PL207851B1 - Sposób wytwarzania L-aminokwasu i sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny - Google Patents

Sposób wytwarzania L-aminokwasu i sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny

Info

Publication number
PL207851B1
PL207851B1 PL369776A PL36977602A PL207851B1 PL 207851 B1 PL207851 B1 PL 207851B1 PL 369776 A PL369776 A PL 369776A PL 36977602 A PL36977602 A PL 36977602A PL 207851 B1 PL207851 B1 PL 207851B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
amino acid
phenylalanine
promoter
dna
bacterium
Prior art date
Application number
PL369776A
Other languages
English (en)
Other versions
PL369776A1 (pl
Inventor
Vitaliy Arkadyevich Livshits
Maria Viacheslavovna Vitushkina
Mikhail Markovich Gusyatiner
Mikhail Kharisovich Ziyatdinov
Valery Zavenovich Akhverdian
Ekaterina Alekseevna Savrasova
Vera Georgievna Doroshenko
Sergey Vladimirovich Mashko
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc, Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of PL369776A1 publication Critical patent/PL369776A1/pl
Publication of PL207851B1 publication Critical patent/PL207851B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
    • C07K5/0613—Aspartame
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy biotechnologii a przedmiotem wynalazku są sposób wytwarzania L-aminokwasu i sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Konwencjonalnie L-aminokwasy wytwarzano przemysłowo metodą fermentacji, wykorzystując szczepy mikroorganizmów otrzymywane z naturalnych źródeł lub mutantów tych samych szczepów, zwłaszcza zmodyfikowanych w celu podniesienia wydajności wytwarzania L-aminokwasów.
Ujawniono wiele technik podniesienia wydajności wytwarzania L-aminokwasów, na przykład, przez transformację mikroorganizmu rekombinowanym DNA (przykładowo US 4,278,765). Techniki te opierają się na podwyższaniu aktywności enzymów biorących udział w biosyntezie aminokwasów i/lub pozbawianiu wrażliwości enzymów docelowych na hamowanie przez sprzężenie zwrotne powodowane przez wytwarzany L-aminokwas (JP 56-18596 (1981), WO 95/16042 lub US 61 012 i US 40 160).
Z drugiej strony, zwiększenie wydzielania aminokwasu może poprawiać produktywność szczepu wytwarzającego L-aminokwas. Ujawniono wytwarzający lizynę szczep bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium wykazujący podwyższoną ekspresję genu wydzielania L-lizyny (gen lysE) (WO 97 23597A2). Ponadto, ujawniono geny kodujące białka wspomagające sekrecję L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny lub pochodnych tiazolidynowych (US 5 972 663).
Obecnie, ujawniono kilka genów Escherichia coli kodujących domniemane białka błonowe wzmacniające wytwarzanie L-aminokwasów. Dodatkowe kopie genu rhtB czynią bakterię bardziej oporną na L-homoserynę i zwiększają wytwarzanie L-homoseryny, L-treoniny, L-alaniny, L-waliny i L-izoleucyny (EP 994190A2). Dodatkowe kopie genu rhtC czynią bakterię bardziej oporną na L-homoserynę i L-treoninę i zwiększają wytwarzanie L-homoseryny, L-treoniny i L-leucyny (EP 1013765A1). Dodatkowe kopie genów yahN, yeaS, yfiK i yggA zwiększają wytwarzanie kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-treoniny, L-alaniny, L-histydyny, L-proliny, L-argininy, L-waliny oraz L-izoleucyny (EP 1016710A2).
Twórcy wynalazku otrzymali wcześniej mutanta E.coli K-12, posiadającego mutację thrR (określanego jako rhtA23), która nadaje oporność na wysokie stężenia treoniny lub homoseryny w podłożu minimalnym (Astaurova, O.B. i in., Appl. Bioch. and Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Mutacja powodowała poprawę wytwarzania L-treoniny (SU 974817), homoseryny i glutaminianu (Astaurova, O.B. i in., Appl. Bioch, and Microbiol., 27, 556-561, 1991) przez poszczególne szczepy E.coli.
Ponadto, twórcy wynalazku ujawnili, że gen rhtA znajduje się na 18 minucie chromosomu E.coli, w pobliżu operonu glnHPQ, który koduje składowe układu transportowego glutaminy oraz, że gen rhtA jest identyczny z otwartą ramką odczytu yhiF pomiędzy genami pexB i ompX. Jednostkę odpowiedzialną za ekspresję białka kodowanego przez otwartą ramkę odczytu oznaczono jako gen rhtA (rht: oporność na homoserynę i treoninę).
Poza tym, twórcy wynalazku stwierdzili, że amplifikacja genu rhtA również nadaje oporność na homoserynę i treoninę. Mutacja rhtA23 jest podstawieniem A w miejsce G w pozycji -1 w odniesieniu do kodonu start ATG (skróty 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology w połączeniu z Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology 1997, San Francisco, Kalifornia 24-29 sierpnia 1997, skrót nr 457). Wiadomo, że układ nukleotydów w regionie pomiędzy sekwencją SD i kodonem start, a szczególnie sekwencja znajdująca się bezpośrednio przed kodonem start istotnie wpływa na zdolność translacji mRNA. Stwierdzono 20 zakresów poziomu ekspresji, w zależności od charakteru trzech nukleotydów poprzedzających kodon start (Gold i in., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui i in., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Dlatego też można spodziewać się, że mutacja rhtA23 spowoduje zwiększenie ekspresji genu rhtA.
Gen rhtA koduje białko, które składa się z 295 reszt aminokwasowych i jest wysoce hydrofobowym białkiem, zawierającym 10 domniemanych elementów transbłonowych. Przeszukiwanie PSI-BLAST sekwencji nukleotydowej szczepu K-12 E.coli, należącego do rodzaju Escherichia (Science, 277, 1453-1474 (1997)) ujawniło co najmniej 10 białek homologicznych do RhtA. Wśród nich znajdowały się białka kodowane przez geny ydeD i yedA. Wcześniej wykazano, że gen ydeD bierze udział w wypływie metabolitów szlaku cysteiny (Dassler i in., Mol. Microbiol., 36, 11011112, 2000; US 5 972 663). Gen yedA jest znany jako domniemana jednostka transbłonowa, która może kodować funkcjonalnie nieznane białko (numery 8037 do 8957 w sekwencji z GenBank o numerze dostępu AE000287 U00096).
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-aminokwasu wybranego z grupy składającej się z L-treoniny i L-fenyloalaniny obejmujący etapy, w których w podłożu hodowlanym hoduje się
PL 207 851 B1 bakterię należącą do rodzaju Escherichia i z podłoża hodowlanego wyodrębnia się wytworzony i nagromadzony w tym podłożu L-aminokwas, charakteryzujący się tym, że bakteria ma zwiększoną ekspresję białka określonego w (A) lub (B) w komórce bakterii:
(A) białka o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białka o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do pięciu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, i które wykazuje aktywność, nadającą bakterii należącej do rodzaju Escherichia oporność na L-aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-fenyloalaniny, L-treoniny, L-homoseryny i L-cysteiny i/lub analog aminokwasowy wybrany z grupy składającej się z p-fluoro-fenyloalaniny, 5-fluoroDL-tryptofanu, S-(2-amino-etylo)cysteiny i 4-aza-DL-leucyny, przy czym ekspresja białka zdefiniowanego w (A) lub (B), jest zwiększona poprzez stransformowanie bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) z zastosowaniem wysokokopijnego wektora niosącego wskazane DNA, poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA do chromosomu bakterii lub poprzez umieszczenie DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora lub trc promotora w zamian za natywny promotor bakterii.
Wytwarzanym L-aminokwasem jest L-fenyloalanina lub L-treonina.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, obejmujący etapy, w których hoduje się bakterię w podłożu hodowlanym do wytworzenia i nagromadzenia w tym podłożu L-fenyloalaniny, przy czym bakteria ta wykazuje zdolność wytwarzania L-fenyloalaniny i syntezuje się niższy ester alkilowy α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z kwasem asparaginowym lub jego pochodnej i otrzymanej L-fenyloalaniny, charakteryzujący się tym, że bakteria ma zwiększoną ekspresję białka komórkowego określonego w (A) lub (B) w komórce bakterii:
(A) białka o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białka o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do pięciu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji i które wykazuje aktywność nadającą bakterii należącej do rodzaju Escherichia oporność na L-aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-fenyloalaniny, L-treoniny, L-homoseryny i L-cysteiny i/lub analog aminokwasowy wybrany z grupy składającej się z p-fluoro-fenyloalaniny, 5-fluoro-DL-tryptofanu, S-(2-aminoetylo)cysteiny i 4-aza-DL-leucyny, przy czym ekspresja białka, zdefiniowanego w (A) lub (B), jest zwiększona poprzez stransformowanie bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) z zastosowaniem wysokokopijnego wektora niosącego wskazane DNA, poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA do chromosomu bakterii lub poprzez umieszczenie DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora lub trc promotora w zamian za natywny promotor bakterii.
Sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etapy, w których kolejno estryfikuje się L-fenyloalaninę do utworzenia niższego estru alkilowego L-fenyloalaniny, kondensuje się niższy ester alkilowy L-fenyloalaniny z pochodną kwasu asparaginowego, przy czym pochodną jest bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, oddziela się niższy ester alkilowy N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z mieszaniny reakcyjnej, i przeprowadza się uwodornianie niższego estru alkilowego N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny do uzyskania niższego estru alkilowego a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Celem wynalazku jest zwiększenie produktywności szczepów wytwarzających L-aminokwas oraz opracowanie sposobu wytwarzania L-aminokwasu, na przykład, L-fenyloalaniny i L-treoniny z wykorzystaniem tych szczepów.
Kiedy allel genu typu dzikiego zamplifikowano na wektorze wysokokopijnym w mikroorganizmie stwierdzono, że gen yedA kodujący białko błonowe, homolog RhtA, które nie jest zaangażowane w szlak biosyntetyczny docelowego L-aminokwasu i nadaje mikroorganizmowi oporność na kilka aminokwasów i analogów aminokwasowych. Poza tym, gen yedA może zwiększać wytwarzanie aminokwasu, kiedy jego dodatkowe kopie wprowadzi się do komórek każdego szczepu.
W wynalazku aminokwas jest w konfiguracji L-, o ile nie stwierdzono inaczej.
Sposób wytwarzania L-aminokwasu obejmuje wytwarzanie L-fenyloalaniny z wykorzystaniem bakterii wytwarzającej L-fenyloalaninę, w której wzmocnione są aktywności białek według wynalazku, takich jak te zawierające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 2. Ponadto, sposób wytwarzania L-aminokwasu obejmuje wytwarzanie L-treoniny z wykorzystaniem bakterii wytwarzającej
PL 207 851 B1
L-treoninę, w której wzmocnione są aktywności białek według wynalazku, takich jak te zawierające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 2.
Wynalazek wyjaśniono poniżej w szczegółach.
Bakteria stosowana w sposobie według wynalazku to wytwarzająca L-aminokwas bakteria należąca do rodzaju Escherichia, przy czym wytwarzanie L-aminokwasu przez bakterię jest zwiększone przez zwiększenie aktywności białka w komórce bakterii.
Bakteria wytwarzająca L-aminokwas oznacza bakterię, która posiada zdolność do wytwarzania i akumulacji L-aminokwasu w podłożu, kiedy bakterię hoduje się w podłożu. Bakteria może posiadać zdolność wytwarzania L-aminokwasu jako właściwość szczepu dzikiego bakterii lub może ją uzyskać, bądź może być ona wzmocniona w wyniku hodowli.
Bakterią jest przykładowo bakteria wytwarzająca L-aminokwas, należąca do rodzaju Escherichia, która wykazuje zwiększoną aktywność białek, które zwiększają wydajność wytwarzania docelowego L-aminokwasu. Konkretnie, bakterią jest wytwarzająca L-aminokwas bakteria należąca do rodzaju Escherichia, która wykazuje zwiększoną aktywność białek. Konkretnie, bakteria ta posiada na chromosomie lub na plazmidzie DNA z genem yedA ulegającym nadekspresji i wykazuje wzmocnioną zdolność do wytwarzania przez te szczepy L-aminokwasu, na przykład, L-fenyloalaniny i L-treoniny.
Białko według wynalazku obejmuje te zdefiniowane w poniższych punktach, (A) lub (B):
(A) białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji;
(B) białko, o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego lub kilku aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji i, które nadaje bakterii wzmocnioną oporność na L-aminokwas, taki jak fenyloalanina, treonina, homoseryna lub cysteina i/lub analog aminokwasowy, taki jak p-fluorofenyloalanina, 5-fluoro-DL-tryptofan, S-(2-aminoetylo)cysteina lub 4-aza-DL-leucyna.
Liczba kilka aminokwasów zależy od pozycji lub rodzaju reszty aminokwasowej w trzeciorzędowej strukturze białka.
Może ona wynosić od 2 do 30, korzystnie od 2 do 15, a najkorzystniej od 2 do 5 dla białka (A).
Oporność na L-aminokwas i/lub analog aminokwasowy oznacza zdolność bakterii do wzrostu w podł o ż u minimalnym zawierają cym L-aminokwas lub jego analog aminokwasowy w stężeniu, w którym bakteria niezmodyfikowana lub typu dzikiego, b ą d ź szczep macierzysty bakterii nie moż e rosnąć, lub oznacza zdolność bakterii do szybszego wzrostu w podłożu zawierającym L-aminokwas bądź analog aminokwasowy niż bakteria niezmodyfikowana lub typu dzikiego bądź szczep macierzysty bakterii. Przykładami analogów L-aminokwasów są p-fluorofenyloalanina, 5-fluoro-DL-tryptofan,
S-(2-aminoetylo)cysteina, 4-aza-DL-leucyna lub podobne. Stężenie L-aminokwasu lub analogu aminokwasowego wynosi od 1000 do 10000 μg/ml, korzystnie od 3000 do 5000 μg/ml w przypadku L-homoseryny, korzystnie od 5000 do 7000 μg/ml w przypadku seryny i cysteiny od 0,1 do 1,0 μg/ml, korzystnie od 0,2 do 0,5 μg/ml w przypadku 5-fluoro-DL-tryptofanu od 0,1 do 2,0 mg/ml, korzystnie od 0,5 do 1,0 mg/ml w przypadku p-fluorofenyloalaniny od 0,1 do 2,0 mg/ml, korzystnie od 0,5 do 1,0 mg/ml w przypadku 4-aza-DL-leucyny i S-(2-aminoetylo)cysteiny.
Bakteria według wynalazku obejmuje również bakterię, w której przypadku aktywność białka wzmacnia się przez transformację bakterii DNA kodującym białko, jak zdefiniowano w (A) lub (B), bądź przez zmianę sekwencji regulatorowej DNA w chromosomie bakterii.
DNA, który stosuje się do modyfikacji bakterii może kodować białko wykazujące aktywność wydzielania L-aminokwasu. Konkretnie, DNA stanowi gen yedA. Gen yedA można otrzymać, na przykład, metodą PCR z zastosowaniem starterów opartych na sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.
DNA według wynalazku obejmuje DNA kodujący białko, które zawiera delecję, substytucję, insercję lub addycję jednego bądź kilku aminokwasów w jednej lub więcej pozycjach białka (A), dopóki nie utraci ono aktywności białka. Chociaż liczba kilka aminokwasów różni się w zależności od pozycji lub rodzaju reszty aminokwasowej w trzeciorzędowej strukturze białka, może ona wynosić od 2 do 30, korzystnie od 2 do 15, a najkorzystniej od 2 do 5 dla białka (A). DNA kodujący zasadniczo takie samo białko jak białko zdefiniowane w (A) można otrzymać przez, na przykład, modyfikację sekwencji nukleotydowej kodującej białko zdefiniowane w (A) wykorzystując mutagenezę ukierunkowaną tak, że jedna lub więcej reszt aminokwasowych ulegnie delecji, substytucji, insercji lub addycji. Tak zmodyfikowany DNA można otrzymać konwencjonalnymi metodami, traktując mutagennymi odczynnikami i warunkami. Takie traktowanie obejmuje traktowanie DNA kodującego białko hydroksyloaminą lub
PL 207 851 B1 poddania bakterii niosącej DNA działaniu promieniowania UV lub traktowanie odczynnikiem, takim jak
N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna lub kwas azotowy.
DNA według wynalazku obejmuje warianty, które mogą występować w różnych szczepach i odmianach bakterii należących do rodzaju Escherichia, zgodnie z naturalną różnorodnością biologiczną. DNA kodujący takie warianty można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z genem lub częścią genu yedA w ostrych warunkach i, który koduje białko zwiększające wytwarzanie L-aminokwas.
Termin ostre warunki określa w opisie warunki, w których powstaje tak zwany specyficzny produkt hybrydyzacji natomiast nie tworzą się niespecyficzne produkty hybrydyzacji. Na przykład, ostre warunki obejmują warunki, w których hybrydyzują fragmenty DNA o wysokiej homologii, na przykład fragmenty DNA o homologii jeden do drugiego nie mniejszej niż 70%. Alternatywnie, przykładami ostrych warunków są warunki zwykle stosowane przy przemywaniu w hybrydyzacji Southerna, np. 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, korzystnie 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Można również zastosować część sekwencji nukleotydowej sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 jako sondę dla DNA, który koduje warianty i hybrydyzuje z genem yedA. Taką sondę można przygotować metodą PCR, stosując jako startery oligonukleotydy utworzone na podstawie sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1, a jako matrycę fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydową o numerze identyfikacyjnym: 1. Jeśli jako sondę stosuje się fragment DNA o długości około 300 bp, warunki przemywania przy hybrydyzacji obejmują, na przykład, 50°C, 2 X SSC i 0,1% SDS.
Transformacja bakterii DNA kodującym białko oznacza wprowadzenie DNA do komórki bakterii, na przykład konwencjonalnymi metodami, w celu podwyższenia ekspresji genu kodującego białko według wynalazku i wzmocnienia aktywności białka w komórce bakteryjnej.
Sposoby zwiększania ekspresji genu obejmują zwiększenie liczby kopii genu. Wprowadzenie genu do wektora, który jest zdolny do funkcjonowania w bakterii należącej do rodzaju Escherichia zwiększa liczbę kopii genu. W tym celu korzystne jest stosowanie wektorów wysokokopijnych. Przykładami wektorów wysokokopijnych są pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b lub podobne.
Poza tym, zwiększenie ekspresji genu można osiągnąć przez wprowadzenie wielu kopii genu do chromosomu bakteryjnego, na przykład, metodą rekombinacji homologicznej lub podobnymi.
W przypadku zwiększania ekspresji dwóch lub więcej genów, geny mogą znajdować się razem na tym samym plazmidzie lub oddzielnie na różnych plazmidach. Dopuszczalne jest również, aby jeden gen znajdował się na chromosomie, a drugi na plazmidzie.
Z drugiej strony, zwiększenie ekspresji genu można osiągnąć przez umieszczenie DNA według wynalazku pod kontrolą silniejszego promotora zamiast promotora natywnego. Siłę promotora definiuje się przez częstość zdarzeń inicjacji syntezy RNA. Metody oceny siły promotora i przykłady silnych promotorów opisali Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Na przykład, promotor PL faga lambda jest znany jako silny konstytutywny promotor. Innymi znanymi silnymi promotorami są promotor lac, promotor trp, promotor trc i podobne. Stosowanie silnego promotora można łączyć ze zwielokrotnianiem kopii genu.
Metody przygotowywania chromosomalnego DNA, hybrydyzacji, PCR, przygotowywania plazmidowego DNA, trawienia i ligacji DNA, transformacji, wyboru oligonukleotydu jako startera i podobne mogą być zwyczajnymi metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Metody te opisano w Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, wyd. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) i podobnych.
Bakterię według wynalazku można otrzymać przez wprowadzenie DNA do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającej wrodzoną zdolność do wytwarzania L-aminokwasów. Alternatywnie, bakterię można otrzymać przez nadanie zdolności do wytwarzania L-aminokwasu bakterii należącej do rodzaju Escherichia posiadającej już DNA.
Bakteria należąca do rodzaju Escherichia nie jest szczególnie ograniczona tak długo, jak wykazuje zdolność do wytwarzania L-aminokwasu lub można jej nadać tę zdolność. Przykłady bakterii należącej do rodzaju Escherichia obejmują Escherichia coli.
Przykłady bakterii wytwarzających aminokwasy należących do rodzaju Escherichia
Bakterie wytwarzające fenyloalaninę
Jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzające fenyloalaninę szczepy bakterii należącej do rodzaju Escherichia,
PL 207 851 B1 takie jak szczep AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), szczep HW1089 (numer dostępu ATCC 55371) zawierający gen pheA34 (US 5 354 672), szczep mutanta MWEC101-b (KR8903681), szczepy NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 i NRRL B-12147 (US 4 407 952) i podobne. Również jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzającą fenyloalaninę bakterię należącą do rodzaju Escherichia, taką jak szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), szczep K-12 E.coli [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) i szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB] nazwany AJ 12604 (FERM BP-3579) i podobne (EP 488424B1).
Bakterie wytwarzające treoninę
Jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzające treoninę szczepy bakterii należące do rodzaju Escherichia, takie jak szczep MG442 (VKPM B-1628) (Gusyatiner i in., Genetika (Rosja), 14, 947-956, 1978, US 4 278 765); VKPM B-3996 (US 6 165 756); VKPM B-5318 (US 6 132 999); BP-3756 i BP-4072 (US 5 474 918) FERM BP-3519 i FERM BP-3520 (US 5 376 538) i podobne.
Sposób według wynalazku obejmuje sposób wytwarzania L-aminokwasu, obejmujący etapy hodowania bakterii w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-aminokwasu w podło żu hodowlanym oraz zbierania L-aminokwasu z podłoża hodowlanego.
Sposób według wynalazku obejmuje również sposób wytwarzania L-fenyloalaniny, obejmujący etapy hodowania bakterii w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-fenyloalaniny w podłożu hodowlanym oraz zbierania L-fenyloalaniny z podłoża hodowlanego. Sposób według wynalazku obejmuje również sposób wytwarzania L-treoniny, obejmujący etapy hodowania bakterii w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-treoniny w podłożu hodowlanym oraz zbierania L-treoniny z podłoża hodowlanego.
W wynalazku hodowla, zbieranie i oczyszczanie L-aminokwasu z podł o ż a i podobne czynności można przeprowadzać podobnie do konwencjonalnych metod fermentacji, w których aminokwas wytwarza się przy wykorzystaniu mikroorganizmu. Podłoże stosowane do hodowli może być albo podłożem syntetycznym albo naturalnym, o ile podłoże zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz soli mineralnych, jeśli to konieczne, odpowiednie ilości składników odżywczych, których mikroorganizm wymaga do wzrostu. Źródło węgla może obejmować różne węglowodany, takie jak glukoza i sacharoza oraz różne kwasy organiczne. W zależności od sposobu asymilacji stosowanego mikroorganizmu, można wykorzystywać alkohol, obejmujący etanol i glicerol. Jako źródło azotu stosuje się różne sole amonowe, takie jak amoniak i siarczan amonowy, inne związki azotowe, takie jak aminy, naturalne źródła azotu, takie jak pepton, hydrolizat sojowy i trawione mikroorganizmy fermentacyjne. Jako sole mineralne stosuje się monofosforan potasowy, siarczan magnezowy, chlorek sodowy, siarczan żelaza, siarczan manganowy, chlorek wapniowy i podobne. Jeśli jest to konieczne do podłoża można dodawać pewne dodatkowe składniki odżywcze. Na przykład, jeśli mikroorganizm wymaga do wzrostu tyrozyny (auksotroficzny pod względem tyrozyny) do podłoża hodowlanego można dodać odpowiednią ilość tyrozyny.
Hodowlę przeprowadza się korzystnie w warunkach tlenowych, tak jak w hodowli z wytrząsaniem i hodowli z mieszaniem i napowietrzaniem, w temperaturze od 20 do 40°C, korzystnie od 30 do 38°C. pH hodowli pozostaje zazwyczaj w zakresie pomiędzy 5 a 9, korzystnie pomiędzy 6,5 a 7,2. pH hodowli można ustalić stosując amoniak, węglan wapniowy, różne kwasy, różne zasady i bufory. Zazwyczaj, hodowla 1-5-dniowa prowadzi do akumulacji docelowego L-aminokwasu w podłożu płynnym.
Po hodowli, elementy w stanie stałym, takie jak komórki można usuwać z podłoża płynnego przez wirowanie lub sączenie membranowe a następnie zbierać docelowy L-aminokwas i oczyszczać konwencjonalnymi metodami, takimi jak metody z wykorzystaniem wymiany jonowej, zatężania i krystalizacji.
Fenyloalaninę wytwarzaną sposobem według wynalazku można stosować, na przykład, do wytwarzania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (określanej również jako aspartam). To jest, sposób według wynalazku obejmuje sposób wytwarzania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z wykorzystaniem L-fenyloalaniny jako surowca. Sposób obejmuje syntetyzowanie estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z L-fenyloalaniny wytwarzanej sposobem według wynalazku oraz kwasu asparaginowego lub jego pochodnej. Jako ester niższego alkilu można wymienić ester metylowy, ester etylowy i ester propylowy lub podobne.
PL 207 851 B1
W sposobie według wynalazku, sposób syntetyzowania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, z L-fenyloalaniny oraz kwasu asparaginowego lub jego pochodnej, nie jest szczególnie ograniczony i można stosować wszelkie konwencjonalne metody dopóki do syntezy estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny można stosować L-fenyloalaninę lub jej pochodną. Konkretnie, na przykład, ester niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny można wytwarzać opisanym sposobem (US 3 786 039). L-fenyloalaninę estryfikuje się w celu otrzymania estru niższego alkilu i L-fenyloalaniny. Ester alkilowy L-fenyloalaniny poddaje się reakcji z pochodną kwasu L-asparaginowego, w której blokuje się grupę aminową i grupę β-karboksylową a grupę α-karboksylową estryfikuje się w celu aktywacji. Pochodna obejmuje bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, taki jak bezwodnik N-formylo-, N-karbobenzoksy- lub N-p-metoksykarbobenzoksy-L-asparaginowy. Przez reakcję kondensacji otrzymuje się mieszaninę N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny i N-acylo-e-L-aspartylo-L-fenyloalaniny. Jeśli reakcję kondensacji przeprowadza się w obecności kwasu organicznego, którego stała dysocjacji kwasowej w temperaturze 37°C wynosi 10-4 lub mniej, to stosunek postaci α do postaci β w mieszaninie jest podwyższony (JP 51-113841). Następnie N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaninę wyodrębnia się z mieszaniny, po czym poddaje uwodornieniu w celu otrzymania a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Wynalazek zilustowano w Przykładach.
P r z y k ł a d 1:
Klonowanie genu yedA z E. coli
Cała sekwencja nukleotydowa szczepu K-12 E. coli jest już określona (Science, 277, 14531474, 1997). Przeszukiwanie PSI-BLAST ujawniło, że w genomie K-12 E. coli znajduje się co najmniej 10 paralogów rthA obejmujących gen yedA. Gen yedA koduje przypuszczalną podjednostkę transbłonową, której funkcja jest nieznana.
Opierając się na znanej sekwencji nukleotydowej zsyntetyzowano startery przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 (starter 1) i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 (starter 2). Starter 1 jest sekwencją komplementarną do sekwencji od 179 do 153 bp przed kodonem start, z miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHl wprowadzonym w jej końcu 5'. Starter 2 jest sekwencją komplementarną do sekwencji od 53 do 77 nukleotydów za kodonem stop, z miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny Sail wprowadzonym w jej końcu 5'.
Chromosomalny DNA szczepu TGl E. coli przygotowywano zwykłą metodą. PCR przeprowadzano, stosując Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400, w następujących warunkach: 40 sekund w temperaturze 95°C, 40 sekund w temperaturze 47°C, 40 sekund w temperaturze 72°C, 30 cykli z wykorzystaniem polimerazy Taq (Fermentas). Otrzymany fragment PCR zawierający gen yedA z jego własnym promotorem traktowano restryktazami BamHl i SalI i wstawiono do wysokokopijnych wektorów pUC19 i pAYCTER3, uprzednio traktowanych tymi samymi enzymami. W ten sposób otrzymano plazmidy, odpowiednio, pYEDA1 i pYEDA2. Wektor pAYCTER3 jest pochodną pAYC32, wektorem o średniej ilości kopii i bardzo stabilnym, skonstruowanym na podstawie plazmidu RSF1010 (Christoserdov A. Y., Tsygankov Y. D, Broad-host range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, tom 16, str. 161-167). Wektor pAYCTER3 otrzymano przez wprowadzenie polilinkera z plazmidu pUC19 i silnego terminatora rrnB do plazmidu pAYC32 w miejsce jego promotora, w sposób przedstawiony poniżej. Najpierw, polilinker z plazmidu pUC19 otrzymano metodą PCR, stosując startery przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6. Otrzymany produkt PCR traktowano restryktazami EcoRI i Bglll. Terminator rrnB otrzymano również metodą PCR, stosując startery przedstawione w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 7 i 8. Otrzymany produkt PCR traktowano restryktazami Bglll i Bcll. Następnie, te dwa fragmenty DNA zligowano z plazmidem pAYC32, uprzednio traktowanym restryktazami EcoRl i Bcll. Tak otrzymano plazmid pAYCTER3.
P r z y k ł a d 2:
Wpływ amplifikacji genu yedA na oporność szczepu TG1 E. coli na aminokwasy i analogi aminokwasów
Plazmidy pYEDA1 i pYEDA2 oraz wektory pUC19 i pAYCTER3 wprowadzono do szczepu TGl E. coli. Tak otrzymano szczepy TG1 (pYEDAl), TG1 (pYEDA2), TG1 (pUC19) i TG1 (pAYCTER3).
Następnie, dla każdego szczepu, określano zdolność do wzrostu w obecności aminokwasów i analogów aminokwasowych, stosując płytki z minimalnym podłożem agarowym z glukozą M9 zwierające gradient stężeń inhibitora. Na płytki wysiewano od 106 do 107 komórek z całonocnej hodowli w podłożu minimalnym (uzupełnionym 100 μg/ml ampicyliny dla szczepów niosących plazmidy). Wzrost oceniano po 44 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C.
PL 207 851 B1
Wyniki przedstawiono w Tablicy 1.
T a b l i c a 1
Substrat Stężenie mg/ml Wzrost po 44 h
TG1 (pUC19)* TG1 (pYEDA1) TG1 (pYEDA2)
- - + + +
L-fenyloalanina 20,0 - + -
L-homoseryna 3,0 - + n.o.
L-treonina 50,0 - + n.o.
L-cysteina 7,5 - + n.o.
L-histydyna 20,0 - + n.o.
p-fluoro-DL-fenyloalanina 1,0 - + -
p-fluoro-DL-fenyloalanina 2,0 - + -
5-fluoro-DL-tryptofan 0,0005 - + n.o.
S(2-aminoetylo)-L-cysteina 0,4 - + +
4-aza-DL-leucyna 1,0 - + n.o.
* Takie same wyniki otrzymano dla szczepu TG1 zawierającego wektor pAYCTER3.
+: wzrost dobry ±: wzrost słaby -: brak wzrostu n.o. - nie oceniano.
P r z y k ł a d 3:
Wpływ amplifikacji genu yedA na wytwarzanie fenyloalaniny
Jako szczep macierzysty do transformacji plazmidami zawierającymi gen yedA stosowano wytwarzający fenyloalaninę szczep AJ12739 E.coli. Szczep AJ12739 zdeponowano w Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rosja, 113545 Moskwa, 1st Dorozhny proezd, 1) 6 listopada 2001 z numerem dostępu VKPM B-8197. Pierwotny depozyt zmieniono na depozyt międzynarodowy na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 23 sierpnia 2002 roku.
Wytwarzający fenyloalaninę szczep AJ12739 transformowano plazmidem pYEDA2 lub wektorem pAYCTER3 w celu uzyskania szczepów, odpowiednio, AJ12739/pYEDA2 i AJ12739/pAYCTER3. Szczepy te hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 18 godzin w bulionie odżywczym z 100 mg/l ampicyliny i stosując 0,3 ml otrzymanej hodowli zaszczepiano 3 ml podłoża fermentacyjnego zawierającego 100 mg/l ampicyliny, w probówkach o wymiarach 20 x 200 mm, i hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 48 godzin na wstrząsarce obrotowej. Po zakończeniu hodowli określano ilość zakumulowanej w podłożu fenyloalaniny stosując TLC. Stosowano płytki do TLC o wymiarach 10 x 15 cm powleczone warstwą 0,11 mm żelu krzemionkowego Sorbfil bez wskaźnika fluorescencyjnego (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rosja). Płytki z Sorbfilem rozwijano w fazie ruchomej: propan-2-ol : octan etylu : 25% wodny roztwór amoniaku : woda = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Jako odczynnik do wizualizacji stosowano roztwór (2%) ninhydryny w acetonie.
Wyniki przedstawiono w Tablicy 2.
Skład podłoża fermentacyjnego (g/l):
Glukoza 40,0 (NH4)2SO4 16,0
K2HPO4 1,0
MgSO4 •7H2O 1,0
FeSO4 •7H2O 0,01
MnSO4 •5H2O 0,01
Tiamina-HCl 0,0002 ekstrakt drożdżowy 2,0
Tyrozyna 0,1
CaCO3 30,0
PL 207 851 B1
Glukozę i siarczan magnezu sterylizuje się oddzielnie. CaCO3 sterylizuje się gorącym suchym powietrzem w temperaturze 180°C w ciągu 2 godzin. pH doprowadza się do 7,0. Antybiotyk wprowadza się do podłoża po sterylizacji.
T a b l i c a 2
Szczep E. coli OD 600 Ilość fenyloalaniny, g/l
AJ12739 (PAYCTER3) 7,0 1,5
AJ12739 (pAYCTER3-YEDA2) 7,5 1,8
Na podstawie Tablicy 2 można zauważyć, że amplifikacja genu yedA poprawia wydajność wytwarzania fenyloalaniny szczepu AJ12739.
P r z y k ł a d 4:
Wpływ wzmocnionej ekspresji genu yedA na wytwarzanie treoniny
Znany wytwarzający treoninę szczep E.coli, VNIIGenetika MG442 (Gusyatiner i in., 1978, Genetika (Rosja), 14, str. 947-956) (zdeponowany w Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego pod numerem dostępu VKPM B-1628) stransformowano plazmidem pYEDA1 lub wektorem pUC19, otrzymując szczepy MG442/pYEDA1 i MG442/pUC19.
Szczepy te hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 18 godzin w bulionie odżywczym ze 100 mg/l ampicyliny i 0,3 ml otrzymanej hodowli zastosowano do zaszczepienia 3 ml podłoża fermentacyjnego zawierającego 100 mg/l ampicyliny w probówkach o wymiarach 20 x 200 mm i hodowano w temperaturze 37°C w cią gu 48 godzin na wstrzą sarce obrotowej. Po hodowli, ilość treoniny zakumulowanej w podłożu określano przez TLC. Płytki z Sorbfilem rozwijano w fazie ruchomej: propan-2-ol : aceton : woda : 25% wodny roztwór amoniaku = 25 : 25 : 7 : 6 (v/v). Jako odczynnik do wizualizacji stosowano roztwór (2%) ninhydryny w acetonie.
Wyniki przedstawiono w Tablicy 3.
Skład podłoża fermentacyjnego (g/l):
Glukoza 50,0 (NH4)2SO4 10,0
K2HPO4 1,0
MgSO4 •7H2O 0,4
FeSO4 •7H2O, 0,02
MnSO4 •5H2O, 0,02
Tiamina-HCl 0,0002 ekstrakt drożdżowy 1,0
CaCO3 20,0
Glukozę i siarczan magnezu sterylizuje się oddzielnie. CaCO3 sterylizuje się gorącym suchym powietrzem w temperaturze 180°C w ciągu 2 godzin. pH doprowadza się do 7,0. Antybiotyk wprowadza się do podłoża po sterylizacji.
T a b l i c a 3
Szczep E. coli Treonina, g/l Wydajność (%)
MG442 (pUC19) 2,9 5,8
MG442 (pYEDA1) 4,0 8,0
Na podstawie Tablicy 2 można zauważyć, że zwiększenie ekspresji genu yedA poprawiło wydajność wytwarzania treoniny przez szczep MG442.
Możliwość zastosowania przemysłowego
Ujawniono sposób, zgodnie z wynalazkiem, wytwarzania L-aminokwasu z zastosowaniem bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającej podwyższoną wydajność wytwarzania aminokwasu, na przykład, L-fenyloalaniny i L-treoniny.
PL 207 851 B1
Lista sekwencji <110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> SPOSÓB WYTWARZANIA L-AMINOKWASÓW Z WYKORZYSTANIEM BAKTERII NALEŻĄCYCH DO RODZAJU ESCHERICHIA <130> B889SMOP1407 <140>
<141> 2002-11-21 <150> RU 2001131570 <151> 2001-11-23 <160> 8 <170> Patentln wersja 2.1 <210> 1 <211> 921 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgcgtttcc ggctcaacct ggcgttcgat aaactccccc gtcggtaatg gtagtggttg acgcgcaaac agcggtggaa agctgggcgt ggtgcgattg gaaaaactga tttggttcga ctcgccacca ggtggagaaa gtactggtca caggacgcat gccagttgtt attttgtcat tcctggcagc cgctacgtcc gcatggtgac caaccgtgcc tggaatgggt atttaagcgg ttggctcagt agatgctggc cggcgctccc ttatcgccat gctacgctta cactgtcgaa cgttgggaaa caagcgagta accgcttttt tcggattggc cggtatttta gctgctcaat ggttgccgaa cctctttacc gggtattgcc caatccgtgg ttatggctcg ggcaggcgtg ttccctttca caacgcttat cgttaacccg gattgaatgg atatctcttc a
ggcgcgctgt gtggaaagct ttgctggcat gccgcgctga catcaaaatg ctgtgcttca attgggcttg ggcgcgattc cgcattacct gtgttaatga ggcttccttg atgtatttaa gtggtcgcgg ctggcgctcg ccggcaaaac ttgcgttgta ggcctccgtt ttttgctact ttggcctgtt ttccttccgg gccgcctgtt ccggaatcat tgattttaat tacctgtagg tcgcgtcgat cggtcggcta tccgtaatgt tcttgctggg gcgtaattgt ccgtagttgc tatcatttgg 60 aatgatggcg 120 gcgcggacac 180 attgctggct 240 catcgccgcc 300 tggcattaaa 360 catgctcaat 420 cggctcgatt 480 gatgatggcg 540 gattgcgggt 600 tctggcgctg 660 cagtccggct 720 tacgggactg 780 cttcgcggtg 840 gccagttatt 900
921 <210> 2 <211> 306 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 2
Met Arg Phe Arg Gin Leu Leu Pro Leu Phe Gly Ala Leu Phe Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Ile Trp Gly Ser Thr Tyr Phe Val Ile Arg Ile Gly Val Glu
20 25 30
Ser Trp Pro Pro Leu Met Met Ala Gly Val Arg Phe Leu Ala Ala Gly
35 40 45
PL 207 851 B1
Ile Leu 50 Leu Leu Ala Phe Leu 55 Leu Leu Arg Gly His 60 Lys Leu Pro Pro
Leu Arg Pro Leu Leu Asn Ala Ala Leu Ile Gly Leu Leu Leu Leu Ala
65 70 75 80
Val Gly Asn Gly Met Val Thr Val Ala Glu His Gin Asn Val Pro Ser
85 90 95
Gly Ile Ala Ala Val Val Val Ala Thr Val Pro Leu Phe Thr Leu Cys
100 105 110
Phe Ser Arg Leu Phe Gly Ile Lys Thr Arg Lys Leu Glu Trp Val Gly
115 120 125
Ile Ala Ile Gly Leu Ala Gly Ile Ile Met Leu Asn Ser Gly Gly Asn
130 135 140
Leu Ser Gly Asn Pro Trp Gly Ala Ile Leu Ile Leu Ile Gly Ser Ile
145 150 155 160
Ser Trp Ala Phe Gly Ser Val Tyr Gly Ser Arg Ile Thr Leu Pro Val
165 170 175
Gly Met Met Ala Gly Ala Ile Glu Met Leu Ala Ala Gly Val Val Leu
180 185 190
Met Ile Ala Ser Met Ile Ala Gly Glu Lys Leu Thr Ala Leu Pro Ser
195 200 205
Leu Ser Gly Phe Leu Ala Val Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Gly Ser Ile
210 215 220
Ile Ala Ile Asn Ala Tyr Met Tyr Leu Ile Arg Asn Val Ser Pro Ala
225 230 235 240
Leu Ala Thr Ser Tyr Ala Tyr Val Asn Pro Val Val Ala Val Leu Leu
245 250 255
Gly Thr Gly Leu Gly Gly Glu Thr Leu Ser Lys Ile Glu Trp Leu Ala
260 265 270
Leu Gly Val Ile Val Phe Ala Val Val Leu Val Thr Leu Gly Lys Tyr
275 280 285
Leu Phe Pro Ala Lys Pro Val Val Ala Pro Val Ile Gin Asp Ala Ser
290 295 300
Ser Glu
305 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter
PL 207 851 B1 <400> 3 aagggatccc tctcattttt attgt <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 4 aagcgtcgac cgagcgtctg gaa 23 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 5 gaccatagat ctgaattcga gctcggtac <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 6 acggccagat ctaagcttgc atgcctgca 29 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 7 aacagtgatc atttgcctgg cggcagtagc gcgg <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter <400> 8 ataaaaagct tagatctcaa aaagagtttg tagaaacgca a 41

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania L-aminokwasu, wybranego z grupy składającej się z L-treoniny i L-fenyloalaniny, obejmujący etapy, w których w podłożu hodowlanym hoduje się bakterię należącą do rodzaju Escherichia i z podłoża hodowlanego wyodrębnia się wytworzony i nagromadzony w tym podłożu L-aminokwas, znamienny tym, że bakteria ma zwiększoną ekspresję białka określonego w (A) lub (B) w komórce bakterii:
(A) białka o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białka o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do pięciu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, i które wykazuje aktywność, nadającą bakterii należącej do rodzaju Escherichia oporność na L-aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-fenyloalaniny, L-treoniny, L-homoseryny i L-cysteiny i/lub analog aminokwasowy wybrany z grupy składającej się z p-fluoro-fenyloalaniny, 5-fluoro-DL-tryptofanu, S-(2-amino-etylo)cysteiny i 4-aza-DL-leucyny, przy czym ekspresja białka zdefiniowanego w (A) lub (B), jest zwiększona poprzez stransformowanie bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) z zastosowaniem wysokokopijnego wektora niosącego wskazane DNA, poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA do chromosomu bakterii lub poprzez umieszczenie DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora lub trc promotora w zamian za natywny promotor bakterii.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzanym L-aminokwasem jest L-fenyloalanina.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarzanym L-aminokwasem jest L-treonina.
4. Sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, obejmujący etapy, w których hoduje się bakterię w podłożu hodowlanym do wytworzenia i nagromadzenia w tym podłożu L-fenyloalaniny, przy czym bakteria ta wykazuje zdolność wytwarzania L-fenyloalaniny i syntezuje się niższy ester alkilowy α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z kwasem asparaginowym lub jego pochodnej i otrzymanej L-fenyloalaniny, znamienny tym, że bakteria ma zwiększoną ekspresję białka komórkowego określonego w (A) lub (B) w komórce bakterii:
(A) białka o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białka o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do pięciu aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji i które wykazuje aktywność nadającą bakterii należącej do rodzaju Escherichia oporność na L-aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-fenyloalaniny, L-treoniny, L-homoseryny i L-cysteiny i/lub analog aminokwasowy wybrany z grupy składającej się z p-fluoro-fenyloalaniny, 5-fluoro-DL-tryptofanu, S-(2-amino-etylo)cysteiny i 4-aza-DL-leucyny, przy czym ekspresja białka, zdefiniowanego w (A) lub (B), jest zwiększona poprzez stransformowanie bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) z zastosowaniem wysokokopijnego wektora niosącego wskazane DNA, poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA do chromosomu bakterii lub poprzez umieszczenie DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora lub trc promotora w zamian za natywny promotor bakterii.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy, w których estryfikuje się L-fenyloalaninę do utworzenia niższego estru alkilowego L-fenyloalaniny, kondensuje się niższy ester alkilowy L-fenyloalaniny z pochodną kwasu asparaginowego, przy czym pochodną jest bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, oddziela się niższy ester alkilowy N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z mieszaniny reakcyjnej, i przeprowadza się uwodornianie niższego estru alkilowego N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny do uzyskania niższego estru alkilowego a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
PL369776A 2001-11-23 2002-11-21 Sposób wytwarzania L-aminokwasu i sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny PL207851B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001131570/13A RU2229513C2 (ru) 2001-11-23 2001-11-23 Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL369776A1 PL369776A1 (pl) 2005-05-02
PL207851B1 true PL207851B1 (pl) 2011-02-28

Family

ID=20254422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL369776A PL207851B1 (pl) 2001-11-23 2002-11-21 Sposób wytwarzania L-aminokwasu i sposób wytwarzania niższego estru alkilowego α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny

Country Status (17)

Country Link
US (2) US7259003B2 (pl)
EP (2) EP1449917B1 (pl)
JP (1) JP4305183B2 (pl)
KR (1) KR101023924B1 (pl)
CN (1) CN100469875C (pl)
AR (1) AR037583A1 (pl)
AT (1) ATE334190T1 (pl)
AU (1) AU2002355021C1 (pl)
BR (1) BR0214329B1 (pl)
CA (1) CA2468178C (pl)
DE (1) DE60213456T2 (pl)
DK (1) DK1449917T3 (pl)
ES (1) ES2269788T3 (pl)
MX (1) MXPA04004872A (pl)
PL (1) PL207851B1 (pl)
RU (1) RU2229513C2 (pl)
WO (1) WO2003044191A1 (pl)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5976843A (en) * 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
US20060040364A1 (en) * 1998-10-13 2006-02-23 Livshits Vitaly A DNA coding for a protein which imparts L-homoserine resistance to Escherichia coli bacterium, and a method for producing L-amino acids
RU2144564C1 (ru) * 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
RU2175351C2 (ru) * 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
DE60210697T2 (de) * 2001-02-13 2007-04-05 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
MXPA04004874A (es) * 2001-11-23 2004-09-03 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia.
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2244007C2 (ru) * 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
RU2273666C2 (ru) * 2003-02-26 2006-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз
BRPI0407966A (pt) * 2003-03-12 2006-03-07 Ajinomoto Kk método para obter uma bactéria, bactéria produzindo l-aminoácido, e, método para produzir um l-aminoácido
WO2005007841A1 (ja) * 2003-07-16 2005-01-27 Ajinomoto Co., Inc. 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
US20050176033A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-11 Klyachko Elena V. Mutant phosphoribosylpyrophosphate synthetase and method for producing L-histidine
RU2275424C2 (ru) * 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
US7005333B2 (en) * 2003-12-30 2006-02-28 Infineon Technologies Ag Transistor with silicon and carbon layer in the channel region
BRPI0506369B1 (pt) * 2004-01-30 2020-11-03 Ajinomoto Co., Inc microorganismo transgênico, e, método para produzir um l-aminoácido
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US20050191684A1 (en) * 2004-02-25 2005-09-01 Zimenkov Danila V. Method for producing L-amino acids
JP4604537B2 (ja) * 2004-03-31 2011-01-05 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
BRPI0509056A (pt) * 2004-03-31 2007-08-21 Ajinomoto Kk bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico
RU2306338C2 (ru) * 2004-06-24 2007-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Mob'-ПРОИЗВОДНАЯ ПЛАЗМИДА RSF1010, НЕ СОДЕРЖАЩАЯ ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ, БАКТЕРИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДУ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
US7915018B2 (en) * 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
WO2006088235A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
DE602006015302D1 (de) * 2005-05-16 2010-08-19 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung einer l-aminosäure unter verwendung eines bakteriums der familie enterobacteriaceae mit abgeschwächter expression des kefb-gens
WO2007086546A1 (en) * 2006-01-26 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) * 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
EP2007873B1 (en) * 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2035569A1 (en) 2006-06-01 2009-03-18 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rcsa gene
RU2337961C2 (ru) * 2006-07-04 2008-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB
RU2006129690A (ru) 2006-08-16 2008-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010017082A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) * 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2365622C2 (ru) 2006-12-22 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus
JP5540504B2 (ja) 2007-01-22 2014-07-02 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
RU2392326C2 (ru) * 2007-02-20 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН ycbPONME (ОПЕРОН ssuEADCB)
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
RU2395567C2 (ru) * 2007-03-22 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ МАЛЫЕ РНК
RU2396349C2 (ru) * 2007-04-03 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ygiD
RU2396337C2 (ru) * 2007-07-24 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yncD
RU2392327C2 (ru) * 2007-08-14 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН chaC ИЛИ ОПЕРОН chaBC
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
WO2009031565A1 (ja) 2007-09-04 2009-03-12 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
RU2008148283A (ru) * 2008-12-09 2010-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА artI
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2497943C2 (ru) * 2010-07-15 2013-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
JP5958653B2 (ja) 2013-10-02 2016-08-02 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
EP2886651B1 (en) 2013-10-21 2018-08-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
CN108463555A (zh) 2016-01-12 2018-08-28 味之素株式会社 生产苯甲醛的方法
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
CN110592084B (zh) * 2019-08-28 2023-07-28 内蒙古伊品生物科技有限公司 一种rhtA基因启动子改造的重组菌株及其构建方法与应用
JP7655312B2 (ja) 2019-09-25 2025-04-02 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
JP7735863B2 (ja) 2019-10-28 2025-09-09 味の素株式会社 ベンズアルデヒドの製造方法
CN119012914A (zh) 2022-04-04 2024-11-22 味之素株式会社 防治寄生植物的方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3786039A (en) * 1969-04-30 1974-01-15 Ajinomoto Kk Method of producing alpha-l-aspartyl-l-phenylalanine lower alkyl esters
SU875663A1 (ru) * 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
SU974817A1 (ru) 1981-06-16 1990-08-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
US4783403A (en) * 1984-02-08 1988-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing l-phenylalanine
SU1694643A1 (ru) * 1987-11-26 1991-11-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина
US5175107A (en) * 1988-10-25 1992-12-29 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine
US5976843A (en) * 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
US5705371A (en) * 1990-06-12 1998-01-06 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
US5534421A (en) * 1991-05-30 1996-07-09 Ajinomoto Co., Inc. Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production
US6132999A (en) * 1992-09-21 2000-10-17 Ajinomoto Co., Inc. L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
CA2223154A1 (en) * 1995-06-02 1996-12-05 G.D. Searle & Co. Heterocyclo substituted hydroxamic acid derivatives as cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase inhibitors
JP4032441B2 (ja) 1995-08-30 2008-01-16 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造方法
DE19548222A1 (de) 1995-12-22 1997-06-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern
DE19726083A1 (de) * 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
RU2144564C1 (ru) 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
RU2148642C1 (ru) 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
RU2209246C2 (ru) 2000-01-26 2003-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Малая субъединица изозима iii и изозим iii синтетазы ацетогидроксикислот из escherichia coli, фрагмент днк (варианты), штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-валина (варианты) и способ получения l-валина
CA2404260A1 (en) * 2000-03-21 2001-09-27 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in prokaryotes
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
DE60210697T2 (de) 2001-02-13 2007-04-05 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia
MXPA04004874A (es) 2001-11-23 2004-09-03 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia.
RU2229513C2 (ru) 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2244007C2 (ru) 2002-02-27 2005-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-треонина, штамм escherichia coli - продуцент треонина (варианты)
BRPI0407966A (pt) 2003-03-12 2006-03-07 Ajinomoto Kk método para obter uma bactéria, bactéria produzindo l-aminoácido, e, método para produzir um l-aminoácido
RU2268300C2 (ru) 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
WO2005007841A1 (ja) 2003-07-16 2005-01-27 Ajinomoto Co., Inc. 変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ及びｌ−システインの製造法
RU2275424C2 (ru) 2003-12-05 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia
US20050181488A1 (en) 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US20050191684A1 (en) 2004-02-25 2005-09-01 Zimenkov Danila V. Method for producing L-amino acids
US8003367B2 (en) 2004-03-16 2011-08-23 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes
RU2306338C2 (ru) 2004-06-24 2007-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Mob'-ПРОИЗВОДНАЯ ПЛАЗМИДА RSF1010, НЕ СОДЕРЖАЩАЯ ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ, БАКТЕРИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ ПЛАЗМИДУ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛЕЗНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
US7915018B2 (en) 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family

Also Published As

Publication number Publication date
ATE334190T1 (de) 2006-08-15
PL369776A1 (pl) 2005-05-02
US20030148473A1 (en) 2003-08-07
AU2002355021B2 (en) 2007-12-13
AR037583A1 (es) 2004-11-17
ES2269788T3 (es) 2007-04-01
AU2002355021C1 (en) 2009-03-19
EP1688482A1 (en) 2006-08-09
US7531332B2 (en) 2009-05-12
CN100469875C (zh) 2009-03-18
KR101023924B1 (ko) 2011-03-22
EP1449917B1 (en) 2006-07-26
DE60213456D1 (de) 2006-09-07
US7259003B2 (en) 2007-08-21
CA2468178C (en) 2014-06-17
BR0214329B1 (pt) 2014-07-22
RU2229513C2 (ru) 2004-05-27
CN1615360A (zh) 2005-05-11
EP1449917A1 (en) 2004-08-25
EP1449917A4 (en) 2005-01-26
WO2003044191A1 (en) 2003-05-30
DE60213456T2 (de) 2007-03-01
BR0214329A (pt) 2004-11-03
AU2002355021A1 (en) 2003-06-10
MXPA04004872A (es) 2004-09-03
JPWO2003044191A1 (ja) 2005-03-24
JP4305183B2 (ja) 2009-07-29
KR20050044573A (ko) 2005-05-12
US20080153138A1 (en) 2008-06-26
DK1449917T3 (da) 2006-11-27
CA2468178A1 (en) 2003-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2468178C (en) Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
KR101023925B1 (ko) 에세리키아속 세균을 사용한 ｌ-아미노산의 제조방법
CA2584517C (en) Method for producing l-amino acids using bacteria of the enterobacteriaceae family
US20120276598A1 (en) Method for producing an l-amino acid
RU2530171C2 (ru) МУТАНТНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ ГЕНОМ yddG, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia
JP2022516111A (ja) 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性ｌ－アミノ酸またはその塩の製造方法