ES2270454T3 - Inhibicion de la expresion de la proteina bcl-2 mediante oligodesoxinucleotidos de sentido contrario. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA NUEVAS COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA USO EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA BCL-2, COMO EL CANCER, CONCRETAMENTE EN EL TRATAMIENTO DEL LINFOMA FOLICULAR (LF). LAS COMPOSICIONES CONTIENEN OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO QUE SE HIBRIDIZAN EN ACIDOS NUCLEICOS BCL-2, CUYOS PRODUCTOS GENETICOS SE SABE QUE INTERACCIONAN CON LA PROTEINA TUMORIGENICA BCL-2. UTILIZADAS SOLAS, O JUNTO CON OTROS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO, ESTAS COMPOSICIONES IMPIDEN LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS CANCEROSAS DEL LF.

Description

Inhibición de la expresión de la proteína Bcl-2 mediante oligodesoxinucleótidos de sentido contrario.

Antecedentes de la invención A. Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de terapia de cáncer, específicamente el tratamiento de las enfermedades Bcl-2. Más particularmente, estos tratamientos implican el uso de oligodesoxinucleótidos de sentido contrario y las formulaciones de liposomas de los mismos.

B. Técnica relacionada

Bcl-2 se ha unido a una amplia diversidad de enfermedades tales como malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, que incluye linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica y discrasia de células de plasma (Campos y col., Blood, 84: 595, 1994); tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes. Una enfermedad particular relacionada con Bcl-2 el el linfoma folicular no-Hodgkin (FL). FL es la malignidad linfoide más común en Europa y Estados Unidos. Típicamente es una enfermedad indolente de bajo grado, que consiste en una acumulación de células B pequeñas en descanso. Aunque la respuesta a la quimioterapia es inicialmente buena, los relapsos son inevitables con la transformación a un tipo histológico más agresivo y el desarrollo de resistencia a fármacos (Aisenberg, J. Clin. Oncol., 13: 2656; 1995; Johnson y col., J. Clin. Oncol., 13:140, 1995). Por encima del 90% de los pacientes de FL, se encuentra una traslocación t (14;18), que da como resultado la yuxtaposición del gen cbl-2 del cromosoma 18q21 con el locus del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina en el cromosoma 14q323 (Tsujimoto y col., Science, 229: 1390, 1985; Graninger y col., J. Clin. Invest., 80: 1512, 1987). Como consecuencia, el gen bcl-2 está bajo la influencia del potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina, y la proteína Bcl-2 se sobreexpresa (Bakhshi y col., Cell, 41:899, 1985; Tsujimoto y col., Oncogene, 2:3, 1987). El potencial tumorigénico de Bcl-2 está relacionado a su capacidad de interferir con las respuestas de muerte fisiológica, por lo tanto potenciando la longevidad de la célula (Nuñez y col., J. Immunol., 144: 3602, 1990). La proteína de Bcl-2 bloquea los estímulos apoptópicos tales como la privación del factor de crecimiento, radiación, choque térmico, virus, y la mayoría de los agentes terapéuticos (Reed, Hematol. Oncol. Clin. North. Am., 9:451, 1995; Hockenbery y col., Nature, 348: 334, 1990). En ratones bcl-2-Ig transgénicos, una hiperproliferación folicular policlonal que consiste en una expansión de linfocitos B maduros se observa inicialmente (McDonnell y col., Cell, 57:79, 1989). Posteriormente, se desarrollan linfomas de tipo inmunoblástico con un gran alto grado monoclonales con 50% de ellos que presentan transposición de C-MYC. Esto sugiere que es necesaria una segunda alteración genética para el desarrollo y progresión de linfoma maligno (McDonnell y Korsmeyer, Nature, 349: 254, 1991).

Recientemente se ha identificado una familia en expansión de proteínas relacionaads con Bcl-2. Ésta incluye Bax, Bcl-X_{2}, Bcl-X_{s}, Bad, Bak, Mcl-1, A-1, y varios marcos abiertos de lectura en virus de ADN (Oltvai y col., Cell 74: 609, 1993; Boise y col., Cell, 74: 597, 1993; Yang y col., Cell, 80: 285, 1995, Chittenden y col., Nature, 374: 733, 1995, Kiefer y col., Nature, 374: 736, 1995; Kozopas y col., Proc. Nat'l Acad Sci, Estados Unidos, 90: 3516, 1993; Lin y col., J. Immunol., 151: 1979, 1993; Pearson y col., Virology, 160: 151, 1987; Neilan y col., Virol., 67: 4391, 1993). El miembro en la familia de Bcl-2 de proteínas se define principalmente mediante homología dentro de los dominios BHI y BH2, que ayudan a regular la dimerización entre los miembros (Sato y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 91: 9238, 1994). Bax que comparte el 21% de identidad de aminoácidos con Bcl-2, se puede unir a la proteína Bcl-2 y neutralizan su capacidad de bloquear la muerte celular. De es modo, la relación de Bcl-2 a Bax se piensa que determina la susceptibilidad de las células a morir después de un estímulo apoptópico (Oltvai y col., 1993; Yin y col., Nature, 369: 321, 1994).

Los oligodesoxinucleótidos fosfodiéster de sentido contrario complementarios a secuencias específicas del sitio traducción-inicio de ARNm de Bcj-2 son capaces de inhibir la producción de la proteína Bcl-2 y el crecimiento de las células que llevan la translocación t (14;18) (Kitada y col., Antisense Res. Dev., 3: 157, 1993). Sin embargo, el uso terapéuticos de oligonucleótidos de sentido contrario está impedido por su baja captación celular y su rápida degradación mediante nucleasas y otros componentes de suero o celulares. Los oligonucleótidos de fosfoprotioato, que son ersistenets a la degradación por nucleasa, se encontró que inhiben el crecimiento celular de FL a concentraciones 10 veces más baja que los oligonucleótidos fosfodiéster (Reed y col., Cancer Research, 50: 6565, 1990a; Cotter y col., Oncogene, 9: 3049, 1994). Sin embargo este planteamiento sufre una baja captación celular de los oligonucleótidos. Por ejemplo, Reed y col., tienen que usar concentraciones de más de 25 \muM de fosforotioatos para lograr 50% de inhibiciones de crecimiento de las líneas celulares derivadas de linfomas de células B, tales como células 697 y Su-Dhl-4. La incorporación de liposomas ha conducido a la potenciación de la captación de oligonucleótidos en células de leucemia (Akhtar y col., Nucleic Acids Res., 19: 5551, 1991; Tari y col., Blood, 84: 601, 1994). El uso de lípidos catiónicos por Reed y col., para la distribución de oligodesoxinucleótidos fosfodiéster de sentido contrario les permitió reducir la concentración de oligonucleótidos a 0,075 a 0,3 \muM y todavía inducen la inhibición de crecimiento en células Su-Dhl-4.

Existe todavía, sin embargo, una gran necesidad de procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades asociadas a Bcl-2 tales como malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, que incluyen linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica, y discrasias de células de plasma; los tumores sólidos similares a los asociados con cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes.

Sumario de la invención

La presente invención se designa para superar las limitaciones de la técnica anterior proporcionando composiciones mejoradas útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas a Bcl-2, tales como malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, que incluye linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica y discrasia de células de plasma tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes. Estas composiciones comprenden oligonucleótidos de sentido contrario novedosos para dirigir ácidos nucleicos específicos en las células de los pacientes.

De este modo, en una realización, se proporciona una composición que comprende un primer polinucleótido que se hibridiza a un segundo polinucleótido que codifica Bcl-2 en condiciones intracelulares. Las condiciones intracelulares como se han definido en esta memoria descriptiva incluyen catión monovalente a una concentración de aproximadamente 160 mM (10 mM de Na^{+}; 150 mM de K^{+}) y una concentración de catión divalente de aproximadamente 20 mM (18 mM de Mg^{++}; 2 mM de Ca^{++}). Las condiciones intracelulares también pueden incluir una concentración de proteína que serviría para disminuir el volumen de hibridación y, por lo tanto, incrementan la concentración eficaz de especies de ácido nucleico, de aproximadamente 150 mg/ml. Los ingredientes y requerimientos adicionales de tales composiciones son como se definen en la reivindicación 1.

Los primeros polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos que tienen una longitud de aproximadamente 8-50 bases. Los polinucleótidos pueden ser polinucleótidos fosfodiéster como se encuentran en la naturaleza, o pueden ser preferiblemente polinucleótidos derivatizados o incluso análogos de polinucleótidos. Los polímeros ejemplares serían polinucleótidos p-etoxi o metilfosfonato. Otros análogos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a polinucleótidos C-5 propino (Wagner y col., Science, 260: 1510 - 1513, 1993), o polinucleótidos como se describe en los documentos US 5.138.045 o EP-A 431.523. Los análogos preferidos son resistentes a nucleasa, que tienen una alta temperatura de fusión, (unión estrecha a ARN), y en ciertas realizaciones los polinucleótidos preferidos son formas hidrófobas para una asociación más eficaz con una formulación de lípidos tal como un liposoma.

En una realización adicional, el polinucleótido se hibridiza a ARNm de bcl-2 y preferible al sitio de inicio de traducción del ARNm de Bcl-2. Sin embargo, se entiende que las moléculas de sentido contrario de la presente invención se pueden hibridar a cualquier área de la transcripción de bcl-2 que es eficaz en la expresión de regulación hacia debajo de la proteína Bcl-2. Existen ciertas ventajas para dirigir el primer marco abierto de lectura, y como se establece, el sitio de inicio de transcripción se prefiere particularmente. En ciertas realizaciones específicas, el polinucleótido puede ser un oligonucleótido que tiene la secuencia ^{5'} CAGCGTGCGCCATCCTIC ^{3'} (SEQ ID nº: 1).

La composición de la presente invención comprende un lípido, como se especifica en la reivindicación 1. El lípido está en asociación con el primer polinucleótido. Un polinucleótido asociado a un lípido se puede describir como encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, interdispersado dentro de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de unión que está asociada a tanto el liposoma como el polinucleótido, formando complejos con un lípido, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o formando complejos con una micela, o de otra manera asociada a un lípido.

El término "lípidos" como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones indica cualquier forma de lípidos o liposomas tanto de origen natural como sintéticos. Los lípidos son sustancias grasas y los conocen bien los expertos en la técnica. Los lípidos de acuerdo con la presente invención no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". Pueden estar simplemente interdispersados en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes en o bien tamaño o forma. Los lípidos son neutros en carga neta y de manera ventajosa pueden estar comprendidos por el lípido dioleoilfsofatidilcolina, sin embargo otros lípidos tales como otros fosfatidilcolinas, fosfatidilgliceroles, y fosfatidiletanolaminas también se pueden emplear.

En todavía otra realización, se proporciona una composición que comprende una construcción de expresión que codifica un primer polinucleótido que se hibridiza a un segundo polinucleótido que codifica Bcl-2, en la que dicho polinucleótido está bajo el control de un promotor que es activo en células eucarióticas. Los ingredientes y requerimientos adicionales de tal composición son como se definen en la reivindicación 11.

Esta invención también comprende el uso de tales composiciones para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de una célula cancerosa tal medicamento de puede aplicar de manera ventajosa en el caso de una diversidad de células cancerosas como se muestra en los ejemplos más adelante. Los medicamentos se muestran que son eficaces en células cancerosas que sobreexpresan o expresan altos niveles de bcl-2 y también expresan la proteína Bax, así como en células con la translocación de p53 en el núcleo tras el daño genotóxico está inhibido por bcl-2. Tales células incluirían, pero no se limitan a malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, que incluye linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica y discrasia de células de plasma; tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes. La composición puede comprender un lípido neutro que está asociado al polinucleótido, tal como un polinucleótido en un liposoma. En una realización específica, la célula cancerosa está en un paciente, y en ciertas realizaciones en un paciente humano. La composición se puede de manera ventajosa administrar a un paciente humano en un volumen de 0,50-10,0 ml por dosis o en una cantidad de 5-30 mg de polinucleótido por m^{2}. En un régimen particular, la composición se administra 3 veces por semana durante 8 semanas. Sin embargo, se pueden usar diversas dosificaciones como se determina por el médico asistente basándose en la enfermedad particular, edad y afección del paciente y otros factores que pueden afectar a la decisión del médico.

Esta invención se refiere a una tecnología de sentido contrario que se puede emplear para tratar enfermedad asociada a Bcl-2. En una realización preferida abarca una composición que comprende un polinucleótido que se hibridiza al sitio de inicio de la traducción del ARNm de Bcl-2. Un ejemplo de un polinucleótido útil es un oligonucleótido que comprende la secuencia CAGCGTGCGCCATCCTTC (SEQ ID nº: 1).

Las composiciones de la presente invención también incluyen composiciones en las que los liposomas se forman a partir del lípido. En algunos casos, puede ser útil tener una composición en la que el polinucleótido está encapsulado en el liposoma. Los lípidos que son particularmente útiles en la presente invención incluyen fosfatidilcolinas, fosfatidil gliceroles, y fosfatidil etanolaminas, siendo un ejemplo el lípido dioleoilfosfatidilcolina, aunque cualesquiera lípidos neutros aceptables se pueden usar.

Un procedimiento de inhibición de una enfermedad asociada a Bcl-2 comprende las etapas de obtención de un polinucleótido que se hibridiza a un polinucleótido que codifica Bcl-2, mezclando el polinucleótido con un lípido neutro para formar una asociación de polinucleótido/lípido, y administrarse dicha asociación a una célula. la célula puede ser una célula cancerosa, tal como una célula de linfoma folicular. Este procedimiento emplea un polinucleótido que comprende un oligonucleótido que comprende un oligonucleótido que tiene una longitud entre 8 y 50 bases. El lípido puede comprender un liposoma. Si es así, el liposoma puede además encapsular el polinucleótido.

El contacto puede tener lugar en un animal, tal como un ser humano. Por ejemplo, la composición se puede administrar a dicho ser humano en un volumen de 0,50-10,0 ml por dosis o en una cantidad de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 mg de polinucleótido por m^{2}. También se puede administrar tres veces a la semana durante ocho semanas.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención también se puede entender mejor mediante referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en esta memoria descriptiva:

Fig 1: Inhibición de crecimiento de células linfoides mediante oligonucleótidos de sentido contrario de bcl-2 liposomales ("L-bcl-2"). Se añadieron concentraciones finales de 3 \mumoles/l (puntos), 4 \mumoles/l (horizontal), 5 \mumoles/l (vertical) y 6 \mumoles/l (diagonal) de L-bcl-2 se añadieron a células Johnson, Jurkat, Raji y Daudi. Después de 5 días, se midió la viabilidad de las células tumorales mediante tinte alamarBlue. La viabilidad se expresó como por ciento de células no tratadas.

Fig 2: Toxicidad no específica en células linfoides a 6 \mumolesl de oligonucleótidos liposomales. Se añadieron liposomas vacíos (diagonal) y dos oligonucleótidos de control liposomales diferentes ("oligos L-control") (gris, negro) a células Johnson, Jurkat, Raji y Daudi a 6 \mumoles/l de concentración final. Después de 5 días, la viabilidad de las células tumorales se midió mediante tinte alamarBlue. La viabilidad se expresó como por ciento de células no tratadas.

Fig 3: Análisis de transferencia de Western de la proteína Bcl-2 en las cuatro líneas celulares. Se lisaron células Johnson, Jurkat, Daudi y Raji en tampón de muestra y se normalizaron para contenido total de proteína. Se cargaron veinticinco gramos de proteína total en cada banda. Se incubaron las membranas con anticuerpo monoclonal de bcl-2 anti-humano de hámster. En las células Johnson, se observó una línea celular que lleva la translocación t (14; 18), sobreexpresión de la proteína Bcl-2. En las células Jurkat y Raji, que carecían de la translocación t (14; 18), la expresión de Bcl-2 es baja. En las células Daudi, no se observa expresión de Bcl-2.

Fig 4A y Fig 4B: Inhibición específica de la proteína Bcl-2 en células Johnson y Jurkat por L-bcl-2.

Fig 4A: Se trataron 1 x 10^{5} de células Johnson por ml en 3 ml con 3 y 4 \mumoles/l de oligos L-bcl-2 o L-control. Después de 3 días de cultivo, los lisados que contenían proteína se prepararon y se sometieron 5 \mu de proteína total a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las manchas se cortaron en secciones y se incubaron con anticuerpos específicos para o bien Bcl-2 o Actina (izquierda). Para estimar la inhibición de la proteína bcl-2, se cuantificaron los datos mediante densitometría de barrido y se expresaron como relación de Bcl-2:Actina (derecha). L-bcl-2: (cuadrados rellenos); L- control: (círculos abiertos).

Fig 4B: Se trataron 1 x 10^{5} de células Jurkat por ml en 3 ml con 3 y 4 \mumoles/l de oligonucleótidos L-bcl-2 o L-control. Después de 3 días de cultivo, los lisados que contenían proteína se prepararon y se sometieron 20 \mu de proteína total a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las manchas se cortaron en secciones y se incubaron con anticuerpos específicos para o bien Bcl-2 o Actina (izquierda). Para estimar la inhibición de la proteína bcl-2, se cuantificaron los datos mediante densitometría de barrido y se expresaron como relación de Bcl-2:Actina (derecha). L-bcl-2: (cuadrados rellenos); L- control: (círculos abiertos).

Fig 5: Análisis de transferencia de Western de la proteína Bax en las cuatro líneas celulares. Se lisaron células Johnson, Jurkat, Daudi y Raji en tampón de muestra y se normalizaron para contenido total de proteína. Se cargaron cincuenta \mugramos de proteína total en cada banda. Se incubaron las membranas con anticuerpo policlonal de Bax anti-humano de conejo.

Fig 6A y Fig 6B: La relación Bcl-2/Bax disminuye en células Johnson por L-bcl-2.

Fig 6A: Se trataron 1 x 10^{5} de células Johnson por ml en 3 ml con 2, 3 y 4 \mumoles/l de oligos L-bcl-2 o L-control. Después de 3 días de cultivo, los lisados que contenían proteína se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las manchas se cortaron en secciones y se incubaron con anticuerpos específicos para o bien Bax o Actina. Este experimento se realizó usando los mismos lisados obtenidos en el experimento mostrado en la Fig. 4ª y Fig. 4B.

Fig 6B: Se cuantificaron los datos mediante densitometría de barrido y se expresaron como relación de Bcl-2:Bax. L-bcl-2: (cuadrados rellenos); oligo L-control: (círculos abiertos).

Fig 7: Fragmentación de ADN en células Johnson incubadas con L-Bcl-2. Se incubaron células Johnson con 4 \mumoles/l de oligos L-bcl-2 y dosL-control. Después de 3 días de incubación, se extrajo el ADN, se sometió a electroforesis a través de gel de azarosa y se tiñen con bromuro de etidio. Banda 1, células no tratadas; banda 2, células tratadas con oligo L-control (mezcladas); banda 3, células tratadas con oligo L-control (aleatorio); banda 4, células tratadas con L-bcl-2.

Fig 8A y Fig 8B: Células Johnson apaptópicas incubadas con L-bcl-2.

Fig 8A: Fotografía fluorescente de células Johnson teñidas con tinte de unión de ADN, naranja acridina, después de 3 días de incubación con 5 \mumoles/l de L-bcl-2 (derecha) o sin oligonucleótidos liposomales ("L-OS") (izquierda).

Fig 8B: Índice apotópico de células Johnson tratadas con 4 y 5 \muM de L-bcl-2 (puntos), oligo L-control (horizontal) o liposomas vacíos (en negro). Índice apoptópico = (nº total de células núcleos apaotópicos/ nº total de células contadas totales) x 100%.

Fig 9A y Fig 9B: Evaluación de la muerte celular después de irradiación de células control LNCaP y bcl-2 transfectadas.

Fig 9A: Evaluación por Microscopía de fluorescencia de inducción de muerte celular después de irradiación de células control LNCaP y bcl-2 transfectadas (LNCaP-bcl-2). No tratadas control (superior izquierda), células LNCaP-bcl-2 no tratadas (izquierda inferior), células control 24 horas después de 20 Gy de irradiación \gamma (derecha superior), y células LNcaP-bcl-2 24 horas después de irradiación (derecha inferior). Las células mostraban los rasgos característicos de apoptosis se observan comúnmente en células control, pero no en LNCaP-bcl-2 después de irradiación.

Fig 9B: Análisis de citometría de flujo de inducción de muerte celular después de irradiación de 20 Gy de irradiación \gamma en células LNCaP. Las células apoptópicas comprenden aproximadamente 30% de la población de células de control del vector LNCaP 8 horas después de la irradiación y < 5% en las células LNCaP-bcl-2 irradiadas.

Fig 10A y Fig 10B y 10C: inducción de p53, localización subcelular y control de transcripción.

Fig 10A: Análisis de transferencia de Western de inducción de proteína p53 e importación nuclear después de irradiación \gamma en células LNCaP control y LNCaP-bcl-2. Los cultivos por debajo de confluencia de células LNCaP control y LNCaP-bcl-2 se irradiaron con 20 Gy. Los extractos de las células enteras o núcleos aislados a partir de células enteras se prepararon 2 y 4 horas después de irradiación. Se analizaron cantidades equivalentes de lisados mediante inmunotransferencia con anticuerpo p53 (Santa cruz). Los barridos densitométricos correspondientes indican que la cantidad de proteína p53 inducida después de irradiación es aproximadamente equivalente en los extractos de células enteras de células LNCaP control y LNCaP-bcl-2. Sin embargo, la acumulación nuclear de proteína p53 se observa solamente en los núcleos aislados a partir de células control LNCaP.

Fig 10B: Análisis microscópico focal de localización subcelular de p53 después de irradiación. Células LNCaP control (izquierda) y LNCaP-bcl-2 (derecha) se irradiaron con 20 Gy, se fijaron después de 4 horas, y se representó la proteína p53 mediante microscopía láser confocal de barrido. La localización nuclear de la proteína p53 se observó solamente en células control de LNCaP.

Fig 10C: Inhibición de Bcl-2 de activación de la transcripción mediante wt-p53. Se transfectaron células NIH3T3 con el plásmido de p53 efector de tipo salvaje (P53 WT) o mutante (P53 MUT) (10 \mug), plásmido indicador P2mdm2-Luc (4 \mug) y plásmido de expresión de \beta-galactosidasa (\betagal) (3 \mug) con o sin el vector de expresión bcl-2 (BCL-2) (20 \mug) usándole procedimiento del fosfato de calcio. La cotransfección con el vector efector vacío (VECTOR) sirvió como un control negativo. Los datos representan el nº de veces de incremento en la actividad de la luciferasa. Bcl-2 inhibía significativamente la capacidad de la proteína p53 de tipo salvaje para transactivar el promotor mdm2 (* p \leq 0,02).

Fig 11A y Fig 11B: regulación hacia debajo de bcl-2 en células de cáncer de colon RKO mediante oligonucleótidos de sentido contrario y localización de p53.

Fig 11A: regulación hacia abajo selectiva de la proteína bcl-2 en células de cáncser de colon RKO. La transferencia de Western de extractos de células enteras (40 \mug) se analizó mediante inmunotransferencia para la proteína bcl-2. Se muestra una representación gráfica de la cantidad relativa de proteína bcl- 2 después de la normalización para la carga de proteína. El tratamiento con oligonucleótidos de sentido contrario bcl-2, pero no oligonucleótidos de control o liposomas vacíos, dio como resultado una reducción en la cantidad de de proteína bcl-2.

Fig 11B: microscopía focal de proteína p53 en células RKO irradiadas tratadas con oligonucleótidos de control (arriba) u oligonucleótidos bcl-2 de sentido contrario (abajo). Se observa localización nuclear significativa de la proteína p53 después de la irradiación en células RKO tratadas con bcl-2 de sentido contrario.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

bcl-2 es un encogen con potencial tumorigénico debido a su capacidad de bloquear la muerte celular programada. La presente invención emplea oligonucleótidos de sentido contrario liposomales para inhibir la producción de bcl-2 de manera que las células tumorales pueden recuperar la capacidad de entrar en la muerte celular programada. la presente invención también se puede usar para tratar malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, que incluye linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica y discrasia de células de plasma; tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes, que están asociados con la expresión de Bcl-2. Tales enfermedades incluirían las células implicadas que sobreexpresan, o expresan un alto nivel de Bcl-2 y que también expresan Bax.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden oligonucleótidos y polinucleótidos de sentido contrario dirigidos a porciones del gen bcl-2 y su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con Bcl-2. Un tipo específico de cáncer que se puede tratar por las composiciones de la presente invención es Fl. Por encima del 90% de pacientes con linfoma folicular tienen una translocación t (14; 18) que da como resultado la translocación del gen bcl-2 de su localización normal en el cromosoma 18 al locus del gen de la cadena pesada de inmunoglobulina en el cromosoma 14. En consecuencia, el gen bcl-2 está bajo la influencia del potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina, y la proteína Bcl-2 se sobreexpresa. Ya que bcl-2 es un encogen con potencial tumorigénico debido a su capacidad para bloquear la muerte celular programada. La presente invención espera tener éxito cuando otros planteamientos fracasado mediante la incorporación de oligonucleótidos de sentido contrario estables, resistentes a nucleasa y más específicamente, para el sitio de inicio de de la traducción del ARNm Bcl-2, en liposomas neutros para la administración en la células inhibir la producción de proteína Bcl-2.

En particular se contempla que mediante el uso de estas moléculas de sentido contrario, o bien solas o en combinación con otras moléculas de sentido contrario, es posible tratar de manera eficaz FL, y posiblemente otros cánceres de Bcl-2. Por ejemplo, como se muestra en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos de sentido contrario de bcl-2 (L-bcl-2) inhiben el crecimiento de células FL y otras células que sobreexpresan la proteína Bcl-2. En la práctica de la invención, se pueden emplear los propis oligo- o polinucleótidos, o los vectores de expresión que codifican los mismos. El procedimiento preferido de administración de estos ácidos nucleicos es mediante liposomas, y en particular los liposomas que están hechos de lípidos neutros. La invención, en sus diversas realizaciones, se describe en mayor detalle más adelante.

A. Polinucleótidos y oligonucleótidos

El término "de sentido contrario" pretende referirse a moléculas de polinucleótido complementarias a una porción de ARN Bcl-2, o los ADN correspondientes a ellos. Oligonucleótidos "Complementarios" son aquellos que son capaces de apareamiento de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crack convencionales. Es decir, las purinas mayores aparearán las bases con las pirimidinas más pequeñas para formatcombinaciones de apareamiento de guanina con citosina (G) y adenina apareada con o bien timina timina (A:T) en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN. la inclusión de las bases menos comunes tales como inopina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras en la hibridación de secuencias puede ofrecer ciertas ventajas en algunos casos y no interfiere con el apareamiento.

La dirección de ADN de doble cadena (ds) con polinucleótidos conduce a la formación de la triple hélice; la dirección de ARN conducirá a la formación de doble hélice. Los polinucleótidos de sentido contrario, cuando se introducen en una célula diana, específicamente se unen a su polinucleótido diana e interfieren con la transcripción, procesamiento de ARN, transporte, traducción y/o estabilidad. Las construcciones de ARN de sentido contrario, o ADN que codifica tales ARN de sentido contrario, se pueden empelar para inhibir la transcripción o traducción de genes o ambas dentro de una célula hospedadora, o bien in vitro o in vivo, tal como dentro de un animal, incluyendo un sujeto humano.

La concentración intracelular de catión monovalente es aproximadamente 160 mM (10 mM de Na^{+}; 150 mM de K^{+}). La concentración intracelular de catión divalente es aproximadamente 20 mM (18 mM de Mg^{++}; 2 mM de Ca^{++}). La concentración intracelular de proteína que serviría para disminuir el volumen de hibridación y, por lo tanto, incrementan la concentración eficaz de especies de ácido nucleico, es de aproximadamente 150 mg/ml. Las construcciones se pueden ensayar in vitro en condiciones que imitan estas condiciones in vivo.

Las construcciones de sentido contrario se pueden diseñar para unirse al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso límites exón-intrón de un gen. Se contempla que las construcciones de sentido contrario más eficaces para la presente invención incluirán regiones complementarias con el sitio de partida del ARNm. Se puede ensayar fácilmente tales construcciones simplemente ensayando las construcciones in vitro para determinar si los niveles de la proteína diana están afectados. Tal ensayo se puede realizar transfiriendo moléculas de ácido polinucleico desnudas a la célula mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, o primero asociando las moléculas de ácido nucleico con uno o más lípidos. De manera similar, la inhibición perjudicial no específica de la síntesis de proteína también se puede medir determinando la viabilidad de la célula diana in vitro.

Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "complementario" o "de sentido contrario" significan polinucleótidos que son sustancialmente complementarios sobre su longitud entera y tienen muy pocas faltas de coincidencia de base. Por ejemplo, la secuencia de quince bases en longitud se puede denominar complementariedad cuando tienen un nucleótido complementario en trece o catorce posiciones de quince. Naturalmente, las secuencias que "completamente complementarias" o "complementos de longitud completo" serán secuencias que son totalmente complementarias a lo largo de su longitud entera y no tienen faltas de coincidencia de bases.

Otras secuencias con bajos grados de homología también se contemplan. Por ejemplo, una construcción de sentido contrario que tiene regiones limitadas de alta homología, pero también contiene una región no homóloga (por ejemplo, una ribozima) se podría designar. Estas moléculas, aunque tienen menos de un 50% de homología, se uniría a secuencias diana en condiciones apropiadas.

Los polinucleótidos descritos anteriormente pueden codificar un gen bcl- 2 o una parte de se gen que es suficiente para efectuar la inhibición de sentido contrario de la expresión de proteína. Los polinucleótidos se pueden derivar de ADN genómico, es decir clonado directamente del genoma de un organismo particular. Sin embargo, en otras realizaciones, los polinucleótidos pueden ser ADN complementario (ADNc). El ADNc es ADN preparado usando ARN Messenger (ARNm) como molde. De este modo, un ADNc no contiene ninguna secuencia de codificación interrumpida y usualmente contiene casi exclusivamente la(s) región(es) codificadora(s) para la proteína correspondiente. En otras realizaciones, el polinucleótido de sentido contrario se puede producir sintéticamente.

Puede ser ventajoso combinar partes de ADN genómico con ADNc o secuencias sintéticas para generar construcciones específicas. Por ejemplo, cuando se desea un intrón en la última construcción, un clon genómico se necesitará usar. El ADNc o polinucleótido sintetizado puede proporcionar más sitios de restricción convenientes para la parte restante de la construcción, por lo tanto, se usaría para el resto de la secuencia.

Las secuencias de ADN y proteína para Bcl-2 se publican en la bibliografía por Tsujimoto y Croce, (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 83: 5214, 1986) (SEQ ID Nº: 4, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 6 y SEQ ID Nº: 7) que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia. Se contempla que las variantes naturales de Bcl-2 existen de manera que tienen secuencias diferentes de las descritas en esta memoria descriptiva. De este modo, la presente invención no se limita al uso de la secuencia de polinucleótidos proporcionada para Bcl-2 sino, que mejor, incluye el uso de cualesquiera variantes de origen natural. Dependiendo de la secuencia particular de tales variantes, pueden proporcionar ventajas adicionales en términos de selectividad diana, es decir, evitan la inhibición de sentido contrario no deseado de transcripciones relacionadas. La presente invención también abarca los mutantes sintetizados químicamente de estas secuencias.

Como se ha establecido anteriormente, aunque las secuencias de sentido contrario pueden ser copias genómicas o de ADNc de longitud completa, o grandes fragmentos de los mismos, también pueden ser fragmentos más cortos, u "oligonucleótidos" definidos en esta memoria descriptiva como polinucleótidos de 50 bases o menos. Aunque son más fáciles de preparar oligómeros más cortos (8-20) e incrementar la accesibilidad in vivo, están implicados numerosos otros factores en la determinación de la especificidad o apareamiento de bases. Por ejemplo, tanto afinidad de unión como especificidad de secuencias de un oligonucleótido a su incremento diana complementario con incremento de longitud. Se contempla que se pueden usar oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 ó 50 pares de bases o mayores. Aunque se puede empelar toda o parte de la secuencia de genes en el contexto de la construcción de sentido contrario, estadísticamente, cualquier secuencia de 17 bases de longitud se produciría solamente una vez más en el genoma humano y, por lo tanto, basta para especificar una única secuencia
diana.

En ciertas realizaciones, se puede desear emplear construcciones de sentido contrario que incluyen otros elementos, por ejemplo, los que incluyen C-5 propino pirimidinas. Los oligonucleótidos que contienen análogos de C-5 propino de uridina u histidina se ha mostrado que unen a ARN con alta afinidad y son potentes inhibidores de sentido contrario de la expresión génica (Wagner y col., 1993). En la práctica de la invención, se pueden usar polinucleótidos derivatizados o análogos de fosfodiéster tales como p-etoxi o metil fosfonatos oligonucleótidos. Tales polinucleótidos pueden ofrecer ciertas ventajas tales como resistencia a nucleasa. Un descubrimiento de los presentes inventores que los p-etoxi oligonucleótidos, que son hidrófobos son también ventajosos porque se incorporar de manera más eficaz en los liposomas.

Como una alternativa a la administración de sentido contrario dirigida, se pueden usar ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima basada en ARN capaz de dirigir y escindir secuencias de bases particulares tanto en ADN como ARN. Las ribozimas se pueden o bien dirigir directamente a las células, en la forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozima, o se introducen en la célula como un vector de expresión que codifica el ARN de la ribozima deseado. Las ribozimas se pueden usar y aplicar de la misma manera que se ha descrito para polinucleótido de sentido contrario. Las secuencias de ribozimas también se pueden modificar de la misma manera que se ha descrito para el polinucleótido de sentido contrario. Por ejemplo, se podría incorporar bases no Watson-Crack, o prepara oligonucleótidos de ARN/ADN mixtos, o modificar la estructura central de fosfo-
diéster.

Como alternativa, los oligo- y polinucleótidos de sentido contrario se pueden proporcionar como ARNm mediante la transcripción de construcciones de expresión que llevan ácidos nucleicos que codifican los oligo- o polinucleótidos. A los largo de esta solicitud, el término "construcción de expresión" significa que incluye cualquier tipo de construcción genética que contiene un ácido nucleico que codifica un producto de sentido contrario en cuya parte o toda la secuencia de ácido nucleico es capaz de transcribirse. Los vectores de expresión típicos incluyen plásmidos bacterianos o fago, tales como cualquiera de la serie de plásmido pUC o Bluescript^{TM} o, como se describe adicionalmente más adelante, vectores virales adaptados para uso en células eucarióticas.

En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codifica un oligo- o polinucleótido de sentido contrario bajo control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica d un gen. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la localización y orientación correcta en relación con el ácido nucleico para controlar el inicio de la ARN polimerasa.

El término promotor se usará en esta memoria descriptiva para referirse a un grupo de módulos de control de la transcripción que se agrupan alrededor del sitio de inicio de la ARN polimerasa II. Mucho del pensamiento sobre cómo los promotores se organizan deriva de los análisis de varios promotores virales, incluyendo aquellos para las unidades de transcripción temprana de la HSV timidina quinasa (tk) y SV40. Estos estudios, aumentados por trabajos recientes, han mostrado que los promotores están compuestos por módulos funcionales discretos, consistiendo cada uno en aproximadamente 7-20 pares de bases de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras o represoras de la transcripción.

Al menos un módulo en cada promotor funciona para posicionar el sitio de partida para la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tal como el promotor para el gen de desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que está encima del propio sitio de partida ayuda a fijar el sitio de inicio.

Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio de la transcripción. Típicamente, éstos están localizados en la región de 30-110 pares de bases cadena arriba del sitio de partida, aunque se han mostrado recientemente un número de promotores que contienen elementos funcionales cadena abajo del sitio de partida también. El espacio entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de manera que la función promotora está preservada cuando los elementos están invertidos o movidos entre sí. En el promotor de tk, el espacio entre los elementos promotores se puede incrementar hasta 50 pares de bases separados antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, aprese los elementos individuales pueden o bien funcionar cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.

El promotor particular que se emplea para controlar la expresión de un ácido nucleico que codifica el péptido inhibidor no se cree que sea importante, de manera que sea capaz de expresar el péptido en la célula dirigida. De este modo, cuando se dirige una célula humana, es preferible posicionar el ácido nucleico que codifica el péptido inhibidor adyacente a y bajo el control de un promotor que es activo en la célula humana. Hablando en términos generales, tal promotor pudiera incluir un promotor o bien humano o viral.

En diversas realizaciones, el promotor génico temprano inmediato de citomegalovirus humano, el promotor temprano de SV40 y la repetición terminal del virus de Sarcoma Rous se puede usar para obtener alto nivel de expresión de diversas proteínas. El uso de otros promotores de fago celular o bacteriano de virus o de mamíferos que se conocen en la técnica que logran la expresión de los péptidos descritos anteriormente se contempla también, con tal que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado.

Mediante el empleo de un promotor con propiedades bien conocidas, el nivel y patrón de expresión de un oligonucleótido o polipéptido de sentido contrario se puede optimizar. Además, la selección de un promotor que se regula en respuesta a señales específicas fisiológicas pueden permitir la expresión inducible de una proteína inhibidora. Por ejemplo, un ácido nucleico bajo el control del promotor PAI-1 humano da como resultado la expresión inducible por el factor de necrosis tumoral. Las tablas 1 y 2 listan varios elementos/promotores que se pueden emplear, en el contexto de la presente invención, para regular la expresión de construcciones de sentido contrario. Esta lista no pretende que sea exhaustiva de todos los posibles elementos implicados en la promoción de la expresión pero, meramente, para ser ejemplares solamente.

Los potenciadotes se detectaron originalmente como elemento genéticos que incrementaban la transcripción a partir de un promotor localizado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Esta capacidad de actuar en una gran distancia tenía un pequeño precedente en estudios clásicos de regulación de la transcripción procariótica. Un trabajo posterior mostraba que las regiones de ADN con actividad potenciadora son promotores muy similares organizados. Esto es, están compuestos de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a uno o más proteínas de transcripción.

La distinción básica entre potenciadores y promotores es operacional. Una región potenciadora en conjunto debe ser capaz de estimular la transcripción a una distancia; esta necesidad no es a nivel de una región promotora o sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirigen el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y potenciadores están a menudo superpuestos y contiguos, a menudo pareciendo tener una organización modular muy similar.

Más adelante hay una lista de promotores virales, promotores/potenciadores celulares y promotores/potenciadores inducibles que se podrían usar en combinación con el ácido nucleico que codifica un péptido inhibidor NF-IL6 en una construcción de expresión (Tabla 1 y Tabla 2). De manera adicional cualquier combinación de promotor/potenciador (según la Base de Datos de Promotores Eucarióticos EPDB) también se podría usar para dirigir la expresión de un ácido nucleico descrito anteriormente. El uso de un sistema de expresión citoplásmico de T3, T7 o SP6 es otra posible realización. Las células eucarióticas pueden apoyar la transcripción citoplásmica a partir de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, o bien como parte del complejo de administración o como una construcción de expresión genética adicional.

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TABLA 1

Promotor
Cadena pesada de inmunoglobulina	c-HA-ras
Cadena ligera de inmunoglobulina	Insulina
Receptor de células T	Molécula de adhesión de células neurales (NCAM)
HLA DQ \alpha y DQ \beta	\alpha1-Antitripsina
Interferón \beta	Histona H2B (TH2B)
Interleuquina-2	Colágeno de ratón o de tipo I
Receptor de interleuquina 2	Proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78)
MHC Clase II 5	Hormona de crecimiento de rata
MHC Clase II HLA-DR\alpha	Amiloide A de suero humano (SAA)
\beta-Actina	Troponina (TN I)
Creatina quinasa de músculo	Factor de crecimiento derivado de plaquetas
Prealbúmina (Transtiretina)	Distrofia muscular Duchenne
Elastasa/	SV40
Metalotioneína	Polioma
Colagenasa	Retrovirus
Gen de albúmina	Virus de papiloma
\alpha-Fetoproteína	Virus de la hepatitis B
\tau-Globina	Virus de inmunodeficiencia humana
\beta-Globina	Citomegalovirus
c-fso	Virus de leucemia Gibbon Ape

TABLA 2

Elemento	Inductor
MT II	Forbol Éster (TPA) metales pesados
MMTV (viris de tumor de mama de ratón)	Glucocorticoides
Interferón \beta	poli (ri) poli (rc)
Adenovirus 5 E2	Ela
c-jun 2	Forbol Éster (TPA), H_{2}O_{2}
Colagenasa	Forbol Éster (TPA)
Stromelisina	Forbol Éster (TPA), IL-1
SV40	Forbol Éster (TPA)
Gen MX murino	Interferón, virus de la enfermedad Newcastle
Gen GRP78	A23187
\alpha-2-macroglobulina	IL-6
Vicentina	Suero
HC Clase I Gen H-2kB	Interferón
HSP70	Ela, antígeno T grande de SV40
Proliferina	Forbol Éster (TPA)
Factor de necrosis tumoral	PHA
Gen \alpha de la hormona estimuladora de tiroides	Hormona del tiroides

En ciertas realizaciones de esta invención, la distribución de un ácido nucleico en una célula se puede identificar in vitro o in vivo incluyendo un marcador en la construcción de expresión. El marcador daría como resultado un cambio identificable a la célula transfectada que permite la fácil identificación de la expresión. Se pueden emplear las enzimas tales como la timidina quinasa (tk) del virus de herpes simplex (eucariótica) o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (procariótica).

También se puede incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada de la transcripción. la naturaleza de la señal de poliadenilación no se cree que sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y se puede emplear cualquiera de tales secuencias. Los ejemplos incluyen las señales de poliadenilación de SV40, globina o adenovirus. También contemplado como un elemento del módulo de expresión es un terminador. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles de mensaje y para minimizar la lectura a través del módulo en otras secuencias.

B. Formulaciones de lípidos

Los oligo- o polinucleótidos de sentido contrario y vectores de expresión descritos anteriormente están asociados con un lípido. Un polinucleótido asociado con un lípido. un polinucleótido asociado a un lípido se puede encapsular en el interior acuoso de un liposoma, entremezclado dentro de la bicapa de lípidos de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de unión que está asociado con tanto el liposoma como el polinucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o de otra manera asociado con un lípido. El lípido o composiciones asociadas a lípido/oligonucleótido de la presente invención no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden estar simplemente entremezclas en una solución, posiblemente formando agregados que no son uniformes ni o bien en tamaño ni en forma. Los lípidos pueden estar en la forma de liposomas conocidos en la técnica como vesículas múltiple lamelares, pequeñas o grandes vesículas unilamelares u otros tipos de vesículas conocidas en la técnica.

Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotitas grasas que se producen naturalmente en el citoplasma así como la clase de compuestos que son bien conocidos por los expertos en la técnica que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, amino alcoholes, y aldehídos. Un ejemplo es el lípido dioleoilfosfatidilcolina.

"Liposoma" es un término genético que abarca una diversidad de vehículos lípidos multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados de lípidos. Los liposomas pueden estar caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separados por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se someten a una auto transposición antes de la formación de estructuras cerradas y agua atrapada y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, en: Wu G. Wu C ed. Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligando, Nueva York; Marel Dekker, p. 87-104, 1991). Sin embargo, la presente invención también abarca composiciones que tienen diferentes estructuras en solución de la estructuravesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o existir meramente en forma de agregados no uniformes de moléculas de lípidos. También se contemplan complejos de lipofectamina-ácido nucleico.

La administración de polinucleótidos mediados por liposomas y la expresión de ADN extraño in vitro ha sido muy exitoso. Wong y col., (Gene, 10: 87-94, 1980) demostró la viabilidad de la administración mediada por liposomas y la expresión de ADN extraño en células de embrión de pollo, HeLa y de hematoma cultivadas. Nicolau y col., (Methods Enzymol., 149: 157-176, 1987) realizó la transferencia exitosa de genes mediada por liposoma en ratas después de inyección intravenosa.

En ciertas realizaciones de la invención, el lípido puede estar asociado a un virus de hematoglutinación (HVJ). Se ha mostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada en la célula de ADN encapsulado por liposoma (Kaneda y col., Science, 243: 375-378, 1989). En otras realizaciones, el lípido se puede complejar o emplear junto con proteínas cromosomas no histona (HMG-1) (Kato y col., J. Biol. Chem., 266: 3361-3364, 1991). En todavía otras realizaciones, el lípido se puede complejar o emplear junto con tanto HVJ como HGM-1. Ya que tales vectores de expresión se han empleado con éxito en la transferencia y expresión de un polinucleótido in vitro e in vivo, son aplicables para la presente invención. Cuando se emplea un promotor bacteriano en la construcción de ADN, también será deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.

Los fosfolípidos neutros se usan para preparar los liposomas.

Los lípidos adecuados para uso de acuerdo con la presente invención se pueden obtener a partir de fuentes comerciales. Por ejemplo, dimiristil fosfatidilcolina ("CMPC") se puede obtener a partir de Sigma Chemical Co., fosfato de dicetilo ("DCP") se obtiene a partir de K y K Laboratorios (Plainview, NY); colesterol ("Chol") se obtiene a partir de Calbiochem-Behring: dimiristoil fosfatidilglicerol ("DMPG" y otros lípidos se pueden obtener a partir de Avanti Polar Lipids. Inc. (Birmingham, Ala.). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenara aproximadamente -20ºC. Preferiblemente, el cloroformo se usa como el único disolvente ya que se evapora más fácilmente que el metanol.

Los fosfolípidos de fuentes naturales, tales como fosfatidilcolina de huevo o soja, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol de cerebro o plantas, cardiolipina de corazón y fosfatidiletanolamina de plantas o bacterias no se usan preferiblemente como el fosfátido primario, es decir, constituyendo 50% o más de la composición de fosfátido total, debido a la inestabilidad y debilidad de los liposomas resultantes.

Los liposomas usados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos diferentes. El tamaño de los liposomas varía dependiendo del procedimiento de síntesis. Un liposoma suspendido en una solución acuosa está generalmente en forma de una vesícula esférica, que tiene una o más capas concéntricas. Cada capa consta de una disposición en paralelo de moléculas representadas por la fórmula XY, en la que X es un resto hidrófilo e Y es un resto hidrófobo. En una suspensión acuosa, las capas concéntricas se disponen de manera que los restos hidrófilos tiendan a permanecer en contacto con una fase acuosa y las regiones hidrófobas tienden a autoasociarse. Por ejemplo, cuando las fases acuosas se presentan tanto dentro como sin liposoma, las moléculas de lípido pueden formar una bicapa, conocida como una lamela, de la disposición XY-YX. Los agregados de lípidos pueden formar cuando las partes hidrófilas e hidrófobas de más de una molécula de lípido asociada entre sí. El tamaño y forma de estos agregados dependerá de muchas variables diferentes, tales como la naturaleza del disolvente y la presencia de otros compuestos en la solución.

Los liposomas dentro del alcance de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con técnicas de laboratorio conocidas. En una realización preferida, los liposomas se preparan mezclando lípidos de liposomas, en un disolvente en un recipiente, por ejemplo, un matraz de vidrio en forma de pera. El recipiente debe tener un volumen diez veces mayor que el volumen de la suspensión esperada de liposomas. Usando un evaporador rotatorio, el disolvente se retira a aproximadamente 40ºC bajo presión negativa. El disolvente normalmente se retira en aproximadamente 5 minutos, a 2 horas, dependiendo del volumen deseado de los liposomas. Las composiciones se pueden secar adicionalmente en un desecador a vacío. Los lípidos secos generalmente se desechan después de aproximadamente 1 semana debido a una tendencia a deteriorarse con el tiempo.

Los lípidos secos se pueden hidratar a aproximadamente 25-50 mM de fosfolípido en agua estéril, exenta de pirógenos agitando hasta que toda la película de lípido se ha resuspendido. Los liposomas acuosos se pueden después separar en alícuotas, cada una se coloca en un vial, se liofiliza y se sella a vacío.

Como alternativa, los liposomas se pueden preparar de acuerdo con otros procedimientos de laboratorios conocidos: el procedimiento de Bangham y col., (J. Mol. Biol., 13: 238, 1965), cuyo contenido se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia; el procedimiento de Gregoriadis, como se describe en DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) p. 287-341, cuyo contenido se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia; el procedimiento de Deamer y Uster, (LIPOSOMES, M. Ostro ed. 1983), cuyo contenido se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia; y el procedimiento de evaporación de fase inversa como describen Szoka y Papahadjopoulos, (Proc. Nat'l Acad Sci, Estados Unidos. 75: 4194-98 1978). Los procedimientos anteriormente mencionados se diferencian de sus respectivas capacidades de atrapar material acuoso en sus relaciones respectivas espacio acuoso a lípido.

Los lípidos secos o liofilizados preparados como se ha descrito anteriormente se pueden deshidratar y reconstituir en una solución de péptido inhibidor y diluirse hasta una concentración apropiada con un disolvente adecuado, por ejemplo, DPBS. La mezcla se agita después vigorosamente en un mezclador Vortex. El ácido nucleico no encapsulado se retira mediante centrifugación a 29.000 x g y se lavan los gránulos de liposomas. Los liposomas lavados se resuspenden a una concentración de fosfolípidos total apropiada, por ejemplo, aproximadamente 50-200 mM. la cantidad de ácido nucleico encapsulado se puede determinar de acuerdo con procedimientos convencionales. Después de la determinación de la cantidad de ácido nucleico encapsulado en la preparación de liposomas, los liposomas se pueden diluir hasta concentraciones apropiadas y almacenarse a 4ºC hasta uso.

Los p-etoxi oligonucleótidos, análogos resistentes a nucleasa de fosfodiésteres, se prefieren debido a que son estables en suero y se transportan de manera eficaz en el citoplasma celular. En una realización preferida se emplea la lípido dioleoilfosfatidilcolina. Sin embargo también pueden ser útiles otros lípidos tales como otras fosfatidilcolinas, fosfatidilgliceroles, y fosfatidil etanolaminas. Los oligonucleótidos resistentes a nucleasa se mezclan con lípidos en presencia de un exceso de butanol. Las mezclas se someten a un aparato Vortex antes de congelarse rn un baño de acetona/hielo seco. La mezcla congelada se liofiliza y se hidrata con solución salina tamponada con Hepes (Hepes 1 mM, NaCl 10 mM, pH 7,5) durante toda una noche, y después los liposomas se sonican en un sonicador de tipo baño durante 10 a 15 minutos. El tamaño de los oligonucleótidos de liposomas típicamente varía entre 200-300 nm de diámetro como se determina mediante el aparato que determina tamaño de partículas submicrónicas modelo 370 (Nicomp, Santa Bárbara, CA).

C. Sistemas de administración alternativos

Retrovirus. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de cadena sencilla caracterizados por una capacidad en convertir su ARN en ADN de doble cadena en células infectadas de transcripción inversa (Coffin, en Virology, Fields y col (eds.), Nueva York; Raven Press, p. 1437-1500, 1990). Después el ADN resultante se integra de manera estable en cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención del virus de las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres geens-gag, pol, y env- que codifican las proteínas de la cápsida, la enzima polimerasa, y componentes de envuelta, respectivamente. Una secuencia encontrada cadena abajo del gen gag, llamada \psi, funciona como una señal para empaquetar el genoma en los virones. Dos secuencias largas de repetición terminal (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Éstos contienen secuencias de promotor y potenciador fuertes y también se requieren para la integración en el genoma de la célula hospedadora (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retroviral, un ácido nucleico que codifica una construcción de sentido contrario Bcl-2 se inserta en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuosa en replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y \psi (Mann y col., Cell, 33: 153-159, 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADN insertado, junto con las secuencias LTR y \psi retrovirales, se introduce en esta línea celular (mediante precipitación con fosfato de calcio por ejemplo), la secuencia \psi permite la transcripción de ARN del plásmido recombinante a empaquetar en partículas virales, que después se secretan en el medio de cultivo (Nicolas Y Rubenstein, en Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez y Denhardt, (eds), Stoneham: Butterworth, p. 494-513, 1988; Temin, en Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York; Plenum Press, p. 149-188, 1986; Mann y col., 1983). El medio que contiene los retrovirus recombinantes se recogen después, se concentran de manera opcional, y se usan para transferencia génica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia diversidad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable requieren la división de células hospedadoras (Paskind y col., Virology, 67: 242-248, 1975).

Adenovirus: Los adenovirus humanos son virus de tumores de ADN de cadena doble con tamaño de genoma de aproximadamente 36 KB. Como un sistema modelo para la expresión génica eucariótica, los adenovirus se han estudiado ampliamente y se han caracterizado bien, que les hace un sistema atractivo para el desarrollo de adenovirus como un sistema de transferencia génica. este grupo de virus es fácil de desarrollar y manipular, y muestran un amplio intervalo de hospedador in vitro o in vivo. En células infectadas de manera lítica, los adenovirus son capaces de cerrar la síntesis de proteínas en el hospedador, dirigiendo las maquinarías celulares para dirigir grandes cantidades de proteínas virales, y produciendo cantidades copiosas de virus.

La región E1 del genoma incluye E1A y E1B que codifican proteínas responsables para la regulación de la transcripción del genoma viral, así como unos pocos geens celulares. La expresión E2, que incluye E2A y E2B, permite la síntesis de funciones replicadoras virales, por ejemplo, proteína de unión de ADN, ADN polimerasa, y una proteína terminal que prepara la replicación. Los productos del gen E3 evitan la histolisis por células T citotóxicos y factor de necrosis tumoral y parecen ser importantes para la propagación viral. Las funciones asociadas a las proteínas E4 incluyen la replicación de ADN, expresión génica tardía, y cierre de célula hospedadora. Los productos génicos tardíos incluyen la mayoría de las proteínas de cápside de virión, y éstas se expresan solamente después de que la mayoría del procesamiento de una única transcripción primaria a partir del promotor tardío principal se haya producido. El promotor tardío principal (MLP) muestra una alta eficiencia durante la fase tardía de la infección (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, p. 51-61, en Human Gene Transfer, Eds, O. Cohen-Haguenauer y M. Boiron Eddiciones John Libbey Exrotext, Francia, 1991).

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Como sólo una pequeña parte del genoma viral parece que se requiere en vectores derivados de adenovirus en cis ofrecen excelente potencial para la sustitución de grandes fragmentos de ADN cuando se usan junto con líneas celulares tales como 293 células. Las líneas celulares de riñón embrionario humano transformado de Ad5 (Graham y col., J. Gen. Virol., 36: 59-72, 1977) se han desarrollado para proporcionar las proteínas virales esenciales en trans.

Las ventajas particulares de un sistema de adenovirus para distribuir proteínas extrañas a una célula incluyen (i) la capacidad de sustituir piezas relativamente grandes de ADN viral por ADN extraño; (ii) la estabilidad estructural de adenovirus recombinantes; (iii) la seguridad de administración adenoviral a seres humanos; y (iv) carencia de cualquier asociación conocida de infección adenoviral con cáncer o malignidades; (v) la capacidad de obtener valoraciones del virus recombinante; y (vi) la alta infectividad de adenovirus.

Las ventajas adicionales de vectores de adenovirus incluyen los niveles más altos de expresión génica. De manera adicional, la replicación de adenovirus es independiente de la replicación génica del hospedador, diferente de las secuencias retrovirales. Debido a que los genes de transformación de adenovirus en la región E1 se puede suprimir fácilmente y proporcionar todavía vectores de expresión eficaces, riesgo oncogénico de vectores de adenovirus se cree que son insignificantes (Grunhaus y Horwitz, Seminal in Virology, 3: 237-252, 1992).

En general, los sistemas de transferencia de genes de adenovirus se basan en adenovirus recombinantes, modificados por ingeniería genética que se hacen incompetentes a la replicación mediante supresión de una parte de su genoma, tal como E1, y todavía incluso mantiene su competencia para infección. Las secuencias que codifican proteínas relativamente grandes se pueden expresar cuando se realizan supresiones adicionales en el genoma de adenovirus. Por ejemplo, los adenovirus suprimidos tanto en las regiones E1 como E2 son capaces de llevar hasta 10 kB de ADN extraño y se pueden desarrollar hasta altas valoraciones en células 293 (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991). Sorprendentemente la expresión persistente de transgenes después de la infección adenoviral también se
ha reseñado.

Otros vectores virales como construcciones de expresión. Otros vectores virales se pueden emplear como construcciones de expresión en la presente invención. Los vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, Stoneham; Butterworth, p. 467-492, 1988; Baichwal y Sugden, en Kucherlapati R, (ed.) Gene transfer. Nueva York: Plenum Press, p. 117-148, 1986; Coupar y col., Gene, 68: 1-10, 1988) virus asociados a adeno (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Hermonat y Muzycska, Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 81: 6466-6470, 1984) y virus herpes se pueden emplear. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamíferos (Friedman y col., Genes Devel. 3: 1314, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988; Horwich y col., J. Virol. 64: 642-650, 1990).

Con el reconocimiento reciente de los virus de la hepatitis B defectuosos, nuevos entendimientos se han conseguido en la relación estructura-función de diferentes secuencias virales, estudios in vitro mostraron que los virus retendrían la capacidad de empaquetamiento dependiente de células auxiliares y transcripción inversa a pesar de la supresión de hasta 80% de su genoma (Horwich y col., 1990). Esto sugiere que grandes partes del genoma se podrían reemplazar con material genético extraño. El hepatotropismo y persistencia (integración) eran propiedades particularmente atractivas para la transferencia génica dirigida por el hígado. Chang y col., (Hepatology, 14: 134A, 1991) recientemente introducía el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en el genoma del virus de la hepatitis B de pato en lugar de la polimerasa, secuencias codificadoras de superficie y presuperficie. Se cotransfectó con el virus de tipo salvaje en una línea celular de hematoma aviar. Medio de cultivo que construía altas valoraciones del virus recombinante se usaron para infectar hepatocitos de pato primarios. La expresión génica de CAT estable se detectó durante al menos 24 días después de la transfección (Chang y col., 1991).

Procedimientos no virales. varios procedimientos virales para la transferencia de vectores de expresión en células de mamífero cultivadas también están contempladas por la presente invención. Estos incluyen precipitación por fosfato de calcio (Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol Cell Biol., 7: 2745-2752, 1987; Rippe y col., Mol. Cell. Biol, 10: 689-695, 1990) DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985) Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985), electroporación (Tur-Kaspa y col., Mol. Cell Biol., 6: 716-718, 1986; Potter y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 81: 7161-7165, 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-1099, 1985), mliposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, Biochem. Biophys. Acta, 721: 185-190, 1982; Fraley y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 76: 3348-3352, 1979) y complejos de lipofectamina-ADN, sonificación de células (Fecheimer y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 76: 3348-52, 1979), bombardeo génico usando microproyectiles de alta velocidad (Yang y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 87: 9568-9572, 1990), policationes y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432, 1987; Wu y Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988). Alguno de estas técnicas se pueden adaptar de manera exitosa para uso in vivo o
ex vivo.

En una realización de la invención, la construcción de expresión puede simplemente consistir en un vector recombinante desnudo. La transferencia de la construcción se puede realizar mediante cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente que físicamente o químicamente permeabilizan la membrana celular. Por ejemplo, Dubensky y col., (Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 81: 7529-7533, 1984), inyectaba de manera exitosa ADN de poliomavirus en la forma de CaPO_{4} precipita en hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos que demuestran la replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif (Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 83: 9651, 1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados por CaPO_{4} dan como resultado la expresión de genes transfectados. Se contempla que el ADN que codifica una construcción Bcl-2 también se puede transferir de una manera similar in vivo.

La transferencia de un vector de expresión de ADN desnudo en células puede implicar el bombardeo de partículas. este procedimiento depende de la capacidad de acelerar micropartículas revestidas de ADN hasta una alta velocidad que les permite perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein y col., nature, 327: 70-73, 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar pequeñas partículas. Uno de tales dispositivos depende de una descarga de alta tensión para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motora (Yang y col., 1990). Las micropartículas usadas han constado de sustancias biológicamente inertes tales como perlas de tungsteno u oro.

Se han bombardeado in vivo órganos seleccionados que incluyen el hígado, piel, y tejido muscular de ratas y ratones (Yang y col., 1990; Zelenin y col., FEBS Lett., 280: 94-96, 1991). Esto puede requerir exposición quirúrgica del tejido o células, para eliminar cualquier tejido intermedio entre la pistola y el órgano diana. El ADN que codifica una construcción de Bcl-2 se puede administrar mediante este procedimiento.

D. Composiciones farmacéuticas y vías de administración

Cuando se aborda la aplicación clínica de liposomas que contienen oligo- o polinucleótidos de sentido contrario o vectores de expresión, será necesario preparar el complejo de liposomas como una composición farmacéutica apropiada para la solicitud pretendida. En general, esto supondrá la preparación de una composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos, así como cualquiera de otras impurezas que podrían ser perjudiciales para los seres humanos o animales. En general también será deseable emplear tampones apropiados para hacer el complejo estable y permitir la captación por células diana.

Las composiciones acuosas de la reivindicación 11 comprenden una cantidad eficaz del vector expresión encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, dispersado adicionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Tales composiciones también se denominan inóculo. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra no deseada cuando se administra a un animal, o un ser humano, según sea apropiado.

Como se usa en esta memoria descriptiva, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los disolventes, medio de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de tal medio y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conocen bien en la técnica. Excepto en el grado en que cualquier medio convencional o agente es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar en las composiciones ingredientes suplementariamente activos.

Las soluciones de composiciones terapéuticas se pueden preparar en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polieilenglicoles líquidos, las mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones terapéuticas se administran de manera ventajosa en la forma de composiciones inyectables o bien en forma de soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de inyección también se pueden preparar. Estas preparaciones también pueden estar emulsionadas. Una composición típica para tal propósito comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener 10 mg, 25 mg, 50 mg o hasta aproximadamente 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de solución salina tamponada con fosfato. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares.

Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro sódico, solución de Ringer dextrosa, etc. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de nutrientes. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con parámetros bien conocidos.

Son adecuadas formulaciones adicionales para administración oral. Las formulaciones orales incluyen excipientes típicos tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. Cuando la vía es tópica, la forma puede ser una crema, pomada, ungüento o pulverización.

Las composiciones terapéuticas pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones terapéuticas serán mediante cualquier vía común mientras que el tejido diana esté disponible mediante esa vía. Esto incluye, oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. La administración tópica sería particularmente ventajosa para el tratamiento de cánceres de piel, para prevenir la alopecia inducida por quimioterapia u otro trastorno hiperproliferativo dérmico. Como alternativa, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones se administrarán normalmente en forma de composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos, tampones u otros excipientes fisiológicamente aceptables. Para el tratamiento de afecciones de los pulmones, la vía preferida es aerosol administrado al pulmón. El volumen de aerosol está entre aproximadamente 0,01 ml y 0,5 ml. De manera similar, un procedimiento preferido para el tratamiento de enfermedad asociada a colon sería mediante enema. El volumen del enema está entre aproximadamente 1 ml y 100 ml.

Una cantidad eficaz de la composición eficaz se determina basándose en el objetivo propuesto. El término "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición terapéutica para producir las respuestas deseadas, descritas anteriormente, en asociación con su administración, es decir, la vía apropiada y régimen de tratamiento. La cantidad a administrar, tanto de acuerdo con el número de tratamientos como dosis unitaria, depende de la protección
deseada.

Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del juicio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado físico y clínico del paciente, la vía de administración, el objetivo pretendido de tratamiento (alivio de síntomas contra cura) y la potencia, estabilidad y toxicidad de la sustancia terapéutica en particular. Para la presente solicitud, se contempla que la cantidad del péptido terapéutico incluida en una dosis unitaria variará entre aproximadamente 5-30 mg de polinucleótido.

E. Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de oligonucleótidos

Los p-etoxi oligonucleótidos resistentes a nucleasa, análogos de fosfodiésteres no iónicos, se compraron de Oligo Therapeutics (Wilsonville, OR). Un oligonucleótido específico para el sitio de inicio de traducción. Se usaron dos oligonucleótidos de control diferentes: ^{5'} CAGCGTGCGCCATCCTTC ^{3'} (SEQ ID Nº 1) se usó como oligonucleótido de sentido contrario. Se usaron dos oligonucleótidos de control diferentes: ^{5'} ACGGTCCGCCACTCCTTCCC ^{3'}
(SEQ ID Nº: 2) (versión mezclada de oligonucleótido de sentido contrario Bcl-2) y la secuencia aleatoria ^{5'} CT
GAAGGGCTTCTTCC ^{3'} (SEQ ID Nº: 3).

Ejemplo 2 Preparación de oligonucleótidos de liposoma (L-OS)

Los p-etoxi oligonucleótidos disueltos en agua destilada se añadieron a fosfolípidos (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) en la presencia de exceso de terc-butanol (\geq 95% por volumen). La mezcla se congeló en un baño de hielo seco/acetona, se liofilizó durante toda una noche y finalmente se hidrató con solución salina tamponada con HEPES (1 mmol/l de Hepes y 10 mmol/l de NaCl) a una concentración de oligonucleótido final de 0,1 mmol/l. Los oligonucleótidos liposomales (L-OS) se sonicaron durante 12 minutos en un sonicador de tipo baño. El diámetro medio de las partículas era 100 nm \pm 50 nm como se determina en un sistema determinante de tamaño de partícula NICOMP (Santa Bárbara, CA).

Ejemplo 3 Inhibición de oligonucleótidos de expresión de proteínas Líneas celulares

Se usaron células Johnson, una línea celular FL transformada humana que lleva la translocación t (14; 1B) que sobreexpresan Bcl-2. También se usaron células Raji y Jurkat, una línea celular de linfoma de Burkitt y una línea celular de leucemia de células T aguda humana, respectivamente. Ambas líneas expresan la proteína Bcl-2 pero carecen de la translocación t (14; 1B). Se usaron células Daudi, una línea celular de linfoma Burkitt humana que no expresa la proteína Bcl-2 como línea de celular de control negativa. Las células Johnson, Raji y Jurkat se desarrollaron en medio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY) complementado con suero fetal bovino al 10% inactivado por calor (FBS). Se hicieron crecer células Daudi en medio RPMI 1640 al 20% complementado con FBS inactivado por calor.

Distribución de células L-OS

Se sembraron 10.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en 0,1 ml del medio respectivo. Las células se incubaron con L-OS a una concentración final de 2 a 8 \mumoles/l a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5%. Cada estudio se realizó por triplicado y se repitió al menos 3 veces.

Ensayo de viabilidad celular

La viabilidad de las células neoplásicas se midió mediante el tinte alamarBlue (Alamar, Sacramento, CA). Después de 5 días de incubación con L-OS, 40 \mul de células/pocillo se separaron alícuotas y se añadieron a 140 \mul de medio reciente. Se añadieron 20 \mul de tinte alamarBlue a cada pocillo. Después de incubación durante 12 horas a 37ºC, se leyeron las placas directamente en un lector de microplacas (Molecular Devices, CA) a 570 y 595 nm. La diferencia en absorbancia entre 570 y 595 nm se tomó como el valor de absorbancia global de las células. Todos los experimentos se analizaron mediante el ensayo t en el que las viabilidades de las células tratadas con el L-OS se compararon con los de los controles no tratados.

Transferencia de Western para la proteína Bcl-2 y Bax

Se sembraron 100.000 células/pocillo en una placa de 6 pocillos en 3 ml del medio respectivo, se trataron con 2, 3 y 4 \mumoles/l de L-OS y se incubaron a 37ºC. Las células no tratadas también se mantuvieron en cultivo. Las muestras se retiraron el día 3 después de la adición del L-OS y se lisaron en 100 \mul de tampón de lisis (Triton al 1%, 150 mmoles/l de NaCl y 25 mmoles/l de Tris pH 7,4) a 0ºC durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos, se recuperaron los sobrenadantes y se normalizaron para un contenido en proteína total (5 \mug/banda de lisados de células Johnson y 20 \mug/banda de lisado de células Jurkat para análisis de Bcl-2, y 25 \mug/banda de células Johnson para análisis de Bax). Los lisados se mezclaron con tampón de muestra que contenía 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 1% de 2-\beta-mercaptoetanol y se sometieron a ebullición durante 5 minutos. Se desarrolló SDS-PAGE en ges de poliacrilamida al 10%, se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon en leche seca no grasa al 10%. Se cortaron los filtros en 2 porciones: la sección inferior se incubó con anticuerpo monoclonal anti-humano-Bcl-2 de hámster o anticuerpo policlonal anti-humano-Bax de conejo (Hockenbey y col., Nature, 348: 334, 1990), y la sección de arriba se incubó con anticuerpo monoclonal anti-actina de ratón (Amersham) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar e incubar con un anticuerpo secundario anti-hámster (Kikegaar y Perry), anti-conejo (Santa Cruz) o anti-ratón-(Amersham) marcado con peroxidasa, las manchas se desarrollaron mediante un sistema de quimioluminiscencia potenciada (ECL,
Amersham). Para estimular la inhibición de proteína Bcl-2 y la relación de proteínas Bcl-2/Bax, barridos densitométricos se realizaron en transferencias de Western en un Escáner Gilford Response Gel (CIBA Coming, Medfield, MA). Integración de área de picos de absorbancia a 500 nm se usó para determinar la relación de proteínas Bcl-2:Actina y
Bcl-2:Bax.

Análisis de apoptosis

Para determinar cuantitativamente la escisión de ADN internucleosomal asociada a apoptosis, se realizó análisis de fragmentación de ADN mediante electroforesis de gel de azarosa (Duke y col., en: Coligan y col., (eds) Current Protocols in inmunology, vol., Nueva York: John Wiley y Sons, p. 3.17.1, 1991. En resumen, se cultivaron 1 x 10^{6} células Johnson se cultivaron en 10 ml de medio en un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm cuadrados, se trataron con 4 \mumoles/l de L-OS, y se incubaron a 37ºC. Se mantuvieron también en cultivo células no tratadas. las muestras se retiraron en día 3 después de tratamiento, se lavaron en PBS y se sedimentaron centrifugaron 10 minutos a 200 x g. Los sedimentos se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis (10 mmoles/l de Tris pH 7,4, 1 mmol/l de EDTA pH 8,0 y 0,2% de Triton X-100) y se ADN fragmentado se separaron a partir de cromatina intacta mediante microcentrifugación durante 10 minutos a 13.000 x g. El Adn se los sobrenadantes se precipitó en 0,7 ml de isopropanol enfriado con hielo durante toda una noche a -20ºC, se volvieron suspender en 30 \mul de tampón TE (10 mmoles/l de Tris pH 7,4, 1 mmol/l de EDTA pH 8,0) y se incubaron en 10 \mul de ARNasa (10 pg/ml de solución) a 60ºC durante 1 hora. Se sometieron a electroforesis 20 \mul de muestra por pocillo en un gel de azarosa al 2% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.

Para determinar cuantitativamente el grado de apoptosis, se usó el tinte naranja de acridina fluorescente unido a ADN (Duke y col., 1991). En resumen, 5 \mumoles/l de concentración final de L-OS se añadieron a 1 x 10^{5} de células/pocillo se sembraron en una placa de 24 pocillos en 1 ml de medio. Después de 3 días de incubación a 37ºC, las células se lavaron con PBS y se volvieron a suspender a 1 x 10^{6} células/ml. Se mezclaron 25 ml de suspensión de células con 1 \mul de tinte de naranja de acridina (100 \mug/ml, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) y se observaron en un microscopio fluorescente. El porcentaje de células apoptópicas (índice apoptópico) se obtuvo usando un hemocitómetro. Índice apoptópico = (nº total de células con núcleos apaotópicos/nº total de células contadas) x 100%.

Efecto de oligonucleótidos de sentido contrario L-bcl-2 ("L-bcl-2") sobre el crecimiento de células de linfoma

Cinco días después de la dición de L-bcl-2 a las células, se determinó la viabilidad de células tumorales. El crecimiento celular se inhibió de una manera dependiente de la concentración en células Johnson, que llevan la translocación t (14; 18) y expresan niveles muy altos de Bcl-2. Una concentración de 6 \mumoles/l de L-bcl-2 dio como resultado la pérdida completa de viabilidad de células Johnson en cinco días (Fig. 1). Una disminución dependiente de la dosis similar en viabilidades de células se podría observar en tres estudios deparados. Por el contrario, después de tratamiento con 6 \mumoles/l de L-bcl-2, las viabilidades de células Jurkat, Raji y Daudi disminuyó en solamente 23%, 0% t 35%, respectivamente (Fig. 1).

Efecto de oligonucleótidos de control liposomal (oligos L-control) sobre el crecimiento de células de linfoma

Se usaron dos oligonucleótidos de control para determinar la especificidad de la inhibición observada. Cuando se añadieron oligos L-controil o liposomas vacíos a células Johnson, no se observó inhibición de crecimiento celular. También se trataron células Jurkat, Raji y Daudi con oligos L-control y liposomas vacíos. La toxicidad no específica se puede observar cuando se usan más de 6 \mumoles/l de L-OS, pero no con liposomas vacíos (Fig. 2).

Inhibición selectiva de proteína Bcl-2 mediante oligonucleótidos de sentido contrario L-bcl-2

Con el fin de determinar si el efecto citotóxico de L-bcl-2 en células Johnson se provocó por una disminución en la proteína Bcl-2, también se determinó la expresión de proteína Bcl-2 en estas células después de tratamiento con L-bcl-2 así como los efectos de L-bcl-2 en las otras líneas celulares que sobreexpresan la proteína Bcl-2 (Fig. 3).

Cuando las células Johnson se trataron 2, 3 y 4 mmoles/l de L-bcl-2, las relaciones de proteína Bcl-2/actina se inhibieron en 28, 57 y 64%, respectivamente. La expresión de la proteína Bcl-2 no se inhibió en las células tratadas con las mismas dosis de oligos L-control.

Cuando las células Jurkat se trataron con 3 y 4 mmoles/l de L-bcl-2, las relaciones de proteína Bcl-2/actina se inhibieron en un 44% y 50% respectivamente. la proteína Bcl-2 no se inhibió significativamente cuando se usaron las mismas dosis de oligos L-control (Fig. 4).

También se determinaron las relaciones de proteína Bcl-2 Bax en células Johnson y Jurkat antes y después de tratamiento con oligos L-bcl-2 y L-control. Las células Johnson, Raji y Daudi expresaban la proteína Bax pero las células Jurkat no la expresaban (Fig. 5). Cuando las células Johnson se trataron con 2, 3 y 4 mmoles/l de L-bcl-2, la relación de Bax/Actina no se modificó, pero la relación de Bcl-2/Bax disminuyó en un 10%, 40% y 50% respectivamente. Estas relaciones de proteína estaban sin modificar después del tratamiento con las mismas dosis de oligos L-control (Fig. 6).

La inhibición de la proteína Bcl-2 conduce a apoptosis en las células FL

También se estudió si los efectos inhibidores de crecimiento observados en las células Johnson pueden estar relacionados con la inducción de apoptosis. Después de tres días de incubación con L-bcl-2, se observó el patrón de degradación de ADN internucleosomal típico, mientras que las células incubadas con oligos L-control no mostraban el patrón de ADN internucleosomal (Fig. 7). Posteriormente, se determinó la cantidad de apoptosis mediante naranja de acridina. después de tres días de exposición y 4 a 5 \mumoles/l de L-bcl-2, eran evidentes células apoptópicas. El índice apoptópico de células Johnson no tratadas era 3% mientras que las células Johnsosn tratadas con 4 y 5 \mumoles/l de L-bcl-2-eran 43% y 61% respectivamente. No se observó incremento de índice apoptópico en células tratadas con oligonucleótidos de control liposomales o liposomas vacíos (Fig. 8).

L-bcl-2 regula hacia abajo selectivamente la expresión de la proteína Bcl-2 y crecimiento celular de una manera dependiente de la dosis

La inhibición del crecimiento celular se observó solamente en al línea celular FL que lleva la translocación t(14; 18), mientras que la inhibición del crecimiento celular no se observó en líneas celulares que carecen de la expresión Bcl-2 (células Daudi) o la translocación t (14; 18) (células raji y Jurkat). No existía toxicidad no específica en células Johnson expuestas a dos oligonucleótidos de control diferentes. Los efectos inhibidores de crecimiento se podrían observar partiendo de una concentración de 3 \mumoles/l de L-bcl-2, y los efectos inhibidores eran máximos a una concentración de 6 \mumoles/l. Uno de los mecanismos mediante L-bcl-2 ejerce inhibición de crecimiento en células Johnson podría ser a través de la inducción de apoptosis, ya que las células tratadas mostraban un patrón internucleosomal de ADN típico, y un índice apoptópico incrementado como se mide mediante naranja de acridina. El día 3, el 61% de células Johnson tratadas con 5 \mumoles/l de L-bcl-2 estaban en apoptosis comparadas con 15% de células tratadas con oligos L-control. No se observó apoptosis en los otros tipos de células.

De este modo, la inhibición de la proteína Bcl-2 conduce a la inhibición de crecimiento celular en células que son dependientes de la presencia de la proteína Bcl-2 para mantener la viabilidad. Los experimentos de transferencia de genes han proporcionado la evidencia de que Bcl-2 juega un papel importante en el mantenimiento de la supervivencia de células linfoides in vitro, aunque también pueden estar implicados otros factores de crecimiento autocrinos (Vaux y col., Nature (Londres), 355: 440, 1988; Reed y col., Proc Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 87: 3660, 1990b; Blagosklonny y Neckers, Eur. Cytokine Network, 6:21, 1995). Usando oligonucleótidos de sentido contrario de fosforo tionato, Cotter y colaboradores observaron inhibición de crecimiento en la línea celular DoHH2 que tiene la trnaslocación t (14; 18) y sobreexpresa la proteína Bcl-2, pero no en la línea celular que sobreexpresa la proteína Bcl-2 sin la translocación t (14; 18) (Cotter y col., 1994). Células que sobreexpresan Bcl-2 y carecen de la translocación t (14; 18) puede necesitar un estímulo apotópico, del mismo modo privación de factor de factor de crecimiento o tratamiento de fármacos quimioterapéuticos, que lleva a apoptosis y detención de crecimiento (Reed, 1995). Se pueden usar oligonucleótidos de sentido contrario para invertir la resistencia quimioterapéutica de las células que también sobreexpresan altos niveles de Bcl-2 sin la translocación t /14; 18) (Kitada y col., Antisense Res. Dev. 4: 71, 1994). Se entiende que tal combinación de L-Bcl-2 de la presente descripción con un estímulo apoptópico estaría abarcado por el espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Bax, un promotor de la muerte celular apoptópica, puede ser una pareja común en heterodimerización y regulación de otras funciones del miembro de la familia Bcl-2 (Sedlak y col., Proc. Nat'l Acad Sci. Estados Unidos, 92: 7834, 1995). Se ha sugerido que el equilibrio en la formación de heterodímeros Bcl-2:Bax y homodímeros Bax:BaX parece ser central en la regulación molecular de la apoptosis (Yin y col., 1994). Además, en un estudio reciente, la relación de Bcl-2:Bax se correlaciona con la muerte celular en células FL5.12 dependientes de IL-3. Cuando aproximadamente la mitad o más de Bax se heterodimeriza con Bcl-2, se inhibió la apoptosis (Yang y col., 1995). la muerte apoptópica observada en células Johnson, después de incubación con L-bcl-2, se podría deber a la disminución en la relación Bcl-2:Bax y formación de más homodímeros Bax:Bax.

Otra explicación es que los oncogenes y genes supresores de tumores tales como C-MYC y p53 pueden estar implicados en la supervivencia de las otras líneas celulares. C-MYC, por ejemplo, se expersa típicamente en linfomas de Burkitt y en alguna Fl transformada (McDonnell y Korsmeyer, 1991). Las mutaciones del gen p53, un gen supresor implicado en numerosos tumores humanos, también puede estar implicado en estas líneas celulares; el gen p53 codifica una proteína de unión a ADN que funcional menos en parte como un factor de transcripción para inducir la detención del ciclo celular y apoptosis mediante la regulación de Bax (Vogelstein y Kinzler, Cell, 70: 523, 1992; Miyashita y col., Oncogene, 9: 1799, 1994; Miyashita y Reed, Cell, 80: 293, 1995). Probablemente la inhibición de la expresión de Bcl-2 dolo no es suficiente para inducir apoptosis e inhibición de crecimiento en células diferentes de las células con un alto nivel de expresión de Bcl-2 tales como aquellas con una translocación t (14; 18). Sin embargo, como se ha descrito en esta memoria descriptiva anteriormente, una disminución en la relación de Bcl-2/Bax t L-bcl-2-forma la base para un planteamiento molecular a la terapia de linfoma molecular así como otras enfermedades de Bcl-2 en células en las que se expresa Bax.

Ejemplo 4 Regulación de Bcl-2 de importe nuclear de p53

La línea celular de carcinoma de próstata humana, LNCaP, que posee un gen p53 de tipo salvaje (Carroll y col., Prostate, 23, 123-134, 1993), se seleccionó para investigar la inhibición de la muerte celular programada dependiente de p53 por bcl-2. Se generaron las líneas celulares estables de carcinoma de próstata LNCaP que expresan bcl-2 y se confirmaron mediante transferencia de Western. La expresión de bcl-2 confería resistencia significativa a la inducción de apoptosis después de la irradiación \gamma comparado con clones control como se determina mediante análisis morfológico y citometría de flujo (Fig. 9A y 9B). No se observó inducción de muerte celular significativa en células LNCaP que expresan bcl-2 hasta 48 horas después de irradiación. Adicionalmente, no existía diferencia en la diferencia de distribución de ciclo celular entre células LNCaP y LNCaP-bcl-2 antes de irradiación y sin evidencia de que la distribución de células en el ciclo celular se alteró después de irradiación. Aproximadamente el 60% de células de control no irradiadas residen en Go/G_{1}, 18% en la fase S, y 22% en G_{2}/M comparado con el 59% de células LNCaP-bcl-2 no irradiaads en G_{0}/G_{1}, 21% en fase S, y 20% en G_{2}/M. Estos valores no eran significativamente diferentes de los observados a los 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, y 8 horas después de la irradiación.

La apoptosis inducida en respuesta al daño genotóxico se considera que es dependiente de p-53. En las células LNCaP, la proteína p53 celular total se indujo hasta niveles aproximadamente equivalentes en clones de expresión de bcl-2 y transfectantes de control en las 4 horas después de la irradiación \gamma de 20 Gy (Fig. 10A). El análisis de transferencia de Western que usa núcleos aislados reveló que los niveles de proteína p53 en el núcleo aumentaba en las 2 horas de irradiación en células LNCaP control, pero no en LNCaP que expresa bcl-2 (Fig. 10A). Esta observación sugiere que la importación nuclear de p53 que sigue al daño de ADN se puede alterar en el contexto de altos niveles de la proteína bcl-2.

Se usó microscopía láser confocal de barrido para caracterizar adicionalmente la importación nuclear p53 después de irradiación. La inhibición de la importación p53 nuclear en las células bcl-2 se confirmó mediante microscopía confocal usando anticuerpos que reconocen la proteína p53 (Fig. 10B). De este modo, mediante dos técnicas independientes se demostró que la importación nuclear de p53 se inhibía significativamente en la expresión de bcl-2 después de la inducción de la muerte celular mediante irradiación ionizante.

Con el fin de determinar si al capacidad transactivadora de p53 estaba afectada en el contexto de la proteína bcl-2, se transfectaron transitoriamente células NIH3T3 con una construcción indicadora del indicador de mdm-2-promotor-luciferasa que posee sitios de unión a p53 funcionales. La actividad de luciferasa se incrementaba aproximadamente 8 veces después de la cotransfección con un plásmido de expresión p53 de tipo salvaje, pero no mutante (Fig. 10C). La cotransfección de bcl-2 y plásmidos de expresión p53 de tipo salvaje daba como resultado una disminución de 2-4 veces en la actividad de luciferasa comparado con la p53 de tipo salvaje sola (p \leq 0,02).

Se llevaron a cabo estudios adicionales usando la línea celular de carcinoma de colon RKO para determinar si la capacidad de bcl-2 de inhibir la importación nuclear de p53 de tipo salvaje para la línea celular de cáncer de próstata LNCaP. Las células RKO poseen un gen p53 de tipo salvaje (Nagasawa y col., Cancer Res., 55, 1842-1846, 1995) y también expresan la proteína bcl-2. Para regular hacia abajo la expresión de bcl-2 en células RKO, se administraron oligonucleótidos de sentido contrario específicos de bcl-2 mediante liposomas. Los niveles de proteínas Bcl-2se redujeron 3 veces comparados con células RKO tratadas con liposomas vacíos o liposomas que contienen oligonucleótidos de control (Fig. 11A). La microscopía confocal se usó para formar imágenes de la proteína p53 4 horas después de irradiación \gamma de 20 Gy en células RKO tratadas con liposomas que contienen oligonucleótidos de sentido contrario bcl-2, u oligonucleótidos de control. Las células RKO tratadas con oligonucleótidos de control mostraron que la mayoría de la proteína p53 permanecía localizada en el citosol (Fig 11B). Por el contrario, las células RKO en las que bcl-2 se ha regulado hacia abajo mediante oligonucleótidos de sentido contrario mostraron altos niveles de proteína p53 dentro del núcleo e inducción de muerte celular significativa (p \leq 0,005) comparadas con células RKO tratadas con oligonucleótidos de control (Fig. 11C). Estos hallazgos sugieren que la capacidad de bcl-2 modulan la importación de proteína p53 de tipo salvaje en respuesta al daño de ADN no es específica del tipo de célula.

Irradiación y tinción de calceína-AM

Se precargaron células con calceína-AM (Molecular Probes, Eugene, OR) a 1 mg/ml durante 20 minutos en RPMI que contenía FBS al 10%. Se proporcionó a las células 20 Gy de radiación usando una fuente \gamma de ^{137}Cs y la fluorescencia generada por calceína se visualizó usando óptica de epifluorescencia y un filtro FIAC (emisión a 530 nm). La dosis de 20 Gy de radiación se seleccionó como la mínima dosis requerida para inducir niveles máximos de apoptosis en células LNCaP.

Análisis citométrico de flujo

Análisis citométrico de flujo de ciclo celular e inducción de muerte celular en células LNCaP. Se fijaron suspensiones de células individuales en etanol al 70% y se incubaron con 50 mg/ml de yoduro de propidio (PI) y 20 mg/ml de ARNasa durante 15 minutos a 37ºC. Se realizó análisis de flujo con un perfil I EPICS a excitación a 488 nm y se recogió para fluorescencia PI usando software Elite 4.0 (Coulter Corp, Miami, FL) y el software del programa Multi Cycle DNA Analysis (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).

Transfecciones y ensayos de Luciferasa

Se transfectaron células LNCaP con el foco esplénico que forma plásmido de expresión de virus con, o sin (control), la inserción de ADNc de bcl-2 como se ha descrito previamente (Marin, y col., Oncogene, 12, 2259-66, 1996; Tu y col., Cancer Lett 93, 147-155, 1995). Los plásmidos efectores LTRXA y plásmidos de expresión LTRKH se han descrito previamente (Defile y col., 1993) y representan p53 de tipo salvaje y mutante, respectivamente. El plásmido indicador P2mdm2-Luc se preparó mediante clonación de un fragmento Xhol de 1 Kb que contenía el elemento de respuesta p53 a partir del gen mdm2 de ratón en el sitio Smal del plásmido pA3-luciferasa. Las células NIH3T3 se sembraron a una densidad de 0,5 x 10^{6} células por placa 24 horas antes de la transfección. El plásmido de tipo salvaje o mutante de tipo salvaje (10 \mug), plásmido indicador P2mdm2-Luc (4 \mug) y plásmido de expresión de la \beta-galactosidasa (\betagal)(3 \mug) se cotransfectaron con o sin vector bcl-2 (20 \mug) siguiendo el procedimiento de fosfato de calcio. la cantidad total de ADN transfectada se normalizó añadiendo plásmido p-GEM hasta 37 \mug de ADN total para todas las transfecciones. A las 48 horas después de la transfección las células se recogieron. Los extractos se prepararon y ensayaron para actividad de luciferasa.

Tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal

Células LNCaP y LNCaP-bcl-2 se hicieron crecer sobre portaobjetos cubiertos revestidos con laminina e irradiados con 20 Gy. Después de 4 horas, se lavaron las células dos veces con PBS, después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se lavaron dos veces en PBS. Se bloquearon las células con suero de cabra al 10%, se incubaron con anticuerpo p53 (AB-2, Calbiochem) en suero de cabra al 10% (1:75), se lavaron dos veces, y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en suero de cabra al 10% (1:200). La formación de imágenes se usó usando un microscopio láser confocal de barrido Zeiss.

Células RKO se desarrollaron sobre portaobjetos cubiertos revestidos con laminina y se incubaron con formulaciones de oligonucleótidos liposomales a una concentración final de 10 \muM a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante 3 días. Después de irradiación con 10 Gy, se lavaron las células dos veces con PBS, después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se lavaron dos veces en PBS. Las células se bloquearon con suero de cabra al 10% en PBS, se incubaron con anticuerpo p53 (AB-2, Calbiochem) en suero de cabra al 10% (1:75), se lavaron dos veces y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en suero de cabra al 10% (1:200). La microscopía confocal se realizó usando un microscopio láser confocal de barrido Zeiss.

Procedimientos de sentido contrario y de ADN

Se compraron p-etoxi-oligonucleótidos, un análogo de fosfodiéster resistente a nucleasa, de Oligo Therapeutics (Wilsonville, OR). un oligonucleótido específico para el sitio de inicio de la traducción de ARNm de bcl-2 humano: 5' CAGCGTGCGCCATCCTTC 3' (SEQ ID Nº: 1) se usó como un oligonucleótido de sentido contrario. El oligonucleótido de control usado era una versión mezclada de oligonucleótido de sentido contrario de Bcl-2 5' ACGGTCCGC
CACTCCTTCCC 3' (SEQ ID Nº: 2). Los P-etoxi-oligonucleótidos, disueltos en DMSO, se añadieron a fosfolípidos (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) en presencia de un exceso de terc-butanol. la mezcla se congeló en un baño de hielo seco/acetona, se liofilizó durante toda una noche y se hidrató con solución salina al 0,9% a una concentración final de oligonucleótido de 0,1 mmoles7l. Se prepararon liposomas vacíos de manera idéntica como antes, excepto que los oligonucleótidos no se incluían en la preparación. Se sembraron 0,25 x 105 células/ml en una placa de 24 pocillos en 0,5 ml del medio respectivo. Las células se incubaron con oligonucleótidos de sentido contrario, control y liposomas vacíos a una concentración final de 10 \muM a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante 3 días. La transferencia de Western de extractos de células enteras (40 \mug) de clones transfectados bcl-2 y control se analizaron mediante inmunotrasnferencia para la proteína bcl-2 usando un anticuerpo monoclonal anti-bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA).

Análisis de expresión de proteína en extractos celulares y nucleares

Análisis de transferencia de Western de inducción de proteína p53 e importación nuclear después de irradiación \gamma. Los cultivos subconfluentes de células LNCaP y LNACaP-bcl-2 se irradiaron con 20 Gy. Los extractos de núcleos se prepararon raspando las monocapas de células en tampón de de lisis hipotónica (100 mM de Hepes, pH 7,4, 1,5 mM de MgCL_{2}, 10 mM de KCl, 0,5 mM de \beta-mercaptoetanol y 5 ng/ml de leupeptina). Después de 10 minutos en hielo, se añadió NP-40 a 0,625% y el sedimento nuclear bruto se recuperó mediante centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos. Los sedimentos nucleares se lisaron en tampón de carga muestra de SDS-PAGE. Los extractos de los núcleos y células enteras se prepararon 2 y 4 horas después de irradiación. Cantidades equivalentes de lisados se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpo p53 (Santa Cruz).

Los extractos de núcleos se prepararon raspando las monocapas de células en tampón de lisis hipotónico (100 mM de Hepes, pH 7,4, 1,5 mM de MgCL_{2}, 10 mM de KCl, 0,5 mM de \beta-mercaptoetanol y 5 ng/ml de leupeptina). Después de 10 minutos en hielo, se añadió NP-40 a 0,625% y el sedimento nuclear bruto se recuperó mediante centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos. Los sedimentos nucleares se lisaron en tampón de carga muestra de SDS-PAGE.

Ejemplo 5 Ensayo in vivo

En una ronda inicial de ensayos in vivo, 30 ratones desnudos (un/un), de edad aproximadamente 5-6 semanas se inyectaron cada una de ellas por vía intraperitoneal con 3 millones de células Johnson, células de linfoma folicular que llevan la translocación t (14; 18). Se usaron tres grupos de 10 ratones cada uno: ratones sin tratar (grupo I), ratones tratados con sentido contrario Bcl-2 p-etoxi liposomal (grupo II) y ratones tratados con Bcl-2 control liposomal (grupo III). Una semana después del implante de tumores, a los ratones de los grupos II y III se les administró una inyección intravenosa de oligos de sentido contrario Bcl-2 liposomal, u oligos Bcl-2 control liposomales. La dosis de oligo es 15 mg/kg de peso corporal de ratón.

Se observó que algunos ratones alcanzaban el estado moribundo (que se define como tamaño de tumor que excede de 1,5 cm^{3}) el día 50. El día 70 después del implante (63 días de tratamiento) seis ratones (60%) en grupos I y III habían alcanzado el estado moribundo y se sacrificaron, mientras solamente 2 ratones (20%) en el grupo II habían alcanzado el estado moribundo y se sacrificaron. Otro ratón alcanzó el estado moribundo el día 77 (70 días después del tratamiento). se terminó el estudio el día 78. El tejido del hígado, riñón, bazo, corazón, pulmones, estómago, intestinos y médula ósea se recogieron para estudios de histopatología. De esta manera los resultados preliminares in vivo indican que el Bcl-2 de sentido contrario distribuidos en liposomas son eficaces en la inhibición de linfoma folicular en ratones.

Ejemplo 6 Ensayos clínicos

Este ejemplo se refiere al desarrollo de protocolos de tratamiento de seres humanos usando las composiciones de oligo- y polinucleótidos asociados a lípidos. Las formulaciones de lípidos serán de uso en el tratamiento clínico de diversos cánceres y enfermedades que sobreexpresan bcl-2 en los que células transformadas o cancerosas juegan un papel. Tal tratamiento serán herramientas particularmente útiles en terapia antitumoral, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes con FL. Este tratamiento también será útil en el tratamiento de otras afecciones que están mediadas por sobreexpresión de bcl-2 y resistencia a regímenes convencionales y tratamientos tales como malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas, incluyendo linfomas foliculares y no foliculares, leucemia linfocítica crónica, y discrasias de células en plasma; tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes.

Los diversos elementos de llevar a cabo un ensayo clínico, incluyendo tratamiento de pacientes y control, serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. La siguiente información que se presenta como una directriz para uso en el establecimiento de composiciones oligo- y polinucleótidos asociados a lípidos solas o en combinaciones con fármacos anticáncer en ensayos clínicos.

Los candidatos para el ensayo clínico de la fase 1 serán pacientes sobre los que han fracasado las técnicas convencionales. Los oligos de sentido contrario Bcl-2 liposomales se administrarán a ellos por vía intravenosa en una base semanal tentativa. Para controlar el curso de la enfermedad y evaluar las respuestas anti-tumorales, se contempla que los pacientes se deben examinar para marcadores tumorales apropiados cada mes. Para determinar la eficacia del fármaco, se controlarán los siguientes parámetros: tamaño tumoral e infiltración de médula ósea de otras células cancerosas. Los ensayos que se usarán para controlar el progreso de los pacientes y la eficacia de los tratamientos incluyen: examen físico, rayos X, trabajo en sangre y otras metodologías de laboratorio clínicas. Además, se extrajo sangre periférica y de me´dula ósea para determinar la modificación de la expresión de la proteína diana. Las dosis proporcionadas en el estudio de fase 1 se intensificó como se hace en los ensayos de la fase 1 clínicos, es decir, las dosis se intensificarán hasta que se alcancen intervalos máximos tolerables.

Las respuestas clínicas se pueden definir mediante una medición aceptable. Por ejemplo, se puede definir una respuesta completa mediante la desaparición completa de evidencia de cáncer durante al menos 2 meses. Mientras que una respuesta parcial se puede definir mediante una reducción del 50% de células de cáncer durante al menos 2 meses.

Ejemplo 7 Tratamiento humano y protocolos clínicos

Este ejemplo describe un protocolo para facilitar el tratamiento de enfermedades mediadas por bcl-2 usando composiciones de oligo- y polinucleótidos asociados a lípidos solas o en combinación con fármacos contra cáncer.

Típicamente, los pacientes que son candidatos para el tratamiento son aquellos con FL aunque los pacientes con malignidades hematológicas, tanto leucemias como linfomas; tumores sólidos como los asociados a cáncer de mama, de próstata y de colon; y trastornos inmunes también se pueden tratar con los procedimientos de esta invención. El curso típico de tratamiento variará dependiendo del paciente individual y enfermedad que se está tratando en formas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un paciente con FL se podría tratar en ocho ciclos semanales, aunque la duración más larga se puede usar si no se observan efectos adversos con el paciente, y términos más cortos de tratamiento se pueden producir si el paciente no tolera el tratamiento como se espera. Cada ciclo constará de entre 20 y 35 dosis individuales espaciadas igualmente, aunque esto también se podría variar dependiendo de la situación clínica.

Un paciente que presenta una afección mediada por bcl-2, como FL se puede tratar usando el siguiente protocolo. Los pacientes pueden, pero no necesitan haber recibido tratamientos terapéuticos quimio, radio o génicos previos. De manera óptima el paciente mostrará función de médula ósea adecuada (definida como recuento de granulocitos absolutos periféricos de > de 2.000/mm^{3} y recuento de plaquetas de 100.000/mm^{3}, función hepática adecuada (bilirrubina 1,5 mg/dl) y función renal adecuada (creatinina 1,5 mg/dl).

La sobreexpresión de bcl-2 se controla típicamente antes de, durante, y después de la terapia. Una composición de la presente invención se administra por vía oral o parenteral en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, adyuvantes, y vehículos fisiológicamente aceptables no tóxicos según se desee. El término parenteral como se usa en esta memoria descriptiva incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, o técnicas de infusión. Las composiciones de oligo- y polinucleótidos asociados a lípidos se pueden administrar al paciente antes, después o simultáneamente con los otros agentes anticancerosos.

Un curso de tratamiento típico puede comprender aproximadamente seis dosis distribuidas durante un período de 7 a 21 días. Tras la elección por el médico el régimen se puede continuar con seis dosis cada tres semanas o en una base menos frecuente (mensualmente, bimensualmente, trimestralmente, etc.). De hecho, estos tiempos son solamente ejemplares para el tratamiento, y el facultativo experto reconocerá fácilmente que son posibles otros cursos de tiempo.

Para matar células de cáncer que sobreexpresan bcl-2 usando los procedimientos y composiciones descritas en la presente invención en general pondrán en contacto una célula diana con las formulaciones asociadas a lípidos descritas previamente. Estas composiciones se proporcionarán en una cantidad eficaz para matar o inhibir la proliferación de la célula.

La administración regional de las formulaciones asociadas a lípidos será un procedimiento eficaz de administración de una dosis terapéuticamente eficaz para neutralizar la enfermedad clínica. Como alternativa puede ser apropiada la administración sistémica. La composición terapéutica de la presente invención se puede administrar al paciente directamente en el sitio del tumor. Esto es en esencia un tratamiento tópico de la superficie de cáncer. El volumen de la composición debe ser usualmente suficiente para asegurar que la superficie entera del tumor se pone en contacto mediante la composición oligo- o poli-nucleótido asociado a lípido.

En una realización, la administración simplemente supone la inyección de la composición terapéutica en el tumor. En otra realización, se inserta un catéter en el sitio del tumor y la cavidad se puede infiltrar de manera continua durante un período de tiempo deseado.

De hecho, los regímenes de tratamiento descritos anteriormente se pueden alterar de acuerdo con el conocimiento adquirido a partir de ensayos clínicos tales como los descritos en el ejemplo 5. Los expertos en la técnica serán capaces de tomar la información descrita en esta memoria descriptiva y optimizar los regímenes de tratamiento basados en los ensayos clínicos descritos en la memoria descriptiva.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Junta de Regentes, La Universidad del Sistema de Texas

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 201 W. 7th Street

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(C)

CIUDAD: Austin

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(D)

ESTADO: Texas

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78701

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (512) 418-3000

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (713) 789-2679

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA Bcl-2 MEDIANTE OLIGODESOXINUCLEÓTIDOS DE SENTIDO CONTRARIO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv)

FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/726.111

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 4 de octubre de 1996

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C):TIPO

DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCGTGCGC CATCCTTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGTCCGCCACTCCTTCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAAGGGCTTCTTCC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5086 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C):TIPO

DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1459 .. 2175

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 239 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:

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6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 911pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: individual

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 147 .. 761

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 205 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:

9

Claims (25)

1. Una composición que comprende (I) un primer polinucleótido que se híbrida a un segundo, polinucleótido que codifica Bcl-2 en condiciones intracelulares y (ii) un fosfolípido neutro asociado a dicho primer polipéptido, en la que dicho primer polipéptido es un oligonucleótido que tiene una longitud de 8 a 50 bases, y en la que dicha composición no contiene lípido catiónico.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido es un p-etoxi o metil fosfonato oligonucleótido.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el componente fosfolipídico es neutro en carga neta.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que el primer polinucleótido es complementario al sitio de inicio de la traducción del ARNm de Bcl-2.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido comprende la secuencia CAGCGTGCGC
CATCCTTC (SEQ ID Nº 1).

6. La composición de la reivindicación 1, comprendiendo la composición un liposoma formado a partir del fosfolípido neutro.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que el oligonucleótido está encapsulado en el liposoma.

8. La composición de la reivindicación 6, en la que el fosfolípido es una fosfatidilcolina, un fosfatidilglicerol, o una fosfatidil etanolamina.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que el fosfolípido es dioleoilfosfatidilcolina.

10. Una composición que comprende una construcción de expresión que comprende un primer polinucleótido que se híbrida a un segundo, polinucleótido que codifica Bcl-2 en condiciones intracelulares, en la que la transcripción de dicho primer polinucleótido está bajo el control de un promotor que es activo en células eucarióticas, en la que dicho primer polinucleótido es un oligonucleótido que tiene una longitud de 8 a 50 bases, y en la que dicha composición está asociada a un lípido neutro, y en la que dicha composición contiene lípido catiónico.

11. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en al fabricación de un compuesto farmacéutico para inhibir o tratar una enfermedad asociada a Bcl-2, en la que la enfermedad es una malignidad hematológica incluyendo leucemias y linfomas, tales como linfomas foliculares y no foliculares y leucemias linfocíticas crónicas, y discrasias de células de; tumores sólidos; y trastornos inmunes en un paciente que muestra una célula (i) que expresa tanto Bcl-2 como Bax y/o (ii) en la que la translocación de p53 en el núcleo tras el daño genotóxico está inhibido por bcl- 2.

12. Uso de la reivindicación 11, en la que la célula es una célula de cáncer, preferiblemente una célula de linfoma folicular.

13. Uso de la reivindicación 11 ó 12, en la que el paciente es un animal.

14. Uso de la reivindicación 13, en la que dicho animal es un ser humano.

15. Uso de la reivindicación 14, en la que dicho compuesto farmacéutico se formula de manera que permite su administración en dosis de 0,50 - 10,0 ml.

16. Uso de la reivindicación 14, en la que dicho compuesto farmacéutico se formula de manera que permite su administración en una cantidad de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 mg de polinucleótido por m^{2} de superficie corporal.

17. Uso de la reivindicación 16, en la que dicho compuesto farmacéutico se formula de manera que permite su administración tres veces por semana durante ocho semanas.

18. Uso de la reivindicación 11, en la que la enfermedad es un tumor sólido.

19. Uso de la reivindicación 18, en la que el tumor sólido se asocia con cáncer de mama, de próstata o de colon.

20. Uso de la reivindicación 11, en la que la enfermedad es malignidad hematológica.

21. Uso de la reivindicación 20, en la que la malignidad hematológica es leucemia o linfoma.

22. Uso de la reivindicación 21, en la que la leucemia es leucemia linfocítica.

23. Uso de la reivindicación 21, en la que el linfoma es un linfoma folicular o no folicular.

24. Uso de la reivindicación 11, en la que al enfermedad es discrasia de células de plasma.

25. Uso de la reivindicación 12, en la que al enfermedad es un trastorno inmune.