ES2269788T3 - Procedimiento para la produccion de l-aminoacidos utilizando escherichia. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de un L-aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por L-treonina y L-fenilalanina, que comprende cultivar una bacteria que pertenece al género Escherichia en un medio de cultivo y recuperar del medio de cultivo el L- aminoácido que va a producirse y acumularse en el medio, en el que dicha bacteria se potencia potenciando la actividad de una proteína tal como se define en (A) o (B) siguientes en una célula de dicha bacteria: (A) una proteína que comprende la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en el listado de secuencias; (B) una proteína que comprende una secuencia aminoácida que incluye deleción, sustitución, inserción o adición de uno a cinco aminoácidos en la secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en el listado de Secuencias, y que presenta una actividad de conferir, a una bacteria que pertenece al género Escherichia, resistencia a un L-aminoácido, seleccionado de entre el grupo constituido por L-fenilalanina, L-treonina, L-homoserina y L- cisteína y/o un análogo de aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por p-fluoro- fenilalanina, 5-fluoro-DL-triptófano, S-(2-aminoetil)cisteína y 4-aza-DL-leucina, en el que dicha actividad de la proteína tal como se define en (A) o (B) se potencia transformando dicha bacteria con un ADN que codifica la proteína tal como se define en (A) o (B), utilizando un vector multicopia que contiene dicho ADN, o alterando la secuencia de regulación de la expresión de dicho ADN en el cromosoma de dicha bacteria.
Description
Procedimiento para la producción de
L-aminoácidos utilizando Escherichia.
La presente invención se refiere a la
biotecnología, específicamente a un procedimiento para la producción
de L-aminoácidos mediante fermentación y más
específicamente, a un gen derivado de la bacteria Escherichia
coli. El gen es útil para mejorar la productividad de los
L-aminoácidos, por ejemplo,
L-fenilalanina y L-treonina.
Convencionalmente, los
L-aminoácidos se han producido industrialmente
mediante el procedimiento de fermentación, utilizando cepas de
microorganismos obtenidos a partir de fuentes naturales o mutantes
de las mismas, modificados especialmente para potenciar la
productividad de los L-aminoácidos.
Se han dado a conocer muchas técnicas para
potenciar la productividad de los
L-aminoácidos, por ejemplo, mediante transformación
del microorganismo mediante ADN recombinante (véase, por ejemplo, la
patente US nº 4.278.765). Estas técnicas se basan en aumentar las
actividades de las enzimas implicadas en la biosíntesis de los
aminoácidos y/o en la desensibilización de las enzimas diana a
partir de la inhibición mediante retroalimentación por el
L-aminoácido producido (véase, por ejemplo, la
solicitud japonesa sometida a inspección pública
No56-18596 (1981), WO 95/16042 o la patente
US nº 5.661.012 y nº 6.040.160).
Por otra parte, la potenciación de la actividad
excretora de los aminoácidos puede mejorar la productividad de la
cepa productora del L-aminoácido. Se da a conocer la
cepa productora de Lisina de una bacteria que pertenece al género
Corynebacterium que presente un aumento de la expresión del
gen de la excreción de la L-lisina (gen
lysE) (WO 9723597A2). Además, se dan asimismo a
conocer genes que codifican proteínas de salida apropiadas para la
secreción de la L-cisteína,
L-cistina, N-acetilserina o
derivados de tiazolidina (patente US nº 5.972.663).
En la actualidad, se dan a conocer varios genes
de Escherichia coli que codifican proteínas putativas de
membrana que potencian la producción de
L-aminoácidos. Copias adicionales del gen rhtB hacen
a una bacteria más resistente a la L-homoserina y
potencian la producción de L-homoserina,
L-treonina, L-alanina,
L-valina y L-isoleucina (solicitud
de patente europea EP994190A2). Copias adicionales del gen
rhtC hacen a una bacteria más resistente a la
L-homoserina y a la L-treonina, y
potencian la producción de L-homoserina,
L-treonina y L-leucina (solicitud
de patente europea EP1013765A1). Copias adicionales de los genes
yahN, yeaS, yfiK e yggA potencian la
producción del ácido L-glutámico,
L-lisina, L-treonina,
L-alanina-L-histidina,
L-prolina, L-arginina,
L-valina y L-isoleucina (solicitud
de patente europea EP1016710A2).
Anteriormente, los presentes inventores
obtuvieron, con respecto a la E. coli K-12,
un mutante que presenta una mutación, thrR (a la que en la
presente memoria se la alude como rhtA23) que está
relacionada en la resistencia a altas concentraciones de treonina o
homoserina en un medio mínimo (Astaurova, O.B. et al., Appl.
Biochem. Microbiol., 21,
611-616-1985). La mutación mejoró la
producción de L-treonina (patente US nº 974817),
homoserina y glutamato (Astaurova, O.B. et al,.
\hbox{Appl. Biochem. Microbiol., 27, 556-561,
1991) por las respectivas cepas productoras de E.
coli .}
Además, los presente inventores han revelado que
el gen rhtA existe a 18 min en el cromosoma de E. coli
cerca del operón glnHPQ que codifica los componentes del
sistema de transporte de la glutamina, y que el gen rthA es
idéntico a ybiF ORF entre los genes pexB y
ompX. La unidad que expresa una proteína codificada por el
ORF se ha denominado como rhtA (rht:resistencia al gen de la
homoserina y de la treonina).
Además, los presentes inventores han encontrado
que la amplificación del gen rhtA confería asimismo
resistencia a la homoserina y la treonina. La mutación
rthA23 es una sustitución A por G en posición -1 con respecto
al codón ATG de iniciación (RESUMEN del 17^{th} International
Congress of Biochemistry and Molecular Biology en combinación con
1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and
Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29
agosto, 1997, resumen nº 457). Es sabido que una composición
nucleótida del espaciador entre la secuencia SD y el codón de
iniciación y especialmente las secuencias inmediatamente por encima
del codón de iniciación afectan profundamente a la capacidad
traductora del ARNm. Se encontró un registro de 20 veces en los
niveles de expresión, dependiendo de la naturaleza de los tres
nucleótidos que preceden al codón de inicio (Gold et al.,
Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et
al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Por
tanto, puede sugerirse que la mutación rhtA23 aumenta la expresión
del gen rhtA.
El gen rhtA codifica una proteína que
está formada por 295 residuos aminoácidos y es una proteína
altamente hidrofóbica que contiene 10 segmentos transmembranales
predichos. Una búsqueda PSIBLAST de la secuencia nucleótida de la
cepa K-12 de A. coli perteneciente al género
Escherichia coli (Science, 277, 1453-1474
(1977) reveló por lo menos 10 proteínas homólogas a la RhtA. Entre
ellas, hay proteínas codificadas por los genes ydeD y yedA.
Anteriormente, se mostró que el gen ydeD está implicado en la
salida de los metabolitos de la vía de la cisteína (Dassler et
al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112, 2000; US nº
5.972.663). El gen yedA ha sido conocido como subunidad
transmembranosa putativa, que puede codificar una proteína
funcionalmente desconocida (números 8037 a 8957 en la secuencia del
registro GenBank AE000287 U00096).
El documento WO 01/70955 A da a conocer
proteínas de proliferación de las células de E. coli y el ADN
que codifica a estas proteínas, pudiendo sobreexpresarse dicho ADN
para alcanzar la sobre producción proteica.
El documento
EP-A-1 013 765 da a conocer una
bacteria que pertenece al género Escherichia que posee la
capacidad para la producción de un aminoácido, y en la que el gen
rhtC codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que
una bacteria que tenga la proteína resistente a la
L-treonina, se potencie.
Aleshin V.V. et al.: "A new family of
amino-acid-efflux proteins" TIBS
Trend in Biochemical Sciences, Elsevier Publication, Cambridge, EN,
vol 24, nº 4, 1 abril 1999
(1999-04-01), páginas
133-135, XP004214249 ISSN;
0968-0004 da a conocer la identificación de una
nueva familia de proteínas de salida de aminoácidos que pueden
utilizarse para la producción de aminoácidos.
Un objetivo de la presente invención consiste en
potenciar la producción de cepas que produzcan
L-aminoácidos y proporcionar un procedimiento para
la producción de L-aminoácidos, por ejemplo,
L-fenilalanina y L-treonina
utilizando estas cepas.
El objetivo se alcanzó identificando que el gen
yedA que codifica una proteína de membrana, homólogo al RhtA,
que no está implicado en la vía biosintética de un
L-aminoácido diana, confería una resistencia
a microorganismos a varios aminoácidos y análogos de aminoácidos,
cuando el alelo de tipo salvaje del gen se amplificó en un vector
multicopia en el microorganismo. Además, el gen yedA puede
potenciar la producción de aminoácidos cuando sus copias
adicionales se introducen en las células de la cepa productora
respectiva.
La presente invención es como sigue:
(1) Procedimiento para la producción de un
L-aminoácido seleccionado de entre el grupo
constituido por L-treonina y
L-fenilalanina, que comprende cultivar una bacteria
que pertenece al género Escherichia en un medio de cultivo y
recuperar del medio de cultivo el L-aminoácido que
va a producirse y acumularse en el medio, en el que dicha bacteria
se potencia potenciando la actividad de una proteína tal como se
define en los siguientes apartados (A) o (B) en una célula de dicha
bacteria:
(A) una proteína que comprende la secuencia
aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en la lista de
Secuencias;
(B) una proteína que comprende una secuencia
aminoácida que incluye deleción, sustitución, inserción o adición
de uno a cinco aminoácidos en la secuencia aminoácida que se muestra
en SEC ID nº:2 en la lista de Secuencias, y que posee la actividad
de conferir, a una bacteria que pertenece al género
Escherichia, resistencia a un L-aminoácido,
seleccionado de entre el grupo constituido por
L-fenilalanina, L-treonina,
L-homoserina y L-cisteína y/o un
análogo de aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por
p-fluoro-fenilalanina,
5-fluoro-DL-triptófano,
S-(2-aminoetil)cisteína y
4-aza-DL-leucina, en
la que dicha actividad de la proteína según se define en (A) o (B)
se potencia transformando dicha bacteria con un ADN que codifica la
proteína tal como se define en (A) o (B), utilizando un vector
multicopia que contiene dicho ADN, o alterando la secuencia de
regulación de la expresión de dicho ADN en el cromosoma de dicha
bacteria.
(De ahora en adelante, se hará referencia a las
proteínas definidas en los apartados anteriores (A) o (B) como
"proteínas de la presente invención")
(2) Procedimiento según el procedimiento
anterior, en el que el L-aminoácido que va a
producirse es la L-fenilalanina.
(3) Procedimiento según el procedimiento
anterior, en el que el L-aminoácido que va a
producirse es la L-treonina.
(4) Procedimiento para la producción de un éster
alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina,
que comprende
cultivar la bacteria tal como se ha descrito
anteriormente en un medio de cultivo para producir y acumular
L-fenilalanina en el medio, presentando dicha
bacteria productividad de la L-fenilalanina, y
sintetizando el éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
a partir del ácido aspártico o su derivado y la
L-fenilalanina obtenida.
(5) Procedimiento según el procedimiento
anterior, que comprende además
esterificar la L-fenilalanina
para generar un éster alquílico inferior de la
L-fenilalanina,
condensar el éster alquílico inferior de la
L-fenilalanina con el derivado del ácido aspártico,
en el que el derivado es anhídrido
N-acil-L-aspártico,
separar el éster alquílico inferior de la
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
de la mezcla reactiva, e
hidrogenar el éster alquílico inferior de la
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
para generar el éster alquílico inferior de la
\alpha-aspartil-L-fenilalanina.
En la presente invención, un aminoácido es de
configuración L-si no se indica lo contrario.
El procedimiento para la producción de el
L-aminoácido incluye la producción de la
L-fenilalanina utilizando la bacteria que produce
la L-fenilalanina, en la que las actividades de las
proteínas de la presente invención, tal como las que comprenden la
secuencia aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2, se potencian.
Asimismo, el procedimiento para la producción de el
L-aminoácido incluye la producción de
L-treonina utilizando una bacteria que produce la
L-treonina, en la que las actividades de las
proteínas de la presente invención tal como las que comprenden la
secuencia aminoácida que se muestra en la SEC ID nº: 2, se
potencian.
La presente invención se explicará en detalle a
continuación.
La bacteria de la presente invención es una
bacteria productora de un L-aminoácido que pertenece
al género Escherichia, en la que la producción del
L-aminoácido por la bacteria es potenciada
potenciando la actividad de las proteínas de la presente invención
en una célula de la bacteria.
En la presente invención, "bacteria productora
de L-aminoácido" significa una bacteria que
presenta la capacidad para producir y acumular el
L-aminoácido en un medio, cuando la bacteria se
cultiva en éste. La bacteria puede presentar la capacidad para
producir dicho L-aminoácido como una propiedad de
una cepa salvaje de la bacteria, o puede potenciarse o conferirse
mediante la cría (o producción).
Una bacteria de la presente invención es la
bacteria que produce L-aminoácidos que pertenece al
género Escherichia que muestra una potenciación de las
proteínas, que potencia la productividad del
L-aminoácido diana. Concretamente, la bacteria de
la presente invención es una bacteria productora de
L-aminoácidos que pertenece al género
Escherichia que posee actividades potenciadas de las
proteínas de la presente invención. Más concretamente, la bacteria
de la presente invención aloja al ADN que posee el gen yedA
sobreexpresado en el cromosoma o en un plásmido en la bacteria y
que posee capacidad potenciada para producir el
L-aminoácido, por ejemplo,
L-fenilalanina y L-treonina,
utilizando estas cepas.
Las proteínas con actividad potenciada incluyen
las definidas en los siguientes apartados, (A) o (B):
(A) una proteína que comprende la secuencia
aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en la lista de
Secuencias;
(B) una proteína que comprende una secuencia
aminoácida que incluye deleción, sustitución, inserción o adición
de uno a cinco aminoácidos en la secuencia aminoácida que se muestra
en SEC ID nº:2 en la lista de Secuencias, y que posee la actividad
de hacer que una bacteria presente una potenciación de la
resistencia a un aminoácido como fenilalanina, treonina, homoserina
o cisteína y/o análogos de aminoácidos tales como la
p-fluoro-fenilalanina,
5-fluoro-DL-triptófano,
S-(2-aminoetil)cisteína y
4-aza-DL-leucina.
"Resistencia a un L-aminoácido
y/o un análogo de aminoácido" significa la capacidad para la
bacteria de desarrollarse en un medio mínimo que contenga el
L-aminoácido o su análogo a una concentración bajo
la cual la bacteria de tipo salvaje, o la cepa parental de la
bacteria, no puede desarrollarse, o la capacidad para la bacteria
de crecer más deprisa en un medio que contenga
L-aminoácido o un análogo de aminoácido, más deprisa
que el tipo no modificado o el tipo salvaje, o la cepa parental de
la bacteria. Como ejemplos de análogos L-aminoácidos
están la p-fluoro-fenilalanina,
5-fluoro-DL-triptófano,
S-(2-aminoetil) cisteína,
4-aza-DL-leucina o
similares. La concentración mencionada anteriormente de
L-aminoácidos o del análogo de
L-aminoácido está comprendida generalmente entre
1.000 y 10.000 \mug/ml, preferentemente entre 3000 y 5000
\mug/ml en el caso de la L-homoserina,
preferentemente entre 5.000 y 7.000 \mug/ml en el caso de la
serina y cisteína, generalmente entre 0,1 y 1,0 \mug/ml,
preferentemente entre 0,2 y 0,5 \mug/ml en el caso del
5-fluoro-DL-triptófano,
generalmente entre 0,1 y 2,0 mg/ml, preferentemente entre 0,5 y 1,0
mg/ml en el caso de la
p-fluoro-fenilalanina; generalmente
entre 0,1 y 2,0 mg/ml, preferentemente entre 0,5 y 1,0 mg/ml en el
caso de la
4-aza-DL-leucina y
S-(2-aminoetil) cisteína.
En la bacteria utilizada en el procedimiento de
la presente invención, la actividad de las proteínas de la presente
invención es potenciada por la transformación de dicha bacteria con
ADN que codifica la proteína, tal como se define en (A) o (B), o
alterando la secuencia de regulación de la expresión de dicho ADN en
cromosoma de la bacteria.
El ADN, que se utiliza para la modificación de
la bacteria puede codificar una proteína que presenta actividad
excretora del L-aminoácido. Más concretamente, el
ADN está representado por el gen yedA. El gen yedA
puede obtenerse, por ejemplo, mediante PCR, utilizando cebadores
basados en la secuencia nucleótida que se muestra en SEC.ID
nº:1.
El ADN incluye un ADN que codifica la proteína
que incluye deleción, sustitución, inserción o adición de uno a
cinco aminoácidos en una o más posiciones sobre la proteína (A),
siempre que no se pierda la actividad de la proteína. El ADN que
codifica sustancialmente la misma proteína que la proteína definida
en (A) puede obtenerse, por ejemplo, mediante modificación de la
secuencia nucleótida que codifica la proteína definida en (A),
utilizando mutagénesis dirigida, de forma que uno o más residuos de
aminoácidos sea suprimido, sustituido, insertado o añadido. Dicho
ADN modificado puede obtenerse mediante procedimientos
convencionales, utilizando tratamiento con reactivos y condiciones
que generen mutaciones. Dicho tratamiento incluye el tratamiento del
ADN que codifica las proteínas que se utilizan en el procedimiento
de la presente invención, con hidroxilamina o el tratamiento de la
bacteria que alberga el ADN con irradiación UV o un reactivo tal
como
N-mtil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
o ácido nitroso.
El ADN incluye variantes que pueden encontrarse
en las distintas cepas y variantes de las bacterias que pertenecen
al género Escherichia según la diversidad natural. El ADN que
codifica dichas variantes puede obtenerse aislando el ADN, que se
hibridiza con el gen yedA o parte del gen, bajo condiciones
rigurosas, y que codifica la proteína que potencia la producción
del L-aminoácido. El término "condiciones
rigurosas" al que se hace referencia en la presente memoria, se
refiere a una condición bajo la que el denominado híbrido
específico, se forma, y el híbrido no específico, no se forma. Por
ejemplo, las condiciones rigurosas incluyen una condición
bajo la que los ADN que presentan una alta homología, por ejemplo,
ADN que tienen una homología no menor que el 70% entre ellos, se
hibridizan. Alternativamente, las condiciones rigurosas se
ejemplifican por condiciones que comprenden la condición habitual
de lavado en hibridización Southern, por ejemplo, 60ºC, 1 x SSC, SDS
al 0,1%, preferentemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1%. Como sonda para
el ADN que codifica variantes y se hibridiza con el gen y
yedA, puede utilizarse asimismo una secuencia parcial de la
secuencia nucleótida de SEC.ID nº: 1. Dicha sonda puede prepararse
mediante PCR utilizando oligonucleótidos producidos basados en l la
secuencia nucleótida de SEC ID nº: 1 como cebadores, y un fragmento
de ADN que contenga la secuencia nucleótida de SEC ID:nº: 1 como
una matriz. Cuando un fragmento de ADN de una longitud de 300 pares
de bases aproximadamente se utiliza como la sonda, las condiciones
de lavado para la hibridación consisten en, por ejemplo, 50ºC, 2 x
SSC, y SDS al 0,1%.
La transformación de la bacteria con un ADN que
codifica una proteína, significa la introducción del ADN en la
célula bacteriana, por ejemplo, mediante procedimientos
convencionales para aumentar la expresión del gen que codifica la
proteína de la presente invención, y potenciar la actividad de la
proteína en la célula bacteriana.
Los procedimientos para la potenciación de la
expresión del gen incluyen un aumento del número de copias del gen.
La introducción del gen en un vector que puede funcionar en una
bacteria que pertenece al género Escherichia, aumenta el
número de copias del gen. Con dicho propósito, pueden utilizarse
preferentemente vectores multi-copia. El vector
multi-copia se ejemplifica por pBR322, pUC19,
pBluescript KS^{+}, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b o
similares.
Además, la potenciación de la expresión del gen
puede obtenerse introduciendo copias múltiples del gen en el
cromosoma bacteriano mediante por ejemplo, el procedimiento de
recombinación homóloga, o similares.
En el caso de que la expresión de dos o más
genes sea potenciada, los genes pueden ser alojados juntos en el
mismo plásmido o por separado en plásmidos distintos. Asimismo,
puede aceptarse que uno de los genes se aloje en un cromosoma, y el
otro gen se aloje en un plásmido.
Por otra parte, la potenciación de la expresión
del gen puede alcanzarse situando el ADN bajo control de un potente
promotor en vez del promotor original. La fuerza del promotor se
define por la frecuencia de actos de la iniciación de la síntesis
del ARN. Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H.
(Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in
vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5,
2987-2994). Por ejemplo, el promotor P_{L} del
fago lambda es conocido como un promotor constitutivo potente._{
}Otros promotores potentes conocidos son el promotor lac,
promotor trp, promotor trc y similares. La utilización
del promotor potente puede combinarse con la multiplicación de las
copias génicas.
Los procedimientos para la preparación del ADN
cromosómico, hibridización, PCR, preparación del ADN plasmídico,
digestión y unión del ADN, transformación, selección de un
oligonucleótido como cebador y similares, puede ser ordinariamente
procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos
procedimientos se describen en Sambrook, J., Fritsch, E.F., y
Maniatis, T., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) y
similares.
La bacteria que se utiliza en el procedimiento
de la presente invención puede obtenerse introduciendo los ADN
mencionados anteriormente en una bacteria que pertenece al género
Escherichia coli que tiene la capacidad, inherentemente, de
producir L-aminoácidos. Alternativamente, la
bacteria puede obtenerse confiriendo capacidad para producir
L-aminoácidos a la bacteria que pertenece al género
Escherichia coli que ya alberga los ADN.
Una bacteria que pertenece al género
Escherichia no está particularmente limitada, siempre que
tenga una capacidad para producir el L-aminoácido o
pueda conferir la capacidad, Los ejemplos de la bacteria que
pertenece al género Escherichia incluye Escherichia
coli.
Ejemplos de bacterias que producen aminoácidos,
que pertenecen al género Escherichia se describen a
continuación.
Como una cepa parental que va a ser potenciada
en la actividad de la proteína de la presente invención, pueden
utilizarse las cepas de bacterias productoras de fenilalanina que
pertenecen al género Escherichia tales como la cepa AJ12739
(tyra:: Tn10, tyrR) (VKPM B-8197);
cepa HW1089 (Nº de registro de ATCC 55371) que aloja el gen
pheA34) (US nº 5.354.672); cepa mutante
MWEC101-b (KR8903681): cepas NRRL
B-12141, NRRL B- 12145, NRR
B-12146 y NRRL B-12147 (US nº
4.407.952) y análogas. Asimismo, como una cepa parental que va a ser
potenciada en la actividad de la proteína de la presente invención,
pueden utilizarse la bacteria productora de fenilalanina que
pertenece al género Escherichia, la cepa K-12
[W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566) de E.
coli, la cepa K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD (FERM
BP-12659) de E. coli, la cepa
K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm (FERM
BP-12662), de E. coli, y la cepa
K-12 [W3110
(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB], denominada como AH12604
(FERM BP-3579) (patente europea EP488424B1).
Como una cepa parental que va a ser potenciada
en la actividad de la proteína de la presente invención, pueden
utilizarse las cepas de bacterias productoras de treonina que
pertenecen al género Escherichia tales como la cepa MG442
(VKPM B-1628) (Gusyatiner, et al,. Genetika
(en ruso), 14, 947-956, 1978, US nº 4.278.765);
VKPM B-3996 (US nº
6.165.756); VKPM B-5318 (US nº 6.132.999);
BP-3756 y BP-4072 (US nº
5.414.918); FERM BP-3519 y FERM
BP-3520 (US nº 5.376.538) y similares.
El procedimiento de la presente invención
incluye el procedimiento para la producción de
L-fenilalanina, que comprende las etapas de
cultivar la bacteria de la presente invención en un medio de
cultivo, para dejar que la L-fenilalanina pueda
producirse y acumularse en el medio de cultivo, y recuperar la
L-fenilalanina a partir del medio de cultivo.
Asimismo, el procedimiento de la presente invención incluye el
procedimiento para la producción de L-treonina, que
comprende las etapas de cultivar la bacteria de la presente
invención en un medio de cultivo, para dejar que la
L-treonina pueda producirse y acumularse en el medio
de cultivo, y recuperar la L-treonina partir del
medio de cultivo.
En la presente invención, el cultivo,
recuperación y purificación del L-aminoácido a
partir del medio y similares, puede llevarse a cabo de una forma
similar al procedimiento convencional de fermentación, en el que un
amino es producido utilizando un microorganismo. Un medio que se
utilice para el cultivo puede ser un medio sintético o un medio
natural, siempre que el medio incluya una fuente de carbono y una
fuente de nitrógeno y minerales y, si es necesario, cantidades
apropiadas de nutrientes que el microorganismo necesita para crecer.
La fuente de carbono puede incluir varios hidratos de carbono tales
como glucosa y sacarosa, y varios ácidos orgánicos. Dependiendo del
modo de asimilación del microorganismo que se utilice, puede
emplearse alcohol, incluyendo etanol y glicerol. Como fuente de
nitrógeno, se utilizan varias sales amónicas tales como el sulfato
amónico y el amoníaco, otros compuestos de ninitrógeno tales como
aminas, una fuente natural de nitrógeno como la peptona,
hidrolizado de soja y microorganismos fermentativos digeridos. Como
minerales se utilizan monofosfato de potasio, sulfato de magnesio,
cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro
cálcico, y similares. Puede añadirse algún nutriente adicional al
medio, si es necesario. Por ejemplo, si el microorganismo requiere
tirosina para el desarrollo (auxotrofía de tirosina), puede añadirse
la cantidad suficiente de tirosina al medio para
cultivo.
cultivo.
El cultivo se lleva a cabo preferentemente bajo
condiciones aeróbicas tales como un cultivo con agitación, agitando
(dicho) cultivo con aireación, a una temperatura entre 20 y 40ºC,
preferentemente de entre 30 y 38ºC. El pH del cultivo está
habitualmente entre 5 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,2. El pH
del cultivo puede ajustarse con amoníaco, carbonato cálcico, varios
ácidos, varias bases, y tampones. Habitualmente, un cultivo de 1 a
5 días conduce a la acumulación del L-aminoácido
diana en el medio líquido.
Después del cultivo, los sólidos tales como
células pueden eliminarse del medio líquido mediante centrifugación
o filtración por membrana, y entonces, el
L-aminoácido diana puede recuperarse y purificarse
mediante un procedimiento convencional tal como el intercambio
iónico, o los procedimientos de concentración y cristaliza-
ción.
ción.
La fenilalanina producida mediante el
procedimiento de la presente invención puede utilizarse para, por
ejemplo, producir el éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
(al que se alude asimismo como "aspartano") Es decir, el
procedimiento de la presente invención incluye el procedimiento para
la producción del éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilanalina,
utilizando la L-fenilalanina como material en
bruto. El procedimiento comprende sintetizar el éster alquílico
inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
a partir de la L-fenilalanina producida por el
procedimiento de la presente invención tal como se ha descrito
anteriormente, y el ácido aspártico o su derivado. Pueden hacerse
referencia al éster alquílico inferior, al éster metílico, al éster
etílico y al éster propílico, o
similares.
similares.
En el procedimiento de la presente invención, un
procedimiento para sintetizar el éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
a partir de la L-fenilalanina y del ácido aspártico
o su derivado, no está particularmente limitado y puede aplicarse
cualquier procedimiento convencional, con tal de que la
L-fenilalanina o su derivado pueda utilizarse para
la síntesis del éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina.
Concretamente, por ejemplo, el éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
puede producirse mediante el procedimiento siguiente (patente US nº
3.786.039). La L-fenilalanina es esterificada para
obtener el éster alquílico inferior de la
L-fenilalanina. El éster alquílico de la
L-fenilalanina se hace reaccionar con el derivado
del ácido L-aspártico del cual el grupo amino y el
grupo \beta-carboxilo están protegidos,
esterificándose el grupo \alpha-carboxilo para
activar. El derivado incluye el anhídrido
N-acil-L-aspártico
tal como el anhídrido N-formil-,
N-carbobenzoxi-, o
N-p-metoxicarbobenzoxi-L-aspártico.
Mediante la reacción de condensación, se obtiene la mezcla de
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
y
N-acil-\beta-L-aspartil-L-fenilalanina.
Si la reacción de condensación se lleva a cabo bajo la existencia
de un ácido orgánico cuya constante de disociación ácida a 37ºC es
de 10^{-4} o menos, la proporción de la forma \alpha a la
\beta en la mezcla aumenta (publicación abierta al público de la
patente japonesa nº 51-113841). Entonces, la
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
es separada de la mezcla, seguido por la hidrogenación para
obtener la
\alpha-L-aspartil-L-
fenilalanina.
fenilalanina.
La presente invención se explicará con mayor
detalle a continuación haciendo referencia a los Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia nucleótida completa de la cepa
K-12 de E. coli se ha determinado ya
(Science, 277, 1453-1474, 1977). Una búsqueda
PSI-BLAST reveló que por lo menos 10 rhtA
parálogos que incluían el gen yedA, se encuentran en el
genoma de E. coli K-12. El gen yedA
codifica la subunidad transmembranosa putativa, cuya FU función es
desconocida.
Basándose en la secuencia nucleótida de la que
se ha informado, se sintetizaron los cebadores que se muestran en
SEC ID nº 3 (cebador 1) y nº4 (cebador 2). El cebador 1 es una
secuencia complementaria a una secuencia de 179 a 153 nucleótidos
por encima del codón de iniciación con un sitio de reconocimiento de
la enzima de restricción BamHI introducido en su extremo 5'.
El cebador 2 es una secuencia complementaria a una secuencia de 53
a 77 nucleótidos por debajo del codón de finalización con un sitio
de reconocimiento de la enzima de restricción SalI
introducido en su extremo 5'.
El ADN cromosómico de la cepa TG1 de E.
coli se preparó mediante un procedimiento ordinario. Se llevó a
cabo la PCR en un "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400", bajo
las condiciones siguientes: 40 seg a 95ºC, 40 seg a 47ºC, 40 seg a
72ºC, 30 ciclos mediante la Taq polimerasa (Fermentas). El fragmento
PCR obtenido que contenía el gen yedA con su propio promotor
se trató con las restrictasas BamHI y Sa1I y se
insertó en los vectores multicopia pUC19 o pAYCTER3 tratados
previamente con las mismas enzimas. De este modo, se obtuvieron,
respectivamente, los plásmidos pYEDA1 y pYEDA2. El vector pAYCTER3
es un derivado de pAYC32, un vector muy estable y con un número
moderado de copias construido sobre la base de plásmido RSF1010
(Christoserdov A. YY., Tsygankov Y. D, Broad-host
range vectors derived from a RSF1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v.
16, págs 161-167). El vector pAYCTER3 se obtuvo
mediante introducción del poliengarce del plásmido pUC19 y del
finalizador potente rrnB en el plásmido pAYC32 en vez de su
promotor, de la forma siguiente. En primer lugar, el poliengarce del
plásmido pUC19 se obtuvo mediante PCR, utilizando los cebadores que
se muestran en SEC ID nº 5 y nº 6. El producto PCR obtenido se
trató con las restrictasas EcoRI y BclI. El terminador
rruB se obtuvo asimismo por PCR utilizando los cebadores
representados en SEC ID nº 7 y nº 8. El producto PCR obtenido se
trató con las restrictasas BglII y BclI. Entonces,
estos dos fragmentos de ADN se unieron en el plásmido pAYC32 tratado
previamente con las restrictasas EcoRI y Bc1I. De
este modo se obtuvo el plásmido pAYCTER3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los plásmidos pYEDA1 y pYEDA2 y los vectores
pUC19 y pAYCTER3 se introdujeron en la cepa TG1 de E. coli.
Así, se obtuvieron las cepas TG1 (pYEDA1), TG1 (pYEDA2), TG1
(pUC19) y TG1 (pAYCTER3).
Entonces, la capacidad de estas cepas para
crecer en presencia de aminoácidos y de análogos de aminoácidos
para cada cepa, se determinó en placas mínimas M9 de agar glucosa
que contenían concentraciones graduadas del inhibidor. Las placas
se rociaron con 10^{6} a 10^{7} células de un cultivo nocturno
desarrollado en un medio mínimo (suplementado con 100 \mug/ml de
ampicilina para las cepas plasmídicas). El crecimiento se estimó
después de 44 horas de incubación a 37ºC. Los resultados se muestran
en la Tabla 1.
| * Los mismos resultados se obtuvieron para la cepa TG1 que aloja el vector pAYCTER3. | ||
| +: crecimiento bueno; | -: no hay crecimiento; | n.d.: no determinado |
La cepa AJ12739 de E. coli que produce
fenilalanina se utilizó como una cepa parental para la
transformación con plásmidos que albergaban el gen yedA. La
cepa AJ12739 se ha depositado en el Russian National Collection of
Industrial Microorganisms (VKPM) (Rusia, 113545 Moscow,
1^{st} Dorozhny proezd, 1) en el 6 de noviembre, 2001, con el
número de registro VKPM B-8197.
La cepa AJ12739 productora de fenilalanina se
transformó con el plásmido pYEDA2 o con el vector pAYCTER3, para
obtener las cepas AJ12739/pYEDA2 y AJ12739/pAYCTER3. Estas cepas se
cultivaron cada una a 37ºC durante 18 horas en un caldo (de
cultivo) nutritivo con 100 mg/l de ampicilina, y 0,3 ml del cultivo
obtenido se inocularon en 3 ml de un medio de fermentación que
contenía 100 mg/ml de ampicilina, en un tubo de ensayo de 20 x 200
mm, cultivándose a 37º durante 48 horas con un agitador rotatorio.
Después del cultivo, se determinó mediante TLC una cantidad
acumulada de fenilalanina en el medio. Se utilizaron placas TLC de
10 x 15 cm revestidas con capas de 0,11 mm de gel silíceo Sorbfil
sin indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar,
Rusia). Las placas Sorbfil se desarrollaron con una fase móvil:
propan-2-ol: etilacetato: 25% de
amoníaco acuoso: agua=40:40:7: 16 (vol/vol). Una solución (2%) de
ninhidrina en acetona se utilizó como un reactivo de visualización.
Los resultados se presentan en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Glucosa | 40,0 | |
| (NH_{4)}2SO_{4} | 16,0 | |
| K_{2}HPO_{4} | 1,0 | |
| MgSO_{4 }. 7H_{2}O | 1,0 | |
| FeSO_{4} . 7H_{2}O | 0,01 | |
| MnSO_{4} .5H_{2}O | 0,01 | |
| Tiamina-HCl | 0,0002 | |
| Extracto de levadura | 2,0 | |
| Tirosina | 0,1 | |
| CaCo_{3} | 30,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
El sulfato de magnesio y la glucosa se
esterilizan por separado. El CaCO_{3} caliente y seco se
esterilizan a 180º durante 2 horas. El pH se ajusta a 7,0. El
antibiótico se introduce en el medio después de esterilización.
| Cepa de E. coli | OD_{600} | Fenilalanina, g/l |
| AJ12739 (pAYCTER3) | 7,0 | 1,5 |
| AJ12739 (pAYCTER-YEDA2) | 7,5 | 1,8 |
A partir de la tabla 2 puede apreciarse que la
amplificación del gen yedA mejoró la productividad de la
fenilalamina de la cepa AJ12739.
La conocida cepa de E. coli que produce
treonina, VNIIGnetika MG442 (Gusyatiner, et al,. 1978,
Genetika (en ruso), 14, pág 947-956) (depositada en
el Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)
según el Tratado de Budapest, con el nº de registro VKPM
B-1628), se transformó con el plásmido pYEDA1 o con
el vector pUC19, dando lugar a las cepas MG442/pYEDA1 y
G442/pUC19.
Estas cepas se cultivaron cada una a 37ºC
durante 18 horas en un caldo (de cultivo) nutritivo con 100 mg/l de
ampicilina, y 0,3 ml del cultivo obtenido se inocularon en 3 ml de
un medio de fermentación que contenía 100 mg/ml de ampicilina, en
un tubo de ensayo de 20 x 200 mm, cultivándose a 37º
durante 48 horas con un agitador rotatorio. Después del cultivo, se
determinó mediante TLC una cantidad acumulada de treonina en el
medio. Las placas Sorbfil se desarrollaron en una fase móvil:
propan-2-ol: acetona:agua:amoníaco
acuoso al 25%=25:25:7:6 (vol/vol). Se utilizó una solución (2%) de
ninhidrina en acetona como un reactivo de visualización. Los
resultados se presentan en la Tabla 3.
La composición del medio de fermentación
(g/l):
| Glucosa | 50,0 | |
| (NH_{4})2SO_{4} | 10,0 | |
| K_{2}HPO_{4} | 1,0 | |
| MgSO_{4} . 7H_{2}O | 0,4 | |
| FeSO_{4} . 7H_{2}O | 0,02 | |
| MnSO_{4} . 5H_{2}O | 0,02 | |
| Tiamina-HCl | 0,0002 | |
| Extracto de levadura | 1,0 | |
| CaCo_{3} | 20,0 |
El sulfato de magnesio y la glucosa se
esterilizan por separado. El CaCO_{3} caliente y seco se
esterilizan a 180º durante 2 horas. El pH se ajusta a 7,0. El
antibiótico se introduce en el medio después de esterilización.
| Cepa de E. coli | Treonina, g/l | Rendimiento (%) |
| MG441 (pUC19) | 2,9 | 5,8 |
| MG442 (pYEDA1) | 4,0 | 8,0 |
A partir de la tabla 2 puede apreciarse que la
amplificación del gen yedA mejoró la productividad de la
treonina de la cepa MG442.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento para la producción de L-aminoácidos
utilizando una bacteria que pertenece al género Escherichia
que presenta un aumento en la productividad de los aminoácidos, por
ejemplo, L-fenilalanina y
L-treonina.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción de
L-aminoácidos utilizando Escherichia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-63468
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-11-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RU 2001131570
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-11-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 921
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggatccc tctcattttt attgt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcgtcgac cgagcgtctg gaa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccatagat ctgaattcga gctcggtac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggccagat ctaagcttgc atgcctgca
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacagtgatc atttgcctgg cggcagtagc gcgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataaaaagct tagatctcaa aaagagtttg tagaaacgca a
\hfill41
Claims (5)
1. Procedimiento para la producción de un
L-aminoácido seleccionado de entre el grupo
constituido por L-treonina y
L-fenilalanina, que comprende cultivar una bacteria
que pertenece al género Escherichia en un medio de cultivo y
recuperar del medio de cultivo el L-aminoácido que
va a producirse y acumularse en el medio, en el que dicha bacteria
se potencia potenciando la actividad de una proteína tal como se
define en (A) o (B) siguientes en una célula de dicha bacteria:
(A) una proteína que comprende la secuencia
aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en el listado de
secuencias;
(B) una proteína que comprende una secuencia
aminoácida que incluye deleción, sustitución, inserción o adición
de uno a cinco aminoácidos en la secuencia aminoácida que se muestra
en SEC ID nº: 2 en el listado de Secuencias, y que presenta una
actividad de conferir, a una bacteria que pertenece al género
Escherichia, resistencia a un L-aminoácido,
seleccionado de entre el grupo constituido por
L-fenilalanina, L-treonina,
L-homoserina y L-cisteína y/o un
análogo de aminoácido seleccionado de entre el grupo constituido por
p-fluoro-fenilalanina,
5-fluoro-DL-triptófano,
S-(2-aminoetil)cisteína y
4-aza-DL-leucina,
en el que dicha actividad de la proteína tal
como se define en (A) o (B) se potencia transformando dicha bacteria
con un ADN que codifica la proteína tal como se define en (A) o
(B), utilizando un vector multicopia que contiene dicho ADN, o
alterando la secuencia de regulación de la expresión de dicho ADN en
el cromosoma de dicha bacteria.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el L-aminoácido que va a producirse es la
L-fenilalanina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el L-aminoácido que va a producirse es la
L-treonina.
4. Procedimiento para la producción de un
éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina,
que comprende
cultivar una bacteria en un medio de cultivo
para producir y acumular L-fenilalanina en el medio,
presentando dicha bacteria productividad de la
L-fenilalanina, y
sintetizar el éster alquílico inferior de la
\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
a partir del ácido aspártico o su derivado y la
L-fenilalanina obtenida,
en el que dicha bacteria es potenciada
potenciando la actividad de una proteína, tal como se define en (A)
o (B) siguientes en una célula de dicha bacteria:
(A) una proteína que comprende la secuencia
aminoácida que se muestra en SEC ID nº: 2 en el listado de
secuencias;
(B) una proteína que comprende una secuencia
aminoácida que incluye deleción, sustitución, inserción o adición
de uno a cinco aminoácidos en la secuencia aminoácida que se muestra
en SEC ID nº: 2 en el listado de Secuencias, y que presenta una
actividad de conferir, a una bacteria que pertenece al género
Escherichia, resistencia a un L-aminoácido,
seleccionado de entre el grupo constituido por
L-fenilalanina, L-treonina,
L-homoserina y
L-cisteína y/o un análogo de aminoácido seleccionado
de entre el grupo constituido por
p-fluoro-fenilalanina,
5-fluoro-DL-triptófano,
S-(2-aminoetil)cisteína y
4-aza-DL-leucina,
en la que dicha actividad de la proteína tal
como se define en (A) o (B) se potencia transformando dicha bacteria
con un ADN que codifica la proteína tal como se define en (A) o
(B), utilizando un vector multicopia que contiene dicho ADN, o
alterando la secuencia de regulación de la expresión de dicho ADN en
el cromosoma de dicha bacteria.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
que comprende además esterificar la L-fenilalanina
para generar un éster alquílico inferior de la
L-fenilalanina,
condensar el éster alquílico inferior de la
L-fenilalanina con el derivado del ácido aspártico,
en el que el derivado es el anhídrido
N-acil-L-aspártico,
separar el éster alquílico inferior de la
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
de la mezcla reactiva, e
hidrogenar el éster alquílico inferior de la
N-acil-\alpha-L-aspartil-L-fenilalanina
para generar el éster alquílico inferior de la
\alpha-aspartil-L-fenilalanina.
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