ES2365511T3 - Marcadores para células precancerosas y cancerosas y método para interferir con la proliferación celular. - Google Patents

Marcadores para células precancerosas y cancerosas y método para interferir con la proliferación celular. Download PDF

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Jaime E. Villegas
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Abstract

Moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano aislado que comprenden el ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5' al extremo 3' de un polinucleótido con una secuencia repetida invertida.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con la terapia del cáncer, el diagnóstico del cáncer y reactivos para la investigación en relación con una nueva familia de ARNs (Ácidos ribonucleicos) mitocondriales humanos, mencionados como ARNs quiméricos mitocondriales. Particularmente la invención concierne a oligonucleótidos dirigidos a los ARNs mitocondriales humanos quiméricos. Los oligonucleótidos de la invención hibridizan con los ARNs mitocondriales humanos quiméricos induciendo la muerte de las células cancerosas. Las composiciones y los métodos provistos en la invención son útiles como una nueva terapia del cáncer. Además, los oligonucleótidos pueden ser usados en el diagnóstico de células cancerosas y precancerosas basado en la expresión diferencial de los ARNs quiméricos mitocondriales en células normales en reposo y en proliferación, células precancerosas y cancerosas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Mitocondrias
Las mitocondrias son organelos subcelulares que sintetizan la adenosina trifosfato (ATP), molécula esencial para el metabolismo, mediante la fosforilación oxidativa. El ADN mitocondrial humano (ADNmt) de 16.654 pares de bases (pb) codifica dos ARN ribosomales (ARNr), 22 ARN de transferencia (ARNt) y 13 marcos de lectura (ORF) que codifican un número similar de polipéptidos (Clayton, 2000; Taanman, 1999). En base del contenido de bases G+T, las dos hebras del ADNmt difieren en su densidad de flotación* y pueden ser separadas en gradientes desnaturalizantes de cloruro de cesio. La hebra pesada (hebra H) codifica los dos ARN ribosomales (12S y 16S), 14 ARNt y 12 polipéptidos que corresponden a ND 1, ND 2, ND 3, ND4L, ND4, ND 5, COX I COX II, COX III, ATP6, ATP8 y Cyt b. La hebra liviana (hebra L) codifica 8 ARNts y la subunidad ND6 del complejo NAD deshidrogenasa (Clayton, 2000; Taanman, 1999).
Una alta proporción del ADNmt contiene una estructura corta de tres hebras llamada el lazo de desplazamiento o lazo D. Esta región, que en seres humanos tiene 1.006 pares de bases está limitada por los genes de los ARNts para fenilalanina (tARNPhe) y para prolina (tARNPro). Ella contiene una hebra corta de ácido nucleico, complementaria a la hebra L, que desplaza la hebra H (Clayton, 2000; Taanman, 1999). Esta región ha evolucionado como el sitio principal de control de la expresión de ADNmt, conteniendo el origen de la replicación de la hebra H, y los promotores principales de la transcripción de las hebras H (HSP) y L (LSP). A pesar de la cercanía de los sitios HSP y LSP (cerca de 150 pares de bases), estos reguladores son independientes funcionalmente tanto in vitro (Shuey y Atardi, 1985; Taanman, 1999) como in vivo, usando el modelo de pacientes con enfermedades mitocondriales (Chinnery y Turnbull, 2000).
Ambas hebras se transcriben como ARNs policistrónicos que son luego procesados para liberar los ARNms, ARNts y ARNrs (Taanman, 1999). En seres humanos la ARN polimerasa mitocondrial es una proteína de 1.230 aminoácidos con una homología significativa con la secuencia de la ARN polimerasa mitocondrial de levaduras y las ARN polimerasas de varios bacteriófagos (Tiranti y colab. 1997). Además, se ha caracterizado una familia de factores de transcripción tal como el factor A o TFAM, que es esencial para la transcripción del ADNmt de mamíferos y es un miembro de la familia de proteínas de alta movilidad (HMG-box) que se unen al ADN (Parisi y Clayton, 1991). Recientemente, dos informes independientes han descrito las características de nuevos factores de transcripción, TBF1M y TBF2M en seres humanos y ratones (McCulloch y colab., 2002; Falkenberg y colab., 2002; Rantanen y colab., 2003). A pesar del considerable progreso en los elementos involucrados en la transcripción del ADNmt, que actúan en cis y trans, los detalles funcionales no se conocen completamente.
Mitocondrias y Apoptosis.
Las mitocondrias cumplen un papel central en la apoptosis, un proceso fundamental por el cual las células mueren en un proceso controlado o programado. Este programa de suicidio celular es esencial durante el desarrollo y para la homeostasis de todos los metazoos. La apoptosis es activada para eliminar células superfluas, dañadas, mutadas
o envejecidas (Meier y colab., 2000). La desregulación de la apoptosis está implicada en la aparición de diversas patologías. Así la inhibición anormal de la apoptosis es la característica de las neoplasias, mientras que la apoptosis masiva se ha relacionado con enfermedades agudas tales como el infarto, shock séptico y enfermedades neurodegenerativas. Actualmente la apoptosis se describe basada en dos vías principales denominadas la vía extrínseca y la vía intrínseca (Zörnig y colab., 2001). La vía extrínseca corresponde a un proceso iniciado en la membrana celular por la unión de ligandos diferentes a los receptores de muerte celular (Krammer, 2000; Zörnig y colab., 2001).
Las caspasas son enzimas responsables de la cascada proteolítica en la apoptosis. Las caspasas son sintetizadas como proteínas precursoras inactivas que experimentan una maduración o proceso proteolítico durante la inducción de la apoptosis (Zörnig y colab., 2001). Sin embargo, hay diversas evidencias experimentales nuevas que indican que las proteasas lisosomales constituyen una ruta alternativa de proteolisis luego de daños apoptóticos (Guicciardi y colab., 2004).
Por otra parte se han descrito proteínas antiapoptosis, homólogas a la oncoproteína humana Bcl-2. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas que son anti apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) o pro-apoptosis (Bax, Bak, Bim, Bid, etc.) (Zörnig y colab., 2001).
Las mitocondrias son especialmente afectadas en forma temprana durante el proceso de apoptosis y actualmente son reconocidas como las coordinadoras centrales de la muerte celular (Boya y colab., 2003; Ferri y Kroemer, 2001; Zörnig y colab., 2001). Varias rutas de señales pro apoptóticas y de daño convergen en las mitocondrias induciendo la permeabilización de la membrana mitocondrial, fenómeno que está bajo el control de las proteínas Bcl-2 (Boya y colab., 2003; Zörnig y colab., 2001). Después que las células reciben daños apoptóticos, el potencial transmembrana (Ψm) se disipa resultando en una completa permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la consecuente salida de proteínas mitocondriales tóxicas. El primer ejemplo de la filtración de una proteína mitocondrial fue la liberación de citocromo c (Liu y colab., 2001). Al estar presente el citocromo c en el citosol, se induce el ensamblaje del complejo de activación de caspasas llamado apoptosoma. El citocromo c se une al Apaf-1 (Factor-1 de activación de proteasas apoptóticas) facilitando la unión de dATP/ATP al complejo y la oligomerización de Apaf-1 (Adrain y colab., 1999; Benedict y colab, 2000). La oligomerización de Apaf-1 permite el reclutamiento de procaspasa-9, la que cataliza activación proteolítica del precursor y la producción de caspasa-9 activa.(Adrain y colab., 1994; Benedict y colab., 2000).
Se ha descrito una familia de inhibidores citosólicos de las proteínas de la apoptosis que se conocen como XIAP, cIAP1 y c-IAP2. Dichas proteínas se unen, e inhiben a las caspasa-3 y la caspasa-9 deteniendo la cascada de degradación. Sin embargo las células contienen mecanismos para eludir esta ruta antiapoptótica. En células en apoptosis las caspasas se liberan de la barrera inhibitoria uniéndose a IAPs de una proteína conocida como Smac* (Segundo activador mitocondrial de caspasas) o DIABLO (Proteína que se une a IAP a pH bajo) (Verhagen y colab., 2002). Al unirse a IAPs, Smac/DIABLO desplazan las caspasas activas de las IAPs promoviendo la muerte celular. Otra proteína, conocida como HtrA2, se libera de la mitocondria al citosol después de un daño apoptótico, lugar donde se une a las IAPs en forma similar a Smac/DIABLO facilitando así la activación de las caspasas (Verhagen y colab., 2002; Martins y colab., 2001; Suzuki y colab., 2001; Hedge y colab., 2002).
El factor de inducción de apoptosis (AIF) es otro componente de la cascada apoptótica. Después de inducida la apoptosis, el AIF se traslada al citosol y al núcleo. En el núcleo, el AIF induce la condensación de la cromatina periférica y la fragmentación del ADN. El AIF también induce otras características de la apoptosis como la disipación de Ψm, y la exposición de fosfatidilserina (Zörnig y colab., 2001). Un factor que parece regular la actividad apoptótica de AIF es la proteína de shock térmico 70 (Ravagnan y colab., 2001). Otro factor mitocondrial que se traslada al núcleo igual que el AIF es la endonucleasa G o Endo G. En el núcleo, Endo G produce la fragmentación del ADN incluso en presencia de inhibidores de caspasas (Li y colab., 2001). Endo G puede actuar en forma similar a la CAD (ADNasa activada por caspasa), una nucleasa cuya activación depende críticamente de caspasas (Samejima y colab, 2001).
Cáncer y precáncer.
El cáncer es una enfermedad celular cuya particularidad única es la pérdida del control normal del ciclo celular, resultando en un crecimiento descontrolado, desdiferenciación y habilidad para invadir otros tejidos y crear metástasis. Carcinogénesis es el proceso por el cual una célula normal se transforma en una célula cancerosa. La carcinogénesis es un proceso de múltiples etapas que comienza con un incidente genético de iniciación, seguido durante la etapa de promoción, por la multiplicación selectiva de las células alteradas para formar adenomas tempranos. En ausencia de una contínua promoción, el adenoma revierte y desaparece. Con un segundo accidente genético, un pequeño grupo de adenomas promovidos continuamente progresan hasta formar adenomas tardíos, algunos de los cuales pueden sufrir la conversión maligna (McKinnell y colab., 1998).
La etiología del cáncer es compleja e incluye alteraciones de la regulación del ciclo celular, aberraciones cromosómicas y ruptura de cromosomas. Se piensa que agentes infecciosos como varios tipos de oncovirus, substancias químicas, radiaciones (ultravioleta o ionizantes) y desórdenes inmunológicos son las grandes causas de la carcinogénesis (McKinnell y colab., 1998).
Desde hace tiempo se ha propuesto que el cáncer está también relacionado con la disfunción mitocondrial. Una de estas teorías sugiere que la mutación mitocondrial puede ser la causa primaria de la transformación celular y del cáncer (Warburg, 1956; Carew y Wang, 2002). Se han descrito alteraciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) en cánceres hematológicos (Clayton y Vinograd, 1967) y en el cáncer mamario (Tan y colab., 2002; Parrella y colab.,
2001). También se han descrito mutaciones en varias regiones del ADNmt y deleciones en pacientes de cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, carcinoma hépatocelular, cáncer de esófago, cáncer renal, cáncer tiroideo y tumores encefálicos (revisión en Carew y Wang, 2002). En general, parece haber dos alteraciones características en el ADNmt en los distintos tipos de tumores. La mayoría de las mutaciones consisten en transiciones de bases de T a C y de G a A. En segundo lugar, aún cuando hay diversidad en los genes particulares en que ocurren las mutaciones, en la mayoría de los tipos tumorales, el asa D parece ser la región en que las mutaciones son más frecuentes en el ADNmt.
Las células precancerosas se definen aquí como células transformadas que pueden evolucionar o diferenciarse en células malignas. Algunos ejemplos de ellas son las células transformadas por el ADN o ARN de oncoviruses.
La presente invención se relaciona con una nueva familia de ARNs mitocondriales y el uso de dichos ARNs como blancos para el diagnóstico y la terapia del cáncer. La invención se refiere a las composiciones y los métodos que son útiles para diferenciar células normales de células tumorales o de células precancerosas o células transformadas por virus oncogénicos. En particular, como se detalla más adelante, la invención describe las composiciones y métodos para ensayos diagnósticos destinados a diferenciar células normales de células cancerosas y precancerosas. En otro contenido, la invención se refiere a las composiciones y métodos para inducir la muerte selectiva y masiva de las células tumorales. Por consiguiente la invención provee materiales y métodos que pueden ser usados en el diagnóstico y terapia del cáncer y precáncer y también en investigación.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida a composiciones y métodos útiles para detectar una nueva familia de ARNs mitocondriales humanos, mencionados como ARNs quiméricos mitocondriales, que se expresan diferencialmente en células normales en reposo y en proliferación, células precancerosas y cancerosas.
ARN quimérico mitocondrial sentido.
Un aspecto de esta invención consiste en proporcionar las composiciones y los métodos para detectar un ARN quimérico mitocondrial sentido compuesto por un repetido invertido de 815 nucleótidos unido covalentemente al extremo 5’ del ARN ribosómico mitocondrial 16S (SEQ ID NO 1, Figura 1 A). El repetido invertido corresponde a un fragmento de 815 nucleótidos del ARN transcrito desde la hebra L del gen de 16S del ADNmt. Por tanto, la síntesis de este nuevo ARN requiere la transcripción de la hebra L y la hebra H del gen de 16S del ADNmt. Como la transcripción de ambas hebras del ADNmt está regulada por diferentes promotores, en esta nueva invención nos referimos a este nuevo ARN como el ARN quimérico mitocondrial (SEQ ID NO 1). Además, como el repetido invertido de 815 nucleótidos se une al ARN 16S sentido (transcrito desde la hebra H) nos referimos a este nuevo ARN como el “ARN quimérico mitocondrial sentido”.
Esta invención aporta métodos y composiciones para detectar la expresión del ARN quimérico mitocondrial sentido en células cultivadas, muestras celulares y cortes de tejidos. La detección puede ser efectuada por hibridación in situ.
En otro aspecto de esta invención, pruebas de hibridación in situ revelan que el ARN quimérico mitocondrial sentido se expresa en células normales en proliferación, células tumorales en cultivo y en células tumorales presentes en biopsias de diferentes tipos tumorales humanos. El ARN quimérico mitocondrial sentido no se expresa en células normales en reposo proliferativo. Se describen métodos y composiciones para detectar un nuevo segundo ARN quimérico mitocondrial sentido en células transformadas por el virus del papiloma 16 o 18 (Hausen, 1996). En estas células transformadas se expresa un nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido compuesto por un repetido invertido de 754 nucleótidos unidos covalentemente al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S (SEQ ID NO2, Figura 1 B). Dicho ARN no está presente en células normales en proliferación ni en células tumorales. Los métodos y composiciones moleculares también demostraron un tercer ARN quimérico mitocondrial sentido, que comprende una secuencia invertida de 694 nucleótidos unidos covalentemente al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S (SEQ ID NO 3, Figura 1 C), que está presente en células transformadas por HTLV-1.
ARN quimérico mitocondrial antisentido.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones de moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano aislado que comprenden el ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5’ al extremo 3’ de un polinucleótido con la secuencia repetida invertida.
Las células normales en proliferación expresan ARNs quiméricos mitocondriales antisentido que corresponden a las SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6. Estos transcritos contienen repetidos invertidos de largo variable (transcritos de la hebra H) unidos al extremo 5’ del ARN 16S mitocondrial ribosomal antisentido (transcrito de la hebra L), de allí el nombre de ARN quimérico mitocondrial antisentido. La expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido está inhibida en cultivos de líneas celulares tumorales y también en células tumorales presentes en biopsias humanas de tipos de tumores diferentes y también en células transformadas o precancerosas. Por tanto, la invención presente provee métodos y composiciones para detectar la expresión de los ARN quimérico mitocondrial sentido y antisentido y así distinguir las células normales en proliferación de las células cancerosas y precancerosas, y por ende entrega un nuevo marcador para células precancerosas y cancerosas.
En este aspecto, la invención se relaciona con un método de detección seleccionado de:
(A) un método para distinguir entre células normales y células pre-cancerosas o cancerosas que comprende las etapas de:
determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 46, y
determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1;
(B) un método para distinguir entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células pre-cancerosas y células cancerosas, que comprende las etapas de:
determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 46, y
determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 2; y
(C) un método en el que células transformadas con virus ARN se distinguen de células cancerosas o células normales, que comprende la etapa de determinar el nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 3, y
en el que dichas etapas de determinación no se llevan a cabo in vivo.
Terapia del Cáncer
En otro contenido de esta invención, se proveen métodos y composiciones que interfieren con los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido. Un aspecto preferido consiste en interferir con el ARN quimérico mitocondrial antisentido en células tumorales que contengan un bajo número de copias de este transcrito. La interferencia es realizada usando oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos cuyas secuencias son complementarias a las secuencias del ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID NO 4 y/o SEQ ID NO 5 y/o SEQ ID NO 6). El tratamiento de células tumorales de diferentes tipos con uno o más de estos oligonucleótidos complementarios induce la muerte celular o la apoptosis. El tratamiento del cáncer y precáncer se lleva a cabo con compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 bases de longitud que son suficientemente complementarios a una molécula de ARN quimérico mitocondrial humano que comprende un ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5’ al extremo 3’ de un polinucleótido con una secuencia repetida invertida para poder hibridar con esa molécula de ARN quimérico mitocondrial humano para formar una pareja estable. Los oligonucleótidos son preferiblemente compuestos de 15 a 50 nucleótidos en que al menos 15 bases son complementarias a SEQ ID NO 4 y/o SEQ ID NO 5 y/o SEQ ID NO 6. En SEQ ID NOS 9 al 98 se muestran ejemplos de dichos oligonucleótidos complementarios. La inducción de la apoptosis es selectiva puesto que linfocitos humanos (célula en reposo proliferativo) o linfocitos humanos estimulados con fitohemaglutinina (células normales en proliferación) no sufren apoptosis después del tratamiento con oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ARN quimérico mitocondrial antisentido bajo las mismas condiciones experimentales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1 A, B y C. Esquemas que muestran la estructura del ARN quimérico mitocondrial correspondiente a las SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 y SEQ ID NO 3. Las fechas indican la posición relativa de los partidores utilizados para amplificar segmentos de ARN. Las flechas bajo las líneas son partidores reversos. Las flechas sobre las líneas corresponden a partidores directos. El partidor 1 está ubicado cercano al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S. Las líneas negras contínuas corresponden al ARN mitocondrial 16S sentido, mientras que las líneas punteadas corresponden al ARN mitocondrial 16S antisentido.
FIGURA 2. Electroforesis en gel de agarosa para mostrar el producto de amplificación obtenido entre el partidor 1 y el partidor 3 indicados en la Figura 1A. La amplificación se realizó por RT-PCR usando como molde células tumorales (SiHa), keratinocitos transformados por HPV 16 (HFK698) o linfocitos B transformados por HLTV-1. Con el ARN de células SiHa se obtuvo un solo amplicón de 210 pares de bases que corresponde a un segmento de la SEQ ID NO 1. En ARN total de keratinocitos transformados con HPV 16, además del amplicón de 210 pares de bases se obtuvo un segundo amplicón de 150 pares de bases que corresponde a un segmento de SEQ ID NO 2. Con ARN de células transformadas con HLTV-1, además de los amplicones de 210 pares de bases y de 150 pares de bases se obtuvo un tercer amplicón que corresponde a un fragmento de SEQ ID NO 3.
FIGURA 3. Esquemas que muestran la estructura del ARN quimérico mitocondrial correspondiente a las SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 Y SEQ ID NO 6. Las flechas indican la posición relativa de los partidores utilizados para amplificar segmentos de ARN. El partidor 1 está ubicado cercano al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S. La estrategia para obtener la secuencia de estos transcritos es similar a la descrita para la Fig. 1.
FIGURAS 4A y 4B. Ensayos de hibridación in situ realizados con varias líneas de células tumorales en cultivo. Las células fueron hibridadas con sondas oligonucleotídicas complementarias al ARN quimérico mitocondrial sentido marcadas con digoxigenina (columna izquierda). Adicionalmente, cortes paralelos de tumor fueron hibridizados con sondas oligonucleotídicas complementarias al ARN quimérico mitocondrial antisentido marcadas con digoxigenina (columna derecha).
FIGURA 5A. Hibridación in situ de secciones de biopsias humanas correspondientes a diferentes tipos tumorales. Las secciones de tumores se hibridizaron con sondas oligonucleotídicas complementarias al ARN quimérico mitocondrial sentido marcadas con digoxigenina (columna izquierda). Adicionalmente, secciones paralelas de los tumores se hibridizaron con sondas oligonucleotídicas complementarias al ARN quimérico mitocondrial antisentido marcadas con digoxigenina (columna derecha).
La Figura 5B corresponde a hibridación in situ de diferentes tumores humanos con sondas oligonucleotídicas complementarias al ARN quimérico mitocondrial sentido marcadas con digoxigenina.
FIGURA 6. Hibridación de células normales en proliferación. Las muestras fueron hibridizadas con sondas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial sentido o antisentido marcadas con digoxigenina. Se obtuvo una fuerte señal de hibridación con ambas sondas, una complementaria al ARN quimérico mitocondrial sentido (columna izquierda) y la otra al ARN quimérico mitocondrial antisentido (columna derecha). Los tejidos y células están identificados a la izquierda.
FIGURA 7. Inmunocitoquímica e hibridación in situ que muestra los cambios de expresión en linfocitos estimulados a proliferar con el mitógeno PHA. Después de 48 horas de estimulación con PHA, los linfocitos expresan los antígenos Ki-67 y PCNA (columna derecha). Estos antígenos no se expresan en los linfocitos control o en reposo (columna izquierda). La hibridación in situ fue efectuada con sondas oligonucleotídicas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial sentido y antisentido, marcadas con digoxigenina. Los linfocitos estimulados expresan tanto el ARN quimérico mitocondrial sentido como el ARN quimérico mitocondrial antisentido (columna derecha)
FIGURA 8. Hibridación in situ de células tumorales mostrando la localización del ARN quimérico mitocondrial sentido en el nucléolo. Las células o los cortes de tumor se individualizan a la izquierda.
FIGURA 9. Microscopía fluorescente que revela los cambios que ocurren en células de tumor HL-60 tratadas con oligonucleótidos dirigidos a ARN quimérico mitocondrial antisentido. A, B, C y D muestran la tinción con un compuesto (VAD-fmok) que se une con gran afinidad a caspasas activadas. Este compuesto está marcado con fluorosceína. Las sondas de oligonucleótidos dirigidas al ARN quimérico mitocondrial antisentido inducen la activación de caspasas de manera similar a la droga estaurosporina (compare B con C). No se detectan caspasas activadas en células control no tratadas (A) o en células tratadas con sondas de oligonucleótidos dirigidas al ARN mitocondrial 12S (D), como control. E y F muestran la tinción de células HL-60 con DAPI. Células controles (no tratadas) muestran una tinción homogénea del núcleo (E), en tanto que las células tratadas con sondas de oligonucleótidos dirigidas al ARN quimérico mitocondrial antisentido muestran extensa fragmentación del núcleo (F).
FIGURA 10 Porcentaje de células apoptóticas después de diferentes tratamientos de linfocitos en reposo y proliferando. La apoptosis fue medida en linfocitos en reposo o estimulados con PHA mediante tinción con DAPI. Las barras 1 y 2 corresponden a células no tratadas. Se observa un bajo nivel de apoptosis espontánea de células control (1) o linfocitos estimulados por PHA (2). Un nivel similar de apoptosis se observa en linfocitos en reposo (3)
o estimulados por PHA (4) tratados con sondas de oligonucleótidos 15 µM dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido durante 15 h, revelando que la apoptosis no es inducida en células normales. Como control, linfocitos en reposo proliferativo o en proliferación fueron tratados con estaurosporina. En estas condiciones cerca del 90% de los linfocitos en reposo proliferativo (5) o estimulados por PHA sufren apoptosis.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La familia de los ARN quiméricos mitocondriales La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las células humanas expresan una familia de nuevos ARN mitocondriales, llamados ARN quiméricos mitocondriales.
Uno de estos transcritos contiene un largo repetido invertido de 815 nucleótidos unido covalentemente al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S, y denominado ARN quimérico mitocondrial sentido. Esta larga secuencia invertida es totalmente complementaria al ARN ribosomal 16S desde la posición 51 hasta la 866, formando un largo tallo y un lazo de 50 nucleótidos. Como se ve en la Figura 1A el tallo formado por 815 pares de bases representa un grave problema para que una transcriptasa reversa pueda sintetizar el ADNc correspondiente. Por lo tanto se usó una nueva estrategia para amplificar este ARN por RT-PCR la que está ilustrada en la Figura 1A. Después de obtener la secuencia de cada fragmento traslapado, éstas se ensamblaron como secuencias contiguas para obtener la secuencia completa del ARN quimérico mitocondrial sentido mostrado en SEQ ID Nº 1 (Fig. 1A)
Otro aspecto de esta invención es el descubrimiento de otros nuevos ARNs quiméricos mitocondriales sentido que se expresan en células transformadas por el virus oncogénico de papiloma humano 16 o 18 (HPV16-HPV18). Se infectaron queratinocitos de prepucio humano (HFK) con el virus de papiloma humano 16 o 18 (Hausen, 1996). La infección produce la transformación o inmortalización de las células HFK. Sin embargo, estas células no son tumorigénicas como las células relacionadas SiHa (infectadas con HPV16) o las células HeLa (infectadas con HPV 18). Estas células expresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID NO 1) similar al de las células SiHa y HeLa. Sin embargo, las células transformadas adicionalmente expresan otro ARN mitocondrial sentido que contiene una secuencia invertida de 754 nucleótidos unidos al ARN ribosomal 16S (Fig 1 B) (SEQ ID NO 2). Este nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido es inhibido o no expresado en células normales humanas (HFK) o en células tumorigénicas (SiHA or HeLa).
En otro contenido de esta invención determinamos la expresión de un tercer ARN quimérico mitocondrial sentido en células transformadas con HTLV-1 (Kobayashi y colab., 1984). Células MT-2 infectadas con HTLV-1 expresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID NO 1) y el ARN quimérico mitocondrial sentido expresado en las células transformadas con HPV 16 o 18 (SEQ ID NO 2). Además de estos transcritos, la célula infectada con HTLV1 expresa un tercer tipo de ARN quimérico mitocondrial sentido que contiene una secuencia repetitiva de 694 nucleótidos unida al extremo 5’ del ARN ribosomal 16S. Este nuevo ARN (Fig. 1C) (SEQ ID NO 3) no se expresa en células normales en proliferación, ni en células tumorales ni en células transformadas por HPV 16 o 18.
Las células normales en proliferación, tal como los queratinocitos de prepucio humano (HFK) descritos en la sección anterior, también sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (Figura 6) (SEQ ID N°1). Los linf ocitos humanos estimulados con mitógenos como la fitohemaglutinina (PHA) entran en fase S del ciclo celular y comienzan la síntesis de ADN (Yu y colab., 1991). Como células en proliferación, los linfocitos también expresan antígenos relacionados a la proliferación tal como Ki-67 y antígenos nucleares de proliferación celular o PCNA (Bantis y colab., 2004). Los linfocitos estimulados también sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID N° 1). Otras células en proliferación, como los linfocitos en el centro germinal del bazo, espermatogonias y células embrionarias, también sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID N° 1) (Figura 4). En oposición, las células que no están proliferando tales como linfocitos no estimulados o células musculares no expresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (Figura 7).
Otro contenido de la invención, aporta métodos para distinguir células en proliferación normal de células tumorales. Como fue descrito anteriormente, las células tumorales y las células normales en proliferación sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido descrito en SEQ ID N°1. Además, en situaciones específicas de infecci ón con HPV y HTLV-1, se encuentran otros ARN quiméricos (SEQ ID N° 2 y SEQ ID N° 3). Sin embargo, la actual invención se basa también en el sorprendente descubrimiento que las células normales en proliferación también sobreexpresan un ARN quimérico mitocondrial antisentido. La expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido se confirmó en linfocitos humanos estimulados con PHA (Figura 7), en células HFK normales y en otras células normales en proliferación (Figura 6). Otro descubrimiento importante de la presente invención consiste en que, a diferencia de las células normales en proliferación las células tumorales no expresan ARN quimérico mitocondrial antisentido o inhiben marcadamente su producción (compare la Figura 4 con las Figuras 6 y 7).
Usando la misma estrategia descrita anteriormente para amplificar el ARN quimérico por RT-PCR, basada en fragmentos traslapados, se pudo determinar la estructura del ARN quimérico mitocondrial antisentido (Figura 3). La secuenciación y ensamblaje en secuencias contiguas revela una compleja familia de ARNs quiméricos mitocondriales antisentidos que contienen secuencias invertidas de largos diferentes unidas al extremo 5’ del ARN ribosomal mitocondrial 16S (Figuras 3A, 3B y 3C) (SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6). La secuencia revela también la formación de estructuras de dos hebras o tallos en esos ARNs y la formación de lazos de 17, 96 y 451 nucleótidos respectivamente (Figuras 3A, B y C. SEQ ID N°4, SEQ ID N°5, SEQ ID N°6).
Otro contenido de la invención es el aporte de métodos y composiciones para seguir la transformación oncogénica de células por un virus oncogénico. Células HeLa (infectadas con HPV 18) o células SiHa (infectadas con HPV 16) sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido pero inhiben la expresión de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido. Por otra parte, las células HFK en proliferación normal sobreexpresan tanto el ARN quimérico mitocondrial sentido como los antisentidos. Después de transformar las células HFK con HPV 16 o HPV 18 ellas adquieren el fenotipo tumoral: sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido. La sobreexpresión del ARN quimérico mitocondrial sentido y la inhibición del ARN quimérico mitocondrial antisentido pueden ser determinadas por hibridación in situ, amplificación del ARN por RT-PCR u otros métodos para determinar un ARN mediante técnicas conocidas por personas expertas en estas artes. Estos métodos y composiciones pueden ser usado para determinar el cambio en la expresión de la familia de ARNs quiméricos en células transformadas por otros virus oncogénicos o por compuestos que inducen la transformación o carcinogénesis (McKinnell y colab. 1998).
Diagnóstico de Cáncer y Precáncer
En la presente invención se aportan los métodos y composiciones para detectar la presencia del ARN quimérico mitocondrial sentido y de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido. Una aspecto preferido es realizar la detección por hibridación in situ. La detección del ARN quimérico mitocondrial sentido y del ARN quimérico mitocondrial antisentido en las células de una muestra biológica indica que son células normales en proliferación. En otro contenido, el resultado de la hibridación in situ con células tumorales mostrará la expresión del ARN quimérico mitocondrial sentido y la inhibición o ausencia del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Si la muestra biológica contiene células normales sin proliferar, la hibridación in situ mostrará que ni el ARN quimérico mitocondrial sentido ni el ARN quimérico mitocondrial antisentido se expresan.
Se entiende por muestra biológica, células normales (en reposo proliferativo o células en proliferación) en cultivo o en extendidos de sangre o de médula ósea, células tumorales en cultivo y células normales transformadas por un virus oncogénico. Además, las muestras biológicas incluyen células obtenidas de la orina o lavados de la vejiga de pacientes en que se sospecha la presencia de cáncer renal o vesical, o células de la saliva de pacientes en que se sospecha la presencia cáncer de la cabeza o cuello o células de lavado broncoalveolar de pacientes en que se sospecha la presencia de cáncer pulmonar. Además, las muestras biológicas incluyen extendidos de sangre de pacientes en que se sospecha la presencia de leucemia o extendidos celulares de sangre o linfa y de nódulos linfáticos de pacientes en que se sospecha la presencia de metástasis.
Las muestras biológicas en la invención incluyen el uso de tejidos congelados rápidamente o preparados de células para análisis histopatológico, técnica muy conocida por aquéllos con experiencia en ese campo de la técnica. Alternativamente las muestras biológicas incluyen las biopsias de secciones fijadas mediante un tratamiento químico que puede ser realizado por una amplia gama de protocolos de fijación conocidos en la técnica (Frederick y colab. 1995; Celis, 1994). Las muestras biológicas pueden ser también materiales biológicos sin fijar que no han sido modificados químicamente o tratados con formalina u otro fijador conocido en la técnica.
Alternativamente, se puede efectuar la hibridación in situ usando muestras biológicas embebidas en materiales como parafina sólida u otros polímeros. Los bloques obtenidos pueden ser seccionados en cortes de 4 a 10 m de espesor mediante un micrótomo. La sección se adhiere a una lámina de vidrio o plástico mediante un adhesivo conocido como polilisina o la proteína adhesiva de cholga (Burzio y colab., 1997)
La hibridación in situ de la presente invención puede ser realizada de diversas maneras conocidas por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo se pone en contacto en condiciones de hibridación una solución que contenga una o más sondas marcadas, dirigidas a una o más de las secuencias del ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3) o al ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6) ubicadas dentro de las células. Luego se compara la señal de hibridación con patrones establecidos de células normales o controles de células cancerosas y precancerosas.
Como se usan aquí, las sondas marcadas utilizadas en la hibridación in situ son ARN, ADN o ácidos nucleicos sintéticos que pueden ser preparados por cualquier método conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos sintéticos incluyen ribosondas transcritas in vitro o fragmentos de PCR. En un aspecto preferido de esta invención se puede usar oligonucleótidos complementarios sintéticos. Las sondas de oligonucleótidos complementarios son de al menos 10 nucleótidos de largo, preferentemente de al menos alrededor de 14 y muy preferentemente de al menos 18 nucleótidos de largo. El técnico competente comprende que el largo puede extenderse desde 10 o más nucleótidos hasta cualquier largo que aún permita la hibridación con los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido. En una forma preferida el largo es de alrededor de 30 nucleótidos, más preferida de alrededor de 25 nucleótidos y muy preferida de entre 10 a 50 nucleótidos de largo. También pueden usar como sondas ácidos nucleicos más largos. Las secuencias de la sonda son al menos noventa y cinco por ciento homólogas a las secuencias registradas en SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5 y SEQ ID N°6.
Las sondas de oligonucleótidos complementarios de la invención actual generalmente contienen uniones fosfodiéster, aunque en algunos casos se incluyen sondas de oligonucleótidos análogos que pueden tener uniones internucleótidos alternativas que incluyen pero no se limitan, a uniones fosforotioato (Mag y colab., 1991; y U.S. Pat. No 5.644.048), péptido de ácido nucleico o PNA (Egholm, 1993; y U.S. Pat. No. 6,656,687), fosforamida (Beaucage, 1993), fósforoditioato (Capaldi y colab., 2000). Otros análogos de oligonucleótidos complementarios se comprenden pero no se limitan a morfolino (Summerton, 1999), oligonucleótidos bloqueados (Wahlested y colab., 2000), ácidos nucleicos peptídicos o PNA (Nielsen y colab., 1993; Hyrup y Nielsen, 1996) u oligonucleótidos modificados por 2-o(2-metoxi) etil en los terminales 5’ y 3’ (McKay y colab., 1999). Los ácidos nucleicos pueden contener cualquiera combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos y cualquiera combinación de bases incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc.
En otro contenido de la invención las sondas de ácidos nucleicos o de oligonucleótidos deben ser marcadas para detectar la hibridación con ARNs quiméricos mitocondriales sentido o ARNs quiméricos mitocondriales antisentido. Estas sondas pueden ser marcadas con un marcador detectable por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de marcación incluyen utilización de cebadores al azar, marcaje de 3’ terminal, PCR y nick translation. La marcación enzimática se realiza en presencia de polimerasa de ácido nucleico, de tres nucleótidos no marcados y de un cuarto nucleótido que está directamente marcado o que contiene un brazo al que puede ser unido un marcador, o se conecta a un hapteno o a otra molécula a la cual se pueda unir una molécula marcada. Los marcadores adecuados pueden ser marcadores radioactivos como .P32, H3 y S35 y marcadores no radiactivos como marcadores fluorescentes. Los fluorocromos (fluoróforos) preferidos incluyen 5(6)-carboxilfluoresceína, ácido 6-((7amino-4-metilcumarina-3-acetil)amino) hexanoico, 5(y 6)-carboxi-X-rodamina, colorante ciano-derivado 2 (Cy2), colorante ciano-derivado 3 (Cy3), colorante ciano-derivado 3.5 (Cy3.5), colorante ciano-derivado 5 (Cy5), colorante ciano-derivado 5.5 (Cy5.5), colorante ciano-derivado 7 (Cy7), colorante ciano-derivado 9 (Cy9) (los colorantes cianoderivado 2, 3 3.5, 5 y 5.5 están disponibles como ésteres NHS en Amersham, Arlington Heights. Illinois) o los colorantes Alexa que comprenden Alexa 488, Alexa 532, Alexa 556, Alexa 590, etc. (Molecular Probes, Eugene, Oregon).
Las sondas pueden ser marcadas indirectamente incorporando un nucleótido unido covalentemente a un hapteno u otra molécula. Los haptenos de preferencia, sin estar limitados a ellos, son la 5(6)-carboxifluorosceína, 2,4 dinitrofenil, digoxigenina y biotina, y efectuando la detección de la sonda con un anticuerpo marcado, dirigido a dicho hapteno o a otra molécula. En el caso de la biotina, la detección puede ser efectuada con avidina o estreptavidina conjugada a una marca detectable. Los anticuerpos, la estreptavidina o avidina pueden ser conjugadas a un marcador fluorescente o a un marcador enzimático como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano para hacerlas detectables. La estreptavidina o avidina conjugada y anticuerpos anti-digoxigenina están disponibles comercialmente en compañías tales como Vector Laboratories (Burlingame, California) and Boehringer Mannheim (Indianapolis, Indiana). Otra posibilidad es conjugar anticuerpos o astreptavidina con reactivos que permiten emisiones mejores y más estables (quantum dot, Wu y colab., 2003).
Las enzimas conjugadas a anticuerpos y estreptavidina pueden ser detectadas en una reacción colorimétrica agregando el substrato a la enzima. En presencia de varios substratos, se producen diferentes colores por la reacción, colores que pueden ser visualizados para detectar sondas múltiples por separado. Cualquier substrato conocido en la técnica puede ser utilizado. Los substratos preferidos para la fosfatasa alcalina incluyen el 5-bromo4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) y el nitro azul de tetrazolio (NBT). Los substratos preferidos para la peroxidasa de raíz de rábano es el diaminobenzoato (DAB). Los expertos en la técnica comprenden que también pueden ser usadas otras actividades enzimáticas.
Otro contenido de la presente invención es la descripción de las condiciones para efectuar la hibridación in situ y lograr resultados precisos y repetibles. Los expertos en la técnica reconocerán que los factores controlados comúnmente para vigilar la rigurosidad de la hibridación incluyen la concentración de formamida u otro agente desnaturalizante, la concentración de sales, la fuerza iónica, la temperatura de hibridación, la concentración de detergente, el pH y la presencia o ausencia de agentes caotrópicos. Estos factores pueden ser modulados para así controlar la rigurosidad de la hibridación de los oligonucleótidos sonda para el ARN quimérico. El grado óptimo de exactitud para un ensayo puede ser determinado experimentalmente examinando cada factor hasta que se alcanza el grado deseado de discriminación.
Otras condiciones que deben ser controladas para una hibridación in situ óptima son por ejemplo, el uso de reactivos químicos para bloquear la unión inespecífica de la sonda a los componentes químicos presentes en las muestras biológicas, además de los ARN quiméricos. Los agentes bloqueadores incluyen pero no se limitan a, ARN, ADN y oligonucleótidos sin marca. El agente bloqueador incorporado en la solución de hibridación suprimirá la unión inespecífica de la sonda marcada y por ende aumentará la razón señal ruido del ensayo. En un diferente aspecto de la invención la sonda tiene una secuencia complementaria a la secuencia de ARN quimérico mitocondrial sentido o antisentido (ver SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, S EQ ID N°4, SEQ ID N°5 y SEQ ID N°6)
La fijación de la muestra biológica es también un aspecto importante de la hibridación que debe ser determinado experimentalmente. Los fijadores que producen gran cantidad de entrecruzamientos, como el glutaraldehído, no se recomiendan porque pueden bloquear el acceso de la sonda al ARN quimérico mitocondrial sentido o al ARN quimérico mitocondrial antisentido. El método preferido en esta invención es la fijación de la muestra biológica con formalina, aunque también se prefieren las muestras congeladas. Para exponer a la sonda a los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y el ARN quimérico mitocondrial antisentido pueden usarse procedimientos adicionales. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser digerida con proteinasa K para eliminar las proteínas que pueden bloquear el acceso de la sonda a los ARNs quiméricos mitocondriales. El tratamiento de las muestras biológicas con proteinasa K u otras proteasas antes de la hibridación in situ es bien conocido por los expertos en la técnica.
Como se describió previamente, la presencia de secuencias repetidas invertidas largas en el ARN quimérico y en los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido, inducen la formación de estructuras estables de dos hebras. Estas estructuras junto con las estructuras secundarias de la región de hebra única del ARN quimérico pueden constituir barreras al acceso de la sonda a los ARNs quiméricos. Por tanto, en otro aspecto de la invención, la muestra biológica es tratada con 0,2 M HCl por 10 min a temperatura ambiente para desnaturalizar el ARN quimérico. Luego la muestra es rápidamente neutralizada mediante varios lavados de la muestra con una solución tampón a pH 7,4 antes de aplicar el protocolo de hibridación descrito aquí. Sin más ayuda que la experimentación de rutina y el descubrimiento entregado aquí, los versados en la técnica pueden fácilmente determinar condiciones de hibridación adecuadas para efectuar ensayos que utilicen los métodos y especies químicas descritas más arriba. Las condiciones de hibridación in situ adecuadas son las condiciones adecuadas para efectuar un procedimiento de hibridación in situ. Por tanto las condiciones de hibridación adecuadas serán evidentes usando el descubrimiento y las referencias expuestos aquí; con o sin experimentación adicional de rutina.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona con la localización de los ARNs quiméricos mitocondriales sentido, la cual puede tener información importante para el pronóstico y manejo del paciente con cáncer. En células tumorales, el ARN quimérico mitocondrial sentido se encuentra principalmente en el citoplasma en estrecha asociación con endosomas tardíos y lisosomas. Sin embargo, en ciertas células se presenta localizado en el nucléolo. En células tumorales presentes en biopsias humanas la señal de hibridación revela que el ARN quimérico mitocondrial sentido está sólo en el citoplasma o en citoplasma y el nucléolo o en el citoplasma y el núcleo. Por lo tanto las diferentes localizaciones pueden tener un valor pronóstico importante. En un contenido preferido, un panel de biopsias por ejemplo tumores de mama, colorrectales o de la próstata pueden ser estudiados por hibridación in situ para detectar el ARN quimérico. Junto con una señal positiva de hibridación (independiente de la marca de la sonda), la localización intracelular (sólo citoplasma, citoplasma y núcleo o citoplasma y nucléolo) debe ser establecida en cada tumor y los resultados comparados con la sobrevida de cada paciente.
En otro aspecto de esta invención, la mezcla de células individuales que contenga células normales y/o células tumorales puede ser sometida a hibridación en suspensión con sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos y complementarias al ARN quimérico mitocondrial sentido o al ARN quimérico mitocondrial antisentido. Por ejemplo la sonda o sondas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial sentido puede ser marcada con rodamina, y la sonda o sondas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial antisentido pueden ser marcadas con Alexa 488. Después de la hibridación y lavados bajo las condiciones anteriormente descritas, las células pueden ser analizadas por citometría de flujo de marcas intracelulares.
El contenido preferido de la invención es usar la hibridación in situ puesto que la información obtenida acerca de la localización específica del ARN quimérico en la célula tumoral aporta información importante adicional al pronóstico.
En otro aspecto de la invención, se considera el uso de métodos moleculares alternativos para detectar la expresión del ARN quimérico en células normales, y la expresión diferencial del ARN quimérico sentido y antisentido en células normales, precancerosas y cancerosas. Estos métodos alternativos incluyen, pero no se limitan a, Northern blot, hibridación en gota, microarreglos de oligonucleótidos para ARNs quimérico sentido y antisentido, amplificación del ARN por RT-PCR, amplificación del ARN mediada por transcripción in vitro o TMA, S1 o ensayos de protección de ribonucleasa, etc.
En un aspecto de la presente invención, el ARN quimérico mitocondrial sentido puede ser detectado con fines diagnósticos con una sonda obtenida por amplificación de una región que contiene parte del extremo 5’ del ARN ribosomal 16S y una región parcial o total de la región de la secuencia invertida. Como se muestra en la Figura 1, el cebador inverso puede ser por ejemplo el partidor 1 (SEQ ID NO 139) y los cebadores directos pueden ser los partidores 3, 4, 5, 6 o 7 (SEQ ID NOS 129, 116, 106, 102, 63). También se pueden usar partidores localizados en otras posiciones y que pueden ser fácilmente diseñados por expertos en la técnica. En otro aspecto de la invención, también pueden ser utilizados ADNc sintetizados por una enzima con actividad de transcripción reversa y partidores al azar como hexámeros o más largos, procedimiento familiar a los versados en la técnica.
Los amplicones de 210, 350, 500 u 800 pares de bases obtenidos, o de otros largos resultantes de usar partidores colocados en otras posiciones pueden ser detectados por electroforesis en gel de agarosa o gel de poliacrilamida (Sambrook et el., 1989) y teñidos con bromuro de etidio u otro colorante intercalante. Los amplicones pueden ser purificados según las intrucciones de los fabricantes.
La detección del ARN quimérico mitocondrial puede ser realizada por análisis de Northern blot (Sambrook y colab., 1989). Después de separar los ARNs en un gel de agarosa los fragmentos son transferidos a una membrana (de nitrocelulosa o de Nylon) por procedimientos conocidos a los expertos en la técnica (Sambrook y colab., 1989). Para analizar la membrana, se puede amplificar un fragmento de 250 pares de bases que corresponde a las posiciones 1000 a 125 de ARN quimérico mitocondrial sentido. El amplicón es purificado (Wizard, Promega) según las instrucciones del fabricante y se utilizan 10 ng como molde para una segunda amplificación. La amplificación se efectúa con la mezcla estándar de PCR (Invitrogen) mas 5 micro Curie de 32P-α-dCTP (Amersham). El fragmento de amplificación radiactivo es desnaturalizado por incubación a 95° por 10 minutos y la sonda desnaturali zada se agrega a la mezcla de hibridación. Las membranas son hibridizadas durante 16 horas a 65°C y después l avadas dos veces con tampón SSC doble concentración, dos veces con SSC 0,5 a 60° y SSC 0,2 a 45°C (Sambrook y colab., 1989). Después de los lavados la membrana se expone a película para rayos-X durante la noche a –70°C. La señal de hibridación en la membrana corresponde al componente mayor de cerca de 2.400 nucleótidos que es el tamaño correspondiente al ARN ribosomal 16S (1559 nucleótidos) más la secuencia invertida de 815 nucleótidos.
En otro aspecto de esta invención, parte del ARN quimérico mitocondrial sentido puede ser detectado después de digestión por ribonucleasa del ARN total extraído de células o tejidos. La estructura de dos hebras o tallo del ARN quimérico mitocondrial sentido es resistente a la digestión con ribonucleasa A. El ARN total de células o tejidos extraído por TRIzol(Invitrogen) se disuelve en un pequeño volumen de SSC doble concentración. La solución se incuba con Ribonucleasa A (Sigma) a una concentración final de 50 microgramos por ml. Después de 30 min a 25°C, el ARN resistente a la ribonucleasa es extraído con TRIzol y precipitado con isopropanol a –20°por la noche. El ARN resistente a la nucleasa se disuelve en agua destilada tratada con DEPC y usado como molde para amplificación por RT-PCR. La amplificación, realizada con partidores dirigidos a las posiciones 55 y 790 del ARN ribosomal 16S produce un fragmento de alrededor de 730 pares de bases con una secuencia que exhibe un 100% deidentidadconlasecuenciadeltallodelARNquiméricomitocondrialsentido(SEQIDN°1). Encontraste,lahebra simple del ARN quimérico correspondiente a la mitad 3’, o el ARN 12S mitocondrial ribosómico o el ARNm para GAPDH son totalmente digeridos por el tratamiento con ribonucleasa A por lo que no se obtienen productos de amplificación cuando se usan partidores dirigidos a estos ARNs.
En otro aspecto de esta invención, el tallo del ARN quimérico mitocondrial sentido obtenido por el tratamiento del ARN total con ribonucleasa A puede ser detectado por Northern blot. El ARN resistente a nucleasa y recuperado de la extracción con TRIzol y precipitación en isopropanol se separa por electroforesis en gel de agarosa. Después de la transferencia, la membrana es tratada con la sonda descrita más arriba y usada para realizar un Northern blot (Sambrook y colab., 1989).
En un contenido adicional, esta invención está dirigida a estuches o kits de diagnóstico adecuados para realizar un ensayo de detección del ARN quimérico mitocondrial sentido o el ARN quimérico mitocondrial antisentido en muestras biológicas. Se han descrito aquí la composiciones y métodos generales y preferidos adecuados para la detección del ARN quimérico mitocondrial sentido y del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Se enumeran, aunque sin limitarse a ellas, las secuencias de sondas de oligonucleótidos. Además, aquí se describen los métodos adecuados para usar sondas de oligonucleótidos o conjunto de sondas de oligonucleótidos de un kit o estuche para detectar los ARNs quiméricos sentido o los ARNs quiméricos antisentido.
El estuche o kit de esta invención comprende una o más sondas de oligonucleótidos y otros reactivos o composiciones seleccionadas para realizar la hibridación in situ usada para detectar ARN quimérico mitocondrial sentido y ARN quimérico mitocondrial antisentido en una muestra. Cada conjunto de dos o mas sondas de oligonucleótidos son preferentemente marcados con especies detectables independientemente de modo que en una célula individual de la muestra biológica se puedan detectar el ARN quimérico mitocondrial sentido y el ARN quimérico mitocondrial antisentido. En un contenido preferido, las sondas de oligonucleótidos del estuche o kit, que se usan para detectar ARN quimérico mitocondrial sentido o el ARN quimérico mitocondrial antisentido están marcados cada una con un hapteno diferente. El hapteno puede ser biotina, digoxenina o fluorosceína, los que pueden ser reconocidos por el método de hibridación in situ con anticuerpos o con estreptavidina marcada con diversas enzimas (p. ej. fosfatasa alcalina o peroxidasa). Alternativamente cada sonda de oligonucleótido de cada conjunto de sondas puede ser marcada con colorantes fluorescentes detectables independientemente. Por ejemplo el conjunto de sondas para detectar ARN quimérico mitocondrial sentido puede ser marcado con rodamina mientras que el conjunto de sondas para detectar el ARN quimérico mitocondrial antisentido puede ser marcados con Alexa
488. Además, se describen los métodos para determinar la localización del ARN quimérico sentido y el ARN quimérico antisentido en células de la muestra biológica. Adicionalmente, pueden usarse las composiciones y los métodos de la invención para determinar la colocalización del ARN quimérico sentido y el ARN quimérico antisentido con marcadores específicos de los diferentes organelos celulares usando el análisis por microscopía confocal.
Las composiciones y métodos provistos aquí se consideran particularmente útiles para la detección y diagnóstico del cáncer y precáncer. El término cáncer incluye células afectadas por cualquiera de las siguientes condiciones anómalas. Estas incluyen leucemia mieloide aguda o crónica, leucemia linfoblástica aguda o crónica, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma de origen no Hodgkin o linfoma maligno; carcinoma gástrico, carcinoma esofágico o adenocarcinoma, adenocarcinoma del conducto pancreático, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, adenocarcinoa del intestino delgado, carcinomas colorrectales; carcinoma hepatocelular; adenoma hepatocelular; carcinoides del tracto urogenital* como adenocarcinoma renal, tumor de Wilm, carcinoma de vejiga urinaria y uretra y adenocarcinoma prostático, cánceres testiculares como seminoma, teratoma, teratocarcinoma, carcinoma de células intersticiales, carcinoma endometrial carcinoma cervical de útero, carcinoma ovárico, carcinoma de vulva y vagina, tumores de células de Sertoli y Leydig, melanoma y carcinoma de trompas de Falopio; carcinomas alveolar y bronquiolar de pulmón; tumores encefálicos; melanoma maligno de la piel, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y sarcoma de Karposi. Además fibrosarcoma, angiosarcoma y rabdomiosarcoma cardíacos, y otras enfermedades tumorales familiares a los expertos en la técnica.
Terapia del cáncer y precáncer.
Las drogas de la quimioterapia pueden inducir una serie de respuestas celulares que impactan en la proliferación y sobrevida tumoral. La más estudiada de estas respuestas celulares es la apoptosis y es evidente actualmente que las drogas anticáncer pueden matar a las células tumorales activando rutas apoptóticas comunes. Desafortunadamente estas drogas también afectan células normales en división rápida tales como las de la médula ósea, células hematopoiéticas normales y células intestinales y queratinocitos de la matriz de los cabellos (McKinnell y colab., 1998; Komarov y colab., 1999; Johnstone y colab., 2002).
Por otra parte, muchas células tumorales tienen mutados factores de iniciación de apoptosis, factores de regulación de apoptosis y factores de ejecución de apoptosis lo que explica por qué células tumorales de diferentes tipos de cáncer se hacen resistentes a una variedad de drogas quimioterapéuticas y radiaciones. Se han descrito mutaciones de factores de la vía intrínseca, de eventos postmitocondriales y de la vía extrínseca de la apoptosis (Rampino y colab., 1997; Vogelstein y colab., 2000; Teitz y colab., 2000; Reed; Johnstone y colab., 2002). Por lo tanto, un paradigma para la terapia del cáncer es un procedimiento que puede desencadenar selectivamente la apoptosis de las células tumorales, sin alterar las células normales en proliferación, evitando los factores alterados o mutados de las diferentes vías apoptóticas.
Las composiciones y métodos de la invención presente se basan en el descubrimiento que las células tumorales y pretumorales sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido a niveles similares a los de las células normales en proliferación. Sin embargo, en contraste con las células normales en proliferación, las células tumorales y pretumorales inhiben la expresión al el ARN quimérico mitocondrial antisentido.
Las estructuras de dichos transcritos se muestran en la Figura 1 y la Figura 3 y las secuencias correspondientes en SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N° 5 y SEQ ID N°6.
En contraste, y constituyendo otro descubrimiento sorprendente, las células pretumorales y tumorales sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido. La supresión o inhibición de la síntesis del ARN quimérico mitocondrial antisentido constituye una nueva diferencia de fenotipo entre una célula cancerosa y una célula normal en proliferación, lo que se considera uno de los mayores contenidos de la invención presente. Además las células tumorales de biopsias humanas de diferentes tipos cancerosos exhiben también el mismo fenotipo que las células cancerosas en cultivo ( Figuras 5A y 5B).
Aunque no está clara la función del ARN quimérico mitocondrial sentido ni la del ARN quimérico mitocondrial antisentido, existe una correlación directa entre la expresión de dichos ARN y la proliferación celular. Por ejemplo, las células en proliferación de tejidos como el hígado, riñón y bazo definidas como tales por la expresión de antígenos como Ki-67, PCNA o histona fosforilada H3 sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido así como el ARN quimérico mitocondrial antisentido. En células en reposo proliferativo de los mismos tejidos, que no expresan Ki-67 o PCNA, ni el ARN quimérico mitocondrial sentido ni el ARN quimérico mitocondrial antisentido no se expresan. Mas aún, como se ilustra en la Figura 7, los linfocitos humanos estimulados con el mitógeno PHA sintetizan ADN y expresan los antígenos de proliferación KI-67 y PCNA. Los linfocitos estimulados sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido y también el ARN quimérico mitocondrial antisentido (Figura 7). Por el contrario, los linfocitos en reposo proliferativo o no estimulados no expresan ni el ARN quimérico mitocondrial sentido ni el ARN quimérico mitocondrial antisentido.
El hallazgo anterior, que es una parte fundamental de la invención presente, muestra que mientras las células normales en proliferación expresan los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido, las células tumorales expresan el ARN quimérico mitocondrial sentido e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Para entender la función de dichos ARNs en la proliferación celular, se trataron células cancerosas en cultivo con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 3) o el ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6). Los resultados, que constituyen otro descubrimiento sorprendente, muestran que en esas condiciones las células entran en el proceso de muerte programada o apoptosis. Después del tratamiento con oligonucleótidos complementarios a los ARNs quiméricos mitocondriales sentido o antisentido por 6 a 15 horas, entre 75 y 96% de las células sufren apoptosis (Tabla 2). Los cambios observados en las células fueron condensación de la cromatina, fragmentación nuclear, fragmentación del ADN, activación de caspasas y alteración de los procesos de la membrana plasmática. Oligonucleótidos control con 4 o más nucleótidos con apareamiento incorrecto o con orden alterado no indujeron apoptosis. Las células fueron afectadas por el tratamiento con oligonucleótidos complementarios al ARN ribosómico mitocondrial 12S sentido o antisentido o complementarios al ARNm o al transcrito antisentido de la subunidad ND 1 mitocondrial. En general, los oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido fueron mucho más efectivos a la misma concentración que los oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial sentido. Este fue un resultado esperado puesto que las células tumorales sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido y por lo tanto es difícil alcanzar una concentración de oligonucleótidos dentro de la célula que interfiera con todas las copias de este transcrito. Por otra parte, como las células tumorales disminuyen la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido, debería ser más fácil interferir con este ARN por cuanto hay un menor número de copias por células.
La inducción de apoptosis es también selectiva para las células tumorales. Los linfocitos humanos en reposo proliferativo o los linfocitos humanos estimulados por 48 horas con PHA no se afectan por el tratamiento con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido o dirigidos al ARN quimérico mitocondrial sentido, incluso después de un tratamiento con una alta dosis (15 µM) de oligonucleótidos complementarios.
La inducción de apoptosis por el tratamiento con oligonucleótidos complementarios dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6) se ha logrado en células de leucemia promielocítica HL-60, leucemia linfoblástica aguda MOLT-4, células de leucemia T-linfocítica, Jurkat, una leucemia de células T, Devernelle o linfoma B NSO/2 o mieloma, células HeLa, DU145, PC-3 Caco-2, Hep-2 y HepG2, pero no se limita a dichas células. Dos tipos celulares, MCF/7 (carcinoma mamario) y melanoma que pueden ser consideradas como paradigma de células tumorales resistentes al tratamiento (quimioterapia o radioterapia), sufren apoptosis sobre un 80% al tratarse por 15 horas con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6). Tratándolas con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico sentido (SEQ ID Nº 1) se obtiene un menor efecto apoptótico. Como se reportó anteriormente, oligonucleótidos con 4 nucleótidos con apareamiento incorrecto o con orden alterado no indujeron muerte celular.
Más abajo se describen los métodos y composiciones para tratar el cáncer usando los ARNs quiméricos antisentido como agentes terapéuticos. El contenido preferido, aunque no limitado a éste, son los métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer usando oligonucleótidos complementarios a los ARNs quiméricos antisentido. El resultado de este tratamiento es por lo menos producir en un sujeto tratado un beneficio en su salud, lo que en el caso del cáncer incluye pero no se limita a la remisión del cáncer, el aminoramiento de los síntomas del cáncer y el control de la diseminación del cáncer por metástasis. Todos dichos métodos implican la inducción de apoptosis en células tumorales con efectos menores en células normales. Oligonucleótidos complementarios dirigidos a ARNs específicos han sido ampliamente utilizados para disminuir o suprimir la expresión de una gran diversidad de ARNm
o la síntesis de las proteínas correspondientes (p. ej. Vickers y colab., 2003). Actualmente se estudian cerca de 42 oligonucleótidos antisentido de diferente composición como fármacos potenciales (Stephens and Rivers, 2003; ver también como ejemplos las U. S. Pat. Nos. 5.801.154, 6.576.759; 6.720.413; 6.573.050 y 6.673.917).
En un aspecto de esta invención, se puede usar uno o más oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido. El uso de dos o más oligonucleótidos complementarios es más efectivo y muestra algún grado de sinergia.
Los oligonucleótidos de la invención pueden ser complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido. Los oligonucleótidos complementarios se unirán los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido interfiriendo con sus funciones. Aunque la complementariedad absoluta es favorecida, no es requerida. Un oligonucleótido cuya secuencia se refiere aquí como “complementaria” a una porción de un ARN, significa que tiene suficiente complementariedad con el ARN para formar una pareja estable. La capacidad de hibridizar depende tanto del grado de complementaridad como del largo del oligonucleótido. Generalmente, mientras más largo sea el ácido nucleico hibridizante, éste puede contener un mayor número de apareamientos incorrectos y aún formar un par estable. Los expertos en la técnica pueden determinar un grado aceptable de apareamientos incorrectos usando procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado.
Los oligonucleótidos complementarios para hibridar con los ARNm para diferentes proteínas están, en general, dirigidos a la región 5’ no traducida del ARNm incluyendo el complemento del codón de iniciación AUG, o a la región 3’ no traducida para ser más efectivos. Los oligonucleótidos complementarios a las regiones codificantes del ARNm son menos efectivos como inhibidores de la traducción (ver referencias previas). El ARN quimérico mitocondrial antisentido son regiones no codificantes, por lo tanto los oligonucleótidos pueden ser complementarios a cualquiera región de dichos transcritos. Las regiones más efectivas se ubican alrededor de los segmentos de una hebra del ARN quimérico mitocondrial antisentido determinadas explorando las secuencias del ARN quimérico antisentido con oligonucleótidos diseñados cada 30 nucleótidos. Los expertos en la técnica entenderán que otras secuencias comprendidas dentro de las secuencias completas de los transcritos de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6 son blancos para el diseño de oligonucleótidos complementarios alternativos.
Los oligonucleótidos complementarios dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido que inducen la muerte de células tumorales de acuerdo a la presente invención, generalmente contendrán una columna vertebral diferente a los fosfodiésteres naturales. Los oligonucleótidos pueden tener alternativamente uniones internucleósidos incluyendo, pero no limitados a fosforotioato (Mag y colab., 1991; y U.S. Pat. Nº 5.644.048), ácido nucleico con unión peptídica (PNA) (Egholm, 1993 y U.S. Pat. Nº 6.656.687), fosforamida (Beaucage, 1993), fosforoditioato (Capaldi y colab., 2000). Otros análogos de oligonucleótidos incluyen, aunque sin estar limitados a, morfolino (Summerton, 1999) oligonucleótidos bloqueados en sus extremos (Wahlestedt y colab., 2000), ácidos nucleicos con unión peptídica (PNA), (Nielsen y colab., 1993; Hyrup y Nielsen, 1996) o nucleótidos modificados en los extremos 5’ y 3’ por 2-o-(2-metoxi) etilo (McKay y colab ., 1999). Los ácidos nucleicos pueden contener cualquier combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos o cualquiera combinación de bases incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc.
Los oligonucleótidos complementarios según la invención pueden comprender al menos una base modificada, seleccionada del grupo siguiente que incluye, pero sin limitarse a, 5-fluorouracil, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5yodouracilo, hipoxantina, xantina 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina*, inosina, N6 isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina. 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’metoxicarboximetilu-racilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil5 oxiacético, wybutoxosine, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5 metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético metilester, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.
Los oligonucleótidos complementarios pueden también incluir al menos un azúcar modificado seleccionado del grupo siguiente, pero sin limitarlo a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.
En otro aspecto de la invención presente, los oligonucleótidos complementarios son diseñados para hibridizar con cualquiera región del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Los oligonucleótidos deben ser al menos de diez nucleótidos de largo, preferentemente oligonucleótidos complementarios de entre 10 y alrededor de 50 nucleótidos de largo. En aspectos específicos el oligonucleótido complementario es al menos 12 nucleótidos, al menos 18 nucleótidos, al menos 22 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos de longitud.
Es importante considerar que tanto para experimentos in vitro como para experimentos in vivo deben utilizarse controles que distinguen entre la interferencia de los oligonucleótidos complementarios con la función del ARN quimérico mitocondrial antisentido en comparación con los efectos biológicos inespecíficos de oligonucleótidos complementarios. Por lo tanto el diseño de los oligonucleótidos debe evitar la presencia en la secuencia de series CpG, series 5’GGGG y otras secuencias que tienen efectos tóxicos en células animales como se informa en la U.S. Pat. Nº 6.673.917. También la presencia de la secuencia 5’CGTTA fue evitada debido al efecto previamente descrito (Tidd y colab., 2000).
En otro contenido de la invención presente, los oligonucleótidos complementarios dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos en animales o en pacientes que tienen cáncer y que inducen sensibilidad a drogas terapéuticas anticáncer o radiaciones. La sensibilidad inducida, conocida también como sensitización o hipersensibilidad, puede ser medida en células tumorales que muestran refractariedad a terapias anticáncer o a radiaciones. Las drogas anticáncer comprenden aquellas conocidas en la técnica y usadas actualmente y las drogas aún no descubiertas. Entre las drogas quimioterapéuticas convencionales están los agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos y agentes antimicrotúbulos. Algunos ejemplos de dichas drogas son la cisplatina metotrexato, doxorubicina, dactinomicina, mitomicina, ciclofosfamida, etc.
En otro aspecto de la invención, junto con o después del tratamiento de animales o pacientes que tienen cáncer con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido, los pacientes pueden ser tratados con radioterapia, en que la radioterapia incluye radiación ultravioleta, radiación gama, partículas alfa, partículas beta, haces de rayos X y de electrones.
En otro aspecto de esta invención, la interferencia con el ARN quimérico mitocondrial antisentido para inducir la muerte de las células puede ser lograda mediante la interferencia en el ARN o el silenciamiento del ARN. En los últimos seis años la interferencia en el ARN (ARNi) ha surgido como una nueva aproximación al silenciamiento de genes en células de mamíferos (Elbashir y colab., 2001; McManus y colab., 2002). Las moléculas de doble hebra de ARN sintéticas* de cerca de 19 a 21 nucleótidos de largo se hibridizan específicamente con su ARNm complementario, produciendo la degradación del ARNm y subsiguiente degradación de las proteínas. Varios genes diferentes han sido exitosamente silenciados por ARN pequeño de interferencia o ARNsi (Lu y colab., 2003; Wachek y colab., 2003). Por tanto, el ARN sintético de doble hebra de cerca de 19 a 21 nucleótidos dirigido al ARN quimérico mitocondrial antisentido o al ARN quimérico mitocondrial sentido puede ser usado para degradar los transcritos e inducir la muerte celular. Las personas familiarizadas en la técnica comprenderán que la secuencia de ARNsi debe ser complementario a cualquier región de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6).
En otro contenido de la invención, las ribozimas pueden ser usadas para interferir con el ARN quimérico mitocondrial antisentido para inducir la muerte de células tumorales. La secuencia de la ribozima debe ser diseñada de acuerdo con la secuencia de ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6) para dividir regiones específicas del transcrito que son más eficientes para iniciar la muerte de las células tumorales. Las ribozimas son moléculas enzimáticas de ARN capaces de catalizar la ruptura específica del ARN (Rossi, 1994). El mecanismo de acción de la ribozima incluye la hibridación específica de la molécula de ribozima al ARN complementario blanco, seguida por una ruptura endonucleotídica. La composición de la ribozima debe incluir una o mas secuencias complementarias al ARNm del gen destino y debe incluir la conocida secuencia para la ruptura de ARNm descrita en U.S. Pat. No. 5.093.246. Así, en el ámbito de esta invención, las moléculas de ribozima (cabeza de martillo) son preparadas de modo de catalizar específica y eficientemente la ruptura endonucleolítica de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido o a los ARNs quiméricos mitocondriales sentido. La construcción y producción de ribozimas (cabeza de martillo) es bien conocida en la técnica y ha sido descrita (Haseloff y colab., 1989). Las ribozimas de la invención presente también incluyen endorribonucleasas de ARN (Zaug y colab., 1984).
La terapia génica se refiere al tratamiento o prevención del cáncer mediante la administración de ácido nucleico a un paciente que tiene cáncer o en quien la prevención o inhibición de cáncer es deseable. En este aspecto de la presente invención, el ácido nucleico producido en forma intracelular es un ARN complementario dirigido al ARN quimérico mitocondrial antisentido que intermedia el efecto terapéutico interfiriendo o inhibiendo la función de estos transcritos mitocondriales induciendo la muerte de las células tumorales. Por lo tanto, un procedimiento preferido es utilizar un ADN recombinante artificial en el cual la trascripción del ARN complementario está controlada por promotores fuertes de la ARN polimerasa II o III. La expresión de la secuencia que codifica el ARN complementario puede lograrse por cualquier promotor conocido en la técnica que actúa sobre células de mamíferos, preferentemente humanas. Tales promotores incluyen, aunque no se limitan a, la región promotora temprana del virus SV40 (Benoist y Chambon, 1981), el promotor de la timidina quinasa del virus herpes (Wagner y colab., 1981), las secuencias reguladoras del gene de la metalotionina (Brinster y colab., Nature 296:39-42, 1982) el promotor del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y colab., 1980), etc. La construcción de ADN recombinante para producir el ARN complementario puede estar basada en un vector viral entre los que se incluye, aunque no se limita al vector de adenovirus, vector de virus adeno-asociado, vector de virus herpes simplex, vector del virus de la viruela y vectores de retrovirus. El vector es introducido en las células tumorales de interés a través de su formulación en un compuesto farmacéutico apropiado, usando métodos familiares para los expertos en la técnica.
Los compuestos farmacéuticos de esta invención incluyen una cantidad efectiva del ácido nucleico complementario (oligonucleótidos complementarios, ARNsi, ribozimas o vectores virales) en un portador aceptable farmacéuticamente, que puede ser administrado a un paciente de cáncer para interferir con la función del ARN quimérico mitocondrial antisentido e inducir la apoptosis de las células cancerosas. Los ácidos nucleicos complementarios pueden ser formulados en un compuesto farmacéutico, que puede incluir portadores, diluyentes, tampones, preservativos, agentes tensioactivos, polietilenimida (PEI), liposomas u otra formulación lipídica conocida en el arte. El compuesto farmacéutico puede ser administrado por aplicación tópica, oral, parenteral o administración rectal. La administración parenteral incluye inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular o administración pulmonar por inhalación o insuflación.
Las composiciones de la invención presente pueden ser utilizadas para el tratamiento terapéutico, diagnóstico, profilaxis y como reactivos y dispositivos para la investigación Las composiciones y métodos aportados aquí son considerados particularmente útiles para el tratamiento del cáncer. El término cáncer como expuesto aquí, incluye células afectadas por cualquiera de las siguientes condiciones anómalas identificadas. Ellas incluyen leucemia mieloide aguda o crónica, leucemia linfoblástica aguda o crónica, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma de origen no Hodgkin o linfoma maligno; carcinoma gástrico, carcinoma esofágico o adenocarcinoma, adenocarcinoma del conducto pancreático, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, adenocarcinoa del intestino delgado, carcinomas colorrectales; carcinoma hépatocelular; adenoma hépatocelular; carcinoides del tracto urogenital como adenocarcinoma renal, tumor de Wilm, carcinoma de vejiga urinaria y uretra y adenocarcinoma prostático, cánceres testiculares como seminoma, teratoma, teratocarcinoma, carcinoma de células intersticiales, carcinoma endometrial, carcinoma cervical de útero, carcinoma ovárico, carcinoma de vulva y vagina, tumores de células de Sertoli y Leydig, melanoma y carcinoma de trompas de Falopio; carcinomas alveolar y bronquiolar de pulmón; tumores encefálicos; melanoma maligno de la piel, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y sarcoma de Karposi. Además fibrosarcoma, angiosarcoma y rabdomiosarcoma cardíacos, y otras enfermedades tumorales familiares a los expertos en la técnica. Así, el término “célula cancerosa” usado aquí, incluye una célula afectada por cualquiera de las condiciones identificadas más arriba.
EJEMPLOS DE REALIZACION
Los siguientes ejemplos sirven para describir la manera de usar la invención descrita anteriormente y también proponer la mejor manera de llevar a cabo varios aspectos de ella. Se entiende que de ninguna manera estos ejemplos son para limitar el ámbito de la invención sino para efectos ilustrativos.
EJEMPLO 1
Aislamiento y secuenciación del ARN quimérico mitocondrial humano sentido. (Figura 1A, SEQ ID NO 1)
Los experimentos iniciales indicaron que el ARN quimérico mitocondrial humano sentido contenía una estructura secundaria más compleja y estable que el ARN quimérico de ratón (Villegas y colab., 2002). Por lo tanto , y basándose en la estructura secundaria del ARN quimérico mitocondrial de ratón, se dedujo una estructura secundaria teórica del ARN quimérico mitocondrial humano (Figura 1A). El transcrito teórico humano contenía la secuencia completa del ARN 16S sentido unido en el extremo 5’ a un fragmento del ARN mitocondrial 16S formando una asa de largo desconocido (Figura 1A). El segmento del ARN 16S mitocondrial antisentido era completamente complementario al ARN 16S mitocondrial sentido y por lo tanto corresponde a un repetido invertido unido al extremo 5’ del transcrito. Basándose en esta estructura se diseñaron partidores para amplificar este transcrito potencial, por RT-PCR. Un partidor reverso ubicado en las posiciones 11 a 31 desde extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S quimérico humano o al comienzo de la asa teórica (Partidor 1, Figura 1A) (SEQ ID NO 139). La secuencia del partidor directo usado corresponde a las posiciones 213-234 del ARN mitocondrial 16S sentido y se ilustra en la Figura 1A, partidor 3. La amplificación del ARN por RT-PCR de varios tejidos humanos y células incluyendo células HeLa, HL-60, Du145, MCF/7 y linfocitos humanos estimulados con PHA (Ver ejemplo 7) usando los partidores 1 y 3 (Figura 1A) produjo un amplicón único de alrededor de 210 pares de bases (Figura 2). La técnica de RT-PCR se efectuó como se ha descrito anteriormente (Villegas y colab., 2000; Villegas y colab., 2002). Los amplicones de cada tejido o célula humana se clonaron y ambas hebras se secuenciaron. Se obtuvo en todos los casos una secuencia idéntica de 216 pares de bases, que contenía una secuencia repetida de 184 nucleótidos unida a los primeros 31 nucleótidos del terminal 5’ del ARN mitocondrial 16S sentido. Después se determinó si el repetido invertido era mayor que 184 nucleótidos y se extendía más hacia el extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S antisentido (Figura 1A). El ADNc de las células HeLa u otras descritas más arriba se amplificó entre el partidor reverso 1, ubicado en el asa descrita anteriormente, y los partidores 4 a 7, para caminar en dirección del extremo 5’ del supuesto repetido invertido (Fig. 1A). De este modo se obtuvieron fragmentos de amplificación de 500. 700 y 800 pares de bases al combinar el partidor 1 con los partidores 4, 5 y 6, respectivamente. Por otra parte, al amplificar el ADNc entre el partidor 1 y el partidor 7 no se obtuvo un producto, indicando que el extremo 5’ del repetido inverso estaba entre los partidores 7 y 8 (ver más adelante). La secuencia completa del amplicon de 800 pares de bases revela un repetido invertido de 769 nucleótidos unido a los primeros 31 nucleótidos del ARN mitocondrial 16S sentido (SEQ ID NO 1) (Figura 1A). La secuencia de la región del terminal 3’ del repetido invertido unido al ARN mitocondrial 16S sentido es idéntica a la encontrada en la misma región del amplicón de 216 pares de bases. Esto es importante porque indica que en ambos casos estábamos amplificando el mismo ARN. Además, la secuencia mostró que faltaban 50 nucleótidos del extremo 3’ del ARN mitocondrial 16S en el repetido invertido del ARN quimérico mitocondrial sentido. En conjunto, estos resultados sugieren que la estructura de dos hebras formada entre el repetido invertido y el ARN mitocondrial 16S sentido comienza en la posición 51 de este último y forma una posible asa de 50 nucleótidos.
Para confirmar el largo de la asa, el ADNc humano se amplificó por PCR entre el partidor directo 2 ubicado en el extremo 3’ del repetido invertido y el partidor 3 que es también inverso en las posiciones 213-234 del ARN mitocondrial 16S sentido (Figura 1A). Se obtuvo un amplicón de aproximadamente 240 pares de bases y la secuencia mostró que los primeros 234 nucleótidos del ARN mitocondrial 16S sentido estaban unidos a los últimos 25 nucleótidos del extremo 3’ del repetido invertido. La secuencia de los 25 nucleótidos del repetido invertido era totalmente complementaria al ARN mitocondrial sentido entre las posiciones 51 a 75 (Figura 1A).
Si la secuencia del amplicón obtenido con los partidores 1 y 6 y la secuencia obtenida con los partidores 2 y 3 se ensamblan como secuencias contiguas, la estructura del ARN quimérico mitocondrial humano sentido resultante confirma un asa de 50 nucleótidos y una estructura de dos hebras de al menos 769 pares de bases (Figura 1A) (ver también SEQ ID NO 1).
Ya que el ARN de dos hebras no es digerido por ARNasa A, el tallo del ARN quimérico mitocondrial humano sentido debería ser resistente a esta enzima. Por otra parte, el asa de la región 3’ del ARN quimérico mitocondrial 16S sentido que se extiende más allá de la estructura de dos hebras debería ser digerida por la enzima. El ARN de HeLa y de otras células fue digerido con ARNasa A (50 µg por ml), seguido por extracción con fenol, y el material resistente a la nucleasa se recuperó por precipitación en etanol. El ADNc del ARN digerido fue amplificado por PCR usando los partidores mostrados en la Figura 1A. El amplicón de alrededor de 800 pares de bases obtenido con los partidores 1 y 6 no fue amplificado después de la digestión con ARNasa A indicando que el asa fue digerida por la enzima. Lo mismo aconteció con el amplicón de 360 pares de bases obtenido con los partidores 10 y 11 como se indica en la Figura 1A. En conjunto, estos resultados indicaron que tanto el asa como la región 3’ del ARN quimérico mitocondrial sentido que se extiende más allá del tallo, fueron digeridos por la enzima. Por otra parte la amplificación del amplicón de 750 pares de bases, correspondiente a la estructura de doble hebra del ARN quimérico mitocondrial sentido y obtenido usando partidores 8 y 6, no fueron afectados por la digestión con ARNasa
A. La secuencia del fragmento de doble hebra resistente a la digestión por ribonucleasa era idéntica con la secuencia esperada del tallo. Los mismos resultados se obtuvieron después de digestión del ARN total proveniente de células HL-60 u otras células humanas.
Para determinar el extremo 5’ de la secuencia invertida repetida del ARN quimérico mitocondrial sentido, el tallo del transcrito obtenido por digestión con ARNasa A se usó para su análisis por RACE. La determinación del extremo 5’ de la secuencia invertida repetida se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados indicaron que la secuencia invertida se extiende por 46 nucleótidos adicionales desde el extremo 5’ del amplicón obtenido por la amplificación del ARN quimérico mitocondrial sentido con los partidores 1 y 6. En resumen, la secuencia invertida de 815 nucleótidos se une al extremo 5’ de los primeros 865 nucleótidos del ARN mitocondrial 16S. La secuencia de este transcrito mostró un 99.8% de identidad con el gen mitocondrial humano (hebras H y L) (SEQ ID NO 1). Los terminales 5’ de ambos extremos del tallo de doble hebra fueron confirmados por RACE 5’.
Los resultados anteriores indicaban que el ARN mitocondrial sentido contenía un tallo o estructura de 815 pares de bases y un asa de 50 nucleótidos. Sin embargo, esos resultados no comprobaban que el repetido invertido está completamente unido al ARN mitocondrial 16S sentido. El uso de métodos convencionales tales como la síntesis del ADNc completo desde el extremo 3’ es infructuoso porque la estructura de doble hebra del transcrito representa un problema insoluble a las transcriptasas reversas, incluyendo Tth (Myers y colab., 1991). Si el repetido invertido de 815 nucleótidos se une a los 1559 nucleótidos del ARN mitocondrial 16S, se esperaría un transcrito de 2,3 Kb. El análisis por Northern blot del ARN total de células HeLa, HL-60 y MCF/7 se llevó a cabo con una sonda marcada con 32P dirigida a la estructura de dos hebras del ARN quimérico mitocondrial sentido. Los resultados revelaron una banda de alrededor de 2,4 Kb además de una banda de 1,6 Kb correspondientes al ARN quimérico mitocondrial sentido y al ARN mitocondrial 16S respectivamente. Si se digiere el ARN con ARNasa A previo al Northern blot, se obtiene una banda única de hibridación de aproximadamente 0,8 Kb que corresponde al tamaño del tallo del ARN quimérico mitocondrial sentido. En conjunto, estos resultados demuestran que el ARN quimérico mitocondrial sentido contiene un repetido invertido de 815 nucleótidos unido al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S sentido correspondiente al SEQ ID NO 1.
Es posible detectar específicamente la región de unión entre el repetido invertido y el ARN mitocondrial 16S sentido usando una sonda de oligonucleótido. La sonda debe incluir 7 a 10 nucleótidos en cada lado del punto de unión entre el extremo 3’ del repetido invertido y el comienzo del ARN mitocondrial 16S. Este oligonucleótido puede ser usado para hibridación in situ o para amplificación por RT-PCR u otros de los métodos familiares a los expertos en la técnica para detectar este nuevo ARN.
El ARN quimérico mitocondrial sentido está presente en células normales en proliferación queratinocitos de prepucio humano, bazo, linfocitos estimulados con PHA, embriones de ratón), en células precancerosas (queratinocitos estimulados con HPV 16 o 18, células MT-2 transformadas con HTLV-1) y en células tumorales. No está presente en células normales en reposo proliferativo. En la Tabla 1 (en el Ejemplo 4) se presenta un resumen de estos resultados.
EJEMPLO 2.
Queratinocitos humanos transformados con virus papiloma sintetizan un nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido. (Figura 1B, SEQ ID NO 2).
Queratinocitos de prepucio humano (HFK) fueron transformados por incubación con un lisado de células previamente infectadas con el virus del papiloma humano 16 (HPV 16). Las células se cultivaron con 3 partes de KSFM, una parte de medio DMEM (Invitrogen) 5 ng/ml de EGF, 50 g/ml de extracto de hipófisis y 10% de suero bovino fetal. Las condiciones del cultivo fueron 37°C y 5% CO 2. Después de 24 horas de infección, las células HFK se transfirieron a otro frasco y fueron cultivadas en las mismas condiciones. Luego, las células (HFK698) fueron sucesivamente transferidas a nuevos frascos de cultivo cada 3 días usando una razón de partición de 1:3 a 1:4. Después del traspaso N°19 las células (HFK698 trans formadas por HPV 16) fueron cosechadas como se describió (Hausen, 1996), colectadas por centrifugación a 300 x g por 10 min y lavadas dos veces con tampón fosfato salino (PBS). El ARN total de las células se extrajo con TRIzol (Invitrogen). Alrededor de 200 nanogramos de ARN se usaron para sintetizar el ADNc con hexámeros al azar como se describió en el Ejemplo 1. El ADNc se amplificó por PCR usando el partidor reverso 1 y el partidor directo 3 como se describe en la Figura 1A. Este protocolo de amplificación produjo el amplicón esperado de 210 pares de bases, en el que los primeros 31 nucleótidos del ARN mitocondrial sentido están unidos al repetido invertido de 184 nucleótidos, según como descrito previamente en el Ejemplo 1, El análisis electroforético de los productos reveló la presencia de un amplicón de 210 pares de bases correspondiente al ARN quimérico mitocondrial sentido además de otro fragmento de 150 pares de bases como se muestra en la Figura 2. La secuencia completa de este nuevo fragmento (SEQ ID NO 2) mostró que los 31 nucleótidos iniciales desde el extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S sentido se unen a un repetido inverso de 121 nucleótidos, que es 63 nucleótidos más corto que el ARN quimérico mitocondrial sentido de la SEQ ID NO 1. Este repetido más corto genera un asa más larga de 96 nucleótidos (Figura 1B) en la estructura del ARN quimérico mitocondrial sentido. El resto de la secuencia es idéntica a la SEQ ID NO 1. Este nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido no está presente ni en células SiHa (Figura 4A ) que son células tumorigénicas transformadas con HPV 16 ni en células humanas normales en proliferación, tales como linfocitos humanos estimulados con PHA. Resultados similares se obtuvieron con células HFK transformadas por HPV 18 o en células 18Nco. Las células transformadas
o inmortalizadas (pero no tumorigénicas) por HPV 16 o HPV 18 se consideran células precancerosas y por lo tanto el nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido es un nuevo marcador potencial de células precancerosas.
Ya que la secuencia del extremo 3’ del repetido invertido de la SEQ ID NO 2 unida al ARN mitocondrial 16S es diferente a la misma región de la SEQ ID NO 1, se puede usar una sonda de oligonucleótido para la detección específica de este transcrito. La sonda debe incluir 7 a 10 nucleótidos a cada lado del punto de unión entre el extremo 3’ del repetido invertido y el comienzo del ARN mitocondrial 16S sentido, tal como el oligonucleótido de la SEQ ID NO 7. Este oligonucleótido puede ser usado para hibridación in situ o para amplificación por RT-PCR o cualquier otro método familiar a los experto en la técnica para detectar este nuevo marcador específico de células precancerosas.
EJEMPLO 3
Las células transformadas con HTLV-1 inducen la expresión de un nuevo y tercer ARN quimérico mitocondrial sentido (Figura 1C, SEQ ID NO 3)
Células MT-2 humanas transformadas con HLTV-1 fueron cultivadas como se ha descrito previamente (Kobayashi y colab., 1984). Las células fueron cosechadas, centrifugadas a 300 x g por 10 min y lavadas dos veces con PBS. La pella final fue extraída con TRIzol como se describe en el Ejemplo 1. El ADNc fue sintetizado con hexámeros al azar usando el ARN como molde y el ADNc fue amplificado por PCR usando el partidor reverso 1 y el partidor directo 3, como se representan en la Figura 1A. Como se describe anteriormente, este protocolo de amplificación produce un amplicón de 210 pares de bases que contiene los 31 primeros nucleótidos del ARN mitocondrial 16S sentido unido a un repetido invertido de 184 nucleótidos que corresponde al ARN quimérico mitocondrial sentido descrito en el Ejemplo 1. El análisis electroforético de los productos de amplificación reveló, además de la presencia del amplicón de 210 pares de bases mencionado, una banda de cerca de 150 pares de bases (ver Figura 2). La secuencia del amplicón de 150 pares de bases es idéntica a la secuencia del amplicón descrito en el Ejemplo 2, correspondiendo a un segundo ARN quimérico mitocondrial sentido que se expresa también en células transformadas por HPV 16 o HPV 18 (SEQ ID NO 2). Adicionalmente se encontró un nuevo producto de amplificación de cerca de 100 pares de bases (Figura 2). La secuencia de este tercer amplicón revela un repetido invertido de 61 nucleótidos unidos al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S sentido que genera un asa de 167 nucleótidos (Figura 1C; SEQ ID NO 3). Este nuevo amplicón no estaba presente en células normales, ni en células tumorales ni en células transformadas con HPV 16 o 18. Por lo tanto este nuevo ARN quimérico mitocondrial sentido es un marcador potencial de células transformadas con el retrovirus oncogénico HLTV-1.
Puesto que la secuencia del terminal 3’ del repetido inverso de SEQ ID NO 3 unido al ARN mitocondrial 16S es diferente a la misma región de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, puede usarse una sonda de oligonucleótidos para la detección específica de este transcrito. La sonda debe extenderse 7 a 10 nucleótidos a cada lado del punto de unión entre el extremo 3’ del repetido inverso y el comienzo del ARN mitocondrial 16S sentido, tal como el oligonucleótido de la SEQ ID NO 8. Este oligonucleótido puede ser usado para la hibridación in situ o la amplificación por RT-PDR o cualquier otro método familiar a los expertos en la técnica para detectar este marcador específico de células transformadas por un retrovirus oncogénico.
EJEMPLO 4
Estructura del ARN quimérico mitocondrial antisentido
Uno de nuestros experimentos iniciales indicó que en algunas de las células estudiadas existía una segunda familia de ARNs quiméricos que corresponden al ARN quimérico mitocondrial antisentido. Para establecer la estructura del ARN quimérico mitocondrial antisentido se utilizó la misma estrategia usada para el ARN quimérico mitocondrial sentido (Figura 1). El ARN quimérico mitocondrial antisentido “teórico” contenía un fragmento del ARN mitocondrial 16S sentido como un repetido inverso unido al extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S antisentido. Este último ARN es transcrito de la hebra L del ADN mitocondrial y corresponde al gen mitocondrial 16S (Figura 3). Para amplificar este ARN se hibridizó un partidor reverso cerca del extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S antisentido y los partidores directos se hibridizaron en diferentes posiciones del posible fragmento del repetido invertido (Figura 3). Se usó ARN total de linfocitos humanos estimulados con PHA por 48 horas como molde. El ADNc fue sintetizado con hexámeros al azar como se describe en el Ejemplo 1. La amplificación de ADNc por PCR se llevó a cabo con el partidor reverso ubicado cerca del comienzo del extremo 5’ del ARN mitocondrial 16S antisentido (partidor 1, Figura 3) y diferentes partidores directos ubicados en el repetido invertido (Figura 3). Se obtuvo sólo tres amplicones que diferían en el
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tamaño del repetido invertido y en el tamaño del asa. Estos amplicones fueron purificados y secuenciados. Uno de estos ARNs quiméricos mitocondriales antisentido contiene un repetido inverso de 365 nucleótidos y un asa de 17 nucleótidos (SEQ ID NO 4). Otro ARN contiene un asa de 96 nucleótidos y un repetido invertido de 189 nucleótidos (SEQ ID NO 5). Una tercera especie de ARN quimérico mitocondrial antisentido contiene un repetido invertido de 296 nucleótidos y un asa de 451 nucleótidos (SEQ ID NO 6). Las secuencias de los tres ARNs quiméricos mitocondriales antisentido eran 99,8 por ciento homólogas con la secuencia del gen del ADN mitocondrial (hebras H y L).
Los resultados, que serán presentados en los ejemplos siguientes, indican que hay una diferencia importante entre células pretumorales y células tumorales y células normales en proliferación respecto a la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Todas las células en proliferación sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido. Sin embargo, mientras las células normales en proliferación también expresan ARN quimérico mitocondrial antisentido, su transcripción es inhibida en células tumorales. Las células en reposo proliferativo no expresan ningún ARN quimérico mitocondrial. Por lo tanto la expresión diferencial de estos ARN representa un nuevo y poderoso marcador de la carcinogénesis, que puede ser detectado por hibridación in situ, Northern blot, RT-PCR o TMA u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Un resumen de la expresión diferencial de los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido se presenta en la Tabla 1
Tabla 1.
Expresión de los ARNs quiméricos en células de diferentes tipos. ARNs quiméricos Normal Normal Transformadas Transformadas Cáncer mitocondriales en reposo proliferando por HPV por HTLV-1
SEQ ID NO1 --+++++ +++++ +++++ +++++ Sentido SEQ ID NO 2 ----++++ ++++ -Sentido SEQIDNO3 ------++++ -Sentido SEQ ID NO 4 --+++++ +/-+/-+/-Antisentido SEQ ID NO 5 --+++++ +/-+/-+/-Antisentido SEQ ID NO 6 --+++++ +/-+/-+/-Antisentido
+ y -: nivel relativo de expresión por hibridación in situ.
EJEMPLO 5.
Las células tumorales sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID NO 1) e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID NOS 4, 5 y 6).
Se usó la hibridación in situ para determinar la expresión del ARN quimérico mitocondrial sentido en líneas de células tumorales en cultivo. Para la hibridación in situ se cultivaron células adherentes de tumores en portaobjetos de 8 cámaras (Lab-Tek®, NUNC) por 24 a 48 h a 37ºC usando los medios y condiciones apropiados recomendadas por la American Tissue Culture Collection o ATCC. Las células no adherentes (por ejemplo HL-60, Jurkat y Ramos) se cultivaron en frascos pequeños por 48 h a 37ºC. Las células fueron recuperadas por centrifugación a 300 x g por 10 min, resuspendidas en un pequeño volumen de PBS y alícuotas de 10 a 20 µl se colocaron en portaobjetos de vidrio previamente cubiertos con polilisina o la proteína adhesiva de cholgas (Burzio y colab., 1997). Se dejaron secar las muestras a temperatura ambiente por 30 min.
Las células fueron lavadas tres veces con PBS y fijadas con paraformaldehido al 4% por 10 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron lavados tres veces con PBS por 5 min e incubados en HCl 0,2 N por 10 min a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas otra vez tres veces, primero con PBS y después y luego con SSC 2X por 10 min (SSC 2X: NaCl 0,3 M, citrato de sodio 30 mM, pH 7,0) (Sambrook y colab., 1989) a temperatura ambiente. La prehibridación se llevó a cabo durante 30 min a 37ºC en una solución que contenía SSC 4X, sulfato de dextrano 10%, 150 µg/ml de ARNt de levaduras y ADN de espermatozoides de arenque, formamida 50% y solución de Denhardt 1X (Ficol tipo 400 0,2 mg/ml, polivinilpirrolidona 0,2 mg/ml y BSA 0,2 mg/ml). La hibridación se llevó a cabo por 15 horas a 37ºC en la mezcla de prehibridación que contiene 3,5 pmoles de las sondas dirigidas a los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido. Las sondas contenían 20 o más deoxinucleótidos dirigidos a diferentes regiones de los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido (ver SEQ ID Nos 99 a 197 y SEQ ID Nos 9 a 98 respectivamente). Las sondas estaban marcadas previamente en el extremo 3’ con digoxigenina-11dUTP (Roche) y transferasa terminal (Promega) como ha sido previamente descrito (Villegas y colab., 2000). Los portaobjetos fueron lavados para eliminar el exceso de sondas, primero con 2X SSC por 10 min a temperatura ambiente, luego con SSC 1X por 30 min a 45ºC y finalmente con SSC 0,2X a temperatura ambiente.
Después de la hibridación, las células fueron incubadas por 30 min en tampón de bloqueo (BSA 1%, Triton X-1000 0,3% en PBS) y luego incubadas por 2 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina (Roche) previamente diluído 1:500 en tampón de bloqueo. Finalmente los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS y la reacción colorimétrica se efectuó con una mezcla de substrato BCIP/NBT (DAKO) como ha sido previamente descrito (Villegas y colab., 2000).. El mismo procedimiento fue empleado para FISH, usando anticuerpos antidigoxigenina conjugados con fluorosceína o rodamina.
Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, la hibridación in situ con una sonda que corresponde a la SEQ ID NO 63, marcada con digoxigenina revela que las células tumorales humanas sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido. La hibridación in situ con la sonda correspondiente a la SEQ ID NO 64 marcada con digoxigenina dió resultado negativo indicando la inhibición de la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido . Los mismos resultados se obtuvieron con sondas de oligonucleótidos dirigidas a otras regiones del ARN quimérico mitocondrial sentido y antisentido.
EJEMPLO 6
Las células tumorales de biopsias humanas sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido (SEQ ID NO 1) e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido (SEQ ID Nos 4, 5 y 6).
Se obtuvieron biopsias humanas de patólogos o muestras de tejidos de DAKO. La mayor parte de las muestras estaban incluídas en parafina y fijadas en formalina. Otras muestras de tejido se fijaron con reactivo de Boiun y también se utilizaron muestras congeladas.
Secciones de tejidos de 4 a 8 µm fueron dispuestas en portaobjetos previamente cubiertos con polilisina o con la proteína polifenólica adhesiva de la cholga Aulacomya ater (Burzio y colab., 1997). Las secciones embebidas en parafina sólida se incubaron por 1h a 60ºC y la parafina se removió por 3 lavados con xilol de 15 min cada uno. Las secciones se secaron al aire y se lavaron cuatro veces con PBS. Luego las secciones se incubaron en HCl 0,2 N por 10 min a temperatura ambiente y luego se lavaron cuidadosamente con PBS. Luego, las muestras fueron hibridadas in situ con las sondas antisentido marcadas con digoxigenina según el protocolo descrito en el Ejemplo 4. Un corte paralelo fue hibridizado con una sonda sentido correspondiente a la misma región del ARN quimérico mitocondrial sentido.
Como se ve en la Figura 5A, las células presentes en tumores de glándula mamaria, cervicouterinos, carcinomas de vejiga y de pulmón revelaron una fuerte tinción con las sondas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial sentido indicando fuerte presencia de este transcrito. Por otra parte la hibridación in situ con la sonda dirigida al ARN quimérico mitocondrial antisentido fue negativa, indicando la inhibición de este transcrito (Fig 5A). Otros tumores también sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial sentido e inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido (Figura 5B).
EJEMPLO 7
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Las células normales en proliferación sobreexpresan los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido.
Usando el mismo protocolo de hibridación descrito en los Ejemplos 5 y 6, la expresión del ARN quimérico mitocondrial sentido fue determinada en células en proliferación. Como se ve en la Figura 6, células HFK, espermatogonias, células del bazo y células en proliferación de embrión de ratón, mostraron un fuerte señal de hibridación la que indica sobreexpresión del ARN quimérico mitocondrial sentido. Por contraste las células que no proliferan, como las del músculo, cerebro e hígado, no mostraron la señal, indicando que el ARN quimérico mitocondrial sentido no se expresa o la expresión es inhibida en dichas células.
Sin embargo, cuando la hibridación in situ en células en proliferación se efectuó con sondas dirigidas al ARN quimérico mitocondrial antisentido, también se observó una fuerte señal (Figura 6). Varios controles analizados paralelamente a las muestras indican que la señal de hibridación con dichas sondas no se debe a un artefacto. La señal de hibridación desaparecía si la hibridación in situ se realizaba con la sonda marcada junto a un exceso (50 a 100 veces) de la misma sonda no marcada con digoxigenina. Si antes de la hibridación las muestras eran incubadas con ribonucleasa A por la noche, la señal de hibridación no aparecía. Además, no se observaba señal de hibridación si la hibridación se hacía con una sonda marcada dirigida al ARN quimérico mitocondrial antisentido incluyendo 4 nucleótidos no complementarios.
EJEMPLO 8
Los linfocitos humanos normales, estimulados con fitohemaglutinina (PHA) sobreexpresan los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido.
Cinco ml de sangre proveniente de pacientes sanos se colectaron con EDTA. La sangre se diluyó con un volumen de NaCl 0,9% y la mezcla se colocó sobre 5 ml de Histopaque-1077 (Sigma) en un tubo de centrífuga. Los tubos fueron centrifugados a 800 x g por 20 min a temperatura ambiente. Las células blancas de la interfase fueron colectadas, diluidas con dos volúmenes de NaCl 0,9% y centrifugadas a 250 x g por 10 minutos a temperatura ambiental. Las células colectadas se resuspendieron y lavaron dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 200 mM glutamina, 10 mM aminoácidos no esenciales, penicilina y estreptomicina sin suero fetal de bovino. El sedimento final se resuspendió en el mismo medio con suero fetal de bovino al 10%. El número de linfocitos humanos se determinó por conteo bajo el microscopio en una cámara de Neubauer.
Los linfocitos humanos fueron cultivados en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio RPMI 1640 suplementado como se describió más arriba, más 10 % suero bovino fetal a 37ºC y con CO2 al 5%. Cerca de 30.000 linfocitos por pocillo se cultivaron con o sin 10 µg/ml del mitógeno PHA, que induce la proliferación (Yu y colab., 1991). Después de 48 a 72 h de tratamiento con PHA, las células están dedicadas activamente a la síntesis de ADN como se demostró por la incorporación de timidina H3 o BrdU (Yu y colab., 1991). Además, después de 48 horas de estimulación con PHA los linfocitos sobreexpresan otros marcadores de proliferación celular tal como el antígeno nuclear de células en proliferación o PCNA y Ki-67 (Bantis y colab., 2004) (Figura 7). Los linfocitos en reposo o controles no expresaron dichos antígenos (Figura 7).
Para determinar si los linfocitos expresaban los ARNs quiméricos mitocondriales sentido, las células fueron sometidas a hibridación in situ con sondas oligonucleotídicas marcadas con digoxigenina y dirigidas al ARN quimérico mitocondrial sentido. El protocolo de hibridación in situ empleado fue descrito en Ejemplo 5. Se obtuvo una fuerte señal de hibridación que indican la sobreexpresión de este transcrito (Figura 7). La señal de hibridación fue similar en intensidad a la observada en células tumorales u otras células normales en proliferación (Comparar la Figura 7 con la Figura 4 A y B, Figura 5A y B). No se observó señal de hibridación en los linfocitos controles, incubados sin PHA (Figura7).
Cuando se llevó a cabo la hibridación in situ con sondas oligonucleotídicas marcados con digoxigenina y dirigidas al ARN quimérico mitocondrial antisentido, se obtuvo una señal de hibridación igualmente fuerte (Figura 7). Diversos controles se realizaron para descartar la posibilidad que la señal de hibridación se debiera a artefactos. La señal de hibridación desaparece si la hibridación in situ se realiza con la sonda marcada junto con un exceso (50 a 100 veces) de la misma sonda sin marcar con digoxigenina. Si se incuban las muestras con ribonucleasa A por la noche, la señal de hibridación desaparece. Tampoco se observa señal de hibridación si ésta se lleva a cabo con una sonda que contenga 4 nucleótidos no complementarios. En contraste, no se obtiene señal en la hibridación in situ de linfocitos no estimulados (Figura 7). En conclusión, los linfocitos humanos normales estimulados a proliferar sobreexpresan ambos, el ARN quimérico mitocondrial sentido y el ARN quimérico mitocondrial antisentido. Estos transcritos no se expresan en células en reposo proliferativo.
EJEMPLO 9
El ARN quimérico mitocondrial sentido muestra diferentes localizaciones en células normales y tumorales.
Las hibridaciones in situ descritas en los Ejemplos 5 y 6, muestran que en varias líneas de células tumorales y en células tumorales de biopsias humanas el ARN quimérico mitocondrial sentido se localiza preferentemente en el citoplasma. Sin embargo, en algunas biopsias de tumores se identificó una clara localización nuclear de los transcritos (Figura 4 A, B).
Un hallazgo sorprendente fue la localización del ARN quimérico mitocondrial sentido en el nucléolo. La hibridación in situ realizada como se informa en el Ejemplo 5, reveló una señal de hibridación positiva en el nucléolo de células HeLa y SiHa (Figura 8). La señal de hibridación era más fuerte en el nucléolo de célula HFK transformada con HPV 16 (Figura 8). La localización nucleolar ha sido encontrada también en células tumorales en tumores de glándula mamaria y rabdomiosarcoma (Figura 8).
Estudios de colocalización indican que el ARN quimérico mitocondrial sentido ubicado en el citoplasma está situado fuera de las mitocondrias y asociado a endosomas tardíos/ lisosomas. Si los estudios de colocalización se realizan con marcadores de mitocondrias tal como Mitotrack (Molecular Probes) o anticuerpos anticitocromo c (Promega) o anti endonucleasa G (Chemicon) la hibridación in situ muestra una colocalización pobre. Sin embargo, se encontró una colocalización perfecta entre la señal de hibridación y los marcadores inmunoquímicos de endosomas tardíos/lisosomas tales como Lysotrack (Molecular Probes) o anticuerpos anti-Lamp-2 (BD Pharmigen) o anticatepsina D (Zymed).
Células HeLa fueron hibridadas in situ con sondas de oligonucleótidos marcadas con digoxigenina como se describe en el Ejemplo 5. Después de los procedimientos de posthibridación y lavado, las células fueron incubadas con un anticuerpo antidigoxigenina marcado con rodamina y un anticuerpo anti Lamp-2 marcado con fluorosceína. Después de incubación por 3 h en la oscuridad, los portaobjetos fueron lavados, montados y analizados en un microscopio confocal Zeiss. Se obtuvo una clara colocalización de la señal de hibridación con la localización de Lamp-2. También se obtuvo colocalización de la señal de hibridación con Lysotrack o anticuerpos anticatepsina D como marcadores de la fracción lisosomal. Hasta donde sabemos, esta es la primera información que un ARN (en especial un transcrito mitocondrial) se asocia a los lisosomas de una célula. La determinación de la localización del ARN quimérico mitocondrial sentido en células tumorales puede tener valor predictivo para pacientes de cáncer. En general, en células normales en proliferación, los ARN quimérico mitocondrial sentido y antisentido se localizan principalmente en el núcleo
EJEMPLO 10
El tratamiento in vitro de células tumorales con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido induce la muerte celular.
Células HL-60 fueron cultivadas en las condiciones óptimas recomendadas por la ATCC. Alrededor de 30.000 células fueron cultivadas en placas de 96 pocillos. Se agregó oligonucleótidos (2 µM) dirigidos al ARN quimérico mitocondrial sentido o antisentido. Para aumentar la permeabilidad de las células, los oligonucleótidos se agregaron mezclados con lipofectamina u óligofectaminas (Invitrogen) o con polietilenimida (PEI) (Exgen TM 500, Fermentas). Se prefirió PEI porque es virtualmente no tóxica para las células. Las células fueron incubadas con los oligonucleótidos por 6 h y el porcentaje de sobrevivencia celular fue establecido por la permeabilidad a Azul Tripan. Después de 6 h de incubación con los oligonucleótidos muere un porcentaje importante de las células. Sin embargo, los oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido fueron más efectivos en inducir la muerte celular (cerca de 90% versus 15% de mortalidad celular). Por otra parte, no se indujo apoptosis cuando las células fueron tratadas con oligonucleótidos dirigidos al ARN mitocondrial 12S o el ARNm de la unidad ND1 o con oligonucleótidos con secuencias con orden alterado, o con oligonucleótidos que contienen 4 nucleótidos no complementarios, todos los cuales fueron usados como control. Los oligonucleótidos usados contienen uniones fósforotioato en los primeros 5 nucleótidos del extremo 5’ y en los últimos cinco nucleótidos del extremo 3’. En promedio los 10 nucleótidos centrales contienen enlaces fosforodiéster.
Para establecer si el tratamiento de las células con estos oligonucleótidos induce la fragmentación del ADN, las células HL-60 fueron incubadas con oligonucleótidos por 6 h bajo las mismas condiciones descritas antes. Alrededor de 30.000 células HL-60 fueron cultivadas en 200 µl de UDMEM más suero bovino fetal al 10 % en placas de 96 pocillos junto con 1 µM de oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial sentido o dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido. La composición de la mezcla de oligonucleótidos con PEI agregada fue la misma descrita en la sección anterior. Después de una incubación de 6 h con los oligonucleótidos, se analizó la fragmentación del ADN celular usando el ensayo TUNEL (DeadEnd Colorimetric TUNEL System, Promega). Como se ve en la Tabla 2, cerca del 96% de las células mostró fragmentación del ADN después del tratamiento con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido. El tratamiento con la droga estaurosporina logró una cifra similar. Los oligonucleótidos con secuencias con orden alterado u oligonucleótidos que contienen bases no complementarias, no mostraron efectos. En contraste, sólo alrededor de 20% de las células murió cuando fueron tratadas con un oligonucleótido dirigido al ARN quimérico mitocondrial sentido (Tabla 2). Como se mostró previamente, las células tumorales inhiben la expresión del ARN quimérico mitocondrial antisentido y en consecuencia estas célula poseen un bajo número de copias de este transcrito. Por lo tanto, la muerte celular es inducida más eficientemente por los oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido. Estos resultados sugieren poderosamente que el bajo número de copias del ARN quimérico mitocondrial en células tumorales constituye un blanco para la terapia del cáncer.
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Tabla 2.
Oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido inducen apoptosis en células HL-60. Tratamiento Porcentaje de células apoptóticas Determinado por TUNEL
Control 3.0 % Oligonucleótidos 96.7 % complementarios al ARN quimérico antisentido Oligonucleótidos que contienen 4 nucleótidos no complementarios 4.0 % Oligonucleótidos con secuencia 3.5 % con orden alterado Oligonucleótidos 26.7 % complementarios al ARN quimérico sentido Estaurosporina 98.4 % Oligonucleótidos 3.7 % complementarios al ARN sentido 12S. Oligonucleótidos 4,1 % complementarios al ARN antisentido 12S. ______________________________________________________ En otro estudio , determinamos si el tratamiento de células con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico
mitocondrial antisentido induce la activación de caspasas. Las caspasas son enzimas proteolíticas involucradas activamente en la muerte celular programada o apoptosis. Células HL-60 fueron incubadas con oligonucleótidos dirigidos ARN quimérico mitocondrial antisentido o con estaurosporina por 6 h bajo las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Luego se agregó VAD-fmk (CaspaCe FITC-VAD-FMK, Promega) conjugado con fluoresceína al cultivo, y se incubó por 30 min a 37ºC. Vad-fmk es un fuerte inhibidor de las caspasas y se une a las proteasas con muy alta afinidad (Gracia-Calvo y colab., 1998). Las células fueron lavadas por centrifugación, montadas en portaobjetos y observadas en un microscopio de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 9, el tratamiento de las células HL-60 con el oligonucleótido dirigido al ARN quimérico mitocondrial antisentido indujo activación de las caspasas, hasta un nivel similar al alcanzado con estaurosporina. No se obtuvo activación de caspasas con oligonucleótidos dirigidos contra el ARN mitocondrial 12S antisentido usado como control.
Las células tratadas con oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido muestran otros cambios compatibles con apoptosis. La observación al microscopio electrónico muestra fragmentación nuclear y condensación de cromatina. La fragmentación nuclear se demostró también tiñendo los núcleos con DAPI.
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Después del tratamiento con estos oligonucleótidos dirigidos al ARN quimérico mitocondrial antisentido, las células sufren fragmentación nuclear como revela la tinción con DAPI (Figuras 9E y 9F).
EJEMPLO 11.
Otras células tumorales también sufren muerte celular cuando son tratadas con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido.
Otras células tumorales fueron tratadas con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido según el protocolo descrito en el Ejemplo 10. Las células fueron incubadas en sus condición óptima de acuerdo a la recomendación de la ATCC y se agregó oligonucleótido 2 µM junto con PEI durante el período inicial de experimento. Seis horas después se efectuó una segunda adición del oligonucleótido a la misma concentración y se determinó el efecto unas 15 h después de iniciar el experimento. La muerte celular se determinó por tinción con DAPI y por recuento del número de células con núcleo fragmentado. Como se ve en la Tabla 3, sobre un 70% de las células tratadas con oligonucleótidos sufren apoptosis. Es importante notar que las células de melanoma, células de linfoma y las del carcinoma mamario MCF/7, conocidas por su resistencia al tratamiento por drogas, sufren apoptosis en gran proporción (Tabla 3).
Tabla 3.
Inducción de apoptosis en células tumorales por tratamiento con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido.
Células Porcentaje de Células Apoptóticas*
(tinción con DAPI )
MCF/7 89 %±9
Melanoma 4295 86 %±7
Hep G2 93 %±3
Hela 91 %±5
DU145 89 %±6
Linfoma de Devernelle 87 %±5
Caco-2 64 %±7
* El tratamiento fue por 15 h con oligonucleótidos 2 µM. La apoptosis en células sin tratamiento o tratadas con oligonucleótidos desordenados o no complementarios, varía entre 3 y 10%
Para determinar si hay regiones en el transcrito que sean blancos más eficientes en inducir apoptosis por parte de los oligonucleótidos se realizaron los siguientes experimentos. La inducción de apoptosis se estudió en células HeLa, HL-60 y MCF/7 con oligonucleótidos de alrededor de 20 nucleótidos, dirigidos cada aproximadamente 30 nucleótidos, partiendo de el extremo 5’ del ARN quimérico mitocondrial antisentido. Al tiempo cero se agregaron 1µM de oligonucleótidos junto con PEI. Este tratamiento fue repetido 6h más tarde. Quince horas después del comienzo del experimento la proporción de células en apoptosis se determinó por tratamiento con DAPI y recuento de las células con núcleos fragmentados. Aún cuando la mayoría de los oligonucleótidos produjeron un grado variable de apoptosis, la región de una hebra del ARN quimérico mitocondrial antisentido resultó un mejor blanco para inducir la muerte celular. Los oligonucleótidos dirigidos a la posible región de doble hebra o la estructura de asa del ARN quimérico mitocondrial antisentido fueron menos efectivos.
La apoptosis puede ser determinada por tinción con azul tripán, tinción de yoduro de propidio e inmunoquímica de anexina. En dichas técnicas, las células pueden ser analizadas por microscopía fluorescente o citometría de flujo. La fragmentación del DNA puede ser medida por TUNEL o por electroforesis para revelar el tamaño de los trozos de
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ADN. El análisis por Western blot puede ser usado para determinar el procesamiento de proteínas tales como las caspasas, poli(ADP-Rib) sintetasa, etc.
EJEMPLO 12
Las células normales en proliferación o en reposo tratadas con oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido son refractarias a la apoptosis.
Como se describió anteriormente las células normales en proliferación sobreexpresan el ARN quimérico mitocondrial antisentido así como el ARN quimérico mitocondrial sentido. Las células en reposo proliferativo no expresan ninguno de estos transcritos. Por lo tanto es importante determinar si los oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido inducen la muerte de las células normales.
Linfocitos humanos se estimularon con PHA 10 µg por ml por 48 h como se describe en el Ejemplo 8. Paralelamente linfocitos control se incubaron también 48 h pero sin PHA. A las 48 h se les agregó 15 µM de oligonucleótido mezclado con PEI (ver Ejemplo 10) a los cultivos de células estimuladas y controles, los que después fueron incubados por 15h. La concentración de oligonucleótido fue 10 veces mayor que la concentración usada en experimentos anteriores (1 – 2 µM). Otras muestras de linfocitos estimulados o control se trataron con 0.4 µM estaurosporina por el mismo período de tiempo. Al terminar el experimento la muerte celular fue medida por tinción con azul tripán o DAPI. Como se ve en la Figura 10, los linfocitos control y los linfocitos estimulados con PHA incubados por 15 h sin oligonucleótido mostraron un nivel similar de apoptosis espontánea que variaba entre 7 y 10% en diferentes experimentos. Un resultado similar se obtuvo con una concentración menor (1 – 2 µM) de oligonucleótido. También los linfocitos controles y estimulados incubados con 15 µM de oligonucleótido mostraron un parecido bajo nivel de apoptosis (alrededor de 10%) (Figura 10). Por el contrario, los linfocitos control o estimulados con PHA e incubados con estaurosporina también por 15 h tuvieron sobre el 80% de apoptosis (Figura 10). Este es un resultado muy importante porque demuestra que las células normales en reposo proliferativo o las células normales en proliferación, como los linfocitos humanos son refractarias a la inducción de apoptosis por oligonucleótidos complementarios al ARN quimérico mitocondrial antisentido. En otras palabras, la inducción de apoptosis en células tumorales interfiriendo con el ARN quimérico mitocondrial antisentido es una táctica selectiva para la terapia del cáncer.
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Warburg, “On the origin of cancer cells”, Science, 123:309-314, 1956.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<100> Información General
<110> Burzio, Luis O.; Villegas, Jaime; Burzio, Verónica A.
<120> Marcadores para células pre-cancerosas y cancerosas y el método para interferir con la proliferación celular en ellas
<130> P68863US1
<140>
<141>
<150> US 60/472,106
<151> 2003-05-21
<160> NUMERO DE SEQ ID NOS: 197
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 1
<211> LONGITUD: 2374
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<222> UBICACION:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 1
tctaatactg gtgatgctag aggtgatgtt tttggtaaac aggcggggta agatttgccg 60 agttcctttt acttttttta acctttcctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga 120 gggtaataat gacttgttgg ttgattgtag atattgggct gttaattgtc agttcagtgt 180 tttaatctga cgcaggctta tgcggaggag aatgttttca tgttacttat actaacatta 240 gttcttctat agggtgatag attggtccaa ttgggtgtga ggagttcagt tatatgtttg 300 ggatttttta ggtagtgggt gttgagcttg aacgctttct taattggtgg ctgcttttag 360 gcctactatg ggtgttaaat tttttactct ctctacaagg ttttttccta gtgtccaaag 420 agctgttcct ctttggacta acagttaaat ttacaagggg atttagaggg ttctgtgggc 480 aaatttaaag ttgaactaag attctatctt ggacaaccag ctatcaccag gctcggtagg 540 tttgtcgcct ctacctataa atcttcccac tattttgcta catagacggg tgtgctcttt 600 tagctgttct taggtagctc gtctggtttc gggggtctta gctttggctc tccttgcaaa 660 gttatttcta gttaattcat tatgcagaag gtataggggt tagtccttgc tatattatgc 720 ttggttataa tttttcatct ttcccttgcg gtactatatc tattgcgcca ggtttcaatt 780 tctatcgcct atactttatt tgggtaaatg gtttggctaa acctagcccc aaacccactc 840 caccttacta ccagacaacc ttagccaaac catttaccca aataaagtat aggcgataga 900 aattgaaacc tggcgcaata gatatagtac cgcaagggaa agatgaaaaa ttataaccaa 960 gcataatata gcaaggacta acccctatac cttctgcata atgaattaac tagaaataac 1020 tttgcaagga gagccaaagc taagaccccc gaaaccagac gagctaccta agaacagcta 1080 aaagagcaca cccgtctatg tagcaaaata gtgggaagat ttataggtag aggcgacaaa 1140 cctaccgagc ctggtgatag ctggttgtcc aagatagaat cttagttcaa ctttaaattt 1200 gcccacagaa ccctctaaat ccccttgtaa atttaactgt tagtccaaag aggaacagct 1260 ctttggacac taggaaaaaa ccttgtagag agagtaaaaa atttaacacc catagtaggc 1320 ctaaaagcag ccaccaatta agaaagcgtt caagctcaac acccactacc taaaaaatcc 1380 caaacatata actgaactcc tcacacccaa ttggaccaat ctatcaccct atagaagaac 1440 taatgttagt ataagtaaca tgaaaacatt ctcctccgca taagcctgcg tcagattaaa 1500 acactgaact gacaattaac agcccaatat ctacaatcaa ccaacaagtc attattaccc 1560 tcactgtcaa cccaacacag gcatgctcat aaggaaaggt taaaaaaagt aaaaggaact 1620 cggcaaatct taccccgcct gtttaccaaa aacatcacct ctagcatcac cagtattaga 1680 ggcaccgcct gcccagtgac acatgtttaa cggccgcggt accctaaccg tgcaaaggta 1740 gcataatcac ttgttcctta aatagggacc tgtatgaatg gctccacgag ggttcagctg 1800 tctcttactt ttaaccagtg aaattgacct gcccgtgaag aggcgggcat aacacagcaa 1860 gacgagaaga ccctatggag ctttaattta ttaatgcaaa cagtacctaa caaacccaca 1920 ggtcctaaac taccaaacct gcattaaaaa tttcggttgg ggcgacctcg gagcagaacc 1980 caacctccga gcagtacatg ctaagacttc accagtcaaa gcgaactact atactcaatt 2040 gatccaataa cttgaccaac ggaacaagtt accctaggga taacagcgca atcctattct 2100 agagtccata tcaacaatag ggtttacgac ctcgatgttg gatcaggaca tcccgatggt 2160 gcagccgcta ttaaaggttc gtttgttcaa cgattaaagt cctacgtgat ctgagttcag 2220
accggagtaa tccaggtcgg tttctatcta ccttcaaatt cctccctgta cgaaaggaca 2280 agagaaataa ggcctacttc acaaagcgcc ttcccccgta aatgatatca tctcaactta 2340
gtattatacc cacacccacc caagaacagg gttt 2374
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 2
<211> LONGITUD: 1679
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<222> UBICACION:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 2
ggggtcttag ctttggctct ccttgcaaag ttatttctag ttaattcatt atgcagaagg 60 tataggggtt agtccttgct atattatgct tggttataat ttttcatctt tcccttgcgg 120 tgctaaacct agccccaaac ccactccacc ttactaccag acaaccttag ccaaaccatt 180 tacccaaata aagtataggc gatagaaatt gaaacctggc gcaatagata tagtaccgca 240 agggaaagat gaaaaattat aaccaagcat aatatagcaa ggactaaccc ctataccttc 300 tgcataatga attaactaga aataactttg caaggagagc caaagctaag acccccgaaa 360 ccagacgagc tacctaagaa cagctaaaag agcacacccg tctatgtagc aaaatagtgg 420 gaagatttat aggtagaggc gacaaaccta ccgagcctgg tgatagctgg ttgtccaaga 480 tagaatctta gttcaacttt aaatttgccc acagaaccct ctaaatcccc ttgtaaattt 540 aactgttagt ccaaagagga acagctcttt ggacactagg aaaaaacctt gtagagagag 600 taaaaaattt aacacccata gtaggcctaa aagcagccac caattaagaa agcgttcaag 660 ctcaacaccc actacctaaa aaatcccaaa catataactg aactcctcac acccaattgg 720 accaatctat caccctatag aagaactaat gttagtataa gtaacatgaa aacattctcc 780 tccgcataag cctgcgtcag attaaaacac tgaactgaca attaacagcc caatatctac 840 aatcaaccaa caagtcatta ttaccctcac tgtcaaccca acacaggcat gctcataagg 900 aaaggttaaa aaaagtaaaa ggaactcggc aaatcttacc ccgcctgttt accaaaaaca 960 tcacctctag catcaccagt attagaggca ccgcctgccc agtgacacat gtttaacggc 1020 cgcggtaccc taaccgtgca aaggtagcat aatcacttgt tccttaaata gggacctgta 1080 tgaatggctc cacgagggtt cagctgtctc ttacttttaa ccagtgaaat tgacctgccc 1140 gtgaagaggc gggcataaca cagcaagacg agaagaccct atggagcttt aatttattaa 1200 tgcaaacagt acctaacaaa cccacaggtc ctaaactacc aaacctgcat taaaaatttc 1260 ggttggggcg acctcggagc agaacccaac ctccgagcag tacatgctaa gacttcacca 1320 gtcaaagcga actactatac tcaattgatc caataacttg accaacggaa caagttaccc 1380 tagggataac agcgcaatcc tattctagag tccatatcaa caatagggtt tacgacctcg 1440 atgttggatc aggacatccc aatggtgcag ccgctattaa aggttcgttt gttcaacgat 1500 taaagtccta cgtgatctga gttcagaccg gagtaatcca ggtcggtttc tatctacttc 1560 aaattcctcc ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc 1620 ccgtaaatga tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggttt 1679
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 3
<211> LONGITUD: 1635
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION:
<222> UBICACION:
<400> SECUENCIA: 3
ggggtcttag ctttggctct ccttgcaaag ttatttctag ttaattcatt atgcagaagg 60 tataggggtt agtccttgct aaacctagcc ccaaacccac tccaccttac taccagacaa 120 ccttagccaa accatttacc caaataaagt ataggcgata gaaattgaaa cctggcgcaa 180 tagatatagt accgcaaggg aaagatgaaa aattataacc aagcataata tagcaaggac 240 taacccctat accttctgca taatgaatta actagaaata actttgcaag gagagccaaa 300 gctaagaccc ccgaaaccag acgagctacc taagaacagc taaaagagca cacccgtcta 360 tgtagcaaaa tagtgggaag atttataggt agaggcgaca aacctaccga gcctggtgat 420
agctggttgt ccaagataga atcttagttc aactttaaat ttgcccacag aaccctctaa 480 atccccttgt aaatttaact gttagtccaa agaggaacag ctctttggac actaggaaaa 540 aaccttgtag agagagtaaa aaatttaaca cccatagtag gcctaaaagc agccaccaat 600 taagaaagcg ttcaagctca acacccacta cctaaaaaat cccaaacata taactgaact 660 cctcacaccc aattggacca atctatcacc ctatagaaga actaatgtta gtataagtaa 720 catgaaaaca ttctcctccg cataagcctg cgtcagatta aaacactgaa ctgacaatta 780 acagcccaat atctacaatc aaccaacaag tcattattac cctcactgtc aacccaacac 840 aggcatgctc ataaggaaag gttaaaaaaa gtaaaaggaa ctcggcaaat cttaccccgc 900 ctgtttacca aaaacatcac ctctagcatc accagtatta gaggcaccgc ctgcccagtg 960 acacatgttt aacggccgcg gtaccctaac cgtgcaaagg tagcataatc acttgttcct 1020 taaataggga cctgtatgaa tggctccacg agggttcagc tgtctcttac ttttaaccag 1080 tgaaattgac ctgcccgtga agaggcgggc ataacacagc aagacgagaa gaccctatgg 1140 agctttaatt tattaatgca aacagtacct aacaaaccca caggtcctaa actaccaaac 1200 ctgcattaaa aatttcggtt ggggcgacct cggagcagaa cccaacctcc gagcagtaca 1260 tgctaagact tcaccagtca aagcgaacta ctatactcaa ttgatccaat aacttgacca 1320 acggaacaag ttaccctagg gataacagcg caatcctatt ctagagtcca tatcaacaat 1380 agggtttacg acctcgatgt tggatcagga catcccaatg gtgcagccgc tattaaaggt 1440 tcgtttgttc aacgattaaa gtcctacgtg atctgagttc agaccggagt aatccaggtc 1500 ggtttctatc tacttcaaat tcctccctgt acgaaaggac aagagaaata aggcctactt 1560 cacaaagcgc cttcccccgt aaatgatatc atctcaactt agtattatac ccacacccac 1620 ccaagaacag ggttt 1635
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 4
<211> LONGITUD: 1921
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<222> UBICACION
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 4
aacctccgag cagtacatgc taagacttca ccagtcaaag cgaactacta tactcaattg 60 atccaataac ttgaccaacg gaacaagtta ccctagggat aacagcgcaa tcctattcta 120 gagtccatat caacaatagg gtttacgacc tcgatgttgg atcaggacat cccaatggtg 180 cagccgctat taaaggttcg tttgttcaac gattaaagtc ctacgtgatc tgagttcaga 240 ccggagtaat ccaggtcggt ttctatctac ttcaaattcc tccctgtacg aaaggacaag 300 agaaataagg cctacttcac aaagcgcctt cccccgtaaa tgatatcatc tcaacttagt 360 attataccct gttcttgggt gggtgtgggt ataatactaa gttgagatga tatcatttac 420 gggggaaggc gctttgtgaa gtaggcctta tttctcttgt cctttcgtac agggaggaat 480 ttgaagtaga tagaaaccga cctggattac tccggtctga actcagatca cgtaggactt 540 taatcgttga acaaacgaac ctttaatagc ggctgcacca tcgggatgtc ctgatccaac 600 atcgaggtcg taaaccctat tgttgatatg gactctagaa taggattgcg ctgttatccc 660 tagggtaact tgttccgttg gtcaagttat tggatcaatt gagtatagta gttcgctttg 720 actggtgaag tcttagcatg tactgctcgg aggttgggtt ctgctccgag gtcgccccaa 780 ccgaaatttt taatgcaggt ttggtagttt aggacctgtg ggtttgttag gtactgtttg 840 cattaataaa ttaaagctcc atagggtctt ctcgtcttgc tgtgttatgc ccgcctcttc 900 acgggcaggt caatttcact ggttaaaagt aagagacagc tgaaccctcg tggagccatt 960 catacaggtc cctatttaag gaacaagtga ttatgctacc tttgcacggt tagggtaccg 1020 cggccgttaa acatgtgtca ctgggcaggc ggtgcctcta atactggtga tgctagaggt 1080 gatgtttttg gtaaacaggc ggggtaagat ttgccgagtt ccttttactt tttttaacct 1140 ttccttatga gcatgcctgt gttgggttga cagtgagggt aataatgact tgttggttga 1200 ttgtagatat tgggctgtta attgtcagtt cagtgtttta atctgacgca ggcttatgcg 1260 gaggagaatg ttttcatgtt acttatacta acattagttc ttctataggg tgatagattg 1320 gtccaattgg gtgtgaggag ttcagttata tgtttgggat tttttaggta gtgggtgttg 1380 agcttgaacg ctttcttaat tggtggctgc ttttaggcct actatgggtg ttaaattttt 1440 tactctctct acaaggtttt ttcctagtgt ccaaagagct gttcctcttt ggactaacag 1500 ttaaatttac aaggggattt agagggttct gtgggcaaat ttaaagttga actaagattc 1560 tatcttggac aaccagctat caccaggctc ggtaggtttg tcgcctctac ctataaatct 1620 tcccactatt ttgctacata gacgggtgtg ctcttttagc tgttcttagg tagctcgtct 1680
ggtttcgggg gtcttagctt tggctctcct tgcaaagtta tttctagtta attcattatg 1740 cagaaggtat aggggttagt ccttgctata ttatgcttgg ttataatttt tcatctttcc 1800 cttgcggtac tatatctatt gcgccaggtt tcaatttcta tcgcctatac tttatttggg 1860 taaatggttt ggctaaggtt gtctggtagt aaggtggagt gggtttgggg ctaggtttag 1920 c 1921
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 5
<211> LONGITUD: 1744
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<222> UBICACION:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 5
tagggataac agcgcaatcc tattctagag tccatatcaa caatagggtt tacgacctcg 60 atgttggatc aggacatccc gatggtgcag ccgctattaa aggttcgttt gttcaacgat 120 taaagtccta cgtgatctga gttcagaccg gagtaatcca ggtcggtttc tatctacctt 180 caaattcctc cctgttcttg ggtgggtgtg ggtataatac taagttgaga tgatatcatt 240 tacgggggaa ggcgctttgt gaagtaggcc ttatttctct tgtcctttcg tacagggagg 300 aatttgaagt agatagaaac cgacctggat tactccggtc tgaactcaga tcacgtagga 360 ctttaatcgt tgaacaaacg aacctttaat agcggctgca ccatcgggat gtcctgatcc 420 aacatcgagg tcgtaaaccc tattgttgat atggactcta gaataggatt gcgctgttat 480 ccctagggta acttgttccg ttggtcaagt tattggatca attgagtata gtagttcgct 540 ttgactggtg aagtcttagc atgtactgct cggaggttgg gttctgctcc gaggtcgccc 600 caaccgaaat ttttaatgca ggtttggtag tttaggacct gtgggtttgt taggtactgt 660 ttgcattaat aaattaaagc tccatagggt cttctcgtct tgctgtgtta tgcccgcctc 720 ttcacgggca ggtcaatttc actggttaaa agtaagagac agctgaaccc tcgtggagcc 780 attcatacag gtccctattt aaggaacaag tgattatgct acctttgcac ggttagggta 840 ccgcggccgt taaacatgtg tcactgggca ggcggtgcct ctaatactgg tgatgctaga 900 ggtgatgttt ttggtaaaca ggcggggtaa gatttgccga gttcctttta ctttttttaa 960 cctttcctta tgagcatgcc tgtgttgggt tgacagtgag ggtaataatg acttgttggt 1020 tgattgtaga tattgggctg ttaattgtca gttcagtgtt ttaatctgac gcaggcttat 1080 gcggaggaga atgttttcat gttacttata ctaacattag ttcttctata gggtgataga 1140 ttggtccaat tgggtgtgag gagttcagtt atatgtttgg gattttttag gtagtgggtg 1200 ttgagcttga acgctttctt aattggtggc tgcttttagg cctactatgg gtgttaaatt 1260 ttttactctc tctacaaggt tttttcctag tgtccaaaga gctgttcctc tttggactaa 1320 cagttaaatt tacaagggga tttagagggt tctgtgggca aatttaaagt tgaactaaga 1380 ttctatcttg gacaaccagc tatcaccagg ctcggtaggt ttgtcgcctc tacctataaa 1440 tcttcccact attttgctac atagacgggt gtgctctttt agctgttctt aggtagctcg 1500 tctggtttcg ggggtcttag ctttggctct ccttgcaaag ttatttctag ttaattcatt 1560 atgcagaagg tataggggtt agtccttgct atattatgct tggttataat ttttcatctt 1620 tcccttgcgg tactatatct attgcgccag gtttcaattt ctatcgccta tactttattt 1680 gggtaaatgg tttggctaag gttgtctggt agtaaggtgg agtgggtttg gggctaggtt 1740 tagc 1744
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 6
<211> LONGITUD: 1854
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Homo sapiens
<220> CARACTERISTICAS:
<222> UBICACION:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 6
gaactcggca aatcttaccc cgcctgttta ccaaaaacat cacctctagc atcaccagta 60 ttagaggcac cgcctgccca gtgacacatg tttaacggcc gcggtaccct aaccgtgcaa 120
aggtagcata atcacttgtt ccttaaatag ggacctgtat gaatggctcc acgagggttc 180 agctgtctct tacttttaac cagtgaaatt gacctgcccg tgaagaggcg ggcatgacac 240 agcaagacga gaagacccta tggagcttta atttattaat gcaaacagta cctaacaaac 300 cctgttcttg ggtgggtgtg ggtataatac taagttgaga tgatatcatt tacgggggaa 360 ggcgctttgt gaagtaggcc ttatttctct tgtcctttcg tacagggagg aatttgaagt 420 agatagaaac cgacctggat tactccggtc tgaactcaga tcacgtagga ctttaatcgt 480 tgaacaaacg aacctttaat agcggctgca ccatcgggat gtcctgatcc aacatcgagg 540 tcgtaaaccc tattgttgat atggactcta gaataggatt gcgctgttat ccctagggta 600 acttgttccg ttggtcaagt tattggatca attgagtata gtagttcgct ttgactggtg 660 aagtcttagc atgtactgct cggaggttgg gttctgctcc gaggtcgccc caaccgaaat 720 ttttaatgca ggtttggtag tttaggacct gtgggtttgt taggtactgt ttgcattaat 780 aaattaaagc tccatagggt cttctcgtct tgctgtgtta tgcccgcctc ttcacgggca 840 ggtcaatttc actggttaaa agtaagagac agctgaaccc tcgtggagcc attcatacag 900 gtccctattt aaggaacaag tgattatgct acctttgcac ggttagggta ccgcggccgt 960 taaacatgtg tcactgggca ggcggtgcct ctaatactgg tgatgctaga ggtgatgttt 1020 ttggtaaaca ggcggggtaa gatttgccga gttcctttta ctttttttaa cctttcctta 1080 tgagcatgcc tgtgttgggt tgacagtgag ggtaataatg acttgttggt tgattgtaga 1140 tattgggctg ttaattgtca gttcagtgtt ttaatctgac gcaggcttat gcggaggaga 1200 atgttttcat gttacttata ctaacattag ttcttctata gggtgataga ttggtccaat 1260 tgggtgtgag gagttcagtt atatgtttgg gattttttag gtagtgggtg ttgagcttga 1320 acgctttctt aattggtggc tgcttttagg cctactatgg gtgttaaatt ttttactctc 1380 tctacaaggt tttttcctag tgtccaaaga gctgttcctc tttggactaa cagttaaatt 1440 tacaagggga tttagagggt tctgtgggca aatttaaagt tgaactaaga ttctatcttg 1500 gacaaccagc tatcaccagg ctcggtaggt ttgtcgcctc tacctataaa tcttcccact 1560 attttgctac atagacgggt gtgctctttt agctgttctt aggtagctcg tctggtttcg 1620 ggggtcttag ctttggctct ccttgcaaag ttatttctag ttaattcatt atgcagaagg 1680 tataggggtt agtccttgct atattatgct tggttataat ttttcatctt tcccttgcgg 1740 tactatatct attgcgccag gtttcaattt ctatcgccta tactttattt gggtaaatgg 1800 tttggctaag gttgtctggt agtaaggtgg agtgggtttg gggctaggtt tagc 1854
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 7
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 7
taggtttagc accgcaaggg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 8
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 8
taggtttagc aaggactaac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 9
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 9
ggggtaagat ttgccgag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 10
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 10
atgctagagg tgatgttttt gg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 11
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 11
cggtgcctct aatactgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 12
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 12
gttaaacatg tgtcactggg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 13
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 13
ttgcacggtt agggtacc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 14
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 14
ggaacaagtg attatgctac c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 15
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 15
ggagccattc atacaggtcc c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 16
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 16
agtaagagac agctgaaccc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 17
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 17
ggcaggtcaa tttcactgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 18
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 18
gctgtgttat gcccgcctc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 19
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 19
agctccatag ggtcttctc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 20
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 20
gttaggtact gtttgcatta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 21
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 21
aagtcttagc atgtactg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 22
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 22
tagtagttcg ctttgactg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 23
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 23
caagttattg gatcaattg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 24
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 24
gggtaacttg ttccgttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 25
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 25
aataggattg cgctgtta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 26
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 26
cctattgttg atatggac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 27
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial <220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 27
ctgatccaac atcgagg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 28
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 28
tagcggctgc accattgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 29
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 29
gttgaacaaa cgaaccttt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 30
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 30
aactcagatc acgtaggac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 31
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 31
cgacctggat tactccgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 32
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 32
ggaatttgaa gtagatag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 33
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA <213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 33
ctcttgtcct ttcgtacag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 34
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 34
ggcgctttgt gaagtagg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 35
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 35
gttgagatga tatcatttac gg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 36
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 36
cacccaccca agaacagg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 37
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 37
caacttagta ttatacccac accca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 38
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 38
tcccccgtaa atgattacat ct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 39
<211> LONGITUD: 25 <212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 39
gagaaataag gcctacttca caaag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 40
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 40
caaattcctc cctgtacgaa ag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 41
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 41
agtaatccag gtcggtttct atct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 42
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 42
aagtcctagc tgatctgagt tcag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 43
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 43
gctattaaag gttcgtttgt tcaac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 44
<211> LONGITUD: 16
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 44
tcccgatggt gcagcc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 45 <211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 45
ttacgacctc gatgttggat ca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 46
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 46
atcctattct agagtccata tcaac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 47
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 47
aataggattg cgctgttatc ccta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 48
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 48
tagggataac agcgcatacc tatt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 49
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 49
ggaacaagtt accctaggga taa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 50
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 50
ttgatccaat aacttgacca acg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 51
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 51
acttcaccag tcaaagcgaa c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 52
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 52
aacccaacct ccgagcag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 53
<211> LONGITUD: 16
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 54
gttggggcga cctcgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 55
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 55
aaactaccaa acctgctta aaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 56
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 56
aaacagtacc taacaaaccc acag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 57
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 57
gaccctatgg agctttaatt tatta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 58
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 58
cataacacag caagacgaga aga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 59
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 59
tgacctgccc gtgaagag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 60
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 60
cagctgtctc ttacttttaa ccagtg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 61
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 61
ctgtatgaat ggctccacga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 62
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 62
agcataatca cttgttcctt aaatag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 63
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 63
accgtgcaaa ggtagcataa tca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 64
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 64
tgattatgct acctttgcac ggt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 65
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 65
gtaccctaac cgtgcaaag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 66
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 66
cctgcccagtgacacatgtt t
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 67
<211> LONGITUD: 25
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 67
cacctctagc atcaccagta ttaga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 68
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 68
cttaccccgc ctgtttacca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 69
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 69
aggttaaaaa aagtaaaagg aactcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 70
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 70
cccaacacag gcatgctca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 71
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 71
accaacaagt cattattacc ctca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 72
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 72
tgacaattaa cagcccaata tcta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 73
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 73
gcctgcgtca gattaaaaca c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 74
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 74
gtaacatgaa aacattctcc tccg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 75
<211> LONGITUD: 28
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 75
tatcacccta tagaagaact aatgttag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 76
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 76
ctgaactcct cacacccaat t
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 77
<211> LONGITUD: 23
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 77
cactacctaa aaaatcccaa aca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 78
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 78
ttaagaaagc gttcaagctc a
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 79
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 79
catagtaggc ctaaaagcag c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 80
<211> LONGITUD: 26
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 80
aaaccttgta gagagagtaa aaaatt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 81
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 81
aaagaggaac agctctttgg acac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 82
<211> LONGITUD: 24
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 82
aatccccttg taaatttaac tgtt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 83
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 83
ctttaaattt gcccacagaa c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 84
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 84
ggttgtccaa gatagaatct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 85
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 85
acaaacctac cgagcctgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 86
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 86
aagatttata ggtagaggcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 87
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 87
cccgtctatg tagcaaaata
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 88
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 88
acctaagaac agctaaaaga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 89
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 89
taagaccccc gaaaccagac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 90
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 90

ataactttgc aaggagagcc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 91
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 91
cttctgcata atgaattaac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 92
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 92
atatagcaag gactaacccc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 93
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 93
agatgaaaaa ttataaccaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 94
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 94
caatagatat agtaccgcaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 95
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 95
aggcgataga aattgaaacc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 96
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 96
tagccaaacc atttacccaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 97
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 97
caccttacta ccagacaacc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 98
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 98
ctaaacctag ccccaaacc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 99
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 99
ctagcatcac cagtattaga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 100
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 100
ttaccaaaaa catcacctct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 101
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 101
gaactcggca aatcttaccc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 102
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido codificante
<400> SECUENCIA: 102
gggtaagatt tgccgagttc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 103
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 103
gctcataagg aaaggttaaa a
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 104
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 104
gtcaacccaa cacaggc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 105
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 105
accaacaagt cattattacc c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 106
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido codificante
<400> SECUENCIA: 106
ggttgattgt agatattggg ct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 107
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 107
attaacagcc caatatctac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 108
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 108
tgcgtcagat taaaacactg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 109
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 109
aaaacattct cctccgcata
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 110
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 110
gttagtataa gtaacatg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 111
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 111
tggaccaatc tatcaccct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 112
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 112
acatataact gaactcctca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 113
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 113
cacccactac ctaaaaaatc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 114
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 114
caccaattaa gaaagcgttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 115
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 115
taggcctaaa agcagccacc aa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 116
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido codificante
<400> SECUENCIA: 116
ttggtggctg cttttaggccta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 117
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 117
taacacccat agtaggcct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 118
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 118
aaccttgtag agagagtaaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 119
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 119
aacagctctt tggacactag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 120
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 120
aactgttagt ccaaagag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 121
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 121
ctctaaatcc ccttgtaaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 122
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 122
actttaaatt tgcccacag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 123
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 123
ggttgtccaa gatagaatc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 124
<211> LONGITUD: 190
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 124
acaaacctac cgagcctcc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 125
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 125
atttataggt tagaggcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 126
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 126
atgtagcaaa atagtgggaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 127
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 127
taagaacagc taaaagagca c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 128
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 128
cgaaaccaga cgagctac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 129
<211> LONGITUD: 22
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido codificante
<400> SECUENCIA: 129
ggggtcttag ctttggctct cc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 130
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 130
taactttgca aggagagcca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 131
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 131
accttctgca taatgaat
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 132
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 132
atatagcaag gactaaccc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 133
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 133
gatgaaaaat tataaccaag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 134
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 134
aatagatata gtaccgcaag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 135
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 135
cgatagaaat tgaaacc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 136
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido codificante
<400> SECUENCIA: 136
tactttattt gggtaaatgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 137
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 137
ccatttaccc aaataaagta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 138
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 138
ttagccaaac catttaccca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 139
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 139
aaggtggagt gggtttgggg c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 140
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 140
gctaaggttg tctggta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 141
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 141
atcgcctata ctttatttgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 142
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 142
atctattgcg ccaggtttca
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 143
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 143
ttttcatctt tcccttgcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 144
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 144
tccttgctat attatgcttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 145
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 145
cattatgcag aaggtatagg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 146
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 146
tctccttgca aagttatt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 147
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 147
tttcgggggt cttagctttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 148
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 148
ctgttcttag gtagctcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 149
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 149
tgctacatag acgggtgtg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 150
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 150
cctctaccta taaatcttcc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 151
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 151
gctatcacca ggctcgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 152
<211> LONGITUD: 17
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 152
aagttgaact aagattc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 153
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 153
gagggttctg tgggcaaatt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 154
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 154
acagttaaat ttacaaggg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 155
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 155
gtgtccaaag agctgttcc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 156
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 156
tactctctct acaaggtttt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 157
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 157
taggcctact atgggtgtta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 158
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 158
aacgctttct taattggtgg c
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 159
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 159
ttttaggtag tgggtgttga
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 160
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 160
ggagttcagt tatatgtttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 161
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 161
tgatagattg gtccaattgg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 162
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 162
ctaacattag ttcttctata g
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 163
<211> LONGITUD: 18
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 163
atgcggagga gaatgttt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 164
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 164
tcagtgtttt aatctgacg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
<210> SEQ ID NO 165
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION: Oligonucleótido antisentido
<400> SECUENCIA: 165
gtagatattg ggctgttaatt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 166
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 166
gtgagggtaa taatgacttg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 167
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 167
atgagcatgc ctgtgttggt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 168
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 168
ggtaagattt gccgagttc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 169
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 169
tggtgatgct agaggtgatg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 170
<211> LONGITUD: 15
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 170
gcggtgcctc taata
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 171
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 171
ggccgttaaa catgtgtcac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 172
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 172
tgattatgct acctttgcac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 173
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 173
ttaaggaaca agtgattatg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 174
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 174
tggagccatt catacaggtc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 175
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 175
aaaagtaaga gacagctgaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 176
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 176
cacgggcagg tcaatttcac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 177
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 177
gtcttgctgt gttatgcccg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 178
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 178
aattaaagct ccatagggt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 179
<211> LONGITUD: 21
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 179
gtttgttagg tactgtttgc a
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 180
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 180
aggtttggta gtttaggac
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 181
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 181
gccccaaccg aaatttttaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 182
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 182
ctcggaggtt gggttctgct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 183
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 183
ctggtgaagt cttagcatgt
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 184
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 184
caattgagta tagtagttcg
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 185
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 185
tgttccgttg gtcaagtta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 186
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 186
aataggattg cgctgttatc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 187
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 187
attgttgata tggactctag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 188
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 188
atccaacatc gaggtcgtaa
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 189
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 189
gcggctgcac catcgggat
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 190
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 190
ttgaacaaac gaaccttta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 191
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 191
aactcagatc acgtaggact
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 192
<211> LONGITUD: 19
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 192
aaaccgacct ggattactc
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 193
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 193
agggaggaat ttgaaggtag
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 194
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 194
ggccttattt ctcttgtcct
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 195
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 195
ggaaggcgct ttgtgaagta
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 196
<211> LONGITUD: 20
<212> TIPO: DNA 5 <213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 196
aagttgagat gatatcattt
10
<200> CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
<210> SEQ ID Nº 197
<211> LONGITUD: 17 15 <212> TIPO: DNA
<213> ORGANISMO: Secuencia artificial
<220> CARACTERISTICAS:
<223> OTRA INFORMACION
<400> SECUENCIA: 197
20 cctgttcttg ggtgggt

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano aislado que comprenden el ARN ribosómico mitocondrial 16S antisentido unido covalentemente en su extremo 5’ al extremo 3’ de un polinucleótido con una secuencia repetida invertida.
  2. 2.
    Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, y SEQ ID NO 6.
  3. 3.
    Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 4.
  4. 4.
    Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARN comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 5.
  5. 5.
    Moléculas de ARN quimérico mitocondrial antisentido según la reivindicación 1, en las que dichos ARNs comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO 6.
  6. 6.
    Uso de uno o más compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 bases de longitud que son suficientemente complementarios a dicha molécula de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para poder hibridar con esa molécula de ARN quimérico mitocondrial humano para formar una pareja estable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o precáncer.
  7. 7.
    Uso según la reivindicación 6, en el que los compuestos u oligonucleótidos se seleccionan de las SEQ ID NOS. 9-97.
  8. 8.
    Uso según la reivindicación 6, en el que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 15 a 50 bases de longitud en los que al menos 15 bases son complementarias a SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y/o SEQ ID No. 6.
  9. 9.
    Uso según la reivindicación 8, en el que en los oligonucleótidos tienen 18-50 bases de longitud.
  10. 10.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que dicho medicamento puede inducir al menos una de muerte de células precancerosas y muerte de células cancerosas en células o tejidos.
  11. 11.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que dicho medicamento está adaptado para la administración conjuntamente con una droga quimioterapéutica para el tratamiento del cáncer.
  12. 12.
    Método de detección seleccionado de
    (A) un método para distinguir entre células normales y células pre-cancerosas o cancerosas que comprende las etapas de:
    determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y
    determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1;
    (B) un método para distinguir entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células pre-cancerosas y células cancerosas, que comprende las etapas de:
    determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y
    determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 2; y
    (C) un método en el que células transformadas con virus ARN se distinguen de células cancerosas o células normales, que comprende la etapa de determinar el nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 3, y
    en el que dichas etapas de determinación no se llevan a cabo in vivo.
  13. 13. Método de detección para distinguir entre células normales y células precancerosas o cancerosas según la reivindicación 12, que comprende las etapas de:
    determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y
    determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1.
  14. 14. Método de detección para distinguir entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células precancerosas y células cancerosas según la reivindicación 12, que comprende las etapas de:
    determinar un nivel de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales antisentido humanos de SEQ ID Nos. 4-6, y
    determinar un nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No 2.
  15. 15.
    Método de detección según la reivindicación 12, en el que células transformadas con virus ARN se distinguen de células cancerosas o células normales mediante la determinación del nivel del ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No 3.
  16. 16.
    Método de detección según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el cada una de dichas etapas de determinación comprende la identificación y cuantificación de al menos uno de los ARNs quiméricos mitocondriales sentido y antisentido mediante al menos uno de los procedimientos siguientes: hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ, Northern blot, hibridación en gota, amplificación de ADNc mediante PCR, TMA o ensayo de protección de ribonucleasa.
  17. 17.
    Método de detección según una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en el que dichas etapas de determinación se llevan a cabo en muestras humanas.
  18. 18.
    Método de detección según la reivindicación 17, en el que dichas muestras humanas comprenden una muestra seleccionada de cortes de tejido congelados o fijados de biopsias humanas, frotis citológicos o suspensiones de células en saliva, orina, sangre, médula ósea, colonocitos, lavado pulmonar, células metastásicas de sangre y linfa.
  19. 19.
    Compuestos u oligonucleótidos de 10 a 50 bases de longitud que son suficientemente complementarios a una molécula de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para poder hibridar con esa molécula de ARN quimérico mitocondrial humano para formar una pareja estable, para su uso como medicamento para el tratamiento del cáncer o precáncer.
  20. 20.
    Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 19, en los que los compuestos u oligonucleótidos se seleccionan de SEQ ID NOS. 9-97.
  21. 21.
    Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 19, en los que los compuestos u oligonucleótidos son oligonucleótidos de 15 a 50 bases de longitud en los que al menos 15 bases son complementarias a SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y/o SEQ ID No. 6.
  22. 22.
    Compuestos u oligonucleótidos según la reivindicación 21, en los que los oligonucleótidos tienen 18-50 bases de longitud.
  23. 23.
    Compuestos u oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en los que dicho medicamento puede inducir al menos una de muerte de células precancerosas y muerte de células cancerosas en células o tejidos.
  24. 24.
    Compuestos u oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en los que dicho medicamento está adaptado para la administración conjuntamente con una droga quimioterapéutica para el tratamiento del cáncer.
  25. 25.
    Kit para hibridación in situ útil para distinguir entre células en proliferación humanas normales y células humanas transformadas o malignas mediante el método de detección según la reivindicación 12, incluyendo el kit:
    (a)
    uno o más oligonucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19-24, en el que dichos oligonucleótidos se marcan para poder detectarse,
    (b)
    reactivo de anticuerpo conjugado para la detección del marcador,
    (e)
    tampón de hibridación y lavado, y
    (d)
    uno o más portaobjetos de células en proliferación humanas normales transformadas o fijadas y uno o más portaobjetos de células malignas o transformadas fijadas, como controles.
  26. 26.
    Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos que tras interferencia inducen muerte de células cancerosas y precancerosas.
  27. 27.
    Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial según la reivindicación 26, en el que dicha interferencia se lleva a cabo mediante un material seleccionado de oligonucleótidos complementarios y ARN de interferencia pequeño.
  28. 28.
    Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos para el diagnóstico de cáncer y precáncer mediante la distinción entre células normales y células cancerosas y precancerosas mediante:
    la determinación de un nivel de al menos uno de los ARNs mitocondriales antisentido humanos según las reivindicaciones 1-5, y
    la determinación de un nivel de un ARN mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 1.
  29. 29. Uso de las moléculas de ARN quimérico mitocondrial humano según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como blancos para el diagnóstico de cáncer y precáncer mediante la distinción entre células normales en reposo proliferativo, células normales en proliferación, células precancerosas y cancerosas mediante:
    la determinación de un nivel de al menos uno de los ARNs mitocondriales antisentido humanos según las reivindicaciones 1-5, y
    la determinación de un nivel de un ARN mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 2.
  30. 30. Uso de la molécula de ARN quimérico mitocondrial de SEQ ID No. 3 como blanco para distinguir células transformadas con virus ARN de células cancerosas o células normales mediante la determinación del nivel de ARN quimérico mitocondrial sentido humano de SEQ ID No. 3.
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