ES2268886T3 - Un nuevo componente en la via de señalizacion de hedgehog. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína Ptch2 humana que tiene la SEC ID Nº 1.
Description
Un nuevo componente en la vía de señalización de
hedgehog.
La presente invención se refiere a nuevas
moléculas, tales como proteínas, polipéptidos y nucleótidos,
implicados en la vía de señalización de hedgehog con una supuesta
implicación en el desarrollo embrionario y carcinogénesis. La
invención también se refiere a diversos usos nuevos y ventajosos de
las moléculas de acuerdo con la invención, por ejemplo, en el
diagnóstico y terapia.
En el estudio del desarrollo de las células, la
mosca de la fruta se ha usado ampliamente como modelo, ya que es
menos compleja que las células de mamífero.
La formación de patrones tiene lugar a través de
una serie de etapas lógicas, reiteradas muchas veces durante el
desarrollo de un organismo. Visto desde una perspectiva evolutiva
más amplia, entre las especies, se observa el mismo tipo de
formaciones de patrones reiterativos. Se ha descrito el dogma
central de la formación de patrones (Lawrence y Struhl, 1996). Se
definen tres etapas interbloqueantes y solapantes. En primer lugar,
la información posicional en forma de gradientes morfogénicos sitúa
las células en etapas no solapantes, encontrando cada conjunto un
compartimiento. En segundo lugar, cada uno de estos compartimientos
adquiere una dirección genética, como resultado de la función de
genes "selectores" activos, que especifican el destino celular
en un compartimiento y también muestran a las células y sus
descendientes cómo comunicarse con células en los compartimientos
adyacentes. La tercera etapa implica interacciones entre células en
compartimientos adyacentes, iniciando nuevos gradientes
morfogénicos, que organizan directamente el patrón.
Tomando estas etapas con mayor detalle, se
descubre que la primera etapa en la formación de patrones es la
definición de conjuntos de células en cada primordio. Las células se
sitúan de acuerdo con sus posiciones con respecto a los ejes
dorsoventral y anterior/posterior por gradientes morfogénicos. La
asignación de las células en el eje dorsoventral constituye las
capas germinales, tales como el mesodermo y el neuroectodermo.
En la segmentación, la segunda etapa (la
especificación del destino celular en cada compartimiento) se
realiza pero por el gen engrailed y los elementos del
complejo bitórax. Engrailed define los compartimientos
anterior y posterior tanto en la segmentación como en la
especificación de extremidades.
La tercera etapa en la formación de patrones, la
secreción de morfogenes, funciona diferenciando los patrones en los
compartimientos (y estableciendo de este modo la polaridad de los
segmentos). Inicialmente, todas las células en un compartimiento son
equipolentes, pero llegan a diversificarse para formar el patrón. La
formación de patrones depende de los gradientes de morfogenes,
gradientes iniciados a lo largo de los límites del compartimiento.
Dichos gradientes se establecen por una señal de corto alcance en
todas las células del compartimiento en el que es activo el gen
selector engrailed mencionado anteriormente. Para la
polaridad de los segmentos, esta señal es Hedgehog. En el
compartimiento adyacente, el gen selector está inactivo, asegurando
que las células sean sensibles a la señal. El intervalo de señal de
Hedgehog es probablemente sólo de unas pocas filas de células; las
células respondedoras llegan a formar una fuente lineal de un
morfogén de largo alcance, que se difunde hacia el exterior en todas
las direcciones. Existen tres Hedgehog conocidas, Sonic (SHH),
Indian (IHH) y Desert (DHH). Las proteínas que codifican pueden
sustituirse entre sí, pero en animales de tipo silvestre, sus
distintas distribuciones provocan actividades únicas. SHH controla
la polaridad del crecimiento de las extremidades, dirige el
desarrollo de las neuronas en el tubo neural ventral y forma
patrones de somitos. IHH controla el desarrollo del hueso
endocondral y DHH es necesaria para la espermiogénesis. Los genes de
hedgehog de vertebrados se expresan en muchos tejidos diferentes,
incluyendo el sistema nervioso periférico, el cerebro, los pulmones,
el hígado, los riñones, los primordios dentales, los genitales y el
endodermo del intestino posterior y el intestino anterior.
Por tanto, se han identificado los genes de
polaridad de los segmentos en las moscas como mutaciones, que
cambian el patrón de las estructuras de los segmentos corporales.
Mutaciones en estos genes provocan que los animales desarrollen los
patrones cambiados en las superficies de los segmentos corporales,
afectando los cambios al patrón a lo largo del eje de la cabeza a la
cola. Por ejemplo, mutaciones en el gen patched provoca que
cada segmento corporal se desarrolle sin las estructuras normales en
el centro de cada segmento. En su lugar, hay una imagen especular
del patrón normalmente encontrado en el segmento anterior. Por
tanto, las células en el centro del segmento componen las
estructuras erróneas, y las dirigen en la dirección incorrecta con
referencia a la polaridad de la cabeza a la cola global del
animal.
Se conocen aproximadamente dieciséis genes de
esta clase. Las proteínas codificadas incluyen quinasas, factores de
trascripción, una proteína de unión celular, dos proteínas
secretadas llamadas wingless (WG) y la Hedgehog mencionada
anteriormente (HH), una proteína transmembrana única llamada patched
(PTC) y algunas proteínas nuevas no relacionadas con ninguna
proteína conocida. Se cree que todas estas proteínas trabajan juntas
en las vías de señalización que informan a las células acerca de sus
alrededores para establecer los destinos celulares y
polaridades.
Se ha propuesto PTC como un receptor para la
proteína HH en base a experimentos genéticos en moscas. Un modelo
para la relación es que PTC funciona a través de una vía muy
desconocida para inactivar su propia trascripción y la trascripción
del gen de polaridad de segmentos wingless. Este modelo
propone que la proteína HH, secretada por células adyacentes, se une
al receptor PTC, lo inactiva y de este modo evita que PTC anule su
propia trascripción y la de wingless. Varios experimentos han
demostrado acontecimientos coordinados entre PTC y HH.
El gen patched humano (PTCH) se
identificó recientemente como el gen responsable del síndrome de
carcinoma de células basales nevoides (NBCCS), también conocido como
el síndrome de Gorlin, que es un trastorno dominante autosómico que
predispone a cáncer y a defectos en el desarrollo (Gorlin (1995)
Dermatologic Clinics 13:113-125)
caracterizado por múltiples carcinomas de células basales (BCC),
meduloblastomas y fibromas de ovario así como numerosas
anormalidades en el desarrollo (Hahn, H., Wicking, C.,
Zaphiropoulos, P.G., Gailani, M.R, Shanley, S., Chidambaram, A.,
Vorechovsky, I., Holmberg, E., Undén, A.B., Gillies, S., Negus, K.,
Smyth, I., Pressman, C., Leffell, D.J., Gerrard, B., Goldstein,
A.M., Dean, M., Toftgard, R., Chenevix-Trench, G.,
Wainright, B. y Bale, A.E. (1996): "Mutations of the human homolog
of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma
syndrome", Cell 85, 841-851; y Jonson, R.L.,
Rothman, A.L., Xie, J., Goodrich, L.V., Bare, J.W., Bonifas, J.M.,
Quinn, A.G., Myers, R.M., Cox, D.R, Epstein, E.H. Jr y Scout, M.P.
(1996): "Human homolog of patched a candidate gene for the basal
cell nevus syndrome", Science 272,
1668-1671). PTCH codifica un receptor de membrana
del dominio amino terminal escindido autolíticamente (proteína con
corte y empalme) de sonic hedgehog (SHH) (Mariano, V., Davey,
R.A., Zuo, Y., Cunningham, J.M. y Tabin, C.J. (1996): "Biochemical
evidence that patched is the Hedgehog receptor", Nature
384, 176-179; y Stone, D.M., Hynes, M.,
Armanini, M., Swanson, T.A., Gu, Q., Johnson, R.L., Scott, M.P.,
Pennica, D., Goddard, A., Phillips, H., Noll, M., Hooper, J.E. de
Sauvage, F. y Rosenthal, A (1996): "The
tumor-suppressor gene patched encodes a candidate
receptor for Sonic hedgehog", Nature 384,
129-134). En el estado de
no-señalización, se cree que PTCH inhibe la
señalización consecutiva de otras proteínas de membrana,
smoothened (SMO), sin embargo, la unión de SHH a PTCH alivia
esta inhibición (Goodrich, L.V., Milenkovic, L., Higgins, K.M. y
Scott, M.P. (1997): "Altered neural cell fates and medullablastom
in mouse patched mutants", Science 277,
1109-1113). Esta cascada de acontecimientos de
señalización, mejor caracteriza in Drosophila, también implica
varios componentes intracelulares incluyendo fused (una
serina treonina quinasa), el supresor de fused, costal 2, y
cubitus interruptus (Ruiz i Altaba, A.: "Catching a Glimpse
of Hedgehog" (1997) Cell 90, 193-196). El
último es un factor de trascripción que regula de forma positiva la
expresión de genes diana que también incluyen PTCH.
Se han identificado mutaciones en el gen de PTCH
en BCC esporádicos y familiares (Gailani, M.R.,
Stahle-Bäckdahl, M., Leffell, D.J., Glynn, M.,
Zaphiropoulos, P.G., Pressman, C., Undén, A.B., Dean, M., Brash,
D.E., Bale, A.E. y Toftgard, R (1996): "The role of human
homologue of Drosophila patched in sporadic basal cell
carcinomas" Nature Genet. 14, 78-81). La
ausencia de la proteína PTCH normal en estas células permite que
suceda la señalización constitutiva de SMO, provocando la
acumulación de ARNm de PTCH mutantes (Undén, B.A., Zaphiropoulos,
P.G., Bruce, K., Toftgard, R., y Stahle-Bäckdahl,
M. (1997): "Human patched (PTCH) mRNA is overexpressed
consistently in tumor cells of both familial and sporadic basal cell
carcinoma", Cancer Res. 57,
2336-2340).
El documento WO 96/11260 describe el aislamiento
de genes patched y el uso de la proteína PTC para identificar
ligandos, diferentes al ligando Hedgehog establecido, que se unan al
mismo.
Sin embargo, aún existe la necesidad de
comprender adicionalmente la señalización celular de SHH/PTCH, que
puede proporcionarse por la descripción de genes adicionales,
péptidos y proteínas implicados en la misma.
La presente invención proporciona una etapa
significativa dirigida al entendimiento de la vía descrita
anteriormente. Se ha clonado y secuenciado un nuevo gen tipo
patched humano (PTCH2) por una combinación de análisis de
bibliotecas de ADNc y RACE. Se han identificado varías formas de
ARNm con un corte y empalme alternativo de PTCH2, incluyendo
transcritos que carecen de segmentos que se cree que están
implicados en la unión de sonic hedgehog (SHH) y ARNm con exones en
el extremo 3' terminal definidos de forma diferente. Por
consiguiente, la invención se refiere a dos variantes de corte y
empalme que producen diferentes extremos
C-terminales como se describe en la Figura 2B.
La Figura 1 muestra la secuencia genómica de la
SEC ID Nº 5, en la que los exones y los intrones están indicados en
la secuencia genómica del nuevo gen de patched 2 humano.
La Figura 2A describe una comparación de
secuencia de aminoácidos de las secuencias de PTCH2 (líneas
superiores) y PTCH1 (líneas inferiores) humanas.
La Figura 2B es una representación de los
acontecimientos de corte y empalme alternativos que producen
diferentes extremos C-terminales.
La Figura 2C es una representación de las
diferentes variaciones de transcritos que han sufrido corte y
empalme que abarcan las secuencias del exón 1 y el exón 2.
La Figura 3A es una fotomicrografía de campo
oscuro de un tumor BCC hibridado con una sonda antisentido marcada
con ^{35}S que muestra una señal abundante de ARNm de PTCH1
(granos brillantes) en todas las células de tumor BCC.
La Figura 3B describe la sobreexpresión de ARNm
de PTCH2 en BCC y se expresa principalmente en contraste en las
células basaloides en la periferia de las redes tumorales.
La Figura 3C es otro BCC que muestra una fuerte
señal de ARNm de PTCH2 en la periferia de la red tumoral (Tu),
mientras que no se detecta señal en la epidermis (Ep).
La Figura 3D son secciones del mismo tumor (C)
hibridado con la sonda con sentido de PTCH2 que no mostró señal.
La Figura 3E muestra la inmunorreactividad para
Ki-67.
La Figura 3F describe cómo las redes tumorales
bajo un aumento de alta potencia muestran una señal de ARNm de PTCH2
abundante (granos negros) en las células tumorales basaloides
oscuras y una señal inferior en el centro (flecha).
Los términos "polipéptidos", "péptido"
y "proteína" se usan indistintamente en este documento para
referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se
aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de
aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido de
origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos
de origen natural.
Las expresiones "aislado",
"purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un
material que está sustancial o esencialmente libre de componentes
que lo acompañan normalmente como se encuentra en su estado
nativo.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a
un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma
monocatenaria o bicatenaria, y salvo que se limite de otro modo,
incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden
funcionar de un modo similar a los nucleótidos de origen
natural.
Un "marcador" es una composición detectable
por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos,
inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles
incluyen ^{32}P, colorantes fluorescentes, reactivos
electro-densos, enzimas (por ejemplo, como se usa
habitualmente en un ELISA), biotina, dioxigenina, o haptenos y
proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos
monoclonales (por ejemplo, el péptido de la SEC ID Nº 1 puede
hacerse detectable, por ejemplo, incorporando un
radio-marcador en el péptido, y puede usarse para
detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido).
Como se usa en este documento una "sonda de
ácido nucleico" se define como un ácido nucleico capaz de unirse
a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria a través de
uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente a través de
apareamiento de bases complementarias, habitualmente a través de la
formación de enlaces de hidrógeno. Como se usa en este documento,
una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C, o T) o
modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.).
Además, las bases de una sonda pueden unirse por un enlace diferente
al enlace fosfodiéster, siempre que no impida la hibridación. Por
tanto, por ejemplo, las sondas pueden ser ácidos peptidonucleicos en
los que las bases constituyentes están unidas por enlaces peptídicos
en lugar de enlaces fosfodiéster. Un especialista en la técnica
entenderá que las sondas pueden unirse a secuencias diana que
carecen de la complementariedad completa con la secuencia de la
sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de
hibridación. Las sondas preferiblemente se marcan directamente como
con isótopos, cromóforos, luminóforos, cromógenos, o pueden marcarse
indirectamente tal como con biotina a la que puede unirse después
un complejo de estreptavidina. Ensayando la presencia o ausencia de
la sonda se puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia o
subsecuencia seleccionada.
Una "sonda de ácido nucleico marcada" es
una sonda de ácido nucleico que está unida, covalentemente, a través
de un enlace, o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de
hidrógeno a un marcador de modo que puede detectarse la presencia de
la sonda detectando la presencia del marcador unido a la sonda.
La expresión "ácido nucleico diana" se
refiere a un ácido nucleico (a menudo obtenido de una muestra
biológica), para el que se diseña una sonda de ácido nucleico que
hibrida específicamente. Lo que debe detectarse es la presencia o
ausencia del ácido nucleico diana, o la cantidad del ácido nucleico
diana que debe cuantificarse. El ácido nucleico diana tiene una
secuencia que es complementaria a la secuencia del ácido nucleico de
la sonda correspondiente dirigida a la diana. La expresión ácido
nucleico diana puede referirse a la subsecuencia específica de un
ácido nucleico más grande al que se dirige la sonda o a la secuencia
global (por ejemplo, gen o ARNm) cuyo nivel de expresión se desea
detectar. La diferencia en el uso será evidente a partir del
contexto.
El termino "recombinante" cuando se usa con
referencia a una célula, o ácido nucleico, o vector, indica que la
célula, o ácido nucleico, o vector, se ha modificado por la
introducción de un ácido nucleico heterólogo o la alteración de un
ácido nucleico nativo, o que la célula se obtiene de una célula
modificada de este modo.
El término "idéntico" en el contexto de dos
secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a los
restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para
una correspondencia máxima. El alineamiento óptimo de las secuencias
para la comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo
de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl.
Math. 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de
Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por la
búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 85: 2444, por herramientas informáticas de
estos algoritmos (GAP, GESTFTT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison WI) o por inspección. El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad Sci USA
90: 5873-5787.
La expresión "identidad sustancial" o
"similitud sustancial" en el contexto de un polipéptido indica
que el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de
secuencia de al menos el 70% con una secuencia de referencia, o
preferiblemente una identidad de secuencia del 80%, o más
preferiblemente del 85% con la secuencia de referencia, o más
preferible una identidad del 90% en una ventana de comparación de
aproximadamente 10-20 restos de aminoácidos. Un
indicio de que dos secuencias polipeptídicas sean sustancialmente
idénticas es que un péptido sea inmunológicamente reactivo con
anticuerpos producidos contra el segundo péptido. Por tanto, un
polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido,
por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren sólo en una
sustitución conservativa.
Un indicio de que dos secuencias de ácido
nucleico sean sustancialmente idénticas es que el polipéptido que
codifica el primer ácido nucleico sea inmunológicamente reactivo de
forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido
nucleico. Otro indicio de que dos secuencias de ácido nucleico sean
sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibriden entre sí
en condiciones rigurosas.
La expresión "que hibride específicamente
con", se refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridación
de una molécula sólo con una secuencia de nucleótidos particular en
condiciones de rigurosidad cuando la secuencia está presente en una
mezcla de ADN o ARN compleja (por ejemplo, celular total). La
expresión "condiciones de rigurosidad" se refiere a condiciones
en las que hibridará una sonda con su subsecuencia diana, pero no
con otras secuencias. Las condiciones de rigurosidad dependen de la
secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias.
Secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más
altas. Generalmente, las condiciones de rigurosidad se seleccionan
para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión
térmica Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH
definidos. La Tm es la temperatura (con una fuerza iónica, pH, y
concentración de ácido nucleico definidos) a la que hibrida el 50%
de las sondas complementarias a la secuencia diana con la secuencia
diana en equilibrio. (Como la secuencia diana está generalmente
presente en exceso, a Tm, el 50% de las sondas estarán ocupadas en
equilibrio). Típicamente, las condiciones de rigurosidad serán
aquellas en las que la concentración salina sea de iones Na de menos
de aproximadamente 1,0 M, típicamente una concentración de iones Na
de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3
y la temperatura sea al menos aproximadamente 30ºC para sondas
cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente
60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos).
Las condiciones de rigurosidad pueden también conseguirse con la
adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.
El término "anticuerpo" se refiere a un
polipéptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina
o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se unen
específicamente y reconocen un analito
(antígeno).
(antígeno).
Un "anticuerpo quimérico" es una molécula
de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una parte de la
misma, está alterada, remplazada o intercambiada, de modo que el
sitio de unión al antígeno (región variable) esté unido a una región
constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o
alterada, o una molécula completamente diferente que otorga nuevas
propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima,
toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la
región variable, o una parte de la misma, está alterada, remplaza o
intercambiada con una región variable que tiene una especificidad
antigénica diferente o alterada.
El término "inmunoensayo" es un ensayo que
utiliza un anticuerpo para unirse específicamente a un analito. El
inmunoensayo está caracterizado por el uso de propiedades de unión
específicas de un anticuerpo particular para aislar, dirigir, y/o
cuantificar el analito.
Las expresiones "se une específicamente a una
proteína" o "específicamente inmunorreactivo con", cuando se
refiere a un anticuerpo, se refiere a una reacción de unión que es
determinante de la presencia de la proteína en presencia de una
población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos.
Por tanto, en condiciones de inmunoensayo indicadas, los anticuerpos
especificados se unen preferentemente a una proteína particular y no
se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en
la muestra. La unión específica a una proteína en dichas condiciones
requiere que un anticuerpo se seleccione por su especificidad por
una proteína particular. Puede usarse una diversidad de formatos de
inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente
inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan
de forma rutinaria inmunoensayos ELISA en fase sólida para
seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente
inmunorreactivos con una proteína. Véase, Harlow y Lane (1988)
Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Publications, Nueva York, para una descripción de formatos de
inmunoensayo y condiciones que pueden usarse para determinar
inmunorreactividad específica.
Un "producto génico", como se usa en este
documento, se refiere a un ácido nucleico cuya presencia, ausencia,
cantidad o secuencia de ácido nucleico es indicativo de la
presencia, ausencia, cantidad, o composición de ácido nucleico del
gen. Los productos génicos, por tanto, incluyen, pero sin
limitación, un trascrito de ARNm, un ADNc trascrito de forma inversa
a partir de un ARNm, y ARN trascrito a partir de ese ADNc, un ADN
amplificado a partir del ADNc, un ARN trascrito a partir del ADN
amplificado y subsecuencias de cualquiera de estos ácidos nucleicos.
Los polipéptidos expresados por el gen o subsecuencias del mismo
también son productos génicos. El tipo particular de producto
génico será evidente a partir del contexto del uso de los
mismos.
Un "fármaco modificado" significa un
compuesto que retiene las propiedades farmacéuticas del fármaco
original o sustancia activa aunque la estructura del mismo se haya
modificado. Además, también se incluye en el término "fármaco"
compuestos útiles en métodos de diagnóstico por sus propiedades de
unión específica.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a dos proteínas humanas descritas en la Figura 2B, capaces
de participar en la vía de PTCH/SHH humana durante el desarrollo
embrionario y/o la carcinogénesis, tal como carcinoma de células
basales. Las proteínas de acuerdo con la invención están codificadas
por variantes de un gen, cuyo ácido nucleico aislado se describe con
detalle a continuación y que se denomina patched 2 (PTCH2)
debido a sus similitudes con patched 1 (PTCH1). Por
consiguiente, las proteínas de acuerdo con la invención muestran
diferencias sustanciales en la secuencia y funciones cuando se
comparan con la proteína PTCH1 humana. Las proteínas pueden
caracterizarse por sus funciones que cuando se comparan con PTCH1
humana son similares pero distintas de las mismas de ciertas
maneras, más específicamente descritas a continuación en la sección
"Resultados y análisis". Las nuevas proteínas humanas PTCH2 de
acuerdo con la invención también son distintas de la PTCH2 de ratón
aislada previamente. Por tanto, en una realización preferida,
comprende las secuencias de aminoácidos descrita en la SEC ID Nº 1 y
presentada en el Gen-Bank con el número de
identificación de proteína AAD17260.1. Una de las presentes
proteínas comprende todos los aminoácidos de la secuencia llamada
SEC ID Nº 1.
Las proteínas de acuerdo con la invención se
preparan fácilmente por los especialistas en este campo por técnicas
de ADN recombinante usando las moléculas descritas a continuación o
cualquier método sintético (véase, por ejemplo, Barany y Merrifield,
Solid-Phase Peptide synthesis, pág.
3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,
Vol. 2: Special Methods in Peptide synthesis, Part A, Merrifield
et al., J. Am. Chem. Soc., 2149-2156).
La presente invención también se refiere al uso
de los péptidos, polipéptidos y proteínas descritos en este
documento como compuestos principales en métodos dirigidos a
descubrir nuevas sustancias, es decir, fármacos modificados, tales
como sustancias que muestren propiedades equivalentes o incluso más
ventajosas que los compuestos principales en sí. Dichos fármacos
modificados también pueden diseñarse por métodos de química
combinatoria, en la que se diseña específicamente un compuesto
estructuralmente similar, por ejemplo, por la ayuda de ordenadores.
Como alternativa, el presente fármaco modificado se identifica por
exploración de una biblioteca de compuestos candidatos, por
ejemplo, usando un anticuerpo de acuerdo con la invención. En el
presente contexto, debe entenderse que, cuando se ha identificado
dicho fármaco modificado, es posible producirlo por cualquier otra
técnica adecuada. Los métodos de proteómica en los que se usan las
presentes moléculas, así como también pueden ser útiles para un uso
per se.
Un segundo aspecto de la invención es un ácido
nucleico que codifica una proteína, definida en las reivindicaciones
1 y 2.
La presente solicitud describe el ácido nucleico
de PTCH2 genómico humano aislado que comprende partes o toda la
secuencia genómica llamada SEC ID Nº 5. En la descripción de la
secuencia genómica mostrada en la Figura 1, se muestra la estructura
de exones/intrones del presente gen. Además de los exones mostrados,
también se ha identificado el exón 12a y 12b, definidos
específicamente por la SEC ID Nº 3 y la SEC ID Nº 4,
respectivamente. Es interesante observar que hay una variante de
corte y empalme que une el exón 12a al segmento 3' del exón 12b
conservando los dinucleótidos GT-AG intrónicos. Los
exones 12a y 12b no son variantes, pero los exones reales del gen
están identificados por secuenciación de la región genómica
correspondiente. (Materiales y métodos como se describe a
continuación). Por consiguiente, estos descubrimientos muestran que
PTCH2 tiene la misma organización estructural de intrones/exones que
PTCH1. La presente solicitud describe un trascrito que ha saltado
sólo uno de los exones 9 y 10 definidos en la Figura 1. En una
realización alternativa, el trascrito de acuerdo con la invención ha
saltado tanto el exón 9 como el exón 10. Las variantes de corte y
empalme del presente gen se analizan con más detalle a continuación
en la sección "Resultados", todas las cuales se incluyen en el
alcance de la presente invención. Este aspecto de la invención
posibilita de forma ventajosa diseñar cebadores de PCR adecuados,
que a su vez posibilita la exploración de mutaciones de todas las
secciones codificantes de los mismos, por ejemplo, por análisis de
SSCP, secuenciación, o cualquier otro método adecuado conocido por
los especialistas en este campo. Por tanto, el nuevo gen de PTCH2
humano se ha localizado por mapeo de híbridos de radiación en el
cromosoma 1p32-35 con D1S211 y WI1404 como los
marcadores flanqueantes más cercanos y con una localización estimada
5,5cR de D1S443. Esta región a menudo se pierde por LOH en diversos
tipos tumorales diferentes, tales como neuroblastoma, melanoma,
cáncer de mama, cáncer de colon, etc. Por consiguiente, PTCH2 es un
candidato para un gen supresor de tumores en esta región y la
presente invención también abarca métodos de diagnóstico basados en
esta nueva descripción.
En esta región cromosómica también se han
mapeado tres síndromes de predisposición a cáncer, concretamente,
melanoma familiar CMM1, el locus modificador para la poliposis
adenamatosa familiar hMom1 y el síndrome de Bebé Michelin. PTCH2 es
también un candidato para el gen que está detrás de estos síndromes
hereditarios. Las presentes moléculas, por lo tanto, se usan de
forma ventajosa en el contexto de estas afecciones, por ejemplo, en
terapia y/o diagnóstico, tal como en ensayos.
Además, la invención también se refiere a
diversos cebadores de PCR basados en secuencias sincrónicas, que
permiten la amplificación de toda la secuencia codificante. Dichos
cebadores se usan de forma ventajosa para la exploración de
mutaciones.
La invención también se refiere al uso de los
nuevos ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, para identificar
mutaciones para propósitos de diagnóstico y/o terapéuticos.
Realizaciones adicionales de este aspecto de la
invención incluyen sondas de ácido nucleico, por ejemplo, sondas de
ADN, ácidos nucleicos marcados, ADNc, ARN, etc., es decir, todos los
productos génicos que se pueden obtener por un especialista en este
campo en base a las nuevas variantes de PTCH2 humanas aisladas.
Otro aspecto de la invención es un ácido
nucleico que corresponde a una cualquiera de las variantes de corte
y empalme descritas en la Figura 2B, una proteína o polipéptido
codificado por la misma, así como diversos usos de la misma.
Con respecto a la preparación de ácidos
nucleicos de acuerdo con la invención, puede usarse cualquier
técnica de ADN recombinante o método sintético adecuado. (Para
procedimientos de laboratorio generales útiles en este contexto
véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2^{a} ed., Vol. 1-3, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Berger y
Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in
Enzymology, Vol 153, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Current
Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al., eds.,
Current Protocols (1994)).
Un aspecto adicional de la presente invención es
un vector que comprende un ácido nucleico definido anteriormente.
Los vectores son, por ejemplo, útiles para transformar células in
vitro o in vivo que expresen las proteínas y péptidos de
acuerdo con la invención y pueden ser, por ejemplos, plásmidos,
virus, etc.
Otro aspecto de la invención es una célula
recombinante, tal como una célula eucariota, por ejemplo, de
mamífero, o una célula procariota, por ejemplo, una bacteria, que
comprende un vector definido anteriormente. Dichas células, por
ejemplo, pueden usarse para controlar los niveles de expresión de
las proteínas y polipéptidos de acuerdo con la invención en una
amplia diversidad de contextos. Por ejemplo, cuando se tienen que
determinar los efectos de un fármaco, se administrará el fármaco al
organismo, tejido o célula transformada. Por consiguiente, los
sistemas modelo que incluyen dichas células son otro aspecto de la
invención.
Un aspecto adicional de la invención es un
anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal, que se
une específicamente a una proteína o polipéptido de acuerdo con la
invención. Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar
(anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto
por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par
una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena
"pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo
N-terminal de cada cadena define una región variable
de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente
responsables del reconocimiento de antígenos. Las expresiones cadena
ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se
refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.
La invención también abarca anticuerpos
quiméricos u otros anticuerpos que se unen a las presentes proteínas
o polipéptidos. Además, la invención también se refiere al uso de
los presentes anticuerpos en ensayos. (En este contexto véase, por
ejemplo, Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul,
ed., Raven Press, N.Y. 1993).
Además, la invención también se refiere a una
célula recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la
invención.
En general, pueden usarse procariotas para
clonar las secuencias de ADN que codifican una cadena de
inmunoglobulina humana anti-PTCH2. E. coli es
un hospedador procariota particularmente útil para clonar las
secuencias de ADN de la presente invención. Microbios, tales como
levaduras también son útiles para la expresión. Saccharomyces
es un hospedador de levaduras preferido, teniendo los vectores
adecuados secuencias de control de la expresión, un origen de
replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee.
Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato
quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levaduras
inducibles incluyen, entre otros, promotores de la alcohol
deshidrogenasa 2, isocitocromo C, y enzimas responsables de la
utilización de maltosa y galactosa.
Las células de mamífero son un hospedador
particularmente preferido para expresar segmentos de nucleótidos que
codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (véase, por
ejemplo, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers,
N.Y., 1987). Se han desarrollado en la técnica varías líneas
celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas
heterólogas intactas, e incluyen las líneas celulares CHO, diversas
líneas celulares COS, células HeLa, células L y líneas celulares de
mieloma. Preferiblemente, las células son
no-humanas. Los vectores de expresión de estas
células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales
como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen
et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49), y sitios con
información de procesamiento necesarias, tales como sitios de unión
al ribosoma, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de
poliadenilación, y secuencias terminadoras de la trascripción. Las
secuencias de control de la expresión preferidas son promotores
derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus,
papilomavirus bovinos y similares (véase, por ejemplo Co et
al. (1992) J. Immunol. 1458:1149).
Un aspecto adicional de la presente invención es
un kit para la detección de un gen o polipéptido de PTCH2 humano que
comprende en un recipiente una molécula seleccionada entre el grupo
compuesto por un ácido nucleico, un polipéptido o una proteína o un
anticuerpo de acuerdo con la invención. Los componentes adecuados
adicionales de dicho kit se determinan fácilmente por los
especialistas en este campo así como las condiciones para el uso del
mismo.
Además, la invención también se refiere al uso
de un ácido nucleico descrito en la reivindicación 1 ó 25 en terapia
génica. Además de dichas secuencias descritas específicamente, uno
cualquiera de los exones descritos en este documento puede usarse
para este fin. Para una revisión de los procedimientos de terapia
génica véase Anderson, Science (1992)
256:808-813; Nabel y Felgner (1993) TIBTECH
11:211-217; Mitani y Caskey (1993) TIBTECH
11:162-166; Mulligan (1993) Science
926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11:
167-175; Miller (1992) Nature
357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology
6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative
Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer y
Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1)
31-44; Haddada et al. (1995) en Current
Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Böhm (eds)
Springer-Verlag, Heidelberg Alemania; y Yu et al
Gene Theraphy (1994) 1:13-26.
El suministro del gen o el material génico al
interior de la célula es la primera etapa crítica en el tratamiento
con terapia génica de una enfermedad. Los especialistas en la
técnica conocen bien una amplia diversidad de métodos de suministro.
Dichos métodos incluyen, por ejemplo, suministro de genes basado en
liposomas (Debs y Zhu (1993) documento WO 93/24640; Mannino y
Gould-Fogerite (1988) Bio Techniques
6(7):682-691; Rose Patente de Estados Unidos
Nº 5.279.833; Brignam (1991) documento WO 91/06309; y Felgner et
al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
7413-7414), y vectores retrovirales deficientes en
replicación que tienen una secuencia polinucleotídica terapéutica
como parte del gen retroviral (véase, por ejemplo, Miller
et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990; Kolberg
(1992) J. NIH Res. 4:43, y Cornetta et al. Hum.
Gene Ther. 2:215 (1991)). Los vectores retrovirales ampliamente
usados incluyen los basados en el virus de leucemia murina. (MuLV),
virus de la leucemia del mono gibbon (GaLV), virus de la
inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), y combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo,
Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66 (5)
2731-2739; Johann et al (1992) J.
Virol. 66 (5):1635-1640 (1992); Sommerfelt et
al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson
et al (1989) J. Virol. 63:2374-2378;
Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224
(1991); Wong-Staal et al., documento
PCT/US94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental
Immunology, Third Edition Panl (ed) Raven Press, Ltd., Nueva
York y las referencias del mismo, y Yu et al., Gene
Therapy (1994) supra).
La presente invención también puede usarse en la
industria farmacéutica. Por ejemplo, se proporcionará información
que pueda posibilitar finalmente que las células del tejido fetal
puedan transplantarse en pacientes que padecen, por ejemplo,
enfermedad de Parkinson o cáncer, tal como BCC. (Para una breve
revisión de los métodos de suministro de fármacos véase Langer 249:1
527-1533 (1990), Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17^{a} ed.
(1985) etc.)
La Figura 1 muestra la secuencia genómica de la
SEC ID Nº 5, en la que los exones y los intrones están indicados en
la secuencia genómica del presente gen patched 2 humano. Sin
embargo, los exones 12a y 12b analizados anteriormente no se
muestran específicamente en la Figura 1, pero en su lugar se
describen como secuencias diferentes SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4,
respectivamente. La Figura 2A describe una comparación de secuencia
de aminoácido de la secuencia de PTCH2 (líneas superiores) y PTCH1
(líneas inferiores) humanas. Las líneas verticales indican
aminoácidos idénticos, mientras que los puntos aminoácidos
similares. La secuencia de PTCH2 presentada está compuesta por los
clones de ADNc originales y los productos del análisis RACE 5'.
La Figura 2B es una representación de los
acontecimientos de corte y empalme alternativo que producen
diferentes extremos C-terminales. En la glándula
parótida y el colon, el penúltimo exón y el último exón están
canónicamente unidos entre sí. En cerebro fetal, sin embargo, el
penúltimo exón con parte del intrón 3' funciona como el exón
terminal. La secuencia intrónica se muestra por letras minúsculas y
la exónica flanqueante por letras mayúsculas. Por encima de la
secuencia de nucleótidos, se muestra la secuencia de aminoácidos
deducida, y por debajo se encuentra la secuencia correspondiente de
Ptch2 de ratón. Los dinucleótidos intrónicos conservados se muestran
por letras en negrita y las señales de terminación se indican por
asteriscos. Obsérvese la ausencia de conservación de la posición de
los codones de terminación entre la secuencias de PTCH2 de ratón y
humana. Las supuestas señales de poliadenilación también se muestran
en este diagrama. La organización genómica se obtuvo analizando
clones BAC que incluyen el gen de PTCH2.
La Figura 2C es una representación de las
diferentes variaciones de trascritos con corte y empalme que
incluyen las secuencias del exón 1 y el exón 2. Los exones 1 y 2
canónicos se muestran por recuadros y el intrón entre ellos por una
línea continua. Los dinucleótidos GT y AG que abarcan las secuencias
que se usan como intrones en trascritos individuales se indican por
letras minúsculas. G, estructura genómica, obtenida de los segmentos
de secuenciación de clones BAC que incluyen el gen de PTCH2; C,
trascrito canónico; A, trascrito A (los exones 9 y 10 saltados de
este producto no se muestran en el diagrama); B, trascrito B.
La Figura 3A es una fotomicrografía de campo
oscuro del tumor BCC hibridado con la sonda antisentido marcada con
^{35}S que muestra la señal abundante para el ARNm de PTCH1
(granos brillantes) en todas las células tumorales BCC.
La Figura 3B describe la sobreexpresión del ARNm
de PTCH2 en BCC y se expresa principalmente en contraste en las
células basaloides en la periferia de las redes tumorales.
La Figura 3C es otro BCC que muestra una fuerte
señal de ARNm de PTCH2 en la periferia de la red tumoral (Tu),
mientras que no se detecta señal en la epidermis (Ep).
La Figura 3D son secciones del mismo tumor (C)
hibridado con la sonda con sentido de PTCH2 que no muestra
señal.
La Figura 3E muestra inmunorreactividad para
Ki-67 (precipitado marrón) observado en la
periferia, en las células que mostraron regulación positiva fuerte
del ARNm de PTCH2.
La Figura 3F describe redes tumorales bajo un
aumento de alta potencia que muestra una abundante señal de ARNm de
PATCH2 (granos negros) en las células tumorales basaloides oscuras y
una señal inferior en el centro (flecha). Barras
(A-E), 24 \mum, y F, 6 \mum.
En el presente contexto, se hace una referencia
general a G. Zaphiropoulos et al., Cancer Res., vol. 59, pág.
787-792, 15 de febrero de 1999, que describe métodos
útiles en el presente contexto. Todas las referencias mencionadas en
la presente solicitud se incluyen por la presente en este documento
como referencia. Los siguientes ejemplos no pretenden limitar el
alcance de la invención sino que son simplemente una
ilustración.
Los análisis RACE se realizaron esencialmente
como se ha descrito anteriormente (Zaphiropoulos, P.G. y Toftgard,
R. (1996): "cDNA cloning of a novel WD repeat protein mapping to
the 9q22.3 chomosomal region", DNA Cell Biol. 15,
1049-1056) usando el kit Marathon (Promega). Las
secuencias cebadoras usadas para RACE están disponibles a
petición.
Las sondas de ARN marcadas con 35S de PTCH2
usadas para las hibridaciones in situ, que se realizaron como
se ha descrito previamente (Unden et al., (1997)
supra), corresponden a las posiciones 218 a 437 y 838 a 920
de la secuencia de PTCH2 de la SEC ID Nº 1.
Para identificar componentes adicionales de la
cascada de PTCH/SHH de acontecimientos de señalización, se buscó en
la base de datos Incyte LifeSeq^{TM} (Incyte Pharmaceuticals Inc.,
Palo Alto, CA, USA) usando las secuencias de PTCH. Además de los
clones que representan el ADNc de PTCH, se identificaron dos ADNc
casi idénticos, de la glándula parótida y el colon, que contenían
secuencias similares a, pero distintas de, el extremo 3' de PTCH.
Por análisis RACE 5' usando ADNc de cerebro fetal se obtuvo
información de secuencia adicional de estos trascritos (llamados
PTCH2) y que corresponde al ADNc de longitud completa (Figura 2A).
PTCH2 es idéntica al 57% con PTCH1, con una región
significativamente variable presente entre los dominios
transmembrana 6 y 7, e idéntica al 91% a la secuencia de Ptch2 de
ratón recientemente publicada (Motoyama, J., Takabatake, T.,
Takeshima, K. y Hui, C. (1998): "Ptch2, a second mouse Patched
gene is co-expressed with Sonic hedgehog", Nature
Genet, 18, 104-106). Similar al gen de ratón, PTCH2
carece de la extensión C-terminal presente en la
PTCH1 de seres humanos, de ratón y de pollo (Goodrich, L.V.,
Johnson, R.L., Milenkovic, L., McMahon, J.A. y Scott, M.P. (1996):
"Conservation of the hedgehog/patched signalling pathway from
flies to mice: Induction of a mouse patched by Hedgehog", Genes
Dev. 10, 301-312, Mariago, V., Scott, M.P., Johnson,
R.L., Goodrich, L.V. y Tabin, C.J. (1996): "Conservation in
hedgehog signalling: Induction of a chicken patched homolog by Sonic
hedgehog in the developing limb" Development 122,
1225-1233). Sin embargo, de acuerdo con la presente
invención, se ha demostrado que el ADNc de PTCH2 humana termina 36
aminoácidos antes que la secuencia de Ptch2 de ratón. Además, cuando
se realizó RACE 3' a partir del cerebro fetal, se identificó una
región C-terminal alternativa. Esto tuvo una gran
similitud estructural con la secuencia C-terminal de
Ptch2 de ratón y se origina de la región genómica que se une a al
menos 2 exones de PTCH2 (Figura 2B). Por lo tanto, en estos
trascritos con corte y empalme alternativo, el penúltimo exón con un
segmento del intrón 3' contiguo sirve como exón terminal.
Además, los trascritos humanos y de ratón
diferían en la posición de las señales de terminación (la secuencia
humana es 21 aminoácidos más larga), lo que sugiere una función no
conservada, específica de la especie de este dominio
C-terminal alternativo. El descubrimiento de dos
posibles regiones C-terminales para PTCH2 es
intrigante e implica un papel de este fenómeno en la modulación de
la señalización. Los trascritos con corte y empalme alternativo
adicionales también se identificaron por el análisis RACE (Figura
2C). El trascrito A carece de la secuencia que corresponde a los
exones 9 y 10 de PTCH1 (comparaciones preliminares de las uniones
intrón-exón de PTCH2 con PTCH1 indican una
organización genómica similar), estando la fase de lectura abierta
retenida en la unión del exón 8 al exón 11. Los exones 9 y 10
codifican la última parte del primer bucle extracelular y los
dominios transmembrana 2 y 3 en la supuesta estructura de la
proteína PTCH1. Además, este trascrito también carece de un segmento
5' del exón canónico 2, debido al uso de un sitio de corte y empalme
3' alternativo presente en este exón, manteniéndose la fase de
lectura abierta. La consecuencia funcional de este corte y empalme
alternativo aún no se conoce, pero es interesante observar que los
bucles extracelulares en PTCH1 se supone que están implicados en la
unión del ligando SHH (Marigo et al., (1996), Nature
384, supra; Stone et al., (1996), Nature
384, supra) y que la inserción de un nuevo casete en
el intrón 9 del gen de PTCH1 de ratón está asociado con un fenotipo
grave (Hahn, H., Wojnowski, L., Zimmer, A.M., Hall, J., Miller, G. y
Zimmer, A. (1998): "Rhabdomyosarcomas and radiation
hypersensitivity in a mouse model of Gorlin syndrome", Nature
Med. 4, 619-622). Además, los exones 9 y 10
codifican parte del supuesto dominio sensible a esteroles (Osborne,
T.F. y Rosenfeld, J.M. (1998): "Related membrane domains in
proteins of sterol sensing and cell signalling provide a glimpse of
treasures still buried within the dynamic realm of intracellular
metabolic regulation", Curr. Opin. Lipidol. 9,
137-140) también encontrado en PTCH1, y que se ha
implicado recientemente en la mediación del efecto modulador potente
del colesterol sobre la señalización de SHH/PTCH (Cooper, M.K.,
Porter, J.A., Young, K.E., y Beachy, P.A. (1998):
"Teratogen-mediated inhibition of target tissue
response to Shh signalling" Science 280,
1603-1607). Por tanto, si PTCH2 también sirve como
receptor para SHH y/o factores relacionados, la forma del receptor
que carece de los exones 9 y 10 puede mostrar propiedades de
señalización alteradas. El trascrito B contiene secuencias
adicionales entre los exones canónicos 1 y 2, que se originan a
partir del extremo 5' del intrón 1. La fase de lectura abierta que
incluye la metionina iniciadora del exón 1 no se mantiene en este
trascrito, lo que sugiere que, si este trascrito es funcional, la
metionina del exón 2 o los codones que no son metionina se usan para
producir un producto proteico, en similitud con lo que se ha
propuesto para los productos con corte y empalme alternativo de
PTCH1 humana (Hahn et al., Cell 85, supra).
Por mapeo de híbridos de radiación, se localizó el gen de PTCH2 en
el brazo corto del cromosoma 1, a diferencia de PTCH1 que reside en
el cromosoma 9q22.3.
Se ha informado de que los homólogos de ratón y
pez cebra de PTCH2 se expresan en un patrón parcialmente solapante
con PTCH1 durante el desarrollo embrionario y que están inducidos
por SHH (Motoyama et al., (1998) Nature Genet. 18,
supra, Concordet, J.P., Lewis, K.E., Moore, J.W., Goodrich,
L.V., Johnson, R. L., Scott, M.P., y Ingham, P.W. (1996): "Spatial
regulation of a zebrafish patched homologue reflects the roles of
sonic hedgehog and protein kinase A in a neural tube and somite
patterning", Development 122, 2835-2846),
lo que implica un papel en esta vía de señalización. Con estos
antecedentes fue interesante analizar la expresión de PTCH2 en BCC
que muestran regulación positiva uniforme de PTCH1 en todas las
células tumorales (Undén et al., (1997) Cancer res.
57, supra). Se realizó hibridación in situ
sobre seis BCC familiares y cuatro BCC esporádicos de diferentes
subtipos histológicos. Se observó una fuerte señal positiva para el
ARNm de PTCH2 exclusivamente en las células tumorales de todos los
BCC. De forma notable, la señal fue uniformemente más fuerte en las
células periféricas en empalizada de las redes tumorales (Figura 2).
Estas células también mostraron una inmunotinción positiva para el
marcador de proliferación celular Ki-67.
El descubrimiento de que en BCC que tienen
mutaciones frecuentes en el gen de PTCH1, la expresión de los ARNm
de PTCH2 está regulada positivamente, une ligeramente la nueva PTCH2
de acuerdo con la invención con la cascada de PTCH/SHH de
acontecimiento de señalización. Por lo tanto, es probable que PTCH2
represente un gen diana de esta vía que está bajo la regulación
negativa de PTCH1, precisamente como PTCH1 en sí misma. Además, esta
observación sugiere fuertemente que PTCH2 tiene funciones diferentes
a PTCH1 ya que la regulación positiva de la expresión de PTCH2
parece incapaz de compensar la proteína PTCH1 inactiva. Esta
conclusión también está apoyada por la letalidad embrionaria
temprana observada en ratones PTCH1 (-/-) 5,13) y la ausencia de
heterogenicidad genética en el síndrome de Gorlin. Sin embargo, si
PTCH2 puede bloquear la señalización constitutiva de SMO, o pudiera
funcionar como receptor de SHH adicional, dependiendo posiblemente
del corte y empalme alternativo, permanece como objeto de
experimentación adicional.
<110> PHARMACIA & UPJOHN S.P.A
KAROLINSKA INNOVATIONS AB
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<120> UN NUEVO COMPONENTE EN LA VÍA DE
SEÑALIZACIÓN DE HEDGEHOG
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<130> 56822
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<140>
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<160> 5
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1146
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<212> PRT
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<213> HUMANO
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<211> 3453
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 119
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 12886
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<212> ADN
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<213> HUMANO
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<400> 5
Claims (14)
1. Una secuencia de ácido nucleico
aislada que codifica una proteína Ptch2 humana que tiene la SEC ID
Nº 1.
2. Una secuencia de ácido nucleico
aislada que codifica una variante de corte y empalme que tiene los
aminoácidos 1-1142 de la SEC ID Nº 1 inmediatamente
seguida por la secuencia
TrpGlyAlaSerSerSerLeuProGlnSerPheAlaArg
ValThrThrSerMetThrValAlaIleHisProProProLeuProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThr
SerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAlaThrGly.
ValThrThrSerMetThrValAlaIleHisProProProLeuProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThr
SerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAlaThrGly.
3. Una proteína que tiene la SEC ID Nº 1
o que tiene los aminoácidos 1-1142 de la SEC ID Nº 1
inmediatamente seguida por la secuencia
TrpGlyAlaSerSerSerLeuProGlnSerPheAlaArgValThrThrSerMetThrValAlaIleHisProProProLeu
ProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThr SerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAla
ThrGly.
ProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThr SerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAla
ThrGly.
4. Una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2,
o una proteína de acuerdo con la reivindicación 3, para su uso como
medicamento.
5. Uso de una secuencia de ácido
nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-2, o una proteína de acuerdo con la reivindicación
3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
afección que implique tumores, tal como BCC.
6. Un método de diagnóstico in
vitro, en el que se usa una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2,
o una proteína de acuerdo con la reivindicación 3.
7. Un método para explorar, en el que se
explora una biblioteca de compuestos candidatos adecuados para
fármacos modificados, usando una proteína de acuerdo con la
reivindicación 3 como compuesto principal.
8. Un vector que comprende una secuencia
de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-2.
9. Una célula recombinante que comprende
un vector de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Un anticuerpo que se une específicamente a
una proteína de acuerdo con la reivindicación 3.
11. Una célula recombinante que expresa un
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un kit para la detección de un gen o
proteína de Ptch2 humana, que comprende en un recipiente una
molécula seleccionada entre el grupo compuesto por una secuencia de
ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-2, una proteína de acuerdo con la reivindicación
3, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Uso de una secuencia de ácido nucleico
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-2, para la fabricación de un medicamento para su
uso en terapia génica.
14. Uso in vitro de una secuencia de
ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-2, como sonda, un cebador o un reactivo de
diagnóstico.
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| SE9803393A SE9803393D0 (sv) | 1998-10-06 | 1998-10-06 | A novel component in the hedgehog signalling pathway |
| SE9803393 | 1998-10-06 |
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