ES2268030T3 - Deteccion de inflamaciones. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la detección de una inflamación, caracterizado porque se determinan cualitativa y/o cuantitativamente la enzima prostaglandina D sintasa (PGDS) o fragmentos parciales de la misma, y porque en el caso de la inflamación que se ha de detectar se trata de una inflamación de las glándulas lácteas.
Description
Detección de inflamaciones.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para la detección de procesos inflamatorios. El
presente invento se refiere en particular a un procedimiento para la
detección de procesos inflamatorios en el tejido de glándulas
lácteas de seres humanos y animales, en particular de vacas, así
como a un estuche de ensayo para la realización del procedimiento
conforme al invento. El procedimiento se adecua en particular para
la detección específica de inflamaciones en glándulas lácteas, por
ejemplo mediante examen de la leche, determinándose cualitativa o
cuantitativamente la enzima prostaglandina D sintasa (PGDS), que
participa en el suceso inflamatorio.
Las inflamaciones de la glándula láctea de una
vaca tienen una gran importancia económica debido a su frecuente
presentación en aproximadamente un 30 - 40% de todas las vacas
lecheras. Por una parte, mediante tales inflamaciones disminuye el
rendimiento de leche y la calidad comercializable de la leche. Por
otra parte, un reconocimiento demasiado tardío y el masivo
tratamiento con antibióticos, que es necesario a continuación de
éste, dan lugar a unos tiempos de espera, en los que la leche no se
puede comercializar. Suponiendo una pérdida de 10% del rendimiento
de leche en un 15% de las vacas lecheras en la República Federal
Alemana, un rendimiento medio de leche de 6.500 kg y un precio por
kilogramo de 0,45 DM (marcos alemanes), se puede calcular por lo
menos una merma económica de aproximadamente 210 millones de DM por
año.
Todos los procesos de diagnóstico aplicados
hasta ahora para la detección de inflamaciones de las glándulas
lácteas son inespecíficos y no permiten ninguna estimación directa
de los procesos inflamatorios en la glándula láctea. Entre estos
procedimientos conocidos se cuentan, por ejemplo, la medición de la
conductibilidad eléctrica de la leche, la determinación de los
números o cómputos de células o la detección de enzimas que indican
un daño que ya se ha producido en el tejido, tales como p.ej. la
lactato deshidrogenasa. La detección de tales enzimas es posible sin
embargo tan sólo relativamente tarde.
Los ensayos rápidos disponibles actualmente para
se aplicación en el sitio de uso (in situ) son ensayos
indirectos y están basados en la detección cualitativa o bien
semicuantitativa de un ácido desoxirribonucleico, que es liberado
desde las células contenidas en la leche, y que se evalúa
visualmente. Un número aumentado de células, que produce una
elevación de la cantidad de ácido desoxirribonucleico, se considera
en este contexto como un indicador de una inflamación en la glándula
láctea. Mientras que el ensayo proporciona un indicio acerca del
cómputo de células, sin embargo, un contenido aumentado de células
no se puede atribuir directamente a procesos inflamatorios, tales
como, por ejemplo, la deficiencia grandemente positiva que se
observa, por ejemplo, al principio y al final de la lactación.
Puesto que las inflamaciones de la glándula
láctea son debidas casi exclusivamente a infecciones bacterianas,
debería de corresponderle una gran importancia al diagnóstico
bacteriológico. No obstante, la práctica muestra que entre las
citadas modificaciones inespecíficas en la leche y la bacteriología
raramente correlaciones. Un diagnóstico, sobre todo, de
inflamaciones subclínicas es, por lo tanto, hasta ahora muy
inseguro. Ejemplos de indicadores proteínicos funcionales de una
mastitis subclínica son, por ejemplo, LDH, NAGasa (Zank W.,
Schlatterer B. Assessment of subacute mammary inflammation by
soluble biomarkers in comparison to somatic cell counts in quarter
milk samples from dairy cows (Evaluación de una inflamación subaguda
de las glándulas lácteas mediante marcadores biológicos solubles,
en comparación con cómputos de células somáticas en muestras de
leche de cuartas partes de vacas lecheras). J Vet Med A 1998;
45:45-51), plasminógeno y plasmina (Urech E., Puhan
Z., Schällibaum M. Changes in milk protein fraction as affected by
subclinical mastitis (Cambios en la fracción proteínica de la leche
como se afecta por la mastitis subclínica). J Dairy Sci 1999;
82:945-951), así como el marcador C5a (Rainard P.,
Poutrel B. Generation of complement fragment C5a in milk is variable
among cows (La generación del fragmento C5a del complemento en la
leche es variable entre vacas). J. Dairy Sci 1999;
82:2.402-2.411).
Las inflamaciones son provocadas por mediadores
de inflamaciones, por regla general después de una iniciación por
medio de productos bacterianos del metabolismo. Unos primeros
procesos se deben en este caso a un metabolismo elevado localmente
de los fosfolípidos, que conduce a prostaglandinas y a productos
metabólicos similares a las prostaglandinas. Éstos son ciertamente
detectables en la secreción láctea de una glándula láctea inflamada,
pero hasta ahora no se han detectado ni reconocido modelos de
composición de sustancias estimables inequívocamente, lo que tiene
que ver, entre otras cosas, con el carácter complicado y el gasto de
la analítica (F. Atroshi y colaboradores,
Inflammation-related changes in cyclic AMP and
cyclic GMP in bovine mastitis (Cambios relacionados con
inflamaciones en AMP cíclico y GMP cíclico en una mastitis bovina).
Vet Res Commun 1989; 13: 427-33; O. O'Sullivan y
colaboradores. Analysis of prostaglandin D2 metabolites in urin:
comparison between enzyme immunoassay and negative ion chemical
ionisation gas chromatography-mass spectrometry
(Análisis de metabolitos de la prostaglandina D2 en la orina:
comparación entre un inmunoensayo enzimático y una espectrometría de
masas con cromatografía de gases por ionización química de iones
negativos). Prostaglandins Other Lipid Mediat 1999;
57:149-165).
Una misión del invento fue, por lo tanto, poner
a disposición un procedimiento y, en particular, un indicador
específico de inflamaciones, para la detección de inflamaciones de
las glándulas lácteas.
El problema planteado por esta misión se
resuelve mediante un procedimiento para la detección de una
inflamación de las glándulas lácteas, que está caracterizado porque
se determinan cualitativa y/o cuantitativamente la enzima
prostaglandina D sintasa (PDGS) o fragmentos parciales de la misma.
La determinación se efectúa preferiblemente en líquidos corporales.
Se comprobó que la prostaglandina D sintasa (PGDS) sube en el caso
de procesos inflamatorios en el cuerpo o en un tejido de seres
humanos y animales. La PGDS se puede encontrar, en el caso de
inflamaciones, en una cantidad aumentada en líquidos corporales,
por ejemplo en el plasma, en el líquido sinovial, en el fluido
cerebrospinal, en la orina o en la eyaculación. La prostaglandina D
sintasa (PGDS) se adecua, por consiguiente, como un indicador de
inflamaciones en procesos inflamatorios, puesto que la cantidad de
la enzima sube en el caso de inflamaciones. La determinación se
puede efectuar también en las heces y sirve entonces para la
detección de inflamaciones en el tracto gastrointestinal, en
particular en el estómago, el páncreas o los intestinos.
El invento se refiere a un procedimiento para la
detección de una inflamación de las glándulas lácteas, que está
caracterizado porque se determinan cualitativa y/o cuantitativamente
la enzima prostaglandina D sintasa (PGDS) o fragmentos parciales de
la misma.
Se comprobó que la prostaglandina D sintasa
(PGDS) es segregada en cantidad aumentada en el caso de
inflamaciones de las glándulas lácteas, de tal manera que esta
enzima se adecua como un indicador de inflamaciones para la
detección específica cualitativa o/y cuantitativa de inflamaciones
de las glándulas lácteas.
Conforme al invento, se pone a disposición, por
consiguiente, un indicador de alta especificidad, acoplado
directamente a los procesos inflamatorios, cuya detección y cuya
cuantificación permiten también un diagnóstico precoz de
inflamaciones de las glándulas lácteas. La enzima indicadora
prostaglandina D sintasa (número de acceso O02853) se presenta en
varias isoformas, que se pueden detectar individualmente o en
común.
La sustancia indicadora PGDS para la detección
de una inflamación de las glándulas lácteas se descubrió mediante
comparación del modelo de composición de proteínas del suero lácteo
de la leche de animales afectados por una inflamación de las
glándulas lácteas, con el de animales sanos, que no están afectados.
Este modelo de composición de proteínas se puede obtener, por
ejemplo, mediante una electroforesis bidimensional en gel
(2D-PAGE), habiendo aparecido, en el caso de
muestras de leche de animales con una inflamación de las glándulas
lácteas, 4 manchas adicionales con un peso molecular de
aproximadamente 26 kDa y con un intervalo de valores del pH de 5,0
a 6,4. Las sustancias recortadas a partir del gel muestran un modelo
de composición muy similar, en cromatografía así como en
espectrometría de masas, de péptidos quimiotrípticos (cortados con
quimiotripsina). Mediante una búsqueda en un banco de datos se
pudieron identificar las 4 sustancias como isoformas de la
prostaglandina D sintasa (PGDS) bovina, estando oxidado en una de
las isoformas un resto de cisteína para dar un ácido sulfónico.
Por consiguiente, a pesar de la naturaleza muy
compleja de los mecanismos de defensa e inflamación de las glándulas
lácteas contra la invasión de diferentes agentes infecciosos, se ha
conseguido poner a disposición un marcador, que permite de una
manera fiable una detección cualitativa y/o cuantitativa de una
inflamación de las glándulas lácteas. A causa de la gran cantidad de
caseínas en la leche, se realizó un fraccionamiento previo de las
proteínas de una leche de vaca en lo que respecta a los componentes
del suero lácteo, con lo que se pudo obtener un esclarecimiento en
cuanto a los polipéptidos, que permite la identificación de la
enzima marcadora PGDS conforme al invento.
Sorprendentemente, esta molécula marcadora se
pudo detectar no solamente en la sangre, o dentro de las células, en
el caso de una inflamación de las glándulas lácteas, sino que, en el
caso de inflamaciones de las glándulas lácteas, se presenta también
en la leche en una cantidad elevada, de tal manera que es posible
una detección sencilla y fácil de una inflamación de las glándulas
lácteas. Además, la enzima se pudo detectar, en el caso de
inflamaciones, en una cantidad elevada en líquidos corporales, p.ej.
en el caso de una encefalitis en una cantidad elevada en el fluido
cerebrospinal y, en el caso de una artritis reumatoide, en el
líquido sinovial. La prostaglandina D sintasa del tipo de
lipocalina, que también se designa como prostaglandina
H2-D-isomerasa (EC5.3.99.2), es una
enzima fijada a membranas (Giacomelli S, Leone MG, Grima J,
Silvestrini B, Cheng CY. Astrocytes synthesize and secrete
prostaglandin D synthase in vitro (Los astrocitos sintetizan
y segregan la prostaglandina D sintasa in vitro). Biochim
Biophys Acta 1996; 1.310:269-276).
Fundamentalmente, el procedimiento conforme al
invento se puede emplear para la detección de inflamaciones en seres
humanos y animales.
Mientras que el procedimiento conforme al
invento se puede emplear para la detección de una inflamación de las
glándulas lácteas en seres humanos y animales, se emplea de una
manera especialmente preferida para la detección de inflamaciones de
las glándulas lácteas de vacas. Preferiblemente, se determinan la
enzima prostaglandina D sintasa o fragmentos parciales de la misma,
en particular fragmentos parciales con una longitud de por lo menos
15 aminoácidos, de manera más preferida de por lo menos 30
aminoácidos, y de manera todavía más preferida de por lo menos 50
aminoácidos, en una muestra de líquido corporal o preferiblemente en
una muestra de leche. En el caso de la detección en seres humanos se
utiliza como marcador en particular la prostaglandina D sintasa
humana, y en el caso de la detección en vacas se utiliza
especialmente la prostaglandina D sintasa bovina.
La determinación del marcador en una muestra de
leche permite in situ una rápida y sencilla estimación acerca
de si se presenta una inflamación o bien de con qué intensidad está
pronunciada una inflamación.
De manera especialmente preferida, la
determinación se lleva a cabo mediando utilización de por lo menos
un anticuerpo dirigido contra la prostaglandina D sintasa.
Anticuerpos aptos para emplearse conforme al invento se pueden
producir de acuerdo con procedimientos conocidos a partir del estado
de la técnica. Para un experto en la especialidad son bien conocidos
los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales y
respectivamente policlonales. Para la producción de anticuerpos
monoclonales por ejemplo el antígeno, en el presente caso por lo
tanto la enzima prostaglandina D sintasa o fragmentos parciales de
la misma, se utilizan en una forma purificada de una manera usual
para la producción de anticuerpos. En principio, para esta finalidad
se puede aplicar el procedimiento, que fue descrito por primera vez
por Köhler y Millstein, siendo conocidos para un experto en la
especialidad también modificaciones y perfeccionamientos de este
procedimiento. La selectividad de los anticuerpos obtenidos se puede
comprobar mediante selección.
También es posible, partiendo de la
prostaglandina D sintasa o de fragmentos parciales de la misma,
producir anticuerpos policlonales de acuerdo con procedimientos
conocidos. Se emplean preferiblemente aquellos anticuerpos
policlonales, en particular los anticuerpos policlonales que
reconocen a todas las isoformas de la prostaglandina D sintasa.
De manera especialmente preferida, el anticuerpo
se produce mediando utilización de los péptidos PGDS1
(Ac-LTSTFLRKDQCETRTLL-NH2), PGDS2
(Ac-FEEDKFLGR-WFTSGLAS-NH2)
o PGDS3 (Ac-GPGQDFRMATLY-
SRSQ-NH2).
SRSQ-NH2).
La determinación se lleva a cabo preferiblemente
mediante un inmunoensayo, en particular mediante un ELISA en
emparedado cuantitativo. En una forma preferida de realización de
este ensayo, una muestra, por ejemplo una muestra de leche que se ha
de ensayar, se pone en contacto con por lo menos dos receptores
diferentes, de los que el primer receptor R1 se presenta
inmovilizado junto a una fase sólida y es capaz de fijarse con la
PGDS y el segundo receptor R2 se presenta en una fase líquida y es
asimismo capaz de fijarse con la PGDS, y lleva una marcación, o
media en la fijación a una molécula detectable, se separa la fase
sólida con respecto de la fase líquida y se determina la marcación o
la molécula detectable en la fase sólida. Mediante cuantificación
de la cantidad determinada de marcación o de la molécula detectable,
se puede cuantificar la cantidad de PGDS presente en la muestra.
En otra forma preferida de realización, el
procedimiento conforme al invento se lleva a cabo como una
transferencia de borrón (blot) Western.
Al llevar a cabo un inmunoensayo se puede
comprobar específicamente el contenido de la PGDS en una muestra,
por ejemplo en una muestra de leche, el cual se puede considerar
como marcador para una inflamación de las glándulas lácteas. Junto a
la determinación cuantitativa, también es posible una determinación
cualitativa, a fin, p.ej., de obtener de antemano un resultado
rápido. Preferiblemente, se establece un valor de corte (en inglés
cut-off), a fin de poder diferenciar entre
resultados negativos y resultados positivos.
En una forma preferida de realización, en primer
lugar, un anticuerpo que se fija específicamente a la enzima PGDS es
inmovilizado junto a una fase sólida por medio de un procedimiento
conocido. La muestra que se ha de examinar, en particular una
muestra de leche, después de haberla desnatado en una solución
tamponadora apropiada, es puesta en contacto con el anticuerpo
fijado y es fijado a través de éste a la fase sólida. Después de
haber lavado el complejo inmovilizado, así obtenido, entre el
anticuerpo y la enzima, se añade un anticuerpo secundario adicional,
acoplado con un marcador, que es fijado a otro epítopo de la PGDS, y
se determina la cantidad del marcador que queda en el sistema. La
cantidad del marcador fijado es directamente proporcional a la
cantidad de PGDS en la muestra. Preferiblemente, el procedimiento
conforme al invento se lleva a cabo paralelamente con un material de
referencia que tiene diferentes concentraciones de PGDS en muestras
de líquidos corporales, en particular en muestras de leche, a fin de
poner a disposición un alto grado de seguridad analítica y de
exactitud.
Con el procedimiento conforme al invento se
pueden detectar y cuantificar tanto una inflamación incipiente de
las glándulas lácteas, así como también una inflamación ya
existente. Además, el procedimiento es específico y fácil de llevar
a cabo. El procedimiento conforme al invento se adecua, además de
esto, no sólo para la realización en un laboratorio, por ejemplo
como un procedimiento cuantitativo de ensayo, sino que se puede
ejecutar también como una variante de ensayo rápido, que permite
estimar in situ la localización y la gravedad de una
inflamación.
Junto a la realización del procedimiento
conforme al invento en forma de un inmunoensayo y en particular de
un ELISA o de una transferencia de borrón Western, la detección de
una PGDS, por ejemplo, en la leche, es posible también con ayuda de
otros procedimientos de detección, prefiriéndose en particular la
detección con ayuda de una espectroscopia de masas, en particular la
MALDI-TOF (espectrometría de masas por tiempo de
vuelo con desorción/ionización mediante láser, asistida por una
matriz) o mediante una electroforesis en gel, en particular una
electroforesis bidimensional en gel. Junto a esto, la concentración
del analito se puede determinar en principio también por medio de
sensores biológicos (biosensores), tales como p.ej. sensores
amperométricos, potenciométricos, piezoeléctricos, termométricos o
fotométricos, o también mediante electrodos con semiconductores,
tales como transistores de efecto de campo (FIT), transistores de
efecto de campo quimiosensibles (CHEMFET), transistores de efecto de
campo con puerta suspendida (SGFET) o transistores de efecto de
campo sensibles a los iones. Tales biosensores se han descrito, por
ejemplo, por E. A. H. Hall y G. Hummel en la obra
"Biosensoren", editorial Springer Heidelberg, Alemania, 1995.
Además, la detección se puede llevar a cabo mediante la tecnología
del candelabro de IBM, Inc. Una realización especialmente ventajosa
del procedimiento, en lo que respecta a la sensibilidad, al
intervalo dinámico de medición, a la cinética de los análisis y a la
flexibilidad del formato, se puede conseguir mediando utilización de
la tecnología de electroquimioluminiscencia. Por
electroquimioluminiscencia se entiende un proceso en el que se
libera luz. La liberación de luz es inducida mediante el recurso de
que se aplica un potencial eléctrico a un electrodo, que media en
una reacción redox cíclica de un ion de rutenio metálico (Bruno, G.
(1997) Rec. Rp. páginas 175-179; Williams R. (1996),
Amer. Biotech, página 26). Una similar tecnología apropiada es la
tecnología TRACE de la entidad CIS, Alemania.
El procedimiento conforme al invento se puede
llevar a cabo por medio de un estuche de ensayo para la detección
o/y para el diagnóstico de una inflamación de las glándulas lácteas,
que contiene por lo menos un receptor que se fija con la
prostaglandina D sintasa, estando estructurado el estuche de ensayo,
en particular, para la realización del procedimiento conforme al
invento. El estuche de ensayo está previsto en particular para la
detección en vacas, pero puede estar previsto también para la
detección en los casos de otros animales o de seres humanos.
El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo
policlonal, que se fija a varias, preferiblemente a la totalidad, de
las isoformas de la prostaglandina D sintasa.
El receptor que se fija a la enzima PGDS media
preferiblemente en la fijación a una fase sólida, de tal manera que
se hace posible una separación de una fase líquida, que contiene la
muestra, en particular una muestra de leche, y de una fase sólida
con la PGDS fijada a ella a través de un receptor. Esta fase sólida
es, en una forma preferida de realización, asimismo parte componente
del estuche de ensayo. La muestra que se ha de examinar se pone en
contacto entonces, en una solución tamponadora apropiada, con el
receptor fijado o capaz de fijarse, en particular un anticuerpo, y
se fija a la fase sólida por medio del receptor. En el caso de
utilizarse la leche como muestra, antes de esta etapa se lleva a
cabo preferiblemente un desnatado.
Después de haber lavado el complejo inmovilizado
obtenido entre un anticuerpo y la PGDS, se añade entonces otro
anticuerpo secundario marcado o capaz de fijarse a una molécula
detectable, p.ej. provisto de biotina, el cual se fija
preferiblemente a otro epítopo de la PGDS. A continuación, se puede
determinar la marcación, p.ej. con ayuda de la estreptavidina
peroxidasa. La cantidad del marcador fijado es directamente
proporcional a la cantidad de PGDS en la muestra. Convenientemente,
el estuche de ensayo contiene un material de referencia con un
contenido conocido, y en particular con diferentes concentraciones
de la PGDS, para la determinación cuantitativa y para el
aseguramiento de la calidad del análisis.
Junto a la forma de realización preferida como
un ensayo en emparedado en fase sólida, el procedimiento conforme al
invento se puede llevar a cabo también por medio de otros métodos de
detección. En particular, se pueden emplear conforme al invento
todos los tipos de procedimientos inmunológicos de detección, que se
llevan a cabo con ayuda de anticuerpos. Así, el procedimiento
conforme al invento se puede llevar a cabo, por ejemplo, como un
ensayo ELISA, un ensayo en cuarzo oscilante, un ensayo con
microbáscula o un ensayo de electroquimioluminiscencia, y contiene
preferiblemente los reactivos, y eventualmente también los
dispositivos, necesarios para ello.
Para una manipulación sencilla, el ensayo se
puede concebir en forma de una tira de ensayo, sobre la que están
dispuestos, por ejemplo en diferentes zonas, los anticuerpos
requeridos, o bien en una forma soluble o fijados a fases sólidas.
La muestra y respectivamente la porción líquida de la muestra, o un
extracto de la misma, pueden migrar entonces a través de la tira de
ensayo y proporcionan una señal junto al sitio de detección, cuando
la PGDS está presente en la muestra.
En una forma preferida de realización, el ensayo
está ejecutado como un ensayo rápido en forma de un ensayo de
difusión a través de una membrana, p.ej. como un ensayo de flujo
lateral (del inglés Lateral Flow Test) inmunocromatográfico o un
ensayo similar.
En el marco del presente invento, la expresión
"receptor" y respectivamente la de "anticuerpo" designan
también a las partes o fragmentos de receptores y respectivamente
anticuerpos, que median todavía en la necesaria fijación a la PGDS.
En este caso, también es posible emplear, en vez de un único
anticuerpo, un conjugado, por ejemplo a base de dos anticuerpos. En
particular, por ejemplo como receptor secundario, se puede utilizar
un anticuerpo capaz de fijarse a la PGDS, y llevar a cabo la
detección a través de otro anticuerpo marcado, que está dirigido
contra la parte Fc del anticuerpo secundario y que lleva una
marcación o, por su parte, está acoplado con una molécula
detectable. Una tal formación de un conjugado a base de dos
anticuerpos debe de estar abarcada dentro del marco de presente
invento, cuando el anticuerpo secundario está definido de tal manera
que media en la fijación a una molécula detectable. Algo análogo es
válido para la fijación del primer anticuerpo a la fase sólida.
También esta fijación se puede efectuar a través de anticuerpos
acoplados a fases sólidas, los cuales se fijan a la parte Fc del
primer anticuerpo.
Dentro del marco del presente invento se
prefiere que el estuche de ensayo utilizable contenga como
receptores unos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos capaces de
fijarse específicamente. Además, se prefiere que el primer
anticuerpo se presente acoplado a una fase sólida, mientras que el
anticuerpo secundario sea preferiblemente un anticuerpo marcado,
soluble, o un anticuerpo soluble, que está fijado a una enzima, la
cual, por su parte, se puede determinar por medio de una reacción de
detección. La marcación se puede estructurar de tal manera que sea
reconocible sin más adiciones de sustancias, tales como p.ej. una
marcación con oro o una marcación fluorescente, pero también puede
estar estructurada de tal manera que una adición de reactivos
adicionales haga posible la determinación. Por ejemplo, la detección
se puede efectuar mediante una marcación con enzimas y una adición
del substrato enzimático.
Un objeto adicional del presente invento es la
utilización de un anticuerpo dirigido contra la prostaglandina D
sintasa para la preparación de un agente destinado a la detección de
inflamaciones de las glándulas lácteas. Conforme al invento se
comprobó que los anticuerpos dirigidos contra la prostaglandina D
sintasa son unos marcadores específicos de inflamaciones de las
glándulas lácteas, de tal manera que ellos se pueden emplear tanto
para la detección cualitativa como también para la detección
cuantitativa de tales inflamaciones.
Preferiblemente, en el procedimiento conforme al
invento se emplea un anticuerpo monoclonal, que se fija
específicamente a la enzima prostaglandina D sintasa (PGDS).
Los anticuerpos son obtenibles con ayuda de
métodos de por sí conocidos. En este caso, primeramente la enzima
prostaglandina D sintasa (PGDS) se aísla y eventualmente se
purifica. Después de esto, un animal de ensayo se puede inmunizar
con la prostaglandina D sintasa así obtenida y respectivamente con
fragmentos de la misma, que tienen los correspondientes epítopos, y
los anticuerpos que se han formado se pueden aislar. Los fragmentos,
que se utilizan para la inmunización, pueden proceder p.ej. de una
digestión con una proteasa de la PGDS purificada, o de péptidos
parciales sintéticos de la misma. La preparación de tales péptidos
parciales es de por sí conocida para un experto en la especialidad.
En este caso, a partir de la secuencia total, p.ej. con ayuda de
programas de ordenador, se pueden seleccionar secuencias parciales,
que contienen correspondientes epítopos. Estas secuencias se ensayan
luego en cuanto a su posibilidad de utilización para la producción
de anticuerpos específicos.
Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales se
producen según el método de Köhler, Milstein (Nature 256,
495-497 (1975)). En este caso se inmunizan, por
ejemplo, ratones BALB/c con una PDGS aislada, y las células
esplénicas de estos animales se fusionan con un linaje de células de
mieloma, por ejemplo, el PA I. Los anticuerpos segregados se ensayan
en cuanto a su especificidad, por ejemplo en un ensayo de tipo ELISA
o RIA, y se aíslan.
Por lo demás, se pueden emplear aptámeros, que
se fijan específicamente a la PGDS. Los aptámeros son secuencias de
oligonucleótidos, que tienen unas propiedades específicas de
fijación. Los aptámeros se pueden preparar o identificar, por
ejemplo, según los métodos descritos en el documento US 5.270.163 o
en la cita de Sumedha, Clin. Chem. 45 (1999)
1.626-1.650.
El invento se explica más detalladamente por
medio de las Figuras adjuntas y los siguientes Ejemplos
Figura
1
Cantidades equivalentes (6 mg) de muestras de
proteínas liofilizadas se cargaron sobre tiras lineales de IPG (con
gradiente de pH inmovilizado) de pH 4-7 y se
enfocaron, seguidamente se llevó a cabo una electroforesis en un gel
con SDS con una concentración constante de acrilamida (12% de T,
2,67% de C). Las flechas indican las especies de proteínas
identificadas, que no están presentes en la cuarta parte no
modificada de una ubre. Las manchas designadas con letras
representan proteínas identificadas, que se encuentran usualmente en
cualquier leche: A: IgG1; B: fragmento de albúmina de suero bovino;
C: fragmento de albúmina de suero bovino; D: fragmento de albúmina
de suero bovino; E: \kappa-caseína;
F-EPI (proteína secretoria).
Figura
2
Separación por HPLC en fase inversa de los
péptidos cortados con quimiotripsina, que se obtuvieron mediante
digestión de las proteínas de las manchas 2 y 3 en el gel.
Figura
3
Espectros de MALDI-TOF en la
modalidad de iones negativos de los péptidos cortados con
quimiotripsina, que se obtuvieron mediante digestión de las
proteínas en las manchas 2 y 3 en el gel. Los espectros son casi
idénticos, con la excepción de los péptidos marcados con flechas. En
la mancha 3, los péptidos situados a 1.085 y 1.198 Da se asignan a
los restos 68 hasta 77 y 67 hasta 77 de la secuencia de PGDS. Las
masas de los correspondientes péptidos en la mancha 2 son 9 Da más
bajas.
Figura
4
Secuencia de PGDS. Los péptidos cortados con
quimiotripsina, que se habían observado, se subrayaron. Los
péptidos, que son diferentes en las manchas 2 y 3, están impresos en
negrita.
Figura
5
Transferencias de borrones Western de
secreciones de leche procedentes de cuartas partes de ubres que han
sido modificadas diferentemente.
Se examinaron 7 vacas, escogidas sobre la base
de un examen bacteriológico, en lo que respecta al cómputo (número)
de las células somáticas (SCC) y a la actividad de la lactato
deshidrogenasa (LDH). Las muestras previas de leche de cuartas
partes infectadas y no infectadas de la misma ubre se cargaron
directamente en recipientes con una capacidad de 50 ml, que
contenían una combinación de los dos inhibidores de proteinasas PMSF
(fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 2 mM) y APMSF (hidrocloruro de
fluoruro de
(4-amidino-fenil)-2-metanosulfonilo,
20 \muM), ambos de la entidad Roche Diagnostics Mannheim,
Alemania. Para la determinación de los cómputos de células y de la
actividad de LDH se utilizaron muestras previas de leche no
entresacadas.
Se midió el SSC con un aparato Fossomatic 360
(de la entidad Foss Electric, Hillerfod, Dinamarca). La actividad de
LDH se midió en una leche desnatada con un autoanalizador Beckman
Synchron CX5 CE (Zank W, Schlatterer B. Assessment of subacute
mammary inflammation by soluble biomarkers in comparison to somatic
cell counts in quarter milk samples from dairy cows (comprobación de
una inflamación mamaria subaguda mediante biomarcadores solubles en
comparación con cómputos de células somáticas en muestras de leche
de cuartas partes procedentes de vacas lecheras). J. Vet. Med. A
1998; 454:46-51). Los resultados se expresaron en
unidades de LDH (\mumol/s I). Las fracciones de proteínas del
suero lácteo se prepararon de acuerdo con el procedimiento de Molloy
MP, Herbert BR, Yan JX, Williams KL, Gooley AA. (Identification of
wallaby milk proteins separated by two-dimensional
electrophoresis, using amino acid analysis and sequence tagging
(Identificación de proteínas del suero lácteo separadas por una
electroforesis bidimensional utilizando un análisis de aminoácidos y
una marcación secuencial). Electrophoresis 1997;
18:1.073-1.078). Dicho brevemente, una separación de
grasa de la leche se realizó mediante centrifugación a 5.000 g (g
=aceleración de la gravedad), a 4ºC durante 10 min. La caseína se
precipitó mediante acidificación de una leche desnatada a un pH de
4,6 con ácido acético 4 M y se separó mediante centrifugación a
5.000 g, a 4ºC y mediante filtración, primeramente a través de un
filtro de papel y luego a través de una membrana de
poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF, 0,2 \mum). El
material filtrado se dializó durante una noche a 4ºC frente a agua
bidestilada. El material no disuelto se separó mediante
centrifugación. Se llevó a cabo una determinación de las proteínas
de acuerdo con Bradford MH. (A rapid and sensitive method for
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding (Un método rápido y
sensible para la cuantificación de cantidades de proteínas del orden
de microgramos mediando utilización del principio de fijación de
proteína y colorante). Anal Biochem 1976; 205:22-26)
mediando utilización de un ensayo Bio-Rad (de la
entidad Hercules, EE.UU.) en cuanto a proteínas. Unas partes
alícuotas se liofilizaron y se almacenaron a -70ºC.
6 mg de proteínas liofilizadas de las fracciones
de suero lácteo se disolvieron en 350 \mul de una solución de
rehidratación (urea 8 M, CHAPS al 2%, ditioeritritol (DTT) al 0,3%,
tampón de IPG al 2%). Immobiline® Dry Strips (tiras secas
Immobiline®), de pH 4-7, 18 cm, se introdujeron en
un dispositivo Multiphor II (de la entidad Amersham Pharmacia
Biotech, Uppsala, Suecia). El enfoque se inició a 500 V. La tensión
eléctrica se aumentó escalonadamente en el transcurso de una hora
hasta 3.500 V, y se prosiguió el enfoque a 2 mA y 10 W durante 7,5
h.
Antes de la segunda dimensión, las tiras de IPG
se equilibraron primeramente durante 15 min en 10 ml de un tampón a
base de Tris-HCl 50 mM, de pH 8,8, urea 6 M,
glicerol al 30% (v/v) [en volumen/volumen], SDS
(dodecil-sulfato de sodio) al 2% (p/v) [en
peso/volumen], una traza de azul de bromofenol y ditioeritritol
(DDT) 65 mM, y luego durante otros 15 min, en el mismo tampón,
siendo reemplazado el DTT por yodoacetamida 260 mM. Sobre un gel de
SDS con una concentración constante de acrilamida (12% de T, 2,67%
de C, 200x205x1,5 mm) las tiras equilibradas de IPG se embebieron en
agarosa al 0,5% en la cara catódica mediando utilización del
dispositivo Protean®II horizontal (de la entidad
Bio-Rad, Richmond, EE.UU.). Las condiciones de
electroforesis fueron 150 V, 15 mA/gel, 10 W a 12ºC durante una
noche, hasta que el colorante de detección bromofenol apareció en el
extremo catódico. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R 350,
hasta que se obtuvo la intensidad necesaria de coloración. Se llevó
a cabo una descoloración de los geles realizando múltiples veces
cambios de una solución de descoloración (etanol al 25%, ácido
acético al 8%).
Las manchas de proteínas teñidas se recortaron y
se descoloraron durante 2-6 h en una mezcla de
acetonitrilo al 40% (v/v) y de NH_{4}HCO_{3} 50 mM al 60% (v/v).
Después de la desecación mediante una centrifugación en vacío, éstas
se impregnaron con una solución de quimiotripsina (30 ng/\mul en
NH_{4}HCO_{3} 50 mM). La digestión se llevó a cabo durante una
noche a la temperatura ambiente. Los péptidos se extrajeron mediante
una adición de 30 \mul de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%
seguida por una adición de 50 \mul de acetonitrilo (CH_{3}CN)
después de 10 min. Se separó el material sobrenadante y se repitió
una vez más el modo de proceder. Los materiales sobrenadantes
combinados se liofilizaron.
Los péptidos formados mediante digestión
enzimática (con quimiotripsina) se separaron mediante una
RP-HPLC (SMART system, Pharmacia, Uppsala, Suecia)
en una columna de Pharmacia C2/C18 SC2.1/10, mediando utilización de
un gradiente lineal de acetonitrilo (0-50% en 40
min) en TFA al 0,1%. Los péptidos se detectaron a una longitud de
onda de 214 nm.
Se registraron espectros de masas de
MALDI-TOF (espectrometría de masas por tiempo de
vuelo con desorción/ionización mediante láser, asistida por una
matriz) en un instrumento Reflex II MALDI-TOF (de la
entidad Bruker-Daltonik, Bremen, Alemania). Todos
los espectros se registraron en la modalidad de reflector con ácido
\alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico
(15 mg/ml en acetonitrilo al 70%) como matriz. Para el análisis por
espectrometría de masas, la mezcla de péptidos se disolvió en 10
\mul de una mezcla 3/7 (v/v) de acetonitrilo y TFA acuoso al 2%.
Los péptidos individuales, purificados por RP-HPLC,
se sometieron a un análisis adicional mediante registro de los
espectros después de la extinción de la fuente (del inglés
Post-Source-Decay).
La búsqueda en un banco de datos mediando
utilización de las masas peptídicas proteolíticas se llevó a cabo
con el programa Peptid Search Programm desarrollado en el grupo EMBL
Protein & Peptide Group
(http://www.mann.embl-heidelberg.de o
http://www.peptsearch.protana.com). El PeptidSearch utiliza un banco
de datos de proteínas no redundante, que contiene actualmente más
que 465.000 inscripciones. La identificación de las proteínas está
basada en la comparación del conjunto de masas peptídicas, que se
dedujeron experimentalmente de las proteínas aisladas, con las masas
teóricas deducidas enzimáticamente de los péptidos obtenidos
enzimáticamente de todas las secuencias de proteínas en el banco de
datos.
Los criterios de selección para cuartas partes
inflamadas subclínicamente de glándulas lácteas eran actividades de
LDH de más que 2 \mumol/sI, cómputos de células somáticas mayores
que 250.000 ml^{-1} y, en caso de que se hubieran determinado,
resultados bacteriológicos positivos. Con finalidades de comparación
se utilizaron sólo cuartas partes modificadas y no modificadas de la
misma ubre. Las cuartas partes de ubres examinadas de las vacas
escogidas se muestran en la Tabla 1.
| Vaca | Cuarta | Unidades de LDH | SCC | Microbiología |
| parte | \mumol/s I | |||
| 1 | 12,23 | 9.911.000 | ||
| 1 | n.d. | |||
| 2 | 1,21 | 30.000 | ||
| 1 | 19,19 | 5.784.000 | ||
| 2 | n.d. | |||
| 2 | 4,22 | 203.000 | ||
| 1 | 16,50 | 5.010.000 | ||
| 3 | n.d. | |||
| 2 | 1,67 | 29.000 |
| Vaca | Cuarta | Unidades de LDH | SCC | Microbiología |
| parte | \mumol/s I | |||
| 1 | 2,53 | 984.000 | ||
| 4 | Streptococcus spp. | |||
| 2 | 1,06 | 29.000 | ||
| 1 | 17,42 | 4.048.000 | ||
| 5 | Staphylococcus spp. | |||
| 2 | 1,58 | 162.000 | ||
| 1 | 28,11 | 7.697.000 | ||
| 6 | Streptococcus spp. | |||
| 2 | 2,86 | 50.000 | ||
| 1 | 5,21 | 1.436.000 | ||
| 7 | Staphylococcus spp. | |||
| 2 | 0,99 | 71.000 | ||
| n.d.: no determinada |
La diferencia más manifiesta en los modelos
obtenidos en 2D-PAGE es la aparición de 4 manchas en
las fracciones de suero lácteo, que se habían obtenido a partir de
cuartas partes inflamadas, comparadas con las que se obtuvieron de
los respectivos testigos internos. Estas manchas están situadas en
un peso molecular de 26 kDa a lo largo de un intervalo de pI (puntos
isoeléctricos) de 5,2 hasta 6,2 y en la Figura 1 están marcadas con
los números 1-4.
Las manchas 1-4, que se
recortaron a partir de los geles de 2D, proporcionan unos modelos,
por cromatografía así como por espectrometría de masas, de
composiciones de péptidos cortados con quimiotripsina (los modelos
de composiciones que se obtuvieron para las manchas 2 y 3 se
muestran en las Figuras 2 y 3). Una búsqueda en el banco de datos,
basándose en las masas de péptidos que se comprobaron, hizo posible
identificar las proteínas inequívocamente como prostaglandina D
sintasa del tipo de lipocalina (número de acceso 002853). Además,
los datos de espectrometría de masas permitieron comprobar que la
proteína madura comienza en el resto 39 de la secuencia del banco de
datos.
Al comparar los modelos de composición de
péptidos, que se obtuvieron a partir de las manchas 2 y 3, se pueden
detectar dos diferencias, tal como se señala por medio de las
flechas en la Figura 2 y en la Figura 3. Para la mancha 3 los
correspondientes péptidos se pueden asignar a los segmentos de
secuencia LLRPAGPPGCY y LRPAGPPGCY (véase la Figura 4). Los
correspondientes péptidos de la mancha 2 muestran una diferencia de
masas de -9 Da. Los espectros después de la extinción de la fuente
(del inglés
Post-Source-Decay-Spectra)
de los dos péptidos aislados mediante una RP-HPLC
hicieron posible asignar la modificación a un resto de cisteína en
la posición 76 de la proteína madura. La diferencia de masas de -9
Da corresponde a la diferencia entre una cisteína alquilada con
yodoacetamida y una cisteína oxidada para dar ácido sulfónico. Esto
coincide también con la observación de que el punto isoeléctrico de
la proteína modificada está desplazado hacia un valor ácido. La
modificación mediante yodoacetamida (mancha nº 3) aparece durante
las condiciones de electroforesis en gel en la segunda etapa de
equilibrado, mientras que, por el contrario, la cisteína oxidada
(mancha 2) ya se presenta, antes de la electroforesis bidimensional
en gel, como un derivado de ácido sulfónico. Puesto que la
introducción de un grupo de ácido sulfónico tiene una fuerte
influencia sobre el punto isoeléctrico de una proteína, las
diferentes cisteínas oxidadas pueden explicar la observación de
varias manchas en el gel con pesos moleculares muy parecidos pero
con valores de pI muy diferentes. Las diferentes manchas pueden ser
provocadas también, no obstante, por una modificación después de la
traducción, tal como ilustrativamente un modelo heterogéneo de
glicosilaciones.
Se llevaron a cabo transferencias de borrones
Western de secreciones de leche procedentes de cuartas partes de
ubres, que han sido modificadas diferentemente. Los anticuerpos
policlonales, utilizados para la transferencia de borrón, fueron
producidos contra la prostaglandina D sintasa procedente de un
esperma de vaca.
Para la comparación se hizo uso de respectivos
pares procedentes de la misma vaca. En el caso de las glándulas
lácteas enfermas se puede reconocer una manifiesta coloración en la
correspondiente posición, a la que se había aplicado el anticuerpo
monoclonal. En el caso de la vaca 1, la cuarta parte "sana"
estaba asimismo en vías de sufrir una inflamación, lo que muestra
que con el procedimiento conforme al invento ya se pueden reconocer
en un estadio muy temprano inflamaciones de las glándulas lácteas. A
fin de obtener una discriminación segura entre resultados positivos
(es decir glándulas inflamadas) y negativos (es decir glándulas
sanas), se puede establecer un valor de corte o/y se pueden medir
simultáneamente muestras de referencia.
Claims (11)
1. Procedimiento in vitro para la
detección de una inflamación,
caracterizado porque
se determinan cualitativa y/o cuantitativamente
la enzima prostaglandina D sintasa (PGDS) o fragmentos parciales de
la misma, y porque en el caso de la inflamación que se ha de
detectar se trata de una inflamación de las glándulas lácteas.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1,
para la detección de procesos inflamatorios en
seres humanos o animales.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2
para la detección de inflamaciones de las
glándulas lácteas de vacas.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque
se determinan la enzima prostaglandina D sintasa
(PGDS) o fragmentos parciales de la misma en una muestra de un
líquido corporal, en una muestra de heces o en una muestra de
leche.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4,
caracterizado porque
la muestra de un líquido corporal se escoge
entre un plasma y una orina.
6. Procedimiento de acuerdo con
una de las reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la determinación se lleva a cabo mediando
utilización de por lo menos un aptámero o/y un anticuerpo dirigido
contra la prostaglandina D sintasa.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6,
caracterizado porque
se utiliza un anticuerpo policlonal o/y
monoclonal.
8. Procedimiento de acuerdo con una de
las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizado porque
se utiliza un anticuerpo, que se puede obtener
mediando utilización de por lo menos uno de los péptidos PGDS1,
PGDS2 o/y PGDS3.
9. Procedimiento de acuerdo con una de
las reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque
la determinación se lleva a cabo por medio de un
inmunoensayo, en particular un ELISA en emparedado cuantitativo o
una transferencia de borrón Western.
10. Procedimiento de acuerdo con una de
las reivindicaciones anteriores,
caracterizado porque
la detección se efectúa con ayuda de una
espectroscopia de masas, en particular una
MALDI-TOF, o mediante una electroforesis en gel, en
particular una electroforesis bidimensional en gel.
11. Utilización de un aptámero o de un
anticuerpo dirigido contra la prostaglandina D sintasa (PGDS) para
la preparación de un agente destinado a la detección de
inflamaciones de las glándulas lácteas.
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