ES2269376T3 - Anticuerpos que reconocen especificamente el psa libre inactivo, y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, siendo dichos anticuerpos anticuerpos policlonales purificados o anticuerpos monoclonales.
Description
Anticuerpos que reconocen específicamente el PSA
libre inactivo, y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno
específico de la próstata (o PSA, para Prostate Specific Antigen) en
su forma libre inactiva, así como a los hibridomas que producen
tales anticuerpos.
La presente invención se refiere asimismo a
reactivos para ensayos inmunológicos que contienen dichos
anticuerpos, así como a ensayos inmunológicos que comprenden el uso
de dichos reactivos.
La presente invención se refiere además a un
método de diagnóstico de un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto del que se sospecha que padece tal patología.
La presente invención se refiere asimismo a un
método de diagnóstico que permite diferenciar entre una patología
benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto en el que se sospecha que padece de una de estas
enfermedades.
Finalmente, la presente invención se refiere al
kit de diagnóstico que permite diagnosticar un adenocarcinoma de la
próstata en un sujeto en el que se sospecha que padece de un
adenocarcinoma, o que permite diferenciar entre una patología
benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto en el que se sospecha que padece de una de estas
enfermedades.
El PSA está producido por el epitelio glandular
de la próstata humana, probablemente en forma de zimógeno inactivo
(Lundwall et al. FEBS Lett. 1987), y se segrega en el líquido
seminal en forma activa (Lilja, J. Clin Invest 1985). La actividad
biológica del PSA en el líquido seminal está relacionada con su
fragmentación proteolítica limitada de las proteínas predominantes
segregadas mediante las vesículas seminales (Lilja, J. Clin. Invest
1985; Lilja et al. J. Clin Invest 1987; Mc Gee et al.
Biol. Reprod. 1988).
El PSA es el principal marcador del cáncer de la
próstata que afectará, a lo largo de su vida, a uno de cada seis
hombres en el mundo occidental. Esta proteasa de la familia de las
calicreínas, principalmente segregada mediante el epitelio
prostático, se encuentra a una concentración de 0,5 a 5 mg/ml en el
líquido seminal, y a una concentración un millón de veces menor en
el suero de un paciente. Así, el PSA se encuentra normalmente a una
concentración menor que 2,5 ng/ml en el suero. Sin embargo, esta
concentración aumenta, en principio notablemente, durante un cáncer
de la próstata, y moderadamente durante alteraciones benignas tales
como la hipertrofia de la próstata benigna (BPH) o la prostatitis
aguda.
Se determinó la secuencia proteica del PSA. Se
trata de una glicoproteína que comprende 237 aminoácidos
("Molecular cloning of human prostate specific antigen cDNA",
Lundwall A., Lilja H., 1987. FEBS Lett. 214:
317-322).
Se ha propuesto un método de diagnóstico que
consiste en medir la concentración de PSA sérica y en compararla
después con un valor límite que es de 4 ng/ml. Sin
embargo, se constató que este método de diagnóstico lleva a
sospechar falsamente de tres pacientes de cada cuatro, lo que es
perjudicial. Además, este método no permite diagnosticar 30 a 45% de
los casos de cánceres confinados en la glándula, lo que constituye
sin embargo un estado precoz de la enfermedad potencialmente curable
cuyo diagnóstico sería por lo tanto particularmente deseable. De
hecho, el carácter poco satisfactorio de este método se demuestra
mediante el estudio publicado en el artículo "Prostate Cancer
Detection in Men UIT FERUM PSA Concentrations of 2.6 to 4.0 ng/ml
and Benign Prostate Examination", Catalona et al. JAMA,
14 de mayo de 1997 - Vol. 277, Nº 18, que muestra que el valor
límite debe de ser menor que 4 ng/ml para detectar precozmente un
cáncer de la próstata.
Por otra parte, se mostró recientemente que en
el suero el PSA se asociaba con inhibidores de proteasa, tales como
\alpha-1-antiquimiotripsina (ACT),
y \alpha-2-macroglobulina (A2M).
Estas asociaciones conllevan a la desactivación de la actividad
quimiotrípsica del PSA, tal como se demostró en el artículo
"Enzimatic activity of prostate specific antigen and its
reactions with ultracellular serine proteinase inhibitors" A.
Christensson, C.B. Laurell, H. Lilja, 1990 Eur. J. Biochem 194:
755-763. Entonces, se propuso el uso de la relación
de PSA libre a PSA total, a fin de mejorar la especificidad del
diagnóstico.
Así, la solicitud de patente
WO-A-97/12245 describe un método que
permite diagnosticar un adenocarcinoma de la próstata sin biopsia.
Este método consiste en medir, en el suero o en la sangre de los
pacientes, la cantidad total de PSA. Si este valor está comprendido
entre 2,5 y 20 ng/ml, se mide asimismo la concentración de PSA
libre. Después, se calcula la relación de PSA libre a PSA total. Si
esta relación es menor que 7%, el diagnóstico se orienta hacía un
adenocarcinoma de la próstata.
Sin embargo, el uso de un límite de 7%, para el
diagnóstico de un cáncer de la próstata, se discute por numerosos
autores, tal como se muestra en la publicación de Lein et al.
"Relation of free PSA/total PSA in serum for differentiating
between patients with prostatic cancer and benign prostate
hyperplasia: Wich cutoff should be used?". En este documento
publicado en la revista Cancer Investigation, 16(1),
45-49, 1998, se demostró que es difícil, mediante
esta relación, diferenciar sistemáticamente un cáncer de la próstata
de una BPH.
Por estas razones, el solicitante se interesó,
en una solicitud de patente
WO-A-00/02052, presentada con
prioridad el 3 de julio de 1998, en la presencia en el suero de
formas escindidas del PSA. Las formas moleculares de PSA sérico de
pacientes que padecen de cáncer o de BPH se cartografiaron mediante
electroforesis bidimensional, asociada con una detección mediante
quimioluminiscencia, a fin de observar el conjunto de las formas de
PSA, es decir las formas libres, complejadas y escindidas.
Los perfiles de electroforesis de sueros de
sujetos que padecen de adenocarcinoma de la próstata son
relativamente homogéneos, presentando sustancialmente la forma no
escindida del PSA, mientras que los de sujetos que padecen de BPH
pueden comprender una proporción relativamente importante de forma
escindida y puntos ligeramente más básicos sin forma escindida. El
aumento de la relación de PSA libre sérico a PSA total sérico
observada en los pacientes que padecen de BPH estaría por lo tanto
esencialmente relacionado con la existencia de PSA escindido, que
podría ser enzimáticamente inactivo y por lo tanto capaz de unirse
al ACT, así como con la presencia de una forma de PSA libre
ligeramente más básica que la forma de PSA libre activa, que podría
corresponder a la forma cimógena, inactiva, del PSA.
En función de estas observaciones, se han
descrito métodos de diagnóstico de adenocarcinoma de la próstata
que comprenden la cuantificación, después de la separación mediante
electroforesis bidimensional, del PSA escindido y/o no escindido, y
el uso de estos valores a fin de establecer un diagnóstico.
Sin embargo, estos métodos necesitan la
implementación de electroforesis bidimensional. Por consiguiente,
son bastante caros y necesitan mucho tiempo de manipulación.
Se conocen del documento WO 98/49323 anticuerpos
que reconocen específicamente la forma cimógena del PSA y su uso en
métodos de diagnóstico del cáncer de la próstata.
Se ha descubierto entonces que era posible
disponer de métodos de diagnóstico de adenocarcinomas de la próstata
que no presentan los inconvenientes antes citados, y que disponen
de una excelente especificidad y sensibilidad, mediante el uso de
reactivos inmunológicos. En efecto, se ha descubierto que era
posible obtener anticuerpos dirigidos específicamente contra el PSA
libre inactivo. Se ha descubierto asimismo que, ventajosamente,
tales anticuerpos se pueden usar especialmente en métodos de
diagnóstico del cáncer de la próstata y del BPH.
Así, la presente solicitud tiene por objeto
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente
al PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1,
siendo dichos anticuerpos policlonales purificados o anticuerpos
monoclonales.
Mediante la expresión "fragmentos de
anticuerpos", se entiende, en general en la presente solicitud,
cualquier fragmento de anticuerpo que haya conservado la
especificidad del anticuerpo de origen, y en particular fragmentos
de tipo Fab y F(ab')_{2}. En la presente solicitud, la
palabra "anticuerpo" designa a continuación unos fragmentos de
anticuerpos cuando lo permite el sentido.
Mediante la expresión "anticuerpos que se unen
específicamente a una forma dada de PSA", se designa claramente
un anticuerpo que se une esencialmente a dicha forma de PSA. Por
ejemplo, el producto que se encuentra unido al anticuerpo está
constituido de al menos 80%, preferentemente de al menos 90%, de
dicha forma de PSA.
Mediante la expresión "PSA libre inactivo",
se entiende, en la presente solicitud, una forma libre del PSA, es
decir no complejada, dicho de otra forma no asociada con sus
inhibidores, tales como ACT. Además, está forma libre es inactiva.
Mediante el término "inactivo" se designa una forma de PSA que
presenta una actividad proteolítica (en particular de tipo
quimiotrípsica) claramente menor que la del PSA libre presente en el
suero de sujetos sanos, por ejemplo, menor que al menos 80% o
más.
La presente invención tiene especialmente por
objeto anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales que se
unen específicamente al PSA libre inactivo, tal como se define en la
reivindicación 1.
La presente invención tiene asimismo por objeto
hibridomas que producen anticuerpos monoclonales tales como se
definen anteriormente.
Se conoce bien la obtención de hibridomas, y no
se volverá a recordar aquí. Se seleccionan los hibridomas que
reconocen específicamente el PSA libre inactivo, tal como se define
en la reivindicación 1, de la manera indicada a continuación. Se
descubrió que algunos clones producían anticuerpos que, fijados a
una columna de cromatografía, retenían solamente una fracción del
PSA total sérico de diferentes individuos, y que está fracción era,
con algunos de estos anticuerpos, una forma libre y sensiblemente
inactiva (tal como se define anteriormente) del PSA.
Por otra parte, se constató que las fracciones
de PSA no retenidas mediante estos anticuerpos contenían todavía un
PSA libre, y conservaban prácticamente toda la actividad
proteolítica del suero de partida.
Así, se pudo obtener fracciones enriquecidas en
PSA libre inactivo, que sirvieron después para ensayar
sistemáticamente clones de hibridomas obtenidos como antes.
Entre los hibridomas obtenidos después de la
inmunización de ratones mediante PSA de origen seminal
comercializado por la compañía SCIPAC, se constató que
aproximadamente 1,5% producían anticuerpos que se unen
específicamente al PSA libre inactivo así obtenido.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un reactivo para ensayo inmunológico que contiene anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos tales como se definen anteriormente.
En los reactivos según la invención, los
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente
al PSA libre inactivo se pueden usar tal cual o bien especialmente
en formas fijadas a un soporte sólido y/o unidos a un marcador.
Se conoce bien la fijación de anticuerpos o de
fragmentos de anticuerpos a un soporte sólido. El soporte se puede
realizar con cualquier material sólido, biológico o sintético,
provisto de propiedades adsorbentes o capaces de unirse a un agente
de acoplamiento. Se conocen materiales, y se describen en la
bibliografía. Entre los materiales sólidos capaces de unir los
anticuerpos mediante adsorción, se citarán, por ejemplo, el
poliestireno, polipropileno, los látex, etc. Entre los materiales
que permiten unir los anticuerpos covalentemente con la ayuda de un
agente de acoplamiento, se pueden citar, especialmente, el dextrano,
la celulosa, etc. El soporte se puede presentar, por ejemplo, en
forma de discos, tubos, perlas o placas, en particular de placas de
microtitulación.
La unión de un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo a un marcador, ya sea radioactivo, enzimático, coloreado
o de cualquier otro tipo comúnmente usado en técnicas inmunológicas,
es bien conocida, y se describe en la bibliografía.
La presente invención tiene además por objeto un
ensayo inmunológico para la determinación cuantitativa del PSA
libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una
muestra biológica extraída de un sujeto, en el que se pone en
contacto dicha muestra con un reactivo tal como se define
anteriormente, y se evalúa la cantidad de PSA libre inactivo, tal
como se define en la reivindicación 1, unido a los anticuerpos del
reactivo.
La muestra biológica extraída del sujeto es
generalmente una muestra de sangre o de suero. Si se desea, puede
haber sufrido una etapa de concentración o dilución previa a su
puesta en contacto con el reactivo que contiene anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al PSA libre
inactivo.
La cuantificación del PSA libre inactivo unido a
dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se puede realizar de
distintas maneras bien conocidas.
Por ejemplo, la cantidad de PSA libre inactivo
se puede evaluar mediante ensayos de tipo sándwich. Según un modo
de realización particular, se pone en contacto un reactivo para un
ensayo inmunológico, en el que los anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos que se unen específicamente al PSA libre inactivo se
fijan al soporte, con la muestra biológica para la que se desea
determinar el contenido de PSA libre inactivo, después, tras el
lavado, se pone en contacto dicho soporte con un segundo anticuerpo
marcado que se une al PSA. Después de un nuevo lavado, se mide la
cantidad de marcador fijado, y se deduce el contenido de PSA libre
inactivo mediante comparación con una curva patrón establecida
previamente.
Según otra forma de de realización de los
ensayos inmunológicos de la invención, se evalúa además la cantidad
de una forma de PSA distinta de la forma libre inactiva, presente en
una muestra de misma la naturaleza extraída del mismo sujeto.
Mediante la expresión "muestra de la misma
naturaleza extraída del mismo sujeto", se entiende dos fracciones
de una misma muestra, o bien dos muestras que provienen de dos
extracciones distintas, pero que deben de ser de la misma
naturaleza, por ejemplo muestras séricas.
Por supuesto, cuando las cantidades medidas se
destinan a ser comparadas, conviene que estos valores sean
comparables. En otros términos, conviene que los valores medidos se
corrijan a la misma dilución o concentración eventual de la
muestra, así como al mismo volumen.
Las formas distintas de la forma libre inactiva
del PSA son, especialmente, PSA complejado, PSA libre total, PSA
libre activo y PSA total, es decir el conjunto de las formas activas
o inactivas, libres o complejadas, del PSA.
Se conoce la determinación de cada una de estas
distintas formas, especialmente con la ayuda de anticuerpos
específicos.
El PSA complejado se determina, por ejemplo, con
la ayuda de anticuerpos descritos en la solicitud de patente
WO-A-98/22509.
El PSA total se determina, por ejemplo, con la
ayuda de anticuerpos descritos por H. Nagasaki et al. (1999),
Clin. Chem. 45: 4486-496.
El PSA libre se determina, por ejemplo, con la
ayuda de anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente WO
92/01936, o con la ayuda de anticuerpos monoclonales comercializados
por CHUGAI (Japón).
La presente invención tiene en particular por
objeto un ensayo inmunológico tal como se define anteriormente, en
el que se determina además el PSA libre activo. La cantidad de PSA
libre activo se puede evaluar de distintas maneras.
Así, según un primer modo de realización, la
cantidad de PSA libre activo se evalúa con la ayuda de anticuerpos
que se unen específicamente al PSA libre activo que se pueden
obtener mediante inmunización con la ayuda de fracciones de PSA
total o fracciones enriquecidas en PSA libre activo. Asimismo, la
cantidad de PSA libre activo se puede evaluar de manera indirecta
mediante evaluación de la cantidad de PSA libre total, de la cual
se resta la cantidad de PSA libre inactivo ya evaluado como
antes.
La presente invención tiene además por objeto un
ensayo inmunológico para determinar la relación de la cantidad de
PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la
cantidad de PSA libre total,
o la relación de la cantidad de PSA libre
inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad
de PSA libre activo,
o la relación de la cantidad de PSA libre activo
a la cantidad de PSA libre total,
o la relación de la cantidad de PSA libre
inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad
de PSA total,
o la relación de la cantidad de PSA libre
inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad
de PSA complejado,
o la relación de la cantidad de PSA libre activo
a la cantidad de PSA total,
o la relación de la cantidad de PSA libre activo
a la cantidad de PSA complejado,
o las inversas de estas relaciones, o
combinaciones de estas relaciones,
en una muestra biológica extraída de un sujeto,
en el que:
- -
- se evalúa la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una muestra biológica extraída de un sujeto, poniendo en contacto dicha muestra con un reactivo según la invención tal como se define anteriormente,
- -
- se evalúa una de las cantidades seleccionadas de entre la cantidad de PSA libre activo, la cantidad de PSA libre total, la cantidad de PSA total y la cantidad de PSA complejado, en una muestra de la misma naturaleza extraída de un mismo sujeto, y
- -
- se determina dicha relación o dicha relación inversa, o dicha combinación de relaciones.
La presente invención se refiere a distintos
métodos de diagnósticos que, de manera general, se aplican a
sujetos que presentan una concentración sérica de PSA superior a 2
ng/ml o a 2,5 ng/ml.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un método de diagnóstico de un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto en el que se sospecha que padece de dicho adenocarcinoma, sin
practicar biopsia, en el que se implementa uno o varios ensayos
inmunológicos tales como se definen aquí arriba.
En efecto, se descubrió que la concentración
(por ejemplo sérica) de PSA libre inactivo es claramente más
elevada en el caso de una BPH que en el caso de un adenocarcinoma de
la próstata.
Por lo tanto, la invención se refiere
especialmente a un método de diagnóstico de BPH o de diferenciación
entre un cáncer de la próstata y una BPH, en el que se mide el
contenido de PSA libre activo, tal como se define en la
reivindicación 1, en una muestra que procede de un individuo, y se
compara este contenido con una escala de valores predeterminados,
siendo dichos valores aquellos observados en los pacientes que
padecen de una BPH reconocida, y los observados en los pacientes
que padecen de un adenocarcinoma de la próstata reconocido, y se
concluye, del resultado de esta comparación, que existe una BPH o
bien que existe un adenocarcinoma de la próstata. Este método
equivale en la práctica a comparar el valor medido con un valor
límite.
Por supuesto, estas variaciones del contenido de
PSA libre inactivo influyen en diferentes relaciones tales como las
relaciones de la cantidad de PSA libre inactivo a la cantidad de PSA
libre total o a la cantidad de PSA total. Se pueden determinar
también otras relaciones, tal como se precisa a continuación.
Se sabe que, de manera general, los resultados
de los ensayos inmunológicos dependen en gran medida de las
características de especificidad y afinidad de los anticuerpos
usados, y que estas características influyen en los valores medidos
con estos anticuerpos. Por lo tanto, se entiende que no es posible
dar valores límites precisos y que se pueden determinar valores
límites adaptados a cada anticuerpo usado, en cada caso, mediante
sencillos experimentos de rutina.
Se debe entender claramente que en la presente
memoria se denomina valor límite a un valor discreto o bien a un
intervalo de valores que corresponden a una zona de indeterminación.
Por supuesto, cuando el valor medido se incluye en el intervalo de
indeterminación, o es muy próximo al valor límite en el caso de un
valor discreto, no se puede sacar una conclusión definitivamente, y
conviene realizar investigaciones suplementarias.
Por supuesto, cuando se determina un valor
límite para un tipo de relación dado, se puede deducir valores
límites que corresponden a otros tipos de relaciones.
La presente invención tiene particularmente por
objeto un método de diagnóstico tal como se ha definido
anteriormente, en el que, además, se compara el valor de la
relación así determinado con un valor límite predeterminado elegido,
dependiendo del tipo de relación usada, de manera que los valores
de dicha relación mayores o, respectivamente, menores, que dicho
valor límite sean representativos de los valores observados en los
pacientes que padecen de un adenocarcinoma de la próstata
reconocido, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha
relación menores o, respectivamente, mayores, que dicho valor
límite sean representativos de los valores observados en los
sujetos reconocidos como no afectados por un adenocarcinoma de la
próstata, y se concluye, a partir del resultado de dicha
comparación, que existe un adenocarcinoma o que no existe un
adenocarcinoma de la próstata.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un método de diagnóstico que permite diferenciar entre una
patología benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata,
en un sujeto en el que se sospecha que padece de una de estas
enfermedades, en el que se implementa un ensayo inmunológico tal
como se define anterior-
mente.
mente.
La presente invención tiene en particular por
objeto tal método en el que, además, se compara el valor de una de
las relaciones mencionadas anteriormente con un valor de
diferenciación predeterminado elegido, dependiendo del tipo de
relación usada, de manera que los valores de dicha relación que son
mayores o, respectivamente, menores, que dicho valor de
diferenciación sean representativos de los valores observados en los
pacientes que padecen una patología benigna reconocida de la
próstata, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha
relación que son menores o, respectivamente, mayores, que dicho
valor de diferenciación sean representativos de los valores
observados en sujetos reconocidos por estar afectados por un
adenocarcinoma reconocido de la próstata, y se concluye, a partir
del resultado de dicha comparación, que existe una patología benigna
de la próstata o un adenocarcinoma de la
próstata.
próstata.
En la práctica, los valores de diferenciación
son análogos a los valores límites mencionados anteriormente.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un método de diagnóstico de un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto del que se sospecha que padece de dicho adenocarcinoma, en el
que:
- -
- se determina la cantidad de PSA libre activo y la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en un muestra extraída de este sujeto,
- -
- llegado el caso, se determina la cantidad de una forma de PSA distinta del PSA libre activo, y distinta del PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una muestra de la misma naturaleza extraída del mismo sujeto, siendo dicha otra forma tal como se define en la reivindicación 18,
- -
- se determina el valor de una de las siguientes relaciones:
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA libre activo,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA libre total,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA total,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA complejado,
o las inversas de estas relaciones, o
combinaciones de estas relaciones,
- -
- se compara el valor de la relación así determinado con un valor límite predeterminado elegido, dependiendo del tipo de relación usada, de manera que los valores de dicha relación mayores o, respectivamente, menores, que dicho valor límite sean representativos de los valores observados en los pacientes que padecen de un adenocarcinoma reconocida de la próstata, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha relación menores o, respectivamente, mayores, que dicho valor límite sean representativos de los valores observados en sujetos reconocidos como no afectados por un adenocarcinoma de la próstata, y se concluye, a partir del resultado de dicha comparación, que existe o que no existe un adenocarcinoma de la próstata.
La presente invención tiene además por objeto un
método de diagnóstico que permite diferenciar entre una patología
benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata, en un
sujeto del que se sospecha que padece de una de estas enfermedades,
en el que:
- -
- se determina la cantidad de PSA libre activo y la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una muestra extraída de este sujeto,
- -
- llegado el caso, se determina la cantidad de una forma de PSA distinta del PSA libre activo, y distinta del PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una muestra de la misma naturaleza extraída del mismo sujeto, siendo dicha otra forma tal como se define en la reivindicación 15,
- -
- se determina el valor de una de las siguientes relaciones:
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA libre activo,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA libre total,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA total,
- \bullet
- relación de la cantidad de PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, a la cantidad de PSA complejado,
o las inversas de estas relaciones, o
combinaciones de estas relaciones,
- -
- se compara el valor de la relación así determinado con un valor de diferenciación predeterminado elegido, dependiendo del tipo de relación usada, de manera que los valores de dicha relación mayores o, respectivamente, menores, que dicho valor de diferenciación sean representativos de los valores observados en los pacientes que padecen una patología benigna reconocida de la próstata, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha relación menores o, respectivamente, mayores, que dicho valor de diferenciación sean representativos de los valores observados en sujetos reconocidos como afectados por un adenocarcinoma reconocido de la próstata, y se concluye, a partir del resultado de dicha comparación, que existe una patología benigna de la próstata o que existe un adenocarcinoma de la próstata.
La presente invención tiene también por objeto
un kit de diagnóstico que permite diagnosticar un adenocarcinoma de
la próstata en un sujeto del que se sospecha que padece dicho
adenocarcinoma, o que permite diferenciar entre una patología
benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto del que se sospecha que padece una de estas enfermedades,
comprendiendo dicho kit:
- -
- anticuerpos según la invención para determinar el PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, en una muestra biológica,
- -
- medios para determinar el PSA libre activo en una muestra biológica de la misma naturaleza, y eventualmente
- -
- medios para determinar una forma de PSA distinta del PSA libre inactivo, tal como se define en la reivindicación 1, y distinta del PSA libre activo, en una muestra biológica de la misma naturaleza, siendo dicha distinta forma tal como se define en la reivindicación 19.
Entre los medios usables en dicho kit, se usan
en particular anticuerpos que se unen específicamente a la forma de
PSA que se desea cuantificar.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención
sin, sin embargo, limitarla.
Se inmunizan ratones hembra BALB/c JYCo, de 4 a
6 semanas (IFFA Credo), mediante inyección intraperitoneal con 15
\mug de PSA purificado (PSA de origen seminal suministrado por
SCIPAC) emulsionados con un volumen igual de adyuvante completo de
Freund, seguido de cinco inyecciones de adyuvante incompleto,
espaciándose las inyecciones dos semanas. Cuatro días después de la
última inyección, las células del bazo se extraen y se fusionan,
según el método de Köhler y Milstein, con células de la línea
celular de mieloma de ratón Sp 2/0-Ag14. Después,
las células se cultivan durante 12 a 14 días. Los sobrenadantes de
los cultivos se recogen y después se someten a un ensayo según un
método de ELISA, en el que la fase sólida se reviste con el antígeno
usado para la inmunización. Las colonias positivas, es decir, que
reaccionan positivamente frente a PSA, se subclonan dos veces
mediante dilución límite. Se cultivan clones seleccionados mediante
ascitos, de manera conocida. La fracción IgG de cada fluido
ascítico se purifica mediante cromatografía en columna de proteína
A-Sefarosa 4 FF, según las instrucciones del
fabricante (PHARMACIA).
Se revisten placas de 96 pocillos (Nunc) con 100
\mul de una disolución que comprende 1 mg/l de PSA no complejado
(suministrado por SCIPAC), de complejo PSA-ACT
(suministrado por los laboratorios SCRIPPS) o de ACT (igualmente
suministrado por los laboratorios SCRIPPS) en 0,05 moles/l de tampón
de carbonato, pH 9,6. Después de incubar una noche a temperatura
ambiente, las placas se lavan tres veces con una disolución salina
tamponada con fosfato (PBS; 50 mmoles/l de tampón de fosfato, pH
7,2, 150 mmoles/l de NaCl) que contiene 0,5 ml/l de Tween 20
(PBS-T), y se bloquea durante 1 hora a 37ºC con un
PBS que contiene 10 g/l de extracto de leche liofilizada. Después,
las placas se lavan una segunda vez con PBS-T. Se
añaden a cada pocillo de cada placa 100 \mul de fluido ascítico
diluido de 10^{-1} a 10^{-6} en PBS-T, y después
se incuba durante una hora a 37ºC. Después, las placas se lavan con
PBS-T, y se añaden a cada pocillo de cada placa 100
\mul de IgG de cabra anti-ratón conjugado con
fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Laboratories) a una
dilución de 1:2000 en PBS-T que contiene 10 g/l de
seroalbúmina bovina (BSA) (SIGMA). Las placas se incuban durante una
hora a 37ºC, y después se lavan con PBS-T.
Se añade el sustrato, una disolución de fosfato
de p-nitrofenilo (SIGMA), durante 30 minutos. La
actividad enzimática se bloquea con una disolución de NaOH de 1
ml/l, y se mide la absorbancia a 405 nm con un lector de placas
ELISA (BioMérieux).
Así, se pudo seleccionar varios anticuerpos que
reconocen el PSA libre, pero que no reconocen ni el PSA complejado,
ni el ACT.
Con el fin de continuar la caracterización de la
especificidad de los anticuerpos, se preparó un PSA que presenta
las características deseadas.
Así, se sintetiza un PSA mediante la línea
celular LNCaP según la técnica descrita en los artículos "LNCaP
Produces both putative zymogen and inactive, free form of prostate
specific antigen", E. Corey et al., 1998, Prostate
35:135-143, "Androgen-Sensitive
human prostate cancer cell, LNCaP, Produce both
N-terminaly mature and truncated prostate specific
antigen isoform", A. Herrala et al., 1997, Eur. J.
Biochem. 255:329-335, "Production of miligram
concentration of free prostate specific antigen (fPSA) from LNCaP
cell culture: Difference between fPSA from LNCaP cell and seminal
plasma" J.T. Wu et al., 1998, J. Clin. Lab. Anal.
12:6-13.
El PSA así producido mediante la línea celular
LNCaP está compuesto de PSA zimógeno, de PSA enzimáticamente maduro
activo, de PSA completo inactivo, así como formas escindidas o
truncadas inactivas del PSA.
Además, el cultivo de la línea se realiza en
presencia de suero de ternera fetal, que contiene ACT, estando así
una proporción de complejo PSA-ACT igualmente
presente. Este PSA de origen celular es, por lo tanto, una buena
herramienta para demostrar la especificidad de reconocimiento de los
distintos anticuerpos monoclonales anti-PSA libre
obtenidos en el ejemplo 2.
Se cultivan células LNCaP en un medio sintético
en el que se añadió suero de ternera fetal. Se reúnen los
diferentes sobrenadantes de cultivo que contienen el PSA segregado,
y se dividen en fracciones idénticas de 380 ml.
Se realizan inmunoabsorbentes acoplando de
manera idéntica los anticuerpos monoclonales
anti-PSA obtenidos en el ejemplo 2 a resina de
sefarosa. Así, se forman columnas de afinidad que contienen
cantidades de resina idénticas. Cada fracción de PSA celular se
inmunopurifica sobre una de estas columnas de afinidad, y el PSA
fijado por cada anticuerpo monoclonal se eluye de la columna, en
primer lugar con una disolución ácida (glicina 0,1 M y pH 2,8),
después con una disolución básica (DEA 0,1 M y pH 11). Después, los
eluatos se neutralizan inmediatamente para preservar la actividad
del PSA.
Se analiza el PSA contenido en las distintas
fracciones obtenidas: después de haber sido cuantificado, se mide
su actividad enzimática. Después, se caracterizan las distintas
formas de PSA contenidas en los eluatos mediante transferencia
Western tras electroforesis sobre gel de
SDS-PAGE.
La cantidad de PSA en cada fracción ácida o
básica se determina mediante un método de ELISA usando un anticuerpo
policlonal anti-PSA a fin de asegurar que el PSA se
determinará en su totalidad.
En la tabla 1 siguiente, se proporcionan los
resultados obtenidos con 3 anticuerpos particulares, específicos de
la forma libre del PSA, obtenidos en el ejemplo 2.
Los resultados de la tabla 1 muestran que el PSA
se encuentra exclusivamente en las fracciones de "eluatos
ácidos", y que no todos los anticuerpos monoclonales han retenido
la misma cantidad de PSA.
La actividad enzimática del PSA contenido en las
fracciones de "elución ácida" se mide sobre un sustrato de
tipo quimiotripsina,
S-2586(MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA.HCl)
obtenido de Chromogenix AB (Mölndal, Suecia). Esta actividad se
determina en 60 \mul de muestra, y la actividad específica se
calcula a partir de la concentración determinada en el párrafo
anterior.
Los resultados se proporcionan en la tabla 2
siguiente.
| Actividad enzimática específica del PSA celular inmunopurificado | |
| Anticuerpos monoclonales | Actividad específica del PSA (\Delta DO/min./\mug de PSA x 1000) |
| 1 | 21,6 |
| 2 | 1,2 |
| 3 | 0,9 |
| Sobrenadante celular de partida | 11,6 |
Los resultados muestran que la actividad
enzimática específica del eluato ácido obtenido con el anticuerpo
anti-PSA nº 1 es dos veces más elevada que la
actividad del sobrenadante celular de partida, antes de la
inmunopurificación.
Dicho anticuerpo enriqueció, por lo tanto, el
PSA purificado en forma enzimáticamente activa. Además, este
anticuerpo nº 1 reconoce una forma libre del PSA. Por consiguiente,
el anticuerpo nº 1 reconoce esencialmente la forma libre activa del
PSA.
La actividad enzimática específica de los
eluatos ácidos obtenidos con los anticuerpos nº 2 y 3 es muy baja.
Esto muestra que estos anticuerpos han retenido esencialmente un PSA
en su forma inactiva. Puesto que estos anticuerpos son específicos
de una forma libre del PSA, éstos reconocen esencialmente el PSA en
su forma libre inactiva.
Además, se sabe que la tripsina es capaz de
transformar el PSA zimógeno en PSA enzimáticamente activo. Por esta
razón, a fin de determinar si el PSA zimógeno había sido retenido,
durante las operaciones de cromatografía de afinidad descritas aquí
arriba, mediante los anticuerpos monoclonales
anti-PSA, se midió la actividad enzimática de los
"eluatos ácidos" en presencia de tripsina. La actividad
específica de los eluatos, determinada con o sin tripsina, es
idéntica. Por consiguiente, los eluatos ácidos obtenidos con los
anticuerpos nº 1, 2 y 3, tal como se describen aquí arriba, no
contienen PSA en su forma zimógeno.
Por lo tanto, ninguno de los anticuerpos 1, 2 ó
3 reconoce la forma zimógena del PSA.
Se separaron mediante electroforesis sobre gel
de acrilamida en condiciones reductoras las distintas formas de PSA
presentes en los eluatos que provienen de las columnas a las que se
fijan los anticuerpos nº 1, 2 y 3, y se realiza la detección del
PSA mediante transferencia Western con un anticuerpo monoclonal que
reconoce el PSA total.
Las transferencias Western realizadas confirman
que está presente un PSA en todas las muestras ensayadas que
proceden de la elución ácida, en proporciones en correlación con las
cantidades determinadas en la tabla 1, mientras que las muestras
que proceden de las eluciones básicas no contenían PSA.
Las transferencias Western realizadas confirman
igualmente que los anticuerpos nº 1, 2 y 3 no han retenido el
complejo PSA-ACT. Finalmente, en comparación con el
PSA obtenido según se indica en el ejemplo 3 utilizado como testigo,
las eluciones ácidas contienen formas de PSA que tienen un peso
molecular normal (33 kDa), e igualmente formas que tienen un menor
peso molecular.
Claims (20)
1. Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
que se unen específicamente al PSA libre inactivo, estando dicho
PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de
la forma zimógena del PSA, siendo dichos anticuerpos anticuerpos
policlonales purificados o anticuerpos monoclonales.
2. Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
según la reivindicación 1, que son anticuerpos monoclonales.
3. Hibridoma que produce anticuerpos
monoclonales según la reivindicación 2.
4. Reactivo para ensayo inmunológico que
contiene anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tales como los
definidos en la reivindicación 1 ó 2.
5. Reactivo para ensayo inmunológico según la
reivindicación 4, en el que dichos anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos se fijan sobre un soporte y/o se unen a un marcador.
6. Ensayo inmunológico para la determinación
cuantitativa del PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre
inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma
zimógena del PSA, en una muestra biológica extraída de un sujeto,
en el que se pone en contacto dicha muestra con dicho reactivo,
según la reivindicación 4 ó 5, y se evalúa la cantidad de PSA libre
inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre
inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA unido a dichos
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
7. Ensayo inmunológico según la
reivindicación 6, en el que además se evalúa la cantidad de una
forma de PSA distinta de la forma libre inactiva, presente en una
muestra de la misma naturaleza extraída del mismo sujeto.
8. Ensayo inmunológico según la
reivindicación 7, en el que dicha forma distinta de PSA se elige
entre PSA libre activo, PSA libre total, PSA complejado y PSA
total.
9. Ensayo inmunológico según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 8, en el que además se determina por lo
menos una relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando
dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo
escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de dicha
forma distinta, o las inversas de estas relaciones, o combinaciones
de estas relaciones.
10. Ensayo inmunológico según la reivindicación
9, en el que además se determina al menos una relación seleccionada
de entre la relación de la cantidad de PSA libre activo a la
cantidad de PSA libre total, o la relación de la cantidad de PSA
libre activo a la cantidad de PSA total, o la relación de la
cantidad de PSA libre activo a la cantidad de PSA complejado, o las
inversas de estas relaciones, o combinaciones de estas
relaciones.
11. Ensayo inmunológico según las
reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha forma distinta es el PSA
libre activo.
12. Método de diagnóstico de una patología
benigna de la próstata o de diferenciación entre una patología
benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata en un
sujeto, en el que se mide el contenido en PSA libre inactivo,
estando dicho PSA libre inactivo constituido por PSA libre inactivo
escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra que
procede de dicho sujeto, mediante un ensayo inmunológico tal como se
define en las reivindicaciones
6 a 11.
6 a 11.
13. Método según la reivindicación 12, en el
que además se compara dicho contenido con una escala de valores
predeterminados, siendo dichos valores aquellos observados en los
pacientes afectados por una patología benigna reconocida de la
próstata, y aquellos observados en los pacientes que padecen un
adenocarcinoma reconocido de la próstata, y se concluye, a partir
del resultado de esta comparación, que existe una patología benigna
de la próstata o que existe un adenocarcinoma de la próstata.
14. Método según la reivindicación 12 ó 13, en
el que además se compara el valor de la relación así determinada
con un valor de diferenciación predeterminado elegido, dependiendo
del tipo de relación usada, de manera que los valores de dicha
relación que son superiores o, respectivamente, inferiores, a dicho
valor de diferenciación sean representativos de los valores
observados en los pacientes que padecen una patología benigna
reconocida de la próstata, y de manera que, inversamente, los
valores de dicha relación que son inferiores o, respectivamente,
superiores, a dicho valor de diferenciación sean representativos de
los valores observados en sujetos reconocidos que padecen un
adenocarcinoma de la próstata reconocido, y se concluye, a partir
del resultado de dicha comparación, que existe una patología
benigna de la próstata o que existe un adenocarcinoma de la
próstata.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que:
- -
- se determina la cantidad de PSA libre activo y la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra extraída de este sujeto,
- -
- en caso necesario, se determina la cantidad de una forma de PSA distinta del PSA libre activo y distinta del PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra de la misma naturaleza extraída del mismo sujeto, siendo dicha forma elegida entre PSA libre total, PSA total y PSA complejado,
- -
- se determina el valor de una de las relaciones siguientes:
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA libre activo,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA libre total,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA total,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA complejado,
o las inversas de estas relaciones, o
combinaciones de estas relaciones,
- -
- se compara el valor de la relación así determinada con un valor de diferenciación predeterminado elegido, dependiendo del tipo de relación usada, de manera que los valores de dicha relación superiores o, respectivamente, inferiores, a dicho valor de diferenciación sean representativos de los valores observados en los pacientes que padecen una patología benigna reconocida de la próstata, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha relación menores o, respectivamente, mayores, que dicho valor de diferenciación sean representativos de los valores observados en sujetos reconocidos como afectados por un adenocarcinoma reconocido de la próstata, y se concluye, a partir del resultado de dicha comparación, que existe una patología benigna de la próstata o un adenocarcinoma de la próstata.
16. Método de diagnóstico de un adenocarcinoma
de la próstata en un sujeto del que se sospecha que padece de dicho
adenocarcinoma, sin realizar biopsia, en el que se implementa un
ensayo inmunológico tal como se define en las reivindicaciones 6 a
11.
17. Método según la reivindicación 16, en el
que, además, se compara el valor de la relación así determinada con
un valor límite predeterminado elegido, dependiendo del tipo de
relación usada, de manera que los valores de dicha relación mayores
o, respectivamente, menores, que dicho valor límite sean
representativos de los valores observados en los pacientes que
padecen un adenocarcinoma reconocido de la próstata, y de manera
que, a la inversa, los valores de dicha relación menores o,
respectivamente, mayores, que dicho valor límite sean
representativos de los valores observados en sujetos reconocidos que
no padecen un adenocarcinoma de la próstata, y se concluye, a
partir del resultado de dicha comparación, que existe o no un
adenocarcinoma de la próstata.
18. Método según la reivindicación 16 ó 17, en
el que:
- -
- se determina la cantidad de PSA libre activo y la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra extraída de este sujeto,
- -
- llegado el caso, se determina la cantidad de una forma de PSA distinta del PSA libre activo y distinta del PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra de la misma naturaleza extraída del mismo sujeto, siendo dicha forma elegida entre PSA libre total, PSA total y PSA complejado,
- -
- se determina el valor de una de las siguientes relaciones:
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA libre activo,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA libre total,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA total,
- \bullet
- la relación de la cantidad de PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, a la cantidad de PSA complejado,
o las inversas de estas relaciones, o
combinaciones de estas relaciones,
- -
- se compara el valor de la relación así determinada con un valor límite predeterminado elegido, dependiendo del tipo de relación usada, de manera que los valores de dicha relación mayores o, respectivamente, menores, que dicho valor límite sean representativos de los valores observados en los pacientes que padecen un adenocarcinoma reconocido de la próstata, y de manera que, a la inversa, los valores de dicha relación menores o, respectivamente, mayores, que dicho valor límite sean representativos de los valores observados en sujetos reconocidos que no padecen un adenocarcinoma de la próstata, y se concluye, a partir del resultado de dicha comparación, que existe o no un adenocarcinoma de la próstata.
19. Kit de diagnóstico que permite diagnosticar
un adenocarcinoma de la próstata en un sujeto del que se sospecha
que padece dicho adenocarcinoma, o que permite diferenciar entre una
patología benigna de la próstata y un adenocarcinoma de la próstata
en un sujeto del que se sospecha que padece una de estas
enfermedades, comprendiendo dicho kit:
- -
- anticuerpos tales como se definen en la reivindicación 1 ó 2 para determinar el PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, en una muestra biológica, y/o
- -
- medios para determinar el PSA libre activo en una muestra biológica de la misma naturaleza, y eventualmente
- -
- medios para determinar una forma de PSA distinta del PSA libre inactivo, estando dicho PSA libre inactivo constituido de PSA libre inactivo escindido y de la forma zimógena del PSA, y distinta del PSA libre activo, en una muestra biológica de la misma naturaleza, seleccionada de entre PSA libre total, PSA total y PSA complejado.
20. Kit según la reivindicación 19, en el que
dichos medios son anticuerpos.
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