ES2070107T5

ES2070107T5 - Ensayo de antigeno especifico de la prostata (psa) libre y complejado.

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Publication number: ES2070107T5
Application number: ES91913019T
Authority: ES
Inventors: Hans Lilja; Ulf-Hakan Stenman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-07-23
Filing date: 1991-07-22
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2011-07-22
Also published as: DE540573T1; DE69117292T3; DK0540573T4; EP0540573A1; DE69117292D1; US5939533A; GR3019888T3; JP2669566B2; JPH06502719A; DK0540573T3; ATE134448T1; US5501983A; WO1992001936A1; US5912158A; EP0540573B1; ES2070107T1; EP0540573B2; SE9002480D0; ES2070107T3; US20020123616A1

Abstract

SEGUN EL METODO DE LA INVENCION, SE APLICAN INMUNOENSAYOS PARA MEDIR EL AEP LIBRE ASI COMO UN COMPLEJO INHIBIDOR DE LA PROTEINASA. SEGUN LA INVENCION, EL AEP LIBRE Y EL COMPLEJO AEP SE MIDEN MEDIANTE UN INMUNOENSAYO NO COMPETITIVO UTILIZANDO, AL MENOS, DOS ANTICUERPOS MONOCLONALES DISTINTOS. LA INVENCION SE CARACTERIZA ADEMAS EN TANTO QUE EL COMPLEJO INHIBIDOR DE LA PROTEINASA DE INTERES SE FORMA BIEN CON UNA O1-ANTIQUIMOTRIPSINA, UN INHIBIDOR O1-PROTEASA (IAP) BIEN CON UNA O2-MACROGLOBULINA. ADEMAS, LA INVENCION SE CARACTERIZA EN TANTO QUE EL AEP LIBRE, EL COMPLEJO INHIBIDOR DE PROTEINASA-AEP Y SU RELACION SE APLICAN EN EL DIAGNOSTICO DE PACIENTES CON CANCER DE PROSTATA.

Description

Ensayo de antígeno específico de la próstata (PSA) libre y complejado.

La presente invención se refiere a un inmunoensayo del antígeno específico de la próstata (PSA: Prostata Specific Antigen), en el que se usan materiales reactivos específicos (anticuerpos) que permiten la medida del PSA libre así como del PSA que está formando complejo con \alpha_{1}-antiquimotripsina.

Se refiere también al uso de PSA libre y de PSA en complejo con \alpha_{1}-antiquimotripsina, y de su relación, como marcador útil en el diagnóstico de pacientes con cáncer de próstata.

Fundamento de la invención

El antígeno específico de la próstata (PSA) fue purificado primero a partir de tejido prostático (Wang et al.,
Invest. Urol. 1979), pero la misma proteína fue casi simultáneamente e independientemente caracterizada en el plasma seminal (Hara et al., J. Lab. Clin. Med. 1989); Graves et al., N. Engl. J. Med. 1985). Ahora se sabe que el PSA es una proteasa de serina de cadena simple, glicosilada, de 33 kDa (Lilja, J. Clin. Invest. 1985; Watt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1986). La cadena principal polipeptídica de 237 aminoácidos tiene mucha semejanza con la de las calicreínas glandulares (Lundwall et al., FEBS Lett 1987; Schaller et al., Eur. J. Biochem. 1987). A diferencia de las calicreínas glandulares similares a la tripsina, que muestran especificidad por el sustrato restringida por Arg (MacDonald et al., Biochem. J. 1988), el PSA muestra una especificidad por el sustrato similar a la quimotripsina (Akiyama et al., FEBS Lett. 1987; Lilja et al., J. Biol. Chem. 1989). Se ha predicho que el PSA es producido como un zimógeno presumiblemente inactivo (Lundwall et al., FEBS Lett. 1987). El PSA activo es segregado en el plasma seminal (Lilja, J. Clin. Invest. 1985), en donde es una de las proteínas más abundantes de la próstata (Lilja et al., The Prostate 1988; Dubé et al., J. Androl. 1987). La actividad biológica del PSA en el semen se refiere a su fragmentación proteolítica limitada de las proteínas predominantes segregadas por las vesículas seminales (Lilja, J. Clin. Invest. 1985; Lilja et al., J. Clin. Invest. 1987); McGee et al., Biol. Reprod. 1988).

Secundariamente a la liberación por el epitelio de la próstata, el PSA puede ser detectado también en la circulación (Papsidero et al., Cancer Res. 1980). Las medidas de la concentración de PSA en el suero han encontrado ahora amplio uso en la vigilancia de pacientes con cáncer de próstata, aunque también se ha publicado el aumento de la concentración de PSA en el suero en la hiperplasia benigna de próstata y como consecuencia de trauma quirúrgico de la próstata (Duffy, Ann. Clin. Biochem 1989; Brawer et al., Urology Suppl. 1989): Sin embargo, actualmente se desconoce si la inmunorreactividad en el suero representa al zimógeno de PSA, el PSA activo o el PSA inactivado por inhibidores de proteinasa extracelulares, y se han publicado resultados contradictorios acerca de la masa molecular de esta inmunorreactividad. Papsidero publicó en 1980 que la PSA-inmunorreactividad eluye como un pico individual de 90 a 100 kDa (Papsidero et al., Cancer Res. 1980), mientras que Alfthan y Stenman publicaron que la parte predominante de esta inmunorreactividad eluye como una proteína de 30 kDa (Alfthan et al., Clin. Chem. 1988) cuando se somete a cromatografía de filtración en gel.

La publicación inicial de patente japonesa 62-46263 publica el hallazgo de gamma-Sm (seminoproteína) en el plasma, tanto complejada con alfa-1-antitripsina como en forma no complejada. También hace referencia a bibliografía que enseña inmunoensayos para la gamma-Sm total e informa acerca del desarrollo de un inmunoensayo para la medida cuantitativa del complejo de gamma-Sm con alfa-1-antitripsina. Este complejo ha sido también descrito como útil para el diagnóstico del cáncer de próstata mediante la detección del complejo gamma-Sm-alfa-1-antitripsina en el suero del paciente y midiendo solamente este complejo. Este complejo con alfa-1-antitripsina fue descubierto evidentemente fraccionando el suero de pacientes con cáncer de próstata según el peso molecular y observando la inmunorreactividad contra los anticuerpos ya conocidos para la medida de la gamma-Sm total en las fracciones de 30.000 y 90.000 Da. Se supuso que la primera fracción era una gamma-Sm no complejada idéntica a la aislada del semen, y que la ultima fracción era el complejo con antitripsina. No se describe ningún inmunoensayo o técnica cuantitativa para la medida de la gamma-Sm no complejada, ni tampoco se menciona siquiera cualquier otro complejo. De acuerdo con el título en inglés del resumen de la patente japonesa, la gamma-Sm es idéntica al PSA.

En la invención del procedimiento los autores demostraron que el PSA tiene la capacidad de formar complejos con inhibidores de proteinasa tales como \alpha_{1}-antiquimotripsina que se presenta en concentración elevada en los fluidos extracelulares humanos, y que el PSA se presenta en estos fluidos tanto en forma libre como complejada. Además, la invención probó ser muy útil en el diagnóstico de pacientes con cáncer de próstata.

Resumen de la invención

De acuerdo con el método de la invención, se aplican inmunoensayos para medir el PSA libre, así como PSA en forma de complejo con \alpha_{1}-antiquimotripsina. El PSA libre y el complejo de PSA se miden de acuerdo con la invención mediante un inmunoensayo no competitivo, empleando al menos dos anticuerpos monoclonales diferentes. La invención se caracteriza además por que el complejo PSA-inhibidor de proteinasa de interés se forma con

\hbox{ \alpha  _{1} -antiquimotripsina}

(ACT). Además, la invención se caracteriza porque el PSA libre, el complejo PSA-inhibidor de proteinasa, y su relación, se aplican al diagnóstico de pacientes con cáncer de próstata. Descripción de los dibujos

Fig. 1 presenta un anticuerpo policlonal y tres anticuerpos monoclonales usados para sondar proteínas transferidas a membranas de PVDF después de electroforesis en gel de agarosa. En la calle 1 está 1 \mug de PSA, en la calle 2 está 1 \mug de PSA incubado a 37°C durante 30 minutos con 6 \mug de \alpha_{1}-antiquimotripsina, y en la calle 3 están 6 \mug de
\alpha_{1}-antiquimotripsina.

Fig. 2 presenta un anticuerpo policlonal y tres anticuerpos monoclonales usados para sondar proteínas transferidas a membranas de PVDF después de SDS-PAGE. En la calle 1 está 1 \mug de PSA, en la calle 2 está 1 \mug de PSA incubado a 37°C durante 30 minutos con 6 \mug de \alpha_{1}-antiquimotripsina, y en la calle 3 están 6 \mug de \alpha_{1}-antiquimotripsina.

Fig. 3 presenta la especificidad de las tres versiones del ensayo.

Fig. 4 presenta una correlación de la inmunorreactividad de PSA en muestras de suero procedentes de 65 pacientes individuales, analizadas con las versiones A y C del ensayo.

Fig. 5 presenta una correlación de la inmunorreactividad de PSA en muestras de suero procedentes de 65 pacientes individuales, analizadas con las versiones A y B del ensayo.

Fig. 6 presenta una filtración en gel de una muestra de paciente B en una columna de HPLC TSK 250. La inmunorreactividad de PSA de las fracciones eluídas fue analizada mediante las versiones A, B y C del ensayo.

Fig. 7 presenta una filtración en gel de una muestra de paciente C en una columna de HPLC TSK 250. La inmunorreactividad de PSA de las fracciones eluídas fue analizada mediante las versiones A, B y C del ensayo.

Fig. 8 presenta una filtración en gel de una muestra de paciente D en una columna de HPLC TSK 250. La inmunorreactividad de PSA de las fracciones eluídas fue analizada mediante las versiones A, B y C del ensayo.

Fig. 9 presenta una caracterización de la inmunorreactividad de PSA en una muestra de suero con un nivel de PSA de 10.000 \mug/L mediante filtración en gel. El PSA y el complejo PSA-ACT fueron medidos mediante IFMA.

Fig. 10 presenta la proporción del complejo PSA-ACT de la inmunorreactividad de PSA total en sueros de pacientes con cáncer de próstata, en función de la concentración de PSA. El nivel de PSA fue medido mediante IRMA y el de PSA-ACT lo fue mediante IFMA.

Descripción detallada 1. Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales

Producción de anticuerpos monoclonales específicos anti-PSA. Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyecciones intraperitoneales con 70 \mug de PSA emulsionado en volúmenes iguales con coadyuvante de Freund completo. La inmunización se repitió después de 3, 6 y 9 semanas con 50 \mug de PSA emulsionado con coadyuvante de Freund incompleto. Tres semanas más tarde se administró a los ratones una reinmunización final con 40 \mug de PSA, y los ratones fueron sacrificados cuatro días más tarde. Se prepararon células linfoides del bazo y se mezclaron en una relación 1:1 con células de plasmacitoma (NS-1). Las células fueron fusionadas y recolectadas en pocillos de microtítulo en KC-2000 (Hazleton Biologicals Inc., Le nexa, EE.UU.) que contenía 200 g/L de suero de ternera fetal y suplemento HAT H-0262 (1:50, Sigma) (Matikainen et al., J. Gen. Microbiol. 1983).

La producción de anticuerpos específicos anti-PSA por los clones maestros se ensayó con placas de tiras de pocillos recubiertas con IgG anti-ratón de conejo (Lövgren et al., Talanta 1984). Las tiras se incubaron con los sobrenadantes del hibridoma o bien con el patrón (anticuerpo monoclonal contra PSA; 0812 Hybritech), se lavaron y se incubaron con PSA marcado con Eu (50 ng por pocillo), y se determinó la cantidad de PSA marcado con Eu que se había unido.

La clonación de los clones maestros mediante diluciones limitadas se realizó como se ha descrito (Staszewski y Yale, J. Biol. Med. 1984). Los clones deseados fueron expandidos intraperitonealmente en ratones Balb/c, recogiéndose el fluido ascítico en 10 días. La fracción de IgG del fluido ascítico se purificó mediante cromatografía en proteína A-Sepha-rosa siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

El PSA unido a la fase sólida se usó para probar si un anticuerpo monoclonal no marcado podía bloquear la unión de otro MAb (anticuerpo monoclonal: Monoclonal Antibody) anti-PSA marcado con Eu al PSA unido a la fase sólida. El PSA unido a la fase sólida se obtuvo mediante la incubación de partes alícuotas de 25 \muL de PSA purificado (25 \mug/L) y 200 \muL de tampón para ensayo DELFIA® (50 mmol/L de Tris, pH 7,75, 0,15 mol/L de NaCl, 0,5 g/L de BSA, y 0,5 g/L de NaN_{3}) durante 2 h en placas de tiras de pocillos recubiertas con el MAb anti-PSA 2E9 ó 5A10. Las tiras se lavaron y después se incubaron durante 1 hora con 200 \muL de un MAb anti-PSA no marcado (0,005 - 50 \mug/L). De nuevo se lavaron las tiras, se incubaron durante 1 hora con otro MAb anti-PSA marcado con Eu y se determinó la cantidad de anti-PSA marcado con Eu no unido.

Caracterización parcial de la especificidad del epítopo de tres anticuerpos monoclonales contra el PSA

Varios clones produjeron anticuerpos monoclonales contra el PSA, como indicó el ensayo fluorométrico. Tres de ellos (denominados 2E9, 2H11 y 5A10) fueron expandidos y los anticuerpos se aislaron del fluido ascítico. Los tres anticuerpos monoclonales contra PSA se usaron para sondar proteínas transferidas sobre membranas de PVDF después de electroforesis en gel de agarosa (Fig. 1) o SDS-PAGE (Fig. 2) de 1 \mug de PSA (calle 1), 1 \mug de PSA incubado a 37°C durante 30 minutos con 6 \mug de \alpha_{1}-antiquimotripsina (calle 2), y 6 \mug de \alpha_{1}-antiquimotripsina (calle 3). El PSA transferido a membranas de PVDF desde los geles de agarosa fue identificado por los tres anticuerpos monoclonales, mientras que el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina fue identificado por los anticuerpos 2E9 y 2H11, pero no por el anticuerpo 5A10. El anticuerpo 2E9 fue el único MAb anti-PSA que identificó fácilmente al PSA y al PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina, cuando estas proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF después de SDS-PAGE. Sin embargo, también se obtuvo una pequeña reacción con el PSA (pero no con el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina) cuando se usaron los anticuerpos 2H11 y 5A10 para sondar estas proteínas transferidas sobre membranas de PVFD después de SDS-PAGE.

También se caracterizó la especificidad para el epítopo de los tres anticuerpos monoclonales usando tres diferentes juegos de ensayos de tipo sándwich en fase sólida. El ensayo (A), en el que se usó el anticuerpo 2E9 como atrapador de la fase sólida y el 2H11 marcado con Eu como anticuerpo de detección, mostró una respuesta a la dosis para el PSA casi idéntica en comparación con el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina (Tabla 1; Fig. 3). Esto contrasta con el ensayo (B), en el que se usó como atrapador el anticuerpo 5A10, que reconoció preferentemente al PSA pero no reconoció más que escasamente al PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina, y 2H11 marcado con Eu como anticuerpo de detección, y con el ensayo (C), en el que se usó el anticuerpo 2E9 como atrapador, y anticuerpo marcado con Eu contra la \alpha_{1}-antiquimotripsina como anticuerpo de detección, que solamente reconoció al PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina (Tabla 1; Fig. 3).

Se usó PSA unido a la fase sólida para caracterizar más la especificidad para el epítopo de los tres anticuerpos monoclonales contra el PSA, habiéndose conseguido la unión del PSA a la fase sólida usando placas de tiras de pocillos recubiertas con el anticuerpo 2E9 o el 5A10. Se encontró así que ninguno de los MAb anti-PSA 2E9, 2H11 o 5A10 bloqueaba significativamente la unión de los demás cuando se ensayó la capacidad de un MAb anti-PSA para bloquear la unión de otro MAb anti-PSA marcado con Eu al PSA unido a la fase sólida.

2. La presencia de complejos de PSA-inhibidor de proteinasa en el suero humano Análisis de PSA en suero humano

Se analizó el suero de muestras individuales de pacientes (n = 65) con los tres juegos de ensayos (A, B y C). El análisis de regresión de los resultados obtenidos con el ensayo A y con el ensayo C dio y = 0,89x + 6,55, r = 0,97 (Fig. 4), y el análisis de regresión entre el ensayo A y el ensayo B dio y = 0,10x + 9,56, r = 0,82 (Fig. 5).

La recuperación total de la inmunorreactividad a partir de los experimentos de filtración en gel de muestras de paciente en la columna de HPLC TSK 250 fue igual de elevada (82 a 107%) con los tres procedimientos de ensayo utilizados (A, B y C). Los experimentos de filtración en gel de muestras de paciente en la columna de HPLC TSK 250 mostraron que el pico predominante de inmunorreactividad de PSA, cuando se analizó con el ensayo A, se identificó en las fracciones que eluían en una posición correspondiente a una masa molecular de 80 a 90 kDa, mientras que se encontró un pico minoritario de esta inmunorreactividad en fracciones que eluían en una posición correspondiente a una masa molecular de 25 a 40 kDa (Fig. 6-8). De la misma forma, el análisis de las fracciones eluidas con el ensayo C (específico para PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina) identificó un pico inmunorreactivo predominante en el intervalo de 80 a 90 kDa (Fig. 6-8). Sin embargo, cuando se usó el ensayo B para analizar las fracciones eluidas de experimentos de filtración en gel, el pico inmunorreactivo predominante eluía en una posición correspondiente a una masa de 25 a 40 kDa. La posición de elución de este pico correspondía al pico inmunorreactivo minoritario identificado con el ensayo A (Fig. 6-8).

Al fraccionar muestras de suero de hombres con diversos niveles de PSA (10 a 10.000 \mug/L) mediante filtración en gel, se observaron también dos componentes correspondientes a PSA y PSA-ACT. En muestras con altos niveles de PSA, dominaba el complejo PSA-ACT (Fig. 9). En sueros femeninos, no se observaron estos componentes (no se indican). La proporción de PSA-ACT de la inmunorreactividad de PSA total aumentaba al aumentar los niveles de PSA (Fig. 10). En sueros procedentes de varones sanos con niveles de PSA por debajo de 2,8 \mug/L, la proporción de PSA-ACT fue de 23 a 47%, en muestras con niveles de PSA de 2,8 a 10 \mug/L, la proporción fue de 26 a 86%, y en muestras con niveles más altos, la proporción siguió aumentando, siendo de 70 a 100% a niveles de PSA por encima de 1000 \mug/L (Fig. 10).

Sobre la base de las concentraciones de los complejos expresadas en unidades arbitrarias, el complejo principal de PSA en los sueros fue el complejo PSA-ACT. En muestras con niveles de PSA bajos, la concentración de

\hbox{PSA-ACT}

estaba próxima al límite de detección. Por consiguiente, no fue posible calcular la proporción de este complejo en muestras normales. Niveles de complejo PSA-ACT claramente elevados se presentaron en muestras con niveles de PSA por encima de 40 \mug/L, y los niveles tendían a aumentar al aumentar los niveles de PSA. 3. PSA y complejos PSA-\alpha_{1}-antiquimotripsina en el diagnóstico de pacientes con cáncer de próstata

Las tres versiones del ensayo expuestas en la sección "Caracterización de la especificidad del epítopo de tres anticuerpos monoclonales contra el PSA" fueron usadas para ensayar 144 pacientes con hiperplasia benigna de próstata (BPH: Benign Prostatic Hyperplasia) y 122 pacientes con diferentes estadios de cáncer de próstata (CAP). Se calcularon las relaciones entre A: PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina/PSA total, y B: PSA libre no complejado/PSA total, así como la sensibilidad y la especificidad clínicas para la medida de PSA total y PSA-\alpha_{1}-antiquimotripsina sola (Tabla 2). De los datos presentados resulta evidente que se consigue mayor especificidad clínica midiendo el complejo PSA-\alpha_{1}-antiquimotripsina, y que las relaciones entre PSA libre/PSA total, y PSA libre/PSA complejado con
\alpha_{1}-antiquimotripsina son significativamente diferentes entre pacientes con BPH y pacientes con CAP.

Tabla 1

La Tabla 1 presenta una respuesta a la dosis de PSA purificado y PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina cuando se analizan mediante tres conjuntos de ensayos diferentes.

-: El ensayo A es MAb anti-PSA 2E9 como atrapador de la fase sólida y MAb anti-PSA 2H11 marcado con Eu como anticuerpo de detección.

-: El ensayo B es MAb anti-PSA 5A10 como atrapador de la fase sólida y MAb anti-PSA 2H11 marcado con Eu como anticuerpo de detección.

-: El ensayo C es MAb anti-PSA 2E9 como atrapador de la fase sólida y anticuerpo de conejo contra \alpha_{1}-antiquimotripsina marcado con Eu como anticuerpo de detección.

Las columnas 1 indican el PSA purificado y las columnas 2 indican el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina.

Tablas 2a y 2b

Las Tablas 2a y 2b presentan los resultados de las pruebas de las muestras de pacientes con tres versiones del ensayo para PSA libre, complejado y total. En la tabla, BPH indica hiperplasia benigna de próstata, CAP indica cáncer de próstata, G indica el grado de diferenciación y T indica el grado. La tabla 2b presenta la sensibilidad y la especificidad.

TABLA 1

1

TABLA 2a

2

TABLA 2b

3

Claims

1. Un inmunoensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de antígeno libre específico de la próstata (PSA libre) en una muestra, caracterizado porque la muestra se expone a un anticuerpo que se une al PSA que forma complejo con \alpha_{1}-antiquimotripsina, y porque se detecta la cantidad de PSA libre unido por el anticuerpo.

2. El inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la determinación cuantitativa del PSA libre se obtiene mediante un inmunoensayo no competitivo.

3. Un inmunoensayo para determinar cuantitativamente la cantidad de antígeno específico de la próstata complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina (PSA complejado) en una muestra, caracterizado porque la muestra se expone a un anticuerpo que se une al PSA complejado y a un anticuerpo que se une a la \alpha_{1}-antiquimotripsina, y porque se detecta la cantidad de PSA complejado unido por ambos anticuerpos.

4. Un inmunoensayo para determinar la relación entre el antígeno libre específico de la próstata, no complejado (PSA libre) y el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina (PSA complejado), caracterizado porque

(a) se mide la cantidad de PSA libre de acuerdo con la reivindicación 1,

(b) se mide la cantidad de PSA complejado de acuerdo con la reivindicación 3, y

(c) se determina la relación entre la cantidad de PSA libre y la cantidad de PSA complejado.

5. Un inmunoensayo para determinar la relación entre le antígeno libre específico de la próstata, no complejado (PSA libre), y la cantidad total de PSA (PSA total), caracterizado porque

(a) se mide la cantidad de PSA libre de acuerdo con la reivindicación 1,

(b) se mide la cantidad de PSA total, y

(c) se determina la relación entre la cantidad de PSA libre y la cantidad de PSA total.

6. El inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo o los anticuerpos son uno o varios anticuerpos monoclonales.

7. El inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la determinación cuantitativa de las diferentes formas de PSA se obtiene usando un anticuerpo monoclonal marcado y uno no marcado.

8. Un complejo de PSA-\alpha_{1}-antiquimotripsina (PSA-ACT) purificado.

9. Un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al PSA libre, pero que no es capaz de unirse al PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina.

10. Una línea celular que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 9.

11. Un método para diferenciar entre la hiperplasia benigna de próstata y el cáncer de próstata determinando la relación entre PSA libre y PSA total, entre PSA libre y PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina, o entre PSA complejado \alpha_{1}-antiquimotripsina y PSA total, en un suero de un paciente, en el que el PSA libre se determina de acuerdo con la reivindicación 1, y en el que el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina se determina de acuerdo con la reivindicación 3.

12. Un método para cribar cáncer de próstata determinando la relación entre PSA libre y PSA total, entre PSA libre y PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina, o entre PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina y PSA total, en un suero de un paciente, en el que el PSA libre se determina de acuerdo con la reivindicación 1, y en el que el PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina se determina de acuerdo con la reivindicación 3.

13. Un procedimiento para preparar un anticuerpo capaz de unirse al PSA libre pero que no es capaz de unirse al PSA complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a) inmunizar ratones con PSA,

(b) preparar células linfoides del bazo de los ratones,

(c) mezclar y fusionar estas células con células de plasmacitoma para formar una línea de células de hibridoma capaz de producir anticuerpos anti-PSA,

(d) cultivar la línea de células de hibridoma para producir anticuerpos

\hbox{anti-PSA}

, y

(e) seleccionar por cribado los anticuerpos específicos anti-PSA que no se unen simultáneamente al PSA que está complejado con \alpha_{1}-antiquimotripsina.

14. Un procedimiento para preparar un complejo de PSA-ACT purificado, que comprende mezclar PSA purificado y ACT purificada, para formar el complejo de PSA-ACT.