus y Bacillus
badius.
\newpage
Los resultados fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, las TGasas investigadas de
Bacteridium, Moo5A10 y Bacillus firmus son
Ca^{2+}-independientes: La actividad después de
la filtración en un ensayo con EDTA fue aproximadamente tan alto
como antes del centrifugado en la muestra no tratada
(80-99%). Después del 2º centricon la actividad es
ligeramente estimulada por la adición de Ca^{2+} a Moo5A10
y Bacteridium. Para el Bacteridium además
aproximadamente el 80% y para Moo5A10 aproximadamente el 93%
de la actividad fueron medidos sin Ca^{2+}. En consecuencia estas
actividades se definen como
Ca^{2+}-independientes.
La TGasa de Bacillus badius fue
Ca^{2+}-dependiente: Después del primer centricon
no se midió ninguna actividad (5%) sin Ca^{2+} añadido. La
actividad pudo ser restaurada después de añadir 2 mM de Ca^{2+} a
aproximadamente el 50%.
Los caldos de cultivo libres de células de
varios microorganismos seleccionados productores de la
transglutaminasa fueron investigados por su capacidad para
polimerizar caseína en solución. Además, dos transglutaminasas
microbianas purificadas fueron también investigadas.
En general, 100 \mu\ell de muestra fueron
mezclados con 20 \mu\ell 0.1 M de glutatión en 0.2 M de
Tris-HCl, pH 7.9 y 100 \mu\ell de
\alpha-caseína 1.5% en 0.2 M de
Tris-HCl, pH 7.9 y se incubaron varias veces a 37ºC.
La reacción fue detenida mezclando 20 \mu\ell de mezcla de
incubación con 20 \mu\ell de tampón de la muestra para análisis
del SDS-PAGE seguido del calentamiento a 95ºC
durante 10 min. La polimerización fue visualizada por
SDS-PAGE.
Los caldos de fermentación investigados fueron
de Streptomyces lydicus, Cercospora carisis, Cladosporium
sphaeospermum y Savoryella lignicola mientras que las
muestras purificadas fueron de Streptomyces lidicus y
Streptomyces platensis.
El experimento fue también realizado con caldo
de fermentación de Lulworthia uniseptata con la única
diferencia de que la incubación se produjo a 70ºC y a 90ºC. Además,
el experimento se efectuó con caldo de fermentación de
Cladosporium sphaeospermum con incubación a 80ºC.
En cualquier caso la incubación resultó en la
formación rápida de polímeros de caseína de masa molecular altísima
concomitante formados con la reducción de monómeros de
\alpha-caseína.
Streptomyces lidicus, NRRL
B-3446 (anterior Streptomyces libani), fue
inoculado en 1 \ell de medio Zim (20 g/t de extracto de levadura,
12 g/t de glucosa, 10 g/\ell bactopeptona, 0.01% plurónico, pH
6.5) y se cultivó con agitación a 30ºC durante 24 h. La solución del
cultivo de semillas resultante fue añadida a 16 \ell de medio Zim
que fue luego cultivado con agitación a 30ºC durante 4 días. El
caldo de cultivo resultante fue filtrado para dar 11.8 \ell de
cultivo filtrado. La actividad transglutaminasa en el cultivo
filtrado fue 3 U/m\ell.
El cultivo filtrado fue concentrado seis veces
usando una membrana Filtron Minisette con 3 kDa. De una parte de
500 ml del concentrado la transglutaminasa fue precipitada
añadiendo sulfato amónico al 65% de saturación a temperatura
ambiente. El precipitado fue disuelto en 10 mM de acetato sódico pH
6.0. Después de una diálisis extensiva contra 10 mM de acetato
sódico a pH 6.0 la muestra fue pasada a través de una columna
SP-Sepharose equilibrada con 10 mM de acetato sódico
a pH 6.0. La transglutaminasa fue eluida usando un gradiente lineal
de 0 a 0.5 M de cloruro sódico. Las fracciones con alta actividad
específica fueron recogidas y la agrupación fue concentrada en una
célula Amicon equipada con una membrana Diaflo con un corte de 10
kDa. Un cambio en el tampón a 20 mM de fosfato sódico a pH 6.5 fue
hecho en la célula Amicon. Las últimas impurezas en la preparación
fueron eliminadas pasándolas a través de una columna de la
Blue-Sepharose equilibrada con 20 mM de fosfato
sódico pH 6.5. La transglutaminasa fue eluida usando un gradiente
lineal de 0 a 1.0 M de cloruro sódico. La enzima fue pura según fue
estimado por SDS-PAGE y la secuenciación
N-terminal. La actividad específica filtrada de la
transglutaminasa pura fue 90 veces la del cultivo filtrado.
La caracterización estructural de la
transglutaminasa se efectuó en una pequeña cantidad de enzima
altamente purificada (1.5 m\ell; A_{280} = 0.3). Un quinto fue
usado para dirigir la secuenciación del aminoácido
N-terminal. El material restante fue liofilizado y
redisuelto en 350 \mu\ell de cloruro de guanidinio 6 M, 0.3 M de
Tris-HCl, pH 8.3 y desnaturalizado durante toda la
noche a 37ºC. A la solución se añadió 10 \mu\ell de DTT 0.1 M y
se incubó durante 4 h a la temperatura ambiente antes de añadir 20
\mu\ell de ICH_{2}COOH recién preparado 0.5 M. La muestra
reducida y S-carboximetilada fue desalada usando una
columna NAP5 (Pharmacia) equilibrada y eluida con 20 mM de
NH_{4}HCO_{3}.
NH_{4}HCO_{3}.
Después de la concentración al vacío la
transglutaminasa S-carboximetilada fue degradada
durante 16 h a 37ºC con 10 \mug de proteasa
lisina-específica (proteasa I de Achromobacter). Los
péptidos resultantes fueron fraccionados usando HPLC de fase
inversa en una columna C18 Vydac eluida con un gradiente lineal del
80% 2-propanol en 0.1% TFA. Las fracciones del
péptido seleccionado fueron sometidas a repurificación usando un
HPLC de fase inversa en otra columna C18 Vydac eluida con
gradientes lineales de acetonitrilo al 80% en TFA al 0.1%.
La secuenciación del aminoácido
N-terminal de la transglutaminasa intacta así como
la secuenciación de los péptidos purificados fue hecha en un
secuenciador de proteínas Applied Biosysttems 473A accionado según
las instrucciones del fabricante.
Las secuencias obtenidas son las siguientes:
Secuencia N-terminal:
- Ala-Ala-Asp-Glu-Arg-Val-Thr-Pro-Pro-Ala-Glu-Pro-Leu-Asn-Arg-Met-Pro-Asp-Ala-Tyr-Arg-Ala-Tyr- Gly-Gly-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Val-Asn-Asn-Tyr-Ile-Arg-Lys-Trp-Gln-
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 1:
- Trp-Gln-Gln-Val-Tyr-Ala-His-Arg-Asp-Gly-Ile-Gln-Gln-Gln-Met-Thr-Glu-Glu-Gln-Arg-Glu-
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 2:
- Leu-Ala-Phe-Ala-Phe-Phe-Asp-Glu-Asn-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 3:
- Ser-Asp-Leu-Glu-Asn-Ser-Arg-Pro-Arg-Pro-Asn-Glu-Thr-Gln-Ala-Glu-Phe-Glu-Gly-Arg-Ile-Val-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 4:
- Gly-Phe-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 5:
- Ala-Leu-Asp-Ser-Ala-His-Asp-Glu-Gly-Thr-Tyr-Ile-Asp-Asn-Leu-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 6:
- Thr-Glu-Leu-Ala-Asn-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 7:
- Asn-Asp-Ala-Leu-Arg-Tyr-Glu-Asp-Gly-Arg-Ser-Asn-Phe-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Asn-Thr-Pro-Ser-Phe- Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 8:
- Glu-Arg-Asp-Gly-Gly-Asn-Tyr-Asp-Pro-Ser-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 9:
- Ala-Val-Val-Tyr-Ser-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 10:
- His-Phe-Trp-Ser-Gly-Gln-Asp-Gln-Arg-Gly-Ser-Ser-Asp-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 11:
- Tyr-Gly-Asp-Pro-Asp-Ala-Phe-Arg-Pro-Asp-Gln-Gly-Thr-Gly-Leu-Val-Asp-Met-Ser-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 12:
- Asp-Arg-Asn-Ile-Pro-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln-Pro-Gly-Glu-Ser-Trp-Val-Asn-Phe-Asp-Tyr-Gly-Trp-Phe- Gly-Ala-Gln-
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 13:
- Thr-Ile-Trp-Thr-His-Ala-Asn-His-Tyr-His-Ala-Pro-Asn-Gly-Gly-Leu-Gly-Pro-Met-Asn-Val-Tyr-Glu- Ser-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 14:
- Phe-Arg-Asn-Trp-Ser-Ala-Gly-Tyr-Ala-Asp-Phe-Asp-Arg-Gly-Thr-Tyr-Val-Ile-Thr-Phe-Ile-Pro-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 15:
- Ser-Trp-Asn-Thr-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
Péptido 16 (péptido
C-terminal):
- Gln-Gly-Trp-Ser
A continuación se muestran las secuencias
alineadas para la secuencia de una transglutaminasa de
Streptoverticillium (Kanaji et al., 1994; Washizu
et al., 1994; EP-A-0481
504). Aunque las dos enzimas son homólogas éstas son claramente
diferentes puesto que el 22% (62 de 279) de los residuos
secuenciados de la transglutaminasa de Streptomyces lydicus
diferían del residuo correspondiente en la transglutaminasa de
Streptoverticillium. Se debe hacer hincapié en que muchas de
las sustituciones encontradas no son conservadoras - p. ej.
Asp1Ala, Pro19Ala, Pro22Ala, Ser23Tyr, Tyr24Gly, Glu28Thr,
Thr29Val, Arg48Ile, Lys49Gln, Ser84Phe, Lys95Glu,
Ser101-Pro, Gly102Asn, Arg105Gln, Gln124Lys,
Lys152Thr, Gly157-Lys, Asn163Tyr, Pro169Asn,
His188Tyr, Arg208Gln, Ser20-9Arg, Ala226Asp,
Pro227Gln, Ala287Pro, His289Asn, Glu30-OAla, Asp324Ala, Lys325Glu y Pro331Ser. El primer residuo mencionado es aquél encontrado en la transglutaminasa de Streptoverticillium y el segundo residuo es aquél encontrado en la transglutaminasa de Streptomyces lydicus:
Pro227Gln, Ala287Pro, His289Asn, Glu30-OAla, Asp324Ala, Lys325Glu y Pro331Ser. El primer residuo mencionado es aquél encontrado en la transglutaminasa de Streptoverticillium y el segundo residuo es aquél encontrado en la transglutaminasa de Streptomyces lydicus:
La alineación de las secuencias peptídicas
obtenida a partir de la transglutaminasa de Streptomyces
lydicus para la secuencia de aminoácidos de la transglutaminasa
de Streptoverticillium:
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de putrescina fue en principio
realizado según Lorand et al. (1972).
La mezcla reactiva contenía: 50 nmoles de
[^{14}C]-putrescina (4.03 GBq/mmol; Amersham), 6
mg de \alpha-caseína, (desfosporilada, Sigma no.
C-8032), 5 \mumoles de glutationa, y
5-10 \mug de TGasa completada hasta 1 ml con 0.2
M de Tris-HCl, pH 7.9 o 40 mM de tampón
Britton-Robinson con el pH pertinente. Las
incubaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente. Partes
alícuotas de 30 \mul fueron retiradas después de 1 y 2 h,
respectivamente, y esparcidas en filtros Whatman 3 MM (D = 2 cm).
Los filtros fueron inmediatamente puestos en cestos sumergidos en
el 10% ATC enfriado en hielo y lavados durante 20 min. Después del
primer lavado los filtros fueron lavados tres veces con el 5% de
ATC enfriado en hielo, dos veces con acetona enfriada en hielo. En
cada fase de lavado debería haber al menos 5 ml de solución de
lavado por filtro. Los filtros fueron secados, puestos en frascos
contadores que contenían 8 ml de fluido luminiscente (Optiphase,
Wallac) y la radioactividad fue medida en un espectrómetro de
centelleo líquido Packard Tri-Carb. Cada
determinación fue realizada por triplicado.
El ensayo de hidroxamato fue en principio
realizado como se describe por Folk y Cole (1965). El reactivo de
detención estaba compuesto por volúmenes iguales de ácido acético
al 15%, FeCl_{3} al 5%, y 2.5 N de HCl.
La mezcla reactiva contenía: 5 \mumoles de
glutationa, 100 \mumoles de cloruro de hidroxilamina, 30
\mumoles de CBZ-Gln-Gly y 0.1 mg
de TGasa completada hasta 1 ml con 40 mM de tampón
Britton-Robinson, pH 7.5. Las incubaciones fueron
realizadas a temperaturas diferentes y detenidas después de 20 min
de incubación por la adición de un volumen igual de reactivo de
detención. La absorbencia a 490 nm fue medida en un lector de
microplacas cinético
UV_{max}.
UV_{max}.
\vskip1.000000\baselineskip
La temperatura óptima para la TGasa de S.
lydicus fue medida en el ensayo de hidroxamato y resultó ser
óptima a 50ºC. Los resultados fueron:
| Temp (ºC) | Actividad relativa (%) |
| 30 | 30 |
| 40 | 75 |
| 45 | 90 |
| 50 | 100 |
| 55 | 75 |
| 60 | 20 |
| 70 | 10 |
\vskip1.000000\baselineskip
El perfil de pH para la Tgasa de S.
lydicus fue determinado en el ensayo de putrescina variando el
pH de 6 a 9. Resultó ser óptimo por encima de pH 8.5. Los
resultados fueron:
| pH | Actividad relativa (%) |
| 6.0 | 6 |
| 6.5 | 12 |
| 7.0 | 21 |
(Continuación)
| pH | Actividad relativa (%) |
| 7.5 | 40 |
| 8.0 | 57 |
| 8.5 | 83 |
| 9.0 | 100 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Tgasa de S. lydicus fue analizada por
su reactividad cruzada inmunológica con la TGasa de
Streptoverticillium mobaraense. Un anticuerpo policlonal fue
dirigido contra la enzima pura de S. mobaraense y usando un
ensayo de inmunodifusión de Ouchterlony resultó no haber reactividad
cruzada entre las TGasas de S. lydicus y S.
mobaraense.
Cuatro conejos fueron inmunizados con la TGasa
pura de S. mobaraense según los procedimientos estándar. El
antisuero de los cuatro conejos fue agrupado y el anticuerpo fue
purificado en una columna de Proteína G HiTrap de Pharmacia según
el procedimiento recomendado. El anticuerpo purificado fue usado en
una inmunodifusión de Ouchterlony (1% agarosa en 0.1 M de
tris-HCl) usando las TGasas puras de S.
mobaraense y S. lydicus como
antígenos.
antígenos.
La cepa creció en un vaso de fermentación de 2
litros provisto de un agitador acoplado magnético, control del pH y
de la temperatura y una bomba peristáltica para añadir la fuente de
carbono con índices fijos. Después del crecimiento durante 3 días
en un cultivo de agar inclinado YPG a 30ºC un nódulo del micelio
fue inoculado en un frasco de agitación de 500 ml conteniendo un
caldo de YPD (2% de extracto de levadura, 1% de
bacto-peptona, 6% de glucosa) y se propagó durante
24 horas a 250 rpm y 30ºC. 100 ml de este cultivo fueron usados
para inocular el fermento ya que contenía 1.3 litros de caldo con
los ingredientes siguientes:
| Extracto de levadura, 50%: | 60 g |
| Amicasa: | 30 g |
| MgS_{2}SOO_{4}.7H_{2}O: | 3 g |
| K_{2}SO_{4}: | 4 g |
| Metales traza: | 3 ml |
| Vitamina I: | 1.5 ml |
| Vitamina II: | 1.5 ml |
| Plurónico (antiespuma): | 3 ml |
Se ajustó el volumen a 1.3 litros con agua
corriente. Se ajustó el pH a 7.0 antes de la esterilización en un
autoclave a 121ºC durante 60 minutos. También una solución de
glucosa fue hecha separadamente en un matraz de 1 litro que
contenía 250 g de glucosa, 1 H_{2}O y 0.25 gramos de ácido cítrico
en agua corriente. Se ajustó el volumen a 500 ml antes de someterlo
a autoclave como antes.
Después de la inoculación del cultivo como se ha
descrito arriba la solución de glucosa fue alimentada a un índice
constante (9 g/H) al fermento durante las siguientes 17 horas. Una
bomba peristáltica Watson-Marlow fue usada. También
se esparció aire filtrado estéril en el fermentador en el
accionador inferior con un índice de 1.4 litro/minuto y este índice
fue mantenido en toda la fermentación. La velocidad del agitador
fue al principio dispuesta a 300 rpm, pero automáticamente acoplada
a la señal de tensión del oxígeno disuelto y un valor de ajuste de
10% de DOT y en consecuencia funcionando a un valor próximo al valor
máximo de 1100 rpm después de 17 horas. La velocidad de
alimentación de la glucosa fue ahora aumentada a 14.5 gramos/hora,
siendo mantenida durante las siguientes 24 horas y acabando con la
reserva de glucosa. Durante este periodo, la velocidad del agitador
fue la máxima (1150 rpm) y DOT próximo a cero. Un exceso de glucosa
estuvo también presente y este disminuyó hasta -0.1% de glucosa en
las 7 horas siguientes. La temperatura fue controlada a 30.0 +/-
0.1ºC y el pH a 7.00 +/- 0.05 por adición de amonio diluido en
agua.
Después de estas 48 horas de crecimiento del
cultivo, con una biomasa de 45 g de biomasa seca por litro, se
recogió y el micelio muy viscoso casi de forma cuantitativa
eliminado por adición de 500 ml de agua corriente. La suspensión
fue almacenada en frío (4ºC) durante 3 días. El sobrenadante fue
eliminado después del centrifugado durante 30 minutos a 4000 rpm. El
producto precipitado fue diluido hasta el volumen original en agua
corriente, suspendido y nuevamente centrifugado, ahora durante 45
minutos. Las concentraciones de la enzima en los dos sobrenadantes
fueron determinadas por el ensayo de hidroxamato.
Los rendimientos están mostrados en la tabla a
continuación:
| Cantidad, | Rendimiento de | Rendimiento de | ||
| gramos | TGasa, mg/l | TGasa, mg | ||
| Caldo diluido | 1993 | |||
| Sobrenadante I | 1536 | 120 | 184 | |
| Sobrenadante II | 1675 | 50 | 84 | |
| Total | 268 |
\vskip1.000000\baselineskip
Este rendimiento corresponde a -180 mg/l de
caldo no diluído.
Esto debería ser comparado con los rendimientos
de la técnica anterior de transglutaminasa los cuales demostraron
no ser superiores a aproximadamente 2.47 unidades/ml en el ensayo
de hidroxamato, ver US 5.252.469.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución del metal
traza
| HCl conc. | 5 ml |
| ZnCl_{2} | 3.4 g |
| FeCl_{3}.6H_{2}O | 27 g |
| MnCl_{2}.4H_{2}O | 9.55 g |
| CuSO_{4}.5H_{2}O | 1.1 g |
| CoCl_{2} | 1.29 g |
| H_{3}BO_{3} | 0.31 g |
| (NH_{4})6Mo_{7}O_{24}.4H_{2}O | 0.1 g |
| Agua destilada a | 1000 ml |
\vskip1.000000\baselineskip
Vitamina
I
| Biotina | 1.25 g |
| Tiamina | 20 g |
| D-calciopantotenato | 250 g |
| Mioinositol | 500 g |
| Cloruro de colina | 500 g |
| Piridoxina | 16 g |
| Niacinamida | 12 g |
| Ácido fólico | 2 g |
| Agua destilada a | 10 L |
\vskip1.000000\baselineskip
Vitamina
II
| Riboflavina | 4 g |
| Agua destilada a | 10 L |
Una solución de Na-caseinato
(Miprodan 30, MD Foods, Dinamarca) fue preparada conteniendo el 9%
de proteína. El pH fue ajustado a 7.0 usando NaOH.
La viscosidad fue medida usando el viscosímetro
Sofraser MIVI 2000. La lectura de la viscosidad está dada como mV
ajustando el valor consignado en 0 mV cuando se medió sin la
adición de la enzima.
El experimento comparó dos
transglutaminasas:
- 1.
- Transglutaminasa comercial (Ajinomoto TG-K) que se formula con dextrina 24%, Ca-lactato 75% y enzima 1%.
- 2.
- Preparación enzimática liofilizada de la fermentación de Streptomyces lydicus, NRRL B-3446 (anterior Streptomyces libani).
La actividad de ambas enzimas está medida por el
ensayo de hidroxamato como se describe en EP 0379606 A1. En base a
ello la dosificación para ambas enzimas fue 0.36mg de enzima para
una solución de sustrato de 5 ml.
El experimento se efectuó dos veces a 50ºC y
55ºC, respectivamente, y los resultados están mostrados en las
tablas a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Medición (mV) a
50ºC
| Tiempo, minutos | TG-K | Streptomyces lydicus |
| 0 | 0 | 0 |
| 6 | 110 | 147 |
| 11 | 64 | 161 |
| 15 | 70 | 173 |
| 20 | 130 | 300 |
| 25 | 240 | 439 |
| 30 | 323 | 561 |
| 35 | 333 | 612 |
| 40 | 390 | 728 |
| 45 | 514 | 833 |
| 50 | 813 | 947 |
| 55 | 1142 | 992 |
| 60 | 1374 | 1040 |
| 65 | 1416 | 1097 |
| 70 | 1230 | 1160 |
| 75 | 1269 | 1196 |
Medición (mV) a
55ºC
| Tiempo, minutos | TG-K | Streptomyces lydicus |
| 0 | 0 | 0 |
| 5 | 108 | 55 |
| 10 | 133 | 175 |
| 15 | 233 | 289 |
| 25 | 329 | 468 |
| 30 | 399 | 602 |
| 40 | 477 | 691 |
| 50 | 661 | 784 |
| 60 | 596 | 873 |
| 70 | 745 | 895 |
| 75 | 720 | 892 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ambas enzimas muestran actividad a 50ºC y 55ºC.
Los resultados muestran que la actividad de la transglutaminasa de
Streptomyces lydicus, NRRL B-3446 (anterior
Streptomyces libani) es mayor a 55ºC en comparación con la
transglutaminasa TG-K que indica una temperatura más
alta óptima y/o una termostabilidad más alta para la enzima de
Streptomyces lydicus, NRRL B-3446 (anterior
Streptomyces libani).
ADN fue aislado de Streptomyces lydicus,
NRRL B-3446. El huésped usado fue SJ2 de E.
coli (Diderichsen, B. et al., (1990)).
Plásmido: el vector de la genoteca fue pSJ1678
que está descrito adicionalmente en WO94/19454 que está incorporado
por la presente por referencia. El vector de clonación fue
pPL1759.
El ADN cromosómico de Streptomyces
lydicus, NRRL B-3446, fue parcialmente digerido
con la enzima de restricción Sau3A1. Los fragmentos fueron clonados
en los sitios del BamHI de un vector de clonación pSJ1678, véase
figura 1 y WO 95/01425, y transformados en SJ2 de Escherichia
coli (Diderichsen, B. et al., (1990)), de ese modo
creando una genoteca de S. lydicus.
A partir de la secuencia proteínica hecha por
secuenciación de la proteína de la transglutaminasa de S.
lydicus se predijeron dos cebadores de la PCR. Un cebador que
contenía un sitio PstI y las 30 bases predichas del
5'-terminal (cebador 7854) y un cebador que contenía
una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción HindIII
y 30 bases complementarias para la secuencia 3' de transglutaminasa
predicha (cebador 7855) del gen de transglutaminasa maduro de S.
lydicus se preparó:
7854:
- 5'-CCTCATTCTGCAGCAGCGGCGGCAGCCGACGAAAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
7855:
- 5'-GCGCGAAGCTTCACGACCAGCCCTGCTTTACCTCGGCGGGGGC-3'
2-4 mg de ADN cromosómico de
S. lydicus fue usado como molde en una reacción PCR (20
ciclos) usando los cebadores 7854 y 7855 y Super Taq ADN polimerasa
y según las instrucciones del fabricante (Super Taq^{TM} DNA
polymerase/PCR buffer, HT BIOTECHNOLOGY LTD)).
Un fragmento de PCR correspondiente al tamaño
previsto de la transglutaminasa de S. lydicus fue recuperado
de un gel de agarosa y digerido con las enzimas de restricción
HindIII y PstI.
El plásmido pPL1759, véase figura 2 y Hansen, C.
(1992), fue digerido con las enzimas de restricción
PstI-HindIII y el fragmento del vector grande fue
ligado al fragmento de la PCR. La mezcla de ligadura fue
transformada en DN1885 de Bacillus subtilis (P. L. Jørgensen
et al., (1990)).
Se realizó la selección de transformantes y el
reaislamiento de los mismos en medios LBPG con 10 \mug de
Canamicina/ml. El análisis del ADN de los plásmidos de estos clones
usando un equipo de secuenciación del ADN (SEQUENASE^{TM} (United
States Biochemicals)) mostró la secuencia prevista (SEC ID nº. 1)
de la región de codificación de la transglutaminasa madura cuando
fue traducida y comparada con la proteína de la transglutaminasa
parcialmente secuenciada de S. lydicus. Este plásmido fue
denominado pJA243 y una cepa DN1885 de B. subtilis que
albergaba este plásmido fue denominada JA243. Un mapa plásmido de
pJA243 está mostrado en la figura 3.
El fragmento PstI-HindIII de
pJA243 fue usado como molde para hacer una sonda marcada
radioactiva usando un Nick Translation Kit^{TM} según está
descrito por el fabricante (código N.5500 de Amersham). Esta sonda
radioactiva fue usada para la hibridación de la colonia a la
genoteca de S. lydicus. Para encontrar el gen de
transglutaminasa nativo se aisló un clon positivo. Esta bacteria
contenía un fragmento insertado en el plásmido pSJ1678. El ADN
clonado podría ser amplificado con los cebadores 7854 y 7855 dando
un fragmento con el tamaño correcto. El clon fue denominado JA260 y
depositado bajo el tratado de Budapest el 23 Agosto 1995 como DSM
10175 (E. coli).
Un ensayo de control de putrescina fue realizado
para investigar si las TGasas de distintas cepas bacterianas son
sensibles a PMSF (metil fenil sulfonil fluoruro). Las
transglutaminasas purificadas de S. lydicus y S.
mobaraense resultó ser insensible a PMSF.
El ensayo fue realizado bajo condiciones
optimizadas (ver ejemplos 1 - 3), e.d. 1 h de incubación a 30ºC, pH
8.5 (2% \alpha-caseína + EDTA en 100 mM
Britton-Robinson-tampón modificado
0.1 M, pH 8.5). La concentración final de PMSF fue 1.6 mM. Como
control, se incluyó un ensayo que incluía propanol: el propanol es
el solvente de PMSF. Este ensayo asegura que los efectos del
solvente están excluidos. El ensayo contenía 0.9 M de
2-propanol es decir la misma concentración que en
el ensayo con PMSF (adición de 8 \mul de propanol de 13 M en vez
de 8 \mul de PMSF en 2-propanol).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad Tgasa de todas cepas investigadas
excepto S. lydicus fue inhibida por la adición de PMSF:
Bacillus badius, Bacillus firmus, Bacillus mycoides, Bacillus
aneurinoliticus, cepa Moo5A10, Bacteridium
(DSM10093) y Bacteridium (CBS 495.74).
Este resultado contrasta con la TGasa de
Streptomyces lydicus y las transglutaminasas microbianas
conocidas. Este resultado implica que las TGasas
PMSF-sensibles catalogadas arriba poseen sitios
activos catalíticos diferentes de las TGasas de Streptomyces
y todas las demás TGasas conocidas (incluyendo el factor XIII).
150 \mul de soluciones de leche desnatada (15
y 20%) y 50 \mul de sobrenadante (es decir diferentes actividades
TGasa) fueron incubados en Tubos Eppendorf a 30ºC mientras que se
agitaba con 700 rpm en un agitador termostatizado.
Los ensayos fueron visiblemente controlados cada
hora y después de la incubación durante la noche (aproximadamente
18 h). Las muestras usadas fueron tratadas con centricon (para
eliminar los iones Ca^{2+}): las muestras correspondientes (1 ml)
fueron concentradas en un tubo del centricon 10 kDa (sin actividad
Tgasa en el filtrado), resuspendidas con Tris-tampón
libre de Ca^{2+} (0.1 M, pH 7.5) hasta 1 ml, centrifugadas
nuevamente y concentradas resuspendiendo el reintento en 0.25 ml de
tampón tris.
Controles: Como algunos medios usados contienen
altas concentraciones de Ca^{2+} (medio H: 34 mM; Medio K nd Q:
3.4 mM; Medio L: 13.6 mM) se realizaron controles para controlar
efectos Ca^{2+}-dependientes
(TGasa-independiente). Los medios fueron tratados
como se describe para las muestras con tubos del centricon.
Todas cepas investigadas mostraron una
gelificación del 15 y/o el 20% de leche desnatada:
- Bacteridium (2 cepas), Bacillus firmus, Bacillus mycoides, Bacillus badius, Bacillus aneurinolytikus, cepa Moo5A10 y Rothia dentocariosa. Bacillus mycoides y Bacillus aneurinolyticus mostraron efectos positivos después de 60 minutos de incubación, todos los demás fueron positivos después de la incubación durante la noche.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX: 37304
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TÍTULO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 993 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD DE LA CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Streptomyces lydicus
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: NRRL B-3446
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..993
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 331 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Transglutaminasa con la secuencia de
aminoácidos dada en la SEC ID Nº. 2, o un análogo de dicha
transglutaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al
menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos dada en
la SEC ID Nº. 2, y que muestra actividad relativa óptima a un pH de
al menos 8.5.
2. Método para la producción de una
transglutaminasa según la reivindicación 1 que comprende el cultivo
en un medio nutritivo adecuado de Streptomyces lydicus, NRRL
B-3446.
3. Composición de transglutaminasa que comprende
la transglutaminasa según la reivindicación 1 y un
estabilizador.
4. Método para entrecruzar proteínas donde una
composición de la transglutaminasa que comprende la
transglutaminasa según la reivindicación 1 es puesta en contacto
con un sustrato proteínico.
5. Uso de la transglutaminasa según la
reivindicación 1 en harina, productos a base de carne, productos a
base de pescado, cosméticos, queso, productos lácteos, productos
alimentarios gelificados y brillo para el calzado.
6. Secuencia de ADN, que codifica una enzima que
muestra actividad transglutaminasa que muestra actividad relativa
óptima a un pH de al menos 8.5, dicha secuencia de ADN
comprendiendo
- a)
- la secuencia de ADN mostrada en SEC ID nº. 1, o
- b)
- un análogo de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID nº. 1, que
- i)
- tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID nº. 1, o
- ii)
- codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID nº. 1
7. Secuencia de ADN según la reivindicación 6
obtenible a partir de un microorganismo, preferiblemente una
bacteria.
8. Secuencia de ADN según la reivindicación 7
que es aislada de o producida en base a un banco de ADN de una cepa
de una bacteria gram-positiva, preferiblemente de
una cepa de Actinomycetes, más preferiblemente de una cepa de
Streptomyces, o de una cepa de una bacteria
gram-negativa, preferiblemente de una cepa de
Bacillus sp.
9. Secuencia de ADN según la reivindicación 8
que está aislada de o producida en base a un banco de ADN de una
cepa de Streptomyces lydicus, en particular Streptomyces
lydicus, NRRL B-3446.
10. Vector de expresión recombinante que
comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 6-9.
11. Célula que comprende un vector de expresión
recombinante según la reivindicación 10.
12. Célula según la reivindicación 11, que es
una célula microbiana, preferiblemente una célula bacteriana o una
célula fúngica.
13. Célula según la reivindicación 12, donde la
célula bacteriana es una célula de una bacteria
gram-positiva, p. ej. del género Bacillus o
Streptomyces o una célula de una bacteria
gram-negativa, p. ej. del género
Escherichia, y la célula fúngica es una célula de levadura,
p. ej. del género saccharomyces, o una célula de un hongo
filamentoso, p. ej. del género Aspergillus, Trichoderma o
Fusarium.
14. Célula según la reivindicación 13, donde
dicha Escherichia es E. coli.
15. Célula según la reivindicación 13, donde
dicho Aspergillus es Aspergillus Niger, Aspergillus
oryzae, o Aspergillus nidulans.
16. Célula según la reivindicación 13, donde
dicho Bacillus es Bacillus licheniformis, Bacillus
lentus, o Bacillus subtilis.
17. Célula según la reivindicación 13, donde la
célula pertenece a un cepa de Streptomyces lydicus.
18. Método para producir la transglutaminasa
según la reivindicación 1, dicho método comprendiendo el cultivo de
una célula según cualquiera de las reivindicaciones
11-17 bajo condiciones que permiten la producción
de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
19. Enzima que muestra actividad
transglutaminasa, enzima que está codificada por una secuencia de
ADN según cualquiera de las reivindicaciones
6-9.
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